Aus der Bundesforschungsanstalt f u r Viruskrankheiten der Tiere in Tiibingen a . N .

Nachweis von inaktiviertem Maul- und Klauenseuchevirus mittels indirekten Neutralisationstestes

11. Mitteilung : Der indirekte Neutralisationstest rnit Vakzinen aus Rindermaterial

Von

G. WITTMANN

(E ingegangen am 3 . 1 ~ 1 ; 1961)

b4it Hilfe des indirekten Neutralisationstestes (INT) ist es moglich, inaktiviertes MKS-Virus aus Formoladsorbat-Vakzinen quantitativ nah - zuweisen (1). Bei 20-30 Tage alten 0,-Vakzinen, 'die aus virushaltigem Mausematerial hergestellt waren, wurde der Test dann positiv, wenn der Gehalt an Ausgangsvirus uber lo6,' LD,, pro ml Vakzine lag. Geringere Antigenmengen liei3en sich nicht mehr mit Sicherheit nachweisen.

In der vorliegenden Arbeit wird uber den Antigennachweis bei Vakzinen aus virushaltigem Rindermaterial mit unterschiedlichem Antigengehalt be- richtet. Des weiteren werden Konzentrierungsverfahren beschrieben, die es ermoglichten, aus Vakzinen mit niedrigem Antigengehalt das inaktivierte Virus so stark anzureichern, dai3 es im INT positiv reagierte.

MATERIAL UND METHODEN

1. Herstellung der MKS-Vakzinen

Hierfur verwendeten wir ein aus frischem Praxismaterial isoliertes 0-Virus (0 Hannover 1960,3. Rinderpassage). Eine genaue Variantendiagnose rnit der KBR und dem Neutralisationstest konnte nicht gestellt werden, weil das Virus mit den 0, und 0,-Immunseren gleichstark reagierte. Fur unsere Untersuchungen war dieses Virus sehr geeignet, da es in Sauglingsmausen gut anging und Titerbestimmungen somit leicht ldurchzufuhren waren. Die Her- stellung der Vakzine erfolgte nach der Methode von PYL (2). Die Formalin- konzentration betrug 0,05 % und der AJ,O,-Gehalt belief s i h auf 0,5 %. Die Aufbewahrung der Vakzine erfolgte bei 4" C.

Vor Zusatz des Al(OH), und des Formalins entnahmen wir eine Probe aus der Virussuspension und verdiinnten sie entsprechend dem Prozentgehalt der Vnkzine rnit isotonischem Phosphatpuffer. Sie diente zur Ermittlung des

700 WITTMANN

Virusgehalts der Vakzine, welche in Sauglingsmausen erfolgte. In der gleihen Weise stellten wir eine Vakzine aus virushaltigem Mausematerial (0,-Brescia) her.

Die Vakzinen wurden wie folgt bezeichnet: R i n Id e r v a k z i n e I : 0-Hannover 1960, 6 %ig, Virusgehalt der

Vakzine 1 0730 Mause-LD,,/ml. R i n Id e r v a k z i n e I I : 0-Hannover 1960, 6 %big, Virusgehalt der

Vakzine 1 0635 Mause-LD,,/rnl. M a u s e v a k z i n e : 0,-Brescia, 3 "/cig, Virusgehalt der Vakzine 106J

Mause-LD,,/ml. Einen Tag vor der Verwendung im INT eluierten wir das inaktivierte

Virus vom Al(OH), nach der bcreits beschriebenen Methode (1) und liei3en das Eluat bis zum Ansatz des INT bei Zimmertemperatur stehen.

2. Anreicherung des inaktivierten Virus aus Vakzineeluaten mit niedrigem Antigengehalt

Sie erfolgte a) durch Ultrazentrifugation und b) durch Ammoniumsulfat- fallung.

a) Ultrazentrifugation

N a h Zusatz von 0,060/0 verflussigter Gdatine wurde das Eluat in der Spinco-Ultrazentrifuge, Modell L, Rotor 30, 3 Stunden bei 30 000 U/min. zentrifugiert. Nach Verwerfung des Uberstandes kratzten wir das Sediment vom Rohrchenboden ab und zermorserten es in einer auf 37" C vorgewarmten Reibschale unter tropfenweiser Zugabe von vorgewarmter m/90 phosphat- gepufferter physiologischer Kochsahlosung (NaC1-Puffer). Zu den Sediment- resten in den Rifhrchen setzten wir etwas NaC1-Puffer zu und hielten die Rohrchen 20 Minuten bei 37' C im Wasserbad. Dann resuspendierten wir das Restsediment durch Pipettieren. Die Suspensionen aus der Reibschale und den Rohrchen gaben wir zusammen. Fur die Resuspendierung wurde so vie1 Puffer verwensdet, dai3 sich das Volumen auf 1/10 des Ausgangswertes verminderte. Hierauf zentrifugierten wir unter Gelatinezusatz erneut 3 Stunden bei 30 000 U/min. und engten die Probe in der oben kschriebenen Weise auf l/50

des Eluatausgangsvolumens ein. Die Suspension liei3en wir iiber Nacht bei 4' C stehen und zentrifugierten sie dann 15 Minuten bei 3000 U/min. Die uber- stehende Flussigkeit verwendeten wir fur den INT. Als Ausgangsvolumen be- nutzten wir meistens 300 ml Eluat. Die daraus gewonnenen 6 ml Konzentrat sind zur Durchfiihrung des INT ausreichend.

b) AmmoniumsulfatfHllung

Dem Eluat (meist 300 ml Ausgangsvolumen) wurden in kleinen Portionen unter standigem Schutteln gleiche Teile einer gesattigten (NH,),SO,-Losung zugesetzt. Der pH-Wert der (NH,),SO,-Liisung war vorher durch Zusatz von 10 O/oiger N a O H auf unlgefahr 8,l gebracht worden [4 Tropfen N a O H auf 10 ml (NH,),SO4]. Im Eluat stellte sich dann ein pH von etwa 7,4 ei'n. Das Gemisch hielten wir unter wiederholtem Schiitteln 1 Stunde bei Zimmertempe- ratur, zentrifugierten es hierauf 20 Minuten bei 6000 U/min. und nahmen das Sediment in NaC1-Puffer auf. Dabei engten wir die Probe auf 1/10 ihres urspriinglichen Volumens ein. Die Salzfallung wurde dann wiederhult und das Sediment in Aq. dest. aufgenommen, wobei wir das Volumen auf 1/50 des Aus- gangsvolumens reduzierten. Nach einer funfzehnminiitigen Zentrifugation bei

Nachweis von inaktiviertern Maul- und Klauenseuchevirus 70 1

3000 U/min. gewannen wir den Uberstand und entsalzten ihn vom restlichen (NH,)$O,, dessen Konzentration noch etwa 16 % betrug. Zur Entsalzung verwendeten wir die Dextrangelfiltration (Sephadex D 25). Diese Methode ist an anderer Stelle bereits beschrieben worden (3).

3. Indirekter Neutralisationstest

Samtliche Serum- und Virusver'dunnungen wurden mit m/90 phosphat- gepufferter physiologischer NaC1-Losung, pH 7,6 ausgefuhrt. Als Indikator- virus verwendeten wir chloroformgereinigtes (1) MKS-Virus der 14. bis 20. Mausepassage (0,-Lombardei, 0-Hannover 1960, 0,-Brescia, 0,-Nor- mandie, 0,-Venezuela, A,-Westerwald, C Riems).

Die Teste wurden mit inaktivierten Meerschweinchenhyperimmunseren 'b) (30 Minuten bei 56" C) angesetzt. Da der INT im Vergleich zu fruher (1) modifiziert worden ist, folgt eine genaue Beschreibung des Testes. Die Aus- fuhrung des Testes erfolgte nach zwei Methoden, namlich der Virusverdun- nungs- und der Serumverdunnungsmethode.

a) Virusverdunnungsmethode

Bei dieser Methode werden zu dem Immunserum-Eluatgemisch abgestufte Viruskonzentrationen gegeben. Die Immunserumkonzentration halt man dabei lionstant. Ein Antikorperuberschufi mui3 dabei vermieden werden, weil sonxt die uberschussigen Antikorper die wahre Reaktion iiberdecken (siehe Tabelle 1).

T a b e l l e 1

D e r E i n f l u f i v o n A n t i g e n k o r p e r i i b e r s c h u f i a u f d e n I N T

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1 : 800 10 3 3 7 3) 10 1,12 4 )

1 : 1600 10 3,55 10 2300

1 : 3200 10 3937 10 2,82

1 : 6400 10 2 7 5 10 2h9

2 e i c h e n e r k 1 a r u n g : 1) NT = Neutralisationstcst; ?) I N T = indirekter Neu- tralisationstest; 3, Neutralisationsindex; 4, Bindungsindex.

Wir stellten deshalb in einmaligen Vorversuchen von jedem Serum Ver- dunnungsreihen in Potenzen von 2 her und priiften jede dieser Serumverdun- nungen mit homologen Virusverdunnungen, die in Potenzen von 4 abgestuft waren. Fur den INT verwendeten wir dann die Serumverdunnung, welche einen Neutralisationsindex (NI) von l O 2 , 5 bis hatte. Bei dem Serum in Tabelle 1 war dies z. B. die Serumverdunnung 1 : 6400. Beim Ansatz des INT fuhrten wir die letzte Serumverdunnung bereits im Eluat bzw. im Eluat- konzentrat aus, um eine unnotige Verdunnung desselben zu vermeiden. SO wurde Z. B. 1 Teil einer Serumverdunnung 1 : 640 zu 9 Teilen Eluat gegeben, wodurh man ldie benotigte Serumverdunnung 1 : 6400 erhielt. Das Immun- serum-Eluatgemisch hielten wir 24 Stunden im Brutschrank bei 37' C. Dann gaben wir zu 0,5 ml des Neutralisationsgemisches 0,5 ml aktives Indikatorvirus,

'$) Herrn D ~ . U H L M A N N irn hiesigen Institut danke ich fur die Uberlassung der Seren.

Zentralblatt fur Veterinirniedizin, Bd. VIII, Heft 7 45

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'9; 7 V

V =

Virusverdiinnungsm

ethode; 6) SV

= Serum

- verdiinnungsm

ethode.

Nachweis von inaktiviertem Maul- und Klauenseuchevirus 703

das in Potenzen von 4 verdunnt war. Die Gemische kamen 30 Minuten lang Lei 37" C ins Wasserbad. Pro Verdunnungsstufe impften wir funf 5-7 Tage alte Mause intraperitoneal (i. p.) mit je 0,l ml.

In derselben Weise setzten wir eine I m m u n s e r u m - K o n t r o 1 1 e ( IS - K t r.) an. Das Eluat wurde dabei durch Puffer ersetzt.

Bei der V i r u s k o n t r o 11 e (V- K t r.) gaben wir zu 0,5 ml Virus- verdunnung 0,5 ml Puffer und hielten die Gemische 30 Minuten bei 37" C. Auf den Zusatz von Normalserum verzichteten wir, da dieses in einer dem Immun- serum entsprechenden Verdunnung ohne Einflui3 auf die Infektiositat des Virus war.

Zur Feststellung von aktivem Virus im Eluat diente die E l u a t - K o n t r o 1 1 e. Das Eluat wurde dabei mit gleichen Teilen Puffer verdunnt und dann auf Mause verimpft (0,l ml, i.p.).

Die Titer der einzeilnen Proben berechneten wir nach BEHRENS und KARBER (4). Die -loglo beziehen sich auf O,1 ml der jeweiligen Gemische. Der Bindungsindex (BI), d. h. die antikorperbindende Fahigkeit des inakti- vierten Virus, wurde auf folgende Weise bestimmt:

log,, V-Ktr. - log,, IS-Ktr. = Neutralisationsindex (log,,) des Immunserums (NIrs)

log,, V-Ktr. - log,, IS 4- Eluat = NI (log,,)

NIis -NIrs+ Eluat = BI des inaktivierten Virus (login) des Immunserum-Eluatgemisches (NIrs + tluat)

Der BI ist bei Verwendung von 5 Mausen pro Virusverdiinnung (Potenzen von 4) mit 95 %iger Sicherheit signifikant positiv, wenn er groi3er als 100~79 ist.

b) Serumverdiinnungsmethode

Im Gegensatz zur Virusverdunnungsmethode ist hier das Virus der kon- stante Faktor, wahrend das Serum stufenweise verdunnt dem Eluat zugegeben wird. Wir verdiinnten das Immunserum in Potenzen von 2, mischten O,I Serumverdunnung mit 0,9 ml Eluat bzw. Eluatkonzentrat und liei3en das Ge- misch 24 Stunden bei 37" C binden. Zu 1 ml dieser Mischung gaben wir l ml einer konstanten Virusverdunnung, die etwa 100 Mause-LD5o pro 0,l ml ent- hielt. Die Reaktionsgemische kamen 30 Minuten lang bei 37" C ins Wasserbad. Pro Verdunnungsstufe impften wir 4 Sauglingsmause mit O,1 ml i. p. Bei der Immunserum-Kontrolle ersetzten wir das Eluat durch Puffer. Um die Zahl der infektiosen Einheiten des Indikatorvirus, mit der beim Test gearbeitet wurde, annahernd bestimmen zu konnen, titrierten wir die Testvirusverdiinnung bei jedem Versuch in Potenzen von 10. Sie wurde vorher mit gleichen Teilen Puffer verdunnt und 30 Minuten bei 37" C gehalten.

Die Neutralisationstiter der Seren berechneten wir nach BEHRENS und KARBER. Sie beziehen sich auf die Endverdunnung des Serums. Durch die Titerdifferenz log,, IS-Ktr. - log,, IS + Eluat bestimmten wir den BI. Die Signifikanzschwelle liegt bei

VERSUCHE U N D ERGEBNISSE

In Vorversuchen hatten wir festgestellt, dai3 3 verschieden alte Handels- vakzinen aus Rindermaterial im INT negativ reagierten. Dies konnte darauf zuruckzufuhren sein, dai3 einerseits inaktiviertes Rindervirus als solches unfahig ist, neutralisierende Antikorper zu binden, oder der in den Vakzinen enthaltene Antigengehalt war andererseits zu gering, um eine signifikante Reduktion der Antikorper zu erreichen.

45'

704 WITTMANN

Zur Klarung dieser Frage stellten wir monovalente 6 %ige Vakzinen aus Rindermaterial her (Rindervakzine I und 11). Der Virusgehalt der Vakzine I lag um lO7l0 LDso pro ml Vakzine, wahrend er bei der Vakzine I1 etwa lO6s5 LDso betrug. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse des INT mit diesen Vakzinen angefuhrt.

Die Vakzine I wurde innerhalb einer Lagerungszeit von 27-83 Tagen nach Herstellung rnit verschiedenen MKS-Immunseren und Virusstammen ge- testet. Einen positiven INT erhielten wir nur mit dem 0,-Lombardeikomplex. Bei allen anderen Seren wurden keine Antikorper vom inaktivierten 0- Hannovervirus gebunden. Aus der Tabelle geht weiterhin hervor, dai3 im Laufe der Lagerung ein deutlicher Ruckgang der antikorperbindenden Fahigkeiten des inaktivierten Virus eintrat. Wahrend nach 62 Tagen Lagerung der BI noch 102J3 (Virusverdunnungsmethode), bzw. lO2l44 (Serumverdunnungsmethode) betrug, hatte er nach 76 Tagen nur noch eine Hohe von lo1**. Nach 83 Tagen konnte mit dem homologen Virus und Immunserum - letzteres stand erst zu diesem Zeitpunkt zur Verfugung - keine Reaktion mehr nachgewiesen werden. Der Antigengehalt der Vakzine war also unter den fur die Reaktion notwen- digen Sihwellwert gefallen.

Die 21 Tage alte Vakzine I1 mit einem Virusgehalt von lO6l5 LDsolml (68 % unter dem der Vakzine I), reagierte im INT mit homologem Serum und Virus negativ.

Die Versuche weisen darauf hin, dai3 das inaktivierte Rindervirus ahnliche antikorperbindende Fahigkeiten besai3 wie das inaktivierte Mausevirus. Fur den positiven Ausfall des Testes war die Menge des in der Vakzine enthaltenen Antigens mai3geblich. Vakzinen ohne infektionsfahiges Restvirus rnit einem Virusgehalt um 107>0 LD5o/ml sprachen im INT an. Der Antigenschwellwert von etwa I06s7 LDso/ml, welcher bei Mausevakzinen fur eine positive Reaktion notwendig war, durfte auch bei Rindervakzinen erforderlich sein. Der INT war streng typenspezifisch und schien weiterhin bedeutend variantenspezifisher zu sein als die KBR und der Neutralisationstest. Es lassen sich hierfur ver- schiedene Grunde anfuhren: Einmal kann die Ursache in dem unterschiedlichen Reaktionsablauf des TNT und Neutralisationstestes liegen, also technisch be- dingt sein. Andererseits ist es moglich, dai3 formalininaktiviertes Virus variantenspezifischer reagiert als aktives Virus. Untersuchungen hieriiber sind im Gange.

Des weiteren pruften wir, ob man durch geeignete Konzentrierungs- methoden inaktiviertes Virus aus Vakzinen mit niedrigem Antigengehalt SO anreichern kann, dai3 der Anti(gengeha1t fur einen positiven INT ausreicht. Wir benutzten hierfur die unter ,,Material und Methoden" beschriebenen An- reicherungsverfahren und stellten in Vorversuchen fest, dai3 man die besten Ergebnisse stets rnit der Kombination Ammoniumsulfatfallung/Dextrangel- filtration erhielt. Bei der Anreicherung durch Ultrazentrifugierung bekamen wir dagegen durchschnittlich urn 0,5 Zehnerpotenzen niedrigere Werte. Am wenigsten eignete sich die Ammoniumsulfatfallung mit anschliei3ender Ent- salzung des Konzentrats durch Dialyse fur eine Antigenanreicherung. Bei der Dialyse ging ein betrachtlicher Teil des Antigens verloren. Zur Klarung obiger Fragestellung benutzten wir deshalb ausschliefllich die erste Methode.

In der Tabelle 3 siod die Ergebnisse des INT mit 50fach konzentrierten Vakzineeluaten zusammengestellt.

Das Eluat der unterschwelligen 0,-Bresciavakzine (Mausematerial, 106J LD5o/ml) reagierte nach 50facher Konzentrierung mit dem homologen sowie dem 0,-Lombardeikomplex positiv. Mit 0,-Venezuela trat keine Reaktioll

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706 WITTMANN

auf. - Die Rindervakzine I, welche nach 83 Tagen Lagerung im INT negativ war, wurde dagegen bei 5Ofacher Konzentrierung des Eluats nach 100tagiger Lagerung positiv. - Die Rindervakzine I1 mit einem von Anfang an sehr niedrigen Antigengehalt reagierte nach 50facher Konzentrierung des Eluats mit dem 0,-Lombardeikomplex positiv, wahrend sie mit dem homologen 0- Hannoversystem ein negatives Ergebnis lieferte. Dies uberraschte insofern, als man mit dem homologen Immunserum die starkste Reaktion erwarten mui3te. Auf Grund von Berechnungen ist es unmoglich, dai3 die Bindung!indices von 1 Ooxo6 bzw. 1 0',69 im normalen Schwankungsbereich des positiven Minimalwertes von 10°378 liegen. Es darf daher angenommen werden, dai3 die Vakzine nur wenig antikorperbindendes Antigen enthielt und bei der Konzentrierung des Eluats Schwankungen in der Antigenausbeute auftraten. -

Schliefllich untersuchten wir noch eine bivalente 98 Tage alte Handels- vakzine. Bei ihr lag der BI des 50fach konzentrierten Eluats mit knapp unter der Signifikanzgrenze von 1 0°>79. Nach 260tagiger Lagerung reagierte sie dagegen vollkommen negativ.

BESPRECHUNG DER ERGEBNISSE

Mit dem INT war es moglich, das in Vakzinen aus Rindermaterial ent- haltene formalininaktivierte Virus quantitativ nachzuweisen. Der INT wurde jedoch nur dann positiv, wenn der Virusgehalt pro ml Vakzine etwa 106,7 LD50 betrug. Trotz einer Modifikation der fruher (1) beschriebenen Methode gelang es nicht, den fur ein positives Ergebnis notwendigen Antigenschwellwert herabzudrucken. Dagegen konnte man mit Hilfe einer 50fachen Anreicherung des Eluats den Antigengehalt soweit konzentrieren, dafi der fur einen positiven INT benotigte Schwellwert erreicht wird. Es mufl in diesem Zusammenhang erwahnt werden, dai3 wir nur Vakzinen, deren Virusgehalt nicht unter lo6,' LDSo/ml lag, untersucht haben. Als beste Konzentrierungsmethode hat sich die Fallung mit gleichen Teilen gesattigter Ammoniumsulfatlosung, der sich zur Entfernung des Salzgehalts eine Dextrangelfiltration des Konzentrats anschlofl, bewahrt. Ersetzten wir {die Dextrangelfiltration durch die Dialyse gegen m/90 Phosphatpuffer, p H 7,6, so trat ein starker Antigenverlust ein. Einigermaflen befriedigende Ergebnisse lieferte auch eine 50fache Konzentrierung durch 3stundige Ultrazentrifugierung bei 30 000 U/min. Arbeits- und zeitmaflig ist aber die Salzfallung einfacher und schneller durchfuhrbar als die Zentri- f ugierung.

Der INT war streng typenspezifisch. Daruber hinaus schien das inakti- vierte Virus im INT weitgehend variantenspezifischer zu reagieren als das aktive Virus in KBR und im Neutralisationstest. Fur unsere Rindervakzine verwendeten wir einen frisch isolierten Praxisstamm (0-Hannover 1960). Die Variantenzugehorigkeit dieses Virus konnte in der KBR und im Neutralisa- tionstest nicht bestimmt werden, da es mit den verschiedenen 0, und 0,- Immunseren eine gleichstarke Reaktion zeigte. Im INT reagierte das inakti- vierte Virus dagegen nur mit dem 0,-Immunserum.

Der Antigengehalt der Vakzinen nahm, soweit er mit dem INT gemessen werden konnte, mit zunehmender Lagerungszeit ab. So reagierte die Rinder- vakzine I bis zum 76. Lagerungstag im INT positiv. Ab dem 83. Lagerungstag war der Test mit dem nichtkonzentrierten Eluat negativ. Reicherte man aber nach diesem Zeitpunkt das Eluat 50fach an, so stieg der Antigengehalt und der INT wurde wieder positiv. Ebenso deutlich trat der fortschreitende Antigen- verlust bei der Mausevakzine zutage. Diese Vakzine hatte von Anfang an einen

Nachweis von inaktiviertem Maul- und Klauenseuchevirus 707

unterschwelligen Antigengehalt, der erst nach 50facher Konzentrierung fur einen positiven Test ausreichte. Bis zum 90. Lagerungstag erhielten wir damit eine positive Reaktion. Ab dem 141. Lagerungstag waren die Proben stets negativ. Der Antigenverlust ist wahrscheinlich auf eine allmahlich starker wer- dende Denaturierung des Virusproteins durch Formalin zuruckzufuhren.

Zusammenfassung

Mit Hilfe des indirekten Neutralisationstestes ( INT) war es moglich, das in Vakzinen aus Rindermaterial enthaltene formalininaktivierte MKS-Virus quantitativ nachzuweisen. Der INT wurde jedoch nur dann positiv, wenn der Virusgehalt pro ml Vakzine etwa 106,' LD5o betrug. Unter diesem Schwell- wert erhielt man einen positiven INT nur nach einer 50fachen Konzentrierung des Vakzineeluats. Vakzinen mit einem niedrigeren Virusgehalt als 1 06>' LD~o/ml wurden dabei nicht untersucht. Als beste Konzentrierungsmethode er- wies sich die Fallung mit Ammoniumsulfat, der sich zur Entsalzung des Kon- zentrats eine Dextrangelfiltration anschloi3.

Der I N T war streng typenspezifisch. Daruber hinaus schien das inakti- vierte Virus weitgehend variantenspezifischer zu reagieren als aktives Virus im Neutralisationstest und ,der KBR.

Mit dem INT konnte nachgewiesen werden, dai3 der Antigengehalt der Vakzinen im Laufe der Lagerung allmahlich abnimmt.

A n m e r k u n g : Nach der Veroffentlichung Ides 1. Teils dieser Arbeit, teilte mir Dr. RIVENSON (Inst. de Fiebre Aftosa, Buenos Aires) mit, dai3 er zusammen mit Dr. SEGURA vor etwa 3 Jahren eine Arbeit beendete, deren Titel etwa ,,Technik der indirekten Neutralisation des MKS-Virus" lautet. Diese Arbeit wurde damals nicht in einer Zeitschrift veroffentlicht. Inzwischen erschien sie in der Revista de Investigaciones Ganadera, 1960, S. 187. Die Autoren stellten bei ihrer. Untersuchungen fest, dai3 hitze- und UV-inaktiviertes MKS-Virus neu- tralisierende Antikorper bindet.

Summary

Demonstration of inactivated foot-and-mouth virus by the indirect neutralisation test

11. The indirect test with vaccines from bovine material

The indirect neutralisation test ( INT) enables the formalin inactivated foot-and-mouth virus in vaccines from bovine material to be determined quantitatively. The test is, however, only positive when the virus content per ml. of vaccine is above I06.7 LD,,. Below this concentration the test is positive only if the vaccine is concentrated 50 times. Vaccines with a virus content below lo6.' LD,,/ml. were not studied. The best method of con- centration is precipitation with ammonium sulphate, followed by de-salting with a Dextran gel filter.

The test was strongly type specific. The inactivated virus reacted far more specifically than active virus in the neutralisation test and the com- plement fixation test.

The INT shows that the antigen content of vaccines falls off con- siderably during storage.

708 WITTMANN

RCsumC

La mise en evidence du virus inactive de la fikvre aphteuse au moyen du test de neutralisation indirect

20 communication: l'emploi du test de neutralisation indirect sur des vaccins provenant de materiel bovin

A l'aide du test de neutralisation indirect ( INT) on put mettre en kvicience quantitativement dans des vaccins provenant Ide materiel bovin le virus ide la fikvre aphteusa inactive par le formol. Cependant c= test ne devenait positif que lorsque la teneur en virus par ml de vaccin atteignait environ 106>7 DL,,. Au dessous de cette limite, on n'obtenait un test positif qu'aprks concentration (50 fois) de l'klution vaccinale. O n n'ktudia pas de vaccins ayant une teneur en virus infkrieure A lo6>' DL,,/ml. La meilleure mCthode de concentration est selon ces essais, la precipitation par le sulfate d'ammonium suivie d'une filtration au gel de dextrane pour exrraire les sels minkraux.

Le test de neutralisation indirect se montra rigoureusement spkcifique pour iles diffdrents types de virus. En outre, le virus inactivk parut rkagir d'une manikre nettement plus spkcifique que le virus actif dans le test de neutralisation et la reaction de fixation du complkment.

Le test Ide neutralisation indirect permit de constater que la teneur en antigkne des vaccins diminue progressivement pendant la conservation en mag asin,

Resumen

Identificaci6n del virus inactivado de la glosopeda mediante la prueba indirecta de neutralizaci6n

11. Comunicaci6n: La prueba indirecta de neutralizaci6n con vacunas de material bovino

Con ayuda de la prueba indirecta de neutralizacibn (PIN) result6 posible identificar cuantitativamente el virus de la fiebre aftosa inactivado con formalina contenido en vacunas de material bovino. Sin embargo, la PIN s610 se hacia positiva cuando el contenido virico por ml de vacuna era de unas

DL,,. Por debajo de a t e valor dintd no se lograba una positiva PIN mis que tras una concentraci6n cincuentena del eluato de vacuna. En este aspect0 no se andizaron vacunas con un contenido virico inferior n lo6,' DL,,/ml. El mejor mktodo de concentraci6n result6 ser la precipitaci6n con sulfato amhnico, a la cual sucedi6 una filtraci6n a travks de dextrano gelificado.

La PIN era estrictamente especifica de tipo. Ademis de esto, el virus inactivado parecia reaccionar, en general, mis lespecificamente frente a las variantes que el virus activo en la prueba de neutralizaci6n y en la reacci6n de fijaci6n Idel complemento.

Con la PIN se pudo probar que el Lontenido antigknico de las vacunas decrece gradualmente en el transcurso de su almacenamiento.

Literaturverzeichnis 1. WITTMANN, G., 1959: Zbl. Vet. Med. 6, 797. 2. PYL, G., 1953: Arch. exp. Vet. Me,.

7, 238. 3. MATHEKA, H. D., und G. WITTMANN, 1961: Zbl. Bakt. I Orig. 182, 169. 4a. BEHRENS, B., 1929: Naunyn-Schmiedbergs Arch. exp. Path. Pharmak. 140, 237 4b. KARBER, G., 1931: ibid. 162, 480.

Anschrift des Verfassers: Dr. G. Wittmann, Tubingen a. N., Waldhauser Hohe.