Neue Screening-Systeme für die enantioselektive Bio- und

Neue Screening-Systeme für die

enantioselektive Bio- und Metallkatalyse

DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Abteilung Chemie der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Diplom-Chemiker

MICHAEL H. BECKER aus Bad Hersfeld

Mülheim an der Ruhr

2000

Referent: Professor Dr. Manfred T. Reetz

Korreferent: Professor Dr. Martin Feigel

Tag der mündlichen Prüfung: 31. Januar 2000

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von November 1997 bis Dezember 1999 am

Max-Planck-Institut für Kohlenforschung unter der Leitung von Professor Dr. Manfred T.

Reetz.

Herrn Professor Dr. Manfred T. Reetz danke ich sehr herzlich für die interessante

Themenstellung, die Möglichkeit, selbständig und interdisziplinär unter hervorragenden

Bedingungen zu arbeiten, die gewährte Freiheit bei der Bearbeitung des Themas sowie die

stete Gesprächsbereitschaft bei fachlichen und darüber hinausgehenden Fragen.

Ich danke Herrn Professor Dr. Martin Feigel für die Übernahme des Korreferats und Herrn

Professor Dr. mult. Dr. h. c. Alois Haas für sein Auftreten als Drittprüfer.

Allen Mitgliedern des Arbeitskreises danke ich für die außerordentlich angenehme

Arbeitsatmosphäre, die vielen lebhaften und anregenden Diskussionen fachlicher und nicht

fachlicher Art sowie die gemeinsamen Unternehmungen innerhalb und außerhalb des

Ruhrgebiets.

Der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. danke ich für das mir

gewährte Promotionsstipendium.

Herrn Heinz-Werner Klein und Herrn Dr. Detlef Stöckigt danke ich sehr herzlich für die

Einführung in die ESI-Massenspektrometrie und die fruchtbare Zusammenarbeit im Rahmen

des ESI-MS-Screenings.

Frau Dr. Sophie Haebel vom Interdisziplinären Forschungszentrum für Biopolymere der

Universität Potsdam danke ich sehr für die Zusammenarbeit und die Durchführung der

MALDI-TOF-MS-Messungen.

Herrn Professor Dr. Alois Fürstner und Frau Monika Liebl danke ich für die gute

Zusammenarbeit im Rahmen der IR-thermographischen Untersuchungen zur Ringschluss-

Olefin-Metathese.

Den Mitarbeitern der Abteilung für Gaschromatographie bin ich für die Durchführung

zahlreicher Analysen zu Dank verpflichtet. Besonders bedanken möchte ich mich bei Herrn

Heribert Husmann für die Durchführung und Optimierung zahlreicher GC-Analysen sowie

die unkomplizierte Kooperation.

Bei Frau Heike Hinrichs, Frau Roswitha Köhler, Herrn Georg Breitenbruch und Herrn

Dipl. Ing. Alfred Deege aus der Abteilung für Flüssigkeitschromatographie möchte ich mich

für Durchführung zahlreicher Analysen bedanken.

Herrn Dr. Arnold Holzwarth danke ich für die Einführung in die Bedienung der IR-

Thermographie-Kamera.

Herrn Dr. Klaus Kühling gebührt mein Dank für die vielen fachlichen, anregenden und

kritischen Diskussionen, die gute Zusammenarbeit und nicht zuletzt für die kulinarischen

Exkursionen im Ruhrgebiet.

Für promptes Korrekturlesen dieser Arbeit sowie hilfreiche und kritische Kommentare

bedanke ich mich herzlich bei meinen Kolleginnen und Kollegen Dr. Gerd Haderlein, Dr.

Klaus Kühling, Gerlinde Mehler, Carsten Rüggeberg, Dr. Elke Westermann und Stephanie

Wilensek.

Bei meinem Kollegen Marcus Hermes bedanke ich mich sehr für die computertechnische und

sonstige Unterstützung sowie die gute Stimmung in Büro und Labor.

Meinem Praktikanten Herrn Karsten Körber danke sehr herzlich für sein großes Engagement

und die sorgfältige Arbeit.

Meinen Eltern und Großeltern danke ich für ihre Unterstützung während meines gesamten

Studiums.

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

„Zeitaufgelöste IR-thermographische Detektion und Screening von enantioselektiven

katalytischen Reaktionen“ M. T. Reetz, M. H. Becker, K. M. Kühling, A. Holzwarth, Angew.

Chem. 1998, 110, 2792-2795; Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2647-2650.

„Eine Methode zum High-Throughput-Screening von enantioselektiven Katalysatoren“

M. T. Reetz, M. H. Becker, H.-W. Klein, D. Stöckigt, Angew. Chem. 1999, 111, 1872-1875;

Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1758-1761.

„IR-Thermographie-Screening von thermoneutralen oder endothermen Reaktionen: Die

Ringschluss-Olefin-Metathese“ M. T. Reetz, M. H. Becker, M. Liebl, A. Fürstner, Angew.

Chem. 2000, 112, im Druck.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis I

Abkürzungsverzeichnis VI

1 EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG 1

1.1 Kombinatorische Chemie und Katalyse 1

1.2 Gerichtete Evolution von Enzymen 2

1.2.1 Strategie 2

1.2.2 Mutagenesemethoden 7

1.2.3 Expressionssysteme 9

1.2.4 Gerichtete Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität von Enzymen 9

1.3 Screening-Systeme für enantioselektive Katalysatoren 12

1.3.1 Vorbemerkungen 12

1.3.2 Screening-Systeme für die enantioselektive kombinatorische Homogen-

katalyse 12

1.3.3 Screening- Systeme für die enantioselektive Biokatalyse 14

1.4 Aufgabenstellung 22

2 IR-THERMOGRAPHIE-SCREENING 27

2.1 Einleitung 27

2.2 Physikalische Grundlagen 27

2.3 IR-Thermographiesysteme 30

2.3.1 Optik 30

2.3.2 Detektoren und Wärmebildaufnahme 30

2.3.3 Korrektur von Störfaktoren 31

2.4 Bisherige Anwendungsbeispiele der IR-Thermographie in der Chemie 32

II Inhaltsverzeichnis

2.5 Zielsetzung der eigenen Arbeiten 34

2.6 Experimenteller Aufbau 35

2.7 Zeitaufgelöstes IR-Thermographie-Screening katalytischer Prozesse in Lösung 36

2.7.1 Lipasekatalysierte Acylierung 36

2.7.2 Übergangsmetallkatalysierte Reaktionen in Lösung 41

2.7.2.1 Enantioselektive hydrolytische Ringöffnung von Epoxiden 41

2.7.2.2 Rutheniumkatalysierte Ringschluss-Metathese von Olefinen 49

2.7.3 Zusammenfassung der IR-thermographischen Untersuchungen und Ausblick 60

3 ESI-MS-SCREENING AUF ENANTIOSELEKTIVITÄT 65

3.1 Allgemeine Bemerkungen 65

3.2 Massenspektrometrische Methoden in der kombinatorischen Chemie und

Katalyse 66

3.2.1 Messtechniken 66

3.2.2 Anwendungen der MS in der kombinatorischen Chemie 68

3.2.3 Screening von homogenen und heterogenen Katalysator-Bibliotheken 69

3.3 Zielsetzung der eigenen Arbeiten 71

3.4 MS-Screening auf Enantioselektivität 71

3.4.1 Allgemeine Bemerkungen 71

3.4.2 Mögliche Anwendungsgebiete der Methode 74

3.4.3 Genauigkeit der ee-Bestimmung 79

3.4.4 Einfluss der Isotopenmarkierung auf die Enantioselektivität 81

3.4.5 Anwendungsbeispiele der Methode 84

3.4.5.1 Beispiele zum Screening auf Enantioselektivität von kinetischen

Racematspaltungen 85

3.4.5.2 Beispiel zum Screening asymmetrischer Reaktionen einer prochiralen

Verbindung 98

3.4.6 Apparativer Aufbau des Screening-Systems 109

3.4.7 Screening auf Enantioselektivität durch MALDI-TOF-MS 111

Inhaltsverzeichnis III

3.4.8 Zusammenfassung und Ausblick 115

4 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 119

5 EXPERIMENTELLER TEIL 125

5.1 Allgemeine Vorbemerkungen 125

5.1.1 Verwendete Lösemittel und Chemikalien 125

5.1.2 Verwendete Enzyme 127

5.1.3 Puffer 127

5.1.4 Verwendete Geräte für enzymatische Reaktionen 127

5.1.5 Darstellung literaturbekannter Verbindungen 127

5.1.6 Analytische Methoden 128

5.1.6.1 Kernresonanzspektroskopie (NMR) 128

5.1.6.2 Massenspektrometrie (MS) 128

5.1.6.3 Infrarotspektroskopie (IR) 128

5.1.6.4 Elementaranalysen 129

5.1.6.5 Gas- und Flüssigkeitschromatographie (GC und LC) 129

5.1.6.6 Säulenchromatographische Methoden 129

5.2 Synthesen 130

5.2.1 Synthese von (S)-1-Phenylethylacetat ((S)-26) 130

5.2.2 Synthese von (R)-1-Phenylethyltrideuteracetat ((R)-79) 131

5.2.3 Synthese von (4R)-Benzyl-3-N-benzyloxy-2-oxazolidin-2-on (95) 132

5.2.4 Synthese von (4R)-Benzyl-3N-((2R)-3,3,3-trideutero-2-phenylpropionyl)-

oxazolidin-2-on (96) 133

5.2.5 Synthese von (R)-3,3,3-Trideuteromethyl-2-phenylpropionsäure ((R)-91) 134

5.2.6 Kinetische Racematspaltung zur Darstellung von (1R)-Tetradeutero-

(1,2,2,2)-1-Phenylethylacetat ((R)-98) und (1S)-Tetradeutero-

(1,2,2,2)-1-Phenylethanol ((S)-97) 135

5.2.7 Synthese von 1-Brom-5,5,5-trideutero-pentan (104) 136

5.2.8 Synthese von 5,5,5-Trideuteropentylmagnesiumbromid (105) 137

5.2.9 Synthese von (S)-8,8,8-Trideutero-2-octanol ((S)-101) 137

IV Inhaltsverzeichnis

5.2.10 Synthese von (4R)-Benzyl-3N-((2R)-3,3,3-trideuteromethyl-2-decanoyl)-

oxazolidin-2-on (113) 139

5.2.11 Synthese von (R)-2,2,2-Trideuteromethyldecansäure ((R)-108) 140

5.2.12 Synthese von (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-pyrrolidin

(L-BOC-Prolinol, (S)-116) 141

5.2.13 Synthese von (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-(hexadecanoyloxymethyl)-

pyrrolidin ((S)-114) 141

5.2.14 Synthese von 1-Bromo-15,15,15-trideuteropentadecan (123) 142

5.2.15 Synthese von 15,15,15-Trideuterohexadecansäure ([D]3-Palmitinsäure (118)) 143

5.2.16 Synthese von (R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-pyrrolidin

(D-BOC-Prolinol, (R)-116) 144

5.2.17 Synthese von (R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-(16,16,16-trideuterohexa-

decanoyloxymethyl)-pyrrolidin ((R)-115) 145

5.2.18 Synthese von (1S,4R)-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (86) 146

5.2.19 Synthese von (1S,4R)-cis-1-Trideuteroacetoxy-4-acetoxy-2-cyclopenten (84) 147

5.2.20 Synthese von (1R,4S)-cis-1-Trideuteroacetoxy-4-acetoxy-2-cyclo-

penten (127) 148

5.2.21 Synthese von (S,S)-1,1'-Binaphthyl-2,2'-diacetat ((S,S)-129) 148

5.2.22 Synthese von (R,R)-1,1'-Binaphthyl-2,2'-bis(trideuteroacetat) ((R,R)-130) 149

5.3 IR-Thermographie-Screening 151

5.3.1 Experimenteller Aufbau 151

5.3.1.1 IR-Kamera 151

5.3.1.2 Schüttler 151

5.3.2 Durchführung der zeitaufgelösten IR-Thermographiemessungen 152

5.3.2.1 Allgemeine Bemerkungen zur Durchführung der IR-Thermographie-

messungen 152

5.3.2.2 Untersuchung der lipasekatalysierten enantioselektiven Acylierung von

1-Phenylethanol (26) 153

5.3.2.3 Untersuchung der enantioselektiven hydrolytischen Ringöffnung von

Epichlorhydrin (42) 154

Inhaltsverzeichnis V

5.3.2.4 Untersuchung der relativen Substrataktivität der Co-(S,S)-Salen-(30)-

katalysierten enantioselektiven hydrolytischen Ringöffnung 155

5.3.2.5 Untersuchung der rutheniumkatalysierten Ringschlussmetathese von

1,7-Octadien (52) 155

5.3.2.6 Katalysator-/Substrat-Screening der rutheniumkatalysierten Ringschluss-

metathese von Malonsäureesterderivaten 157

5.4 ESI-MS-Screening auf Enantioselektivität 158

5.4.1 Allgemeine Bemerkungen 158

5.4.1.1 ESI-Massenspektrometer 158

5.4.1.2 Allgemeine Bemerkungen zur Aufnahme der ESI-Massenspektren 158

5.4.1.3 MALDI-TOF-Massenspektrometrische Untersuchungen 158

5.4.2 Untersuchungen zum Screening auf Enantioselektivität 159

5.4.2.1 Bestimmung des Enantiomerenüberschusses synthetischer Mischungen der

pseudo-enantiomeren 1-Phenylethanole (S)-28 und (R)-79 159

5.4.2.2 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Veresterung von

2-Phenylpropionsäure rac-89 und (S)-89/(R)-91 159

5.4.2.3 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung

von 1-Phenylethanol rac-26 und (S)-97/(R)-26 160

5.4.2.4 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung

von 2-Octanol rac-99 und (S)-101/(R)-99 161

5.4.2.5 Lipasekatalysierte Veresterung von 2-Methyldecansäure (S)-107/(R)-108 162

5.4.2.6 Esterasekatalysierte Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 84 162

5.4.2.7 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Hydrolyse des meso-

Diacetats 125 und des pseudo-meso-Diacetats 84 163

5.4.2.8 Vergleichsexperiment der lipasekatalysierten Hydrolyse des meso-

Diactats 125 und der pseudo-meso-Diacetate 84 und 127 164

5.4.2.9 MALDI-TOF-Untersuchungen zum Screening auf Enantioselektivität 165

6 LITERATURVERZEICHNIS 169

VI Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Äq. Äquivalent(e)

Ar Arylrest

ber. berechnet

bs breites Singulett (NMR)

COD cis, cis-1,5-Cyclooctadien

d Dublett (NMR)

dt Dublett eines Tripletts (NMR)

ee Enantiomeric Excess

EA Elementaranalyse

E. coli Escherichia coli

ESI Elektrospray-Ionisation

GC Gaschromatographie

h Stunde(n)

HPLC High Performance Liquid Chromatography

i. D. im Durchmesser

IR infrarot, Infrarotspektroskopie

Irel relative Intensität

KAP kapillare Messung (IR)

Kap. Kapitel

KBr als Kaliumbromidpressling vermessen (IR)

m Multiplett (NMR), medium (IR)

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight

min Minute(n)

MS Massenspektrometrie

m/z Masse/Ladung

MTBE tert-Butylmetylether

MTP Mikrotiterplatte

NMR Nuclear Magnetic Resonance

Inhaltsverzeichnis VII

PCR Polymerase Chain Reaction

Ph Phenylrest

rac racemisch

rel. relativ

rel. Int. relative Intensität

Rf Ratio of Fronts (DC)

RT Raumtemperatur

s Sekunde(n), Singulett (NMR), strong (IR)

t Triplett (NMR)

Tab. Tabelle

THF Tetrahydrofuran

w weak (IR)

Kapitel 1

Einleitung und Aufgabenstellung

1.1 Kombinatorische Chemie und Katalyse 1

1 Einleitung und Aufgabenstellung

1.1 Kombinatorische Chemie und Katalyse

Ein wachsender Wettbewerb in der pharmazeutischen Chemie und Agrochemie erfordert eine

immer raschere Entwicklung neuer Wirkstoffe, Testverfahren und ein schnellere

Markteinführung der Produkte, um letztendlich durch geringere Forschungs- und

Entwicklungskosten in der Wirkstoffforschung dem Druck der Mitbewerber standhalten zu

können. Die kombinatorische Chemie[1-4] hat nicht zuletzt deswegen die Entwicklung neuer

Leitstrukturen und Wirkstoffe innerhalb dieser Zweige der chemischen Industrie in den

letzten Jahren maßgeblich beeinflusst und verändert.

Unter kombinatorischer Chemie in der Wirkstoffforschung wird die effiziente Synthese

großer Substanzbibliotheken von Molekülen mit mehr oder weniger ähnlichen chemischen,

physikalischen und strukturellen Eigenschaften durch unterschiedliche Verfahren

verstanden.[1-4] Während in den Anfängen dieses relativ neuen Konzepts zur Generierung

neuer Strukturen die Synthese im Vordergrund stand, wird heute das rasche parallele und

empfindliche Testen der Substanzbibliotheken zur Identifizierung von Leitstrukturen mit den

gewünschten Eigenschaften (High-Throughput-Screening, HTS oder Hochdurchsatz-Tests)

dazu gezählt.[5] Nach einem Primär-Screening werden die Leitstrukturen durch

kontinuierliche Veränderungen z. B. der Struktur oder Konzentration weitgehend optimiert

und anschließend in einem weiteren Sekundär-Screening erneut getestet. Die Hits, d. h. die

Verbindungen der Leitstrukturoptimierung, die sich in den Tests wiederum als diejenigen mit

den optimalen Eigenschaften herausgestellt haben, werden anschließend in größeren Mengen

synthetisiert und eingehender charakterisiert. Die High-Throughput-Screening-Verfahren

stellen nicht nur ein wichtiges Teilgebiet in der kombinatorischen Wirkstoffforschung dar. In

immer stärkerem Maße werden kombinatorische Methoden zur Entwicklung neuer

Materialien[6-13] und neuer homogener und heterogener und insbesondere enantioselektiver

Katalysatoren[6,10,13-23] eingesetzt. Die wachsende Zahl an Publikationen auf diesem

Forschungsgebiet spiegelt das große Interesse an neuen oder verbesserten Materialien und

Katalysatoren wider.

2 1 Einleitung und Aufgabenstellung

Ein Grund für die zunehmenden Forschungsaktivitäten auf dem Gebiet der kombinatorischen

enantioselektiven Katalyse liegt nicht zuletzt in der ebenfalls wachsenden Bedeutung chiraler

Wirkstoffe. Im Jahr 1998 wurden mit chiralen Verbindungen weltweit über 96 Milliarden

US$ erwirtschaftet und für das Jahr 2000 wird mit einem Marktvolumen von mehr als 100

Milliarden US$ gerechnet.[24] Aufgrund von möglichen unterschiedlichen physiologischen

Wirksamkeiten der Enantiomere und strengen Richtlinien der Gesetzgeber für chirale

pharmazeutische Produkte, gewinnen Syntheseverfahren, die enantiomerenreine Substanzen

liefern, immer mehr an Bedeutung.

Der Zugang zu solchen chiralen Verbindungen ist auf vielfältige Weise möglich.[25]

Besonders attraktiv sind zum einen die asymmetrische Synthese und zum anderen die

Spaltung des Racemats in die optisch aktiven Antipoden. Sowohl für die asymmetrische

Synthese als auch für Racematspaltungen gibt es oftmals metallkatalysierte oder

biokatalysierte Verfahren. Doch entsprechen die Eigenschaften eines bekannten Katalysators

nicht immer den Anforderungen einer effizienten Synthese. So zeigen diese beispielsweise

eine zu geringe Aktivität oder Selektivität in der gewünschten Umsetzung. Mittlerweile ist

eine ganze Reihe von Beiträgen erschienen, die über die Anwendung kombinatorischer

Synthesemethoden (z. B. Festphasen-Parallelsynthese, „Split-and-mix“-Methode, „Split-and-

pool“-Methode oder Kodierungs-/Dekodierungsverfahren) zur Generierung einer

Ligandenbibliothek für neue oder optimierte Homogenkatalysatoren und Enzymmimetika

berichten.[13] Im Anschluss daran erfolgt eine Komplexierung des entsprechenden

Metallprecursors und das Testen der katalytischen Aktivität und/oder Stereoselektivität in

einer bestimmten chemischen Umsetzung (vgl. Kapitel 1.3). Wie in der Wirkstoffforschung

stellt auch hier die Entwicklung neuer geeigneter und effizienter Testverfahren, die eine

Suche und Optimierung des Katalysators mit den erforderlichen Eigenschaften in kurzer Zeit

ermöglicht, eine große Herausforderung dar, denn bislang stellen die zur Verfügung

stehenden Assays den „Flaschenhals“ in diesen kombinatorischen Ansätzen dar.

1.2 Gerichtete Evolution von Enzymen

1.2.1 Strategie

Ein anderer, ebenfalls „kombinatorischer“ Ansatz zur Erzeugung enantioselektiver

Biokatalysatoren besteht in der gerichteten Evolution von Enzymen (o. a. Directed Evolution,


Evolution im Reagenzglas).[26-32] Dabei werden durch molekularbiologische Methoden

Enzymbibliotheken erzeugt, die in Kombination mit geeigneten Assays die Identifizierung

verbesserter Biokatalysatoren ermöglichen. Im Unterschied zu dem seit längerem etablierten

rationalen Ansatz der ortsspezifischen Mutagenese (vgl. Kapitel 1.2.2) sind für diesen

evolutiven Mutageneseprozess weder Kenntnisse über die Struktur des Enzyms noch über den

möglichen Katalysemechanismus notwendig.

Neben Beispielen, die eine Verbesserung der Stabilität im organischen Lösemittel, eine

Änderung der Aktivität, sowie die Thermostabilität von Enzymen zum Ziel hatten,[31,33-36] ist

für die Entwicklung neuer Biokatalysatoren für die Synthese chiraler Verbindungen die

Änderung der natürlichen Substratspezifität und insbesondere die Verbesserung der

Stereoselektivität einer bestimmten enzymkatalysierten chemischen Reaktion von

besonderem Interesse.[34,37-39] Die für chemische Anwendungen zur Verfügung stehenden

Enzyme sind sehr vielfältig, z. B. Hydrolasen (z. B. Lipasen, Esterasen oder Amidasen),

Oxidoreduktasen, Oxinitrilasen, Aldolasen oder Transferasen.[40-43] Die am besten

untersuchte Enzymklasse ist die der Hydrolasen, nicht zuletzt durch deren Bedeutung für die

Racematspaltung von chiralen Estern, Säuren, Aminen und Alkoholen. Erwähnenswert in

diesem Zusammenhang sind die industriell durchgeführten Racematspaltungen, z. B. die der

BASF für die Darstellung chiraler Amine[44,45] und die im Tanabe-Sepracor-Prozess zur

Herstellung einer chiralen Zwischenstufe für die Darstellung des Calciumantagonisten

Diltiazem[46].

Den Ausgangspunkt der gerichteten Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität eines

Biokatalysators stellt der Wildtyp des Enzyms dar, der in einer gewünschten asymmetrischen

Transformation oder einer kinetischen Racematspaltung einen geringen oder gar keinen

Enantiomerenüberschuss aufweist. Mit der DNA des Wildtyps wird mittels

molekularbiologischer Zufallsmutagenese-Methoden der für das entsprechende Enzym

kodierende Genabschnitt der DNA verändert (vgl. Kapitel 1.2.2) und auf diese Weise eine

Bibliothek von Genmutanten erzeugt. Nach Ligation der Mutantenbibliothek in einen Vektor

und Transformation von einem geeigneten bakteriellen Expressionssystem mit einem Vektor

(vgl. Kapitel 1.2.3) werden auf Agarplatten Bakterienkolonien erhalten, deren Zellen Klone

einer einzigen Zelle darstellen (somit nur eine Enzymmutante produzieren können). Nach

einer ersten Selektion durch ein Wachstumsassay (vgl. Kapitel 1.3.1) werden die Mutanten

von den Agarplatten zur „Enzymproduktion“ in Mikrotiterplatten überführt, mit Nährlösung


versetzt und kultiviert. Zur Durchführung der enzymkatalysierten Reaktion wird ein Teil des

enzymhaltigen Kulturüberstands eines jeden Wells (Troges) der Mikrotiterplatte zusammen

mit einer Puffer- und entsprechender Substratlösung in eine weitere Mikrotiterplatte

überführt. Durch ein anschließendes Screening (vgl. Kapitel 1.3) wird nun die Mutante der

Mutantenbibliothek mit einer gegenüber dem Wildtyp verbesserten Enantioselektivität

identifiziert. Die in der ersten Generation gefundenen Enzymvarianten können in weiteren

Runden der Mutagenese optimiert werden (Abb. 1.1).

Abb. 1.1: Allgemeines Schema zur Durchführung der gerichteten Evolution.

Durchführung der enzymkatalysierten

Reaktion in Mikrotiter-platten und Screening

(z. B. auf ee)

Identifizierung und Isolierung der positiven

Mutanten und Wiederholung des

Prozesses (Ausgangspunkt für

nächsten Zyklus)

Einführung von Mutationen (x)

Ligation der mutierten Gene in

Vektoren

Selektion der positiven Mutanten auf Agar, Überführung und

Kultivierung in Mikrotiterplatten

Transformation des geeigneten

Expressionssystems und Anzucht der Bakterien auf

Agarplatten

Wildtyp- bzw. Mutanten-Gen

x

DNA

Enzym

RNA

x

x x

x x

x

x

x

x

x

x

x


Dieser Vorgang aus Generierung einer Bibliothek von mutierten Genen, der Expression dieser

Gene in einem geeigneten Organismus und der Identifizierung der Gene durch Screening oder

Selektion, die zu den Enzymen mit verbesserten Eigenschaften führen, wird so lange

wiederholt, bis eine Mutante mit ausreichender Enantioselektivität für die jeweilige

enzymatische Umsetzung erhalten wird (Abb. 1.2).

Abb. 1.2: Schematische Darstellung der sequentiellen Erhöhung der Enantioselektivität einer enzymkatalysierten Reaktion durch mehrere Mutagenesezyklen.

Es ist jedoch nicht gesagt, dass eine weniger selektive (z. B. die zweit- oder drittbeste)

Mutante einer Generation nicht einen (absolut betrachtet) günstigeren Ausgangspunkt für

weitere Mutagenesezyklen darstellen könnte. In nachfolgenden Generationen könnte dadurch

ein Biokatalysator mit einer höheren Selektivität entstehen als bei einer Auswahl der jeweils

besten Mutante eines Evolutionszyklus. Aufgrund einer schrittweisen Optimierung kann aber

nur die relativ beste und nicht die absolut gesehen beste Mutante einer Generation identifiziert

werden. Abhilfe schaffen könnten hier rekombinative Mutageneseverfahren (vgl. Kapitel

1.2.2), bei denen mehrere positive („beste“) Mutanten den Ausgangspunkt für die folgende

Generation darstellen (Molecular Breeding).

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6

Mutanten-Generation

ee / %

Wildtyp 1 2 3 4 5


Die Anzahl möglicher Enzymvarianten, die durch gerichtete Evolution erzeugt werden

können, steigt exponentiell mit der Zahl der Aminosäuren des Enzyms, die während eines

Mutagenesezyklus gleichzeitig ausgetauscht werden. Im Fall einer in unserer Arbeitsgruppe

verwendeten Lipase aus P. aeruginosa PAO1 mit 285 Aminosäuren würde eine komplette

Substitution aller im Enzym vorkommenden Aminosäuren gegen alle verbleibenden 19

anderen eine Bibliothek von 20285 Enzymmutanten ergeben. Dies ist eine unvorstellbar hohe

Zahl. Unter Berücksichtigung aller Permutationen beträgt dagegen die Anzahl an Mutanten

eines Enzyms, bei denen in jeder Enzymmutante nur eine Aminosäure gegen eine der 19

restlichen randomisiert ausgetauscht wird, nach Gleichung 1.1[31]

N = 19M Â X!/[(X-M)!M!] Gleichung 1.1

mit N = Anzahl der Mutanten, M = Anzahl der gleichzeitig ausgetauschten Aminosäuren pro

Enzymmutante (hier M = 1) und X = Anzahl der Aminosäuren im Enzym (hier X = 285),

theoretisch nur 5415. Durch die Degenerierung des genetischen Kodes ist es jedoch

unmöglich, durch Mutationsverfahren wie epPCR (vgl. Kapitel 1.2.2) eine Bibliothek zu

generieren, die alle 5415 Mutanten enthält. Selbst eine Erhöhung der Mutationsrate schafft

keine Abhilfe des Problems, nicht alle möglichen Enzymmutanten in einer Bibliothek zu

erfassen, denn schon eine Mutationsrate von zwei Substitutionen von Aminosäuren pro

Enzymmutante würde nach obiger Gleichung zu einer Zahl von > 15 Millionen zu testenden

Varianten führen. Das Testen einer solchen Anzahl ist mit den bisher bekannten Selektions-

und Screening-Systemen (vgl. Kapitel 1.3) in einem überschaubaren Zeitrahmen nicht

möglich.

Die Voraussetzungen für eine erfolgreiche gerichtete Evolution zur Herstellung eines Enzyms

mit verbesserten Eigenschaften sind neben möglichst effizienten Mutationsstrategien und der

funktionellen Expression des Proteins in einem mikrobiellen Wirtsorganismus ein schnelles

und zuverlässiges Testsystem zur Identifizierung der positiven Enzymvarianten aus einer

„Bibliothek“ von mehreren Tausend oder gar Millionen Mutanten.


1.2.2 Mutagenesemethoden

Für die zufällige Einführung von Mutationen in die für ein Enzym kodierenden DNA-

Abschnitte (Gene) stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung, deren Prinzipien hier

kurz erläutert werden sollen.[39]

Sind detaillierte Kenntnisse über die dreidimensionale Struktur, die Funktionsweise und die

Bedeutung einzelner Aminosäuren eines Enzyms bekannt, ist der Einsatz der ortsgerichteten

Mutagenese von Vorteil, die den Austausch, die Einführung oder das Entfernen eines oder

mehrerer Nukleotide innerhalb eines Gens erlaubt und somit zu einer veränderten

Aminosäuresequenz führt.[47-51] Häufig ist eine (oder einige wenige) spezifische

Aminosäure(n) eines Enzyms für die katalytische Aktivität verantwortlich. Jedoch ist eine

Vorhersage des Aminosäuresaustauschs (d. h. den Austausch einer Aminosäure gegen eine

der restlichen 19), der zu einer Verbesserung der gewünschten Eigenschaften führt, derzeit

unmöglich, insbesondere, wenn es um den schwierigen Parameter Enantioselektivität geht.

Durch Anwendung von Sättigungsmutagenese, bei der die für die unterschiedlichen

Aminosäuren kodierenden Basentripletts in die entsprechende Gensequenz eingeführt werden,

kann an einer vorgegebenen Position im Protein die dort vorhandene Aminosäure gegen die

restlichen 19 Vertreter ausgetauscht werden.[52-54]

Ist eine bestimmte Aminosäuressubsequenz definierter Länge für die katalytische Aktivität

eines Proteins verantwortlich, kann eine Veränderung dieses Abschnitts unter Umständen zu

optimierten Eigenschaften führen. Durch Anwendung von Kassettenmutagenese, bei der ein

bestimmter Genabschnitt durch PCR-Methoden unter Verwendung mutagener Kassetten

(Oligonukleotiden mit zufälligen Kodons) in den Genabschnitt kloniert wird, ist ein

Austausch von drei bis zu mehreren hundert Nukleotiden, die entsprechend eine bis zu

mehreren hundert Aminosäuren kodieren, möglich.[55-59]

Sind weder die Sekundär- noch die Tertiärstruktur eines Enzyms bekannt, stehen für die

gerichtete Evolution mehrere Methoden zur Verfügung: (a) nicht-rekombinative Methoden

wie fehlerhafte PCR (error-prone PCR, epPCR)[26,60-62], Amplifizierung des Gens in

bakteriellen Mutationsstämmen (Bacterial Mutator Strains)[63] oder (b) rekombinative

Methoden wie DNA-Shuffling[29,64-66] oder der Staggered Extension Process[67,68].

Während bei der fehlerhaften PCR absichtlich durch ein von der „normalen“ PCR

abweichendes PCR-Protokoll (d. h. Veränderung der Salz-, Nukleotid- oder Taq-Polymerase-

Konzentration) höhere Fehlerraten bei der Amplifizierung der DNA herbeigeführt werden,


wird bei Verwendung von bakteriellen Mutationsstämmen die genetische Veränderung durch

Ausschalten von DNA-Reparaturmechanismen der verwendeten Stämme erzeugt.

Bei Anwendung rekombinativer Methoden werden Veränderungen der Gensequenz durch

Bruch und erneutes Zusammenfügen von sich unterscheidender DNA in einer neuen

Kombination hervorgerufen. Der Grad der evolutiven Veränderungen ist dabei besonders

hoch und die Methode erfordert sowohl im Fall einer homologen Rekombination (d. h. einer

Rekombination zwischen identischen oder veränderten DNA-Sequenzen eines Organismus)

als auch einer nicht homologen Rekombination (d. h. von DNA-Bruchstücken aus

verschiedenen Organismen, sog. Family-Shuffling) verschiedene Enzyme zum Bruch der

DNA bzw. zur Rekombination der DNA-Fragmente. Prominente Beispiele für solche

rekombinative Mutationsverfahren sind zum einen das DNA-Shuffling, bei dem verwandte

Gene mit verschiedenen (positiven) Mutationen durch das DNA-Verdauungsenzym DNAse I

zufällig fragmentiert werden und anschließend Gensequenzen rekombiniert werden, deren

positive Mutationen wiederum als Startpunkt für weitere Runden von Mutationen und

Rekombinationen dienen können. Zum anderen können durch den Staggered Extension

Process (STEP) Rekombinationen durch eine verkürzte PCR-artige Reaktion erzeugt werden.

Dabei wird ein definierter Primer zusammen mit Templat-DNA, die ein oder mehrere Gene

enthalten kann, einer extrem verkürzten PCR zur Verlängerung des Primers durch DNA-

Polymerase unterworfen.[67] Die erzeugten kurzen DNA-Fragmente können sich nun

wiederum an neue DNA-Template anlagern und werden weiteren Zyklen der Primer-

Verlängerung solange unterworfen, bis Gensequenzen voller Länge gebildet werden, die als

Ausgangspunkt für die herkömmliche PCR dienen. Eine weitere rekombinative Methode stellt

die Random-Priming Recombination (RPR) dar.[68] Dabei werden Zufalls-Primer verwendet,

um kurze, ca. 50-500 Basen lange DNA-Fragmente zu erzeugen, die komplementär zu

bestimmten DNA-Abschnitten eines Gens sind. Im weiteren können diese DNA-Fragmente,

die durch fehlerhafte Anlagerung der Primer (Mispriming) und fehlerhaften Einbau ebenfalls

Mutationen tragen, aneinander binden. Durch Verwendung einer DNA-Polymerase und durch

eine wiederholte PCR-analoge Reaktion werden vollständige Genabschnitte erhalten.


1.2.3 Expressionssysteme

Einen weiteren wichtigen Bestandteil der gerichteten Evolution von Enzymen stellt die

Expression der zuvor mutierten Gene eines Proteins in einem geeigneten Wirtsorganismus

dar, denn erst in solch einem Expressionssystem kann das Enzym in ausreichenden Mengen

„produziert“ und anschließend (nach Sekretion in das Kulturmedium oder nach Lyse der

Zellmembran des Wirtsorganismus) auf die gewünschte Eigenschaft getestet werden.[31,69]

Die gewünschten Gene (hier die Mutanten-Genbibliothek eines Enzyms, z. B. einer Lipase)

werden in Plasmide (ringförmige DNA) hinter einen geeigneten Promoter kloniert, der die

Transkription des Proteins steuert und gezielt an- oder ausgeschaltet werden kann und so die

Expression des Enzyms kontrolliert. Der Expressionsstamm, oftmals Escherichia coli (E.

coli), wird mit dem Plasmid transformiert (vgl. Abb. 1.1). Durch Zugabe bestimmter

chemischer Induktoren wie z. B. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird nun der

Promoter (und damit auch die Transkription des jeweiligen Genabschnitts in die mRNA und

die Translation der mRNA zum Protein) aktiviert oder auch unterdrückt. Das nach

Transkription und Translation gebildete Enzym wird durch „Helferenzyme“ (die neben der

Sekretion auch die korrekte Faltung des Enzyms bewirken) in den Kulturüberstand

ausgeschleust. Jedoch wird oft nach Expression eines Enzyms, welches ursprünglich aus

einem anderen Organismus stammt (wie im Fall der Lipase aus Pseudomonas aeruginosa), in

E. coli katalytisch weniger aktive oder gar inaktive Enzyme erhalten.[69] Neben dem vielfach

verwendeten GRAM-negativem Bakterium E. coli stehen auch GRAM-positive

Expressionssysteme wie z. B. Bacillus zur Verfügung, deren zellulärer Aufbau sich durch das

Vorhandensein von nur einer Zellmembran prinzipiell von den GRAM-negativen Bakterien

wie E. coli unterscheidet, gleichzeitig aber eine direkte (d. h. ohne eine Beteiligung durch

zusätzliche Helferproteine) Sekretion des gebildeten Enzyms in das Kulturmedium

ermöglicht.

1.2.4 Gerichtete Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität von

Enzymen

In einem ersten Beispiel zur Steigerung der Enantioselektivität von einer enzymkatalysierten

reduktiven Aminierung eines substituierten β-Tetralons 1 zum Aminotetralin 2 konnte durch

Einführung von Mutationen in eine Transaminase die Selektivität durch Anwendung von


ortsgerichteter Mutagenese in nur einer Runde von 65 % auf 98 % zugunsten des S-

Enantiomers 2 erhöht werden (Schema 1.1).[70,71]

Schema 1.1: Enantioselektive reduktive Aminierung von 1 durch eine Transaminase.[70,71]

Zum Screening wurde die parallel durchgeführte Rückreaktion der enantiomerenreinen

Aminotetraline zum prochiralen chromophoren Tetralon untersucht, dessen Bildungs-

geschwindigkeit photometrisch untersucht werden konnte. Dieses System beinhaltet jedoch

keine Evolution, denn nur ein Mutagenese-Runde war erforderlich.

Das erste Beispiel der Anwendung der gerichteten Evolution zur Erhöhung der

Enantioselektivität von enzymkatalysierten Reaktionen durch mehrere Runden der

Mutagenese konnte in einer Kooperation unserer Arbeitsgruppe mit der von JÄGER an der

Ruhr-Universität Bochum in einer Modellreaktion gezeigt werden.[37,72] Dabei wurde die

lipasekatalysierte Hydrolyse des racemischen 2-Methyldecansäure-p-nitrophenylesters (3) zur

korrespondierenden (S)-Säure 4 in wässrigem Puffer untersucht (Schema 1.2).

Schema 1.2: Lipasekatalysierte Hydrolyse von rac-2-Methyldecansäure-p-nitrophenylester (rac-3).[37,72]

1 2

rac-3 4 (S)-3

5

O NH2

2-Amino- butan

Methylethyl- keton

Transaminase

+

R = C8H18

O

OR

O

O

NO2

RO

O

NO2

R Lipase

wässriger Puffer pH 7.5

O NO2+ -

-


Die für die Untersuchungen verwendete Hydrolase war die aus 285 Aminosäuren bestehende

bakterielle Lipase aus P. aeruginosa PAO1, deren Wildtyp in der Hydrolyse einen

Enantiomerenüberschuss von 2 % (E-Wert[73] = 1.0) zugunsten des S-Enantiomers der freien

Säure 4 zeigt.[69,74] Durch Verwendung des Substrats rac-2-Methyldecansäure-p-

nitrophenylester (rac-3) konnte die Reaktion spektrophotometrisch durch Freisetzung des p-

Nitrophenolats (5) verfolgt werden (vgl. Kapitel 1.3.3). Durch Anwendung verschiedener

Mutationsverfahren konnte in mehreren Mutageneserunden die Enantioselektivität von 2 %

(Wildtyp-Lipase) bislang auf 93 % (E-Wert = 25) zugunsten des S-Enantiomers der Säure 4

erhöht werden.[39,75]

In einem späteren Fall konnte die Enantioselektivität einer Esterase aus Pseudomonas

fluorescens in der Hydrolyse des 3-Hydroxyesters rac-6 von 0 % (Wildtyp-Enzym) auf 25 %

erhöht werden (Schema 1.3).[76]

Schema 1.3: Esterasekatalysierte Hydrolyse des 3-Hydroxyesters 6 zur korrespondierenden Säure.[76]

In diesem Fall erfolgte das Screening durch Kombination eines Indikator- und eines

Wachstumsassays, wobei jedoch nur Informationen über die Aktivität der Enzymmutanten

erhalten wurden.

Die bislang wenigen aber bemerkenswerten Beispiele verdeutlichen die Bedeutung der

gerichteten Evolution zur Steigerung der Enantioselektivität von enzymkatalysierten

Reaktionen. Neben Optimierungen und Entwicklungen von neuen Mutagenesemethoden und

geeigneten Expressionssystemen ist die Entwicklung geeigneter Testsysteme zum effizienten

Durchmustern der Enzymbibliotheken von besonderem Interesse (vgl. Kapitel 1.3).

rac- 6 7

8

O

OOHBnO

OH

OOHBnO

OH

OOHBnO +Esterase


1.3 Screening-Systeme für enantioselektive Katalysatoren

1.3.1 Vorbemerkungen

Die Methoden der kombinatorischen Synthese bieten eine ganze Reihe von Möglichkeiten zur

Herstellung unterschiedlichster Klassen von Liganden- und/oder Katalysatorbibliotheken für

die enantioselektive Homogenkatalyse mit mehreren Tausend verschiedenen Strukturen.

Gleiches gilt für gerichtete Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität von Enzymen

durch die Entwicklung verschiedener Mutageneseverfahren innerhalb der letzten zehn Jahre.

Hierbei stellt die Generierung einer mehrere Millionen Varianten umfassenden

Mutantenbibliothek kein Problem dar (vgl. Kapitel 1.2.2). Die Herstellung von diesen großen

Bibliotheken ist jedoch nur dann sinnvoll, wenn gleichzeitig auf effiziente Assays zum Test

auf die gewünschte Eigenschaft zurückgegriffen werden kann. Solche vollautomatisierten und

zumeist parallelen Testsysteme auf Basis von Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie,

Reportermolekül-, Szintillations- oder photometrischen Assays stehen bereits für das

Wirkstoff-Screening zur Verfügung und ermöglichen das Testen mehrerer hunderttausend

Substanzen pro Woche.[5,77] Im Gegensatz dazu ist über Screening-Verfahren für die

enantioselektive Katalyse wenig beschrieben. Obwohl viele Methoden zur Bestimmung des

Enantiomerenüberschusses bekannt sind,[78] stützen sich die bisher beschriebenen Beiträge

fast ausschließlich auf die klassischen Methoden zur Bestimmung des

Enantiomerenüberschusses (vgl. Kapitel 1.3.2), ermöglichen nur einen geringen Durchsatz

oder beschränken sich auf Substrate mit bestimmten Funktionalitäten (vgl. Kapitel 1.3.3).

Der von ARNOLD aufgestellte erste Leitsatz der Zufallsmutagenese „You get what you screen

for!“ [79] trifft somit gleichermaßen auf die gerichtete Evolution zur Erzeugung

enantioselektiver Biokatalysatoren und die kombinatorische enantioselektive

Homogenkatalyse zu.

1.3.2 Screening-Systeme für die enantioselektive kombinatorische

Homogenkatalyse

Zum Testen der katalytischen Aktivität kombinatorisch erzeugter Homogenkatalysatoren sind

bereits mehrere elegante Lösungen gefunden worden, die zum Teil ein paralleles Testen der

Bibliotheken ermöglichen.[13,23] Allgemein anwendbare Verfahren liegen jedoch nicht vor.


Eine hohe Parallelisierung bieten vor allem photometrische oder Fluoreszenz-Assays, bei

denen die sich während der Reaktion ändernde Absorption oder Fluoreszenz eines

Reaktanden oder Reaktionsprodukts zur Messung der Aktivität des Katalysators ausgenutzt

wird. Die Absorptions- oder Fluoreszenzmessung von in 96er, 384er oder 1536er

Mikrotiterplatten durchgeführten Reaktionen ist mit den entsprechenden kommerziell

erhältlichen Mehrkanal-UV/Vis- oder Fluoreszenzspektrometern innerhalb von wenigen

Minuten möglich.

Im Fall der kombinatorischen Festphasen-Synthese von neuartigen metallbindenden

Peptidliganden oder Makrozyklen kann die Affinität verschiedener Metallionen und deren

selektive Bindung für einen Aktivitätstest genutzt werden. Durch Umsetzung der

kombinatorisch, meist an fester Phase synthetisierten Verbindungen mit Metallsalzlösungen

werden intensive, für das jeweilige Metall charakteristische farbige Komplexe gebildet. Die

anschließende Identifizierung der Struktur des Liganden kann nach einer Identifizierung der

farbigen festphasengebundenen Komplexe mit einem Lichtmikroskop und Abspaltung der

Festphase oder durch Kodierungs-/Dekodierungsmethoden erfolgen.[13] Die einfache

Durchführung dieser Ansätze und das hohe Maß an Parallelität ermöglichen das schnelle

Testen von Tausenden von Liganden.

Zum Nachweis der Aktivität von Katalysatoren kann ebenfalls eine Temperaturänderung

während der Reaktionen genutzt werden (vgl. Kapitel 2).

Wie anfangs erwähnt, sind in der Literatur bereits einige Beispiele zur Anwendung

kombinatorischer Synthesemethoden für die Generierung einer Bibliothek von Liganden oder

Katalysatoren für die asymmetrische Synthese erschienen.[13,23] Im Anschluss daran erfolgt

eine Komplexierung des entsprechenden Metallprecursors und Durchführung der

katalytischen Reaktion (z. B. Diethylzink-Addition an Aldehyde[80], asymmetrische

Hydrierung[81], diastereo- und enantioselektive C-H-Insertion von Metallcarbenen[82],

asymmetrische Addition von Trimethylsilylcyanid an meso-Epoxide[83,84], Multisubstrat-

Screening in der asymmetrischen Reduktion,[85] Multisubstrat-Screening in der

enantioselektiven Diethylzink-Addition an Aldehyde,[86] palladiumkatalysierte

asymmetrische Alkylierung,[87] allylische Aminierung durch neuartige C3-symmetrische

Triarylphosphine[88] LEWIS-Säure-katalysierte enantioselektive Aza-DIELS-ALDER-Reak-

tion,[89] asymmetrische STRECKER-Reaktion[90,91] oder asymmetrische Epoxidation von

Alkenen[92]). In allen hier aufgeführten Beispielen dienten klassische serielle analytische


Verfahren wie GC oder HPLC an chiraler stationärer Phase zur Bestimmung des Umsatzes

und des Enantiomerenüberschusses, so dass nur sehr kleine Katalysatorbibliotheken

untersucht werden konnten.

Eine mögliche (wenn auch serielle) Alternative, die eine Bestimmung des Umsatzes und des

Enantiomerenüberschusses der Produkte ohne eine vorherige Trennung der enantiomeren

Produkte erlaubt, wendeten MIKAMI und Mitarbeiter durch Verbindung von HPLC an

achiraler Phase und Messung des Zirkulardichroismus (CD)[93-95] zum Screening der

enantioselektiven Addition von Diethylzink an prochirale Aldehyde in Gegenwart chiraler

Diol-Liganden und chiraler stickstoffhaltiger Aktivatoren an.[96,97] Es ist jedoch unklar, wie

viele ee-Bestimmungen pro Tag durchgeführt werden können. Die Reaktionsprodukte wurden

mit Hilfe eines automatisierten Probenaufgabesystems in ein mit einem CD-Detektor

ausgestatteten HPLC-System injiziert. Das erhaltene CD-Signal ∆ε und Absorption ε

ermöglichen die Bestimmung des Dissymmetriefaktors g (g = ∆ε ⋅ ε–1), der linear vom

Enantiomerenüberschuss abhängt, jedoch unabhängig von der Produktkonzentration ist. Die

notwendige achirale HPLC-Trennung diente zur Vorreinigung der Reaktionsprodukte

(Abtrennung der Zersetzungsprodukte des Katalysators) und zur Umsatzbestimmung

(Trennung des chromophoren Aldehyds von den ebenfalls chromophoren Alkoholen). Die

Analysenzeit von drei Minuten für das untersuchte 1-Phenylpropanol limitiert jedoch den

Probendurchsatz. Die Bestimmung des Enantiomerenüberschusses lipasekatalysierter

Reaktionen durch CD ist ebenfalls möglich.[98]

1.3.3 Screening- Systeme für die enantioselektive Biokatalyse

Auf den ebenfalls noch jungen Ansatz der gerichteten Evolution von Enzymen zur Steigerung

der Enantioselektivität treffen prinzipiell die gleichen Limitierungen zu wie im Fall der

kombinatorischen Methoden zur Entdeckung oder Optimierung chiraler

Homogenkatalysatoren. Die Erzeugung von Mutantenbibliotheken mit 106-109-Enzym-

varianten durch eine der o.g. Methoden (vgl. Kapitel 1.2.2) stellt kein Problem dar. Doch wird

die Größe der Bibliothek bislang durch die zur Verfügung stehenden Testsysteme (Selektions-

oder Screening-Systeme) zur Bestimmung der Stereoselektivität eingeschränkt. Die

Identifizierung positiver Mutanten kann zum einen durch Screening, d. h. durch

Identifizierung einer oder einiger weniger positiver Varianten in Gegenwart aller anderen,


erfolgen. Eine Alternative bietet die Selektion, bei der sich im Idealfall nur eine (oder einige

wenige) Mutante(n) oder ein Klon mit den gesuchten Eigenschaften herausbildet bzw.

„überlebt“.[39,99]

Im Prinzip ermöglicht die Selektion gegenüber dem Screening einen wesentlich höheren

Durchsatz. Durch Bakterienanzucht auf einem substrathaltigen Minimalmedium (d. h. das

Produkt einer Substratumwandlung dient als alleinige Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle

für die Bakterienanzucht) kann sich ein Wuchsvorteil derjenigen positiven Mutanten (d. h. der

aktivsten Enzyme) herausbilden, die die gewünschte Reaktion katalysieren bzw. das Substrat

mit erhöhter Aktivität umsetzen. Am weitesten verbreitet ist eine Selektion zur Identifizierung

der aktivsten Enzymmutanten, die eine durch den Bakterienwuchs hervorgerufene

Farbänderung oder ein Auftreten von Klärhöfen ausnutzt. Dabei wird wiederum

substrathaltiger Agar verwendet und durch enzymatische Umsetzung des Substrats entstehen

durch pH-Änderung oder Freisetzung eines Chromophors um die wachsenden

Bakterienkolonien Verfärbungen oder der Agar wird durch Klärhofbildung aufgehellt. Tritt

keine Diffusion der sichtbaren Effekte auf, können die positiven Bakterienmutanten leicht

identifiziert werden. Von Nachteil ist, dass die Selektion nur eine qualitative Aussage treffen

kann und zur Identifizierung der enantioselektivsten Enzymmutanten bislang nicht ohne

weiteres herangezogen werden kann.[99]

Einen Ausweg zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses von enzymkatalysierten

Reaktionen bieten entsprechende Screening-Verfahren, deren Durchsatz bislang jedoch

limitiert ist und die teilweise nur ein Testen bestimmter Substratklassen ermöglichen. Neben

den klassischen analytischen Verfahren zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses einer

enzymkatalysierten Reaktion bzw. Racematspaltung wie GC oder HPLC an chiraler

stationärer Phase sind auch in diesem Fall Fluoreszenz- oder kolorimetrische Assays, die das

parallele Testen von in Mikrotiterplatten durchgeführten Reaktionen ermöglichen,

wünschenswert. Doch erfüllen die bislang entwickelten Assays nicht immer alle

Anforderungen zur exakten Bestimmung des Enantiomerenüberschusses und des Umsatzes

bzw. des E-Werts[27,73] einer Reaktion. Die Vor- und Nachteile der bislang bekannten

Verfahren werden im Folgenden näher beschrieben.

Ein erstes Beispiel für ein fluorogenes Assay zur Bestimmung der Aktivität und der

Stereoselektivität lipasekatalysierter Reaktionen stammt von HERMETTER und

Mitarbeitern.[100-102] Durch Verwendung einer 1 : 1-Mischung „enantiomerer“ fluorogener


Glycerole (9 und 10), deren Fluoreszenzintensitäten bei 451 nm bzw. bei 378 nm liegen, kann

die lipasekatalysierte Hydrolyse der beiden enantiomeren Ester gleichzeitig, d. h. durch

schnelle alternierende Messungen bei 378 nm und 451 nm, zeitabhängig detektiert werden

(Schema 1.4).

Schema 1.4: Lipasekatalysierte Hydrolyse „enantiomerer“ fluorogener Glycerole.[102]

Die Perylen- (9) bzw. die Pyrengruppe (10) dienen dabei als Fluorophore. Die Fluoreszenz

wird durch den im Molekül für beide „enantiomeren“ Fluorophore vorhandenen

Fluoreszenzquencher Trinitrophenylamin solange unterdrückt, bis eine lipasekatalysierte

Esterhydrolyse induziert wird. Dieser Ansatz bietet damit grundsätzlich die Möglichkeit, die

Racematspaltung enantiomerer Ester mit Chiralitätsinformation im Alkoholrest zu detektieren

und unterscheidet sich damit prinzipiell von den Screening-Systemen, deren Chromophore

oder Fluorophore im Alkoholrest und deren Chiralitätsinformation im Säureteil des Esters

liegt (s. u.). Für eine Anwendung dieses Assays zum Testen der enzymatischen Aktivität und

Selektivität von größeren Enzymbibliotheken ist bislang jedoch nichts bekannt und erscheint

angesichts der Tatsache, dass es sich bei diesen Substraten um „Exoten“ handelt, auch eher

unwahrscheinlich, da die Struktur dieser Screening-Substanzen von dem eigentlichen Substrat

durch Anwesenheit sperriger Fluorophore bzw. Fluoreszenzquencher zu sehr abweicht.

9

10

( )

( )

( )9

11

15

H

O

O

O

O

ONH

NO2

NO2

O2N

Lipase

Puffer

( )15

( )11

H

O

O

ONH

NO2

NO2O2N

O

O

( )11


Dies hat insofern Konsequenzen, als dass sich die Enantioselektivität der Enzymmutante für

die Hydrolyse der Screening-Substanz vom eigentlichen Substrat stark unterscheidet und

damit eine Übertragbarkeit nicht mehr gewährleistet wird.

In einem in unserem Arbeitskreis entwickeltem Screening-System zur Bestimmung des

E-Werts von hydrolasekatalysierten Racematspaltungen chiraler Carbonsäuren werden

enantiomerenreine p-Nitrophenolester (S)- und (R)-11 (in unserem Fall 2-Methyldecansäure-

p-nitrophenolester, vgl. Kapitel 1.2.4) verwendet, deren Hydrolyse zu den korrespondierenden

Säuren (S)- und (R)-12 in separaten Trögen einer Mikrotiterplatte untersucht wird (Schema

1.5). Dazu werden die Kavitäten der Mikrotiterplatte paarweise mit Kulturüberstand der

Lipase-Mutanten und mit wässrigem Puffer (TRIS-Puffer) versetzt.

Schema 1.5: Ein auf gleichzeitiger Hydrolyse enantiomerenreiner p-Nitrophenolester basierendes Screening-System zur Bestimmung des E-Werts von hydrolase-katalysierten Racematspaltungen.[37,72]

Nach gleichzeitiger Zugabe von enantiomerenreinem (S)- bzw. (R)-p-Nitrophenolester 11 in

jeweils eine der beiden Kavitäten kann die enzymatische Hydrolyse für jedes (S)/(R)-

Enantiomerenpaar photometrisch durch Messung der Absorption des während der Reaktion

freigesetzten p-Nitrophenolations (5) bei 410 nm zeitlich verfolgt werden (Abb. 1.3).

(S)-11 (S)-12 5

(R)-11 (R)-12 5

NO2OH+OH

O

R*O

O

R* NO2

Lipase

wässriger Puffer

NO2OH+OH

O

R*O

O

R* NO2

Lipase

wässriger Puffer


0

0,5

1

1,5

0 100 200 300 400 500 600

(S )-Enantiomer

(R )-Enantiomer

Zeit / s

A

Abb. 1.3: Absorptions-Zeit-Diagramm einer mit einer Enzymmutante parallel durchgeführten lipasekatalysierten Hydrolyse von (S)- und (R)-2-Methyldecan-säure-p-nitrophenolester (11).

Die relativen Steigungen der Geraden des Absorptions-Zeit-Diagramms können als Maß für

die Enantioselektivität (E-Wert) herangezogen werden. Ein Nachteil dieses Screening-

Verfahrens besteht in der fehlenden Konkurrenzreaktion des jeweils anderen Enantiomers des

p-Nitrophenolesters. Dadurch kann unter Umständen eine erhöhte Aktivität der eingesetzten

Hydrolase für die eingesetzten enantiomerenreinen p-Nitrophenolester (S)- und (R)-11

vorgetäuscht werden und damit zu einer Verfälschung des aus den beiden Geradensteigungen

bestimmten E-Werts führen. Ferner eignet sich der Test nur zur qualitativen Identifizierung

positiver „Hits“, die dann mit herkömmlichen Methoden exakt untersucht werden müssen.

Eine mögliche Alternative zur Bestimmung des E-Werts hydrolasekatalysierter

Racematspaltungen bietet der von JANES et al. entwickelte Quick-E-Test[103] Hierbei wird

ebenfalls die parallel durchgeführte Hydrolyse der enantiomerenreinen p-Nitrophenolester

chiraler Carbonsäuren durchgeführt, zur Simulation der Konkurrenzreaktion wird zusätzlich

noch ein achiraler Resorufinester 15 eingesetzt. Durch die unterschiedlichen

Absorptionsmaxima des bei der Hydrolyse freigesetzten p-Nitrophenolat-Anions (5) bei

410 nm und des Resorufin-Anions (17) bei 570 nm lassen sich die Hydrolysen photometrisch

gleichzeitig untersuchen (Schema 1.6).


Schema 1.6: Eine Teilschritt des Quick-E-Tests zur Bestimmung des E-Werts hydrolasekatalysierter Esterhydrolysen.[103]

Obwohl hier prinzipiell durch Verwendung des achiralen Resorufinesters die

Konkurrenzreaktion „vorgetäuscht“ werden kann, birgt dieses Verfahren Nachteile. Für eine

Anwendung als Screening-Verfahren für die gerichtete Evolution muss sichergestellt werden,

dass durch Verwendung dieses achiralen sperrigen Resorufinesters kein Einfluss auf die

evolutive Optimierung des Enzyms bzgl. des eigentlichen Substrats genommen wird.

Ein neueres auf Fluoreszenz basierendes gekoppeltes Enzym-Assay zur Bestimmung des

E-Werts von Racematspaltungen enzymatischer Esterhydrolysen stammt aus der

Arbeitsgruppe von REYMOND.[104] Dabei werden, wie im Fall der Hydrolyse

enantiomerenreiner p-Nitrophenolester chiraler Carbonsäuren,[37,72] die esterasekatalysierten

Esterhydrolysen enantiomerenreiner chiraler sekundärer Alkohole (S)-18 und (R)-18 in

benachbarten Kavitäten einer Mikrotiterplatte getrennt durchgeführt. Die enantiomeren

Benzopyranone (R)-19 und (S)-19 werden gebildet, die in zwei nachfolgenden gekoppelten

Enzymreaktionen zuerst durch Pferdeleberalkoholdehydrogenase (Horse Liver Alcohol

Dehydrogenase, HLDH) und NAD+ zum Keton 21 oxidiert und anschließendend durch

Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin, BSA) zum Fluorophor Umbelliferon (22)

umgesetzt werden (Schema 1.7).

13 14 5

15 16 17

O

NO2

N

O OO

+

+

O

O-

O

O

H27C13-

O

O

NO2

N

O OO

O

H27C13

+Lipase

Puffer-

-


Schema 1.7: Auf Fluoreszenz basierendes gekoppeltes Enzym-Assay zur Bestimmung des E-Werts esterasekatalysierter Racematspaltungen chiraler Ester.[104]

Die Bildung des Umbelliferons (22) kann durch ein Fluoreszenzspektrometer zeitabhängig

parallel für die Hydrolysen der enantiomeren Ester erfasst werden. Durch den linearen

Zusammenhang zwischen dem Anteil an hydrolysiertem Ester und gebildetem Umbelliferon

(22) kann wiederum auf den E-Wert der Reaktion geschlossen werden. Bemerkenswert ist die

100-fach höhere Empfindlichkeit dieses Assays gegenüber dem Nitrophenolat-Assay, so dass

selbst bei geringen Substrat- bzw. Enzymkonzentrationen oder einem geringen Umsatz ein

Nachweis möglich ist. Das prinzipiell gleiche Assay wurde ebenfalls im Screening

stereoselektiver katalytischer Aldolase-Antikörper eingesetzt.[105] Einschränkend lässt sich

sagen, dass all diese Verfahren Substrate mit speziellen funktionellen Gruppen (z. B.

(R)-18 (S)-18

(R)-19 (R)-20

21 21

22 22

O OO

OAc

O OO

OAc

Esterase Puffer

Esterase Puffer

O OO

OH

O OO

OH

O OO

O

O OO

O

O OOHO OOH

BSApH >7

BSApH >7

HLDHNAD+

HLDHNAD+


p-Nitrophenolatester) erfordern, die nicht unbedingt in einem anwendungsgemäßen

Testsystem (z. B. Methylester) erwünscht sind.

In einem weiteren von KAZLAUSKAS und Mitarbeiter beschriebenen Screening-Verfahren zur

Bestimmung des E-Werts von hydrolasekatalysierten Racematspaltungen chiraler Ester nutzt

die bei der Esterhydrolyse freigesetzte Säure zur Protonierung eines pH-Indikators aus, um

eine Farbänderung herbeizuführen.[106] Durch Verwendung eines Puffers und eines

Indikators mit demselben pKa-Wert wird durch die freigesetzte Säure der verwendete Puffer

und der Indikator im gleichen Maß protoniert und somit eine lineare Korrelation zwischen der

freigesetzten Säure und der Protonierung des Indikators hergestellt. Die durch den

protonierten Indikator hervorgerufene Farbänderung kann wiederum photometrisch erfasst

werden. Das Screening-Verfahren wurde anhand der lipasekatalysierte Hydrolyse von α,β-

Isopropylidenglycerinbutyrat (23) mit kommerziell erhältlichen Lipasen unter Verwendung

von BES-Puffer (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure) und p-Nitrophenol als

Indikator demonstriert (Schema 1.8).

Schema 1.8: Hydrolyse von α,β-Isopropylidenglycerinbutyrat (23) als Modellreaktion für ein auf Änderung des pH-Werts basierendes Screening-System.[106]

In benachbarten Kavitäten einer Mikrotiterplatte werden abermals die beiden

enantiomerenreinen Ester hydrolysiert und die Reaktionen photometrisch miteinander

verglichen. Durch die relativen Reaktionsgeschwindigkeiten der enantiomeren Ester kann der

E-Wert der Reaktion bestimmt werden. Über neuere Verfahren, die die IR-Thermographie

bzw. Massenspektrometrie zur Bestimmung der Aktivität und Enantioselektivität enzym- und

metallkatalysierter Reaktionen nutzen, wird im Rahmen der eigenen Arbeiten in Kapitel 2 und

Kapitel 3 näher eingegangen.

Obwohl diese hier aufgeführten Screening-Systeme durch Parallelisierung einen hohen

Probendurchsatz ermöglichen, im kleinen Maßstab durchführbar sind und teilweise auch

geringe Änderungen der gewünschten Eigenschaften (der Enantioselektivität und der

23 24 25

OO

O

O

OO

OH O

O

-+ + H+

Hydrolase

PufferpH 7.2

Indikator


Aktivität eines Bio- oder Homogenkatalysators) erfassen, sind sie einigen Limitierungen

unterworfen. Eine Voraussetzung für die industrielle Anwendung eines auf Enantioselektivität

optimierten Enzyms ist, dass im Screening eine der eigentlichen Verbindung (z. B. auf

aliphatische oder aromatische kostengünstige Alkohole abgeleitete Ester) strukturell ähnliche

Substanz (z. B. p-Nitrophenolester) eingesetzt werden kann, die Optimierung des Enzyms

aber bzgl. der eigentlichen Zielverbindung erfolgt.[107] Einige der hier gezeigten Assays

verwenden sperrige und teure Fluorophore bzw. Chromophore, die teilweise in mehrstufigen

Synthesen in die Testverbindung eingebracht werden müssen und scheiden daher für eine

Enzymoptimierung industriell relevanter Substrate aus. Ferner muss bei optischen Assays zur

Bestimmung des Enantiomerenüberschusses von Racematspaltung, in denen die Reaktionen

der reinen Enantiomere parallel untersucht und miteinander vergleichen werden, sichergestellt

werden, dass durch das Fehlen der Konkurrenzreaktion des jeweiligen anderen Enantiomers

kein Einfluss auf die evolutive Optimierung des Enzyms genommen wird.

Zudem eignen sich die hier aufgezeigten Beispiele fast ausschließlich zur Bestimmung der

Stereoselektivität von Racematspaltungen. Neben der klassischen Analytik bieten bislang nur

wenige Assays die Möglichkeit, die Enantioselektivität von atomökonomisch günstigen

Reaktionen prochiraler oder meso-Substrate zu bestimmen (für ein Beispiel siehe Kapitel

1.2.4). Eine Möglichkeit bietet die von MIKAMI auf CD und HPLC an achiraler Phase

basierende Methode. Über mögliche Anwendungen massenspektrometrischer Techniken wird

auf Kapitel 3.4 verwiesen.

1.4 Aufgabenstellung

Wie im letzten Abschnitt bereits erwähnt, stehen für ein effizientes Screening von

kombinatorisch erzeugten Homogen- und durch gerichtete Evolution generierten

Biokatalysatoren nur wenige Methoden zur Verfügung, mit denen neben der katalytischen

Aktivität auch die Stereoselektivität einer enantioselektiven Reaktion getestet werden kann.

Zudem sind die bislang bekannten Screening-Verfahren teilweise auf bestimmte

Funktionalitäten beschränkt oder sehr empfindlich gegenüber Veränderungen der

Reaktionsbedingungen. Ein kombiniertes Screening aus einem vorgeschalteten Aktivitätstest

(Selektion aktiver Mutanten durch einen Wuchsvorteil oder photometrische Assays) und

einem nachträglichen Test auf Enantioselektivität (z. B. chromatographische Methoden an

1.4 Aufgabenstellung 23

chiraler stationärer Phase) birgt den Nachteil, dass katalytisch weniger aktive aber trotzdem

sehr selektive Enzymmutanten nicht erfasst werden.

Das Ziel der Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung neuer effizienter Testsysteme

für Bibliotheken von (enantioselektiven) Homogen- und Biokatalysatoren.

Kapitel 2

IR-Thermographie-Screening


2 IR-Thermographie-Screening

2.1 Einleitung

Unter Infrarot-Thermographie (IR-Thermographie) wird die Messung und die ortsaufgelöste

Darstellung von Wärmestrahlung verstanden.[108-110] Mit modernen Thermographie-

Systemen lässt sich die thermische Strahlung direkt nachweisen und Temperaturen von

Objekten können schnell und ohne Beeinflussung des Messobjekts quantitativ gemessen und

in Wärmebildern dargestellt werden. Nicht zuletzt deswegen findet die IR-Thermographie

Anwendung in unterschiedlichen Bereichen. Neben dem bislang größten Einsatz in der

Militärtechnik wird diese Untersuchungsmethode seit Einführung des ersten zivilen

Thermographiesystems der Firma Agema (früher AGA) im Jahr 1964 zunehmend stärker für

die unterschiedlichsten zivilen Zwecke genutzt.[109,110] Einige Beispiele für zivile

Anwendungen sind Instandhaltung, Umweltschutz, Medizin, Materialprüfung und

Qualitätssicherung. In Forschung und Entwicklung werden Thermographie-Systeme vor

allem in der Elektro-, Automobil-, Luft- und Raumfahrttechnik eingesetzt.

Im Folgenden werden die physikalischen Grundlagen der IR-Thermographie (Kapitel 2.2), die

Funktionsweise von IR-Thermographiesystemen (IR-Kameras, Kapitel 2.3) und die

bisherigen Anwendungen in der chemischen Forschung (Kapitel 2.4) diskutiert.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals die IR-Thermographie zum Screening von

homogenen metallkatalysierten und biokatalysierten (enantioselektiven) Reaktionen

eingesetzt werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Kapitel 2.7 beschrieben.

2.2 Physikalische Grundlagen

Im elektromagnetischen Spektrum deckt der Infrarot-Bereich den Spektralbereich von

ca. 0.7 µm bis 50 µm ab und liegt somit zwischen dem für den Menschen sichtbaren

langwelligen Bereich des Lichts (ca. 0.7 µm) und den Radiowellen. Die sogenannte

Temperatur- oder Wärmestrahlung ist identisch mit dem IR-Bereich des elektromagnetischen

Spektrums. Diese IR-Strahlung rührt daher, dass jeder Körper oberhalb des absoluten

Nullpunkts elektromagnetische Strahlung emittiert.

28 2 IR-Thermographie-Screening

Die physikalischen Grundlagen zur Messung der Temperatur- oder Wärmestrahlung bildet

zum einen das KIRCHHOFF’sche Gesetz über die Absorption oder Emission von Strahlung und

zum anderen das PLANCK’sche Strahlungsgesetz.[108-110] Danach senden alle Körper

thermische Strahlung aus, die nur von der Temperatur T und dem Emissionsgrad bestimmt

wird. Ebenso können Körper Strahlung absorbieren. Fällt Strahlung auf einen Körper, ist die

Summe aus dem reflektierten (r), dem transmittierten (t) und dem absorbierten Anteil (a)

gleich der einfallenden Strahlungsmenge (Gleichung 2.1).[110]

r + t + a = 1 Gleichung 2.1

Dabei wird zwischen schwarzen, weißen und grauen Körpern unterschieden. Bei schwarzen

Körpern wird die gesamte einfallende Strahlung absorbiert (a = 1) und der Anteil an

reflektierter und transmittierter Strahlung ist null (r = t = 0). Fällt Strahlung auf weiße Körper,

wird diese vollständig reflektiert (r = 1, a = t = 0). Bei grauen Körpern gilt für den

absorbiertem Strahlungsanteil 0 < a < 1 und für den reflektiertem Anteil 0 < r < 1, wobei a

und r nicht wellenlängenabhängig sind.

Die Temperaturabhängigkeit der spezifischen spektralen Ausstrahlung M (T) schwarzer

Körper beschreibt das PLANCK’sche Strahlungsgesetz aus dem Jahr 1900 (Gleichung

2.2),[108-110]

M (T) =

1

2

5

2

−⋅ kT

hc

e

hc

λλ

π [W/m3] Gleichung 2.2

wobei h das PLANCK’sche Wirkungsquantum, c die Lichtgeschwindigkeit und k die

BOLTZMANN-Konstante darstellen. Die Beziehung gilt strenggenommen nur für schwarze

Strahler.

Der Emissionsgrad , eine stoffspezifische dimensionslose Größe, erfasst den Zusammenhang

zwischen der spezifischen Ausstrahlung eines realen Körpers (E) mit einer bestimmten

Temperatur und der Abstrahlung eines schwarzen Strahlers (ES) gleicher Temperatur durch

die Beziehung = E/ES. Er ist von der Wellenlänge, Oberfläche, dem Beobachtungswinkel

und der Temperatur des Körpers abhängig.

Das Emissionsvermögen, d. h. die abgestrahlte Leistung einer bestimmten Fläche eines

Körpers, ist das Produkt aus dem Emissionsgrad und dem Emissionsvermögen eines

schwarzen Strahlers.


In einer Wärmebildkamera wird nun die von einem Körper abgestrahlte Leistung durch den

vom Empfänger vorgegebenen Wellenlängenbereich nachgewiesen. Das Signal der IR-

Thermographiekamera hängt somit neben detektorspezifischen Größen vor allem von der

Temperatur und dem Emissionsgrad des „strahlenden“ Körpers ab. Nach dem PLANCK’schen

Strahlungsgesetz ändert sich bei einer Temperaturänderung die Strahlungsemission und damit

auch das empfangene Signal. Ist der Emissionsgrad des strahlenden Körpers bzw. Materials

bekannt, lässt sich die Temperaturabhängigkeit des Signals quantitativ erfassen.[109,110]

Schwarze Strahler, wie z. B. kleine Hohlräume, haben über den gesamten Spektralbereich

einen konstanten Emissionsgrad ( = 1). Graue Strahler, wie z. B. leicht polierte Flächen,

haben ebenfalls einen konstanten Emissionsgrad, jedoch ist < 1. Selektive Strahler, z. B.

Hochdruckbogenlampen, zeigen eine Wellenlängenabhängigkeit und sind für quantitative

Untersuchungen ungeeignet.

Für thermographische Untersuchungen werden alle Objekte als graue Strahler angesehen. Die

fast immer vorhandene leichte Wellenlängenabhängigkeit kann bei Temperaturen unterhalb

von 100 °C vernachlässigt werden.[110] Strahlungsquellen mit dieser Temperatur zeigen eine

Strahlungsemission bei Wellenlängen größer als 3 µm und der Emissionsgrad ändert sich im

Wellenlängenbereich von 3-5 µm nur geringfügig.

Da die Temperaturerfassung durch IR-Thermographiesysteme meist in einem größeren

Abstand zum untersuchten Objekt erfolgt, muss der Einfluss der Atmosphäre auf die

Ausbreitung der IR-Strahlen berücksichtigt werden.[109] Durch in der Atmosphäre

enthaltenen Wasserdampf und Kohlenmonoxid wird die IR-Strahlung in den für IR-

Thermographiemessungen relevanten Wellenlängenbereich bis 14 µm absorbiert. Zusätzlich

emittiert die Atmosphäre als „Körper“ mit einer gegenüber dem absoluten Nullpunkt erhöhten

Temperatur eine Eigenstrahlung, die sich der Strahlung des untersuchten Objekts überlagert.

Aufgrund der Eigenabsorption ergeben sich bestimmte Bereiche, in denen eine nur geringe

Dämpfung der Wärmestrahlung erfolgt und die sich daher für die IR-Thermographie

besonders eignen. Diese sogenannten „atmosphärischen Fenster“ liegen im nahen Infrarot

(1. Fenster: 1-2 µm), im mittleren Infrarot (2. Fenster: 3-5 µm) und im fernen Infrarot

(3. Fenster: 8-14 µm).[109]


2.3 IR-Thermographiesysteme

Die wichtigsten Bestandteile eines IR-Thermographiesystems sind die abbildende Optik, der

IR-Detektor, das Bildabtastverfahren, die Signalverarbeitung sowie die Möglichkeiten zur

Korrektur äußerer Einflüsse (Störfaktoren). Durch die Strahlungsemission der zu

untersuchenden Körper werden für die IR-Thermographie die Wellenlängenbereiche

(„Fenster“) von 3-5 µm (kurzwelliger Bereich) und 8-14 µm (langwelliger Bereich)

genutzt.[109]

2.3.1 Optik

Wärmebildkameras verfügen prinzipiell über die gleichen Komponenten, z. B. Linsen und

Blenden, wie „normale“ optische Kameras für sichtbares Licht und erzeugen über eine

optische Abbildung das verkleinerte Bild eines Objekts auf einem strahlungsempfindlichen

Sensor. Für die Herstellung geeigneter Linsen kommen nur infrarotdurchlässige Materialien

wie z. B. Silizium, Germanium, Zinkselenid oder Zinksulfid in Frage, da die Transmission

von normalem Glas bereits ab 2 µm abnimmt und Glas bei ca. 4.5 µm für Wärmestrahlung

undurchlässig ist.

2.3.2 Detektoren und Wärmebildaufnahme

Die Aufgabe des IR-Detektors ist es, die einfallende IR-Strahlung in ein elektrisches Signal

umzuwandeln. Heutzutage werden in den kommerziell erhältlichen Thermographiesystemen

fast ausschließlich Quantendetektoren eingesetzt. Es handelt sich dabei um Halbleiter, in

denen die einfallende IR-Strahlung, d. h. die IR-Quanten (Photonen) Elektronen-

Defektelektronen-Paare erzeugen (innerer photoelektrischer Effekt) oder Elektronen auslösen

(äußerer photoelektrischer Effekt) und dadurch entweder eine Photonenspannung, einen

Photonenstrom oder eine Widerstandsänderung herbeiführen. Die Quantendetektoren besitzen

gegenüber thermischen Detektoren eine höhere Empfindlichkeit und ermöglichen so eine

wesentlich bessere Temperaturauflösung im Wärmebild. Durch eine unterschiedliche

Zusammensetzung des Detektormaterials kann der Empfindlichkeitsbereich des Detektors auf

den entsprechenden Wellenlängenbereich (kurzwellig oder langwellig, s. o.) abgestimmt

werden. Häufig verwendete Detektor-Halbleitermaterialien sind u. a. Bleisulfid (PbS),

Bleiselenid (PbSe), Indiumantimonid (InSb) und Cadmiumquecksilbertellurid (CdHgTe). Mit

2.3 IR-Thermographiesysteme 31

letzterem lässt sich durch unterschiedliche Zusammensetzungen der für die IR-Thermographie

interessante Bereich bis ca. 14 µm abdecken.

Eine Folge der zunehmenden Grenzwellenlänge solcher Detektoren ist, dass die optimalen

Eigenschaften erst bei tiefen Temperaturen erreicht werden (im Fall von Kurzwellen-

Detektoren ist bei Umgebungstemperatur die Energielücke so gering, dass die thermische

Energie ausreicht, um das Leitungsband mit Elektronen zu füllen; eine Messung ist unter

diesen Bedingungen unmöglich). Detektoren von IR-Systemen für den Wellenlängenbereich

8-14 µm werden daher bei Temperaturen um 77 K (STIRLING-Kühler) betrieben. Für den

Bereich 3-5 µm reicht eine thermoelektrische Kühlung des Detektors auf 200 K aus. Um eine

bessere Empfindlichkeit zu erzielen, werden jedoch auch hier Kühlungen um 77 K verwendet.

Die Aufnahme eines Wärmebilds kann durch verschiedene Techniken erfolgen. Eine

Möglichkeit bieten Einzeldetektoren oder Detektorzeilen, bei denen das Objekt abgetastet und

die einzelnen Bildpunkte nacheinander auf dem Detektor abgebildet werden. Wesentlich

höhere Bildpunktzahlen (ca. 80 000) und größere Bildwiederholfrequenzen (etwa 25 Hz)

lassen sich durch Matrixanordnungen von Detektoren (focal plane arrays, FPA) erzielen.

Solche Detektor-Arrays mit Platinsilizid als Detektormaterial (PtSi-Detektoren) werden

ebenfalls mit STIRLING-Kühlung bei 77 K betrieben und sind besonders für den Bereich von

3.6-6 µm geeignet. Sie zeichnen sich durch eine hohe Auflösung und Temperaturgenauigkeit

aus.[110]

2.3.3 Korrektur von Störfaktoren

Der prinzipielle Unterschied zwischen einem Infrarot-Sichtgerät und einem IR-

Thermographiesystem besteht darin, dass bei letzterem eine Temperaturmessung erfolgt.

Dabei wird für jeden Bildpunkt die Temperatur aus der vom Objekt ausgehenden registrierten

Strahlungsleistung bestimmt. Wichtige Parameter, die einen Einfluss auf die registrierte

Strahlungsleistung ausüben können, sind die Detektorempfindlichkeit, das

Emissionsvermögen des Objekts und der Einfluss durch die Atmosphäre. Daher ist eine

absolute Temperaturkalibrierung notwendig, bei der jedem Detektorsignal in einem

bestimmten Temperaturmessbereich eine Temperatur zugeordnet wird.[109,110] Im Fall von

FPA-Systemen ist eine Korrektur für jeden Bildpunkt notwendig. Sind z. B. im Messobjekt

verschiedene Materialien mit unterschiedlichen Emissionsgraden vorhanden, können trotz


homogener Temperaturverteilung des Objekts im Wärmebild verschiedene Temperaturen

vorgetäuscht werden.[110] Moderne Thermographiegeräte führen die Kompensation solcher

Störeinflüsse geräteintern mit Temperaturfühlern und internen Referenzstrahlern durch. Zur

Ermittlung der Temperaturabhängigkeit der Wärmestrahlung des Messobjekts ist eine

Korrektur durch die Bestimmung einer Kennlinie somit unnötig.[109]

2.4 Bisherige Anwendungsbeispiele der IR-Thermo-graphie in der Chemie

Wie bereits erwähnt, sind die Anwendungen der IR-Thermographie im zivilen Bereich sehr

vielfältig, doch ist die zweidimensionale thermographische Abbildung von Temperatur- und

Emissivitätsverteilungen nicht auf Objekte wie Gebäude, Werkstoffe usw. beschränkt. Durch

die Möglichkeit, die unterschiedlichen Photonenintensitäten der IR-Strahlung (der

Wärmestrahlung) durch unterschiedliche Farben in den thermographischen Aufnahmen (den

Wärmebildern) darzustellen, kann diese Detektionsmethode auch zur Untersuchung lokaler

Temperaturdifferenzen und somit von Reaktionsgeschwindigkeiten chemischer Reaktionen

angewandt werden. Im folgenden Abschnitt werden die bisherigen Anwendungen der IR-

Thermographie zur Untersuchungen chemischer Prozesse beschrieben. Eine ausführlichere,

wenn auch nicht ganz vollständige Übersicht gibt ein kürzlich erschienener

Übersichtsartikel.[13]

Über die erste Anwendung von IR-thermographischen Methoden zur Untersuchung

chemischer Reaktionen berichteten SCHMITZ und Mitarbeiter bereits 1984.[111-113] Eine

Zusammenfassung dieser Arbeiten stammt aus dem Jahr 1987.[114] Untersucht wurde die

heterogene katalytische Oszillationen bei der Reaktion von Wasserstoff mit Sauerstoff. Bei

dieser sehr exothermen Reaktion konnten große Temperaturunterschiede von ca. 70 °C

detektiert werden.

Im Jahr 1987 beschrieben SERMON und Mitarbeiter die IR-Emissionsanalyse der Hydrierung

von Cyclohexen und die H2-Oxidation an einem Platin/Siliziumdioxid-Katalysator, wobei

Temperaturunterschiede von 5 °C aufgelöst werden konnten.[115]

Über eine weitere Anwendung berichten 1989 LOBBAN et al. im Rahmen von Untersuchungen

zur Oxidation von Ammoniak an elektrisch beheizten Platin-Bändern.[116]

2.4 Bisherige Anwendungsbeispiele der IR-Thermographie in der Chemie 33

Das erste Beispiel über eine Anwendung der IR-Thermographie für ein paralleles Testen der

katalytischen Aktivität einer kleinen Katalysatorbibliothek stammt von MOATES et al. aus

dem Jahr 1996.[117,118] Die Katalysatorpräparation erfolgte durch konventionelle

Imprägnierung von Aluminiumoxid als Trägermaterial mit verschiedenen Metallsalzlösungen

und durch anschließende Reduktion mit Wasserstoff zum Metall. Nach Kalibrierung der

Kamera wurde die katalytische Aktivität dieser aus 16-Mitglieder bestehenden kleinen

Bibliothek anhand der Wärmetönung der Knallgasreaktion parallel untersucht. Die

unterschiedliche katalytische Aktivität konnte qualitativ durch ein „Aufglühen“[13] der

verschiedenen metallhaltigen Katalysatorpellets beim Aufheizen des Reaktors verfolgt

werden. Damit konnte erstmals verdeutlicht werden, dass ein paralleles Screening von

heterogenkatalysierten Reaktionen durch IR-Thermographie möglich ist.

MAIER und Mitarbeiter untersuchten 1998 durch IR-Thermographie die Aktivität einer

Modellbibliothek von heterogenen Katalysatoren aus Übergangsmetall-imprägnierten

amorphen mikroporösen Mischoxiden (AMM) in verschiedenen Gasphasenreaktionen.[119]

Unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen und sehr empfindlichen FPA-IR-

Thermographiesystems mit einem PtSi-Detektor gelang die Identifizierung der aktivsten

Katalysatoren. Selbst bei Reaktionstemperaturen von bis zu 350 °C und unter Verwendung

geringer Mengen (<200 µg) der Katalysatoren konnten in Oxidations- und

Reduktionsreaktionen die aktivsten Komponenten dieser Bibliothek in anhand geringer

Temperaturdifferenzen (zwischen 0.1 °C und 2 °C) zuverlässig identifiziert werden.

In allen bislang beschriebenen Beispielen wurde die IR-Thermographie zur Untersuchung der

katalytischen Aktivität von heterogenen Katalysatoren in Gasphasenreaktionen genutzt. Bis

zu Beginn dieser Arbeit war nichts darüber bekannt, in wieweit die IR-Thermographie zur

Untersuchung der Reaktionswärme von Prozessen in Lösung herangezogen werden kann.

Während der Durchführung der vorliegenden Arbeit erschien 1998 ein Beitrag von TAYLOR

und MORKEN, in dem die Synthese einer durch Split-and-pool-Methoden hergestellten

Bibliothek von ca. 3150 verschiedenen festphasengebundenen Acylierungskatalysatoren

beschrieben wurde.[120] Im Anschluss wurde die katalytische Aktivität dieser

polymergebundenen Katalysatoren in der Acylierung von Ethanol getestet. Die aktivsten

Katalysatoren konnten durch die Wärmetönung der Reaktionen mit einer IR-Kamera

identifiziert werden („hot beads“). Als wichtig für diese Untersuchungen erwies sich der

Zusatz einer bestimmten Menge an Chloroform zu der Reaktionslösung aus Ethanol,


Acetanhydrid und Triethylamin. Damit wurde sichergestellt, dass die Katalysatorkügelchen

während der Reaktion auf der Oberfläche der Lösung „schwimmen“. Ohne Zusatz von

Chloroform wurde ein Absinken der Polymerkugeln in die Lösung beobachtet. Eine Detektion

der aktivsten Komponenten durch eine IR-Kamera ist dann aufgrund der IR-Emissivität des

Lösemittels nicht mehr möglich.

2.5 Zielsetzung der eigenen Arbeiten

Bis zu Beginn dieser Arbeit beschränkten sich die Anwendungen der IR-Thermographie auf

die Untersuchung der Wärmestrahlung heterogen katalysierter Prozesse. Obwohl die IR-

Thermographie nur Aussagen über die Aktivität von Katalysatoren treffen kann und

Informationen über die Produktzusammensetzung (der Selektivität von Katalysatoren) nicht

zugänglich sind, ist das Durchmustern von Katalysatorbibliotheken und die Bestimmung der

Lebensdauer von Katalysatoren durch diese Methode sehr vielversprechend.[13]

In Kapitel 1.3.2 wurde die Problematik der Screening-Verfahren für (enantioselektive)

katalytische Prozesse erläutert. Viele der bislang beschriebenen Testsysteme sind fast

ausschließlich für die Bestimmung der Enantioselektivität von Estern chiraler Carbonsäuren

geeignet und eine Analyse von chiralen Alkoholen, Aminen, Aminoalkoholen oder Epoxiden

ist nicht ohne weiteres möglich. Die IR-Thermographie bietet die Möglichkeit zur parallelen

Untersuchung mehrerer Reaktionen und ist nicht auf bestimmte Funktionalitäten in den

Substraten angewiesen. Eine Grundvoraussetzung ist jedoch, dass während der Reaktion eine

messbare Änderung der Temperatur auftritt, die dann mit der katalytischen Aktivität eines

Bio- oder Metallkatalysators korreliert werden kann.

Angesichts der Tatsache, dass über eine Anwendung der IR-Thermographie zur Untersuchung

von Reaktionen in Lösung nichts bekannt war, sollte untersucht werden, ob sich die Methode

zum Screening katalytischer Prozesse in Lösung eignete. Einige prinzipielle Fragen mussten

dabei berücksichtigt werden. Ob

• die während der Reaktion auftretenden Temperaturänderungen ausreichend für eine IR-

thermographische Detektion ist,

• eine Miniaturisierung und damit eine paralleles Testen möglich ist,

• die Emissivität des Lösemittels eine Detektion der Temperaturdifferenzen der

katalytischen Reaktion verhindern wird,

2.6 Experimenteller Aufbau 35

• neben metallkatalysierten auch biokatalysierte Prozesse untersucht werden können und

• ob sich die Methode gegebenenfalls zur Bestimmung der Enantioselektivität von metall-

oder biokatalysierten Umsetzungen eignet.

2.6 Experimenteller Aufbau

Wie in Kapitel 5.3.1 näher beschrieben, wurde für alle IR-Thermographiemessungen eine im

Max-Planck-Institut für Kohlenforschung vorhandene AEGAIS-Infrarot-Kamera der Firma

AIM AEG Infrarot-Module GmbH, Heilbronn, mit einem 256x256-FPA-PtSi-Detektor, der

Temperaturdifferenzen bis zu 10 mK detektieren kann, verwendet. Die Kamera wurde an

einem Stativständer befestigt, der eine Höhenverstellung der Kamera ermöglicht.

Für ein paralleles Screening am besten geeignet ist die Durchführung der Reaktionen in

Mikrotiterplatten. Zu Beginn der Untersuchungen waren jedoch keine geeigneten Apparate

erhältlich, die zum einen ein Schütteln der Mikrotiterplatten, zum anderen eine gleichmäßige

Temperierung der Reaktionsgefäße ermöglicht hätten, welche für Kalibrierungsmessungen

zur Korrektur lokaler Unterschiede des Emissions- und des Reflexionsvermögens notwendig

ist. Daher wurde ein kommerziell erhältlicher Schüttler für 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße

verwendet, der ein Schütteln der Reaktionsgefäße ermöglicht und eine konstante

Temperierung der Lösung gewährleistet. Im Rahmen von Voruntersuchungen zeigte sich

jedoch, dass bei Verwendung eines solchen Schüttlers und solcher Gefäße keine optimale

Durchmischung und Temperierung erzielt wurde. Daher wurde der obere Teil des Schüttlers

durch einen Aluminiumsockel mit zylindrischen Löchern für Glasgefäße mit einem

Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 35 mm (vgl. Kapitel 5.3.1) ersetzt. Der Schüttler

wurde unterhalb des Objektivs der IR-Kamera platziert.

Im weiteren Teil der Arbeiten wurde ein seit kurzer Zeit kommerziell erhältlicher Schüttler

für Mikrotierplatten eingesetzt (vgl. Kapitel 5.3.1.2). Auf diesen Schüttler wurde zur

konstanten Temperierung der Mikrotiterplatten zusätzlich ein Aluminiumaufsatz (vgl. Abb.

2.1) montiert, auf den die verwendeten Polypropylen-Mikrotiterplatten (Flachboden

Polypropylen-MTP) aufgesteckt wurden (Abb. 2.1).


Abb. 2.1: Kommerziell erhältlicher Schüttler für MTP und verwendeter Aluminiumaufsatz zur besseren Wärmeübertragung (Die Mikrotiterplatte ist zur besseren Veran-schaulichung halbiert worden).

2.7 Zeitaufgelöstes IR-Thermographie-Screening katalytischer Prozesse in Lösung

2.7.1 Lipasekatalysierte Acylierung

Als Modellreaktion für eine IR-thermographische Untersuchung einer enzymkatalysierten

Reaktion in Lösung diente die in der Literatur beschriebene enantioselektive Acylierung von

1-Phenylethanol (26) mit Vinylacetat (27) und katalytischen Mengen einer immobilisierten

Lipase aus Candida antarctica (Novo Nordisk SP 435 Lipase, Novozym® 435).[121] Diese

Mikrotiterplatte Aluminium-

aufsatz


Umsetzung verläuft mit einer Enantioselektivität von >99 % zugunsten des (R)-Esters 28 und

des verbleibenden (S)-1-Phenylethanols ((S)-26) (Schema 2.1).

Schema 2.1: Lipasekatalysierte Racematspaltung von 1-Phenylethanol (26).

Ziel der Studie war daher die Prüfung der Frage, ob sich die IR-Thermographie eignet,

Unterschiede in der Wärmetönung bzw. der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von

der absoluten Konfiguration zu detektieren.

Neben racemischem 26 wurde zur Untersuchung der Enantioselektivität der Reaktion in

getrennten Reaktionsgefäßen auch (S)-26 und (R)-26 eingesetzt. In zwölf Glasgefäße des

Schüttlers wurden Lösungen von Vinylacetat (27) jeweils spaltenweise mit racemischen 26,

(R)-26 und (S)-26 in drei unterschiedlichen Konzentrationen (zeilenweise) hergestellt (vgl.

Abb. 2.2). Damit eine exakte Bestimmung der während der Reaktion auftretenden

Temperaturveränderungen möglich ist, wurde vor der eigentlichen Messung eine

Kalibrierungsmessung zur Korrektur lokaler Emissivitätsunterschiede durchgeführt (vgl.

Kapitel 5.3.2.2). Die Wärmestrahlung dieses Arrays wurde bei sechs unterschiedlichen

Temperaturen zwischen 25 °C und 35 °C aufgenommen und anschließend eine nichtlineare

Regression der Daten durchgeführt. Die Reaktionsgefäße mit den Substraten wurden auf

30 °C abgekühlt und die Temperatur konstant gehalten. Um nur die Wärmestrahlung infolge

der katalytischen Aktivität in den einzelnen Reaktionsgefäßen durch entsprechende

Farbdarstellung sichtbar werden zu lassen, wurde vor der Initiierung der Reaktion eine Offset-

Thermographiemessung durchgeführt, die geräteintern von den folgenden aufgenommenen

Wärmebildern „subtrahiert“ wurde. Eine Datenbearbeitung der IR-thermographischen

Aufnahmen erfolgte nachträglich mit dem Programm MATLAB®. Durch die

Nachbearbeitung ist eine Auswahl des Temperaturbereichs möglich, in dem die

Temperaturdifferenzierung durch eine unterschiedliche Farbdarstellung wiedergegeben

werden soll.

rac-26 27 (R)-28 (S)-26

CH3

OHO

O+

Novo SP 435

Toluol30 °C

CH3

OAc

+ CH3

OH


rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

0.5 M

1.0 M

2.0 M

2.0 M ohne

Enzym

0.5 M

1.0 M

2.0 M

2.0 M ohne

Enzym

rac (S) (R) T / °C

0.5 M

1.0 M

2.0 M

2.0 M ohne

Enzym

Abb. 2.2 Zeitaufgelöste IR-Thermographieaufnahmen der lipasekatalysierten Veresterung von 1-Phenylethanol (26) vor Beginn der Reaktion (a, 0 min), nach 0.5 min (b) und nach 3.5 min (c). Zur Durchführung siehe Kapitel 5.3.2.2.

In Abb. 2.2 (Bild a) ist die danach erhaltene IR-Thermographieaufnahme der Anordnung der

Reaktionsbehälter mit den unterschiedlichen konzentrierten Substratlösungen bei 30 °C

abgebildet. Zur Temperaturdifferenzierung wurde für diese Wärmebilder ein Bereich von

7 = 1.0 °C gewählt. Die homogene Temperaturverteilung innerhalb der Reaktionsgefäße ist

am einheitlichen Farbverlauf sichtbar. Die in den Reaktionsgefäßen detektierte

Temperaturverteilung ist an der Temperaturskala neben den Wärmebildern klar erkennbar. In

manchen Gefäßen treten halbmondförmige Schattierungen auf. Diese rühren von lokal

auftretenden Emissivitäts- bzw. Reflexionsstörungen vom oberen Rand der Glasgefäße her,

haben jedoch keinen Einfluss auf die beobachtete Wärmestrahlung der Reaktion und führen

damit nicht zu Verfälschungen in den Wärmebildern. Als Kontrolle für die während der

31.0

31.1

31.3

31.4

31.5

31.6

31.7 31.8

31.9

31.2

31.0

31.1

31.3

31.4

31.5

31.6

31.7 31.8

31.9

31.2

31.0

31.1

31.3

31.4

31.5

31.6

31.7 31.8

31.9

31.2

a

0 min

b

0.5 min

c

3.5 min


Veresterung freiwerdende Reaktionswärme wurden die drei unteren substrathaltigen

Reaktionsgefäße nicht mit Enzym versetzt (vgl. Abb. 2.2, „2 M, ohne Enzym“). Durch Zugabe

von jeweils 5 mg der immobilisierten Lipase wurde die heterogenkatalysierte Reaktion

initiiert und der Reaktorblock für 5 s geschüttelt. Die in den Reaktionsgefäßen auftretenden

Temperaturänderungen wurden periodisch gemessen. Für die Dauer der Messung wurde das

Schütteln unterbrochen. Innerhalb von 5 s wurden 250 Thermographieaufnahmen registriert,

die geräteintern zu einem Wärmebild gemittelt wurden. Die Aufnahme nach 30 s

Reaktionszeit ist in Abb. 2.2, Bild b gezeigt. Anhand der in den verschiedenen

Reaktionsgefäßen auftretenden Temperaturerhöhungen ist deutlich zu erkennen, dass das (R)-

Enantiomer von 26 wesentlich schneller umgesetzt wird als (S)-26, bei dem bei keiner

Konzentration eine Veränderung der Temperaturverteilung und somit keine nennenswerte

Reaktion auftritt. Dagegen ist in den Gefäßen mit rac-26 eine leichte, aber deutliche

Temperaturerhöhung erkennbar. Ebenfalls deutlich sichtbar ist eine Zunahme der

Temperaturdifferenzen bei den unterschiedlichen Konzentrationen von rac-26, (S)-26 und

(R)-26. Wie zu erwarten treten im Vergleich mit den Referenzgefäßen ohne Enzym die

deutlichsten Temperaturdifferenzen zwischen (S)-26 und (R)-26 bei der höchsten

Konzentration auf. Das heißt, dass die Wärmestrahlung einer Lösung um so größer ist, je

höher die Substratkonzentration ist.

Somit wird erstmals klar, dass die unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeit von zwei

Enantiomeren IR-thermographisch detektierbar ist.

Die gleiche Reaktion wurde unter analogen Bedingungen (jedoch ohne Referenzsubstanzen)

mit einer geringeren Menge (2.5 mg) der immobilisierten Lipase durchgeführt. In Abb. 2.3 ist

die nachbearbeitete Wärmebildaufnahme 1.5 Minuten nach Initiierung der Reaktion durch

Zugabe des Enzyms gezeigt.


Abb. 2.3: IR-thermographische Aufnahme der lipasekatalysierten Veresterung von 1-Phenylethanol (26) nach 1.5 Minuten Reaktionszeit. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.3.2.2.

Für dieses Wärmebild wurde zur Temperaturdifferenzierung ein Temperaturfenster von

7 = 0.3 °C gewählt. In dieser Abbildung sind wieder die halbmondförmigen Flecken

erkennbar, die keinen Einfluss auf die Wärmestrahlung in den Reaktionsgefäßen haben. Die

„Flecken“ zwischen den Reaktionsbehältern rühren von Emissivitäts- bzw.

Reflexionsstörungen der Oberfläche des Schüttlers her und haben ebenfalls keinen Einfluss

auf die Wärmetönung der Reaktion bzw. auf die Temperaturverteilung in den

Reaktionsgefäßen. Obwohl gegenüber der in Abb. 2.3 dargestellten Reaktion in diesem Fall

nur die Hälfte der Enzymmenge verwendet wurde, ist eine Differenzierung möglich. Auch

hier ist deutlich erkennbar, dass das (R)-Enantiomer von 26 schneller umgesetzt wird als

(S)-26. In den Gefäßen mit rac-26 ist wiederum nur eine leichte Temperaturerhöhung

sichtbar.

rac (S) (R) T / °C

0.5 M

1.0 M

2.0 M

c

31.70

31.65

31.60

31.55

31.50

31.45

31.40 1.5 min


2.7.2 Übergangsmetallkatalysierte Reaktionen in Lösung

Als Modellreaktionen für eine IR-thermographische Untersuchung metallkatalysierter

homogener Prozesse kommen viele Reaktionstypen in Frage. Um die Möglichkeit eines

Screenings homogener metallkatalysierter Prozesse durch IR-Thermographie zu

demonstrieren, wurden zwei Reaktionstypen ausgewählt: (a) die enantioselektive

Ringöffnung von Epoxiden durch metallhaltige chirale Salen-Katalysatoren (Kapitel 2.7.2.1,

Salen = N,N -Bis(salyciliden)ethylendiamin) und (b) die rutheniumkatalysierte Ringschluss-

Metathese von Olefinen (Kapitel 2.7.2.2).

2.7.2.1 Enantioselektive hydrolytische Ringöffnung von Epoxiden

Die enantioselektive Epoxidation nichtfunktionalisierter Olefine liefert mit den von JACOBSEN

und Mitarbeitern[122,123] und KATSUKI und Mitarbeitern[124,125] entwickelten

enantiomerenreinen Mangan(III)-Salen-Katalysatoren die entsprechenden Epoxide in hohen

Enantiomerenüberschüssen. Die von JACOBSEN beschriebenen metallhaltigen (S,S)-Salen-

Katalysatoren eignen sich auch zur kinetischen Racematspaltung von Epoxiden durch

enantioselektive nukleophile Ringöffnung.[126-132] In diesen Arbeiten wurde in

Laborversuchen der aktivste und selektivste der zehn untersuchten Übergangsmetall-Salen-

Komplexe 29 bis 38 anhand eines Aktivitäts- und Selektivitäts-Screenings in der

enantioselektiven katalytischen Ringöffnung von meso-Cyclohexenoxid (39) durch

Benzoesäure (40) gefunden (Schema 2.2).[128]

Als aktivster und zugleich selektivster Komplex erwies sich der Co-Komplex 30.[133] Der in

der enantioselektiven Ringöffnung von Epoxiden mit Trimethylsilylazid erfolgreich

eingesetzte Cr-Komplex 33[126,134] zeigte zwar eine gute Aktivität, war jedoch in der hier

beschriebenen Reaktion weniger selektiv als 30. Interessanterweise zeigte der für die

enantioselektive Epoxidation von Olefinen verwendete Mn-Komplex 35[122,123] überhaupt

keine Aktivität in dieser Reaktion. Unter Verwendung des (R,R)-Enantiomers von 30 konnte

in einer weiteren Arbeit das Potential dieses sehr aktiven und hoch enantioselektiven Co-

Salen-Komplexes in der hydrolytischen kinetischen Racematspaltung terminaler Epoxide

unterstrichen werden.[129]


O

N NM

O

HH

O + PhCO2HOH

OCOPh

5 mol% Kat.

MTBE20 °C, 20 h

Schema 2.2: Enantioselektive katalytische Ringöffnung von meso-Cyclohexenoxid (39) durch Benzoesäure (40) katalysiert durch chirale Salen-Metall-Komplexe.[128]

Zur Demonstration der Möglichkeit eines IR-thermographischen Screenings

metallkatalysierter Reaktionen schien diese Reaktion ideal geeignet, da in den Arbeiten von

JACOBSEN und Mitarbeitern die Aktivitäts- und Selektivitätsprofile dieser synthetisch einfach

zugänglichen und luftstabilen Co-, Cr- und Mn-(S,S)-Salen-Komplexe (30, 33 und 35)

beschrieben waren (vgl. Kapitel 5.3.2.3). Aufgrund der nukleophilen Ringöffnung der

Epoxide sollte die dabei freiwerdende Ringspannungsenergie sich deutlich auf die

Wärmestrahlung auswirken. In einer ersten Reaktion wurde die Aktivität und Selektivität

anhand der drei in Schema 2.2 dargestellten Katalysatoren 30, 33 und 35 bei der Hydrolyse

von Epichlorhydrin (42, Schema 2.3) IR-thermographisch untersucht. In allen Fällen handelt

es sich um homogenkatalysierte Reaktionen.

M = Ti+4(Cl2) 29 M = Co+2 30

= V+4(O) 31 = Ni+2 32

= Cr+3(Cl) 33 = Cu+2 34

= Mn+3(Cl) 35 = Al+3(Cl) 36

= Fe+3(Cl) 37 = Al+3(CH3) 38

39 40 41

Kat.:


Schema 2.3: Durch chirale Metall-(S,S)-Salen-Komplexe katalysierte Racematspaltung von Epichlorhydrin (42).

Wiederum wurde neben dem racemischen Substrat rac-42 zur Bestimmung der Selektivität

der drei Katalysatoren die enantiomerenreinen Epichlorhydrine (S)-42 und (R)-42 in

getrennten Reaktionen untersucht. In neun Glasgefäßen des Thermomixers wurden

zeilenweise Lösungen der drei zuvor mit Essigsäure an Luft[129] aktivierten Metall-(S,S)-

Salen-Komplexe 30, 33 und 35 (vgl. Kapitel 5.3.2.3) in Toluol gegeben und spaltenweise mit

rac-42, (R)-42 und (S)-42 versetzt (vgl. Abb. 2.4). Die Katalysatorkonzentration betrug in

allen Fällen 2 mol%. Zur exakten Bestimmung der während der Reaktion auftretenden

Temperaturveränderungen wurde vor der eigentlichen Messung wieder eine

Kalibrierungsmessung durchgeführt (vgl. Kapitel 5.3.2.3). Dazu wurde die Wärmestrahlung

dieses Arrays bei sechs Temperaturen zwischen 24 °C und 39 °C aufgenommen und

anschließend eine nichtlineare Regression der Daten durchgeführt. Die Reaktionsgefäße

wurden auf 27 °C temperiert.

rac-42 (R)-42 43

Kat.:

M = Co+2 30

= Cr+3(Cl) 33

= Mn+3(Cl) 35

+O

ClCH2

O

ClCH2 ClCH2

OHOHKat.

H2O / CH3COOH

Toluol27 °C

O

N NM

O

HH


rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

30

33

35

30

33

35

rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

30

33

35

30

33

35

rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

30

33

35

30

33

35

Rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

30

33

35

30

33

35

Abb. 2.4: Zeitaufgelöste IR-Thermographieaufnahmen der übergangsmetallkatalysierten enantioselektiven nukleophilen Ringöffnung von 42 (vgl. Kapitel 5.3.2.3).

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

0 min

a b

2.5 min

5 min

dc

4 min

e

7 min

f

8 min

32 min

hg

15 min


Vor Initiierung der Reaktionen durch Zugabe von 0.55 Äquivalenten Wasser wurde wieder

eine Offset-Thermographiemessung durchgeführt, um nur die Wärmestrahlung infolge der

katalytischen Aktivität in den einzelnen Reaktionsgefäßen durch eine entsprechende

Farbdarstellung sichtbar zu machen. Die zeitaufgelösten IR-thermographischen Aufnahmen

nach Bearbeitung mit dem Programm MATLAB® sind in Abb. 2.4 gezeigt. Zur

Temperaturdifferenzierung wurde für diese Wärmebilder ein Temperaturbereich von

7 = 1.0 °C gewählt, erkennbar an der Temperaturskala neben den einzelnen Abbildungen. In

Abb. 2.4 (Bild a) ist die IR-Thermographieaufnahme nach der Offset-Messung

wiedergegeben, in der die Anordnung der Gefäße und die homogene Temperaturverteilung

innerhalb der Reaktionsgefäße am einheitlichen Farbverlauf erkennbar ist. Die in manchen

Gefäßen sichtbaren halbmondförmigen Schattierungen haben ihre Ursache in lokal

auftretenden Emissivitäts- bzw. Reflexionsstörungen vom oberen Rand der Glasgefäße und

haben keinen Einfluss auf die beobachtete Wärmestrahlung der Reaktion. Der Reaktorblock

wurde in periodischen Abständen für 5 Sekunden geschüttelt. Aufgrund der längeren

Reaktionszeiten wurden 500 Thermographieaufnahmen über 10 Sekunden registriert, die

geräteintern gemittelt wurden. Das Schütteln wurde dafür unterbrochen. Die IR-

thermographischen Aufnahmen nach 2.5 min, 4 min, 5 min, 7 min, 8 min, 15 min und 32 min

Reaktionszeit sind in Abb. 2.4 gezeigt. Anhand der Temperaturunterschiede in den

Reaktionsgefäßen ist deutlich ersichtlich, dass der Co-Komplex 35 der aktivste Katalysator ist

und dass das (S)-Enantiomer von 42 bevorzugt hydrolysiert wird. In den Reaktionsgefäßen

mit (R)-42 ist keine Reaktion zu beobachten. Entsprechend den Erwartungen wird vom

racemischen 42, nur das (S)-Enantiomer umgesetzt, so dass die in diesem Gefäß detektierte

Wärmestrahlung zwischen den reinen Enantiomeren von 42 liegt. Deutlich erkennbar ist auch,

dass der Cr-Komplex 33 die Ringöffnung von Epichlorhydrin (42) zwar enantioselektiv

katalysiert, doch ist die Aktivität gegenüber dem Co-Komplex 30 geringer. Der Mn-Komplex

35 zeigt dagegen überhaupt keine Aktivität. Dieser Aktivitäts- und Selektivitätsvergleich der

drei (S,S)-Salen-Komplexe 30, 33 und 35 steht damit in Einklang mit den Ergebnissen von

JACOBSEN und Mitarbeitern in der erwähnten Katalysatorstudie mit Benzoesäure (40) als

Nukleophil.[128]

Um die während der Reaktion entstehende Wärmeentwicklung bei der durch den

Co-Komplex 30 katalysierten Reaktion deutlicher werden zu lassen, wurde die IR-

thermographische Aufnahme nach 7 min Reaktionszeit mit einem veränderten


Temperaturfenster ausgewertet. Zum Vergleich ist das IR-Wärmebild nach 7 min

Reaktionszeit mit einem Temperaturfenster von 1 °C (Abb. 2.5, a) zusammen mit der

veränderten Aufnahme, die Temperaturdifferenzen bis ca. 9 °C erfassen kann (Abb. 2.5, b).

rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

30

33

35

30

33

35

Abb. 2.5: IR-Thermographieaufnahmen der übergangsmetallkatalysierten enantioselektiven nukleophilen Ringöffnung von 42 nach einer Reaktionszeit von 7 min mit unterschiedlichen Temperaturskalen von 1 °C (a) und 9 °C (b). Zur Durchführung siehe Kapitel 5.3.2.3.

Im linken Wärmebild in Abb. 2.5 können keine Aussagen über Temperaturunterschiede

getroffen werden, weil die Temperaturen in den drei „heißen“ Gefäßen oberhalb des

Temperaturbereichs liegen, die bei Verwendung dieses Temperaturfensters von 1 °C (a)

erfasst werden. Hingegen kann durch die nachträgliche Bearbeitung der IR-

thermographischen Aufnahmen der Temperaturbereich so eingestellt werden, dass eindeutig

die Temperaturunterschiede (und damit die Aktivität) in unterschiedlichen Gefäßen erkannt

werden können (Abb. 2.5, b). Der in diesem Zusammenhang beobachtete Temperaturanstieg

für die Reaktion vom Co-Komplex 30 mit dem (S)-Enantiomer von 42 auf > 37 °C ist

bemerkenswert.

Neben Informationen über die relativen Aktivitäten verschiedener Katalysatoren ist auch das

Substratspektrum eines Katalysators von Interesse. Dazu wurden die relativen

Substratreaktivitäten in der nukleophilen Ringöffnung der drei chiralen Epoxide 42, 44 und

46 unter Verwendung des Co-Komplexes 30 untersucht (Schema 2.4).

29.3

29.4

29.6

29.7

29.8

29.9

30.0 30.1

30.2

29.5

29

30

32

33

34

35

36

37

31

7 min

a b

7 min


Schema 2.4: Enantioselektive hydrolytische Ringöffnung chiraler Epoxide katalysiert durch den (S,S)-Co-Salen-Komplex(30).

Wie zuvor wurden die Racemate sowie die (S)- und die (R)-Enantiomere der drei Epoxide 42,

44 und 46 in getrennten Gefäßen untersucht. In neun Glasgefäße des Thermomixers wurden

zeilenweise Lösungen des zuvor mit Essigsäure an Luft[129] aktivierten Co-(S,S)-Salen-

Komplexes 30 in Toluol (vgl. Kapitel ) spaltenweise mit jeweils dem racemischen, dem (S)-

oder dem (R)-Enantiomer eines der drei Epoxide 42, 44 bzw. 46 versetzt. Die Konzentration

des Katalysators in den Mischungen mit einem Gesamtvolumen ca. 250 µl betrug 2 mol%.

Nach Durchführung der Kalibrierungsmessung (vgl. Kapitel 5.3.2.4) im Temperaturbereich

zwischen 24 °C und 36 °C und anschließender nichtlinearer Regression der Daten wurden die

Reaktionsgefäße auf 27 °C temperiert. Zur Temperaturdifferenzierung wurden die IR-

Thermographieaufnahmen teilweise mit zwei Temperaturbereichen von 7 = 2.5 °C und 8 °C

ausgewertet. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 0.55 Äquivalenten Wasser gestartet.

Der Reaktorblock wurde in periodischen Abständen geschüttelt und für die IR-

thermographische Detektion angehalten. Es wurden wiederum 500 Thermographieaufnahmen

in 10 Sekunden registriert, die geräteintern gemittelt wurden. Die zeitaufgelösten IR-thermo-

graphischen Aufnahmen nach Bearbeitung mit dem Programm MATLAB® sind in Abb. 2.6

für die Reaktionszeiten von 7 min, 14 min und 28 min gezeigt.

rac-44 R = CH2OBn (R)-44 45 rac-46 R = Ph (S)-46 47 rac-42 R = CH2Cl (R)-42 43

30 +

O

R

O

R ROH

OH

H2O / CH3COOH

Toluol27 °C


rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

44

46

42

29.5

29.0

28.5

28.0

27.5

44

46

42

33

32

31

30

29

28

27

26

rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

44

46

42

29.5

29.0

28.5

28.0

27.5

44

46

42

33

32

31

30

29

28

27

26

rac (S) (R) T / °C rac (S) (R) T / °C

44

46

42

29.5

29.0

28.5

28.0

27.5

44

46

42

Abb. 2.6: Zeitaufgelöste IR-thermographische Aufnahmen zur Untersuchung der relativen Substratreaktivitäten der drei chiralen Epoxide 42, 44 und 46 in der cobaltkatalysierten enantioselektiven Ringöffnung. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.3.2.4.

Aufgrund der Temperaturunterschiede in den Reaktionsgefäßen ist deutlich zu erkennen, dass

das Benzidylglycidyloxiran (S)-44 das reaktivste Substrat ist. Das (S)-Epichlorhydrin ((S)-42)

ist weniger reaktiv. Deutlich unreaktiver ist das (R)-Enantiomer von Styroloxid ((R)-46).

Aufgrund der Änderung der Deskriptoren nach der CIP-Nomenklatur setzt der (S,S)-Co-

Salen-Komplex bevorzugt das (R)-Enantiomer von Styroloxid ((R)-46) um. Die gleiche

be

28 min

d

14 min

c

14 min

b

7 min

a

7 min

be

28 min 26

27

28

29

30

31

32

33 f

28 min


relative Reaktivitätsabfolge von (R)-46 und (S)-42 wurde zuvor von JACOBSEN und

Mitarbeitern bei der Durchführung der gleichen Reaktion im Labormaßstab gefunden;[129]

Substrat 44 war nicht Bestandteil dieser Studie.

2.7.2.2 Rutheniumkatalysierte Ringschluss-Metathese von Olefinen

Eine elegante Methode zur Knüpfung von C–C-Bindungen stellt die

übergangsmetallkatalysierte Olefin-Metathese dar, bei der zwischen zwei substituierten

Alkenen formal die Alkylidengruppen ausgetauscht werden.[135]

R’

R’

R’’

R’’

+Katalysator

R’’R’

R’ R’’

+

Schema 2.5: Allgemeines Schema zur Olefin-Metathese symmetrisch substituierter Olefine.[135]

Diese Olefin-Metathese ermöglicht somit die Spaltung und Knüpfung von C–C-

Doppelbindungen. Obwohl diese durch eine Reihe von Übergangsmetallen katalysierte

Reaktion seit langem bekannt ist und industriell angewandt wurde bzw. wird,[136] z. B. im

PHILIPPS-Triolefin-Prozess[137], im SHOP[138] (Shell Higher Olefine Process) oder in der

ringöffnenden Olefinpolymerisation von Norbornen (Norsorex-Prozeß),[139] hat die Olefin-

Metathese erst in den letzten Jahren für die präparative organische Synthese an Bedeutung

gewonnen. Die Gründe dafür sind vielschichtig. Die Entwicklung neuer Katalysatoren hat die

Umsetzung hochfunktionalisierter und sterisch anspruchsvoller Olefine unter milden

Reaktionsbedingungen und in hohen Ausbeuten ermöglicht. Die verstärkten Forschungs-

aktivitäten auf diesem Gebiet führten zu einem verbesserten Verständnis der Substrat-

Katalysator-Wechselwirkung. Das Potential wird durch zahlreiche Anwendungen und

Weiterentwicklungen, z. B. in der Kreuz-Metathese[140] in der Naturstoffsynthese[141] oder in

der Alkin-Metathese[142] und der Metathese von Olefinen[143-145] unterstrichen.


Die intramolekulare Variante der Olefin-Metathese von Diolefinen wird als Ringschluss-

Metathese (Ring Closing Metathesis, RCM) bezeichnet (Schema 2.6).

Schema 2.6: Mechanismus der RCM von � -Diolefinen nach CHAUVIN.[135,144,146]

Nach den derzeitigen Vorstellungen über den Mechanismus verläuft die RCM über eine

alternierende Sequenz aus einer formalen [2+2]-Cycloaddition zwischen einer C=C-

Doppelbindung und einem Alkylidenmetallkomplex und einer nachfolgenden Cycloreversion

(CHAUVIN-Mechanismus, Schema 2.6).[135,144,146] CHAUVIN und Mitarbeiter postulierten als

erstes den Reaktionsablauf über eine Metallacyclobutan-Zwischenstufe (Schema 2.6, B). Die

Einzelheiten über die Struktur und die Eigenschaften der einzelnen Intermediate in diesem

allgemeinen Mechanismus sind jedoch noch nicht vollständig geklärt.[144] Dennoch konnten

in jüngster Zeit Arbeiten von GRUBBS und Mitarbeitern weitere Einblicke zum Verständnis

der einzelnen Zwischenstufen anhand der in ihrer Gruppe dargestellten Ruthenium-Komplexe

(vgl. Schema 2.7, 48 und 49) geben.[147] Demnach sind diese Komplexe

Katalysatorvorläufer, die nach einer [2+2]-Cycloaddition mit einem Olefin in ein

Metallacyclobutan (Schema 2.6, B) übergehen. Nach Cycloreversion wird bei Verwendung

terminaler Olefine Ethen und eine Metallcarben-Spezies gebildet (Schema 2.6, C), die in einer

[M] CH2

CH2

CH2

A

B C

D

CH2[M]

CH2CH2

CH2[M] [M]

RCM


weiteren [2+2]-Cycloaddition intramolekular mit einer weiteren Olefin-Einheit unter Bildung

eines zweiten Metallacyclobutans (Schema 2.6, D) reagiert. Der Katalysezyklus wird durch

die Cycloreversion dieser Zwischenstufe unter Ausbildung des zyklischen Olefins und

Rückbildung der katalytisch aktiven Metallcarben-Spezies (Schema 2.6, A) geschlossen. Im

Fall der von GRUBBS verwendeten Ruthenium-Komplexe LnRu=CH2 verlaufen 95 % der

RCM über diese Metallcarben-Spezies.[147]

Synthetische Anwendungen der RCM sind seit den 80er Jahren bekannt.[148,149] Eine

präparative Bedeutung gewann diese Reaktion jedoch erst durch die Entwicklung neuer

Metathesekatalysatoren innerhalb der letzten Jahre.[135] Der Durchbruch wurde mit den von

SCHROCK und Mitarbeitern vorgestellten vierfachkoordinierten Neopentyliden- und

Neophyliden-Molybdän-Komplexen[145,150] und insbesondere mit den von GRUBBS und

Mitarbeitern entwickelten Rutheniumalkylidenkomplexen[143,151-154] erzielt. Die

Vielseitigkeit dieser Katalysatoren und einige Weiterentwicklungen[144,145] konnten in

jüngster Zeit anhand zahlreicher Anwendungen in der Naturstoffsynthese,[141,155-157] in der

Festphasen-Synthese,[158] der Metathesepolymerisation azyklischer Diene (ADMET)[159]

und in der Entwicklung enantioselektiver Varianten[20] eindrucksvoll demonstriert werden.

Trotz der vielfältigen Anwendungen der RCM und der Bestrebungen, neue oder optimierte

Katalysatoren zu finden, ist bislang nichts bekannt über die Generierung einer

kombinatorischen Bibliothek von Liganden für oder von Metathese-Katalysatoren.[160] Ein

Grund dafür könnten die bislang fehlenden Screening-Verfahren für diese Reaktion sein.[20]

Obwohl anfangs keine thermodynamischen Daten über die RCM von Olefinen zur Verfügung

standen, wurde versucht, die Reaktion IR-thermographisch zu verfolgen. In einer

Zusammenarbeit mit M. LIEBL aus der Arbeitsgruppe von Professor A. FÜRSTNER am Max-

Planck-Institut für Kohlenforschung sollten die in Schema 2.7 gezeigten von GRUBBS und

Mitarbeitern beschriebenen Rutheniumalkylidenkomplexe 48[152] und 49[153,154] und die von

FÜRSTNER, HILL und Mitarbeitern entwickelten einfach zugänglichen Ruthenium-Komplexe

50 und 51[161] in einem Katalysator-Substrat-Screening miteinander verglichen werden.


Schema 2.7: Im IR-Thermographie-Screening verwendete Rutheniumcarbenkomplexe 48[153,154], 49[152], 50 und 51[161].

Da bislang alle IR-Thermographie-Messungen in offenen Gefäßen ausgeführt wurden,

schienen diese RCM-Katalysatoren aufgrund ihrer Toleranz gegenüber Feuchtigkeit und

Luftsauerstoff besonders geeignet.

In Vorversuchen wurde der Ruthenium-Komplex 49 in der Testreaktion von 1,7-Octadien

(52) zu Cyclohexen (53) und Ethen (54) eingesetzt (Schema 2.8).

Schema 2.8: Rutheniumkatalysierte RCM von 1,7-Octadien (52) unter Bildung von Cyclohexen (53) und Ethen (54).

Da in früheren Arbeiten substituierte � -Diolefinen wie 52 erfolgreich mit den Ruthenium-

Katalysatoren 48 und 49 in hohen Ausbeuten und bei milden Bedingungen umgesetzt werden

48 49

50 51

49

52 53 54

+ CH2 CH2

Ruthenium-Katalysator

RuCl

Cl PCy3

PCy3

RuCl

Cl PCy3

PCy3

H

RuCl

Cl PCy3

PCy3

RuPCy3

Cl

ClRu

Cl


konnten,[143,162] erschien das Substrat für Testversuche gut geeignet. Ebenfalls bekannt war

bei der Verwendung von 48 als RCM-Katalysator, dass eine erhöhte Temperatur bei hohen

Substratkonzentration zu verbesserten Umsätzen führt.[162-164] In ersten IR-Thermographie-

messungen wurde 1,7-Octadien (52) mit Katalysatorkonzentrationen zwischen 0.07 und

5 mol% umgesetzt. Die Reaktion wurde zwischen 40 °C und 60 °C unter den üblichen

Messbedingungen (Mikromaßstab (200 µl Gesamtvolumen), Kalibrierungsmessung, Offset-

IR-Thermographiemessung) durchgeführt. In keinem dieser ersten Versuche konnte jedoch

eine Temperaturdifferenz in den Wärmebildern festgestellt werden. Dass in den

Testversuchen unter den gewählten Bedingungen eine Reaktion stattgefunden hatte, konnte an

der teilweise heftigen Gasentwicklung in den Reaktionsgefäßen beobachtet werden.

Zusätzlich durchgeführte gaschromatographische Analysen bestätigten die Bildung von

Cyclohexen (53). Wurden die Versuche jedoch bei 30 °C durchgeführt, waren

Temperaturdifferenzen zu beobachten. Vier der fünf Reaktionsgefäße (Gefäße 1-4, Abb. 2.7)

wurden mit jeweils 100 µl unterschiedlich konzentrierten Toluollösung des Ruthenium-

Komplexes 49 versehen. Die Glasgefäße wurden nach Durchführung der Kalibrierungs-

messung (zwischen 25 °C und 35 °C) und der Offset-IR-Thermographiemessung bei 30 °C

mit jeweils 100 µl 1,7-Octadien versetzt. In dem mit K beschrifteten Reaktionsbehälter wurde

zur Kontrolle Octan anstatt 1,7-Octadien (52) zugegeben. Das gezeigte Wärmebild (250

gemittelte Bilder) wurde nach einer Reaktionszeit von einer Minute aufgenommen. In Abb.

2.7 ist eine IR-thermographische Aufnahme der durch den Ruthenium-Komplex 49

katalysierten RCM von 1,7-Octadien (52) abgebildet.

Obwohl die an dem Temperaturbalken erkennbaren Temperaturdifferenzen der

Reaktionslösungen in den Gefäßen 1, 2, 3 und 4 (Abb. 2.7) gegenüber dem Gefäß der

Kontrollreaktion K mehr oder weniger stark sind, wird deutlich, dass die Lösungen in den

Gefäßen 1-4 sich abgekühlt haben. Selbst bei einer Katalysatorkonzentration von nur

0.15 mol% (Gefäß 2, Abb. 2.7) des Ru-Komplexes 49 ist gegenüber der Kontrollreaktion K

unter diesen Bedingungen eine Abkühlung um 0.1-0.2 °C erkennbar.

1


Abb. 2.7: IR-thermographische Aufnahme der rutheniumkatalysierten RCM von 1,7-Octadien (52) katalysiert durch den Komplex 49 nach einer Reaktionszeit von einer Minute. Die Zahlen links neben den Gefäßen dienen zur Unterscheidung der Katalysatorkonzentrationen von 48: 1: 0.07 mol%; 2: 0.15 mol%; 3: 0.3 mol%; 4: 0.74 mol%; K: Kontrolle, 0.74 mol% Katalysator mit Octan versetzt. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.3.2.5.

Dieser beobachtete endotherme Effekt wurde in der gleichen RCM von 1,7-Octadien (52) zu

Cyclohexen (53) unter Verwendung der in Schema 2.7 gezeigten vier Rutheniumkatalysa-

toren 48, 49, 50 und 51 näher untersucht. Für diese weitergehenden IR-Thermographie-

untersuchungen wurden jeweils 100 µl einer 0.01 M Lösung der vier Ruthenium-Komplexe in

Toluol in die Glasgefäße des Thermomixers gegeben, wobei die Lösung des GRUBBS-

Katalysators 48 ein zweites Mal für eine Kontrollreaktion verwendet wurde. Zur Bestimmung

der während der Reaktion auftretenden Temperaturveränderungen wurde wieder eine

Kalibrierungsmessung durchgeführt. Die Wärmestrahlung dieses Arrays wurde bei sechs

Temperaturen zwischen 27 °C und 37 °C aufgenommen und anschließend eine nichtlineare

Regression der Daten durchgeführt. Für die Durchführungen der eigentlichen Reaktionen

wurden die Reaktionsgefäße auf 32 °C temperiert und anschließend eine Offset-IR-

Thermographiemessung aufgenommen, um nur die Wärmestrahlung der Reaktion sichtbar

werden zu lassen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl 1,7-Octadien (52) initiiert

(Gefäße 1-4, Abb. 2.8). Dies entspricht einer Katalysatorkonzentration von 0.15 mol%. Für

die Kontrollreaktion mit dem GRUBBS-Katalysator 48 (Gefäß K, Abb. 2.8) wurden wie schon

zuvor aufgrund ähnlicher physikalischer Eigenschaften 100 µl Octan zugegeben. Der

Reaktionsblock wurde in periodischen Abständen für kurze Zeit (5-10 Sekunden) geschüttelt.

1

30.20 30.15 30.10 30.05 30.00 29.95 29.90 29.85 29.80 29.75

30.25 T / °C

K

3 2

4

1


Für die IR-thermographische Detektion der auftretenden Temperaturänderungen wurde das

Schütteln unterbrochen. Innerhalb von 5 s wurden 250 Thermographieaufnahmen registriert,

die geräteintern gemittelt wurden. In Abb. 2.8 sind die zeitaufgelösten IR-Thermographie-

aufnahmen der Reaktion nach Bearbeitung mit dem Programm MATLAB® abgebildet, die

mit einem Temperaturfenster von 1.5 °C ausgewertet wurden.

T / °C T / °C

T / °C

Abb. 2.8 Zeitaufgelöste IR-thermographische Aufnahmen der RCM von 1,7-Octadien (52) katalysiert durch die GRUBBS-Komplexe (48 (Gefäß 1) und 49 (Gefäß 2)) und die von FÜRSTNER et al. 50 (Gefäß 3) und 51 (Gefäß 4). Das mit „K“ beschriftete Gefäß diente als Kontrollreaktion und enthält den GRUBBS-Katalysator 48 in gleicher Konzentration wie Gefäß 1 und Octan. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.3.2.5.

Die Abb. 2.8 a zeigt die Anordnung der mit den unterschiedlichen Katalysatoren bestückten

Reaktionsgefäße direkt nach der Offset-Messung und vor der Substratzugabe bzw. vor Zugabe

des Octans. Am einheitlichen Farbverlauf ist die homogene Temperaturverteilung innerhalb

der Reaktionsgefäße erkennbar. Die wiederum in manchen Gefäßen sichtbaren

halbmondförmigen Schattierungen rühren von lokal auftretenden Emissivitäts- bzw.

32.6

32.4

32.2

32.0

31.8

31.6

31.4

32.6

32.4

32.2

32.0

31.8

31.6

31.4

32.6

32.4

32.2

32.0

31.8

31.6

31.4

a b

c

K 1

3 2

4 vor

Substratzugabe 1 min

2 min


Reflexionsstörungen vom oberen Rand der Glasgefäße her und haben keinen Einfluss auf die

beobachtete Wärmestrahlung der Reaktion. In den Wärmebildern b und c in Abb. 2.8 ist die

Temperaturverteilung in den Gefäßen nach einer Reaktionszeit von 1 min (b) und 2 min (c)

zu sehen. Die im Vorversuch beobachtete Abkühlung der Reaktionslösungen ist in den

Gefäßen 1, 2 und 3 mit den Katalysatoren 48, 49 und 50 wieder eindeutig erkennbar. Dagegen

sind im Gefäß 4 und in dem der Kontrollreaktion K keine Temperaturveränderungen im

Vergleich mit dem Wärmebild a in Abb. 2.8 sichtbar. Ferner wird die relative Aktivität der

Katalysatoren 48, 49 und 50 in dieser Reaktion deutlich. Katalysator 49 (Gefäß 2) ist deutlich

weniger aktiver als 48 und 50. Diese qualitativen Beobachtungen konnten in präparativen

Experimenten unter identischen Reaktionsbedingungen bestätigt werden.[165]

Die Ursache dieses während der RCM deutlich auftretenden endothermen Effekts ist bislang

nicht vollständig geklärt. Nachträglich mit dem Programm ASPIN durchgeführte

thermodynamische Rechnungen der Umsetzung von 1,7-Octadien (52) zu Cyclohexen (53)

und Ethen (54) ergeben bei einem Druck von einem Bar und einer Temperatur von 30 °C eine

Standardreaktionsenthalpie von 4.8 kJ/mol.[166] Die durchgeführte Reaktion sollte demnach

schwach endotherm bzw. annährend thermoneutral sein. Anhand dieser Rechung könnten die

in den IR-Thermographieaufnahmen beobachteten Abkühlungseffekte interpretiert werden,

deren relativen Unterschiede letztendlich Aussagen über die Aktivität eines Katalysators

geben. Unter Umständen ist das während der Reaktion gebildete Ethen (54) für diese

„Kälteeffekte“ verantwortlich, denn eine Erklärung der beobachteten Abkühlung der

Reaktionsgefäße von etwa 0.8 °C im Gefäß 1 in Abb. 2.8 (Bild c) gegenüber der

Kontrollreaktion in Gefäß K auf Basis der schwachen Standardreaktionsenthalpie ist

unwahrscheinlich. Die Verdampfungswärme des gebildeten Ethens (54) aus der toluolhaltigen

Substrat-/Katalysatorlösung heraus könnte ebenso zu einer Abkühlung der Reaktionslösungen

beitragen wie die Mischungs- bzw. Solvatationsenthalpie des Ethens (54) in der Lösung. Des

Weiteren tauchen diese „Kälteflecken“ auch nur in den Gefäßen auf, in denen eine hohe

katalytische Aktivität der entsprechenden Ruthenium-Komplexe beobachtet wird. Somit

scheidet ein durch Verdampfen des Lösemittels hervorgerufener Abkühleffekt aus (die

Lösung der Kontrollreaktion zeigt keine Temperaturänderung). Da die beobachteten

endothermen (bzw. im Fall der enzymkatalysierten Acylierung oder der

übergangsmetallkatalysierten Hydrolyse von Epoxiden exothermen) Temperaturänderungen


der katalytischen Reaktion im direkten Zusammenhang mit der Aktivität eines Katalysators

oder Katalysatorvorläufers stehen, ist der Ursprung dieses Kälteeffekts zweitrangig.

In einer weiteren Testreaktion wurde ein Substrat-/Katalysator-Screening mit den vier in

Schema 2.7 gezeigten Ruthenium-Komplexen 48, 49, 50 und 51 und den in Schema 2.9

gezeigten Malonsäureesterderivaten durchgeführt.

Schema 2.9: In der RCM eingesetzte Diene für eine IR-thermographische Untersuchung eines Substrat-/Katalysator-Screenings.

Diese Versuche wurden in Polypropylen-Mikrotiterplatten mit einem entsprechenden

temperierbaren Schüttler (vgl. Kapitel 5.3.1.2) ausgeführt. In vier Kavitäten einer

Mikrotiterplatte wurde spaltenweise jeweils 100 µl eines der Diene gegeben (vgl. Abb. 2.9).

Nach Durchführung der Kalibrierungsmessungen zwischen 25 °C und 35 °C und nichtlinearer

Regression der Daten wurde die Mikrotiterplatte auf 30 °C abgekühlt, die Temperatur

konstant gehalten und anschließend die Offset-IR-Thermographiemessung durchgeführt. Die

Reaktion wurde durch die gleichzeitige Zugabe von jeweils 100 µl einer der vier 0.1 M

Katalysatorlösungen in Toluol zu jeweils einem der Substrate mit Hilfe einer Mehrkanal-

48-51

n = 1 55 56

n = 2 57 58

n = 3 59 60

48-51

61 62

48-51

63 64

CO2EtEtO2CEtO2C CO2Et

30 °C

CO2EtEtO2CEtO2C CO2Et

30 °C

30 °C

EtO2C CO2Et

( )n

CO2EtEtO2C

( )n


Pipette gestartet. Die Zugabefolge wurde bei Substrat 63 begonnen und nacheinander wurden

die Diene 61, 59, 57 und 55 mit den Katalysatorlösungen versetzt. Die Mikrotiterplatte wurde

in periodischen Abständen für 10 Sekunden geschüttelt. Für die IR-thermographische

Detektion der Temperaturänderungen wurde das Schütteln unterbrochen. Die Detektionszeit

betrug 5 Sekunden, innerhalb derer 250 Thermographieaufnahmen registriert und geräteintern

zu einem Wärmebild gemittelt wurden.

63 61 59 57 55 T / °C 63 61 59 57 55 T / °C

51

50

49

48

51

50

49

48

63 61 59 57 55 T / °C 63 61 59 57 55 T / °C

51

50

49

48

51

50

49

48

63 61 59 57 55 T / °C

51

50

49

48

Abb. 2.9 Zeitaufgelöste IR-Thermographie-Aufnahmen eines Substrat-/Katalysator-Screenings der rutheniumkatalysierten RCM der Diene 55, 57, 59, 61 und 63 mit den Katalysatoren 48-51. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.3.2.6.

28.5

29.0

29.5

30.0

30.5 c

5 min

28.5

29.0

29.5

30.0

30.5 e

17 min

28.5

29.0

29.5

30.0

30.5

30 s

a

28.5

29.0

29.5

30.0

30.5

2 min

b

28.5

29.0

29.5

30.0

30.5 d

10 min


In Abb. 2.9 sind zeitaufgelöste IR-Thermographieaufnahmen der Reaktion nach

anschließender Bearbeitung mit dem Programm MATLAB® abgebildet. Die Zeiten in den IR-

thermographischen Abbildungen entsprechen der jeweiligen Reaktionszeit nach beendeter

Zugabe der Diene. Zur Temperaturdifferenzierung wurde ein Temperaturfenster von

7 = 2 °C verwendet. Auch hier sind die zeitlich aufgelösten Temperaturdifferenzen in den

Kavitäten der Mikrotiterplatte deutlich erkennbar. Es fällt auf, dass die Diene 55 und 57, die

zu den 5- bzw. 6-gliedrigen Olefinen 56 und 58 zyklisieren, die reaktivsten Substrate

darstellen. Besonders auffällig ist die hohe Aktivität des Ruthenium-Katalysators 48

gegenüber diesen Substraten. Nach einer Reaktionszeit von 2 Minuten wird keine so starke

Abkühlung der Lösungen mehr beobachtetet, was zu der Vermutung führt, dass die Diene zu

diesem Zeitpunkt bereits größtenteils umgesetzt sind. Die Reaktivität des Diens 59, das zu

dem entsprechenden 7-gliedrigen Ring 60 umgesetzt wird, ist deutlich geringer. Eine noch

geringere Reaktivität zeigen die Diene 61 und 62. Ersteres enthält eine zweifach-substituierte

Doppelbindung. Bei letzterem ist eine innere Doppelbindung enthalten und bei der

Umsetzung entsteht neben dem Reaktionsprodukt 64 auch Propen. Ein direkter Vergleich mit

Substrat 62 ist daher schwierig, da die Propenbildung zu anderen Enthalpieeffekten in der

Reaktionslösung führen kann als die Ethenbildung.

Weiterhin erschwert diese Vorgehensweise bei der Katalysatorzugabe eine Interpretation der

Daten. Der Zeitraum von etwa 90 Sekunden, der für das parallele Befüllen der Katalysator-

lösungen notwendig war, führt zu einer zeitlich verzögerten Detektion der katalytischen

Aktivität. Das heißt, bis zum Zeitpunkt der ersten IR-thermographischen Aufnahme, die

30 Sekunden nach beendeter Zugabe der Katalysatorlösungen und Schütteln der

Mikrotiterplatte erfolgte (vgl. Abb. 2.9), war das Substrat 63 bereits 2 Minuten mit den

Katalysatoren in Kontakt und zu großen Teilen umgesetzt. Der den Wärmebildern c und d in

Abb. 2.9 zufolge für die Umsetzung des Diens 63 aktive Katalysator 51 ist tatsächlich

weniger aktiv als die Ruthenium-Komplexe 48-50. Da das Dien 63 zu dem Zeitpunkt (10 min

Bild d, Abb. 2.9) schon annähernd vollständig umgesetzt wurde, sind in den entsprechenden

Kavitäten der Mikrotiterplatte auch keine deutlichen Temperaturdifferenzen mehr erkennbar.

Das Reaktivitätsmuster des Diens 63 in Reaktionen mit den Ruthenium-Katalysatoren 48-51

konnte durch Laborexperimente gestützt werden.[165] Diese bestätigen, dass 51 in der

Umsetzung mit 63 den Katalysator mit der geringsten Aktivität darstellt.


Abhilfe schaffen könnte eine inverse Zugabe der Katalysatoren zu den Substraten. In jedem

Fall würden auch hier Verfälschungen bei der Interpretation der IR-thermographischen

Aufnahmen auftreten, da dann die hohe Reaktivität der Substrate 55 und 57 unterdückt bzw.

gar nicht sichtbar wird.

Anhand dieses Beispiels wird die Problematik eines Substrat-/Katalysator-Screenings durch

eine IR-thermographische Detektion mit derart reaktiven Substraten bzw. derart aktiven

Katalysatoren deutlich. Die Katalysatorkonzentration muss einerseits so hoch sein, damit die

Temperaturdifferenzen der Reaktion durch die IR-Kamera erfasst werden können. Ferner

limitiert dieses Vorgehen eine gleichzeitige Detektion aller Reaktionen von Beginn an,

dadurch dass nur eine begrenzte Zahl der untersuchten Substrate (bzw. Katalysatoren)

gleichzeitig mit Katalysator (bzw. Substrat) versetzt werden kann. Einen Ausweg bieten

kommerziell erhältliche Flüssigkeitsdilutoren, die eine simultane Zugabe von (im Idealfall

aller) Lösungen einer Mikrotiterplatte in die Kavitäten einer weiteren ermöglichen. Solch ein

System stand für diese Untersuchungen nicht zur Verfügung. Es wäre für ein ausgedehnteres

Screening wie im oberen Fall jedoch erforderlich, um das Aktivitäts- bzw. Reaktivitäts-

verhalten von Katalysatoren bzw. Substraten mit dieser Detektionsmethode miteinander

vergleichen zu können.

2.7.3 Zusammenfassung der IR-thermographischen Untersuchungen und

Ausblick

In dieser Arbeit konnte erstmals die Anwendung der IR-Thermographie als Detektions-

methode zur zeitaufgelösten Untersuchung von katalytischen Reaktionen in Lösung

demonstriert werden. Ferner wurde erstmals enantioselektive Katalyse IR-thermographisch

erfasst. Neben der Untersuchung einer lipasekatalysierten Acylierung eines chiralen Alkohols

konnte in der übergangsmetallkatalysierten hydrolytischen Ringöffnung von chiralen

Epoxiden anhand der während der Reaktion entstehenden Temperaturänderungen die

katalytische Aktivität verschiedener chiraler Übergangsmetall-Salen-Komplexe detektiert

werden. Durch die getrennte Untersuchung der reinen Enantiomere und des Racemats eines

speziellen Substrats konnten zudem die relativen Enantioselektivitäten der Katalysatoren

qualitativ bestimmt werden. Dabei konnten in allen Fällen die in der Literatur bekannten


Aktivitäts- bzw. Selektivitätsmuster der untersuchten Reaktionen nachvollzogen werden. Die

allgemeine Anwendbarkeit der IR-Thermographie zum Screening von katalytischen

Prozessen in Lösung konnte zudem in der rutheniumkatalysierten Ringschluss-Metathese

(RCM) von Olefinen gezeigt werden. Durch die während der Reaktion auftretenden

unterschiedlich starken Abkühlungen der Reaktionslösungen konnten die aktivsten

Katalysatoren identifiziert werden. Obwohl im speziellen Fall der RCM von 1,7-Octadien

(52) zu Cyclohexen (53) und Ethen (54) thermodynamische Rechnungen[166] ergaben, dass

die Reaktion nur schwach endotherm ist, tragen vermutlich aufgrund der Bildung von Ethen

oder Propen hervorgerufenen Enthalpieänderungen (z. B. durch Mischungs- oder

Solvatationsenthalpie) oder die Verdampfungswärme des Ethens (54) zu einer Abkühlung der

Reaktionslösung bei. Da die Temperaturänderungen der Reaktionen im Zusammenhang mit

der katalytischen Aktivität stehen, können die beobachteten Kälteeffekte zum Screening von

Katalysatorbibliotheken herangezogen werden. Entgegen der allgemein vertretenen

Annahme[13,20] konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass die IR-Thermographie

nicht nur zum Screening exothermer Reaktionen geeignet ist. Durch katalytische Reaktionen

hervorgerufene endotherme Effekte können ebenfalls in Wärmebildern sichtbar gemacht

werden, so dass selbst die Detektion schwach endothermer oder thermoneutraler Prozesse

möglich ist.

Ein Screening mittels IR-Thermographie sollte prinzipiell auch auf andere Prozesse

übertragbar sein; vorausgesetzt, die durch die Reaktion hervorgerufene Temperaturänderung

der Lösung (und damit die Änderung der Wärmestrahlung) ist groß genug, um durch eine IR-

Kamera detektiert werden zu können. Beispiel für stark exotherme Reaktionen sind vielfältig,

wie die Epoxidation von Alkenen, die Hydrierung von Olefinen, die DIELS-ALDER-Reaktion

oder die Hydroborierung[20,167] und bieten sich für eine IR-thermographisches Screening der

Aktivität von Katalysatorbibliotheken an. Prinzipiell denkbar ist auch eine Quantifizierung

der durch die Temperaturänderung einer Reaktion hervorgerufenen IR-Wärmestrahlung, die

sich mit dem in dieser Arbeit verwendeten IR-Thermographiesystem jedoch nicht ohne

weiteres erfassen lässt. Andere kommerziell erhältliche IR-Thermographiesysteme bieten die

Möglichkeit einer genauen zeitaufgelösten Temperaturbestimmung und sollten eine

Quantifizierung in weiten Bereichen ermöglichen.[168]

Kapitel 3

ESI-MS-Screening auf Enantioselektivität

3.1 Allgemeine Bemerkungen 65

3 ESI-MS-Screening auf Enantioselektivität

3.1 Allgemeine Bemerkungen

Die Methoden der kombinatorischen Chemie und der gerichteten Evolution stellen mehrere

Anforderungen an die Analysen- bzw. Detektionsmethoden (vgl. Kapitel 1.3).[5,169] Eine

hohe Empfindlichkeit der Methoden ist die Voraussetzung, um die oftmals nur in geringen

Mengen zur Verfügung stehenden Substanzen nachweisen zu können. Weitere Erfordernisse

neben der Automatisierbarkeit eines Analysenverfahrens sind kurze Analysenzeiten und eine

geringe Probenvorbereitung, um hohe Probenaufkommen zu bewältigen. Anforderungen

werden ebenfalls an die Verarbeitung der Daten gestellt, die automatisierbar sein sollte.[5] Die

derzeitigen Techniken sind jedoch nicht in der Lage, allen Erfordernissen gerecht zu werden,

so dass oft verschiedene Analysenverfahren miteinander gekoppelt werden. Während in der

kombinatorischen Wirkstoffchemie auf viele effektive Methoden zum Durchsuchen großer

Bibliotheken biologisch aktiver Substanzen zurückgegriffen werden kann,[5] steht die

Entwicklung von High-Throughput-Screening-Verfahren zum Testen von enantioselektiven

Metallkatalysatoren oder Biokatalysatoren erst am Anfang (vgl. Kapitel 1.3 und Kapitel 2.7).

In diesem Kapitel wird eine neue Methode zur Bestimmung der Enantioselektivität von

kinetischen Racematspaltungen und von asymmetrisch verlaufenden Reaktionen prochiraler

Verbindungen mit enantiotopen Gruppen beschrieben. Die Methode beruht auf der

Verwendung von isotopenmarkierten Substraten und einem isotopenspezifischen

Detektionssystem. Hierfür wird die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-

Massenspektrometrie oder ESI-MS) verwendet, die in Kombination mit einem

automatisierten Probenaufgabesystem die Analyse einer großen Zahl katalytischer

asymmetrischer Reaktionen ermöglicht. In dem folgenden Kapitel werden in Kürze die

Grundlagen der in der kombinatorischen Chemie gebräuchlichen massenspektrometrischen

Meßmethoden und die Anwendungsmöglichkeiten der Massenspektrometrie (MS) in der

kombinatorischen Chemie unter besonderer Berücksichtigung einiger Beispiele zum

Katalysator-Screening erläutert.

66 3 ESI-MS-Screening auf Enantioselektivität

3.2 Massenspektrometrische Methoden in der kombinatorischen Chemie und Katalyse

Die gängigen massenspektrometrischen Techniken[170-172] sind nicht nur zur

Charakterisierung von kombinatorisch hergestellten Produktgemischen und

polymergebundenen Verbindungen geeignet, sondern auch zum Screening von

Katalysatorbibliotheken. Die Messungen werden zwar seriell durchgeführt, nehmen jedoch

wenig Zeit in Anspruch und sind zudem automatisierbar. Dies mag ein Grund dafür sein,

warum die Massenspektrometrie die momentan am vielfältigsten einsetzbare

Analysenmethode im Bereich der kombinatorischen Chemie darstellt.[169]

3.2.1 Messtechniken

Zur Analyse von kombinatorisch erzeugten Substanzbibliotheken sind unterschiedliche

massenspektrometrische Methoden von Bedeutung.[169,173] Eine weit verbreitete Methode

stellt die ESI-Massenspektrometrie dar.[174-176] In Abb. 3.1 ist eine schematische Darstellung

des Messprinzips dargestellt.

Abb. 3.1: Schematische Darstellung des Messprinzips der ESI-Massenspektrometrie.[169]

Kapillare Probe in

Lösung

Quadrupol

Detektor geladenes Aerosol

± 2-6 kV

Linsensystem

3.2 Massenspektrometrische Methoden in der kombinatorischen Chemie und Katalyse 67

Die gelöste Probe (z. B. das Eluat einer Flüssigkeitschromatographiesäule, LC-Säule) wird in

eine Metallkapillare injiziert, an deren Spitze ein starkes elektrisches Feld anliegt. Das

Potential an der Spitze ist gerade so hoch, dass keine Entladung stattfindet. Unter bestimmten

Flussbedingungen bildet sich nach Verlassen der Kapillare auch ohne thermische

Unterstützung der Desolvatisierung bei Atmosphärendruck ein feiner Nebel aus elektrisch

geladenen Tröpfchen. Die anfangs gebildeten elektrisch geladenen Tröpfchen haben einen

Durchmesser von einigen Mikrometern. Während des Desolvatisierungsvorgangs der Probe

wächst die Feldstärke auf der Tropfenoberfläche sehr stark an, so dass entweder einfach oder

mehrfach geladenen Ionen aus der Flüssigkeit in die Gasphase übergehen (spontane Ionen-

Emission)[171] und diese im Hochvakuum des Massenspektrometers detektiert werden

können. Je nach Polarität der angelegten elektrischen Spannung bilden sich Ionen mit

überwiegend positiver [M+nX] n+ (positiver Ionen-Modus) oder negativer Ladung [M–nX] n–

(negativer Ionen-Modus) mit X = z. B. H+, Na+, Ka+ oder NH4+. Eine effektivere Vernebelung

der gelösten Probe wird durch einen konzentrischen Gasfluss (Ion Spray) um die

Kapillarspitze herum erreicht.[171,172] Dies hat zur Konsequenz, dass eine Ionen-Spray-

Ionenquelle mit deutlich höheren Flussraten betrieben werden kann als bei der reinen

Elektrospray-Methode.[171] Zur Überleitung der gebildeten Ionen werden oft

Quadrupolmassenfilter eingesetzt, die in Abhängigkeit von der daran angelegten elektrischen

Spannung die Ionen entsprechend ihrem Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) selektiv zum

Detektor gelangen lassen. Durch Verwendung von sogenannten Triple-Quadrupol-ESI-

Massenspektrometern wird die gezielte Fragmentierung von Ionen mit bestimmten Massen

ermöglicht. Diese auch als Tandem-Massenspektrometrie (auch MS/MS) bezeichnete

Methode liefert zusätzliche Informationen anhand des Fragmentierungsmusters. Einen großen

Vorteil bietet die Möglichkeit, die ESI-Massenspektrometrie mit chromatographischen

Verfahren wie der Flüssigkeitschromatographie (LC/MS-Kopplung) oder der Kapillarzonen-

Elektrophorese (CZE/MS) zu koppeln. Mit diesen Methoden wird die Auftrennung und

Analyse von komplexen Substanzgemischen ermöglicht.[169,172] Eine ausführlichere

Darstellung über die Grundlagen und Anwendungen der ESI-Massenspektrometrie gibt

COLE.[177]

Eine weitere massenspektrometrische Methode, die in der kombinatorischen Chemie vielfach

eingesetzt wird, ist die MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-

Of-Flight-MS).[169,172,173,178,179] Bei dieser Technik wird die Probe in eine feste Matrix


eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls werden die Probenmoleküle verdampft und

schonend ionisiert. Primär entstehen bei dieser sehr milden Ionisationsmethode einfach

geladene Ionen, die nachfolgend in einem elektrischen Feld stark beschleunigt werden. Durch

einen Flugzeitanalysator (Time-Of-Flight, TOF) wird die Masse der Ionen bestimmt. Das

Detektionssystem beruht darauf, dass verschiedene Ionen mit gleicher Energie aber einer

unterschiedlichen Masse für das Zurücklegen der gleiche Strecke im Analysator eine

unterschiedliche Zeit benötigen.[169]

Eine interessante, wenn auch technisch noch nicht ganz ausgereifte Entwicklung stellt die

Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (TOF-SIMS) dar.[180] Diese Methode eignet

sich zur direkten On-Bead-Analyse von kombinatorischen Bibliotheken bei hoher räumlicher

Auflösung. Die Ionisation der Probe erfolgt mit einem Galliumionenstrahl, wobei die

Oberfläche der Probe (polymergebundene Verbindungen) unter Bildung von Sekundärionen

abgetragen wird.[169] Momentan liefert diese Methode im Vergleich zu den bisher erwähnten

Techniken schlechter interpretierbare Spektren.[169,181]]

Für eine ausführliche Beschreibung von massenspektrometrischen Techniken sei auf die

Literatur verwiesen.[170-172]

3.2.2 Anwendungen der MS in der kombinatorischen Chemie

Die Anwendungen der Massenspektrometrie in der kombinatorischen Chemie sind sehr

vielfältig. Aufgrund von Kopplungen mit anderen analytischen Methoden (LC, GC oder CE)

ergeben sich zusätzliche Anwendungsmöglichkeiten, auf die im Rahmen dieser Arbeit jedoch

nicht eingegangen wird.

Alternativ zum EDMAN-Abbau können Peptide mittels ESI- oder MALDI-MS sequenziert

werden.[169,172]. Diese Methode der Peptidsequenzierung beruht im Prinzip darauf, dass sich

die Peptidbindung einfacher spalten lässt als chemische Bindungen des Peptidrückgrates oder

der Seitenketten. Durch Tandem-MS lassen sich die Ionen selektiv fragmentieren. Anhand

des Fragmentierungsmusters können die Bruchstücke identifiziert und die Sequenz des

Peptids ermittelt werden. Eine Weiterentwicklung stammt von YOUNGQUIST et al., die

während der Peptidsynthese in jedem Kupplungsschritt durch Zugabe einer kleinen Menge

eines speziellen Reagenzes einen sequenzspezifischen Kettenabbruch erreichen, so dass ohne

Fragmentierung direkt die Sequenz bestimmt werden kann.[182]

3.2 Massenspektrometrische Methoden in der kombinatorischen Chemie und Katalyse 69

Dass sich massenspektrometrische Methoden gut zur Strukturprüfung von kombinatorisch

generierten Substanzbibliotheken eignen, konnte erstmals anhand der Untersuchung von

Peptidbibliotheken gezeigt werden.[183,184] Mit Hilfe des Syntheseplans einer

Peptidbibliothek lässt sich die Verteilung der Peptide und der Massen berechnen. Durch einen

Vergleich der theoretischen Massenverteilung mit der tatsächlichen aus dem Massenspektrum

erhaltenen kann die Qualität der Bibliothek beurteilt werden.[169]

Wie oben bereits erwähnt, eignen sich massenspektrometrische Analysenmethoden ebenfalls

zur Untersuchung von einzelnen Beads, d. h. von festphasengebundenen Substanzen.[169]

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Massenspektrometer, die einen Nachweis von

Substanzen im Femtomolbereich erlauben, ist die direkte Festphasen-Analyse durch ESI-MS,

MALDI-TOF-MS oder TOF-SIMS möglich. Die Abtrennung des polymeren Trägerharzes

vom Produkt kann bei Verwendung säurelabiler oder photolabiler Linker durch Umsetzung

mit gasförmiger Trifluoressigsäure bzw. UV-Licht erfolgen. Bei Anwendung der TOF-SIMS-

Technik (s. o.) kann das Produkt direkt analysiert werden. Für die ESI-MS-Analyse müssen

die abgespaltenen Substanzen noch gelöst werden, wohingegen MALDI-TOF-

Untersuchungen die Einbettung der Proben in eine Matrix erfordern. Eine elegante Weiterent-

wicklung beschreiben FITZGERALD und Mitarbeiter.[185] Durch Verwendung eines

photolabilen Linkers und der MALDI-TOF-MS werden durch den Laser des

Massenspektrometers die zuvor in eine Matrix eingebetteten polymergebundenen Substanzen

gleichzeitig von der Festphase abgespalten, verdampft und ionisiert.

Eine weitergehende Beschreibung massenspektrometrischer Techniken und deren Einsatz in

der kombinatorischen Chemie gibt die Literatur.[169,173]

3.2.3 Screening von homogenen und heterogenen Katalysator-

Bibliotheken

Wie in Kapitel 1.1 bereits erwähnt, stellt das Screening von Katalysator-Bibliotheken einen

neuen Ansatz dar, um neue Katalysatoren zu finden bzw. bestehende zu optimieren.

Mittlerweile gibt es eine Reihe von Methoden, die sich für ein Screening von homogenen und

heterogenen Katalysatoren eignen.[13] Innerhalb des letzten Jahres sind mehrere

Veröffentlichungen erschienen, die über ein Katalysator-Screening durch massenspektro-

metrische Techniken berichten.


Die erste dieser Arbeiten stammt von WEINBERG und Mitarbeitern, die ein speziell zur

Hochgeschwindigkeitsrasterung von Heterogenkatalysator-Bibliotheken entwickeltes

Massenspektrometer verwenden.[186] Mit diesem Gerät konnten die Anfangsaktivitäten und

-selektivitäten einer durch In-situ-Verdampfungstechniken hergestellten Bibliothek getestet

werden. Die Analysenzeit betrug für jede Komponente etwa eine Minute. Leider handelt es

sich bei dem verwendeten Gerät um eine technisch aufwendige und zudem kostenintensive

Konstruktion, deren Einsatz für routinemäßige Anwendungen fragwürdig ist.

Eine weitere Entwicklung stammt von MAIER und Mitarbeitern.[187] Durch Verwendung

eines kommerziell erhältlichen Gasanalyse-Massenspektrometers und eines Syntheseroboters,

dessen Dosiereinheit durch verschiedene Kapillaren für die Eduktzufuhr und die

Produktanalyse ersetzt wurde, ist eine ortsaufgelöste Bestimmung der Produktselektivitäten

von Reaktionen heterogener Katalysator-Bibliotheken möglich. Der Vorteil dieser Methode

liegt in der einfachen Durchführbarkeit. Von Nachteil ist, dass mit diesem Aufbau nur

Reaktionen unter Normaldruck verfolgt und – wie im ersten Beispiel – nur die Selektivitäten

zu Beginn der Reaktion erfasst werden können.

Von SENKAN und Mitarbeitern wurde ein parallel arbeitendes Mehrkammerreaktorsystem zur

Verfolgung der Aktivitäts- und Selektivitätsentwicklung von Heterogenkatalysator-

Bibliotheken entwickelt.[188,189] Die Kopplung eines Mehrkammerreaktorsystems mit einer

Kapillarprobenentnahme und der TOF-Massenspektrometrie ermöglicht die zeitgleiche

Analyse vieler heterogenkatalysierter Reaktionen auch über einen längeren Zeitraum hinweg.

Auf diese Weise ermöglicht diese Methode nicht nur die Bestimmung von Anfangsaktivitäten

und -selektivitäten, sondern auch eine Erfassung von Induktionsperioden und unterscheidet

sich dadurch von den beiden erstgenannten.

CHEN und Mitarbeiter berichteten erstmals über die Anwendung massenspektrometrischer

Techniken im Screening homogener Katalysator-Bibliotheken für die Olefinpolymeri-

sation.[190] Durch Anwendung von ESI-MS/MS konnte die gleichzeitige, kompetitive

Untersuchung mehrerer katalysierter Reaktionen anhand der Ethylenpolymerisation mit

Diimin-Katalysatoren vom BROOKHART-Typ demonstriert werden. Nach Abbruch der

Polymerisationen führen nachfolgende Ionen-Molekül-Reaktionen zu einer erheblichen

Vereinfachung der sehr komplexen Massenspektren von Polymermischungen.


3.3 Zielsetzung der eigenen Arbeiten

Obwohl massenspektrometrische Analysen nur seriell durchführbar sind, demonstrieren die

Beispiele im letzten Kapitel die vielfältigen Einsatzmöglichkeiten der Massenspektrometrie in

der kombinatorischen Chemie und für ein Screening von homogenen und heterogenen

Katalysator-Bibliotheken. Zudem kann durch die Massenspektrometrie neben der

Identifizierung von Substanzen in komplexen Gemischen eine quantitative Bestimmung

bekannter Verbindungen erfolgen.[172]

Die Suche nach einem optimalen Katalysator für eine asymmetrische Transformation eines

speziellen Substrats ist aufwendig und oftmals mangelt es an einem geeigneten Testverfahren,

das eine exakte Bestimmung der Stereoselektivität der gewünschten Umsetzung in kurzer Zeit

ermöglicht (vgl. 1.3). Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit sich die

Massenspektrometrie unter Verwendung von isotopenmarkierten Substraten zum Screening

auf Enantioselektivität von Racematspaltungen und asymmetrischen Reaktionen prochiraler

Substrate eignet. Nach der Methodenentwicklung bestand eine weitere Aufgabe darin, das

Verfahren weitestgehend zu automatisieren. Nur so kann bei einer möglichen Anwendung in

der gerichteten Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität von Enzymen und im

Screening asymmetrischer metallkatalysierter Prozesse ein hoher Probendurchsatz

gewährleistet werden.

3.4 MS-Screening auf Enantioselektivität

3.4.1 Allgemeine Bemerkungen

Der Einsatz isotopenmarkierter Substanzen zur Untersuchung chemischer Reaktionen durch

massenspektrometrische Techniken ist weit verbreitet. Ein Anwendungsgebiet besteht in der

Verwendung solcher Substanzen zum Studium enzymkatalysierter Reaktionen.[172]

GEYSEN und Mitarbeiter beschrieben 1996 eine Methode zur Analyse kombinatorisch

generierter Substanzbibliotheken.[191] Durch Verwendung isotopenmarkierter Aminosäure-

mischungen können die Komponenten der Bibliothek nach Abspaltung von der festen Phase

durch diesen „Massencode“ schnell und einfach identifiziert werden.

Für ein auf Massenspektrometrie basierendes Screening-Verfahren zur Bestimmung der

Enantioselektivität lag im Rahmen der eigenen Arbeiten folgende Idee zugrunde: Durch eine


isotopenspezifische Detektionsmethode wie die Massenspektrometrie sollten sich bei

Verwendung isotopenmarkierter Substrate in Form von pseudo-Enantiomeren oder pseudo-

prochiraler Verbindungen die relativen Mengen der Reaktanden und/oder Produkte

asymmetrisch verlaufender Reaktionen direkt bestimmen lassen, ohne dass dabei eine

Trennung der chiralen Verbindungen oder die Bildung von Diastereomeren erforderlich ist.

Der Begriff pseudo-Enantiomere ist in der Literatur bereits beschrieben. Pseudo-Enantiomere

sind chirale Verbindungen, die sich nur durch zwei Merkmale, eine umgekehrte absolute

Konfiguration und eine Isotopenmarkierung, voneinander unterscheiden. 1 : 1-Mischungen

pseudo-enantiomerer Verbindungen werden als pseudo-Racemate bezeichnet und in der

medizinischen Forschung für stereoselektive Metabolismus-Studien eingesetzt.[192-195] Doch

sollte dieser Begriff laut neuerer Literatur nicht mehr verwendet werden.[196]

HOREAU et al. beschrieben 1990 eine massenspektrometrische Methode zur Bestimmung der

Konfiguration sekundärer Alkohole.[197] Durch Derivatisierung eines chiralen Alkohols

unbekannter Konfiguration mit einem Überschuss einer 1 : 1-Mischung von

isotopenmarkierten pseudo-enantiomeren Anhydriden werden pseudo-diastereomere Ester

gebildet, deren Diastereomerenüberschuss sich über das Verhältnis der totalen Intensitäten

aus dem Massenspektrum bestimmen lässt. Die Anwendung von HOREAUS

massenspektrometrischer Methode ist prinzipiell zur Bestimmung des Enantiomeren-

überschusses in einem Screening übertragbar. Die notwendige Derivatisierung stellt jedoch

einen zusätzlichen Schritt dar.

Basierend auf der von HOREAU entwickelten Methode berichten SIUZDAK, FINN und

Mitarbeiter 1999 unabhängig von unseren Studien über eine Weiterentwicklung.[198] Als

Derivatisierungsreagenz werden Acylierungsmittel in Form pseudo-enantiomerer chiraler

Säuren verwendet, die sich durch einen Substituenten, der nicht an das chirale Zentrum

gebunden ist, in ihrer Masse unterscheiden. In Reaktionen mit chiralen Alkoholen oder

Aminen werden aufgrund unterschiedlicher Reaktionsgeschwindigkeiten pseudo-

Diastereomere gebildet. In Schema 3.1 ist das allgemeine Reaktionsschema für die Reaktion

eines chiralen Alkohols mit massenmarkierten Säuren in Gegenwart einer Base und DCC

dargestellt.


Schema 3.1: Schematische Darstellung der Reaktion eines chiralen Alkohols mit chiralen Säuren („A“ bzw. „B“) unterschiedlicher Masse in Gegenwart von DCC und einer Base.[198]

Aus dem Massenspektrum kann im Anschluss an die Derivatisierung das Verhältnis der

totalen Intensitäten der erzeugten Ester bestimmt und anhand von zwei Eichmessungen der

Enantiomerenüberschuss der Probe ermittelt werden. Die Abweichungen der Enantiomeren-

bestimmung vom wahren ee-Wert liegen bei ±10 %. Trotz des Mehraufwandes durch eine

zusätzliche Derivatisierung und Eichmessungen ist die Methode damit ausreichend genau für

eine Screening asymmetrischer Prozesse auf Enantioselektivität.[198]

Eine weiteres Beispiel zur Verwendung solcher 1 : 1-Mischungen von isotopenmarkierten

Verbindungen findet sich in der Literatur der Wirt-Gast-Chemie. Mit pseudo-enantiomeren

Kronenethern lassen sich die Selektivitäten chiraler Erkennungsphänomene in Wirt-Gast-

Komplexen bestimmen.[199-202]

In dem folgenden Abschnitt werden die möglichen Anwendungsgebiete der eigenen

Screening-Methode auf Enantioselektivität (Kapitel 3.4.2) dargelegt. Vor der Entwicklung

eines Screening-Systems wurde in Vorversuchen die Präzision und Richtigkeit der ee-

Bestimmungen mit dieser Methode (Kapitel 3.4.3) sowie mögliche Einflüsse der

Isotopenmarkierung auf die Enantiomerenüberschüsse asymmetrischer Reaktionen (Kapitel

3.4.4) untersucht. Die Anwendbarkeit der Methode wird anhand einiger Beispiele

demonstriert (Kapitel 3.4.5). In Kapitel 3.4.6 wird der apparative Aufbau des Screening-

Systems erläutert. In Kapitel 3.4.7 wird ein Beispiel zum Screening auf Enantioselektivität

durch MALDI-TOF-MS beschrieben.

A CO2R

(S)

A CO2R

(R)

R OH

(R)

R OH

(S)

+

B CO2R

(R)

B CO2R

(S)

Base, DCClangsam

Base, DCCschnell

Base, DCCschnell

Base, DCClangsam

A CO2H

A CO2H

B CO2H

B CO2H


3.4.2 Mögliche Anwendungsgebiete der Methode

Wie bereits erwähnt, basiert die Methode auf der Verwendung isotopenmarkierter Substrate in

Form von pseudo-Enantiomeren, pseudo-meso und pseudo-prochiraler Verbindungen.

Schema 3.2: Asymmetrische Transformationen von pseudo-enantiomeren (a und b), pseudo-meso (c) und pseudo-prochiralen (d) Verbindungen. FG stellt die funktionelle Gruppe dar, FG’ bzw. FG’’ symbolisieren die durch die Umsetzung gebildeten funktionellen Gruppen; die Isotopenmarkierung ist durch einen Stern (*) gekennzeichnet.

In Schema 3.2 sind die vier prinzipiellen Möglichkeiten asymmetrischer Transformationen

abgebildet, deren Enantiomerenüberschüsse sich bei Verwendung derart isotopenmarkierter

Substanzen durch die relativen Mengen der Reaktanden und/oder Produkte durch ESI-MS

ohne eine vorherige chromatographische Trennung der Edukte oder Produkte bestimmen

lassen.

Im Fall einer kinetischen Racematspaltung werden chirale pseudo-enantiomere Verbindungen

vom Typ 65 und 66, die sich durch die absolute Konfiguration und die Isotopenmarkierung

65 66 67 68 69 70

65 71 67 72 69

73 74 75 69 70

76 77 78 69 70

FG

R1 R2

FG*

R1 R2+ + + +FG’’ FG’’*

FG

R1 R2+ + + FG’’

FG’

R1 R2

FG’

R1 R2*

FG’

R1 R2

FG’

R1 R2

FG

R1 R2*

+ + +FG’’ FG’’*

a)

b)

c)

d)

RR

FG FG*

n + + +FG’’ FG’’*

RR

FG’ FG*

n RR

FG FG’

n

R

FG FG*

R

FG’ FG*

R

FG FG’


(*) in der funktionellen Gruppe (FG*) unterscheiden, in enantiomerenreiner Form dargestellt

und zur Simulation eines Racemats im 1 : 1-Verhältnis gemischt (Schema 3.2, a). Während

der asymmetrischen Reaktion, bei der die funktionelle Gruppe (FG bzw. FG*) umgewandelt

wird, entstehen bei einer kinetischen Racematspaltung „echte“ Enantiomere 67 und 68 neben

achiralen nicht markierten 69 und isotopenmarkierten Nebenprodukten 70. Die Verhältnisse

der totalen Intensitäten der nicht umgesetzten Edukte 65/66 und der Nebenprodukte 69/70 aus

den Massenspektren (m/z-Intensitäten der Quasi-Molekülionen) ermöglichen die Bestimmung

des ee-Werts ohne chromatographische Trennung. Das Verhältnis der m/z-Intensitäten der

Quasi-Molekülionen von 69/70 entspricht dem Enantiomerenüberschuss der gebildeten

enantiomeren Produkte, da die Nebenprodukte 69 bzw. 70 zu gleichen Anteilen gebildet

werden wie die eigentlichen Produkte der Reaktion (67 bzw. 68). Der sog. E- oder s-

Wert,[73,203,204] der ein vom Umsatz und von der Substratkonzentration unabhängiges Maß

für die Selektivität einer kinetischen Racematspaltung ist, kann durch die Enantiomeren-

überschüsse der Edukte und Produkte direkt bestimmt werden.

Ein Beispiel für eine enantioselektive Umsetzung von Fall a ist in Schema 3.3 dargestellt.

Schema 3.3: Beispiel einer Umsetzung eines 1 : 1-Gemisches von pseudo-Enantiomeren (S)-28 und (R)-79, bei der eine Spaltung der funktionellen Gruppe bzw. der isotopenmarkierten funktionellen Gruppe unter Bildung enantiomerer Produkte (S)- und (R)-26 stattfindet.

Bei Verwendung einer 1 : 1-Mischung von (S)-1-Phenylethylacetat ((S)-28) und

isotopenmarkiertem (R)-1-Phenylethyltrideuteroacetat ((R)-79) werden in einer kinetischen

Racematspaltung die nicht markierten Enantiomere (S)- und (R)-1-Phenylethanol (26) sowie

Essigsäure (80) und Trideuteroessigsäure (81) gebildet. Durch den Unterschied in der

(S)- 28 (R)- 79

(S)-26 (R)-26 80 81

OAc[D]3OAc

+

+ CD3COOHCH3COOH +

OH OH

+


Molekülmasse lässt sich das Verhältnis der totalen Intensitäten von (S)-28/(R)-79 und somit

der Enantiomerenüberschuss aus den ESI-Massenspektren bestimmen. Die Verhältnisse der

totalen Intensitäten der bei der Reaktion freigesetzten Essigsäure (80) bzw. Trideutero-

essigsäure (81) können prinzipiell zur Bestimmung des ee-Werts der eigentlichen

Reaktionsprodukte (S)- und (R)-1-Phenylethanol (26) herangezogen werden. Aus den

Enantiomerenüberschüssen der Edukte und Produkte kann dann der E-Wert[73,203,204] der

Reaktion ermittelt werden. Jedoch können aufgrund der Bildung von Cluster-Ionen unter ESI-

MS-Bedingungen die Verhältnisse der Intensitäten niedermolekularer Verbindungen wie

Essigsäure (80) bzw. Trideuteroessigsäure (81) nicht bestimmt werden; eine direkte

Bestimmung des E-Werts aus den Enantiomerenüberschüssen der Edukte und Produkte ist in

solchen Fällen massenspektrometrisch nicht möglich, kann aber aus dem ee-Wert der Edukte

und dem Umsatz der Reaktion erfolgen. Der Umsatz der Reaktion kann durch einen internen

Standard ermittelt werden, der nachträglich zu der Reaktionslösung gegeben wird.[205,206]

Besonders gut geeignet sind solche Standardsubstanzen, die unter ESI-MS-Bedingungen ein

ähnliches Ionisierungsverhalten wie die eigentlichen Analyten, d. h. in diesem Fall wie die

Edukte oder Produkte der untersuchten Reaktion, zeigen. Für das konkrete Beispiel in Schema

3.3 sind beispielsweise entsprechend substituierte 1-Phenylethanole wie p-Methyl-

1-phenylethanol geeignet. Analog zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses erfolgt die

Umsatzbestimmung über das Verhältnis der totalen Intensitäten (m/z-Intensitäten der Quasi-

Molekülionen) des Produkts der Reaktion (hier 26) und des Standards. Im Fall einer

kinetischen Racematspaltung eines Esters wie in Schema 3.3 kann durch Verwendung

anderer, höhermolekularer Acylreste im Substrat (wie z. B. Butyrat oder Pentanoat), die unter

ESI-MS-Bedingungen nicht zur Bildung von Cluster-Ionen neigen, eine direkte Bestimmung

des E-Werts erfolgen. Die Zugabe eines internen Standards ist hierbei für die

Umsatzbestimmung nicht unbedingt erforderlich.

Die Einführung der Isotopenmarkierung in ein Enantiomer des Substrats ist in dem oben

gezeigten Beispiel sehr leicht durch die reaktive funktionelle Gruppe (FG*) möglich. In

manchen Fällen ist jedoch eine Isotopenmarkierung in einem der Reste (R2) des einen

Enantiomers des Substrats von Vorteil (Schema 3.2, b). Wird eine asymmetrische

Transformation mit pseudo-enantiomeren Substraten des Typs 65 und 71 durchgeführt,

entsteht durch die Bindungsbildung oder Spaltung der funktionellen Gruppe FG ein neues

pseudo-Enantiomerenpaar 67 und 72 und ein achirales Nebenprodukt 69. Die


Enantioselektivität der Edukte und Produkte kann durch Bestimmung des Verhältnisses der

m/z-Intensitäten der Quasi-Molekülionen von 65/71 und 67/72 ermittelt werden. Der

Selektivitätsfaktor (E-Wert) der Reaktion kann bei Verwendung derart markierter pseudo-

enantiomerer Verbindungen in jedem Fall bestimmt werden, da die entstehenden

Nebenprodukte keine Isotopenmarkierung aufweisen und somit für die Bestimmung des

Enantiomerenüberschusses keine Relevanz besitzen. Ein mögliche Umsetzung nach Fall b

(Schema 3.2) ist in Schema 3.4 wiedergegeben.

Schema 3.4: Beispiel einer Umsetzung eines 1 : 1-Gemisches von pseudo-Enantiomeren, bei der eine Spaltung der funktionellen Gruppe unter Ausbildung eines neuen pseudo-Enantiomerenpaares stattfindet.

Fall c aus Schema 3.2 symbolisiert eine asymmetrische Transformation einer prochiralen

Verbindung mit enantiotopen Gruppen, von denen eine für die massenspektrometrische

Bestimmung des Enantiomerenüberschusses der Reaktion isotopenmarkiert (FG*) ist. Bei

Verwendung einer prochiralen pseudo-meso-Verbindung vom Typ 73 werden in einer

stereoselektiven Reaktion durch eine Spaltung der pseudo-enantiotopen funktionellen

Gruppen FG oder FG* Mischungen von zwei pseudo-Enantiomeren 74 und 75 gebildet, die

massenspektrometrisch unterscheidbar sind. Die Bestimmung des Enantiomerenüberschusses

mit solchen Substraten ist mit dieser Methode möglich. Zur Umsatzbestimmung ist hier

wiederum ein interner Standard erforderlich, idealerweise die der Verbindung 73

entsprechende nicht markierte prochirale meso-Verbindung, die vor der massenspektro-

metrischen Analyse zur Reaktionslösung zugesetzt wird. Ein Beispiel für solche eine

asymmetrische Reaktion ist in Schema 3.5 abgebildet.

(S)-28 (R)- 82 (S)-26 (R)-83 80

CD3

OAc

CH3

OAc

+ + 2 CH3COOHCH3

OH

CD3

OH

+


Schema 3.5: Asymmetrische Transformation der prochiralen pseudo-meso-Verbindung 84. Durch eine Bindungsspaltung an den pseudo-enantiotopen Gruppen werden die pseudo-enantiomeren Produkte 85 und 86 gebildet.

Aus den ESI-Massenspektren kann der Enantiomerenüberschuss aus den Verhältnissen der

totalen Intensitäten (m/z-Intensitäten der Quasi-Molekülionen) von 85 und 86 bestimmt

werden. Zur Umsatzbestimmung ist für dieses Beispiel die Zugabe der nicht markierten meso-

Verbindung, die der Substanz 84 entspricht, gut geeignet (vgl. Kapitel 3.4.5).

In Analogie zum letzten Beispiel können die Enantiomerenüberschüsse anderer

asymmetrischer Prozesse von pseudo-prochiralen Verbindungen wie 76, die eine Spaltung der

enantiotopen funktionellen Gruppe FG oder der isotopenmarkierten funktionellen Gruppe

FG* beinhalten, mit dieser Methode bestimmt werden (Schema 3.2, d). In diesen Fällen

werden wie im Fall c (Schema 3.2) pseudo-enantiomere Produkte 77 und 78 neben den

achiralen Nebenprodukten 69 und 70 gebildet. Auch hier kann eine Umsatzbestimmung über

einen internen Standard erfolgen.

Die funktionellen Gruppen (FG) in Schema 3.2 können die unterschiedlichsten organischen

Reste darstellen. Im Fall von Bindungsspaltungsreaktionen wie Hydrolysen sind dies u. a.

Acyloxy-Reste (-OC(O)R), Thioacyloxy-Reste (-SC(O)R), Amido-Reste (-NHC(O)R),

Carboxyl-Reste (-CO2R) oder Epoxy-Reste. Für bindungsknüpfende Reaktionen wie

Acylierungen kommen z. B. Hydroxy-Reste (-OH), Thiol-Reste (-SH), Amino-Reste (-NH2

oder -NHR) oder Carboxy-Reste (-CO2H) in Frage.

84 85 86

80 81

OH3AcO[D] OAcOHOAc3AcO[D] +

CH3COOH CD3COOH+


3.4.3 Genauigkeit der ee-Bestimmung

Im Rahmen von Voruntersuchungen wurde die Genauigkeit der Enantiomerenbestimmung

der neuen Methode durch Vergleich mit der klassischen Analytik (GC an chiraler stationärer

Phase) demonstriert. Dazu wurden die pseudo-Enantiomere (S)-28 und (R)-79 in

enantiomerenreiner Form synthetisiert (Schema 3.6 und Schema 3.7). Unter

Standardbedingungen wurden die enantiomerenreinen 1-Phenylethanole (S)-26 und (R)-26

mit Acetanhydrid (87) bzw. Hexadeuteroacetanhydrid (88, 99 Atom% D) zu den

entsprechenden Estern (S)-28 und (R)-79 umgesetzt.

Schema 3.6: Synthese von (S)-1-Phenylethylacetat ((S)-26).

Schema 3.7: Synthese von (R)-1-Phenylethyltrideuteroacetat ((R)-79).

Anschließend wurden die pseudo-Enantiomere (S)-28 und (R)-79 in unterschiedlichen

Verhältnissen miteinander gemischt. Die auf diese Weise erhaltenen Mischungen wurden zur

Bestimmung des Enantiomerenverhältnisses durch Gaschromatographie an chiraler

stationärer Phase analysiert und die Ergebnisse mit denen der ESI-MS-Messungen verglichen.

In Abb. 3.2 ist ein ESI-Massenspektrum einer ca. 3 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere

(S)-28 und (R)-79 abgebildet. Erkennbar sind die Natrium-Addukte der Quasi-Molekülionen

von (S)-28 und (R)-79.

(S)-26 87 (S)-28

(R)-26 88 (R)-79

OH OAc

CH3

O

O

O

CH3

+Pyridin

CH2Cl20 °C - RT

99 %

OH OAc[D]3

D3C

O

O

O

CD3

+Pyridin

CH2Cl20 °C - RT

99 %


Abb. 3.2: ESI-Massenspektrum einer Mischung der beiden pseudo-Enantiomere (S)-28 und (R)-79 (Probe 6, Tabelle 3.1).

In Tabelle 3.1 sind die Ergebnisse der gaschromatographischen und der ESI-MS-Analyse

gegenübergestellt.

Tabelle 3.1: Durch GC und ESI-MS bestimmte Enantiomerenüberschüsse von Mischungen der pseudo-Enantiomere (S)-28 und (R)-79.

Probe (GC)a ee / %

(ESI-MS)b ee / %

1 100 100 2 91 90 3 81 79 4 74 73 5 60 57 6 56 54 7 48 48 8 28 27 9 10 10 10 23 20 11 40 38 12 45 43 13 55 53 14 65 60 15 75 74 16 95 93 17 100 100

a Für die Durchführung und die gaschromatographische Analyse an chiraler stationärer Phase siehe Kap. 5.4.2.1. b Die Durchführung der ESI-MS-Analysen erfolgte nach Kapitel 5.4.1.2.

[(S)-28+Na]+

[(R)-79+Na]+

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

60

40

20

80

100

m / z

Irel / %


Der Vergleich der erhaltenen pseudo-Enantiomerenüberschüsse aus beiden analytischen

Methoden zeigt eine gute Übereinstimmung. In nur einem Fall (Probe 14, Tabelle 3.1) beträgt

die Abweichung zwischen der gaschromatographischen und der ESI-MS-Analyse 5 %. Da

diese ESI-MS-Analysenmethode zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses in erster

Linie als Screening-Verfahren auf Enantioselektivität asymmetrischer Transformationen

eingesetzt werden soll, sind derartige Abweichungen vernachlässigbar. In weiteren

Experimenten konnte die Genauigkeit der ee-Bestimmungen ebenfalls bestätigt werden (vgl.

Kapitel 3.4.5).

3.4.4 Einfluss der Isotopenmarkierung auf die Enantioselektivität

Denkbar ist, dass die Isotopenmarkierung in einem der pseudo-Enantiomere oder in einer der

pseudo-enantiotopen funktionellen Gruppen einer pseudo-prochiralen Verbindung sich auf

den Ablauf der asymmetrischen Transformation auswirkt. Unter Umständen führt dies im

Vergleich mit echten Enantiomeren bzw. prochiralen Verbindungen zu einer Verfälschung der

bestimmten Enantioselektivität oder des Umsatzes einer Reaktion. In einem Screening einer

Katalysatorbibliothek auf Enantioselektivität könnten solche sekundären Isotopen-

effekte[207,208] zur Identifizierung eines in Wirklichkeit sehr viel unselektiveren Katalysators

führen oder ein für die gewünschte Reaktion sehr selektiver Katalysator würde nicht

gefunden. Um solche sekundären Isotopeneffekte ausschließen zu können, wurden unter

identischen Reaktionsbedingungen Vergleichsexperimente mit den pseudo-Enantiomeren und

dem „echten“ Racemat durchgeführt. Ein erstes Beispiel eines solchen Vergleichsexperiments

stellt die lipasekatalysierte stereoselektive Veresterung von rac-2-Phenylpropionsäure (rac-

89) und einer 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-89 und (R)-91 von

2-Phenylpropionsäure mit n-Butanol in tert-Butylmethylether (MTBE) dar (Schema 3.8). Als

Lipase wurde die immobilisierte Lipase aus Candida antarctica (Novozym® SP 435 Lipase)

eingesetzt.


Schema 3.8: Umsetzung von rac-2-Phenylpropionsäure (rac-89) und einer 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-89 und (R)-91 von 2-Phenylpropionsäure.

Für die Vergleichsexperimente wurde die deuterierte (R)-2-Phenylpropionsäure ((R)-91) nach

einer von EVANS et al. eingeführten Methode zur stereoselektiven Synthese -alkylierter

Carbonylverbindungen synthetisiert (Schema 3.9).[209,210] Dazu wird das (4R)-

Benzyloxazolidinon (94) mit 1-Phenylessigsäurechlorid (93) zum (4R)-Benzyl-3-N-

benzyloxy-2-oxazolidin-2-on (95) umgesetzt. Der anschließende Reaktionsschritt liefert nach

Deprotonierung mit Natriumhexamethyldisilazid und Umsetzung mit deuteriertem

Methyliodid (> 99 Atom% D) selektiv nur das in Schema 3.9 gezeigte Diastereomer 96. Im

letzten Schritt der Reaktionssequenz wird das chirale Auxiliar oxidativ durch Umsetzung mit

Lithiumhydroxid und Wasserstoffperoxid unter Bildung der trideuterierten (R)-2-

Phenylpropionsäure ((R)-91) abgespalten. Der Enantiomerenüberschuss von (R)-91 wurde

durch Vergleich mit dem undeuterierten Enantiomer durch Flüssigkeitschromatographie

bestimmt und betrug > 99 %. Durch Mischen von (R)-91 mit kommerziell erhältlichem

enantiomerenreinem (S)-89 in einem 1 : 1-Verhältnis wurde das pseudo-Enantiomerenpaar

(S)-89/(R)-91 erhalten.

rac-89 (S)-90 (R)-90

(S)-89 (R)-91 (S)-90 (R)-92

a)

b)

CH3

CO2H

CD3

CO2H

+ CH3

CO2Bu

CD3

CO2Bu

+

CH3

CO2H

CH3

CO2Bu

CH3

CO2Bu

+Novo SP 435

Lipase

n-ButanolMTBE

Novo SP 435Lipase

n-ButanolMTBE


Schema 3.9: Synthesesequenz zur Darstellung der deuterierten Säure (R)-91.

Während der parallel durchgeführten Veresterung von rac-2-Phenylpropionsäure (rac-89) und

der 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-89 und (R)-91 wurden zu identischen

Zeitpunkten Proben entnommen und diese durch Flüssigkeitschromatographie an chiraler

stationärer Phase untersucht. In Abb. 3.3 ist der Enantiomerenüberschuss der nicht

umgesetzten 2-Phenylpropionsäure bzw. der der nicht umgesetzten pseudo-Enantiomere

(S)-89/(R)-91 gegen die Ausbeute des 2-Propionsäurebutylesters aufgetragen.

93

94 95

(R)-91 96

CD3

CO2H

ONH

O

1. NaN(Si(CH3)3)2

THF-78 °C

2. CD3ITHF

-78 °C - RT

83 %

O

Cl

1. n-BuLiTHF

-78 °C

2.

-78 °C - RT83 %

LiOH/H2O2

THF0 °C - RT

74 %

N O

O O

N O

O

CD3

O


0

10

20

30

0 10 20 30 40

Ausbeute / %

ee / %

Abb. 3.3: Vergleich der erhaltenen ee-Werte der nicht umgesetzten 2-Phenylpropionsäure der kinetischen Racematspaltung von rac-89 ( �� PLW� GHQHQ� GHU� 5HDNWLRQ� HLQHU�1 : 1-Mischung von (S)-89 und (R)-91 ( �� XQG� GHV� 8PVDW]HV� ]XP�2-Phenylpropionsäurebutylesters. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.2.

Wie aus Abb. 3.3 zu entnehmen ist, stimmen die erhaltenen Daten im Rahmen des

experimentellen Fehlers miteinander überein. Generell sind sekundäre Isotopeneffekte bei

solchen asymmetrischen Prozesse jedoch nicht auszuschließen. Doch konnten bei den bislang

untersuchten enzymkatalysierten Prozessen keinerlei Hinweise auf einen Einfluss der

Isotopenmarkierung in einer 1 : 1-Mischung pseudo-enantiomerer Verbindungen oder in einer

pseudo-enantiotopen Gruppe einer pseudo-prochiralen Verbindung gefunden werden. Weitere

Beispiele solcher Vergleichsexperimente sind in Kapitel 3.4.5 zu finden.

3.4.5 Anwendungsbeispiele der Methode

Um eine allgemeine Anwendbarkeit der Methode zu demonstrieren, wurden als

Testreaktionen weitere kinetische Racematspaltungen und die enantioselektive Umsetzung

einer prochiralen Verbindung näher untersucht.


3.4.5.1 Beispiele zum Screening auf Enantioselektivität von kinetischen

Racematspaltungen

Sofern die „echten“ Racemate zugänglich waren, wurden Vergleichsexperimente mit diesen

und den istopenmarkierten 1 : 1-Mischungen der pseudo-Enantiomere durchgeführt.

In einer ersten Testreaktion wurde die lipasekatalysierte kinetische Racematspaltung von

1-Phenylethanol (26) untersucht. Für das Vergleichsexperiment wurden das racemische

1-Phenylethanol (rac-26) und eine 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-97/(R)-26

verwendet (Schema 3.10).

Schema 3.10: Lipasekatalysierte Umsetzung von rac-1-Phenylethanol (rac-26) und einer 1 : 1-Mischung von (S)-97/(R)-26.

Das tetradeuterierte (S)-1-Phenylethanol ((S)-97) ist durch eine lipasekatalysierte kinetische

Racematspaltung von rac-97 mit Vinylacetat (27) leicht und enantiomerenrein (> 99 % ee)

zugänglich (Schema 3.11). Das tetradeuterierte (R)-Enantiomer von 1-Phenylethylacetat ((R)-

98) entsteht ebenfalls enantiomerenrein (> 99 % ee).

rac- 26 27 (S)- 28 (R)-28

(S)-97 (R)-26 27

(S)-98 (R)-28

OAc+

CH3

OH

OAc+

CH3

OH

+CD3

D OH

CH3

OAc

CD3

D OAc

+

CH3

OAc

CH3

OAc

+Novo SP 435

Lipase

Cyclohexan

Novo SP 435 Lipase

Cyclohexan


Schema 3.11: Kinetische Racematspaltung von tetradeuteriertem rac-1-Phenylethanol (97).

Zur Durchführung des Vergleichsexperiments wurde unter identischen Reaktionsbedingungen

in parallel durchgeführten Reaktionen das rac-1-Phenylethanol (rac-26) und eine 1 : 1-

Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-97/(R)-26 mit Vinylacetat (27) in Cyclohexan mit

Novo SP 435 Lipase verestert. Zu verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben entnommen

und durch Gaschromatographie an chiraler stationärer Phase untersucht. In Abb. 3.4 ist der

Enantiomerenüberschuss des nicht umgesetzten 1-Phenylethanols (26) bzw. der Mischung der

pseudo-Enantiomere (S)-97/(R)-26 gegen die Ausbeute des gebildeten Esters 28 bzw. der

Mischung der Ester (S)-98/(R)-28 aufgetragen.

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60Umsatz / %

ee / %

Abb. 3.4: Auftragung der erhaltenen ee-Werte des nicht umgesetzten 1-Phenylethanols der kinetischen Racematspaltung von rac-26 ( �� XQG� GHQHQ� GHU� DQDORJHQ� 5HDNWLRQ�von einer 1 :1 -Mischung von (S)-97/(R)-26 ( �� JHJHQ� GLH� $XVEHXWH� DQ�1-Phenylethylacetat 28 bzw. (S)-98/(R)-28. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.3.

rac-97 27 (S)- 97 (R)- 98

99 % 93 %

CD3

D OAc

CD3

D OH

+OAc+CD3

D OH Novo SP 435 Lipase

MTBE


Wie in dem in Kapitel 3.4.4 besprochenen Beispiel sind die Unterschiede in den

Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen dem racemischen Substrat 26 und der 1 : 1-Mischung

der pseudo-Enantiomere (S)-97/(R)-26 gering und liegen innerhalb des experimentellen

Fehlers. Mögliche sekundäre Isotopeneffekte können unter diesen Reaktionsbedingungen

somit ausgeschlossen werden.

Zur Überprüfung der Genauigkeit der Enantiomerenbestimmung durch die ESI-MS-Methode

wurden die ee-Werte von Proben der kinetischen Racematspaltung von (S)-97/(R)-26 aus der

gaschromatographischen Analyse an chiraler stationärer Phase mit denen der ESI-MS-

Messungen verglichen. In Abb. 3.5 ist ein ESI-Massenspektrum der Reaktion abgebildet.

Erkennbar sind die Natrium-Addukte der Quasi-Molekülionen der Edukte Tetradeutero-(S)-1-

Phenylethanol ((S)-97) und (R)-1-Phenylethanol ((R)-26) sowie das Natrium-Addukt des

ausschließlich gebildeten (R)-Enantiomers des 1-Phenylacetats (R)-28.

Abb. 3.5: ESI-Massenspektrum einer Probe der lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung der pseudo-Enantiomere (S)-97/(R)-26 (Probe 2, Tabelle 3.2).

[26+Na]+

[28+Na]+

[97+Na]+

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

80

60

40

20

100

m / z

Irel / %


In der folgenden Tabelle 3.2 sind die erhaltene ee-Werte der gaschromatographischen

Analyse der nicht umgesetzten Mischung aus (S)-97 und (R)-26 den Enantiomeren-

überschüssen der ESI-MS-Analyse gegenübergestellt.

Tabelle 3.2: Durch GC und ESI-MS bestimmte ee-Werte des nicht umgesetzten Enantiomers aus der kinetischen Racematspaltung einer 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-97 und (R)-26 sowie die durch ESI-MS bestimmten pseudo-ee-Werte von (R)-28.

Probe Zeit / h (GC)a ee ((S)-97) / %

(ESI-MS)b ee ((S)-97) / %

(ESI-MS)b ee ((R)-28) / %

1 0c 1 2 0 2 0,5 20 20 > 99 3 1 34 36 > 99 4 2 62 60 > 99 5 4 91 91 > 99 6 6 98 98 > 99 7 8 100 100 > 99

a Für die Durchführung und die gaschromatographische Analyse an chiraler stationärer Phase siehe Kap. 5.4.2.3. b Die Durchführung der ESI-MS-Analysen erfolgte nach Kapitel 5.4.1.2. c Vor Reaktionsbeginn.

Zusätzlich sind die ee-Werte des ausschließlich gebildeten (R)-1-Phenylethylacetats ((R)-28)

aus der ESI-MS-Analyse aufgeführt. Eine gleichzeitige Enantiomerenbestimmung des

gebildeten Esters durch die entsprechende gaschromatographische Analyse an chiraler

stationärer Phase war mit denen für das 1-Phenylethanol (26) optimierten Trennbedingungen

nicht möglich.

Wie schon in Kapitel 3.4.4 konnten auch in diesem Vergleichsexperiment keine Hinweise auf

einen möglichen Isotopeneffekt gefunden werden. Der Vergleich der mit beiden analytischen

Methoden bestimmten pseudo-Enantiomerenüberschüsse von (S)-97 zeigt wie zuvor in

Kapitel 3.4.3 eine gute Übereinstimmung.

In einem weiteren Versuch wurde die lipasekatalysierte Acylierung eines aliphatischen

Alkohols untersucht. Wiederum wurde in einem Vergleichsexperiment unter identischen

Bedingungen der Reaktionsverlauf des „echten“ Racemats von 2-Octanol (rac-99) mit dem


einer 1 : 1-Mischung von trideuteriertem (S)-2-Octanol ((S)-101) und (R)-2-Octanol ((R)-99)

miteinander verglichen (Schema 3.12).

Schema 3.12: Lipasekatalysierte Umsetzung von rac-2-Octanol (rac-99) und einer 1 : 1-Mischung von (S)-101 und (R)-99.

Das trideuterierte (S)-2-Octanol ((S)-101) ist in einer dreistufigen Synthese zugänglich

(Schema 3.13). Ausgehend von 1,4-Dibrombutan (103) wurde durch die von TAMURA und

KOCHI entwickelte Methode zur Kreuzkupplung von GRIGNARD-Verbindungen und

Alkylhalogeniden unter Zusatz von Dilithiumtetrachlorocuprat das trideuterierte

Pentylbromid (104) erhalten.[211] Die korrespondierende GRIGNARD-Verbindung 105 wurde

im Anschluss unter Kupfer(I)chloridÂ&2'-Katalyse[212,213] mit dem kommerziell

erhältlichem (S)-Propenoxid 106 zum trideuterierten (S)-2-Octanol ((S)-101) mit einem

Enantiomerenüberschuss von 96 % umgesetzt. Das Produkt wurde nachträglich durch

Flüssigkeitschromatographie präparativ aufgereinigt.

rac-99 27

(S)- 100 (R)- 100

(S)-101 (R)- 99 27

(S)- 102 (R)- 100

OAcOAc+

D3COAc

+OAc

OAcD3COH

+OH

+Novo Sp 435

Lipase

Cyclohexan

OAc

OH+

Novo Sp 435 Lipase

Cyclohexan


Schema 3.13: Synthese von trideuteriertem (S)-2-Octanol ((S)-101).

Wie in dem Beispiel zuvor wurde für das Vergleichsexperiment die deuterierte Verbindung

(S)-101 mit dem undeuterierten (R)-Enantiomer des 2-Octanols ((R)-99) im 1 : 1-Verhältnis

gemischt. Unter identischen Reaktionsbedingungen wurde das pseudo-Enantiomer sowie das

racemische 2-Octanol (rac-99) in parallel durchgeführten Reaktionen mit n-Butanol in

Cyclohexan mit der immobilisierten Lipase Novo SP 435 verestert (Schema 3.12). Zur

Untersuchung des Reaktionsverlaufs der kinetischen Racematspaltungen wurden zu

verschiedenen Zeitpunkten Proben aus der Reaktionslösung entnommen und im Fall der

Veresterung vom (rac-99) durch Gaschromatographie an chiraler stationärer Phase und im

Fall der verwendeten pseudo-Enantiomere (S)-101 und (R)-99 sowohl durch GC an chiraler

stationärer Phase als auch durch ESI-MS analysiert. In Abb. 3.6 sind die durch

Gaschromatographie an stationärer Phase ermittelten ee- bzw. pseudo-ee-Werte der

lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung von rac-2-Octanol (rac-99) bzw. der 1 : 1-

Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-101 und (R)-99) gegen die Reaktionszeit aufgetragen.

103 104 105

106 105

(S)-101

D3COHO

BrBr

D3C BrD3C MgBr

Li2CuCl4 /CD3MgI

THF0 °C80 %

Mg

THFRT - 70 °C

1. CuCl.(COD)THF

-78 °C

THF-78 °C RT

46 %

2.


0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Zeit / h

ee / %

Abb. 3.6: Gaschromatographisch ermittelte ee-Werte des nicht umgesetzten (S)-2-Octanols ((S)-99, �� XQG� GHV� JHELOGHWHQ� �R)-2-Octylacetats ((R)-100, �� DXV� GHU�5HDNWLRQ�von rac-99 sowie die pseudo-ee-Werte des nicht umgesetzten deuterierten (S)-2-Octanols ((S)-101, �� XQG� GHV� EHYRU]XJW� JHELOGHWHQ� �R)-2-Octylacetats ((R)-100, �� DXV� GHU� 5HDNWLRQ� GHU� � : 1-Mischung von (S)-101 und (R)-99. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.4.

Auffällig ist nur die Differenz der Enantiomerenüberschüsse der nicht umgesetzten (S)-2-

Octanole ((S)-99) ( �� Ezw. (S)-101 ( �� ]X�%HJLQQ� GHU�5HDNWLRQ� �� h Reaktionszeit). Alle

anderen ee-Werte zeigen eine gute Übereinstimmung und gaben keine Hinweise auf mögliche

Einflüsse der Isotopenmarkierung. In derzeitigen Untersuchungen werden die Enantiomeren-

überschüsse der Proben der Reaktion der 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-101

und (R)-99 mit ESI-MS untersucht.


In einem weiteren Beispiel einer lipasekatalysierten Veresterung einer aliphatischen Säure

wurde die Genauigkeit der pseudo-ee-Bestimmung der ESI-MS-Methode abermals

untersucht. Dazu wurde eine 1 : 1-Mischung der beiden pseudo-enantiomeren

2-Methyldecansäuren (S)-107 und (R)-108 mit n-Butanol in Cyclohexan mit der schon zuvor

verwendeten Novo SP 435 Lipase verestert (Schema 3.14).

Schema 3.14: Lipasekatalysierte Umsetzung einer 1 : 1-Mischung der pseudo-enantiomeren 2-Methyldecansäuren (S)-107 und (R)-108 zu den pseudo-enantiomeren Estern (S)-109 und (R)-110.

Die dazu benötigte deuterierte (R)-2-Methyldecansäure ((R)-108) wurde wie die zuvor

verwendete deuterierte (R)-2-Phenylpropionsäure ((R)-91) nach der von EVANS und

Mitarbeitern entwickelten Methode zur stereoselektiven -Alkylierung synthetisiert (Schema

3.15).[209,210].

(S)-107 (R)- 108

(S)-109 (R)-110

Novo Sp 435 Lipase

n-ButanolCyclohexan

O

5 OCH3

O

5

CD3

O+

O

5 OHCH3

O

5

CD3

OH+


Schema 3.15: Reaktionssequenz zur Darstellung der deuterierten (R)-2-Methyldecansäure ((R)-108).

Das (4R)-Benzyloxazolidinon (94) wird mit Decansäurechlorid (111) zum entsprechenden

(4R)-Benzyl-3-N-decanoyl-2-oxazolidin-2-on (112) umgesetzt. Nach anschließender

Deprotonierung mit Natriumhexamethyldisilazid und Umsetzung mit dem deuterierten

Methyliodid (>99 Atom% D) wird selektiv nur das gezeigte Diastereomer 113 erhalten. Im

letzten Schritt der Reaktionssequenz wird das chirale Auxiliar oxidativ durch Umsetzung mit

Lithiumhydroxid und Wasserstoffperoxid unter Freisetzung der trideuterierten (R)-2-

Methyldecansäure ((R)-108) abgespalten. Der Enantiomerenüberschuss von (R)-108 wurde

durch Vergleich mit den undeuterierten Enantiomeren mittels Flüssigkeitschromatographie

bestimmt und betrug >99 %.

111

94 112

(R)-108 113

ONH

O

Cl

O

5

1. n-BuLiTHF

-78 °C

2.

-78 °C - RT87 %

N O

O

5

O

N O

O

5

O

CD3

O

5 OHCD3

1. NaN(Si(CH3)3)2

THF-78 °C

2. CD3ITHF

-78 °C - RT

75 %

LiOH/H2O2

THF0 °C - RT

95 %


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280

80

100

60

40

20

m / z

Irel / %

Im Anschluss wurde (R)-108 mit enantiomerenreiner (S)-2-Methyldecansäure ((S)-107),

welche durch Verwendung des enantiomeren chiralen Auxiliars durch den gleichen

Syntheseweg zugänglich ist,[72,209,210,214] in einem 1 : 1-Verhältiniss zum pseudo-

Enantiomerenpaar (S)-107/(R)-108 für die Umsetzung gemischt.

Zur Untersuchung des Reaktionsverlaufs wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben

entnommen, die zur Bestimmung des pseudo-ee-Werts durch Gaschromatographie an chiraler

stationärer Phase und durch ESI-MS untersucht wurden. In Abb. 3.7 ist ein ESI-

Massenspektrum einer Probe abgebildet (Probe 4 in Tabelle 3.3). Erkennbar sind die Natrium-

Addukte der Quasi-Molekülionen der pseudo-enantiomeren Säuren (S)-107/(R)-108 und der

pseudo-enantiomeren Ester (S)-109 und (R)-110 (Abb. 3.7).

Abb. 3.7: ESI-MS-Spektrum einer Probe der lipasekatalysierten Umsetzung der pseudo-enantiomeren 2-Methyldecansäuren (S)-107/(R)-108 zu den pseudo-enantiomeren Estern (S)-109 und (R)-110 (Probe 4, Tabelle 3.3).

In der folgenden Tabelle 3.3 sind die erhaltenen ee-Werte der nicht umgesetzten Mischung

von (S)-107 und (R)-108 aus der gaschromatographischen Analyse denen der ESI-MS-

Analyse gegenübergestellt.

[(S)-109+Na]+

[(R)-110+Na]+

[(S)-107+Na]+

[(R)-108+Na]+


Tabelle 3.3: Durch GC und ESI-MS bestimmte pseudo-ee-Werte der nicht umgesetzten Enantiomere aus der lipasekatalysierten Umsetzung einer 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-107 und (R)-108 sowie die durch ESI-MS bestimmten pseudo-ee-Werte von (R)-110.

Probe Zeit / h (GC)a ee ((S)-107) / %

(ESI-MS)b ee ((S)-107) / %

(ESI-MS)b ee ((R)-110) / %

1 8 1.8 -0.8 20 2 10 1.0 1.4 17 3 12 2 5.0 19 4 18 5.2 5.6 15 5 24 10 11 15


Ebenfalls mit aufgeführt sind die pseudo-ee-Werte der ESI-MS-Analyse des bevorzugt

gebildeten Esters (R)-110, deren Bestimmung durch Gaschromatographie an chiraler

stationärer Phase nicht möglich war. Trotz der geringeren Enantiomerenüberschüsse, die in

diesem Zusammenhang unerheblich sind, zeigt ein Vergleich beider Analysenmethoden eine

gute Übereinstimmung der Enantiomerenüberschüsse der Säure (S)-107.

Da für bestimmte chirale Ester die gezielte Einführung einer isotopenmarkierten Gruppe

synthetisch aufwendig sein kann, ist eine Markierung im achiralen Teil des Esters chemisch

einfacher durchzuführen. Anhand der in Schema 3.16 gezeigten pseudo-enantiomeren

Prolinol-Ester (S)-114/(R)-115 soll dies näher erläutert werden.


Schema 3.16: Lipasekatalysierte Esterhydrolyse einer 1 : 1-Mischung der pseudo-Enantiomere (S)-114/(R)-115.

Die Hydrolyse einer 1 : 1-Mischung der pseudo-enantiomeren Palmitinsäureprolinoylester

(S)-114/(R)-115 führt zu den enantiomeren BOC-geschützten Aminoalkoholen (S)- und (R)-

116, die jedoch aufgrund einer fehlenden Isotopenmarkierung massenspektrometrisch nicht

unterscheidbar sind. Da die enantiomeren Prolinole BOC-(S)- und (R)-116 im gleichen

Verhältnis gebildet werden wie die Palmitinsäure 117 (im Fall der Hydrolyse von (S)-114)

bzw. wie die deuterierte Palmintinsäure 118 bei der Hydrolyse von (R)-115, ist bei einer

enantioselektiven Umsetzung eine Enantiomerenbestimmung der Alkohole (S)- und (R)-116

durch MS über das Verhältnis der totalen Intensitäten der beiden Säuren 117/118 möglich.

Bei Verwendung isotopenmarkierter Verbindungen dieser Art wäre somit die Bestimmung

des ee-Werts der pseudo-enantiomeren Edukte direkt und die der Produkte indirekt über die

achiralen aber massenspektrometrisch unterscheidbaren Nebenprodukte 117/118 einer

enantioselektiven Umsetzung denkbar. In Schema 3.17 und Schema 3.18 sind die Synthesen

der pseudo-enantiomeren Palmitinsäureprolinoylester (S)-114/(R)-115 wiedergegeben.

Die Synthese des Prolinol-Esters (S)-114 erfolgte ausgehend vom (S)-Prolinol ((S)-119) durch

Einführung der BOC-Schutzgruppe mit BOC-Anhydrid 120 und anschließender Umsetzung

mit Palmitinsäurechlorid (121) (Schema 3.17).

(S)-114 (R)- 115

(S)- 116 117 (R)- 116 118

NO

OOO

13 NO

O

CD3

OO

13+

N

OO

OHN

OO

OH+

OH

O

13 OH

O

CD313+ +

Lipase

Phosphatpuffer


Schema 3.17: Synthese des Prolinol-Esters (S)-114.

Für die Synthese des zu (S)-114 pseudo-enantiomeren Prolinol-Esters (R)-115 war die

Synthese der deuterierten Palmitinsäure 118 erforderlich (Schema 3.18).

Schema 3.18: Synthese des deuterierten Prolinol-Esters (R)-115.

(S)-119 120 (S)- 116

(S)-116 121 (S)- 114

122 123 118

(R)- 124 120 (R)- 116

(R)-116

118 (R)- 115

NO

OOO

13Cl

O

13

N

OO

OH+

NH

OHO

O

O

O

O CH2Cl20 °C - RT> 99 %

N

OO

OH+

CH2Cl20 °C - RT

96 %

NO

O

CD3

OO

13OH

OCD314

N

OO

OH+

NH

OHO

O

O

O

O

(C(O)Cl)2

CH2Cl20 °C - 40 °C

CH2Cl20 °C - RT

95 %

1.

2.

OH

OCD314

Br CD314Br Br

14

Li2CuCl4 /CD3MgI

THF5 °C67 %

CH2Cl20 °C - RT

95 %

MgEt2O

RT - 35 °C

RTCO2 (s) 55 %

1.

2.


Ausgehend vom 1,14-Dibrombutan (122) wurde durch die von TAMURA und KOCHI

entwickelte Methode zur Kreuzkupplung von GRIGNARD-Verbindungen mit

Alkylhalogeniden das deuterierte Pentadecylbromid 123 erhalten.

Die Reaktion mit Magnesium lieferte die GRIGNARD-Verbindung, die in situ mit Trockeneis

zur deuterierten Palmitinsäure (118) umgesetzt wurde. Die Umsetzung von 118 mit

Oxalylchlorid ergibt das Säurechlorid, welches in situ durch Reaktion mit dem BOC-

geschützten (R)-Prolinol ((R)-116) das Produkt den gewünschten Ester (R)-115 liefert.

Die gezeigte zweistufige Synthesesequenz vom 1,14-Dibrombutan (122) zur deuterierten

Palmitinsäure (118) sollte somit einen allgemein anwendbaren und einfachen Zugang zu

terminal trideuterierten Säuren ermöglichen.

Enzymatische Umsetzungen einer 1 : 1-Mischung der pseudo-enantiomeren

Palmitinsäureprolinylester (S)-114 und (R)-115 und sowie ESI-MS-Analysen der

entsprechenden Reaktionsprodukte sind Bestandteil laufender Untersuchungen.

3.4.5.2 Beispiel zum Screening asymmetrischer Reaktionen einer prochiralen

Verbindung

Anhand einer Modellverbindung sollte die potentielle Anwendung des ESI-MS-Methode zur

ee-Bestimmung asymmetrischer Umsetzungen prochiraler Substanzen demonstriert werden.

Wie im Fall der Untersuchungen der kinetischen Racematspaltungen von 1 : 1-Mischungen

pseudo-enantiomerer Verbindungen (Kapitel 3.4.5.1) wurde in Vergleichsexperimenten die

Umsetzung des pseudo-meso Diacetats 84 und die Reaktion der „echten” meso-Verbindung

125 untersucht (Schema 3.19).


Schema 3.19: Lipasekatalysierte Esterhydrolyse eines prochiralen meso-Diacetats 125 und der pseudo-meso-Verbindung 84.

Die Synthese von 84 erfolgte ausgehend vom kommerziell erhältlichen meso-Diacetat 125

(Schema 3.20). Nach JOHNSON et al. wurde 125 durch die Novo SP 435 Lipase

enantioselektiv zum Monoacetat 86 hydrolysiert (>99 % ee).[215] Im Anschluss wurde 86

unter Standardreaktionsbedingungen mit Deuteroacetylchlorid (>99 Atom% D) zum pseudo-

meso-Diacetat 84 umgesetzt.

Schema 3.20: Synthese des pseudo-meso-Diacetats 84.

Zur Überprüfung der Genauigkeit der ESI-MS-Analyse wurde das pseudo-meso-Diacetat 84

in Voruntersuchungen mit Schweineleberesterase (Porcine Liver Esterase, PLE) in TRIS-

Puffer umgesetzt (Schema 3.21).

125 126 86

84 85 86

125 86

86 84

OAc3AcO[D] OH3AcO[D] OAcOH+

LipasePhosphat-

Puffer

Extraktion

LipasePhosphat-

Puffer

Extraktion

OAcAcO OAcOH+OHAcO

OAc3AcO[D]OAcOH

PyridinCD3COCl

CH2Cl20 °C - RT

98 %

OAcAcO OAcOH

Novo SP 435Lipase

Phosphatpuffer

Extraktion96 %


90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290

m / z

Irel / %

100

80

60

40

20

Schema 3.21: Esterasekatalysierte Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 84.

Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben entnommen und der

Enantiomerenüberschuss der gebildeten pseudo-enantiomeren Monoacetate 85 und 86 durch

GC an chiraler stationärer Phase und durch ESI-MS bestimmt. Die Ergebnisse dieser

Analysen sind in Tabelle 3.4 zusammengefasst. In Abb. 3.8 ist ein ESI-Massenspektrum einer

Probe (Probe 2, Tabelle 3.4) wiedergegeben.

Abb. 3.8: ESI-Massenspektrum einer Probe aus der Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 84 (Probe 2, Tabelle 3.4).

84 85 86

[84+Na]+

[85+Na]+

[86+Na]+

OAcOH+PLE

TRIS-PufferRT

OAc3AcO[D] OH3AcO[D]


Tabelle 3.4: Durch GC und ESI-MS bestimmte pseudo-ee-Werte des bei der esterasekatalysierten Hydrolyse des pseudo-meso Diacetats 84 bevorzugt gebildeten Monoacetats 85.

Probe Zeit / h (GC)a ee (85) / %

(ESI-MS)b ee (85) / %

1 3 74 74 2 4 73 74 3 5 74 74 4 6 74 73 5 7 74 75


Ein Vergleich der mit beiden Analysenmethoden bestimmten ee-Werte zeigt auch hier eine

gute Übereinstimmung.

Im folgenden wurde das in Schema 3.19 gezeigte Vergleichsexperiment der Hydrolyse der

meso- und der pseudo-meso-Verbindung des Diacetats 125 bzw. 84 durchgeführt. Dazu wurde

in zwei getrennten Ansätzen unter identischen Reaktionsbedingungen die lipasekatalysierte

Hydrolyse von 125 und 84 untersucht. Als Lipase wurde Bacillus subtilis Lipase A eingesetzt,

die unserer Arbeitsgruppe im Rahmen eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Priv.-Doz.

Dr. K.-E. JÄGER zur Verfügung steht. Die Lipase wurde in Form eines lipasehaltigen

Kulturüberstands (Bacillus subtilis Lipase A in E. coli BL21(DE3), Vektor: pET22 lipA1)

eingesetzt. Zu verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben aus beiden Ansätzen

entnommen und extrahiert. Die organischen Extrakte beider Reaktionen wurden durch

Gaschromatographie an chiraler stationärer Phase untersucht. Die Proben aus der Hydrolyse

des pseudo-meso-Diacetats 84 wurden ebenfalls durch ESI-MS analysiert. In Abb. 3.9 sind

zunächst die Enantiomerenüberschüsse der gaschromatographischen Analyse des in beiden

Reaktionen bevorzugt gebildeten Monoacetats 126 bzw. 85 sowie die ee-Werte von 85 aus

der ESI-MS-Analyse gegen die Reaktionszeit aufgetragen.


0

10

20

30

40

50

0 24 48 72 96 120 144

Zeit / h

ee / %

Abb. 3.9: Auftragung der ee-Werte des Monoacetats 126 ( �� E]Z�� 85 ( �� DXV� GHU�gaschromatographischen Analyse und der pseudo-ee-Werte von 85 aus der ESI-MS-Analyse ( ). Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.7.

Es wird deutlich, dass die ee-Werte der gaschromatographischen Analyse der bevorzugt

gebildeten Monoacetate 126 bzw. 85 kaum voneinander abweichen und die Isotopen-

markierung des eingesetzten pseudo-meso-Diacetats 84 keinen Einfluss auf die Selektivität

der verwendeten Lipase hat. Auffällig ist die Abweichung des ee-Werts des isotopen-

markierten Monoacetats 85 aus der ESI-MS-Analyse () von den korrespondierenden Werten

der GC-Analyse (). Die Abweichungen bei geringen Reaktionszeiten sind in erster Linie auf

die geringen Umsätze zurückzuführen (vgl. Abb. 3.11), die eine Bestimmung der relativen

Intensitäten der Quasi-Molekülionen der pseudo-enantiomeren Monoacetate 85 und 86

erschweren. Da die Bestimmung des pseudo-ee-Werts im Fall der Voruntersuchungen (vgl.

Tabelle 3.4) unter gleichen ESI-MS-Bedingungen eine gute Übereinstimmung zeigten, sind

die konstanten Abweichungen der Werte der ESI-MS- von denen der GC-Analyse nicht

eindeutig zu erklären. Ein Grund könnte die automatisierte Auswertung der GC-Analysen

sein, die aufgrund dieser großen Probenserien genutzt wurden. Die GC-Analysen der in

Tabelle 3.4 gezeigten Proben dagegen wurden manuell ausgewertet. Sowohl bei den

eingesetzten Diacetaten 125 und 84 als auch bei Reaktionsprodukten 85, 86 und 126 handelt

es sich um sehr polare Verbindungen. Die Peaks in den Chromatogrammen weisen ein starkes


Tailing auf. Eine automatische Integration solcher Peaks ist somit erschwert und könnte ein

Grund für die Abweichungen sein.

Eine direkte Information aus den ESI-Massenspektren über den Umsatz einer Reaktion ist

jedoch nicht möglich. Unter ESI-MS-Bedingungen werden verschiedene Substanzen

unterschiedlich gut ionisiert und eine Korrelation des Umsatzes über die Intensitäten der

Quasi-Molekülionen des oder der Edukte und Produkte (im konkreten Fall das Diacetat 84

und die Monoacetate 85 und 86) ist daher nicht möglich. Wie in Kapitel 3.4.2 bereits erwähnt

wurde, ist dies jedoch durch den Zusatz eines internen Standards möglich. Als interne

Standards kommen eben solche Verbindungen in Frage, die unter ESI-MS-Bedingungen ein

ähnliches Ionisieriungsverhalten zeigen wie ein Edukt oder ein Produkt einer Reaktion. Durch

Zusatz solcher interner Standards zu den Proben einer Umsetzung lässt sich der Umsatz über

das Verhältnis der relativen Intensitäten der Standardsubstanz und des Edukts oder Produkts

einer Reaktion bestimmen. Für eine gleichzeitige Bestimmung des Umsatzes und des

Enantiomerenüberschuss der Hydrolysereaktion des pseudo-meso-Diacetats 84 wurde den

Proben das meso-Diacetat 125 als interner Standard zugesetzt. Nach Extraktion wurden die

Proben im 1 : 1-Verhältnis mit einer Lösung von 125 versetzt, die der Ausgangskonzentration

von 84 entspricht. Aus den ESI-Massenspektren konnten dann zusätzlich aus dem Verhältnis

pseudo-meso-Diacetat 84/meso-Diacetat 125 Informationen über den Umsatz der Reaktion

erhalten werden. In Abb. 3.10 ist das ESI-Massenspektrum der Probe nach einer

Reaktionszeit von 144 h und Zusatz des internen Standards abgebildet.


90 110 130 150 170 190 210 230 250m / z

Irel / %

40

60

80

100

20

Abb. 3.10: ESI-Massenspektrum einer Reaktionsprobe der Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 84 nach Zusatz des internen Standards 125 (Probe nach einer Reaktionszeit von 144 h).

In dem ESI-Massenspektrum sind die Natrium-Addukte der Quasi-Molekülionen der pseudo-

enantiomeren Monoacetate 85 und 86 und die der Diacetate 84 und 125 deutlich erkennbar.

Aus dem Verhältnis der totalen Intensitäten der Natrium-Addukte von 84 und 125 wurde der

Umsatz ermittelt. In Abb. 3.11 sind die durch GC ermittelten Umsätze der Vergleichs-

experimente der Diacetate 84 und 125 gegen die Reaktionszeit aufgetragen. Zusätzlich ist der

durch ESI-MS ermittelte Umsatz der Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 84

wiedergegeben.

[84+Na]+

[125+Na]+

[86+Na]+

[85+Na]+


0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0 24 48 72 96 120 144

Zeit / h

Umsatz %

Abb. 3.11: Auftragung der durch GC ermittelten Umsätze der Hydrolysen von 125 ( �� XQG�84 ( �� VRZLH� GHV� QDFK� =XVDW]� GHV� LQWHUQHQ� 6WDQGDUGV� HUPLWWHOWHQ� 8PVDW]HV� GHU�Hydrolyse von 84 ( ) durch ESI-MS. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.7.

Es fällt auf, dass der Umsatz der beiden Hydrolysereaktionen stagniert. Die Ursache dafür

könnte zum einen eine Desaktivierung der Lipase über die lange Reaktionszeit sein. Möglich

wäre auch, dass die gebildeten Monoacetate 85 und 86 inhibierend wirken und daher der

Umsatz nicht weiter ansteigt.

Die Abbildung lässt ebenfalls erkennen, dass eine Bestimmung des Umsatzes bei

gleichzeitiger Ermittlung der pseudo-ee-Werte unter Verwendung eines internen Standards

möglich ist. Jedoch zeigt der Vergleich zwischen den durch GC und den durch ESI-MS

bestimmten Umsätzen der Hydrolyse des Diacetats 84, dass bei letzterer Methode

systematisch höhere Werte erhalten werden. Da alle Extraktionen der Reaktionsproben im

kleinen Maßstab durchgeführt wurden, ist eine Anreicherung des pseudo-meso-Diacetats 84

im organischen Extrakt durch ein Verdampfen des Lösemittels (Ethylacetat) möglich. Das

Versetzen mit einer der Ausgangskonzentration von 84 entsprechenden äquimolaren Lösung

von 125 würde dann zu einer erhöhten Konzentration von 84 in den Proben führen. Eine

andere mögliche Fehlerquelle für diese Abweichungen könnte durch Pipettierungenauigkeiten

bei der Zugabe des Standards herrühren. Abhilfe schaffen könnte eine gleichzeitge

Verdünnung der Proben mit einem Lösemittelgemisch, welches zuvor mit dem internem

Standard versetzt wurde. Dies hat den Vorteil, dass mögliche Fehler durch ungenaues

Pipettieren minimiert werden, da die Verdünnungen in der Regel im Verhältnis 1 : 20 –


1 : 100 erfolgen. Zudem würde die Zahl der zusätzlichen Arbeitsschritte halbiert werden, was

im Fall einer Anwendung der Methode in der gerichteten Evolution von Vorteil wäre.

Weiterhin fällt auf, dass die in der Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 84 erhaltenen

Umsätze von denen der Reaktion des meso-Diacetats 125 abweichen. Da die erhaltenen

Enantiomerenüberschüsse dieses Vergleichsexperiments (vgl. Abb. 3.9) nur geringfügig

voneinander abweichen, können Isotopeneffekt auf die Selektivität der verwendeten Lipase

ausgeschlossen werden. Um den Einfluss der Deuterierung des verwendeten Substrats klären

zu können, waren weitere Vergleichsexperimente notwendig. Hierfür war die Synthese des zu

84 enantiomeren pseudo-meso-Diacetats 127 nötig (Schema 3.22).

Die Darstellung erfolgte durch Acylierung des kommerziell erhältlichen enantiomerenreinen

Monoacetats 126 (Schema 3.22).

Schema 3.22: Synthese des pseudo-meso-Diacetats 127.

In einem zusätzlichen Vergleichsexperiment wurden bei einer geringeren Substratkonzen-

tration (20 mM anstatt 50 mM) die Hydrolysen der beiden pseudo-meso-Diacetate 84 und 127

und des meso-Diacetats 125 unter identischen Reaktionsbedingungen durchgeführt (Schema

3.23).

126 127

OHAcO OAc[D]3AcO

PyridinCD3COCl

CH2Cl20 °C - RT

97 %


Schema 3.23: Zusätzliches Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Esterhydrolyse der Diacetate 125, 84 und 127.

Die Ergebnisse der gaschromatographischen Analyse des Vergleichsexperiments sind in den

folgenden beiden Abbildungen wiedergegeben. In Abb. 3.12 sind die ee-Werte der bevorzugt

gebildeten Monoacetate 126 bzw. 85 gegen die Reaktionszeit aufgetragen.

125 126 86

84 85 86

127 126 128

OAc[D]3AcO OAc[D]3OH+OHAcOLipase

Phosphat-PufferpH 7.5

RT

OAcAcO OAcOH+OHAcOLipase


RT

OH3AcO[D] OAcOH+OAc3AcO[D]Lipase


RT


0

10

20

30

40

50

0 24 48 72 96 120 144

Zeit / h

ee / %

Abb. 3.12: Auftragung des ee-Werts des Monoacetats 126 ( ) aus der Hydrolyse von 125, des ee-Werts von 85 ( ��DXV�GHU�5HDNWLRQ�YRQ�84 sowie des ee-Werts von 126 aus der Reaktion von 127 ( �� Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.8.

Wie zuvor sind die erhaltenen Enantioselektivitäten der Monoacetate 85 bzw. 126 aus den

Hydrolysen von 84 und 125 nahezu identisch. Einen geringeren ee-Wert zeigt das bevorzugt

gebildete Monoacetat 126 aus der Reaktion von 127.

Die Abb. 3.13 zeigt das Umsatz/Zeit-Diagramm der drei Hydrolysereaktionen.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 24 48 72 96 120 144

Zeit / h

Umsatz / %

Abb. 3.13: Auftragung des Umsatzes der Hydrolyse von 125 ( ), von 84 ( ��XQG�YRQ�YRQ�127 ( ��JHJHQ�GLH�5HDNWLRQV]HLW� Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.8.


Trotz verringerter Substratkonzentration ist in allen drei Hydrolysereaktionen eine

Stagnierung des Umsatzes zu erkennen, die vermutlich auf eine Inaktivierung des Enzyms

zurückgeführt werden kann. Des Weiteren fällt im Vergleich zu den Reaktionen von 125 und

84 die hohe Anfangsaktivität der Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 127 auf, die bei

zunehmenden Reaktionsverlauf jedoch nachlässt. Auch hier ist unter identischen

Reaktionsbedingungen ein leicht erhöhter Umsatz in der Hydrolyse von 84 zu erkennen. Die

niedrigeren ee-Werte des Monoacetats 126 aus der Reaktion von 127 (vgl. Abb. 3.12)

könnten aus der erhöhten Reaktivität von 127 bzw. der erhöhten Aktivität der verwendeten

Lipase gegenüber diesem Substrat durch die Deuterierung der Acetylgruppe herrühren. Die

Reaktion des pseudo-meso-Diacetats 84 führt bei einer im Vergleich zu 127 geringeren

Anfangsreaktivität zu einem leicht erhöhten Umsatz bei langen Reaktionszeiten (vgl. Abb.

3.11 und Abb. 3.13). Jedoch werden die gleichen Selektivitäten erhalten wie in der Hydrolyse

von 125 (vgl. Abb. 3.9 und Abb. 3.12).

Die deutlichen Unterschiede in der Reaktivität sowie in der Selektivität bei der Hydrolyse des

Substrats 127 im Vergleich mit den Subtraten 125 und 84 sind auf einen Isotopeneffekt

zurückzuführen. Dieser ist aber für eine Anwendung der Methode zum Screening auf

Enantioselektivität ohne Belang, da zu diesem Zweck das pseudo-meso-Diacetats 84

eingesetzt werden soll.

Abschließend lässt sich sagen, dass ein Screening auf Enantioselektivität von prochiralen

pseudo-meso-Verbindungen wie 84 und eine Bestimmung des Umsatzes durch Verwendung

eines internen Standards mit der ESI-Massenspektrometrie möglich ist.

3.4.6 Apparativer Aufbau des Screening-Systems

Wie in den letzten Abschnitten demonstriert werden konnte, sind die Ergebnisse der ESI-MS-

Analysen ausreichend genau für eine Anwendung des Verfahrens im Screening

asymmetrischer Prozesse auf Enantioselektivität. Da die Zielsetzung dieser Arbeit u. a. in der

Entwicklung einer Methode für ein Screening auf Enantioselektivität bestand, sind mögliche

Abweichungen bei der Enantiomerenbestimmung von 5-10 % vom wahren ee-Wert, welche

aufgrund eines experimentellen Fehlers bei Analyse oder aufgrund der Verwendung

isotopenmarkierter Verbindungen durch potentielle sekundäre Isotopeneffekte auftreten

könnten, ohne weiteres tolerierbar. Die Hits in einem primären Screening, d. h. in diesem Fall


die enantioselektivsten Katalysatoren oder Reagenzien einer asymmetrischen Umsetzung,

werden ohnehin in Kontrollexperimenten nachträglich überprüft.

Aufgrund der Resultate und einer Anwendung der Methode zur ee-Bestimmung in der

gerichteten Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität von Enyzmen wurde ein

experimenteller Aufbau realisiert, der einen möglichst hohen Durchsatz und eine

Automatisierung der Methode ermöglicht. In Abb. 3.14 ist der schematische Aufbau des

Screening-Systems zur Bestimmung von ee-Werten dargestellt.

PC undAuswertungESI-MS

Synthese der enantiomeren, -,

oder Verbindung

pseudo-mesopseudo-

pseudo-prochiralen

enantioselektiveUmsetzung

Probenmanagerfür Mikrotiterplatten

chirale Katalysatorenoder Reagenzien

Abb. 3.14: Schematische Darstellung des Screening-Verfahrens auf Enantioselektivität durch ESI-MS.

Die Voraussetzungen für ein Screening auf Enantioselektivität mit möglichst hohem

Durchsatz sind neben der Durchführung der Reaktionen im Mikrotitermaßstab die

automatisierte Durchführung der Analysen und Auswertung der Daten. Die parallele

Umsetzung der isotopenmarkierten pseudo-Enantiomere oder pseudo-prochiralen

Verbindungen mit einer Bibliothek chiraler Bio- oder Metallkatalysatoren und der

Aufarbeitung der Reaktionen durch Zentrifugation, Extraktion und/oder Verdünnung ist mit

kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatten mit kleinen Volumina möglich. Bei Verwendung

von Pipettierrobotern wird ein hoher Durchsatz gewährleistet. Ein hoher Durchsatz

massenspektrometrischer Analysen kann durch Kombination eines automatischen

Probenaufgabesystems für Mikrotiterplatten mit einem ESI-Massenspektrometer und einer

entsprechenden Software realisiert werden. Das für die Voruntersuchungen (Kapitel 3.4.3 und

3.4.4) und für die Anwendungsbeispiele (Kapitel 3.4.5) verwendete ESI-Massenspektrometer

Hewlett Packard 5989B ESI-MS (vgl. Kapitel 5.4.1.1) ist prinzipiell in Kombination mit


einem automatischen Probenaufgabesystem für Mikrotiterplatten verwendbar. Jedoch bietet

die Software dieses älteren Massenspektrometers keine Möglichkeit für eine direkte

Steuerung solcher Pipettierroboter. Wie Demonstrationsversuche mit verschiedenen

kommerziell erhältlichen automatischen Probenaufgabesystemen gezeigt haben, führt dies zu

einer erheblichen Verringerung des Probendurchsatzes. Da diese Methode zur Bestimmung

des Enantiomerenüberschusses auf keine chromatographische Trennung der pseudo-

enantiomeren Edukte oder Produkte angewiesen ist und die Proben bei konstantem

isokratischem Lösemittelfluß in das ESI-MS injiziert werden (Flow Injection), werden die

Analysenzeiten der einzelnen Proben und damit der Durchsatz im Prinzip durch zwei

Faktoren bestimmt. Zum einen muss ein verschleppungsfreies Injizieren der Proben

gewährleistet werden, da sonst Verfälschungen der Ergebnisse nachfolgender Analysen die

Folge wären. Zum anderen wird der Probendurchsatz durch den Zeitraum limitiert, der

verstreicht, bis der automatische Probengeber nach einer beendeten Datenaufnahme des ESI-

Massenspektrometers eine weitere Probe in das Rheodyne-Ventil des ESI-MS-Systems

injiziert.

Im Rahmen der Arbeiten zum Screening auf Enantioselektivität durch ESI-MS wurden

Massenspektrometer verschiedener Hersteller unter Berücksichtigung der oben genannten

Faktoren getestet. Unter den untersuchten Geräten erwies sich ein aus Massenspektrometer,

Gradientenpumpe und automatischem Probengeber bestehendes „Komplett-System“ der

Firma Waters als besonders geeignet. Das in derzeitigen Untersuchungen verwendete Single-

Quadrupol Massenspektrometer ZMD 2000 für ESI- und APCI (Atmospheric Pressure

Chemical Ionisation) ermöglicht bei isokratischem Betrieb der Gradientenpumpe und

Flussraten von 100-200 µl/min in Kombination mit dem Waters 2700 Sample Manager für

Mikrotiterplatten die Durchführung von Analysen im Takt von 45-90 Sekunden abhängig von

den verwendeten Substanzen. Somit können 700-1400 Proben auf ee-Werte innerhalb eines

Tags untersucht werden.

3.4.7 Screening auf Enantioselektivität durch MALDI-TOF-MS

Wie in Kapitel 3.2.1 und 3.2.2 bereits angedeutet wurde, gibt es für die MALDI-TOF-

Massenspektrometrie in der kombinatorischen Chemie zahlreiche Anwendungsgebiete. Da

automatisierte MALDI-TOF Massenspektrometer kommerziell erhältlich sind, war im


Rahmen der eigenen Untersuchungen zu klären, inwieweit sich diese Methode zum schnellen

Screening auf Enantioselektivität eignen würde. Die prinzipielle Vorgehensweise bei der

Bestimmung der ee-Werten von pseudo-enantiomeren Verbindungen mit dieser Technik ist in

Abb. 3.15 dargestellt.

Abb. 3.15: Schematische Darstellung der Vorgehensweise beim Screening auf Enantio-selektivität durch MALDI-TOF Massenspektrometrie.

Wie beim Screening auf Enantioselektivität durch ESI-MS wurden isotopenmarkierte pseudo-

Enantiomere verwendet. Im Anschluss an die enantioselektive Umsetzung wurden die

entsprechenden Reaktionsprodukte in einer Mikrotiterplatte mit einer geeigneten

Matrixlösung versetzt und auf das MALDI-Target überführt. Durch MALDI-TOF MS-

Analyse konnte der pseudo-Enantiomerenüberschuss der jeweiligen Probe bestimmt werden.

Diese Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. S. HAEBEL vom Interdiszipli-

nären Forschungszentrum für Biopolymere der Universität Potsdam und Herrn

Dr. D. STÖCKIGT vom Max-Planck-Institut für Kohlenforschung in Mülheim an der Ruhr

durchgeführt. Dass die Bestimmung von pseudo-Enantiomerenüberschüssen mit MALDI-

TOF-MS möglich ist, konnte im Rahmen dieser Arbeit in ersten Versuchen demonstriert

werden.

Da sich für die MALDI-TOF MS-Analysen insbesondere Substanzen mit höheren

Molekulargewichten eignen,[216] wurde in einer Modellreaktion die enzymatische Hydrolyse

der pseudo-enantiomeren (S,S)- und (R,R)-Binaphthol-Diacetate 129 und 130 untersucht

(Schema 3.24).

Synthese der pseudo-Enantiomere

enantioselektive Umsetzung

Probenmanager für

Mikrotiterplatten: Präparation der

MALDI-TARGETS

chirale Katalysatoren oder Reagenzien

PC und Auswertung

MALDI-TOF-MS


Schema 3.24: Enzymatische Hydrolyse einer 1 : 1-Mischung der pseudo-enantiomeren (S,S)- und (R,R)-Binaphthol-Diactate 129 und 130 zu den pseudo-enantiomeren Monoacetaten 131 und 132.

Die Synthese der beiden Binaphthol-Diacetate 129 und 130 erfolgte durch die Acylierung der

enantiomerenreinen Binaphthole (S,S)- und (R,R)-133 (Schema 3.25).

Schema 3.25: Synthese der pseudo-enantiomeren Binaphthol-Diactate 129 und 130.

(S,S)- 129 (R,R)-130

(S,S)-131 (R,R)-132

(S,S)-133 (S,S)-129

(R,R)-133 (R,R)-130

OAc[D]3

OAc[D]3OAcOAc

+

OAc[D]3

OHOHOAc

+

PLE

TRIS-PufferpH 7.5

RT

OHOH

OHOH

OAc[D]3

OAc[D]3

OAcOAcCH3

O

Cl+

D3C

O

Cl+

Pyridin

CH2Cl20 °C - RT> 99 %

Pyridin

CH2Cl20 °C - RT> 99 %


380 360

100

80

60

40

20

400 420

m / z

Irel / %

Für die enzymatische Hydrolyse mit Schweineleberesterase (Porcine Liver Esterase, PLE)

wurden die pseudo-Enantiomere 129 und 130 in einem 1 : 1-Verhältnis miteinander gemischt

und zu der enzymhaltigen Pufferlösung gegeben. Nach einer Reaktionszeit von 4 Tagen

wurden Proben der Lösungen für die MALDI-TOF MS-Analyse entnommen und mit einer

5%igen Matrix-Lösung von Trihydroxyacetophenon in Methanol versetzt und auf ein

MALDI- Target transferiert. Die Analysenzeiten betrugen zwischen 40 und 120 Sekunden pro

Spot des Targets, d. h. pro gemessener Probe, abhängig von der Zahl der summierten

Spektren (zwischen 20 und 50). In Abb. 3.16 ist ein MALDI-TOF Massenspektrum einer

Probe gezeigt.

Abb. 3.16 MALDI-TOF Massenspektrum einer Probe der enzymatischen Hydrolyse einer 1 : 1-Mischung der pseudo-enantiomeren Binaphthol-Diacetate 129 und 130. Erkennbar sind die Natrium- bzw. Kalium-Addukte von 129 und 130. Zur Durchführung siehe Kapitel 5.4.2.9.

Aus den Signalintensitäten der Natrium-Addukte wurde der Enantiomerenüberschuss der

Probe bestimmt. Der pseudo-ee-Wert des Diacetats 129 beträgt in diesem Fall 40 %. In den

MALDI-Massenspektren konnten keine Hinweise auf die Hydrolyseprodukte wie Binaphthol

133 oder die entsprechenden monoacylierten Produkte 131 und 132 gefunden werden.

Diese ersten Untersuchungen belegen die prinzipielle Möglichkeit eines Screenings auf

Enantioselektivität durch MALDI-TOF Massenspektrometrie. Die Methode sollte sich

ebenfalls zur pseudo-Enantiomerenbestimmung von asymmetrischen Reaktionen pseudo-

[130+Na]+

[129+K]+

[130+K]+

[129+Na]+


prochiraler oder pseudo-meso-Verbindungen eignen. Zur genaueren Evaluierung der Methode

sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig.

3.4.8 Zusammenfassung und Ausblick

In diesem Teil der Arbeit wurde eine neue Methode zum Screening auf Enantioselektivität

von asymmetrisch katalysierten Reaktionen von chiralen Verbindungen und von prochiralen

Substraten mit enantiotopen Gruppen entwickelt.

Durch Verwendung isotopenmarkierter Substrate in Form pseudo-enantiomerer oder pseudo-

prochiraler Verbindungen kann der Verlauf asymmetrischer Transformationen, d. h. die

relativen Mengen der Reaktanden und/oder Produkte durch ESI-Massenspektrometrie ohne

eine vorherige chromatographische Trennung bestimmt werden. Ferner ist eine Derivati-

sierung unter Bildung von Diastereomeren nicht erforderlich.

Die Genauigkeit der Methode und der Einfluss der Isotopenmarkierung wurde anhand von

Vergleichsexperimenten der Racemate und der 1 : 1-Mischung der entsprechenden pseudo-

Enantiomere in enzymkatalysierten kinetischen Racematspaltungen und durch Vergleichs-

experimente von Umsetzungen einer prochiralen und pseudo-prochiralen Verbindung

demonstriert. Dazu wurden die bestimmten Enantioselektivitäten aus den ESI-MS-Messungen

mit denen der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie an chiraler stationärer Phase verglichen.

Die Ergebnisse belegen eine ausreichende Genauigkeit für eine Anwendung der Methode im

Screening auf Enantioselektivität von Katalysatorbibliotheken. Durch die richtige Wahl der

Position der Isotopenmarkierung konnten Hinweise auf mögliche sekundäre Isotopeneffekte

ausgeschlossen werden.

Im Fall der prochiralen Verbindung konnte durch Verwendung eines internen Standards

neben der Enantioselektivität auch der Umsatz der Reaktion bestimmt werden. Weitere

Untersuchungen der Umsatzbestimmungen sind jedoch notwendig, um eine höhere

Genauigkeit zu erzielen.

Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde der experimentelle Aufbau der Screening-Methode

realisiert. Unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ESI-Massenspektrometers mit

Gradientenpumpe und automatischem Probengeber für Mikrotiterplatten können Proben im

Abstand von 45-90 Sekunden verschleppungsfrei analysiert werden (700-1400 Proben pro

Tag).


In einer ersten Untersuchung konnte ebenfalls demonstriert werden, dass die Methode nicht

auf die Anwendung der ESI-Massenspektrometrie limitiert ist, sondern auch auf MALDI-

TOF-MS übertragen werden kann.

Die Methode wurde bislang an Beispielen aus dem Bereich der Enzymkatalyse demonstriert,

sollte sich jedoch ebenfalls auf metallkatalysierte kinetische Racemetspaltungen[217] und

asymmetrische Transformationen von prochiralen Substraten mit enantiotopen Gruppen

übertragen lassen.

Ein Screening auf Enantioselektivität von asymmetrischen Reaktionen prochiraler

Verbindungen mit enantiotopen Seiten ist mit dieser Methode nicht ohne weiteres möglich. In

derzeitigen Untersuchungen wird die Möglichkeit der ee-Bestimmung durch eine

Derivatisierung der Reaktionsprodukte derartiger Umsetzungen mit pseudo-enantiomeren

Estern untersucht. Diese Derivatisierung führt zu Verbindungen mit unterschiedlichen

Massen, welche sich massenspektrometrisch unterscheiden lassen. Das Prinzip ist im

folgenden Schema 3.26 am Beispiel eines chiralen Alkohols wiedergegeben.

Schema 3.26: Derivatisierung eines chiralen Alkohols mit einer 1 : 1-Mischung pseudo-enantiomerer Ester, von denen ein pseudo-Enantiomer bevorzugt mit dem (R)-Enantiomer des chiralen Alkohols reagiert, das andere entsprechend mit dem (S)-Enantiomer unter Bildung von Diastereomeren, die aufgrund einer Isotopenmarkierung massenspektrometrisch unterscheidbar sind. Der Stern (*) symbolisiert die Isotopenmarkierung.

R OH

(R)

R OH

(S)

+

R’*CO2R

R’CO2Et

(R) oder (S)

R’*CO2Et

(S) oder (R)

R’CO2R

+

Kapitel 4

Zusammenfassung und Ausblick

4 Zusammenfassung und Ausblick 119

4 Zusammenfassung und Ausblick

Effiziente Testverfahren sind eine Voraussetzung für jedes High-Throughput-Screening. Dies

trifft zum einen auf die kombinatorische Chemie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe zu,

zum anderen auf den jungen Ansatz der kombinatorischen Material- und Katalyseforschung.

Insbesondere für die enantioselektive kombinatorische Homogenkatalyse und die gerichtete

Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität von Enzymen sind geeignete Screening-

Methoden unerlässlich für das Auffinden des selektivsten Metall- oder Biokatalysators.

Das Thema dieser Arbeit war daher die Entwicklung neuer Screening-Methoden für die

(enantioselektive) kombinatorische Homogenkatalyse und die gerichtete Evolution von

Enzymen.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die zeitaufgelöste

IR-Thermographie zur Detektion biokatalytischer und homogener metallkatalysierter

Prozesse in Lösung angewandt werden kann.

Im Fall einer lipasekatalysierten Veresterung eines sekundären Alkohols konnte neben der

Aktivität auch die Enantioselektivität der Reaktion qualitativ bestimmt werden. Selbst bei

Verwendung geringer Mengen des Biokatalysators konnten durch die detektierte

Wärmestrahlung in den IR-thermographischen Aufnahmen die Aktivität und Selektivität der

Reaktionen eindeutig nachgewiesen werden.

Die Möglichkeit eines zeitaufgelösten Screenings homogener metallkatalysierter Reaktionen

durch die IR-Thermographie wurde anhand von zwei Modellreaktionen demonstriert. In

einem ersten Beispiel wurde die enantioselektive katalytische Ringöffnung von chiralen

Epoxiden durch verschiedene chirale Übergangsmetall-Salen-Komplexe untersucht. Die

relativen Aktivitäten und Selektivitäten der Katalysatoren konnten durch die freigesetzte

Wärmestrahlung der Reaktion bestimmt werden. In einem speziellen Fall wurden

Temperaturänderungen von mehr als 8 °C beobachtet. Der selektivste dieser chiralen Metall-

Salen-Komplexe wurde ebenfalls für ein Screening der relativen Substratreaktivität

unterschiedlicher chiraler Epoxide eingesetzt. Wie bei den IR-thermographischen

Untersuchungen zur relativen Aktivität und (Enantio-)Selektivität der Metall-Salen-Komplexe

120 4 Zusammenfassung und Ausblick

konnten auch in diesen Untersuchungen die in der Literatur beschriebenen Reaktivitätsmuster

unterschiedlicher Substrate anhand der zeitaufgelösten Wärmebilder nachvollzogen werden.

Eine Quantifizierung der beobachteten Temperaturänderungen ist im Hinblick auf eine

Anwendung der Methode zum Screening auf Enantioselektivität von kinetischen

Racematspaltungen von Interesse. Diese Untersuchungen waren mit dem verwendeten IR-

Thermographiesystem nicht ohne weiteres möglich und stehen bislang noch aus.

In einem weiteren Beispiel eines homogenen metallkatalysierten Prozesses konnte erstmals

gezeigt werden, dass die zeitaufgelöste IR-thermographische Detektion unter bestimmten

Voraussetzungen auch zum Screening thermoneutraler oder endothermer Reaktionen

herangezogen werden kann. Im Fall der rutheniumkatalysierten Ringschluss-Olefin-Metathese

(RCM) von 1,7-Octadien zu Cyclohexen und Ethen wurde eine Abkühlung der

Reaktionslösung beobachtet. Obwohl thermodynamische Rechnungen ergaben, dass diese

Reaktion nur schwach endotherm ist, konnten aufgrund unterschiedlich starker Abkühlungs-

effekte die aktivsten Rutheniumkatalysatoren in dieser Modellreaktion ermittelt werden.

Dieser Effekt wurde in weiteren IR-Thermographieuntersuchungen in einem ausgedehnteren

Katalysator-/Substrat-Screening mit verschiedenen Rutheniumkatalysatoren und verschie-

denen Dienen ausgenutzt. Obwohl die Ursachen der Abkühlung der Reaktionslösung unklar

sind – vermutlich tragen verschiedene Enthalpieeffekte sowie die Verdampfungswärme des

während der Reaktion gebildeten Ethens dazu bei – stehen die beobachteten Temperatur-

änderungen im Zusammenhang mit der katalytischen Aktivität und können daher im

Screening ausgenutzt werden.

Da alle Reaktionen im Mikromaßstab (< 300 µl Gesamtvolumen) durchgeführt wurden und

eine räumliche Auflösung kein Problem darstellt, ist eine Übertragung der Methode auf ein

Screening größerer Katalysatorbibliotheken und anderer Reaktionstypen durchaus denkbar.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine neue Methode zum Screening auf Enantioselektivität

von asymmetrisch katalysierten Prozessen von chiralen Verbindungen und von prochiralen

Substraten mit enantiotopen Gruppen beschrieben.

Die Methode basiert auf der Verwendung isotopenmarkierter Substrate in Form von 1 : 1-

Mischungen von pseudo-Enantiomeren bzw. isotopenmarkierter pseudo-prochiraler

Verbindungen mit enantiotopen Gruppen. Der Verlauf der asymmetrischen Transformation

kann durch das Verhältnis der relativen Intensitäten der Quasi-Molekülionen der Reaktanden

4 Zusammenfassung und Ausblick 121

und/oder Produkte aus den Massenspektren durch ESI-MS ohne eine vorherige

chromatographische Trennung oder Diastereomerenbildung bestimmt werden.

Die Genauigkeit der Methode und der Einfluss der Isotopenmarkierung wurde anhand von

Beispielen enzymkatalysierter kinetischer Racematspaltungen und der Esterhydrolyse einer

prochiralen Verbindung demonstriert. Der Vergleich der gas- oder flüssigkeitschromato-

graphisch ermittelten ee-Werte mit den ESI-MS-Messungen zeigt eine gute Überein-

stimmung. Die Genauigkeit der Methode ist ausreichend hoch für eine Anwendung der

Methode im Screening auf Enantioselektivität von Katalysatorbibliotheken.

Durch die richtige Wahl der Position der Isotopenmarkierung können Einflüsse durch

mögliche Isotopeneffekte auf die Selektivität der untersuchten Reaktionen ausgeschlossen

werden.

Es zeigte sich, dass bei Verwendung eines internen Standards neben der Enantioselektivität

auch der Umsatz der Reaktion der prochiralen Verbindung ermittelt werden kann. Eine

Optimierung der Umsatzbestimmung ist jedoch nötig, um eine höhere Genauigkeit zu

erzielen.

Dass die Methode nicht auf die Anwendung der ESI-Massenspektrometrie limitiert ist,

sondern auf andere MS-Methoden wie z. B. die MALDI-TOF-MS übertragen werden kann,

konnte an einer Modellreaktion demonstriert werden.

In weiteren Arbeiten wurde der experimentelle Aufbau der Methode für ein Screening

realisiert. Die Kombination eines kommerziell erhältlichen ESI-Massenspektrometers mit

Gradientenpumpe und automatischem Probengeber für Mikrotiterplatten ermöglicht die

Analyse von Proben im 45-90 Sekunden-Takt. Typischerweise können 700-1400

ee-Bestimmungen pro Tag durchgeführt werden.

Obwohl die neue Methode bislang nur an Beispielen der Enzymkatalyse demonstriert wurde,

ist eine Anwendung im Screening auf Enantioselektivität von metallkatalysierten kinetischen

Racematspaltungen[217] und asymmetrischen Transformationen von prochiralen Substraten

mit enantiotopen Gruppen denkbar.

Da ein Screening auf Enantioselektivität von asymmetrischen Reaktionen prochiraler

Verbindungen mit enantiotopen Seiten mit dieser Methode nicht ohne weiteres möglich ist,

wird in derzeitigen Untersuchungen die Möglichkeit der ee-Bestimmung durch eine

Derivatisierung der Reaktionsprodukte derartiger Umsetzungen mit pseudo-enantiomeren

122 4 Zusammenfassung und Ausblick

Estern untersucht. Diese Derivatiserung führt zu Verbindungen mit unterschiedlichen Massen,

welche sich massenspektrometrisch unterscheiden lassen.

Neben der erstmaligen Anwendung der IR-Thermographie zur zeitaufgelösten parallelen

Detektion bio- und metallkatalysierter (enantioselektiver) Prozesse in Lösung wurde in dieser

Arbeit ein neues Screening-Verfahren auf Enantioselektivität von asymmetrisch verlaufenden

Reaktionen beschrieben. Damit stehen zwei Testsysteme zur Verfügung, die sich für viele

Anwendungen im Screening von kombinatorisch generierten Bibliotheken neuer Bio- und

Metallkatalysatoren eignen.

Kapitel 5

Experimenteller Teil


5 Experimenteller Teil

5.1 Allgemeine Vorbemerkungen

Da es sich bei den Zielverbindungen größtenteils um luftstabile Verbindungen handelt,

wurden die meisten Arbeiten an der Luft durchgeführt. Im Fall von luft- und/oder

feuchtigkeitsempfindlichen Verbindungen wurden die Reaktionen unter Standard-Schlenk-

Techniken mit Argon als Schutzgas durchgeführt. Alle verwendeten Glasgeräte wurden im

Ölpumpenvakuum (< 10–2 mbar) von Luft- oder Feuchtigkeitsspuren befreit und mit Argon

begast.

Alle Temperaturangaben beziehen sich auf die Temperatur des Kälte- oder Heizbades.

5.1.1 Verwendete Lösemittel und Chemikalien

Alle verwendeten Lösemittel wurden nach den üblichen Verfahren mit den unten aufgeführten

Reagenzien getrocknet, anschließend destilliert oder unter vermindertem Druck kondensiert

und unter Argon aufbewahrt.[218]

Tetrahydrofuran, Toluol: Natriumtetraethylaluminat

Dichlormethan, [D]2-Dichlormethan, [D]1-Chloroform,

Pyridin, Triethylamin, [D]6-Dimethylsulfoxid: Calciumhydrid

Diethylether, Pentan, Hexan: Natrium/Kalium-Legierung

Dimethylformamid: Dibutylzinndilaurat/Desmodur

Methanol: Magnesium

Alle käuflichen Ausgangschemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, bei einer

Reinheit von >97 % direkt eingesetzt, andernfalls destilliert, umkristallisiert oder getrocknet.

Hexadeuteroacetanhydrid (99 Atom% D, Aldrich), (1R, 4S)-cis-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol

(>98 %, Fluka), (1S, 4R)-cis-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (>99 %, Fluka), Trideutero-

acetylchlorid (99 Atom% D, Aldrich), (S)-Benzylglycidylether (>99 %, Fluka), (R)-Benzyl-

glycidylether (>99 %, Fluka), (4R)-Benzyl-2-oxazolidinon (>99.5 %, Fluka), Benzyliden-

bis(tricyclohexylphosphin)-dichlorruthenium (>97 %, Fluka), (S,S)-N,N’-Bis(3,5-di-tert-

126 5 Experimenteller Teil

butylsalicyliden)-1,2-cyclohexandiamin (98 %, Aldrich), (S,S)-N,N’-Bis(3,5-di-tert-

butylsalicyliden)-1,2-cyclohexandiamin-mangan(III)-chlorid (98 %, Fluka), (R,R)-1,1’-Bis-2-

naphthol (>99.9 % ee, Kankyo Kagaku Center, Japan), (S,S)-1,1’-Bis-2-naphthol (> 99.9 % ee,

Kankyo Kagaku Center, Japan), n-Butanol (>98 %, Fluka), n-Butyllithium (1.6 M in Hexan,

Chemetall), 1,5-Cyclooctadien-kupfer(I)-chlorid (Fluka), Decansäurechlorid (98 %, Aldrich),

cis-3,5-Diacetoxy-1-cyclopenten (>98 %, Fluka), 1,4-Dibrombutan (99 %, Aldrich),

Diallylmalonsäureethylester (98 %, Aldrich), 1,14-Dibromtetradecan (>97 % GC,

Chemikalienlager MPI für Kohlenforschung), Dinatriumhydrogenphosphat·Dihydrat (>98 %,

Fluka), Di-tert-butyldicarbonat (97 %, Aldrich), rac-Epichlorhydrin (>99 %, Aldrich), (S)-

Epichlorhydrin (>99 %, Fluka), (R)-Epichlorhydrin (>99 %, Fluka), (R)-2-

Hydroxymethylpyrrolidin ((D)-Prolinol, >98 %, Fluka), (S)-2-Hydroxymethylpyrrolidin ((L)-

Prolinol, > 98 %, Fluka), Kaliumdihydrogenphosphat (>99.5 %, Fluka), Natriumhexamethyl-

disilazid (Chemikalienlager MPI für Kohlenforschung), 1,7-Octadien (>99 %,

Chemikalienlager MPI für Kohlenforschung), rac-2-Octanol ( >98 %, Fluka), (S)-2-Octanol

(99 % ee, Aldrich), (R)-2-Octanol (99 % ee, Aldrich), Palmitinsäure (99 %, Sigma),

Phenylessigsäurechlorid (98 %, Aldrich), rac-1-Phenylethanol (>98 %, Merck-Schuchardt),

(S)-1-Phenylethanol (99 % ee, Fluka), (R)-1-Phenylethanol (99 % ee, Fluka), rac-1,2,2,2-

Tetradeutero-1-Phenylethanol (Cambridge Isotope Laboratories), rac-2-Phenylpropionsäure

(>98 %, Fluka), (S)-2-Phenylpropionsäure (>97 % ee, Fluka), (R)-2-Phenylpropionsäure

(>97 % ee, Fluka), (S)-Propylenoxid (99 % ee, Aldrich), rac-Styroloxid (97 %, Aldrich), (S)-

Styroloxid (98 %, Aldrich), (R)-Styroloxid (99 %, Acros), Trideuteroiodmethan

(>99.5 Atom% D, Aldrich), Trideuteromethylmagnesiumiodid (1.0 M in Diethylether,

> 99 Atom% D, Aldrich), , , -Tris-(hydroxymethyl)-methylamin Hydrochlorid (TRIS,

> 99 %, Aldrich), Vinylacetat (> 99 %, Merck-Schuchardt).

Die für die IR-Thermographieuntersuchungen verwendeten Ruthenium-Komplexe 49, 50 und

51 sowie die verwendeten Allylmalonsäureesterderivate 57, 59, 61 und 63 wurden

freundlicherweise von Frau M. LIEBL, Arbeitsgruppe Professor Dr. A. FÜRSTNER, Max-

Planck-Institut für Kohlenforschung, zur Verfügung gestellt.


5.1.2 Verwendete Enzyme

Folgende Enzyme wurden verwendet:

Novo SP 435 Lipase: Novozym® 435, auf Acrylharz immobilisierte Candida

antarctica Lipase, Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark

Schweineleberesterase: (Porcine Liver Esterase, PLE) Sigma

Bacillus subtilis Lipase A (in Escherichia coli BL21(DE3), Vektor: pET22 lipA1): Im

Rahmen einer Kooperation von Herrn T. EGGERT,

Arbeitsgruppe Priv.-Doz. Dr. K.-E. JÄGER, Ruhr-Universität

Bochum, in Form eines lipasehaltigen Kulturüberstands mit

einem Proteingehalt von 15 mg/l zur Verfügung gestellt.

5.1.3 Puffer

Folgende Puffer wurden für die enzymatischen Reaktionen verwendet:

10 mM TRIS-Puffer, pH 7.5 (TRIS/HCl)

10 und 50 mM Phosphat-Puffer, pH 7.5 (DinatriumhydrogenphosphatÂ'LK\GUDW�XQG�.DOLXP-

dihydrogenphosphat)

5.1.4 Verwendete Geräte für enzymatische Reaktionen

Alle enzymatischen Umsetzungen mit größeren Volumen (> 2 ml) wurden in ERLENMEYER-

Kolben oder Rundkolben bei Raumtemperatur mit einem Swip KL-2 Schüttler der Firma

Edmund Bühler durchgeführt.

Zur Durchmischung kleiner Volumina wurden Schüttler der Firma Eppendorf (Thermomixer

5437 oder Comfort) für 0.5, 1.5 und 2.0 ml Reaktionsgefäße verwendet.

5.1.5 Darstellung literaturbekannter Verbindungen

Folgende Verbindungen wurden nach Literaturvorschriften dargestellt:

(S,S)-N,N’-Bis(3,5-di-tert-butylsalicyliden)-1,2-cyclohexandiamin-cobalt(II)[133], (S,S)-N,N’-

Bis(3,5-di-tert-butylsalicyliden)-1,2-cyclohexandiamin-chrom(III)-chlorid[134], Li2CuCl4[211]

,

(4R)-Benzyl-3-N-decanoyl-2-oxazolidin-2-on (112)[72,209,210,214],

(S)-2-Methyldecansäure ((S)-107)[72,209,210,214]


5.1.6 Analytische Methoden

5.1.6.1 Kernresonanzspektroskopie (NMR)

Die 1H-NMR- und Breitband-1H-entkoppelten 13C-NMR-Spektren wurden mit Bruker AMX

300 und Bruker DPX 300 (300.13 bzw. 75.48 MHz) sowie Bruker AC 200 und Bruker AM

200 (200.13 bzw. 50.32 MHz) Spektrometern gemessen. Die chemischen Verschiebungen

wurden relativ zu Tetramethylsilan (TMS) angegeben. Als interne Standards dienten für 1H-

NMR-Spektren die Restwasserstoffsignale der verwendeten Lösemittel (Chloroform:

7.24 ppm, Dichlormethan: 5.31 ppm, Dimethylsulfoxid: 2.50 ppm); für 13C-NMR-Spektren

die Signale der deuterierten Lösemittel (Chloroform: 77.0 ppm, Dichlormethan: 53.7 ppm,

Dimethylsulfoxid: 37.7 ppm).

5.1.6.2 Massenspektrometrie (MS)

Die Aufnahme von Elektronenstoß-Ionisations-Spektren (EI) erfolgte unter fraktionierter

Verdampfung oder durch Flüssigkeitseinlass mit den Geräten Finnigan MAT 8200 und

Finnigan MAT 8400 der Firma Finnigan GmbH, Bremen. ESI-, APCI- und LC/MS-

Messungen wurden mit einem LC-System HP 1090 und einem Massenspektrometer HP 5989

B MS-Engine, beide Firma Hewlett-Packard GmbH, Waldbronn, aufgenommen. Die GC/MS-

Kopplungen unter Elektronenstoß-Ionisation (EI) und chemischer Ionisation (CI) wurden mit

einem GC HP 5890 der Firma Hewlett-Packard GmbH, Waldbronn, und einem

Massenspektrometer MAT SSQ 7000 der Firma Finnigan GmbH, Bremen, aufgenommen.

Die Angabe der Intensitäten der Signale beziehen sich auf den Basispeak. Für Fragmente mit

einer Isotopenverteilung ist jeweils nur der intensivste Peak eines Isotopomers aufgeführt.

5.1.6.3 Infrarotspektroskopie (IR)

Die IR-Spektren wurden mit einem Nicolet Magna-IR 750 Spektrometer aufgenommen. Die

Art der Probenvorbereitung ist bei den jeweiligen Analysenergebnissen aufgeführt.


5.1.6.4 Elementaranalysen

Alle Elementaranalysen wurden im Mikroanalytischen Laboratorium H. Kolbe, Mülheim an

der Ruhr, durchgeführt.

Die Berechnung des tatsächlichen prozentualen Massenanteils isotopenmarkierter

Verbindungen erfolgte nach folgender Formel:

x % = n · M / m Gleichung 5.1

wobei x % der berechnete prozentuale Massenanteil eines Elements, n die Anzahl der Kerne

dieses Elements im Molekül, M die tatsächliche Molekülmasse unter Berücksichtigung der

natürlichen Isotopenverteilung und m die tatsächliche Molekülmasse unter Berücksichtigung

der Isotopenmarkierung darstellt.

5.1.6.5 Gas- und Flüssigkeitschromatographie (GC und LC)

Die Gas- und Flüssigkeitschromatogramme wurden von der Abteilung für Chromatographie

des Max-Planck-Instituts für Kohlenforschung in Mülheim an der Ruhr aufgenommen. Die

Geräte und Bedingungen sind bei den jeweiligen Versuchsvorschriften angegeben.

5.1.6.6 Säulenchromatographische Methoden

Zur Säulenchromatographie wurde Kieselgel 60 (Korngröße 0.063-0.200 mm (70-230 mesh

ASTM)) der Firmen Merck, Darmstadt und Aldrich verwendet.

Für die Dünnschichtchromatographie (DC) wurden kieselgelbeschichtete Kunststofffolien mit

Fluoreszenzindikator (DC-Fertigfolien Polygram SIL-G/UV254, Schichtdicke 0.25 mm) der

Firma Macherey & Nagel, Düren, verwendet. Die Detektion erfolgte mit UV-Licht oder durch

Behandlung mit Oxidationsreagenzien (Iod, Molybdatophosphorsäure-Cer(IV)sulfat oder

Kaliumpermanganat).


5.2 Synthesen

5.2.1 Synthese von (S)-1-Phenylethylacetat ((S)-26)

In einem 25-ml-Stickstoffkolben werden unter Luft- und

Feuchtigkeitsausschluss 8.28 mmol (1.01 g, 1.00 ml) (S)-1-Phenylethanol

((S)-26), 12.4 mmol (1.50 Äq., 983 mg, 1.00 ml) Pyridin und 15 ml

Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C gekühlt. Unter Rühren werden

innerhalb von 10 min 10.8 mmol (1.30 Äq., 1.10 g, 1.02 ml) Acetanhydrid zugetropft. In

einem Zeitraum von 12 h wird auf Raumtemperatur erwärmt und sukzessive mit je zweimal

20 ml 10%iger Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter

Natriumchloridlösung extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat

getrocknet, vom Trockenmittel durch Filtration getrennt und am Rotationsverdampfer vom

Lösemittel befreit. Das Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgetragen und chromatographisch

gereinigt (Laufmittel: Hexan : Essigsäureethylester = 9 : 1). Die Produktfraktionen (Rf = 0.48)

werden vereinigt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Nach Trocknen im

Ölpumpenvakuum verbleibt eine klare Flüssigkeit (1.25 g, 7.62 mmol, 92 %). 1H-NMR

(CDCl3, 200 MHz): δ = 1.52 (d, 3J = 6.6 Hz, 3H, CHCH3), 2.06 (s, 3H, COOCH3), 5.94 (q, 3J

= 6.6 Hz, 1H, CHCH3), 7.24-7.38 (m, 5H, Ar-H); 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 21.4

(CH3COO), 22.2 (CHCH3), 72.3 (COOCH3), 126.1 (Ar-C), 127.9 (Ar-C), 128.5 (A-Cr), 141.7

(i-Ar-C), 170.3 (COOCH3); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 164 [M+] (25), 122

(77), 107 (36), 105 (69), 104 (100), 103 (24), 79 (27), 78 (27), 77 (43), 51 (24), 43 (90); IR

(KAP): ~ν (cm-1) = 3454 (w, C=O), 3065, 3034, (alle s, Ar), 2982, 2872 (alle s, CH, CH3),

1733 (s, C(O)O), 1605, 1586, 1495 (alle, w, Ar), 1371 (s, C(O)CH3), 1239, 1209, 1065, 1029

(alle s, C-O), 761, 699 (s, Ar); EA: C: 72.95 % (ber. 73.15 %), H: 7.28 % (ber. 7.37 %); GC

(Hewlett Packard 5890, Säule: 25 m fused silica, 0.25 mm i. D., 2,6-Dimethyl-3-pentyl-β-CD

(95 % Methyl-/ 5 % Phenylpolysiloxan), Detektor: FID, Temperaturprogramm: 80 °C-

4 °C/min-120 °C-0.2 min isotherm, Trägergas: 0.63 bar Wasserstoff), Retentionszeiten: (S)-

Enantiomer: 5.6 min, (R)-Enantiomer: 5.8 min, 99.8 % ee.

(S)-26

OAc

5.2 Synthesen 131

5.2.2 Synthese von (R)-1-Phenylethyltrideuteracetat ((R)-79)


Feuchtigkeitsausschluss 8.28 mmol (1.01 g, 1.00 ml) (R)-1-Phenylethanol

((R)-26), 12.4 mmol (1.50 Äq., 983 mg, 1.00 ml) Pyridin und 15 ml

Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C gekühlt. Unter Rühren werden

innerhalb von 10 min 10.8 mmol (1.30 Äq., 1.16 g, 1.02 ml) [D]6-Acetanhydrid (99 Atom%

D, Aldrich) zugetropft. Innerhalb von 12 h wird auf Raumtemperatur erwärmt und sukzessive

mit je zweimal 20 ml 10%iger Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und

gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat





Ölpumpenvakuum verbleibt eine klare Flüssigkeit (1.28 g, 7.65 mmol, 92 %). 1H-NMR

(CDCl3, 200 MHz): δ = 1.53 (d, 3J = 6.6 Hz, 3H, CHCH3), 5.88 (q, 3J = 6.6 Hz, 1H, CHCH3),

7.24-7.36 (m, 5H, Ar-H); 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 22.2 (CH3), 72.3 (COH), 126.1

(Ar-C), 127.7 (Ar-C), 128.5 (Ar-C), 141.7 (i-Ar-C), 170.3 (COOCD3); MS (EI, 70 eV, pos.

Ionen): m/z (% rel. Int.): 167 [M+] (24), 123 (77), 108 (39), 105 (67), 104 (100), 103 (25), 78

(27), 77 (35), 51 (19), 46 (65), 43 (14); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3437 (w, C=O), 3065, 3034,

(alle w, Ar), 2982, 2933 (alle w, CH, CH3), 2264, 2161 (alle W, CD3), 1739 (s, C(O)O), 1605,

1586, 1495 (alle, w, Ar), 1376 (w, C(O)CH3), 1252, 1209, 1069, 1029 (alle s, C-O), 759, 699

(s, Ar); EA: C: 71.77 % (ber. 71.83 %), H+D: 6.98 % (ber. 7.23 %); GC (Hewlett Packard

5890, Säule: 25 m fused silica, 0.25 mm i. D., 2,6-Dimethyl-3-pentyl-β-CD (95 % Methyl-

/ 5 % Phenylpolysiloxan), Detektor: FID, Temperaturprogramm: 80 °C-4 °C/min-120 °C-

0.2 min isotherm, Trägergas: 0.63 bar Wasserstoff), Retentionszeiten: (S)-Enantiomer:

5.6 min, (R)-Enantiomer: 5.8 min, 99.8 % ee.

(R)-79

OAc[D]3


5.2.3 Synthese von (4R)-Benzyl-3-N-benzyloxy-2-oxazolidin-2-on (95)

In einem 250-ml-Stickstoffkolben werden unter Luft- und Feuchtig-

keitsausschluss 24.0 mmol (4.52 g) (4R)-Benzyloxazolidin-2-on (94)

in 80 ml Tetrahydrofuran gelöst und auf –78 °C gekühlt. Unter Rühren

werden innerhalb von 15 min 24.0 mmol (15.0 ml einer 1.60 M

Lösung) n-Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 90 min wird bei –

78 °C eine Lösung von frisch destilliertem Phenylessigsäurechlorid

(93) (24.0 mmol, 3.71 g, 3.18 ml) und 10 ml Tetrahydrofuran

innerhalb von 10 min zugetropft. Nach beendetem Zutropfen wird das Trockeneisbad durch

ein Eisbad ersetzt. Nach Rühren bei 0 °C für 1 h wird die Reaktion durch Zugabe von 25 ml

einer gesättigten Ammoniumchloridlösung beendet und es wird eine weitere Stunde bei 0 °C

gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Anschluss in einen 250-ml-Kolben überführt und das

organische Lösemittel wird am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird dreimal

mit je 60 ml Diethylether, zweimal mit je 70 ml 1 M Natronlauge, 1 M Salzsäure und

gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über

Magnesiumsulfat getrocknet, vom Trockenmittel durch Filtration getrennt und am

Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Das Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgetragen

und chromatographisch gereinigt (Laufmittel: Hexan : Essigsäureethylester = 3 : 1). Die

Produktfraktionen (Rf = 0.34) werden vereinigt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel

befreit. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum verbleibt eine klare Flüssigkeit (5.88 g,

19.9 mmol, 83 %). 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 2.67 (dd, 3J = 9.5 Hz, 3J = 13.4 Hz, 1H,

PhCH2CH), 3.27 (dd, 3J = 3.3 Hz, 2J = 13.4 Hz, 1H, PhCH2CH), 4.14-4.23 (m, 2H, OCH2),

4.26 (d, 2J = 15.7 Hz, 1H, PhCH2CO), 4.35 (d, 2J = 15.7 Hz, 1H, PhCH2CO), 4.65-4.70 (m,

1H, NCH), 7.25-7.36 (m, 10H, Ar-H); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 37.7 (ArCH2CH),

41.6 (ArCH2CO), 55.3 (NCH), 66.1 (OCH2), 127.26 (Ar-C), 127.34 (Ar-C), 128.3 (Ar-C),

128.6 (Ar-C), 128.9 (Ar-C), 129.4 (Ar-C), 129.8 (Ar-C), 130.0 (Ar-C), 133.5 (Ar-C), 135.1

(Ar-C), 153.4 (CHCON), 171.2 (NCOO); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 296

(9), 295 [M+] (44), 178 (6), 119 (16), 118 (100), 117 (9), 91 (88), 90 (11), 65 (12); IR (KAP):

~ν (cm-1) = 3516, 3382 (beide w, C=O), 3087, 3063, 3028, 3005 (alle w, Ar), 2979, 2918

(beide w, aliphatisch CH), 1783 (s, NC(O)O), 1699 (s, NC(O)), 1600, 1496, 1456 (alle, w,

95

N O

O O

5.2 Synthesen 133

Ar), 764, 696 (beide s, Ar); EA: C: 73.31 % (ber. 73.20 %), H: 5.72 % (ber. 5.80 %), N:

4.68 % (ber. 4.74 %).

5.2.4 Synthese von (4R)-Benzyl-3N-((2R)-3,3,3-trideutero-2-phenyl-

propionyl)-oxazolidin-2-on (96)


Feuchtigkeitsausschluss 18.0 mmol (3.29 g) Natriumhexamethyl-

disilazid in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst und auf –78 °C gekühlt.

Unter Rühren wird innerhalb von 30 min eine Lösung von 18.0 mmol

(5.30 g) (4R)-Benzyl-3-N-benzyloxy-2-oxazolidin-2-on (95) in 25 ml

Tetrahydrofuran zugetropft. Nach 90 min Rühren bei –78 °C wird

eine Lösung aus 90.0 mmol (13.0 g, 5.60 ml) Trideuteromethyliodid

(99 Atom% D) und 20 ml Tetrahydrofuran innerhalb von 30 min zugetropft. Es wird bei

-78 °C weitere 12 h gerührt und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 30 ml einer

gesättigten Ammoniumchloridlösung beendet. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wird das

Reaktionsgemisch in einen 250-ml-Kolben überführt und das organische Lösemittel am

Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird dreimal mit je 60 ml Diethylether

extrahiert. Die vereinigten etherischen Phasen werden zweimal mit je 50 ml 10%iger

Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet,

vom Trockenmittel durch Filtration getrennt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel

befreit. Das Rohprodukt wird aus Ether/Essigsäureethylester umkristallisiert. Nach Filtration

und Trocknen im Ölpumpenvakuum wird ein farbloser Feststoff erhalten (4.67 g, 14.9 mmol,

83 %). 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 2.80 (dd, 3J = 9.8 Hz, 2J = 13.3 Hz, 1H, ArCH2CH),

3.35 (dd 3J = 3.2 Hz, 2J = 13.3 Hz, 1H, ArCH2CH), 4.02-4.13 (m, 2H, OCH2), 4.55-4.62 (m,

2H, NCH), 5.10 (s, 1H, ArCHCD3), 7.21-7.38 (m, 10H, Ar-H); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz):

δ = 37.9 (ArCH2CH), 42.9 (CHCD3), 55.8 (NCH), 65.9 (OCH2), 127.3 (Ar-C), 127.4 (Ar-C),

128.1 (Ar-C), 128.7 (Ar-C), 129.0 (Ar-C), 129.4 (Ar-C), 135.3 (ArCH2CH), 140.2 (i-Ar-C),

152.9 (CHCON), 174.6 (NCOO); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 312 [M+]

(34), 135 (100), 108 (72), 107 (18), 91 (14); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3537, 3366 (beide w,

C=O), 3067, 3028 (beide w, Ar), 2982, 2916, 2871 (alle w, aliphatisch CH), 2249, 2229, 2216

96

N O

O

CD3

O


(alle w, CD3), 1779 (s, NC(O)O), 1695 (s, NC(O)), 1599, 1493, 1452 (alle, w, Ar), 761, 705

(beide s, Ar); EA: C: 73.16 % (ber. 73.05 %), H+D: 6.00 % (ber. 6.13 %), N: 4.41 % (ber.

4.48 %).

5.2.5 Synthese von (R)-3,3,3-Trideuteromethyl-2-phenylpropion-

säure ((R)-91)

In einem 250-ml-Stickstoffkolben werden 11.6 mmol (3.64 g) (4R)-Benzyl-

3N-((2R)-3,3,3-trideutero-2-phenylpropionyl)-oxazolidin-2-on (96) in ca.

100 ml Tetrahydrofuran gelöst und die erhaltene Lösung auf 0 °C gekühlt.

Unter Rühren wird eine Lösung von 23.3 mmol (978 mg)

Lithiumhydroxid-Monohydrat in 18.0 ml einer 30%igen wässrigen Wasserstoffperoxidlösung

unter Rühren zugegeben. Anschließend wird bei 0 °C 18 h gerührt. Die Reaktion wird bei

0 °C durch tropfenweise Zugabe von 20 ml einer gesättigten Natriumsulfitlösung beendet, das

Reaktionsgemisch in einen 250 ml-Kolben überführt und das organische Lösemittel am

Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird dreimal mit je 70 ml Dichlormethan

extrahiert und die organische Phase verworfen. Die wässrige Phase wird mit 10%iger

Salzsäure auf pH 5 angesäuert und anschließend dreimal mit je 70 ml Diethylether extrahiert.

Die vereinigten etherischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, vom

Trockenmittel durch Filtration abgetrennt und das Lösemittel am Rotationsverdampfer

entfernt. Nach Trocken im Ölpumpenvakuum verbleibt eine farblose Flüssigkeit (8.60 mmol,

1.32 g, 74 %). 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 3.72 (s, 1H, CHCD3), 7.24-7.35 (m, 5H.

Ar-H), 11.5 (s, 1H, COOH); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 45.2 (CHCD3), 127.4 (Ar-C),

127.6 (Ar-C), 128.7 (Ar-C), 139.7 (i-Ar-C), 180.8 (COOH); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z

(% rel. Int.): 153 [M+] (24), 109 (11), 108 (100), 91 (8), 82 (5), 81 (8), 80 (5), 79 (10), 78 (8),

77 (6), 43 (11); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3500-2500 (b, COOH), 3064, 3031 (beide w, Ar),

2952, 2716, 2628 (alle w, aliphatisch CH), 2234, 2130, 2076 (alle w, CD3), 1705 (s, C(O)O),

1601, 1496, 1454 (alle, w, Ar), 1415 (s, OH), 1227 (s, CO), 941 (w, OH), 730, 696 (beide s,

Ar); EA: C: 70.35 % (ber. 73.56 %), H+D: 6.62 % (ber. 6.58 %); HPLC (Varian 5560,

stationäre Phase: 250 mm Chiracel OD-H, 4.6 mm i. D., mobile Phase: n-Heptan : 2-

Propanol : Trifluoressigsäure = 98 : 2 : 0.1, 298 K, 1.2 MPa, 0.5 ml/min, Detektion: UV

254 nm), Retentionszeiten: (R)-Enantiomer: 21.2 min, (S)-Enantiomer: 25.0 min, 99.4 % ee.

(R)-91

CD3

CO2H

5.2 Synthesen 135

5.2.6 Kinetische Racematspaltung zur Darstellung von (1R)-Tetra-

deutero-(1,2,2,2)-1-Phenylethylacetat ((R)-98) und (1S)-Tetra-

deutero-(1,2,2,2)-1-Phenylethanol ((S)-97)

In 100-ml-Stickstoffkolben werden unter Argon 300 mg

Novo SP 435 Lipase mit 50 ml MTBE, 20.9 mmol

(2.64 g) rac-Tetradeutero-(1,2,2,2)-1-Phenylethanol (rac-

97) und 15.9 mmol (0.75 Äq., 1.37 g) Vinylacetat (27)

versetzt. Der Kolben wird 24 h bei Raumtemperatur auf

einem Schütteltisch bei 250 U/min geschüttelt. Die Reaktionslösung wird durch Filtration

vom immobilisierten Enzym abgetrennt und mit insgesamt 100 ml MTBE gewaschen. Die

Lösung wird am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Es verbleibt eine farblose

Flüssigkeit, die auf Kieselgel aufgetragen und chromatographisch getrennt wird (Laufmittel:

Pentan : Diethylether = 5 : 1). Es werden zwei Produktfraktionen erhalten: Produkt 1

(Rf = 0.62 , (R)-Tetradeutero-(1,2,2,2)-1-Phenylethylacetat ((R)-98) und Produkt 2 (Rf = 0.22 ,

(S)-Tetradeutero-(1,2,2,2)-1-Phenylethanol ((S)-97)). Nach Entfernen des Lösemittels am

Rotationsverdampfer werden (R)-98 und (S)-97 als farblose Flüssigkeiten erhalten. (R)-

Tetradeutero-(1,2,2,2)-1-Phenylethylacetat ((R)-98, 1.63 g, 9.70 mmol, 93 %): 1H-NMR

(CDCl3, 300 MHz): δ = 2.07 (s, 3H, CH3), 7.28-7.36 (m, 3H, Ar-H); 13C-NMR (CDCl3,

75 MHz): δ = 21.7 (CH3), 72.2 (CD(OCOCH3)), 126.5 (m-Ar-C), 128.2 (p-Ar-C), 128.9

(o-Ar-C), 142.0 (i-Ar-C), 170.7 (OC(O)CH3); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.):

168 [M+] (12), 127 (7), 126 (84), 125 (11), 109 (57), 108 (45), 107 (100), 106 (22), 105 (13),

81 (11), 80 (31), 79 (18), 78 (10), 77 (14), 51 (13), 46 (11), 43 (53); IR (KAP): ~ν (cm-1) =

3086, 3063, 3031 (alle w, Ar), 2237, 2182, 2126 (alle w, CD3), 1738 (s, C(O)O), 1607, 1584

(beide w, Ar), 1495, 1449 (beide, s, Ar), 1370 (s, CH3), 1249 (CO), 760, 698 (beide s, Ar);

EA: C: 71.26 % (ber. 71.40 %), H+D: 7.08 % (ber. 7.19 %); GC (Hewlett-Packard 5890-1,

Säule: 25 m IVADEX 7, Detektor: FID, Temperaturprogramm: 80 °C-5 °C/min-140 °C-

1.2 min isotherm, Trägergas: 1.0 bar Wasserstoff), Retentionszeiten: (R)-Enantiomer:

8.02 min, (S)-Enantiomer: 8.53 min, > 99.5 % ee; (S)-Tetradeutero-(1,2,2,2)-1-Phenylethanol

((S)-97, 1.31 g, 10.4 mmol, 99 %): 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 2.07 (s, 3H, CH3), 7.28-

7.36 (m, 3H, Ar-H); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 21.7 (CH3), 72.2 (CD(OCOCH3)),

126.5 (m-Ar-C), 128.2 (p-Ar-C), 128.9 (o-Ar-C), 142.0 (i-Ar-C), 170.7 (OC(O)CH3); MS (EI,

70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 127 (2), 126 [M+] (27), 125 (4), 109 (12), 108 (100), 107

(S)-97 (R)-98

CD3

D OH

CD3

D OAc


D3C Br

(10), 106 (5), 105 (9), 92 (3), 81 (8), 80 (95), 79 (15), 78 (31), 77 (21), 54 (8), 53 (5), 52 (8),

51 (17), 50 (6), 46 (20); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3348 (b, OH), 3084, 3060, 3026 (alle w, Ar),

2229 (s, CD3), 2122, 2068 (beide w, CD3), 1604, 1584 (beide w, Ar), 1493, 1448 (beide, s,

Ar), 1064 (s, CO), 707, 697 (beide s, Ar); EA: C: 76.17 % (ber. 76.14 %), H+D: 8.06 % (ber.

7.99 %); GC (Hewlett-Packard 5890-1, Säule: 25 m IVADEX 7, Detektor: FID,

Temperaturprogramm: 80 °C-5 °C/min-140 °C-1.2 min isotherm, Trägergas: 1.0 bar

Wasserstoff), Retentionszeiten: (R)-Enantiomer: 8.26 min, (S)-Enantiomer: 8.35 min,

> 99.5 % ee.

5.2.7 Synthese von 1-Brom-5,5,5-trideutero-pentan (104)


Feuchtigkeitsausschluss 10.8 g (50.0 mmol) 1,4-Dibrombutan (103)

(über Calciumhydrid getrocknet) in 100 ml abs. THF gelöst, auf 0°C

gekühlt und mit 25 ml einer 0.10 M Li 2CuCl4-Lösung in THF versetzt. Zu der klaren

orangefarbenen Lösung werden 50.0 ml einer 1.0 M Lösung von Trideuteromagnesiumiodid

in Diethylether (99Atom% D) getropft. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei 0 °C gerührt.

Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 50 ml einer gesättigten

Ammoniumchloridlösung abgebrochen und solange 10%ige Salzsäure zugegeben bis eine

klare Lösung entsteht (ca. 10 ml). Die wässrige Phase wird zweimal mit jeweils 100 ml

Diethylether extrahiert. Die vereinigten etherischen Phasen werden anschließend

nacheinander jeweils zweimal mit 100 ml 20%iger Zitronensäure-, 50 ml gesättigter

Ammoniumchlorid-, 50 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat- und 50 ml gesättigter

Natriumchloridlösung extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet, vom Trockenmittel durch

Filtration getrennt. Die etherische Lösung wird am Rotationsverdampfer bis auf ca. 25 ml

eingeengt, aus der anschließend durch präparative GC das gewünschte Produkt isoliert wird.

Auf diese Weise werden 2.60 g (16.9 mmol, 34 %) 1-Brom-5,5,5-trideutero-pentan (104) als

klare farblose Flüssigkeit erhalten. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.29-1.44 (m, 4H,

CD3CH2CH2), 1.87 (pq, 3J = 6.9 Hz, 2H, BrCH2CH2), 3.41 (q, 3J = 6.9 Hz, 2H, BrCH2); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 21.6, 30.3, 32.6, 34.0; MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (%

rel. Int.): 155 (5), 153 (5), 125 (9), 74 (100), 58 (16), 55 (16), 46 (42), 45 (71), 44 (40), 43

(24), 42 (16), 41 (25), 39 (15), 32 (11), 29(15), 28(14), 27(20); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 2961,

104

5.2 Synthesen 137

2930, 2862 (alle s, CH2), 2216, 2123, 2073 (alle m, CD3), 639, 563 (CBr); EA: C: 39.01 %

(ber. 38.98 %), H+D: 7.24 % (ber. 7.20 %), Br: 51.84 (ber. 51.86); präparative GC (AMPG-

60/2, Säule: 6 m, 20 mm i. D., Säulenmaterial: Vol. A4, 100-200 mesh, Belegung: 20 % SF-

96): Säule: 100 °C, Einlass: 160 °C, Auslass: 60 °C, Detektor FID: 250 °C, Trägergas:

Stickstoff, Durchfluss: 622 ml/min, Betriebsart: PC+BF, Temperatur Vorlage: -10 °C,

Temperatur Falle: -60 °C; GC (Hewlett Packard 6890-2, Säule: 25 m SE54/G169, Detektor:

FID, Temperaturprogramm: 230 °C/60 °C-300 °C in 15 min, Trägergas: 0.5 bar Helium):

Retentionszeit: 6.27 min, ≥ 99.9 %.

5.2.8 Synthese von 5,5,5-Trideuteropentylmagnesiumbromid (105)

In einem 250-ml-Dreihalskolben mit Tropftrichter, und

Rückflusskühler werden 597 mg (24.8 mmol) Magnesiumspäne von

Luft- und Feuchtigkeitsspuren befreit und mit einem Iodkristall zur

Aktivierung 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das überschüssige Iod wird im Vakuum

entfernt und über den Tropftrichter werden ca. 5 ml einer Lösung von 3.80 g (24.7 mmol)

1-Brom-5,5,5-trideutero-pentan (104) in 35 ml abs. THF zugegeben. Nach Einsetzen der

Reaktion wird die verbleibende Lösung zugetropft und anschließend der Ansatz bei 70 °C für

3.5 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Erkalten auf Raumtemperatur wird die GRIGNARD-Lösung

von den verbleibenden Magnesiumspänen filtriert und in eine Ampulle überführt. Die Lösung

wird mit abs. THF auf ein Endvolumen von 50.0 ml aufgefüllt (c = 0.494 M) und zur weiteren

Verwendung bei -30 °C gelagert.

5.2.9 Synthese von (S)-8,8,8-Trideutero-2-octanol ((S)-101)

In einem SCHLENK-Gefäß mit CLAISEN-Aufsatz und Tropftrichter

werden unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluss 329 mg

(1.59 mmol) Kupfer(I)chlorid-1,5-Cyclooctadien-Komplex mit

30 ml abs. THF und 963 mg (16.6 mmol) (S)-Propylenoxid (106) versetzt. Die gelbe

Suspension wird auf -78 °C gekühlt. Über den Tropftrichter werden 33.6 ml (16.6 mmol) der

0.494 M Lösung von 5,5,5-Trideuteropentylmagnesiumbromid (105) zugetropft, wobei

nacheinander eine Farbänderung von gelb, über rot-orangefarben nach braun und schließlich

schwarz auftritt. Der Ansatz wird innerhalb von 9 h auf Raumtemperatur erwärmt, in 40 ml

(S)-101

D3C MgBr

105

D3COH


gesättigte Ammoniumchloridlösung gegossen und 10 min intensiv gerührt. Die organische

Phase wird abgetrennt und die wässrige dreimal mit jeweils 30 ml Diethylether extrahiert. Die

organischen Phasen werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet, vom Trockenmittel

durch Filtration abgetrennt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Es

verbleiben 1.72 g eines gelben Öls. Das Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgetragen und

chromatographisch gereinigt (Laufmittel: Pentan : Diethylether = 3 : 1). Die


befreit. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum verbleibt eine klare Flüssigkeit (1.35 g,

7.62 mmol), die durch präparative HPLC gereinigt wird. Es werden 898 mg (6.74 mmol,

46 %) (S)-8,8,8-Trideutero-2-Octanol ((S)-101) als klare Flüssigkeit erhalten. 1H-NMR

(CDCl3, 300 MHz): δ = 1.19 (d, 3H, 3J = 6.2 Hz, CH3), 1.28-1.47 (m, 11H,

CD3(CH)5CH(OH), 3.79 (s, 3J = 6.2 Hz, 1H, CH(OH)); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz):

δ = 22.4, 23.5, 25.8, 29.3, 31.8, 39.4, 68.2 (CH(OH)); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel.

Int.): 118 (2), 115 (2), 100 (7), 87 (6), 86 (2), 83 (2), 73 (4), 72 (4), 71 (2), 70 (3), 69 (2), 60

(3), 59 (4), 58 (9), 57 (7), 56 (5), 55 (9); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3355 (w, OH), 2966, 2926,

2859 (alle s, CH3, CH2), 2212, 2123, 2074 (alle m, CD3), 1464, 1417, 1374 (alle m, CH3),

1136, 1117, 1015 (alle m, C-O); EA: C: 72.18 % (ber. 72.11 %), H+D: 13.68 % (ber.

13.62 %); GC (Hewlett Packard 5890-2, Säule: IVADEX 7, Detektor: FID,

Temperaturprogramm: 230 °C/40 °C-2 °C/min bis 76 °C, 15 °C/min bis 180 °C, 3 min

isotherm, Trägergas: 0.7 bar Wasserstoff), Retentionszeit: (S)-Enantiomer 15.1 min , (R)-

Enantiomer 15.4 min, 96 % ee; präparative HPLC (Shimadzu LC-8A Gradientensystem,

Säule: 191 mm Merck NW 50, 48 mm i.D., stationäre Phase: ICN-Silica-100C18/A 18-32 µm,

98/21, mobile Phase: Methanol : Wasser = 2 : 1, Fluss: 35 ml/min, Druck: 4.3 MPa,

Detektion: RID, E = 0.64), 99.9 %.

5.2 Synthesen 139

5.2.10 Synthese von (4R)-Benzyl-3N-((2R)-3,3,3-trideuteromethyl-2-

decanoyl)-oxazolidin-2-on (113)


Feuchtigkeitsausschluss 13.9 mmol (2.55 g) Natriumhexamethyl-

disilazid in ca. 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und auf –78 °C

gekühlt. Unter Rühren wird innerhalb von 30 min eine Lösung von

12.6 mmol (4.17 g) (4R)-Benzyl-3N-decanoyloxy-2-oxazolidin-2-

on (112) in 20 ml Tetrahydrofuran zugetropft. Nach 90 min

Rühren bei –78 °C wird eine Lösung von 36.2 mmol (5.20 g,

2.30 ml) Trideuteroiodmethan (99 Atom% D) in 15 ml Tetrahydrofuran innerhalb von 30 min

zugetropft. Es wird bei –78 °C für weitere 12 h gerührt und anschließend die Reaktion durch

Zugabe von 30 ml einer gesättigten Ammoniumchloridlösung beendet. Nach Erwärmen auf

Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in einen 250-ml-Kolben überführt und das

organische Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird dreimal mit

60 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten etherischen Phasen werden zweimal mit je

50 ml 10%iger Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter

Natriumchloridlösung extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über


Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Das Rohprodukt (3.84 g) wird auf Kieselgel

aufgetragen und chromatographisch gereinigt (Laufmittel: Hexan : Essigsäure-

ethylester = 10 : 1). Die Produktfraktionen (Rf = 0.40) werden vereinigt und am Rotations-

verdampfer vom Lösemittel befreit. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum verbleibt ein

farbloses Öl (3.28 g, 9.41 mmol, 75 %). 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.72 (t, 3J = 6.7 Hz, 3H, CH3), 1.10-1.27 (m, 12H, CH3(CH2)6CH2CH(CD3)C), 1.51-1.65 (m, 2H,

CH3(CH2)6CH2CH(CD3)C), 2.61 (dd, 3J = 9.6 Hz, 2J = 13.3 Hz, 1H, ArCH2CH), 3.11 (dd 3J = 3.2 Hz, 2J = 13.3 Hz, 1H, ArCH2CH), 3.53 (m, 1H, CH3(CH2)6CH2CH(CD3)C), 3.99-4.07

(m, 2H, OCH2CH), 4.49-4.55 (m, 1H, NCH), 7.05-7.21 (m, 10H, Ar-H); 13C-NMR (CDCl3,

75 MHz): δ = 14.1 (CH3), 22.6 (CH2), 27.2 (CH2), 29.2 (CH2), 29.4 (CH2), 29.6 (CH2), 31.8

(CH2), 37.3 (CH2CHCD3), 37.5 (ArCH2CH), 37.9 (CHCD3), 55.3 (NCH), 66.0 (OCH2), 127.3

(m-Ar-C), 128.9 (p-Ar-C), 129.4 (o-Ar-C), 135.3 (i-Ar-C), 153.0 (CHCON), 177.4 (NCOO);

MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 348 [M+] (11), 257 (15), 236 (19), 178 (9), 172

113

N O

O

5

O

CD3


(100), 144 (100), 134 (7), 117 (14), 91 (16), 88 (29), 74 (28), 71 (18), 60 (23), 57 (26), 43

(25), 41 (12); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3087, 3063, 3029 (w, Ar), 2954, 2926, 2855 (alle s, CH3,

CH2), 2228, 2121, 2074 (alle m, CD3), 1782 (s, NCOO), 1699 (s, NCO), 1605, 1498, 1454

(m, Ar), 762, 702 (beide m, Ar); EA: C: 72.26 % (ber. 72.38 %), H+D: 9.06 % (ber. 8.97 %),

N: 4.10 % (ber. 4.02 %).

5.2.11 Synthese von (R)-2,2,2-Trideuteromethyldecansäure ((R)-108)

In einem 250-ml-Rundkolben werden 9.35 mmol (3.27 g) ((4R)-

Benzyl-3-N-((2R)-2,2,2-trideuteromethyl-2-decanoyl)-oxazolidin-2-on

(113) in 25 ml Tetrahydrofuran gelöst und die erhaltene Lösung auf

0 °C gekühlt. Unter Rühren wird eine Lösung von 19.1 mmol

(800 mg) Lithiumhydroxid-Monohydrat in 5 ml einer 30%igen wässrigen

Wasserstoffperoxidlösung unter Rühren zugegeben. Anschließend wird bei 0 °C 18 h gerührt.

Die Reaktion wird bei 0 °C durch tropfenweise Zugabe von 20 ml einer gesättigten

Natriumsulfitlösung beendet und das organische Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt.

Der Rückstand wird dreimal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Phase wird

mit 10%iger Salzsäure auf pH 5 angesäuert und anschließend dreimal mit je 30 ml

Diethylether extrahiert. Die vereinigten etherischen Phasen werden über Magnesiumsulfat

getrocknet, vom Trockenmittel durch Filtration abgetrennt und das Lösemittel am

Rotationsverdampfer entfernt. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum verbleiben 1.68 g

(8.87 mmol, 95 %) einer farblosen Flüssigkeit. 1H-NMR: 0.88 (t, 3J = 6.7 Hz, 3H, CH3),

1.27-1.46 (m, 12H, CH3(CH2)6CH2CH(CD3)), 1.62-1.72 (m, 2H, CH3(CH2)6 CH2CH(CD3)C),

2.42-2.46 (m, 1H, CH3(CH2)6CH2CH(CD3)C), 11.47 (bs, 1H, COOH); 13C-NMR (CDCl3,

75 MHz): δ = 14.1 (CH3), 22.7 (CH2), 27.1 (CH2), 29.2 (CH2), 29.4 (CH2), 29.5 (CH2), 31.9

(CH2), 33.4 (CH2CHCD3), 39.1 (CHCD3), 183.1 (COOH); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z

(% rel. Int.): 189 [M+] (2), 146 (5), 143 (4), 132 (6), 129 (6), 104 (2), 101 (2), 90 (34), 77

(100), 57 (9), 55 (8), 43 (17), 41 (15), 29 (9); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3030, 2671 (w, COOH),

2956, 2926, 2856 (alle s, CH3, CH2), 2229, 2125, 2076 (alle m, CD3), 1707 (s, COO), 1293,

1229 (beide m, CO), 944 (m, OH); EA: C: 69.74 % (ber. 69.79 %), H+D: 11.78 % (ber.

11.71 %); GC (Hewlett Packard 5890, Säule: IVADEX 1, Detektor: FID,

Temperaturprogramm: 230 °C/60 °C bis 140 °C mit 15 °C/min,140 °C bis 170 °C mit

O

5 OHCD3

(R)-108

5.2 Synthesen 141

4 °C/min, 170 °C bis 220 °C mit 10 °C/min, Trägergas: 0.5 bar Helium), Retentionszeit: (R)-

Enantiomer: 12.0 min, > 99 % ee.

5.2.12 Synthese von (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-pyrroli-

din (L-BOC-Prolinol, (S)-116)

Zu einer Lösung von 40.0 mmol (4.04 g) (S)-2-

Hydroxymethylpyrrolidin ((L)-Prolinol, (S)-119) in 25 ml abs.

Dichlormethan wird in einem 100-ml-Rundkolben bei 0 °C eine

Lösung von 40.0 mmol (8.72 g) Di-tert-butyldicarbonat (120) in 25 ml

abs. Dichlormethan getropft. Unter Erwärmung auf Raumtemperatur

wird die klare Lösung 18 h gerührt und anschließend dreimal mit jeweils 25 ml 5%iger

Salzsäure, zweimal mit je 25 ml 20%iger Natriumcarbonatlösung und zweimal mit je 25 ml



Lösemittel befreit. Letzte Lösemittelreste werden im Ölpumpenvakuum entfernt. Es

verbleiben 8.04 g (39.9 mmol, > 99%) eines farblosen Feststoffs in analysenreiner Form. Die

analytischen Daten stimmen mit denen der Literatur überein.[219]

5.2.13 Synthese von (S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-(hexadecanoyloxy-

methyl)-pyrrolidin ((S)-114)

Zu einer auf 0 °C gekühlten Lösung von 12.1 mmol (2.44 g)

(S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-pyrrolidin (L-BOC

Prolinol, (S)-116) in 30 ml abs. Dichlormethan werden

18.2 mmol (1.50 Äq., 1.44 g, 1.46 ml) abs. Pyridin zugetropft.

Nach 10 min wird eine Lösung von 13.3 mmol (1.10 Äq., 3.66 g, 4.05 ml)

Palmitinsäurechlorid in 20 ml abs. Dichlormethan zugetropft. Unter Erwärmung auf

Raumtemperatur wird die klare Lösung 12 h gerührt und anschließend zweimal mit je 15 ml

5%iger Salzsäure, zweimal mit je 15 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und

zweimal mit je 15 ml gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert. Die organische Phase wird

über Magnesiumsulfat getrocknet, vom Trockenmittel durch Filtration getrennt und am

Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Das verbleibende gelbe Öl wird auf Kieselgel

(S)-116

(S)-114

N

O O

OH

N

O O

O

O

14


aufgetragen und chromatographisch gereinigt (Laufmittel: Hexan : Essigsäureethyl-

ester = 9 : 1). Die Produktfraktionen (Rf = 0.32) werden vereinigt und am

Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum

verbleiben 5.09 g (11.6 mmol, 96 %) eines farblosen Feststoffs. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz):

δ = 0.88 (t, 3J = 8.3 Hz, 3H, CH3(CH2)13CH3COO), 1.26 (bs, 24H, CH3(CH2)12(CH2)2COO),

1.48 (s, 9H, (CH3)3COCON), 1.57-1.68 (m, 2H, CH2CH2COO), 1.75-2.02 (m, 4H,

NCH2CH2CH2CH), 2.30 (t, 3J = 7.6 Hz, 2H, CH3(CH2)13CH2COO), 3.25-3.51 (m, 2H,

NCH2), 3.87-4.21 (m, 3H, NCHCH2O); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 14.1 (CH3), 22.7

(CH2), 25.0 (CH2), 28.3 ((CH3)3C), 28.5 (NCH2CH2CH2CH), 29.2 (CH2), 29.3 (CH2), 29.4

(CH2), 29.5 (CH2), 29.62 (CH2), 29.67 (CH2), 29.70 (CH2), 31.9 (CH2), 34.3

(CH3(CH2)13CH3COO), 46.6 (NCH2CH2CH2CH), 55.6 (NCHCH2O), 64.5 (NCHCH2O), 79.6

((CH3)3CO), 154.5 ((CH3)3COCON), 173.6 (CH3(CH2)14COO); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen):

m/z (% rel. Int.): 366 (0.7), 338 (1), 239 (2), 187 (4), 183 (15), 170 (29), 128 (29), 127 (36),

114 (100), 83 (11), 70 (83), 57 (56), 43 (14), 41 (12); IR (KBr): ~ν (cm-1) = 2960, 2919, 2850

(s, alle CH2, CH3), 1743 (s, COO), 1695 (s, NCOO), 1396 (s), 1366 (m), 1243 (m), 1169 (s)

(alle (CH3)3OCON; EA: C: 71.18 % (ber. 71.03 %), H: 11.29 % (ber. 11.23 %), N: 3.15 %

(ber. 3.19 %).

5.2.14 Synthese von 1-Bromo-15,15,15-trideuteropentadecan (123)

In einem mit Tropftrichter und Septum versehenen 250-ml-Dreihalskolben

werden unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluss 55.0 mmol (19.6 g)

1,14-Dibromtetradecan (122) in 120 ml abs. THF gelöst und auf -5 °C gekühlt.

Anschließend werden über den Tropftrichter 55.0 ml einer 1.00 M Lösung von

Trideuteromagnesiumiodid in Ether (55.0 mmol, 99Atom%) und zeitgleich über das Septum

mittels einer Spritzenpumpe 11.0 ml einer 10.0 mM Lösung von Li2CuCl4 in abs. THF

(0.110 mmol) zugetropft. Während der Zugabe wird der Ansatz auf +5 °C erwärmt. Dabei tritt

eine Farbänderung von gelb über grau nach violett auf. Nach 4 h bei 5 °C wird die Reaktion

durch Eingießen in 150 ml 5%ige Salzsäure abgebrochen. Nach Zugabe von 50 ml einer

verdünnten Natriumthiosulfatlösung wird die organische Phase abgetrennt, zweimal mit je

50 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung und zweimal mit je 50 ml gesättigter Natrium-

chloridlösung extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, durch

123

D3C Br 14

5.2 Synthesen 143

Filtration vom Trockenmittel getrennt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit.

Es verbleiben 15.5 g eines farblosen Feststoffs, der auf Kieselgel aufgetragen und

chromatographisch gereinigt wird (Laufmittel: Pentan). Die Produktfraktionen (Rf = 0.83)


Ölpumpenvakuum verbleibt ein farbloser Feststoff 10.9 g (37.0 mmol, 67 %). 1H-NMR

(CDCl3, 300 MHz): δ = 1.26 (bs, 22H, CD3(CH2)11(CH2)3Br), 1.35-1.47 (m, 2H,

CD3(CH2)11CH2(CH2)2Br), 1.85 (q, 3J = 6.9 Hz, 2H, CD3(CH2)12CH2CH2Br), 3.40 (t, 3J = 6.9 Hz, 2H, CD3(CH2)13CH2Br); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 22.8, 28.6, 29.2,

29.76, 29.83, 29.3, 30.0, 30.04, 30.06, 32.2, 33.2, 34.4 (alle CH2); MS (EI, 70 eV, pos.

Ionen): m/z (% rel. Int.): 295 (11), 295 [M+] (12), 214 (8), 151 (20), 149 (21), 137 (98), 135

(100), 97 (15), 88 (22), 85 22(), 83 (26), 74 (31), 71 (40), 69 (48), 60 (44), 59 (12), 58 (13),

57 (72), 56 (15), 55 (60), 46 (23), 45 (18), 44 (17), 43 (64), 42 (16), 41 (50), 29 (19); IR

(KBr): ~ν (cm-1) = 3055 (w); EA: C: 61.12 % (ber. 61.21 %), H+D: 10.69 % (ber. 10.62 %),

Br: 27.13 % (ber. 27.15 %).

5.2.15 Synthese von 15,15,15-Trideuterohexadecansäure ([D]3-Palmitin-

säure (118))

In einem 250 ml-Dreihalskolben mit Rückflusskühler, Tropftrichter und

Septum werden 138 mg (5.66 mmol) Magnesiumpulver von Luft- und

Feuchtigkeitsspuren befreit und mit einem Iodkristall 3 h bei

Raumtemperatur zur Aktivierung gerührt. Das überschüssige Iod wird im

Vakuum entfernt und über den Tropftrichter werden ca. 3 ml einer Lösung von 5.66 mmol

(1.67 g) 1-Brom-15,15,15-trideuteropentadecan (123) in 15 ml abs. Diethylether zugetropft.

Nach dem Einsetzen der Reaktion wird die restliche Lösung zugetropft. Anschließend werden

über den Tropftrichter noch 15.0 ml abs. Diethylether zugegeben und der Ansatz 12 h unter

Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden weitere 30 ml abs.

Diethylether und Trockeneis zugegeben und solange gerührt bis eine klare, leicht gelbe

Lösung erhalten wird. Die Reaktion wird durch langsame Zugabe von 50 ml einer 10%igen

Salzsäurelösung abgebrochen. Die etherische Phase wird im Scheidetrichter abgetrennt und

die wässrige Phase noch zweimal mit je 30 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten

etherischen Phasen werden zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert, über

118

D3C

O

OH14


Magnesiumsulfat getrocknet und durch Filtration vom Trockenmittel abgetrennt. Es

verbleiben 1.37 g eines farblosen Feststoffs, der chromatographisch gereinigt wird

(Laufmittel: Pentan : Diethylether : Essigsäure = 70 : 30 : 1). Die Produktfraktionen

(Rf = 0.49) werden vereinigt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Nach

Trocknen im Ölpumpenvakuum verbleibt ein farbloser Feststoff 806 mg (3.11 mmol, 55 %). 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.26-1.36 (m, 24H, CD3(CH2)12(CH2)2COOH), 1.57-1.68

(m, 2H, CD3(CH2)12CH2CH2COOH), 2.35 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H, CH2COOH), 11.10 (bs, 1H,

COOH); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 22.4, 24.7, 29.1, 29.39, 29.45, 29.6, 29.66, 29.68,

31.9. 34.0 (alle CH2), 179.9 (COOH); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 259 [M+]

(100), 230 (4), 216 (22), 202 (4), 185 (12), 174 (7), 171 (7), 160 (13), 129 (36), 115 (11), 87

(17), 73 (80), 69 (23), 60 (87), 43 (40), 29 (14); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3010, 2678 (w,

COOH), 2915, 2848 (beide s, CH2), 2221, 2210, 2074 (alle m, CD3), 1702 (s, COOH), 1311

(m, COO), 942 (m, OH); EA: C: 74.21 % (ber. 74.07 %), H+D: 12.34 % (ber. 12.43 %).

5.2.16 Synthese von (R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-pyrroli-

din (D-BOC-Prolinol, (R)-116)

Zu einer Lösung von 49.6 mmol (5.02 g) (R)-2-

Hydroxymethylpyrrolidin ((D)-Prolinol, (R)-116) in 30 ml abs.

Dichlormethan wird in einem 100-ml-Rundkolben bei 0 °C eine

Lösung von 49.6 mmol (10.8 g) Di-tert-butyldicarbonat (120) in 30 ml

abs. Dichlormethan getropft. Unter Erwärmung auf Raumtemperatur

wird die klare Lösung 18 h gerührt und anschließend dreimal mit jeweils 30 ml 5%iger

Salzsäure, zweimal mit je 30 ml 20%iger Natriumcarbonatlösung und zweimal mit je 30 ml



Lösemittel befreit. Letzte Lösemittelreste werden im Ölpumpenvakuum entfernt. Es

verbleiben 9.45 g (46.9 mmol, 95 %) eines farblosen Feststoffs in analysenreiner Form. Die

analytischen Daten stimmen mit denen des (S)-Enantiomers (S)-116 überein.[219]

(R)-116

N

O O

OH

5.2 Synthesen 145

5.2.17 Synthese von (R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-(16,16,16-trideuterohexa-

decanoyloxymethyl)-pyrrolidin ((R)-115)

In einem von Luft- und Feuchtigkeitsspuren befreiten

30-ml-Stickstoffkolben werden 5.68 mmol (1.47 g)

16,16,16-Trideuterohexadecansäure (118) in 15 ml abs.

Dichlormethan suspendiert, auf 0 °C gekühlt und mit

17.0 mmol (3.00 Äq., 2.16 g, 1.47 ml) Oxalylchlorid versetzt. Nach Erwärmen auf Raum-

temperatur wird der Ansatz für 12 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Erkalten auf

Raumtemperatur wird die nun klare, gelbe Lösung zu einer auf 0 °C gekühlten Lösung von

5.68 mmol (1.14 g) (R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-pyrrolidin (D-BOC-Prolinol,

(R)-116), 8.52 mmol (3.00 Äq., 674 mg, 686 µl) in 15 ml abs. Dichlormethan getropft. Nach

Erwärmen auf Raumtemperatur wird der Ansatz 12 h gerührt, anschließend mit 20 ml

Dichlormethan verdünnt und zweimal mit je 15 ml 5%iger Salzsäure, zweimal mit je 15 ml

gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit je 15 ml gesättigter

Natriumchloridlösung extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat


Lösemittel befreit. Das verbleibende gelbe Öl wird auf Kieselgel aufgetragen und

chromatographisch gereinigt (Laufmittel: Hexan : Essigsäureethylester = 9 : 1). Die


befreit. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum verbleiben 2.38 g (5.38 mmol, 95 %) eines

farblosen Feststoffs. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.26 (bs, 24H,

CD3(CH2)12(CH2)2COO), 1.46 (s, 9H, (CH3)3COCON), 1.57-1.69 (m, 2H, CH2CH2COO),

1.75-2.03 (m, 4H, NCH2CH2CH2CH), 2.30 (t, 3J = 7.6 Hz, 2H, CH3(CH2)13CH2COO), 3.26-

3.51 (m, 2H, NCH2), 3.87-4.23 (m, 3H, NCHCH2O); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 22.4

(CH2), 25.0 (CH2), 28.3 ((CH3)3C), 28.5 (NCH2CH2CH2CH), 29.2 (CH2), 29.3 (CH2), 29.4

(CH2), 29.5 (CH2), 29.6 (CH2), 29.7 (CH2), 31.9 (CH2), 34.3 (CD3(CH2)13CH3COO), 46.6

(NCH2CH2CH2CH), 55.6 (NCHCH2O), 64.6 (NCHCH2O), 79.6 ((CH3)3CO), 154.5

((CH3)3COCON), 173.6 (CD3(CH2)14COO); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 386

(0.6), 369 (0.8), 341 (1), 242 (2), 187 (4), 183 (15), 170 (30), 128 (29), 127 (37), 114 (100),

83 (11), 70 (82), 57 (53), 43 (10), 41 (11); IR (KBr): ~ν (cm-1) = 2977, 2919, 2850 (s, alle

CH2), 2214, 2122, 2076 (alle m, CD3), 1743 (s, COO), 1695 (s, NCOO), 1396 (s), 1367 (m),

(R)-115

N

O O

O

O

CD3

14


1170 (s) (alle (CH3)3OCON); EA: C: 70.88 % (ber. 71.00 %), H+D: 11.21 % (ber. 11.25 %),

N: 3.11 % (ber. 3.07 %).

5.2.18 Synthese von (1S,4R)-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (86)

In einem 500-ml-Rundkolben 15.0 g (81.5 mmol) cis-1,4-Diacetoxy-2-

cyclopenten (125) mit 400 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7.5) und 2.0 g

Novo SP 435 Lipase versetzt und auf einem Schütteltisch bei

Raumtemperatur solange geschüttelt bis das Edukt vollständig zum monoacylierten Produkt

umgesetzt ist (Kontrolle per GC). Nach vollständiger Hydrolyse zum monoacylierten Produkt

wird der Ansatz nach 18 h durch Filtration vom immobilisierten Enzym abgetrennt, das

Immobilisat nacheinander mit 100 ml dest. Wasser und mit 200 ml MTBE gewaschen. Im

Scheidetrichter wird die organische Phase abgetrennt und zweimal mit je 200 ml MTBE

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, das

Trockenmittel durch Filtration abgetrennt und das Lösemittel am Rotationsverdampfer

entfernt. Es verbleibt eine farblose Flüssigkeit, die zur Kristallisation in wenig MTBE

aufgenommen und mit Pentan versetzt wird. Das gebildete kristalline farblose Produkt wird

mit einer Nutsche von der Mutterlauge abgetrennt und im Ölpumpenvakuum getrocknet. Die

Mutterlauge wird am Rotationsverdampfer eingeengt und wiederum in MTBE/Pentan

aufgenommen und zur weiteren Kristallisation gelagert. Der Enantiomerenüberschuss der

Kristallfraktionen wird durch GC an chiraler stationärer Phase bestimmt. Kristallfraktionen

mit einem Enantiomerenüberschuss von >99 % werden vereinigt, die mit niedrigerem

Enantiomerenüberschuss erneut in MTBE/Pentan aufgenommen und kristallisiert. Auf diese

Weise werden 11.1 g (1S,4R)-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (86) (78.0 mmol, 96 %) in Form

eines feinkristallinen Feststoffs erhalten. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.67 (dt, 3J = 3.8 Hz, 2J = 14.6 Hz, 1H, CH2), 1.84 (s), 1H, OH), 2.06 (s 3H, CH3), 2.76(dt, 3J = 7.4 Hz, 2J = 14.6 Hz, 1H, CH2), 4.71 (m, 1H, CHOH), 5.49-5.51 (m, 1H, CHOAc), 5.97-6.00 (m, 1H,

CHC(H)OH), 6.10-6.13 (m, 1H, CHC(H)OAc); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 21.2 (CH3),

40.5 (CH2), 74.9 (C(H)OH), 77.1 (C(H)OAc), 132.6 (CHC(H)OAc), 138.5 (CHC(H)OH),

170.8 (COCH3); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 125 (2), 100 (4), 99 (6), 83

(17), 82 (91), 81 (19), 55 (23), 54 (22), 53 (14), 43 (100), 39 (17), 29 (13), 27 (14); IR (KAP):

~ν (cm-1) = 3085 (w, OH), 3077, 3061 (beide m, =CH), 2995, 2978, 2949, 2921 (alle m, CH

OAcOH

86

5.2 Synthesen 147

aliphatisch), 1726 (s, C(O)O), 1260 (s, C(O)O), 1088, 1063, 1022, 981, 969 (alle s, C-O); EA:

C: 59.20 % (ber. 59.14 %), H+D: 7.13 % (ber. 7.09 %); GC (Hewlett Packard 6890-2, Säule:

25 m IVADEX 5, Detektor: FID, Temperaturprogramm: 230 °C/60 °C-5 °C/min-140 °C/140-

200 °C/15 °C/min, 5 min isotherm, 340 °C, Trägergas: 0.98 bar Wasserstoff), Retentionszeit:

12.6 min, > 99 % ee.

5.2.19 Synthese von (1S,4R)-cis-1-Trideuteroacetoxy-4-acetoxy-2-cyclo-

penten (84)


Feuchtigkeitsausschluss 35.2 mmol (5.00 g) (1S,4R)-cis-4-Acetoxy-

2-cyclopenten-1-ol (86), 6.95 mmol (1.50 Äq., 4.18 g, 4.27 ml)

Pyridin und 100 ml Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C gekühlt. Unter Rühren wird

innerhalb von 10 min 42.2 mmol (1.20 Äq., 3.44 g, 3.00 ml) [D]3-Acetylchlorid (99 Atom%

D) zugetropft. Innerhalb von 12 h wird auf Raumtemperatur erwärmt und sukzessive mit je

zweimal 50 ml 1 M Salzsäurelösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und






Ölpumpenvakuum verbleibt eine klare Flüssigkeit (6.38 g, 34.1 mmol, 97 %). Analytik: 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.71-1.78 (m, 2H), 2.07 (s, 3H), 2.83-2.93 (m, 2H), 5.55

(dd, 3J = 3.8 Hz, 2J = 7.5 Hz, 2H), 6.10 (s, 2H); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 21.5 (s),

37.5 (s), 76.9 (s), 135.0 (s), 171.1 (s); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 128 (9),

127 (3), 125 (9), 124 (3), 84 (17), 83 (81), 82 (82), 81 (16), 55 (6), 54 (24), 46 (100), 43 (92);

EA: C: 57.75 % (ber. 57.74 %), H+D: 6.52 % (ber. 6.46 %).

84

OAc3AcO[D]


5.2.20 Synthese von (1R,4S)-cis-1-Trideuteroacetoxy-4-acetoxy-2-cyclo-

penten (127)

In einem 100 ml-Stickstoffkolben werden unter Luft- und

Feuchtigkeitsausschluss 3.36 mmol (478 mg) (1R,4S)-cis-4-

Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (126), 5.04 mmol (1.50 Äq., 395 mg,

408 µl) Pyridin und 30 ml Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C gekühlt. Unter Rühren

werden innerhalb von 10 min 4.03 mmol (1.20 Äq., 329 mg, 290 µl) [D]3-Acetylchlorid (99

Atom% D) zugetropft. Innerhalb von 12 h wird auf Raumtemperatur erwärmt und sukzessive

mit je zweimal 15 ml 1 M Salzsäurelösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und






Ölpumpenvakuum verbleibt eine klare Flüssigkeit (612 mg, 3.27 mmol, 97 %). Analytik: 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.70-1.78 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 2.83-2.93 (m, 2H), 5.56

(dd, 3J = 3.8 Hz, 2J = 7.5 Hz, 2H), 6.10 (s, 2H); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ = 21.5 (s),

37.5 (s), 76.9 (s), 135.0 (s), 171.0 (s); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 128 (10),

127 (9), 125 (10), 124 (9), 84 (17), 83 (90), 82 (84), 81 (14), 55 (4), 54 (23), 46 (100), 43

(90); IR (KAP): ~ν (cm-1) = 3074 (beide w, =CH), 2992, 2952, (alle m, CH aliphatisch),

2268, 2139, 2112 (alle w, CD3), 1735 (s, C(O)O), 1369 (s, CH3), 1237 (s, C(O)O), 1076,

1027, 988 (alle s, C-O); EA: C: 57.59 % (ber. 57.74 %), H+D: 6.1 % (ber. 6.46 %).

5.2.21 Synthese von (S,S)-1,1’-Binaphthyl-2,2’-diacetat ((S,S)-129)

In einem 50-ml-Stickstoffkolben wird unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluss 5.00 mmol

(1.43 g) (S,S)-1,1'-Bi-2,2'-naphthol ((S,S)-133) (> 99.9 % ee) in 20 ml

Dichlormethan gelöst, mit 15.0 mmol (3.00 Äq., 1.19 g, 1.21 ml)

Pyridin versetzt und auf 0 °C gekühlt. Unter Rühren werden innerhalb

von 5 min 12.5 mmol (2.50 Äq., 985 mg, 888 µl) Acetylchlorid

zugetropft. In einem Zeitraum von 12 h wird auf Raumtemperatur

erwärmt und anschließend sukzessive mit je zweimal 20 ml 1 M

127

(S,S)-129

AcO OAc[D]3

OAcOAc

5.2 Synthesen 149

Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung

extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, vom Trockenmittel

durch Filtration getrennt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Das

Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgetragen und chromatographisch gereinigt (Laufmittel:

Hexan : Essigsäureethylester = 7 : 3). Die Produktfraktionen (Rf = 0.55) werden vereinigt und

am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum

verbleibt ein farbloser Feststoff (1.88 g, 4.99 mmol, 99 %). 1H-NMR ([D]6-DMSO,

300 MHz): δ = 1.83 (s, 2H), 6.94 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.29-7.34 (m, 2H), 7.48-7.55 (m, 4H),

8.05-8.15 (m, 4H); 13C-NMR ([D]6-DMSO, 75 MHz): δ = 20.4 (CH3), 122.4, 122.6, 125.4,

125.7, 126.8, 128.2, 129.5, 131.0, 132.7, 146.6, 168.8 (COCH3); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen):

m/z (% rel. Int.): 370 [M+] (13), 328 (37), 286 (100), 268 (9), 257 (7), 239 (10), 46 (11); IR

(KBr): ~ν (cm-1) = 3055 (w), 3019 (w). 2936 (w), 1760 (s), 1622 (m), 1595 (m), 1508 (m),

1472 (m), 1430 (m), 1367 (s), 1215 (s), 1130 (s), 1074 (m), 1012 (m), 813 (m), 761 (m); EA:

C: 77.53 % (ber. 77.82 %), H: 4.92 % (ber. 4.90 %).

5.2.22 Synthese von (R,R)-1,1’-Binaphthyl-2,2’-bis(trideuteroacetat)

((R,R)-130)


Feuchtigkeitsausschluss 5.00 mmol (1.43 g) (R,R)-1,1'-Bi-2,2'-

naphthol ((R,R)-133) (>99.9 % ee) in 20 ml Dichlormethan gelöst,

mit 15.0 mmol (3.00 Äq., 1.19 g, 1.21 ml) Pyridin versetzt und auf

0 °C gekühlt. Unter Rühren werden innerhalb von 5 min 12.5 mmol

(2.50 Äq., 1.02 g, 889 µl) Trideuteroacetylchlorid (99Atom% D)

zugetropft. In einem Zeitraum von 12 h wird auf Raumtemperatur erwärmt und anschließend

sukzessive mit je zweimal 20 ml 1 M Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung

und gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert. Die organische Phase wird über


Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Das Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgetragen

und chromatographisch gereinigt (Laufmittel: Hexan : Essigsäureethylester = 7 : 3). Die


befreit. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum verbleibt ein farbloser Feststoff (1.85 g,

(R,R)-130

OAc[D]3

OAc[D]3


4.99 mmol, 99 %). 1H-NMR ([D]6-DMSO, 300 MHz): δ = 6.94 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.27-7.34

(m, 2H), 7.48-7.55 (m, 4H), 8.05-8.15 (m, 4H); 13C-NMR ([D]6-DMSO, 75 MHz): δ = 20.4

(s), 122.4 (s), 122.6 (s), 125.4 (s), 125.7 (s), 126.8 (s), 128.2 (s), 129.5 (s), 131.0 (s), 132.7

(s), 146.6 (s), 168.8 (s); MS (EI, 70 eV, pos. Ionen): m/z (% rel. Int.): 376 [M+] (17), 332 (41),

288 (100), 268 (6), 259 (5), 240 (5), 46 (11); IR (KBr): ~ν (cm-1) = 3054 (w), 3019 (w), 2268

(w), 2147 (w), 2092 (w), 1755 (s), 1622 (m), 1595 (m), 1509 (m), 1471 (m), 1231 (s), 1146

(s), 1075 (s), 1059 (s), 819 (s), 804 (s), 755 (s); EA: C: 76.23 % (ber. 76.85 %), H+D: 4.89 %

(ber. 4.82 %).


5.3 IR-Thermographie-Screening

5.3.1 Experimenteller Aufbau

5.3.1.1 IR-Kamera

Für alle IR-Thermographiemessungen wurde eine AEGAIS-Infrarot-Kamera der Firma AIM

AEG Infrarot-Module GmbH, Heilbronn, mit einem 256x256-FPA-PtSi-Detektor, Objektiven

mit Brennweiten von 28 mm und 50 mm und einer Germaniumlinse verwendet. Um eine

Höhenverstellung zu ermöglichen, wurde die IR-Kamera an einem Stativständer befestigt.

5.3.1.2 Schüttler

Für einen Teil der IR-Thermographieuntersuchungen wurde ein kommerziell erhältlicher

Eppendorf-Thermomixer für Eppendorf-Reaktionsgefäße verwendet, der sowohl ein Schütteln

der Reaktionsgefäße ermöglicht, als auch eine konstante Thermostatisierung der Lösung

gewährleistet.

Der obere Teil des Thermomixers wurde durch einen Aluminiumsockel mit zylindrischen

Löchern für Glasgefäße mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 35 mm (Shell

Vial, Nr. 8005-MO-H aus Klarglas, 8 x 35 mm mit Stopfen, Nr. 8005-W-C, Glastechnik

Gräfenroda GmbH, Gräfenroda) ersetzt.

Im weiteren Teil der Arbeit wurde ein entsprechender Thermomixer für MTP (Eppendorf-

Thermomixer comfort mit Wechselaufsatz für MTP) eingesetzt. Auf diesen Schüttler wurde

zusätzlich ein Aluminiumaufsatz montiert, auf den die verwendeten 96er-Polypropylen-

Flachboden MTP (Nr. 601805, HJ Bioanalytik, Mönchengladbach; Verschlussdeckel für

MTP, Nr. 850277, HJ Bioanalytik, Mönchengladbach) aufgesteckt werden können. Der

Thermomixer mit Aluminiumaufsatz ist in Abb. 2.1 (Kapitel 2.6, S. 36) dargestellt.


5.3.2 Durchführung der zeitaufgelösten IR-Thermographiemessungen

5.3.2.1 Allgemeine Bemerkungen zur Durchführung der IR-Thermographiemessungen

Für die Durchführung der IR-Thermographiemessungen wird der entsprechende Schüttler mit

einem Abstand von ca. 25-30 cm unter dem Objektiv der IR-Kamera platziert. Je nach

durchgeführter Reaktion werden vor der Initiierung der Reaktion entweder die Reaktanden

(als Lösung oder in Substanz) oder entsprechenden Stammlösungen der Katalysatoren in die

Glasgefäße bzw. in die Kavitäten der MTP gegeben. Die IR-Kameras wird nach einer Offset-

IR-Thermographiemessung mit einer dünnen Kapillare auf die Flüssigkeitsoberfläche in den

verwendeten Glasgefäßen oder PP-MTP fokussiert. Zur Korrektur lokaler Unterschiede des

Emissions- und des Reflexionsvermögens der verwendeten Lösemittel und des Materials der

Reaktionsgefäße (Glasgefäße oder PP-MTP) wird eine Temperaturkalibrierung der

Photonenintensitäten durchgeführt. Die Kalibrierung erfolgt durch Einlesen der

Wärmestrahlung des Aufbaus, d. h. der zuvor mit Substrat- oder Katalysatorlösung befüllten

Glasgefäße oder PP-MTP bei sechs verschiedenen Temperaturen und anschließender

nichtlinearer Regression der Daten. Für jede Kalibrierungsmessung werden die befüllten

Glasgefäße oder die MTP mit dem Thermomixer auf die entsprechenden Temperaturen erhitzt

und zur Äquilibrierung der Temperatur für ca. 5 min leicht geschüttelt (ca. 300-500 U/min).

Während dieser Zeit werden die Glasgefäße mit geeigneten Stopfen (s. o.) bzw. die MTP mit

geeigneten Matten (s. o.) verschlossen, die 30 s vor jeder Kalibrierungsmessung entfernt

werden. Im Anschluss werden die Glasgefäße bzw. die MTP mit dem Schüttler auf die

jeweilige Reaktionstemperatur abgekühlt. Während dieser Zeit werden die Reaktionsgefäße

verschlossen und nach Äquilibrierung der Temperatur die Stopfen bzw. Matten wieder

entfernt. Vor der Initiierung der katalytischen Reaktion durch Zugabe von Enzym, Reaktand

bzw. Katalysatorlösung wird eine Offset-IR-Thermographiemesssung durchgeführt, so dass

nur die Wärmestrahlung infolge der Reaktionen detektiert wird. Die Aufnahme der

Wärmebilder erfolgt periodisch in beliebigen Zeitabständen, wobei das Schütteln für die IR-

Thermographiemessungen unterbrochen wird. Die Aufnahmedauer beträgt je nach Aktivität

des untersuchten Systems zwischen 5 und 10 s, wobei die während dieser Zeit registrierten

250 bzw. 500 Wärmebilder geräteintern gemittelt werden. Die exakten Bedingungen

(verwendeter Schüttler, Volumina, Konzentrationen, Temperaturen der

Kalibrierungsmessungen sowie Anzahl der gemittelten Wärmebilder) sind bei dem jeweiligen


Versuch angegeben. Die Wärmebilder werden von der Software der IR-Kamera gespeichert

und nachträglich mit der Bildverarbeitungssoftware MATLAB®, Version 5.1, der Firma The

MathWorks, (Natick, Massachusetts, USA) bearbeitet. Dieses Programm ermöglicht eine

individuelle Farbdarstellung der Photonenintensitäten der IR-Thermographieaufnahmen in

unterschiedlichen Temperaturbereichen („Temperaturfenstern“). Die Temperaturfenster

werden für jede durchgeführte Reaktion zur optimalen Darstellung individuell ermittelt.

5.3.2.2 Untersuchung der lipasekatalysierten enantioselektiven Acylierung von

1-Phenylethanol (26)

Diese Versuche wurden in Glasgefäßen und dem mit einem Aluminiumaufsatz modifizierten

Eppendorf-Thermomixer Comfort (Kapitel 5.3.2.1) ausgeführt. In zwölf Glasgefäße werden

entsprechend Abb. 2.2 (Bild a) in Kapitel 2.7.1 jeweils 100 µl äquimolarer 1 M, 2 M und 4 M

Lösungen von (S)-, (R)- und rac-1-Phenylethanol (26) in Toluol mit jeweils 100 µl 1 M, 2 M

und 4 M Vinylacetat-Lösungen (27) in Toluol versetzt. Nach Fokussierung der IR-Kamera

werden Kalibrierungsmessungen bei 25, 27, 29, 31, 33 und 35 °C durchgeführt. Anschließend

werden die Lösungen auf 30 °C temperiert und eine Offset-IR-Thermographiemessung

durchgeführt. Die Detektionszeit der IR-Thermographiemessungen beträgt jeweils 5 s,

entsprechend 250 Aufnahmen. Die erste Wärmebildaufnahme wird vor der Initiation der

Reaktion aufgenommen (Kapitel 2.7.1, Abb. 2.2 (Bild a)). Die Reaktion wird gestartet, indem

zu neun der zwölf Gefäße entsprechend Abb. 2.2 (Bild a) jeweils 5.0 mg der immobilisierten

Novo SP 435 Lipase gegeben werden. Die Gefäße werden sofort nach Enzymzugabe und

danach in Zeitabständen von einer Minute für 5 s geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von

0.5 min und 3.5 min werden weitere Wärmebilder aufgenommen (Abb. 2.2, Bilder b und c).

Für die Thermographieaufnahmen wird zur klaren Differenzierung der Temperatur-

unterschiede ein Temperaturfenster von 1 °C gewählt.

Für das in Kapitel 2.7.1, Abb. 2.3 gezeigte Wärmebild wird analog verfahren. Die Menge des

zugesetzten Enyzms beträgt 2.5 mg. Die Gefäße werden sofort nach Enzymzugabe und

danach in Zeitabständen von einer Minute für 5 s geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von

0.5 min wird das Wärmebild aufgenommen. Zur klaren Differenzierung der Temperatur-


unterschiede wird die Thermographieaufnahme mit einem Temperaturfenster von 0.3 °C

ausgewertet.

5.3.2.3 Untersuchung der enantioselektiven hydrolytischen Ringöffnung von

Epichlorhydrin ( 42)

In Analogie zu den Arbeiten von JACOBSEN und Mitarbeitern[129] werden zur Aktivierung der

Katalysatoren jeweils 60.0 µmol des Co-(S,S)-Salen-Komplexes 30 (36.2 mg), des Cr-

Komplexes 33 (37.9 mg) und des Mn-Komplexes 35 (38.1 mg) in 1 ml Toluol gelöst, mit

120 µmol Essigsäure (7.21 mg, 6.86 µl) versetzt und eine Stunde in einem offenen Kolben

gerührt. Das Lösemittel und überschüssige Essigsäure werden am Rotationsverdampfer unter

vermindertem Druck und danach im Ölpumpenvakuum entfernt. Die erhaltenen Feststoffe der

drei Metallkomplexe 30, 33 und 35 werden jeweils in 300 µl Toluol aufgenommen und in

jeweils drei Glasgefäße des mit einem Aluminiumaufsatz modifizierten Eppendorf-

Thermomixer aliquotiert (Kapitel 2.7.2.1, Abb. 2.4 (Bild a)). Je eine der drei Lösungen eines

jeden Metall-Salenkomlexes 30, 33 und 35 wird mit 1.00 mmol (92.5 mg, 78.4 µl) (S)-, (R)-

bzw. rac-Epichlorhydrin (42) versetzt. Nach Fokussierung der IR-Kamera werden

Kalibrierungsmessungen bei 24, 27, 30, 33, 36 und 39 °C durchgeführt. Anschließend werden

die Lösungen auf 27 °C temperiert und eine Offset-IR-Thermographiemessung durchgeführt.

Die Detektionszeit der IR-Thermographiemessungen beträgt jeweils 10 s, entsprechend

500 Aufnahmen. Die erste Wärmebildaufnahme wird vor der Initiation der Reaktion

aufgenommen (Abb. 2.4 (Bild a)). Die Reaktionen werden durch Zugabe von 0.55 mmol

Wasser (0.55 Äq., 9.9 µl) bei 27 °C initiiert. Die Gefäße werden sofort nach Wasserzugabe

und danach in Zeitabständen von etwa 0.5-1 min für jeweils 5 s geschüttelt. Nach

Reaktionszeiten von 2.5, 4, 5, 7, 8, 15 und 32 min werden Wärmebilder aufgenommen (Abb.

2.4, Bilder b-h) und zur klaren Differenzierung der Temperaturunterschiede mit einem

Temperaturfenster von 1 °C ausgewertet. Das Wärmebild nach einer Reaktionszeit von 7 min

wird zusätzlich mit einem Temperaturfenster von 9 °C ausgewertet (Abb. 2.5, Bild b).


5.3.2.4 Untersuchung der relativen Substrataktivität der Co-(S,S)-Salen-(30)-

katalysierten enantioselektiven hydrolytischen Ringöffnung

Zur Aktivierung des Katalysators werden in einem Kolben 180 µmol des Co-(S,S)-Salen-

Komplexes 30 (109 mg) in 3 ml Toluol gelöst, mit 360 µmol Essigsäure (21.6 mg, 20.6 µl)

versetzt und eine Stunde an der Luft gerührt. Das Lösemittel und die überschüssige

Essigsäure werden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck und danach im

Ölpumpenvakuum entfernt. Der erhaltene Feststoff wird in 900 µl Toluol aufgenommen. In

neun Glasgefäße des mit einem Aluminiumaufsatz modifizierten Eppendorf-Thermomixers

werden jeweils 100 µl der Lösung gegeben (Kapitel 2.7.2.1, Abb. 2.6). Auf die neun

Lösungen werden jeweils 1.00 mmol (S)-, (R)- und rac-Benzylglycidylether (44, 164 mg,

153 µl), (S)-, (R)- und rac-Styroloxid (46, 120 mg, 114 µl) sowie (S)-, (R)- und rac-

Epichlorhydrin (42, 93 mg, 78 µl) aliquotiert (Abb. 2.6). Die mit Styroloxid (46) und

Epichlorhydrin (42) befüllten Gefäße werden mit 39 µl bzw. mit 75 µl Toluol zu einem

Gesamtvolumen von 253 µl aufgefüllt, so dass die Konzentration der Epoxide 3.95 M in

Toluol beträgt. Nach Fokussierung der IR-Kamera werden Kalibrierungsmessungen bei 24,

26, 28, 30, 33 und 36 °C durchgeführt. Anschließend werden die Lösungen auf 27 °C

temperiert und eine Offset-IR-Thermographiemesssung durchgeführt. Die Detektionszeit der

IR-Thermographiemessungen beträgt jeweils 10 s, entsprechend 500 Aufnahmen. Die

Reaktionen werden durch Zugabe von jeweils 0.55 mmol Wasser (0.55 Äq., 9.9 µl) bei 27 °C

initiiert. Die Gefäße werden sofort nach Wasserzugabe und danach in Zeitabständen von etwa

1 min für jeweils 20 s geschüttelt. Nach Reaktionszeiten von 7, 14 und 28 min werden

Wärmebilder aufgenommen und zur klaren Differenzierung der Temperaturunterschiede mit

zwei Temperaturfenstern von 1 °C und 9 °C ausgewertet (Abb. 2.6, Bilder a-f).

5.3.2.5 Untersuchung der rutheniumkatalysierten Ringschlussmetathese von

1,7-Octadien (52)

Für die Reaktionen des in Abb. 2.7 (Kapitel 2.7.2.2) gezeigten Wärmebilds werden in fünf

Glasgefäße des mit einem Aluminiumaufsatz modifizierten Eppendorf-Thermomixers jeweils

100 µl einer 5.00 mM (Gefäß 1, entsprechend einer Katalysatormenge von 0.070 mol%),




sowie zweimal 100 µl einer 50.0 mM (Gefäße 1 und K, entsprechend einer Katalysatormenge

von jeweils 0.740 mol%) der Lösung des Rutheniumkomplexes 49 in Toluol gegeben. Nach

Fokussierung der IR-Kamera werden Kalibrierungsmessungen bei 25, 27, 29, 31, 33 und

35 °C durchgeführt. Anschließend werden die Lösungen auf 30 °C temperiert und eine Offset-

IR-Thermographiemessung durchgeführt. Die Detektionszeit der IR-Thermographie-

messungen beträgt jeweils 5 s, entsprechend 250 Aufnahmen. Die Reaktionen werden durch

Zugabe von jeweils 100 µl 1,7-Octadien (52, 74.6 mg, 677 µmol) (Gefäße 1-4, Abb. 2.7) bei

30 °C initiiert. Gefäß K wird mit 100 µl Octan versetzt. Die Gefäße werden sofort nach

Zugabe des 1,7-Octadiens (52) bzw. des Octans und danach in Zeitabständen von etwa 5 min

jeweils 30 s geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von 1 min wird ein Wärmebild

aufgenommen und zur klaren Differenzierung der Temperaturunterschiede mit einem

Temperaturfenster von 0.5 °C ausgewertet (Abb. 2.7).

Für die Reaktion der in Abb. 2.8 (Kapitel 2.7.2.2) gezeigten Wärmebilder werden in fünf

Glasgefäße des mit einem Aluminiumaufsatz modifizierten Eppendorf-Thermomixers

zweimal 100 µl einer 10.0 mM Lösung des Ruthenium-Komplexes 48 in Toluol (Gefäß 1 und

K) sowie je 100 µl 10.0 mM Lösungen der Rutheniumkatalysatoren 49 (Gefäß 2), 50 (Gefäß

3) und 51 (Gefäß 4) in Toluol gegeben. Nach Fokussierung der IR-Kamera werden

Kalibrierungsmessungen bei 27, 29, 31, 33, 35 und 37 °C durchgeführt. Anschließend werden

die Lösungen auf 32 °C temperiert und eine Offset-IR-Thermographiemessung durchgeführt.

Die Detektionszeit der IR-Thermographiemessungen beträgt jeweils 5 s, entsprechend

250 Aufnahmen. Die erste Wärmebildaufnahme wird vor der Initiation der Reaktion

aufgenommen (Abb. 2.8 (Bild a)). Die Reaktionen werden durch Zugabe von jeweils 100 µl

1,7-Octadiens (52, 74.6 mg, 677 µmol) (Gefäße 1-4, Abb. 2.8) bei 30 °C initiiert. Gefäß K

wird mit 100 µl Octan versetzt. Die Gefäße werden sofort nach Zugabe des 1,7-Octadien (52)

bzw. des Octans für ca. 10 s und danach in Zeitabständen von etwa 1 min für jeweils 5 s

geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von 1 min und 2 min werden Wärmebilder

aufgenommen und zur klaren Differenzierung der Temperaturunterschiede mit einem

Temperaturfenster von 1.5 °C ausgewertet (Abb. 2.8).


5.3.2.6 Katalysator-/Substrat-Screening der rutheniumkatalysierten Ringschluss-

metathese von Malonsäureesterderivaten

Für die Reaktionen der in Abb. 2.9 (Kapitel 2.7.2.2) gezeigten Wärmebilder werden auf 20

Kavitäten einer Polypropylen-MTP des mit einem Aluminiumaufsatz modifizierten

Eppendorf-Thermomixers für MTP jeweils viermal 100 µl der fünf Diene 55, 57, 59, 61 und

63 aliquotiert. Nach Fokussierung der IR-Kamera werden Kalibrierungsmessungen bei 25, 27,

29, 31, 33 und 35 °C durchgeführt. Anschließend werden die Lösungen auf 30 °C temperiert

und eine Offset-IR-Thermographiemessung durchgeführt. Die Reaktionen werden durch die

gleichzeitige Zugabe von jeweils 100 µl der vier 0.1 M Katalysatorlösungen der

Rutheniumkomplexe 48, 49, 50 und 51 in Toluol zu jeweils einem der Diene mit einer

Mehrkanalpipette bei 30 °C initiiert, wobei die Substrate in der Reihenfolge 63, 61, 59, 57, 55

mit den Katalysatorlösungen versetzt werden. Die Detektionszeit der IR-

Thermographiemessungen beträgt jeweils 5 s, entsprechend 250 Aufnahmen. Die Gefäße

werden sofort nach der Zugabe der Katalysatorlösungen für ca. 10 s und danach in

Zeitabständen von etwa 1 min für jeweils 10 s geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von 0.5,

1, 2, 5, 10 und 17 min werden Wärmebilder aufgenommen und zur klaren Differenzierung der

Temperaturunterschiede mit einem Temperaturfenster von 2 °C ausgewertet (Abb. 2.9).


5.4 ESI-MS-Screening auf Enantioselektivität

5.4.1 Allgemeine Bemerkungen

5.4.1.1 ESI-Massenspektrometer

Die ESI-MS-Analysen wurden mit einem ESI-Massenspektrometer der Firma Hewlett

Packard HP 5989B Engine Quadrupol-Massenspektrometer mit einer HP 59987A API

Elektrosprayquelle II mit Hexapol-Ionenführung (Analytica of Branford) und ChemStation-

Software durchgeführt.

5.4.1.2 Allgemeine Bemerkungen zur Aufnahme der ESI-Massenspektren

Die Aufnahme der ESI-Massenspektren wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Datenaufnahme: Scan-Spektren im positiv Ionenmodus; m/z von 90-300 (abhängig von den

jeweiligen Substanzen) in m/z 0.1 Schritten, Einheitsauflösung, GAUSS` Massenfilter m/z 0.3

min; GAUSS` Zeitfilter 0.05 min; Druck des N2-Nebulizer-Gases: 80 psi, Fluss des N2-

Trocknungsgases ca. 9 l/min (150 °C), Lösemittelfluss: 0.06ÂPO�PLQ��&+3OH : H2O = 8 : 2.

Die Proben wurden vor den ESI-MS-Analysen mit Methanol : Wasser = 8 : 2 auf eine

Konzentration von 0.5 -2.0 mM verdünnt. Es wurden jeweils 10 µl dieser Lösung in das

Rheodyne-Ventil des ESI-MS-Systems injiziert. Die ESI-Massenspektren wurden

gesammelt und die Verhältnisse der pseudo-Enantiomere durch die absoluten Intensitäten der

entsprechenden Natrium-, Kalium- der Ammoniumaddukte der Quasi-Molekülionen

bestimmt.

Im Fall von Probenserien wurden die Verhältnisse der Signale durch ein Makro automatisch

aus der m/z-Intensitätsliste der einzelnen Messungen in eine Excel-Tabelle übertragen.

5.4.1.3 MALDI-TOF-Massenspektrometrische Untersuchungen

Die MALDI-TOF-Massenspekten wurden mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer der

Firma Brucker-Franzen Analytik GmbH, Bremen, Reflex II am Interdisziplinären

Forschungszentrum für Biopolymere der Universität Potsdam von Frau Dr. S. HAEBEL und

Herrn Dr. D. STÖCKIGT, ehemals Max-Planck-Institut für Kohlenforschung, durchgeführt.


Als Matrix wurde eine 5%ige Lösung von Trihydroxyacetophenon in Methanol verwendet.

5.4.2 Untersuchungen zum Screening auf Enantioselektivität

5.4.2.1 Bestimmung des Enantiomerenüberschusses synthetischer Mischungen der

pseudo-enantiomeren 1-Phenylethanole (S)-28 und (R)-79

Es werden jeweils 100 mM Lösungen von (S)-1-Phenylethylacetat ((S)-28) und (R)-1-

Phenylethyltrideuteroacetat ((R)-79) in Methanol hergestellt. Aus beiden Lösungen werden

Mischungen mit unterschiedlichen Anteilen der pseudo-Enantiomere (S)-28) und (R)-79

hergestellt, deren Enantiomerenüberschüsse anschließend durch GC an chiraler stationärer

Phase und durch ESI-MS bestimmt werden. Die Durchführung der ESI-MS-Analysen erfolgt

nach 5.4.1.2, wobei die Proben zuvor mit Methanol : Wasser = 8 : 2 verdünnt werden. Für die

GC-Analysen wird ein Aliquot jeder Mischung mit 150 µl MTBE versetzt.

Trennbedingungen der gaschromatographischen Analyse an chiraler stationärer Phase: GC-

Gerät: Hewlett Packard 5890, Säule: 25 m fused silica, 0.25 innerer Durchmesser, 2,6-

Dimethyl-3-pentyl-β-CD, Detektor: FID, Temperaturprogramm: 80 °C-4 °C/min-120 °C-

0.2 min isotherm, Trägergas: 1.2 bar Wasserstoff, Retentionszeiten: (S)-1-Phenylethylacetat

((S)-28): 5.5 min, (R)-1-Phenyltrideuteroethylacetat ((R)-79): 6.8 min.

5.4.2.2 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Veresterung von 2-Phenyl-

propionsäure rac-89 und (S)-89/(R)-91

Für das Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Veresterung werden eine 100 mM

Lösung von rac-2-Phenylpropionsäure (rac-89) und eine 100 mM Lösung einer 1 : 1-

Mischung der pseudo-enantiomeren (S)-2-Phenylpropionsäure ((S)-89) und der trideuterierten

(R)-2-Phenylpropionsäure ((R)-91) in MTBE hergestellt. In zwei 10 ml Rundkolben werden

jeweils 300 mg Novo SP 435 Lipase mit 2.0 ml der 100 mM Lösung von rac-89 bzw. 2.0 ml

der 100 mM Lösung der 1 : 1-Mischung aus (S)-89 und (R)-91 mit 1.9 ml MTBE und 100 µl

n-Butanol (81 mg, 1.1 mmol) versetzt. Beide Kolben werden verschlossen und bei

Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 400 U/min geschüttelt. Über einen Zeitraum

von 8 h werden in Abständen von 15 min aus beiden Ansätzen jeweils 20 µl entnommen und

für die HPLC-Analyse an chiraler stationärer Phase mit jeweils 40 µl MTBE verdünnt.


Trennbedingungen der HPLC-Analyse chiraler stationärer Phase: HPLC-Gerät: Varian

5560, stationäre Phase: 250 mm Chiracel OD-H, 4.6 mm i. D., mobile Phase: n-Heptan : 2-

Propanol : Trifluoressigsäure = 97 : 3 : 0.1, Temperatur: 298 K, 3.1 MPa, 0.5 ml/min,

Detektion: UV 220 nm, Retentionszeiten: 2-Phenylpropionsäure-n-butylester (90/92):

8.2 min, (R)-89 bzw.(R)-91: 15.9 min, (S)-89: 18.1 min.

5.4.2.3 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung von

1-Phenylethanol rac-26 und (S)-97/(R)-26

Für das Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Veresterung werden jeweils 20.0 mM

Lösungen von rac-1-Phenylethanol (rac-26), von (S)-1-Tetradeuterophenylethanol ((S)-97)

und von (R)-1-Phenylethanol ((R)-26) in Cyclohexan hergestellt. In einem 100 ml

ERLENMEYER-Kolben werden 25.0 mg Novo SP 435 Lipase mit 50.0 ml der 20 mM Lösung

von rac-26 in Cyclohexan versetzt. In einem zweiten 100 ml ERLENMEYER-Kolben werden

25.0 mg Novo SP 435 Lipase mit je 25.0 ml der 20.0 mM Lösungen von (S)-97 und (R)-26

versetzt. Zu beiden Ansätzen werden zeitgleich 1.00 mmol Vinylacetat (27, 86.1 mg, 92.2 µl)

gegeben, wobei vor der Zugabe jeweils 250 µl der Ansätze für analytische Zwecke

entnommen werden. Beide Gefäße werden verschlossen und bei Raumtemperatur mit

250 U/min geschüttelt. Aus beiden Ansätzen werden nach einer Reaktionszeit von 0.5, 1, 2,

und 4 h jeweils 250 µl der Lösung entnommen. Jeder Probe wird zur Bestimmung des

Enantiomerenüberschusses durch GC an chiraler stationärer Phase und durch ESI-MS

untersucht. Die Durchführung der ESI-MS-Analysen erfolgt nach 5.4.1.2, wobei die Proben

zuvor mit Methanol : Wasser = 8 : 2 verdünnt werden.


Gerät: Hewlett Packard 6890, Säule: 25 m IVADEX 7, Detektor: FID, Temperatur des

Injektorblocks: 230 °C: Temperaturprogramm: 80 °C-5 °C/min-130 °C-5 min isotherm,

Trägergas: 1.0 bar Wasserstoff, Retentionszeiten: 1-Phenylethylacetat (28): 7.7 min, (R)-1-

Phenylethanol ((R)-28): 7.8 min, (S)-1-Tetradeuterophenylethanol ((S)-97) bzw. (S)-1-

Phenylethanol ((S)-28): 8.0 min.


5.4.2.4 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung von

2-Octanol rac-99 und (S)-101/(R)-99

Für das Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Veresterung werden jeweils 40.0 mM

Lösungen von rac-2-Octanol (rac-99), von (S)-2-Trideuterooctanol ((S)-101) und von (R)-2-

Octanol ((R)-99) in Cyclohexan hergestellt. In einem 100 ml ERLENMEYER-Kolben werden

50.0 mg Novo SP 435 Lipase mit 50.0 ml der 40.0 mM Lösung von rac-99 in Cyclohexan

versetzt. In einem zweiten 100 ml ERLENMEYER-Kolben werden 50.0 mg Novo SP 435 Lipase

mit je 25.0 ml der 40.0 mM Lösungen von (S)-101 und (R)-99) versetzt. Zu beiden Ansätzen

werden zeitgleich 3.00 mmol Vinylacetat (27, 258 mg, 277 µl) gegeben, wobei vor der

Zugabe jeweils 250 µl der Lösung für analytische Zwecke entnommen werden. Beide Gefäße

werden und bei Raumtemperatur mit 250 U/min geschüttelt. Aus beiden Ansätzen werden

nach einer Reaktionszeit von 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 und 10 h jeweils 250 µl der Lösung entnommen.

Jeder Probe wird zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses durch GC an chiraler

stationärer Phase untersucht.



Injektorblocks: 230 °C: Temperaturprogramm: 80 °C-5 °C/min-130 °C-5 min isotherm,

Trägergas: 1.0 bar Wasserstoff, Retentionszeiten: (R)-2-Octanol ((R)-99): 13.6 min, (S)-2-

Octanol ((S)-99): 13.8 min, (S)-2-Octylacetat ((S)-100): 15.3 min, (R)-2-Octylacetat ((R)-

100): 15.5 min.

Der Enantiomerenüberschuss der Proben der pseudo-enantiomeren 2-Octanole (S)-101 und

(R)-99 und pseudo-enantiomeren 2-Octylacetate (S)-102 und (R)-100 kann an achiraler Phase

bestimmt werden:

Trennbedingungen der gaschromatographischen Analyse an achiraler stationärer Phase: GC-

Gerät: Hewlett Packard 6890, Säule: 30 m RTX-5, Detektor: FID, Temperatur des

Injektorblocks: 230 °C: Temperaturprogramm: 21 min bei 60 °C isotherm-0.8 °C/min-85 °C-

12 °C/min-320 °C-350 °C, Trägergas: 0.6 bar Wasserstoff, Retentionszeiten: (S)-2-

Trideuterooctanol ((S)-101): 20.4 min, (R)-2-Octanol ((R)-99): 20.9 min, (S)-2-

Trideuterooctylacetat ((S)-102): 45.0 min, (R)-2-Octylacetat ((R)-100): 45.4 min.


5.4.2.5 Lipasekatalysierte Veresterung von 2-Methyldecansäure (S)-107/(R)-108

Für die Untersuchung der lipasekatalysierten Veresterung einer 1 : 1-Mischung der pseudo-

enantiomeren 2-Methyldecansäure (S)-107 und (R)-108 werden jeweils 20.0 mM Lösungen

von (S)-2-Methyldecansäure ((S)-107) und (R)-2-Trideuteromethyldecansäure ((R)-108) in

Cyclohexan hergestellt. In einem 100 ml ERLENMEYER-Kolben werden 50.0 mg Novo SP 435

Lipase mit je 25.0 ml der 40.0 mM Lösungen von (S)-107 und (R)-108 versetzt. Vor der

Zugabe von 1.00 mmol Vinylacetat (27, 74.1 mg, 91.5 µl), werden 250 µl des Ansatzes für

analytische Zwecke entnommen. Das Gefäß wird verschlossen und bei Raumtemperatur mit

250 U/min geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von 8, 10, 12, 18 und 24 h werden jeweils

250 µl der Lösung entnommen. Jede Probe wird zur Bestimmung des Enantiomeren-

überschusses durch GC an chiraler stationärer Phase und durch ESI-MS untersucht. Die

Durchführung der ESI-MS-Analysen erfolgt nach 5.4.1.2, wobei die Proben zuvor mit

Methanol : Wasser = 8 : 2 verdünnt werden.



Injektorblocks: 230 °C: Temperaturprogramm: 60 °C-15 °C/min-140 °C-140 °C-4 °C/min-

170 °C-170 °C-10°C/min-220 °C-15 min isotherm, Trägergas: 0.5 bar Wasserstoff,

Retentionszeiten: (S)-2-Methyl- und (R)-2-Trideuteromethyldecansäurebutylester ((S)-109)

und (R)-110): 11.9 min, (S)-2-Methyldecansäure ((S)-107): 13.3 min, (R)-2-

Trideuteromethyldecansäure ((R)-108): 13.5 min.

5.4.2.6 Esterasekatalysierte Hydrolyse des pseudo-meso-Diacetats 84

In einem 20 ml Rundkolben werden 52.5 mg Schweineleberesterase (Porcine Liver Esterase,

PLE, Sigma) mit 10.0 ml 10 mM TRIS-Puffer (pH 7.5) und 600 µmol (112 mg) des pseudo-

meso-Diacetats 84 versetzt. Der Kolben wird verschlossen und bei Raumtemperatur mit

250 U/min geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von 3, 4, 5, 6, und 7 h werden jeweils 50 µl

des Ansatzes entnommen und mit 100 µl Diethylether in 0.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen

extrahiert. Jede Probe wird zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses durch GC an

chiraler stationärer Phase und durch ESI-MS untersucht. Die Durchführung der ESI-MS-

Analysen erfolgt nach 5.4.1.2, wobei die Proben zuvor mit Methanol : Wasser = 8 : 2

verdünnt werden.




Injektorblocks: 230 °C: Temperaturprogramm: 60 °C-5 °C/min-140 °C isotherm, Trägergas:

0.5 bar Wasserstoff, Retentionszeiten: (1S, 4R)-cis-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (86):

13.0 min, (1R, 4S)-cis-4-Trideuteroacetoxy-2-cyclopenten-1-ol (85): 13.5 min, 2-Acetoxy-4-

trideuteroacetoxycyclopent-1-en (84): 14.5 min.

5.4.2.7 Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Hydrolyse des meso-Diacetats 125

und des pseudo-meso-Diacetats 84

Für das Vergleichsexperiment zur lipasekatalysierten Hydrolyse werden jeweils 500 mM

Lösungen des meso-Diacetats 125 und des pseudo-meso-Diacetats 84 in DMSO hergestellt. In

einem 100 ml ERLENMEYER-Kolben werden 5.00 ml der 500 mM Lösung von 125 (2.5 mmol,

Endkonzentration 50 mM) in DMSO mit 40.0 ml 10.0 mM Phosphatpuffer (pH 7.5) versetzt.

Entsprechend werden in einem zweiten 100 ml ERLENMEYER-Kolben 5.00 ml der 500 mM

Lösung von 84 (2.5 mmol, Endkonzentration 50 mM) in DMSO mit 40.0 ml 10.0 mM

Phosphatpuffer (pH 7.5) versetzt. Zu beiden Ansätzen werden zeitgleich 5.00 ml des

lipasehaltigen Kulturüberstands der Bacillus subtilis Lipase A (in E. coli BL21(DE3), Vektor:

pET22 lipA1) gegeben, wobei vor der Zugabe jeweils 500 µl der Ansätze für analytische

Zwecke entnommen werden. Beide Gefäße werden verschlossen und bei Raumtemperatur mit

250 U/min geschüttelt. Aus beiden Ansätzen werden nach einer Reaktionszeit von 1, 2, 4, 6,

8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 120 und 144 h jeweils 500 µl der Lösung entnommen und mit 500 µl

Essigsäureethylester extrahiert. Jede organische Phase wird zur Bestimmung des

Enantiomerenüberschusses und des Umsatzes durch GC an chiraler stationärer Phase und

durch ESI-MS untersucht. Die Durchführung der ESI-MS-Analysen der Proben des pseudo-

meso-Diacetats 84 erfolgt nach 5.4.1.2, wobei zur Umsatzbestimmung die Proben zuvor in

einem 1 : 1-Verhältnis (v/v) mit einer 50.0 mM Lösung des meso-Diacetats 125 als internem

Standard versetzt und anschließend mit Methanol : Wasser = 8 : 2 verdünnt werden.



Injektorblocks: 230 °C: Temperaturprogramm: 60 °C-5 °C/min-140 °C-15 °C/min-220°C-

350 °C, Trägergas: 0.8 bar Wasserstoff, Retentionszeiten: (1S,4R)-cis-4-Acetoxy-2-


cyclopenten-1-ol (86): 14.0 min, (1R,4S)-cis-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (126) bzw.

(1R,4S)-cis-4-Trideuteroacetoxy-2-cyclopenten-1-ol (85): 14.6 min, 2,4-Diacetoxy-cyclopent-

1-en (125) bzw. 2-Acetoxy-4-trideuteroacetoxycyclopent-1-en (84): 15.5 min.

5.4.2.8 Vergleichsexperiment der lipasekatalysierten Hydrolyse des meso-Diacetats 125

und der pseudo-meso-Diacetate 84 und 127

Für die Vergleichsexperimente zur lipasekatalysierten Hydrolyse werden jeweils 500 mM

Lösungen des meso-Diacetats 125 und der pseudo-meso-Diacetat 84 und 127 in DMSO

hergestellt. In einem 100 ml ERLENMEYER-Kolben werden 2.00 ml der 500 mM Lösung von

125 (2.5 mmol, Endkonzentration 20 mM) in DMSO mit 3.00 ml DMSO und 40.0 ml

10.0 mM Phosphatpuffer (pH 7.5) versetzt. Entsprechend werden zwei weitere 100 ml

ERLENMEYER-Kolben 2.00 ml der 500 mM Lösung von 84 bzw. 127 (2.5 mmol,

Endkonzentration 20 mM) in DMSO mit 3.00 ml DMSO und 40.0 ml 10.0 mM Phosphatpuffer

(pH 7.5) versetzt. Zu beiden Ansätzen werden zeitgleich 5.00 ml des lipasehaltigen

Kulturüberstands der Bacillus subtilis Lipase A (in E. coli BL21(DE3)/pET22 lipA1)

gegeben, wobei vor der Zugabe jeweils 500 µl der Ansätze für analytische Zwecke

entnommen werden. Beide Gefäße werden verschlossen und bei Raumtemperatur mit

250 U/min geschüttelt. Aus beiden Ansätzen werden nach einer Reaktionszeit von 1, 2, 4, 6,

8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 120 und 144 h jeweils 500 µl der Lösung entnommen und mit 500 µl

Essigsäureethylester extrahiert. Jeder Probe wird zur Bestimmung des

Enantiomerenüberschusses und des Umsatzes durch GC an chiraler stationärer Phase

untersucht.



Injektorblocks: 230 °C: Temperaturprogramm: 60 °C-5 °C/min-140 °C-15 °C/min-220°C-

350 °C, Trägergas: 0.8 bar Wasserstoff, Retentionszeiten: (1S,4R)-cis-4-Acetoxy-2-

cyclopenten-1-ol (86) bzw. (1S,4R)-cis-4-Trideuteroacetoxy-2-cyclopenten-1-ol (128):

14.0 min, (1R,4S)-cis-4-Trideuteroacetoxy-2-cyclopenten-1-ol (85) bzw. (1R,4S)-cis-4-

Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol (126): 14.6 min, 2,4-Diacetoxy-cyclopent-1-en (125) bzw. 2-

Acetoxy-4-trideuteroacetoxycyclopent-1-en (84) bzw. 4-Acetoxy-2-trideuteroacetoxy-

cyclopent-1-en (127): 15.5 min.


5.4.2.9 MALDI-TOF-Untersuchungen zum Screening auf Enantioselektivität

Für das Vergleichsexperiment zur esterasekatalysierten Hydrolyse werden jeweils 1.00 mmol

(370 mg) des (S,S)-1,1‘-Binaphthyl-2,2‘-diacetats ((S,S)-129) und 1.00 mmol (376 mg) des

(R,R)-1,1‘-Binaphthyl-2,2‘-bis(trideuteroacetat) ((R,R)-130) in 20.0 ml Acetonitril gelöst. In

einem 100 ml ERLENMEYER-Kolben werden 100 mg Schweineleberesterase (Sigma) mit

45 ml 10 mM TRIS-Puffer (pH 7.5) und 5.00 ml der jeweils 50.0 mM Lösung der pseudo-

Enantiomere 129/130 versetzt. Das Gefäß wird verschlossen und bei Raumtemperatur mit

250 U/min geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von 4 Tagen werden Proben der Lösungen

für die MALDI-TOF MS-Analyse entnommen und im 10 : 3-Verhältnis mit einer 5%igen

Matrix-Lösung von Trihydroxyacetophenon in Methanol versetzt und auf ein MALDI-Target

transferiert. Es werden jeweils 20-50 Spektren ausgewählt. Der Enantiomerenüberschuss der

Probe wird aus dem Verhältnis der relativen Intensitäten der Natrium-Addukte von 129 und

130 bestimmt (Tabelle 5.1).

Tabelle 5.1: Durch MADLI-TOF-MS bestimmte relative Intensitäten der Natrium- und Kalium-Addukte von 129 und 130.

Messung Nr. Irel ([129+Na]+) / %

Irel ([130+Na]+) / %

Irel ([129+K]+) / %

Irel ([130+K]+) / %

1 70 30 71 29 2 68 32 71 29 3 71 29 72 28 4 70 29 73 27

Mittelwert 70 30 77 28

Kapitel 6

Literaturverzeichnis

6 Literaturverzeichnis 169

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Hinweise über die Anwendung kombinatorischer Methoden zur Herstellung oder über

ein Screening einer Bibliothek von Liganden für oder von Olefin-Metathese-

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[166] Die thermodynamischen Rechnungen wurden von Dr. P. Schwab und Dr. G. Kautz

(BASF AG, Ludwigshafen) durchgeführt. Die Standardbildungsenthalpie für 1,7-

Octadien wurde mit der Inkrementmethode nach BENSON berechnet.

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72, 1753-1786.

[214] Ich danke Herrn Marcus Hermes für die Synthese dieser Verbindung.

[215] C. R. Johnson, S. J. Bis, Tetrahedron Lett. 1992, 33, 7287-7290.

[216] D. Stöckigt, persönliche Mitteilung.

[217] A. H. Hoveyda, M. T. Didiuk, Curr. Org. Chem. 1997, 2, 489-526.

[218] D. D. Perrin, W. L. F. Amarengo, D. R. Perrin, Purification of Laboratory Chemicals,

2. Aufl., Pergamon Press, Oxford, 1980.

[219] P. E. Reed, J. A. Katzenellenbogen, J. Org. Chem. 1991, 56, 2624-2634.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Michael Heinrich Becker

Geburtsdatum 15. November 1971

Geburtsort Bad Hersfeld

Familienstand Ledig

Werdegang

1978 – 1982 Grundschule Ronshausen

1982 – 1988 Brüder Grimm-Schule Bebra

1988 – 1991 Jakob-Grimm-Schule Rotenburg an der Fulda

Juni 1991 Abitur

1991 – 1992 Zivildienst

Oktober 1992 – September 1997 Studium der Chemie an der Philipps-Universität Marburg

und der University of Manchester, Institute of Science

and Technology (UMIST), Großbritannien

Oktober 1994 Diplom-Vorprüfung

September 1995 – Februar 1996 Auslandsaufenthalt an der University of Manchester,

Institute of Science and Technology (UMIST)

Februar 1997 Diplom-Hauptprüfung

April 1997 – September 1997 Diplomarbeit bei Professor Dr. G. Boche, durchgeführt

unter Anleitung von Professor Dr. M. T. Reetz am Max-

Planck-Institut für Kohlenforschung in Mülheim an der

Ruhr, Thema: „Synthese von N,N-Diphenylphosphino-

methylamin-Immobilisaten und deren Anwendung in der

Hydroformylierung“.

November 1997 –

Dezember 1999

Beginn der vorliegenden Dissertation in der

Arbeitsgruppe von Professor Dr. M. T. Reetz am Max-

Planck-Institut für Kohlenforschung in Mülheim an der

Ruhr

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Neue Screening-Systeme für die enantioselektive Bio- und