Nickelspeziesanalyse im Cytosol humaner intestinaler ... · für die Einführung in die Tiefen der CE / ICP-MS Kopplung und seine Hilfestellung bei auftretenden Problemen der Kopplung

Nickelspeziesanalyse im Cytosol humaner intestinaler

Gewebeproben mittels online-Kopplung von

Kapillarelektrophorese und induktiv gekoppeltem

Plasma-Massenspektrometer

Der Fakultät für Naturwissenschaften

der Universität Duisburg-Essen

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigte Dissertation

von

Sven Bonsack

aus

Bochum

Referent: Prof. Dr. A. Golloch

Koreferent: Prof. Dr. B. Neidhart

Tag der mündlichen Prüfung: 02.04.2003

Erklärung

Hiermit erkläre ich, daß ich die Arbeit selbständig verfaßt habe. Die verwendetenQuellen sowie die verwendeten Hilfsmittel sind vollständig angegeben.

Göttingen, den 06.01.2003

Herrn Priv.-Doz. Dr. Prange vom GKSS Forschungszentrum danke ich für die Überlassungdes interessanten Themas und für die aufregenden Diskussionen. Bei Herrn Prof. Dr. Gollochbedanke ich für die universitäre Betreuung meiner Arbeit.

Mein Dank gilt weiterhin Herrn Prof. Dr. Neidhart für die wissenschaftliche Betreuung vonSeiten des GKSS Forschungszentrums und für die Korrektur dieser Arbeit.

Bei Herrn Prof. Oellerich von der Abteilung Klinische Chemie der Georg-August-UniversitätGöttingen möchte ich mich für flexible Gestaltung meiner Arbeitszeit und für das mirentgegengebrachte Verständnis bei die Erstellung dieser Arbeit bedanken.

Besonders möchte ich mich bei Frau Dr. Evelin Denkhaus für Ihre hervorragende inhaltlicheund moralische Betreuung der Arbeit bedanken. Ohne Ihre ständige Diskussionsbereitschaftbzw. Beiträge und Ihr offenes Ohr wäre diese Arbeit nie zu dem geworden, was sie ist.

Weiterhin möchte ich mich bei Herrn Dr. Dirk Schaumlöffel vom GKSS Forschungszentrumfür die Einführung in die Tiefen der CE / ICP-MS Kopplung und seine Hilfestellung beiauftretenden Problemen der Kopplung herzlich bedanken.

Außerdem gilt mein Dank den Mitarbeitern der Abteilung KAE des Instituts fürKüstenforschung/Physikalische und Chemische Analytik des GKSS ForschungszentrumsGeesthacht für die Hilfsbereitschaft und für das angenehme Arbeitsklima.

Für die Durchführung der TXRF Messungen möchte ich meinen Dank Herrn Dr. Reus vomGKSS Forschungszentrum Geesthacht aussprechen.

Besonders bedanken möchte ich mich bei meiner Mutter und meinem Bruder, die durchständige moralische Unterstützung zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Am Ende möchte ich mich noch bei meiner Freundin Ines dafür bedanken, dass sie in der Zeitdes Zusammenschreibens meine Launen ausgehalten und mir immer Mut zugesprochen hat,wenn es nötig war. Vor allem aber bin ich Ihr für das Korrekturlesen meiner Arbeit dankbar.

Für meinen Großvater und meinen Vater, die, so glaube ich,

ein bisschen stolz auf mich wären. Ich verspreche Euch,

dass ich Eure Worte über „Doktoren der Chemie“ nie

vergessen werde.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung__________________________________________________ 1

2 Stand der Forschung ________________________________________ 4

2.1 Nickelspezies in biologischen Proben___________________________ 4

2.2 Induktiv-gekoppltes-Plasma / Massenspektrometrie (ICP-MS) _______ 92.2.1 Zerstäuber für chromatographische Trennverfahren ___________________ 10

2.2.2 HPLC / ICP-MS Kopplung _______________________________________ 11

2.2.2.1 Reversed-Phase-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS ___________ 11

2.2.2.2 Ionenpaar-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS ________________ 12

2.2.2.3 Ionenaustausch-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS ____________ 13

2.2.2.4 Größenausschluss-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS _________ 14

2.2.3 Kapillarelektrophorese gekoppelt mit der ICP-MS _____________________ 15

3 Problemstellung ___________________________________________ 20

4 Analysenverfahren _________________________________________ 21

4.1 Probenmaterial_____________________________________________ 21

4.2 Probenvorbereitung_________________________________________ 23

4.3 Eingesetzte Kopplungstechniken______________________________ 244.3.1 CE / ICP-MS Kopplung __________________________________________ 26

4.3.2 SEC-Chromatographie mit UV-Detektion ____________________________ 28

4.3.3 SEC / ICP-MS Kopplung_________________________________________ 29

4.4 Totalreflexionsröntgenfluoreszensanalyse (TXRF) _______________ 31

4.5 Gesamtproteinbestimmung nach Biuret-Lowry __________________ 31

5 Optimierung der Analysenmethoden __________________________ 32

5.1 Reduzierung von Nickelkontaminationen _______________________ 325.1.1 Reinigung der Gefäße __________________________________________ 32

5.1.2 Reinigung der Chemikalien_______________________________________ 33

5.1.3 Reduzierung der Nickelkontamination durch apparative Veränderungen____ 35

5.2 Optimierung der CE-Trennbedingungen mithilfe eines gemischten Metallothionein-Standards ___________________________________ 36

5.2.1 Optimierung der Kapillarentemperatur ______________________________ 38

5.2.2 Optimierung der Kapillarenlänge __________________________________ 39

5.2.3 Optimierung des Innendurchmessers der Kapillare ____________________ 40

5.2.4 Optimierung der Konzentration des Puffers __________________________ 41

Inhaltsverzeichnis

5.2.5 Optimierung des pH-Wertes des Puffers ____________________________ 42

5.2.6 Optimierte Messparameter für die CE / ICP-MS Kopplung_______________ 44

5.3 Vergleich unterschiedlicher Cytosolherstellungsverfahren ________ 45

5.4 Optimierung der Probenvorbehandlung ________________________ 46

5.5 Trennbedingungen der SEC-Trennung _________________________ 515.5.1 Einfluss der Temperatur auf die Stabilität des Cytosols während der

SEC-Trennung ________________________________________________ 51

5.5.2 Einfluss eines Antioxidants auf die SEC-Trennung ____________________ 52

5.5.3 Zusammenfassung der Trennbedingungen der SEC / ICP-MS Kopplung ___ 53

6 Nickelspeziesanalyse im Cytosol kolorektaler Human-

gewebeproben_____________________________________________ 54

6.1 Bestimmung der Gesamtnickelgehalte im Cytosol mithilfe der TXRF 546.1.1 Diskussion der Ergebnisse _______________________________________ 56

6.2 Gesamtproteinbestimmung der Cytosole der Proben 1-5 __________ 576.2.1 Diskussion der Ergebnisse _______________________________________ 57

6.3 Nickelspeziesanalyse mithilfe der CE / ICP-MS Kopplung__________ 586.3.1 Auswertung und Aussage der Speziesanalyse________________________ 60

6.4 Nickelspeziesanalyse mithilfe der SEC / ICP-MS Kopplung ________ 676.4.1 SEC mit UV-Detektion __________________________________________ 67

6.4.1.1 Ergebnis und Diskussion ________________________________________ 68

6.4.2 Nickelspeziesanalyse mithilfe der SEC / ICP-MS Kopplung________________

6.4.2.1 Auswertungen und Aussagen der Nickelspeziesanalyse ________________ 69

6.4.2.2 Fraktionierung mittels SEC und anschließende Speziesanalyse mithilfe der

CE / ICP-MS Kopplung__________________________________________ 75

6.4.2.3 Ergebnisse und Diskussion der Fraktionierung _______________________ 76

6.4.2.4 Semiquantitative Nickelspeziesanalyse _____________________________ 76

6.5 Verdrängungsreaktionen der Ni2+- durch Zn2+-Ionen ______________ 79

6.5.1 Durchführung der Verdrängungsreaktion __________________________79

6.5.2 Ergebnisse und Diskussion ______________________________________ 80

7 Zusammenfassung _________________________________________ 82

8 Ausblick__________________________________________________ 86

9 Literaturverzeichnis ________________________________________ 88

10 Anhang__________________________________________________ 101

10.1 Geräteliste________________________________________________ 101

Abbildungsverzeichnis

10.2 Verwendete Chemikalien____________________________________ 102

10.3 Verwendete Abkürzungen___________________________________ 103

10.4 Experimetelles ____________________________________________ 105

10.5 Optimierung ______________________________________________ 10610.5.1 Cytosolherstellung mit dem Potter Eveljhem Homogenisator____________ 106

10.5.2 Cytosolherstellung mit dem Ultraschalldesintegrator __________________ 106

10.6 Optimierung der Cytosolherstellung __________________________ 108

10.7 TXRF Messungen__________________________________________ 109

10.8 Gesamtproteinbestimmung _________________________________ 111

10.9 Berechnung statistischer Größen für die CE / ICP-MS Kopplung___ 112

10.10 Nickelspeziesanalyse mithilfe der CE / ICP-MS (Probe 1-2 und 10-15)11310.10.1 Nickel/Kupfer Korrelation bei der CE / ICP-MS_______________________ 120

10.11 Berechnung statistischer Größen für die SEC / ICP-MS Kopplung _ 128

10.12 Nickelspeziesanalyse mit Hilfe der SEC / ICP-MS Kopplung_______ 12910.12.1 Nickel/Kupfer Korrelation bei der SEC / ICP-MS _____________________ 131

AbbildungsverzeichnisAbbildung 1-1: Dosis-Wirkungs-Prinzip _________________________________________ 1

Abbildung 4.1-1: Entnahmestellen der Gewebeproben ______________________________ 22

Abbildung 4.2-1: Potter-Eveljhem-Homogenisator (links), Ultraschalldesintegrator (rechts) __ 23

Abbildung 4.3-1: Schematischer Aufbau eines Sektorfeld-Massenspektrometers__________ 25

Abbildung 4.3-2: Shield Torch System___________________________________________ 25

Abbildung 4.3-3: Schema der CE / ICP-MS Kopplung_______________________________ 26

Abbildung 4.3-4: Schematischer Aufbau des Interface für die CE / ICP-MS Kopplung ______ 27

Abbildung 4.3-5: Verwendetes Interface _________________________________________ 28

Abbildung 4.3-6: Schematischer Aufbau einer SEC mit einem UV-Detektor ______________ 29

Abbildung 4.3-7: Schematischer Aufbau einer SEC / ICP-MS Kopplung_________________ 30

Abbildung 4.3-8: Kopplung SEC mit ICP-MS (A), Sprühkammer (B) ____________________ 30

Abbildung 5.1-1: Dampfreinigungsapparatur zur Reinigung der PFA-Gefäße _____________ 33

Abbildung 5.1-2: Aufbau des Conensystems eines ICP-MS __________________________ 35

Abbildung 5.1-3: Gegenüberstellung von zwei Elektropherogrammen eines humanen Gewebe-

cytosols unter Einsatz verschiedener Conen; Detektion 60Ni ____________ 36

Abbildung 5.2-1: Vergleich eines Elektropherogramms eines Cd-beladenen Metallothionein-

gemisches mit einem Elektropherogramm eines Cytosols von einer malignen

Kolongewebeprobe unter optimierten Bedingungen __________________ 37


Abbildung 5.2-2: Verlauf des Temperaturgradienenten innerhalb einer Kapillare __________ 38

Abbildung 5.2-3: Elektropherogramm des MT-Gemisches bei einer Pufferkonzentration

von 20 mmol/L _______________________________________________ 41

Abbildung 5.2-4: Elektropherogramm des MT-MIX Standards mit einer Pufferkonzentration

von 50 mmol/L _______________________________________________ 42

Abbildung 5.2-5: Einfluss des pH-Wertes des Puffers auf die elektrophoretische Trennung eines

Cadmium beladenen MT-MIX Standards __________________________ 43

Abbildung 5.3-1: Elektropherogramme von Nickelspezies in Abhängigkeit von der

Cytosolgewinnung ____________________________________________ 45

Abbildung 5.3-2: Vergleich der Gesamtnickelkonzentration im Cytosol in Abhängigkeit von der

verwendeten Aufschlussmethode (mechanisch und mittels Ultraschall) ___ 46

Abbildung 5.4-1: Elektropherogramme von zwei Cytosolen (NG und TG) vor der

Acetonitrilfällung______________________________________________ 47

Abbildung 5.4-2: Elektropherogramme von zwei Cytosolen (NG und TG) nach der

Acetonitrilfällung______________________________________________ 47

Abbildung 5.4-3: SEC / ICP-MS Chromatogramme eines Cytosols vor und nach

der Acetonirilfällung ___________________________________________ 49

Abbildung 5.4-4: Probenvorbehandlung zur Nickelspeziesanalyse mittels CE / ICP-MS und

SEC / ICP-MS Kopplung _______________________________________ 50

Abbildung 5.5-1: SE-Chromatogramme eines Cytosols in Abhängigkeit von der

Säulentemperatur_____________________________________________ 51

Abbildung 5.5-2: SE-Chromatogramme eines Cytosols in Abhängigkeit von der Zugabe eines

Antioxidants _________________________________________________ 52

Abbildung 6.1-1: Ergebnisse der TXRF-Messung für die Cytosole vor der Acetonitrilfällung _ 55

Abbildung 6.1-2: Ergebnisse der TXRF-Messung für die Cytosole nach der Acetonitrilfällung 55

Abbildung 6.2-1: Gesamtproteingehalte der Cytosole (Probe 1-5) _____________________ 57

Abbildung 6.3-1: Elektropherogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 3_______________ 59

Abbildung 6.3-2: Elektropherogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 5_______________ 59

Abbildung 6.3-3: Elektropherogramme der Cytosole (NG/entz.G) der Probe 4 ____________ 59

Abbildung 6.3-4: Elektropherogramme einer Ni-Standardlösung (20 µg/L) und eines Cytosols

der Probe NG 3 ______________________________________________ 60

Abbildung 6.3-5: Übereinstimmung der Migrationszeit der Nickelspezies I und der Kupferspezies

im Cytosol von NG 3 __________________________________________ 61

Abbildung 6.3-6: Elektropherogramme zur Identifizierung einer weiteren Nickelspezies_____ 64

Abbildung 6.3-7: Verhalten der Nickelspezies im Cytosol gegenüber niedrig konzentrierten

EDTA-Lösungen______________________________________________ 65

Abbildung 6.3-8: Verhalten der Nickelspezies im Cytosol gegenüber hoch konzentrierten EDTA-

Lösungen ___________________________________________________ 65

Abbildung 6.4-1: Massenkalibriergerade für die SEC-Säule __________________________ 67

Abbildung 6.4-2: SE-Chromatogramme der Cytosole von Normalgewebe und Tumorgewebe

der Probe 1(UV-Detektion bei 254 nm) ____________________________ 68


Abbildung 6.4-3: Vergleich Chromatogramm eines Cytosol (TG) mit UV und

mit ICP-MS Detektion _______________________________________ 69

Abbildung 6.4-4: SE-Chromatogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 3 ___________ 70

Abbildung 6.4-5: SE-Chromatogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 5 ___________ 70

Abbildung 6.4-6: SE-Chromatogramme der Cytosole (NG/entz.G) der Probe 4 ________ 71

Abbildung 6.4-7: Zuordnung der Nickelspezies über eine Kupferspezies (Molmasse 6 kDa)

der Probe NG 1____________________________________________ 73

Abbildung 6.4-8: Zuordnung der Nickelspezies über eine Kupferspezies (Molmasse 6 kDa)

der Probe TG 1 ____________________________________________ 74

Abbildung 6.4-9: Fraktionierung des Cytosols der Probe TG 1 _____________________ 75

Abbildung 6.4-10: Elektropherogramme der SEC-Fraktionen (4 kDa und 9 kDa) ________ 76

Abbildung 6.5-1: SE-Chromatogramme nach Zusatz von Zn2+- und Ni2+-Ionen zum Cytosol

der Probe NG 10___________________________________________ 80

Abbildung 6.5-2: SE-Chromatogramme nach Zusatz von Zn2+- und Ni2+-Ionen zum Cytosol

der Probe TG 10 ___________________________________________ 80

Abbildung 10.6-1: Elektropherogramme von Kupferspezies in Abhängigkeit von der Cytosol-

herstellung_______________________________________________ 108

Abbildung 10.6-2: Elektropherogramme von Zinkspezies in Abhängigkeit von der Cytosol-

herstellung_______________________________________________ 108

Abbildung 10.6-3: Elektropherogramme von Bleispezies in Abhängigkeit von der Cytosol-

herstellung_______________________________________________ 108

Abbildung 10.8-1: Kalibriergerade zur Bestimmung des Gesamtproteingehaltes der

Cytosolproben____________________________________________ 111

Abbildung 10.10-1: Elektropherogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 1 ___________ 113

Abbildung 10.10-2: Elektropherogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 2 ___________ 114

Abbildung 10.10-3: Elektropherogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 10 __________ 114






Abbildung 10.10-9: Übereinstimmung der Migrationszeiten der Nickelspezies I und der

Kupferspezies im Cytosol von NG 1 ___________________________ 120


Kupferspezies im Cytosol von TG 1 ___________________________ 121


Kupferspezies im Cytosol von NG2 ___________________________ 121


Kupferspezies im Cytosol von TG2____________________________ 121





Kupferspezies im Cytosol von NG4 ___________________________ 122


Kupferspezies im Cytosol von entz.G4 _________________________ 122


Kupferspezies im Cytosol von NG 5 ___________________________ 123

Abbildung 10.10-17: Übereinstimmung der Migrationszeiten der Nickelspezies I und der __ 123



Kupferspezies im Cytosol von NG 10 __________________________ 123


Kupferspezies im Cytosol von TG 10 __________________________ 124




Kupferspezies im Cytosol von TG11___________________________ 124

















Abbildung 10.12-1: SE-Chromatogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 1 __________ 129

Abbildung 10.12-2: SE-Chromatogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 10 _________ 129


Abbildung 10.12-4: SE-Chromatogramme der Cytosole(NG/TG) der Probe 13__________ 130



Abbildung 10.12-7: Zuordnung der Ni-Spezies über eine Cu-Spezies (6 kDa)

der Probe NG 3___________________________________________ 131

Tabellenverzeichnis


der Probe TG 3 ___________________________________________ 131


der Probe NG 4___________________________________________ 131


der Probe entzündetes G 4 __________________________________ 132


der Probe NG 5___________________________________________ 132


der Probe TG 5 ___________________________________________ 132


der Probe NG 10__________________________________________ 133


der Probe TG 10 __________________________________________ 133


der Probe NG 11__________________________________________ 133


der Probe TG 11 __________________________________________ 134


der Probe NG 13__________________________________________ 134


der Probe TG 13 __________________________________________ 134


der Probe NG 14__________________________________________ 135


der Probe TG 14 __________________________________________ 135


der Probe NG 15__________________________________________ 135


der Probe TG 15 __________________________________________ 136

TabellenverzeichnisTabelle 2.1-1: Molare Massen der Nickelspezies im Cytosol von Rattennieren_____________ 4

Tabelle 2.1-2: Ergebnisse der Nickelspeziesanalyse im Cytosol von unterschiedlichen

Gewebeproben der Ratte bzw. des Frosches ___________________________ 6

Tabelle 2.2-1: Zusammenfassung der CE / ICP-MS Literatur _________________________ 17

Tabelle 4.1-1: Kenndaten der analysierten Gewebeproben___________________________ 22

Tabelle 5.1-1: Konditionierungsschritte des Chelex 100 für die anschließende Reinigung des

Tris-HNO3-Puffers _______________________________________________ 34

Tabelle 5.2-1: Gewählte Messparameter für die Optimierung der Kapillarentemperatur _____ 39

Tabellenverzeichnis

Tabelle 5.2-2: Auflistung der optimierten Parameter der CE / ICP-MS Kopplung________ 44

Tabelle 5.5-1: Optimierte Messparameter für die SEC / ICP-MS Kopplung ____________ 53

Tabelle 6.3-1: Peakflächenverhältnisse der Nickelspezies I zu Spezies II _____________ 62

Tabelle 6.4-1: Proteinstandards für die Massenkalibrierung der SEC-Säule. ___________ 67

Tabelle 6.4-2: Molmassen der Nickelspeziesfraktionen ___________________________ 71

Tabelle 6.4-3: Peakflächenverhältnisse der Nickelspezies I (6 kDa) zu Nickelspezies II

(9 kDa); SEC / ICP-MS Messungen_______________________________ 77

Tabelle 10.7-1: Ergebisse der TXRF-Messung für die Cytosolproben

vor der Acetonitrilfällung_______________________________________ 109

Tabelle 10.7-2: Ergebisse der TXRF-Messung für die Cytosolproben

nach der Acetonitrilfällung _____________________________________ 110

Tabelle 10.8-1: Ergebnisse der Kalibrierung für die Gesamtproteinbestimmung (n=3) ___ 111

Tabelle 10.8-2: Ermittelte Extinktionen und die berechneten Gesamtproteingehalte (n=3) 112

Tabelle 10.9-1: Wiederholpräzision eines Cytosols für die CE / ICP-MS Kopplung3 _____ 112

Tabelle 10.9-2: Abschätzung der Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze der CE / ICP-MS

Kopplung __________________________________________________ 113

Tabelle 10.10-1: berechnete Flächen der Nickelspezies I und II für die CE / ICP-MS und

Flächenverhältnisse für die Proben 1-5 und 10-15 __________________ 116

Tabelle 10.10-2: Wertetabelle zur Durchführung des t-Test (auf der Ebene von 0,01) für die

Peakflächenverhältnisse (CE / ICP-MS) __________________________ 117

Tabelle 10.10-3: Ergebnisse des t-Test der Peakflächen ___________________________ 118

Tabelle 10.11-1: Wiederholpräzision (Rententionszeit) eines Cytosols für die SEC / ICP-MS

Kopplung (n=5)______________________________________________ 128

Tabelle 10.11-2: Wiederholpräzision (Peakflächen) eines Cytosols für die SEC / ICP-MS

Kopplung (n=5)______________________________________________ 128

Tabelle 10.12-1: berechnete Flächen der Nickelspezies I und II für die SEC / ICP-MS und

Flächenverhältnisse für die Proben 1-5 und 10-15 __________________ 136

Tabelle 10.12-2: Wertetabelle zur Durchführung des t-Test (Ebene 0,01) für die

Peakflächenverhältnisse (SEC / ICP-MS) _________________________ 137

Tabelle 10.12-3: Ergebnisse des t-Test der Peakflächen ___________________________ 137

Einleitung 1

1 EinleitungEvolutionsbedingt sind eine Vielzahl von Elementen des Periodensystems am humanen

Stoffwechsel beteiligt. Dabei wird zwischen Mineral- und Spurenelementen unterschie-

den. Zu den Mineralelementen zählen Kalium, Magnesium, Calcium und Natrium. Spu-

renelemente sind chemische Elemente, die der menschliche, tierische oder pflanzliche

Organismus nur in Spuren enthält und die oftmals lebenswichtige Aufgaben erfüllen.

Spurenelemente kommen im Bereich von Gramm (Zn: 2,3g) bis Milligramm (Mo: 5

mg) im humanen Organismus vor. Die Aufnahme geschieht über die Nahrung, wobei

als limitierende Faktoren sowohl der Gehalt in den Nahrungsmitteln als die

Bioverfügbarkeit des entsprechenden Spurenelementes berücksichtigt werden muss.

Sowohl der Magen als auch der Darm gelten als Resorptionsort. Ihre Wirkung entfalten

die Spuren-elemente nur in ionisch gelöster oder komplexgebundener Form. Sie können

in drei Gruppen eingeteilt werden.

1. essentielle Spurenelemente, deren Notwendigkeit für den Menschen erwiesen ist

und deren Mangel zur Manifestation von klinischen Symptomen führt.

2. Elemente, deren Funktion für den Menschen als noch nicht genügend gesichert gilt

3. Elemente, die in größeren Mengen beim Menschen toxisch wirken, z.B. Cadmium,

Blei, Quecksilber, Arsen usw.

Abbildung 1-1: Dosis-Wirkungs-Prinzip[2]

Einleitung 2

Abbildung 1-1 zeigt die Einteilung chemischer Elemente in essentielle, nicht essentielle

und toxische Elemente nach dem Dosis-Wirkungs-Prinzip. Nicht essentielle Elemente

sind bis zu einer bestimmten Elementkonzentration im Körper noch tolerierbar. Sobald

diese Konzentration überschritten wird, wirkt das Element toxisch. Ein als Gift bezeich-

netes Spurenelement wirkt schon in den kleinsten Konzentrationen toxisch. Der Verlauf

des Dosis-Wirkungs-Prinzip für essentielle Elemente zeigt ein breites Maximum bei

einer mittleren Elementkonzentration.

Da Spurenelemente ihre Wirkung im Organismus nur in ionisch gelöster oder komplex-

gebundener Form ausüben können, sind sie häufig Bestandteile von Makromolekülen,

wie z.B. Proteine und Enzyme. Daher sind qualitative und quantitative Informationen

über die Bindungsform (= Spezies) der Spurenelemente von großer Bedeutung, da so

Aussagen z.B. über die Toxizität der Spurenelementspezies möglich sind. Hierzu müs-

sen Analysenverfahren zur Speziesanalyse entwickelt werden, die sowohl die Molekül-

als auch die Speziesinformationen erhalten. Diesen Anspruch erfüllen z.B. online-

Kopplungen (Hyphenated Systems) von chromatographischen Trenntechniken mit

elementspezifischen Detektoren. Diese Kopplungen bilden heute die Grundlage der

Metallspeziesanalyse. Die Anforderung an ein solches analytisches Verfahren sind recht

hoch, so darf die Speziesinformation während der Probennahme, Lagerung und Analyse

nachweislich nicht verändert werden bzw. die Veränderungen müssen reproduzierbar

und bekannt sein [5]. Das eingesetzte Trennverfahren muss einerseits ein hohes

Trennvermögen aufweisen und das Nachweisverfahren andererseits eine sehr gute

Empfindlichkeit besitzen.

Diese Anforderungen gilt es durch die richtige Wahl des Trennverfahrens bzw. des

Nachweisverfahrens für eine Nickelspeziesanalyse zu erfüllen. Nickel zählt neben Zinn,

Vanadium und Mangan zu der 2. Kategorie der Spurenelemente, deren Funktion für den

Menschen noch nicht vollständig geklärt ist. Da Nickel in geringen Konzentrationen im

menschlichen Körper vorliegt, wurden bisher nur die Gesamtnickelkonzentration in

humanen Gewebeproben bestimmt, nicht aber der Gehalt einzelner Nickelspezies, da

die Konzentration für eine Nickelspeziesanalyse zu gering eingestuft wurde. Es konnten

also keine Aussagen über die Bindungsform des Nickels im humanen Organismus

gemacht werden. Mithilfe von tierexperimentellen Versuchen, in denen Versuchstieren

eine sehr hohe Dosis an 63NiCl2 oral verabreicht oder injiziert wurde, konnten erste Ein-

flüsse einer definierten Nickelspezies auf den Metabolismus des Tieres untersucht wer-

den. Dies widerspricht streng genommen einer Speziesanalyse, da es nicht nachweislich

Einleitung 3

gesichert ist, dass die Speziesinformationen durch das übersteigerte Angebot an 63NiCl2

unverändert bleiben. Die Nickelspeziesanalyse ist unter Erhalt des natürlichen

Verteilungsmuster der Nickelspezies in biologischen Realproben von besonderem

Interesse, um Informationen über die Rolle von Nickel im Körper bzw. im Metabolis-

mus zu erhalten.

Stand der Forschung 4

2 Stand der Forschung

Die folgenden beiden Unterkapitel beinhalten zwei Themenschwerpunkte. Zum einen

werden die bisher identifizierten Nickelspezies in biologischen Proben vorgestellt und

zum anderen die neusten Entwicklungen der Kopplung verschiedener Trennverfahren

(chromatographisch, elektrophoretisch) mit der induktiv gekoppelten Plasma Massen-

spektrometerie (ICP-MS) erläutert.

2.1 Nickelspezies in biologischen Proben

Schon zu Beginn der achtziger Jahre wurden die ersten Arbeiten mit dem Ziel einer

Nickelspeziesanalyse im Cytosol von Nagetieren nach Injektion von 63Nickelchlorid

(63Ni2+ als radioaktives Ion) durchgeführt [7-14/ 19]. Bis zu diesem Zeitpunkt waren nur

α2-Macroglobulin und Albumin als nickelbindende Serumproteine bekannt.

Sunderman et al. waren die Vorreiter auf dem Gebiet der Nickelspeziesanalyse im Cyto-

sol von Ratten nach Inkubation mit 63Nickelchlorid [8]. Sie fanden mithilfe chromato-

graphischer Methoden heraus, dass 68 Prozent von 63Nickel an Substanzen, deren Mol-

masse kleiner als 2 kDa war, gebunden wurde. Das restliche Nickel verteilte sich auf

fünf makromolekulare Verbindungen mit Molmassen von 130 kDa, 70 kDa, 55 kDa, 30

kDa und 10 kDa (Zuordnung der Fraktion zu möglichen Substanzen bzw. Substanz-

klassen siehe Tabelle 2.1-1). In der folgenden Tabelle 2.1-1 sind die Ergebnisse (molare

Masse der Nickelspezies) der ersten Arbeiten auf dem Gebiet der Nickelspeziesanalyse

im Cytosol von Rattennieren aufgelistet.

Tabelle 2.1-1: Molare Massen der Nickelspezies im Cytosol von Rattennieren [8]

molare Masse / kDa Substanz / Substanzklasse

130 Nickeloplasmin

70 Albumin

55 63Ni-Metalloprotein [16]

30 -----

10

Metallothionein ähnliches

Protein (MLP) [18]

Die elektrophoretische Mobilität des Proteins mit einer Molmasse von 130 kDa besaß

sehr große Ähnlichkeit mit der des Nickeloplasmins, sodass man davon ausging, dass es


sich um dieses Protein handeln könnte. Aufgrund der Daten, die aus der Anwendung

verschiedener Trennmethoden gewonnen wurde, könnte es sich bei der 70 kDa Spezies

um Albumin handeln. Hinter der 55 kDa Spezies könnte sich das von Jacobsen be-

schriebene 63Ni-Metalloprotein verbergen, das er im Cytosol von humanen Drüsen

gefunden hatte [16]. Zu diesem Zeitpunkt konnte der Nickelspezies mit einer molaren

Masse von 30 kDa noch keine Substanz oder Substanzklasse zugeordnet werden (ein

Verdacht deutete auf eine nicht näher spezifizierte Nickelspezies hin, die Oskarsson [17]

im Cytosol der Lunge bzw. Niere von Mäusen gefunden hatte).

Diese Ergebnisse wurden von Herlant-Peers et al. [19] bestätigt, die im Cytosol von

Mäusen nach Inkubation mit 63Nickelchlorid eine Nickelspeziesanalyse mithilfe der

Gelelektrophorese (Gradienten SDS1 Page) durchgeführt hatten. Sie untersuchten so-

wohl die in vitro als auch die in vivo Einlagerung von 63Ni2+ in subzellare Lungen- und

Leberfraktionen von Mäusen und detektierten nickelbindende Proteine mit ähnlichen

molaren Massen wie die Gruppe um Sunderman [19].

Bis Ende der achtziger Jahre flachte das Interesse an der Nickelspeziesanalyse in biolo-

gischen Matrizes deutlich ab. Erst wiederum durch Arbeiten von Sunderman, die auf

seine bisher gewonnenen Erkenntnisse (siehe Tabelle 2.1-1) aufbauten, stieg das Inter-

esse an der Nickelspeziesanalyse wieder. Aufgrund der Weiterentwicklung der Trenn-

techniken war man nun in der Lage, die Spezies besser separieren zu können. Es

wurden im Vergleich zu den Anfängen eine deutlich höhere Anzahl an Nickelspezies im

Cytosol verschiedener Rattenorgane nachgewiesen. Diese Untersuchung beschränkte

sich aber nicht mehr auf das Cytosol von Ratten, sondern wurde auf Cytosole von

Froschorganen ausgeweitet [7]. Es wurden weitere Versuche unternommen, die

gefundenen Nickelspezies zu identifizieren. Die Tabelle 2.1-2 zeigt eine

Zusammenfassung der Nickelspezies-analyse in Cytosolen von verschiedenen Ratten-

und Froschorganen.

1 SDS = Natriumdodecylsulfat


Tabelle 2.1-2: Ergebnisse der Nickelspeziesanalyse im Cytosol von unterschiedlichen

Gewebeproben der Ratte bzw. des Frosches [7]

Cytosol von Rattenproben Cytosol von Froschprobenmolare

Masse / kDaSubstanz /

SubstanzklasseGewebeprobe molare

Masse /kDa

Substanz /Substanzklasse

Gewebeprobe

72 Niere 74 Isoform vonAlbumin

alle Gewebeteile1

67 Albumin

alle Gewebeteile1 70 Isoform von

Albumin alle Gewebeteile1

58 Muskelgewebe 58 Muskelgewebe55 Gehirn, Lunge,

Niere und Leber____ ____

43 Muskelgewebe,Niere und Leber

43 DNA bindendesProtein

Eierstöcke

41 Gehirn 40DNA bindendes

Protein /Transskriptions-

faktor TFIIIA

Eierstöcke

39 Muskelgewebe 39 Niere und Leber

32 Lunge und Niere 38 Eierstöcke

30Vermutung:

kohlen-stoffhaltigeAnhydrase

alle Gewebeteile1 30

Vermutung:kohlenstoffhaltige

Anhydrasealle Gewebeteile1

20 alle Gewebeteile1 17 alle Gewebeteile1

kleiner 20alle Gewebeteile1 (hohe Gehalte inder Lunge und

Milz)

kleiner 20

alle Gewebeteile1

(hohe Gehalte inder Leber)

1 Muskelgewebe, Gehirn, Lunge, Leber und Milz

Wie aus der Tabelle 2.1-2 hervorgeht, handelt es sich bei dem Protein im Cytosol der

Eierstöcke des Frosches mit einer molaren Masse von 40 kDa um den Transskriptions-

faktor TFIIIA, der starke Ähnlichkeit mit der humanen Aldolase A besitzt. Dies ließ den

Schluss zu, dass Aldolase A ein Zielenzym für die bisher bekannte, aber noch nicht

geklärte Nickeltoxizität sein könnte [15].

Um weitere Erkenntnisse über den molekularen Mechanismus der nickelinduzierten

Gentoxizität bzw. der Karzinogenität zu erlangen, wurden Austauschreaktionen (Aus-

tausch von Zn2+gegen Ni2+) untersucht. Es wurde beobachtet, dass die Zn2+-Ionen bei

den DNA bindenden Proteingruppen mit 28 Aminosäureresten, die Paare von Histidin-

und Cysteinresten mit zwei bis fünf Aminosäuren am äußeren Ende besaßen, gegen

Ni2+-Ionen leicht ausgetauscht wurden. Durch diesen Austausch wurde die Funktion der

DNA-bindenden Proteine stark beeinträchtigt. In dem Fall, dass die Proteinfunktion

vollständig verloren geht, wirkt das Protein embryo- und gewebetoxisch. Die mit dem


Austausch verbundene Induzierung von Reaktionen freier Radikale wirkt sich

wiederum negativ auf die Onkogenese aus [7/9/12].

Bei der Nickelspeziesanalyse von humanen Cytosolproben der Niere konnten sowohl

peptid- als auch kohlenhydrathaltige Nickelkomplexe gefunden werden [20]. Die nickel-

bindenden Peptide wiesen einen hohen Gehalt an Glutamin- und Aspartamsäure auf,

aromatische und schwefelhaltige Aminosäuren konnten nicht nachgewiesen werden.

Ferner konnte Ni2+ unter physiologischen Bedingungen auch bei einem Überschuss an

Cu2+ nicht verdrängt werden, was auf eine starke Bindung von Nickel an die Peptide

schließen ließ [20].

Mit der Erkenntnis, dass Nickel bzw. Ni2+-Ionen bevorzugt an histidinreiche Proteine

binden [23/186], konnte Sunderman ein weiteres nickelbindendes Protein mit histidinrei-

chen Nickel(II)-Bindungsdomänen isolieren und identifizieren. Dabei handelt es sich

um ein Serin Proteinase Inhibitor, das er mit „pNiXa“ (43-45 kDa) bezeichnet [9-10/13].

Die Koordinierung des Nickel(II)-Ions im pNiXa kann auf drei verschiedene Weisen

erfolgen. Zum einen kann das Octadecapeptid mit seinen histidinreichen Domänen für

eine sechsfache Koordination des Nickel(II)-Ions sorgen, sodass ein oktaedrischer

Nickel(II)-Komplex resultiert, wenn der N-Term von pNiXa acetyliert ist. Fehlt diese

funktionelle Gruppe liegt ein quadratisch planer Nickel(II)-Komplex vor [9]. Er unter-

suchte zusätzlich die Interaktionen von pNiXa mit Chymotrypsin, wobei sich heraus-

stellte, dass pNiXa ein aktiver Chymotrypsin Inhibitor ist [10].

Neben pNiXa wurde auch das Protein Hpn entdeckt und charakterisiert [11]. Bei Hpn

handelt es sich wiederum um ein histidinreiches, metallbindendes (nickelbindendes)

Polypetid des Helicobacter pylori bzw. des Helicobacter mustulae. Helicobacter pylori

ist ein humanes gastrointestinales Pathogen, das mit Gastritis und anderen Darmerkran-

kungen in Verbindung gebracht wird. Diese Mikroorganismen produzieren eine hohe

Anzahl von Ureasen, die wie alle bekannten Ureasen, Ni2+ und Zn2+ binden. Das Protein

des Helicobacters pylori wurde nach klinischer Isolierung identifiziert und das identi-

sche Protein im Helicobacter mustulae wiedergefunden. Auch in diesem Fall handelte

es sich sowohl um ein Ni2+-bindendes als auch um Zn2+-bindendes Protein [11].


Zum selben Ergebnis kamen auch Fu et al. in ihren Arbeiten [24]. Sie untersuchten das

metallbindende Protein HypB des Bradyrhizobium japonicum und konnten zeigen, dass

dieses Protein aufgrund des hohen Histidingehaltes 18 divalente Nickel-Ionen pro Di-

mer binden kann. Diese Eigenschaft nutzten sie zur Reinigung bzw. Isolierung des Pro-

teins aus, indem sie es mithilfe einer Ni2+-beladenen Metallchelat-Affinitätschromato-

graphie von der Matrix trennten. Neben Ni2+-Ionen bindet HypB noch Zn2+, Cu2+, Co2+,

Cd2+ und Mn2+.

2002 wurde ein Review von Denkhaus und Salnikow veröffentlicht [26], in dem auf die

Essentialität, Toxizität und Karzinogenität von Nickel eingegangen wurde; zusätzlich

wurden auch nickelbindende Proteine beschrieben. Nach Ihren Ausführungen geht

Nickel, obwohl es nicht signifikant mit der DNA reagiert, starke Interaktionen mit Pro-

teinen ein [26/27]. Neben den erwähnten nickelbindenden Proteinen führten sie noch die

Gruppe der DAN-Gene und Genprodukte auf. Diese können ebenfalls Nickel binden, da

sie (HX)n2

-Ketten aufweisen, die essentiell für eine Ni2+-Koordination sind. DAN-Gene

besitzen Tumorsuppressor Aktivitäten, was in vitro nachgewiesen wurde [28-29] und für

die vorliegende Arbeit von besonderem Interesse sein könnte.

2 (HX)n = Histidinhaltige Sequenz


2.2 Induktiv-gekoppltes-Plasma / Massenspektrometrie (ICP-MS)

In den letzten Jahren haben gekoppelte Systeme (Hyphenated Systems) zur Element-

speziesanalyse in den Bereichen der Umweltforschung, der Lebensmitteluntersuchung

und der bio-medizinschen Forschung zunehmend an Bedeutung gewonnen, da Fragen

nach Metallspezies und deren Konzentration in den verschiedenen Probenmaterialien

immer mehr in den Vordergrund gerückt sind. Die Fragen der Beurteilung von Gefah-

renpotenzialen, die von verschiedenen Metallspezies ausgehen können, mussten und

müssen weiterhin geklärt werden. Dazu sollte eine Analysenmethode, die eine

Erhaltung der Speziesinformation garantiert, entwickelt werden. In den meisten Fällen

wurden dazu chromatographische (Gaschromatographie (GC), Flüssigchromatographie

(LC), Ionenchromatographie (IC)) oder elektrophoretische Trenneinheiten mit dem

ICP-MS gekoppelt. Der Gebrauch eines ICP-MS als chromatographischer Detektor

wurde erstmals in den späten achtziger Jahren beschrieben.

Der Vorteil der Kopplung eines Trennsystems mit einem ICP-MS liegt auf der Hand.

Das ICP ist eine energiereiche Ionenquelle, die einen hohen Grad an Ionisation für die

Elemente bei guter Empfindlichkeit bietet [30/157]. Es ist in der Lage die eluierten Spe-

zies bei gleichzeitigem Abbau von Matrix zu atomisieren. Das Massenspektrometer

zählt zu den atomspektroskopischen Detektoren, die in der Lage sind, mehrere Isotope

eines Analyten während eines chromatographischen oder elektrophoretischen Laufes

simultan zu bestimmen, da es zeitaufgelöst Signale liefern kann [162].

Im weiteren Verlauf der Arbeit werden die gängigen chromatographischen und elektro-

phoretischen online Kopplungen mit der ICP-MS beschrieben.

Die GC / ICP-MS Kopplung ist zwar eine äußerst leistungsfähige Methode zur

Elementspeziesanalyse, besitzt aber ein eingeschränktes Einsatzgebiet. Sie wird

ausschließlich im Umweltbereich und dort speziell in der Analyse von

metallorganischen Substanzen (z.B. Organo-Zinn-Verbindungen) eingesetzt, da sowohl

das Medium des Analyten wie auch der Analyt selbst gut verdampfbar sein muss. Da

diese Methode bei bio-medizinischen Untersuchungen keine Anwendung findet, wird

sie in den weiteren Ausführungen nicht weiter behandelt.

Dagegen haben sowohl die LC als auch die CE / ICP-MS Kopplung ein breites Anwen-

dungsspektrum, wobei der Fokus zunehmend auf Analysen metallhaltiger Biomoleküle

liegt. Aufgrund der kleinen Probenmengen wird der Einsatz der CE / ICP-MS Kopplung

in der bio-medizinischen Analytik bevorzugt (mikroanalytischer Ansatz).


2.2.1 Zerstäuber für chromatographische Trennverfahren

Die Flüssigkeitschromatographie mit ihren verschiedenen Trennmodi wie die Reversed-

phase-Chromatographie (RPLC), die Ionenpaar-Chromatographie (IPC), die Ionenaus-

tausch-Chromatographie (IEC) und die Größenausschluss-Chromatographie (SEC) hat

einen bedeutenden Vorteil gegenüber der Kapillarelektrophorese (CE) und der

Gaschromatographie (GC). Da die Flussraten der genannten Trennmethoden im unteren

mL Bereich liegen, also keine Optimierung der Flussraten an den Zerstäuber erforder-

lich ist, ist kein spezielles Interface wie bei der CE und GC nötig, sondern das Elutat

kann sofort über einen Zerstäuber ins Plasma überführt werden. Es werden meist

kommerziell erhältliche Zerstäuber wie Cross-Flow oder konzentrische Zerstäuber mit

gekühlter Sprühkammer eingesetzt, sodass nur 1-3 % der Probe ins Plasma gelangt. Die

Transferleitung besteht aus einer inerten PEEK3 oder PTFE4 Kapillare [34]. Der Einsatz

eines hydraulischen Hochdruckzerstäubers zeigte eine Steigerung der Empfindlichkeit

für einige Elemente im Vergleich zu den herkömmlichen Zerstäubern [35]. Eine

Alternative fanden Koropchak et al. und Tomlinson et al. [36/37]. Sie setzten die

Thermospraytechnologie zur Zerstäubung ein, um mit einer Flussrate von 2 mL/min

arbeiten zu können. Ein anderer Ansatzpunkt war der Einsatz eines Ultraschall-

zerstäubers. Dieser verbesserte den Probentransport, sodass die generelle Effizienz der

Zerstäubung bei 10-30 % lag. Shum et al. entwickelten einen Direktinjektionszerstäuber

speziell für die LC / ICP-MS Kopplung. Der Zerstäuber befand sich direkt in der Fackel

des ICPs. Der theoretische Probentransport ins Plasma lag bei 100% und der Zerstäuber

arbeitete mit einer sehr geringen Flussrate von 30-120 µL/min [38-40].

Für die online-Kopplung von CE mit der ICP-MS würde sich ein Zerstäuber mit einer

sehr geringen Flußrate anbieten, da die CE mit solchen Flußraten arbeitet. Das Totvo-

lumen des eingesetzten Zerstäubers muss sehr klein sein, da sonst die scharfe Trennung

der CE durch das zu große Totvolumen innerhalb des Zerstäubers aufgehoben wird. Aus

diesen Gründen wäre ein modifizierter konzentrischer Zerstäuber für eine solche

Kopplung sehr gut geeignet.

3 Abk. für Polyetheretherketon, einen hochtemperaturbeständigen u. schlagzähen Thermoplasten4 Kurzz. (nach DIN 7728, Tl. 1, Jan. 1988) für Polytetrafluorethylene.


2.2.2 HPLC / ICP-MS Kopplung

Die HPLC / ICP-MS Kopplung ist aufgrund des geringen instrumentellen Aufwandes

(kein spezielles Interface nötig) für die Speziesanalyse weit verbreitet [41-44]. In den

letzten Jahren sind viele Veröffentlichungen erschienen, die den Einsatz dieser Technik

dokumentieren. Das Einsatzgebiet liegt hauptsächlich in der Arsen- und Selenspezies-

analyse, z.B. in Pflanzenextrakten [45-52]. Gleichzeitig stieg auch das Interesse an

weiteren Metallspeziesanalysen in biologischen Proben mittels HPLC / ICP-MS

Kopplung. So führten Inagaki et al. eine Speziesanalyse von Spurenelementen, die an

Proteine gebunden sind, im humanen Blutserum durch [53]. Jakubowski et al. koppelten

nach der Einführung der ICP-MS Geräte mit eingebauter Kollisionszelle diese mit einer

HPLC-Anlage, um eine Selenspeziesanalyse im humanen Urinproben durchführen zu

können [54].

2.2.2.1 Reversed-Phase-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS

Die Reversed-Phase-Chromatographie (RPLC) ist eine der am häufigsten benutzen Me-

thoden der Flüssigchromatographie, bei der die stationäre Phase weniger polar ist als

die mobile Phase. Als stationäre Phase werden häufig C8 oder C18 Materialien

eingesetzt. Das Einsatzgebiet der Reversed-Phase-Chromatographie liegt hauptsächlich

auf den Gebieten der Umwelt- [56-59] und klinischen Forschung [34/60-64]. Innerhalb der

Umweltforschung konnten so Butylzinnverbindungen sowohl in

Polyvinylchloridprodukten als auch in Fungiziden bzw. Insektiziden analysiert werden

[56]. Neben dem Einsatz dieser Kopplung auf dem Gebiet der Quecksilberanalytik unter

Verwendung eines Ultraschallzerstäubers (NWG5: 70-160 pg) wurden auch organische

Bleiverbindungen (Trimetyl-, Triethyl- und Triphenylverbindnungen) unter

isokratischen Bedingungen getrennt und quantifiziert [58-59].

In der klinischen Forschung wird die RPLC / ICP-MS Kopplung zur Analyse von Me-

tallkomplexen bzw. von Metallspezies in Biomolekülen eingesetzt [64]. So trennten und

analysierten Taktera et al. Iodid und fünf Iodoaminosäuren in Hormonen der Schild-

drüse, die sie auch im Urin und Blutplasma zur Früherkennung von Schilddrüsener-

krankungen bestimmen konnten (NWG: 35-130 pg) [60]. Ebenso konnten Metallopor-

phyrine sowohl im Blut als auch im Urin getrennt und quantifiziert werden [62]. Ein

5 NWG = Nachweisgrenze


weiteres Anwendungsgebiet stellt die Analyse von platinhaltigen Chemotherapeutika

da. Hierzu benutzten Cairns et al. eine vorgeschaltete Desolvatationseinheit, um mit

100%igem organischem Lösungsmittel arbeiten zu können [63].

2.2.2.2 Ionenpaar-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS

Eine weitere Möglichkeit der Kopplung einer Trenneinheit mit der ICP-MS ist die

Kombination Ionenpaar-Chromatographie (IPC) und ICP-MS. Mithilfe der IPC können

hydrophobe ionische Spezies getrennt werden, indem die gebildeten Ionenpaare auf-

grund ihres Adsorptionsverhalten an der unpolaren stationären Phase retardiert werden.

Hier werden die gleichen Anforderungen an die Zerstäubereinheit wie bei der RPLC /

ICP-MS Kopplung gestellt.

Die Hauptanwendungsgebiete dieser online-Kopplungstechnik liegen in der Analyse

von umwelt-relevanten bzw. biologischen Proben. Vor allem bei der Analyse von

Arsenspezies in biologischen Proben (Fisch, Urin, Blutserum) und in Umweltproben

(Wasser und Meerwasser) wird sehr häufig auf die Ionenpaar-Chromatographie als

Trenntechnik zurückgegriffen. Hierbei können absolute Nachweisgrenzen von bis zu

0,1 pg (auf Arsen bezogen) erreicht werden [65-71]. Beauchemine et al. setzten der

mobilen Phase 5% Methanol zu, um die Trennung der Arsenspezies zu verbessern.

Zugleich mussten sie die Generatorleistung des ICP-MS steigern, um eine vergleichbare

Nachweisstärke wie nach einer Trennung mit einer rein wässrigen mobilen Phase zu

erhalten [65-67].

Neben der Analyse von Organoquecksilber- und Organozinnverbindungen [77-80] haben

Yang und Jiang auf der Basis der IPC / ICP-MS Kopplung eine Selenspeziesanalyse im

Urin entwickelt, um so Nachweisgrenzen bis 0,17 ng/mL erreichen zu können. Brown et

al. modifizierten die bisher beschriebenen Kopplungen und führte eine Isotopenver-

dünnungsanalyse zur Bestimmung von Bleispezies durch. Im isokratischen Modus der

IPC konnten sie Bleispezies bis zu einer absoluten Nachweisgrenze von 0,37-3,9 pg je

nach Spezies (auf Blei bezogen) analysieren [76-77]. Jakubowski et al. verbesserten das

Kopplungssystem und setzten zur Chromspeziesanalyse in Umweltproben einen

hydraulischen Hochdruckzerstäuber ein [35]. Um die auftretenden Kohlenstoffinter-

ferenzen im Plasma zu unterdrücken, fügten sie dem Plasmagas Sauerstoff zu.


Im Gegensatz zur RPLC / ICP-MS-Kopplung besitzt die IPC / ICP-MS-Kopplung nur

geringe Bedeutung in der klinischen Forschung. Ein Beispiel für die Anwendung liegt

in der Untersuchung von Reaktionen des cis-Platin mit verschiedenen Proteinen [81].

2.2.2.3 Ionenaustausch-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS

Die Kopplung von ICP-MS und Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) spielt eine

zentrale Rolle in der Elementspeziesanalytik.

Bei der IEC werden zwischen zwei Arten unterschieden, die Anionen-Austausch- und

die Kationen-Austausch-Chromatographie.

Ein typisches Packmaterial einer IEC Säule ist ein Copolymerisat aus Styren und Di-

vinylbenzen. Mithilfe dieser Packungsmaterialien können geladene und ungeladene

Spezies aufgrund unterschiedlicher Affinität zum Austauschermaterial getrennt werden.

Die Trenneffizienz hängt stark vom pH-Wert, von der Pufferkonzentration, von der

Konzentration des organischen Modifieres, der Temperatur und der Flussrate der mobi-

len Phase ab.

Es gibt drei große Anwendungsgebiete der Anionen-Austausch-Chromatographie-

Kopplung. Neben der schon von der IPC / ICP-MS Kopplung (es wird kein spezielles

Interface benötigt) bekannten Arsenspeziesanalyse in Urin wird sie neben der Chrom-

speziesanalyse auch in der klinischen Forschung eingesetzt [34].

Das Hauptproblem bei der Arsenspeziesanalyse mittels Massenspektrometrie stellt die

gleichzeitige Anwesenheit von Chlorid-Ionen in der Probe (z.B. Urin) dar. Die Interfe-

renzen von ArCl+ auf der Masse 75 (Arsen) führen zu Problemen bei der Quantifizie-

rung der Arsenspezies. Trotzdem konnten Nachweisgrenzen von 20-92 pg Arsen erzielt

werden [82-88]. Goosens et al. überführten alternativ zur Hydrid-Generierung die Arsen-

spezies (in Meerwasser, humanem Serum, Urin) mittels einer Dowex-IX 8 Säule in die

Nitratform und trennte sie so von den Chlorid-Ionen ab. Anschließend wurden die Säule

mit 0,03 molarer Salpetersäure gespült, wobei die Chlorid-Ionen zurückgehalten

wurden [90]. Sheppard et al. stellten fest, dass neben der Chloridabtrennung die

Zumischung von Helium ins Plasmagas die Nachweisgrenze deutlich verbessert.

Zusätzlich verdünnt Sheppard die Urinproben mit Wasser (1:5), um die Oxidation von

Arsenit zum Arsenat zu verhindern [83]. Ohne die Chlorid-Ionen abzutrennen,

versuchten Chen et al. den Metabolismus von Dimethylarsinsäure (DMA) bei Ratten

durch Urinanalytik, nach oraler Einnahme von mit DMA versetztes Trinkwasser, unter


Einsatz der IEC / ICP-MS Kopplung zu klären [89]. Mithilfe der Ionen-Austausch-

Chromatographie auf Basis der Anionen wurde der Anstieg an Arsenit, DMA,

Trimethylarsinoxid und einer nicht definierten Verbindung im Urin beobachtet. Die

Autoren kamen zu dem Ergebnis, dass DMA durch ein intestinales Bakterium zu

anorganischem Arsen demethyliert wurde.

Neben der Arsenspeziesanalyse wird diese Kopplungstechnik bei der Chromspezies-

analyse eingesetzt. Da Chrom(III)-Verbindungen als essentiell gelten, hingegen

Chrom(VI)-Verbindungen sehr stark toxisch wirken können, sind Informationen über

den Gehalt bzw. der Konzentration und der Oxidationsstufe der Chromverbindungen

sehr wichtig [91-95]. Zoorob et al. setzten für ihre Arbeiten (Analyse von Chromspezies)

einen „Direkt-Injektions-Zerstäuber“ ein, sodass das Eluat direkt in der Plasmafackel

zerstäubt wurde. Auf diesem Wege erzielten sie absolute Nachweisgrenzen von bis zu 3

pg Chrom [91]. Riog-Navarro gelang es mithilfe der IEC / ICP-MS Kopplung simultan

Arsenspezies und Chrom(VI) zu analysieren [92].

Im Bereich der klinischen Forschung ist das Interesse an der Speziesanalyse essentieller

Elemente in humanen Seren groß. Hierzu setzen Sanz-Medel et al. ein doppelt-fokussie-

rendes ICP-MS ein. Die Quantifizierung der Spezies wurde mittels Isotopenverdün-

nungsanalyse durchgeführt [97]. Ein weiterer Bereich der klinischen Forschung be-

schäftigt sich mit der Klärung des Metabolismus von goldhaltigen Medikamenten6 in

menschlichem Blut. Hierzu wurden die Ergebnisse der Goldspeziesanalyse mittels IEC /

ICP-MS ausgewertet und bewertet [98].

Die Ionen-Austausch-Chromatographie auf Basis der Kationen spielt hinsichtlich ge-

koppelter Systeme eher eine untergeordnete Rolle und sei an dieser Stelle lediglich er-

wähnt.

2.2.2.4 Größenausschluss-Chromatographie gekoppelt mit der ICP-MS

Die online-Kopplung der SEC (angels.: size exclusion chromatography / Größenaus-

schluss-Chromatographie) ICP-MS ist eine leistungsfähige Trenntechnik, wenn sie mit

einer elementspezifischen Detektion verbunden ist. Bei dieser Trenntechnik erfolgt

keine chemische oder physikalische Wechselwirkung zwischen dem Analyten und der

stationären Phase [30]. Die Trennung erfolgt ausschließlich über das Verhältnis von

6 werden häufig bei Arthristiserkrankungen eingesetzt


Analytgröße zu Porengröße der stationären Phase, insofern ist die Bezeichnung „Chro-

matographie“ streng genommen falsch. Es kann davon ausgegangen werden, dass die

native Form der Spezies während der Trennung erhalten bleibt. Aufgrund dieser scho-

nenden Trennbedingungen wird die SEC hauptsächlich in der Speziesanalytik von bio-

logischen Proben eingesetzt (z.B. bei der Analyse von Metallothioneinen (MT) in biolo-

gischer Matrices mit Tris-Puffer als mobile Phase) [101-110].

Dean et al. erreichten eine Separierung und Identifizierung der MTs mittels SEC / ICP-

MS in der Leber von Pferden und in den Nieren von Schweinen [101/106]. Wolf und

Richards analysierten ebenfalls MTs mithilfe der SEC / ICP-MS in biologischen Pro-

ben. Kernpunkt ihrer Arbeit war die Untersuchung der Verteilungsmuster der MT-Iso-

formen im Cytosol von humanen Hirnproben und Hirnproben von Alzheimerpatienten

[109-110]. Mason et al. beschränkten sich dagegen auf die Analyse von MT-Standardlö-

sungen und untersuchten die Elemente Cadmium, Zink und Kupfer. Hierbei stellten sie

fest, dass Zink während der chromatographischen Trennung durch Kupfer ersetzt wurde

(Reihenfolge des Einbaus als Ligand bei MTs: Cu > Cd > Zn) [102/104].

Shum und Houk vergrößerten das Einsatzgebiet der SEC / ICP-MS Analyse. Sie führten

unter Zuhilfenahme eines „Direkt-Injektions-Zerstäubers“ eine Proteintrennung in

humanen Serum ohne jegliche Probenvorbereitung durch. Das Hauptaugenmerk lag

hierbei auf Proteinen, die Blei, Cadmium, Kupfer, Eisen und Zink binden. Shum und

Houk erreichten mit der eingesetzten Kopplung eine absolute Nachweisgrenze von 0,5-

3 pg Metall [40].

2.2.3 Kapillarelektrophorese gekoppelt mit der ICP-MS

Durch die Kopplung der Kapillarelektrophorese (CE) mit der ICP-MS besteht die Mög-

lichkeit, sowohl die hohe Trennschärfe der CE (es können Anionen, Kationen und unge-

ladene Moleküle simultan getrennt werden) als auch die hohe Empfindlichkeit der ICP-

MS zur Bestimmung von Metallspezies zu verbinden. Ein weiterer Vorteil der CE ge-

genüber anderen Trennmethoden liegt in der Möglichkeit der Analyse kleinster Pro-

benmengen (im unteren nL-Bereich; einige Humanproben (Ausnahme: Blut, Urin,

extra-vasale Flüssigkeiten) stehen nur in sehr geringen Probenmengen zur Verfügung).

Bei der CE / ICP-MS Kopplung handelt es sich um eine relativ neue Kopplungstechnik,

die zum Beginn der 90iger Jahre eingeführt wurde. Erst gegen Ende der 90iger Jahre


wurde in einer geringen Anzahl von Veröffentlichungen die Entwicklung und einige

Anwendungen der Methodik beschrieben.

Der Nachteil dieser Kopplung liegt darin, dass ein Interface für die online-Kopplung

von CE und ICP-MS benötigt wird. Es ist nicht möglich, wie bei den bisher beschrie-

benen Kopplungen, einen kommerziellen Zerstäuber mit Sprühkammer zu verwenden,

da die Flussrate der CE für die meisten kommerziellen Zerstäuber zu gering ist. An das

Interface sind folgende Anforderungen geknüpft:

1. der Stromkreis der CE muss über das Interface geschlossen werden können,

2. die Flussrate der CE muss an die Flussrate des Zerstäubers über das Interface ange-

passt werden können,

3. das Interface muss ein geringes Totvolumen besitzen, um keinen Sogeffekt auf die

Kapillare auszuüben,

4. es muss die Position der CE-Kapillare im Interface reproduzierbar sein.

In der Literatur sind verschiedenen Ansätze zur Entwicklung eines solchen Interface zu

finden. Tabelle 2.2-1 gibt einen Überblick über die Lösungsansätze und dem Einsatzge-

biet der CE / ICP-MS Kopplung.


Tabelle 2.2-1: Zusammenfassung der CE / ICP-MS Literatur

Arbeits-gruppe

Literatur-stelle

Interface / Zerstäuberart Anwendung Vorteil / Nachteil

Barnes /Quinghong

[112/113]

• KommerziellerUltraschallzerstäuber +Desolvationseinheit

• Stromkreis wird durchkoaxialen Fluss einerElektrolytlösunggeschlossen

• ModifizierteSprühkammer

Metallothio-nein (MT)Trennung

• 3-8 mal so hoheIntensitäten wie miteinemGlaszerstäuber

• Problem mit derPosition derKapillare imInterface, dadurchProbleme mit demStrom

• Nachweisgrenzenfür Cd / Zn von0,082-1,15 mg/L(bezogen auf MT)

Mei [121]

• Weiterentwicklung derKopplungseinheit vonBarnes

• Universell für mehrereZerstäubertypeneinsetzbar

• Kernstück des Interfaceein Y-förmiges Glasrohrmit Anschluss für dieCE-Kapillare, make-upFlüssigkeit undZerstäuber

Entwicklungder Kopplung

• Problem mit derPosition derKapillare imInterface, dadurchProbleme mit demStrom

Taylor [122]

• KommerziellermikrokonzentrischerZerstäuber (MCN M2Svon CETAC)

• KreisförmigeSprühkammer

• Kernstück des Interfaceein T-förmiges Glasrohrmit Anschluss für dieCE-Kapillare, make-upFlüssigkeit undPlatindraht zumSchließen desStromkreises

Metallothio-nein Trennung • Hoher Zeitaufwand

beim Auswaschendes Interfaces (10s)

Kirlew [125]

• Ultraschallzerstäuber(1,35 MHz)

• Flussraten der make-upFlüssigkeit von 0,08-0,1mL/min

Speziesanalysevon Se und As

• Probleme bei derAnordnung der CE-Kapillare zurUltraschallquelle

Lund / Bendahl [126/127]

• Direkt-Injektions-Zerstäuber

• Flussrate von 1-15µL/min bei wässrigenLösungen

• Extrafluss einer Elektro-lytlösung zum Schließendes Stromkreises mittelseiner HPLC Pumpe

Alkali- undErdalkali-metalle,

Chrom III / VI

• Kompromisslösung,da nicht die hoheTrennschärfe derCE und dieEmpfindlichkeit derICP-MS ausgenutztwerden können


Lund / Tangen [128]• Weiterentwicklung der

Kopplungseinheit vonLund / Bendahl

• ModifizierterkonzentrischerZerstäuber (MCN 100)

Seltene Erden

• Vorteil: geringesTotvolumen

• Separation von 8Seltenen Erden in15 s

Sutton [129]

• Vergleich von 2Zerstäubern

• Hoch EffizienzZerstäuber

• Trad. konzentrischenZerstäuber

• Bei beiden kreisförmigeSprühkammer

Lanthanoide

• Deutlich bessereNachweisgrenzenbei Einsatz desHoch EffizienzZerstäubers

Caruso [138/139]

• PneumatischerZerstäuber

• Im selbstansaugendenBetriebsmodus

Trennung vonMetallothio-nein I und

Ferrit /Vitamin B 12,Co-, Mn-, Zn-Protoporphyrin

• Durch Betrieb imselbstansaugendenModus wird derSogeffekt auf dieKapillare minimiert

Lobinski [141-143] • Mikrozerstäuber Metallothio-nein Trennung

• großes Tot-volumen, dadurchSogeffekt auf dieKapillare

Wei Hsi [137]

• CEC1 Kopplung mit ICP-MS

• Interfaceanordnung wieMei (Y-Stück), aber miteinem crossflowZerstäuber

1CEC= CE-Chromatographie

Speziesanalysevon As / Se /

Cr

• Verbesserung derTrennung durchden Einsatz derCEC

Sanz-Medel [134] • Meinhard Zerstäuber Speziesanalysevon Hg

• Nachweisgrenzenvon 4-7 µg/L

Tsung-Hung [135] • MCN ZerstäuberSpeziesanalyse

von Hg

• MCN Zerstäuberliefert vergleichbareErgebnisse wieandere Kopplungs-einheiten

Schramel /Michalke [114-120]

• Selbst entwickeltes undkonstruiertes Interface

• Grundlage: modifizierterMeinhard Zerstäuber

• Schließen des Strom-kreises über einenkoaxialen Elektrolyt-strom

Speziesanalysevon Pt / Sb / Se

inUmweltproben

und Jod-Speziesanalysein biologischen

Proben

• Problem: Sitz derKapillare imInterface

• Abhilfe: Fixierungmittels Mikrometer-schraube

Prange /Schaumlöffel [130-133]

• Modifizierter,selbstansaugendermikrokonzentrischerZerstäuber

Metallothio-nein Trennungim Cytosol von

humanenGewebeproben

• Sehr geringesTotvolumen

• Aufgrund derveränderten Dimen-sionen des Zerstäu-bers kein Sog-effekt auf die CE-Kapillare

• Erfolgreiche Trenn-ung der drei Iso-formen (MT I-III)


Wie aus der Tabelle 2.2-1 zu entnehmen ist, wird die CE / ICP-MS Kopplung haupt-

sächlich in der bio-medizinischen bzw. klinischen Forschung eingesetzt.

Alle Arbeiten, die sich mit der CE / ICP-MS Kopplung beschäftigt haben, weisen eine

Gemeinsamkeit auf. In allen Fällen wird eine zusätzliche Elektrolytlösung in das Inter-

face geleitet, mit dem Ziel den CE-Stromkreis zu schließen. Die Wahl der Zerstäuber

variiert stark. Neben Ultraschallzerstäubern werden sehr häufig sowohl mikrokonzen-

trische wie auch Meinhard-Zerstäuber eingesetzt [112-120/122/125/187/130-135/141-143].

Bei allen Anwendungen stellte sich heraus, dass die Position der CE-Kapillare im

Interface bei der Kopplung eine bedeutende Rolle spielt. Einzig Michalke und

Schaumlöffel haben sich dieses Problems angenommen [114-120/130-133]. Michalke

positionierte die CE Kapillare mittels einer Mikrometerschraube am Interface,

Schaumlöffel hingegen löste das Problem durch den Einsatz eines T-Stücks, das

innerhalb der Zerstäuberkapillare konzentrisch zuläuft und so immer der optimale Sitz

der Kapillare garantiert ist.

Auf der Basis der Arbeiten von Prange und Schaumlöffel konnte die CE / ICP-MS

Kopplung optimiert werden [130/131]. Das von ihnen entwickelte Interface wurde stetig

verbessert und ist seit Anfang 2000 kommerziell bei der Firma CETAC als CEI 100

erhältlich (siehe Punkt 4.3 der Arbeit). Anwendung fand die von Schaumlöffel et al.

erarbeitete Methode in der Analyse von Metallothionein im Cytosol von humanen Hirn-

proben [132]. Weiterhin setzten Schaumlöffel et al. diese Kopplung zur Iostopen-Ver-

dünnungsanalyse ein, um die Metallzusammensetzung von MT-Standards, die aus

Kaninchenleber gewonnen wurden, zu bestimmen [133]. Es zeigte sich, dass die erar-

beitete Kopplungstechnik hervorragend zur Analyse biologischer Proben einsetzbar

war, sodass sie auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit Anwendung fand.

Problemstellung 20

3 ProblemstellungNickel gehört neben Zinn, Vanadium und Arsen zu den Spurenelementen, deren Essen-

tialität für den Menschen nicht gesichert ist. Hingegen konnten die krebserregende und

cytotoxische Wirkung von Nickel und Nickelverbindungen nachgewiesen werden

[26/145-149]. Während die molekularen Mechanismen der Nickelkarzinogenese zum

großen Teil bekannt sind [149], sind die Bindungspartner von Nickel im Humangewebe

aufgrund ihrer sehr geringen Konzentrationen weitestgehend unbekannt. Erste Untersu-

chungen haben gezeigt, dass der Nickelgehalt von gesunden gegenüber malignen Ge-

webe des Intestinaltrakts Unterschiede aufweist [146]. Um sowohl die cytotoxische als

auch die Immunsystem anregende Wirkung von Nickel z.B. als Zusatz herkömmlicher

Chemotherapeutika, nutzen zu können, müssen die Nickelspezies in humanen Geweben

bekannt sein.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Analysenverfahren zur Nickelspeziesanalyse im

Cytosol humaner Gewebeproben entwickelt werden. Das Ziel sollte dabei sein, die

Nickelspezies im Cytosol von Normal- und Tumorgewebe des humanen Intestinaltrakts

zu trennen, zu charakterisieren und zu identifizieren. Weiter sollten mögliche Unter-

schiede der Nickelspezies im Cytosol normaler und maligner Zellen, die sowohl qualita-

tiver wie auch quantitativer Art sein können, aufgezeigt werden. Zu diesem Zweck

sollte eine CE / ICP-MS Kopplung (Kapillarelektrophorese gekoppelt an ein induktiv

gekoppeltes Plasma Massenspektrometer) eingesetzt und für die Trennung von cytosol-

ischen Nickelspezies optimiert werden. Die Ergebnisse sollten mittels SEC / ICP-MS

Kopplung verifiziert werden.

Dazu musste ein Konzept zur Reduzierung bzw. Eliminierung von Nickelkontami-

nationsquellen ausgearbeitet werden, da sonst eine Nickelspezies-Analyse unter den

gegebenen Bedingungen (geringe Nickelkonzentrationen) nicht möglich wäre. Nickel-

kontainationsquellen können die eingesetzten Chemikalien (Aufreinigung der Chemi-

kalien) sein; aber auch apparative Aspekte (Ausschalten von Kontaminationsquellen

durch eingesetzte Geräte bzw. Geräteparameter) sollten berücksichtigt werden. Neben

der Optimierung sämtlicher Trennverfahren (CE und SEC) kommt der

Probenpäparation und der Probenvorbehandlung eine bedeutende Rolle zu.

Analysenverfahren 21

4 Analysenverfahren

In diesem Kapitel werden die zur Nickelspezies-Analyse eingesetzten Analysenverfah-

ren beschrieben. Der Beschreibung der CE / ICP-MS Kopplung kommt eine besondere

Bedeutung zu [130-131].

4.1 Probenmaterial

Bei den zu analysierenden Gewebeproben handelte es sich jeweils um maligne (TG)

und normale Gewebeproben (NG) des humanen Intestinaltrakts. Im Anschluss an den

chirurgischen Eingriff wurde ein kleiner Teil des Resektats für die Speziesanalyse zur

Verfügung gestellt. Das verbleibende Resektat wurde pathologisch untersucht. Die

Gewebeproben wurden in Polyethylen-Folien eingeschweißt und bei –30°C gelagert.

Sowohl der pathologische Bericht wie auch die Patientendaten konnten unter

Einhaltung des Datenschutzes eingesehen werden. In Tabelle 4.1-1 sind die

individuellen Patientendaten zusammengefasst.

Tabelle 4.1-1: Kenndaten der analysierten Gewebeproben

Probe Entnahme-

ort

Gewebeart 1Tumorstadium (T)/

Differenzierungs-

grad (G)

Alter des

Patienten

/ Jahr

Geschlecht 2

1 Coecum3 TG / NG

T 4

G2-3 74 w

2 Rektum4 TG / NG

T 3

G3 84 w

3

Colon-

ascendens5 TG / NG

T 4

G2 60 m

4

Colon-

transversum6 entzünd.G /

NG

k.A. 60 m

5

Colon-

sigmoideum7 TG / NG

T 4

G3 53 m


6-9 Bei diesen Proben waren nur Tumorgewebe vorhanden, sodass sie zur Opti-

mierung der Geräteparameter genutzt wurden

10 Rektum4 TG / NG Adenom8 67 m

11

Colon-

sigmoideum7 TG / NG

T 0

G 2 70

w

12

Colon-

sigmoideum7 TG / NG

T 3

G 3 58 m

13

Colon-

ascendens5 TG / NG

T 3

G 2 78

w

14

Colon-

transversum6 TG / NG9

T 2

G2 72 m

15

Colon-

sigmoideum7 TG / NG

T 2

G 2 72 m

1: TG = malignes Gewebe ; NG = normales Gewebe ; entzünd.G = entzündetes Gewebe2: w = weiblich ; m = männlich, k.A.= keine Angaben3: Blinddarm ; 4: Enddarm ; 5: aufsteigender Darm ; 6: Querdarm ; 7: Übergang zum Enddarm8: Adenom = Vorstufe des Karzinoms9: undefiniert, kann sich auch um Adenomgewebe handeln

Die folgende Abbildung 4.1-1 zeigt die Entnahmestellen der untersuchten Gewebepro-

ben.

Abbildung 4.1-1: Entnahmestellen der Gewebeproben [150]

Rektum(Probe 2 / 10)

Colon-transversum(Probe 4 / 14)

Colon-ascendens(Probe 3 / 13)

Coecum(Probe 1)

Appendix

Colon-sigmoideum(Probe 5 / 8 / 9 /11 / 12 / 15)

Colon-descendens


4.2 Probenvorbereitung

Zur Herstellung des Cytosols aus humanen Gewebeproben können zwei unterschiedli-

che Verfahren (der mechanische Zellaufschluss oder der Zellaufschluss mittels Ultra-

schall) angewendet werden. Üblicherweise wird der mechanische Zellaufschluss mit

einem Potter-Eveljhem–Homogenisator und der Zellaufschluss mittels Ultraschall mit

einem kommerziell erhältlichen Ultraschalldesintegrator durchgeführt (siehe Abbildung

4.2-1). Vor dem Zellaufschluss wurden die gefrorenen Gewebeproben mit Quarzskal-

pellen in kleine Stücke geschnitten.

Abbildung 4.2-1: Potter-Eveljhem-Homogenisator (links), Ultraschalldesintegrator (rechts)

Bei der Herstellung der Cytosole mithilfe des Potter-Eveljhem Homogenisators wurden

die geschnitten Gewebeproben in einem Verhältnis Probe zu gereinigtem und entgastem

Tris-HNO3-Puffer 1:2 gemischt und mit einem Ultra Turrax unter Argonschutzgas-

atmosphäre und Eiskühlung vorhomogenisiert 7. Anschließend erfolgte der mechanische

Zellaufschluss im Eisbad unter Argon in einem Reinraum der Klasse 1000. Danach

wurde die homogenisierte Probe bei + 4°C und 25.000g 99 min. (Probe 10-15) bzw. 99

min. bei 100.000g (Probe 1-5) zentrifugiert. Das Cytosol wurde abpipettiert und unter

Argon bei –25°C gelagert.

Für den Zellaufschluss mittels Ultraschalldesintegrator wurde die geschnittene Probe

unter Argonschutzgasatmosphäre in ein „Eppendorfcap“ (Volumen 2 mL) überführt und

mit Puffer (gereinigt und entgast) versetzt (Verhältnis 1:2). Die Beschallungsdauer beim

Ultraschalldesintegrators betrug 15 min bei höchster Stufe mit einem Beschallungsin


tervall von 50 %. Der Aufschluss wurde bei +4°C durchgeführt. Die anschließende

Zentrifugation über einen Zeitraum von 99 min. erfolgte bei 25.000g und +4°C. Das

hergestellte Cytosol wurde unter Argon bei –25°C gelagert.

Details beider Verfahren wurden mit Fotos dokumentiert und können im Anhang der

Arbeit eingesehen werden.

4.3 Eingesetzte Kopplungstechniken

Im Rahmen der angestrebten Nickelspeziesanalyse in Cytosolen humaner Gewebepro-

ben wurde sowohl mit einer CE / ICP-MS (nach Schaumlöffel) als auch mit einer SEC /

ICP-MS Kopplung gearbeitet.

Wie erste Messungen [164] mithilfe der TXRF8 gezeigt haben, lag die Gesamtnickel-

konzentration im Cytosol der humanen Darmproben im µg/L Bereich, sodass an das

Massenspektrometer hohe Ansprüche hinsichtlich der Nachweisstärke (vor allem für

Nickel) gestellt wurden. Um diesen Ansprüchen gerecht zu werden, wurde für beide

Kopplungen statt eines Quadrupolgerätes ein Sektorfeld-Massenspektrometer [Finnigan

MAT „Element 1“] verwendet. (Schema eines solchen Gerätes siehe Abbildung 4.3-1)

Um die größtmögliche Nachweisstärke zu erhalten, wurde während der gesamten Arbeit

mit der geringsten Auflösung von 300 gearbeitet. Diese Massenauflösung ist eine kon-

stante Größe und nicht wie bei einem Quadrupolgerät eine Funktion der Masse.

7 Zu Beginn der Arbeit (Probe 1-5) wurde noch Dithiotreitol (5mmol/L) als Antioxidants zugefügt, bei

den weiteren Proben wurde auf die Zugabe aus Gründen, die noch beschrieben werden (siehe Punkt

5.5.2), verzichtet.8 TXRF= Totalreflexionsröntgenfluoreszenz-Spektrometrie


Abbildung 4.3-1: Schematischer Aufbau eines Sektorfeld-Massenspektrometers [165]

Um die Nachweisstärke bzw. die Empfindlichkeit noch weiter zu erhöhen, wurde ein

„Shield Torch“-System verwendet (siehe Abbildung 4.3-2).

Abbildung 4.3-2: Shield Torch System [165]

Bei diesem System befindet sich zwischen der Fackel (Torch) und der HF-Spule ein

geerdetes Platinschild. Dieses Schild sorgt für die Bündelung der Ionenenergie und des

Ionenstrahls im Plasma, wodurch die Empfindlichkeit des Massenspektrometers ge-

steigert wird [166].


4.3.1 CE / ICP-MS Kopplung

Das Kernstück der CE / ICP-MS Kopplung ist das Interface zwischen der CE und der

ICP-MS. Die Abbildung 4.3-3 zeigt den schematischen Aufbau der eingesetzten CE /

ICP-MS Kopplung.

Abbildung 4.3-3: Schema der CE / ICP-MS Kopplung

Nach der Konditionierung der Kapillare (siehe Tabelle 5.2-7) wird die Probe bzw. das

Cytosol hydrodynamisch in die CE Kapillare injiziert und anschließend Strom an die

CE Kapillare angelegt. Die Analyten werden aufgrund ihrer Mobilität getrennt und

gelangen über das Interface bzw. den Zerstäuber ins Plasma und werden mithilfe des

Massenspektrometers detektiert.

Um eine solche Kopplung betreiben zu können, wurde ein spezielles Interface einge-

setzt. Dieses Interface darf keine Sogeffekte (Bandenverbreiterung) besitzen, muss für

die Anpassung der CE-Flussrate (im unteren nL-Bereich) an den Zerstäuber (µL-

Bereich) sorgen und den Strom der CE schließen, so dass die hohe Trennschärfe der

Kapillarelektrophorese nicht negativ beeinflusst wird:

In Abbildung 4.3-4 ist ein solches Interface schematisch dargestellt. Dieses Interface

wurde von Schaumlöffel und Prange [130/131] entwickelt und wird kommerziell von der

Firma CETAC als CEI 100 vertrieben.

+ -+ -

Kapillare

Puffer

Hochspannung

Argon

Puffer

��

��

��

Interface

ICP - MS

Kapillarelektrophorese (CE)

Proben-vial

Kapillare

Puffer

Hochspannung

Argon

Puffer

��

��

��

Interface

ICP - MS

Proben-vial


Abbildung 4.3-4: Schematischer Aufbau des Interface für die CE / ICP-MS Kopplung [130]

Wie aus der Abbildung hervorgeht, besteht das Interface aus zwei Teilstücken. Zum

einen aus dem Kreuzstück, das die Gegenelektrode (Platin) und den Anschluss für die

Make-up Flüssigkeit beinhaltet und zum anderen aus einem modifizierten, selbstansau-

genden mikrokonzentrischen Zerstäuber. Die CE-Kapillare befindet sich direkt über der

Zerstäuberkapillare, sodass nur ein sehr geringes Totvolumen im Zerstäuber vorhanden

ist [130].

Die CE-Kapillare wird von der Make-up Flüssigkeit (Ammoniumnitratpuffer pH 7,4

plus 5 µg Ge/L) umspült, um den Stromkreis der CE zu schließen. Gleichzeitig werden

die Analyten, die aus der Kapillare migrieren, mit dieser Make-up Flüssigkeit verdünnt

und sofort zerstäubt (Anpassung der Flussraten von CE und Zerstäuber). Aufgrund der

niedrigen Flussrate (7-12 µL/min) und der inneren Dimensionierung des Zerstäubers ist

praktisch kein Sogeffekt auf die Kapillare vorhanden. Anhand des konstanten German-

iumsignals der Make-up Flüssigkeit kann die Qualität der Zerstäubung während einer

Messung kontrolliert werden. Die Intensitäten der Signale in den Elektropherogrammen

wurden auf das Signal für Germanium in der Standardlösung normiert, um eine bessere

Vergleichbarkeit der Elektropherogramme zu gewährleisten. Dies wurde bei allen Elek-

troferrogrammen im weiteren Verlauf der Arbeit so gehandhabt.

Das trockene Aerosol gelangt durch eine Quarzsprühkammer über eine gegen

elektrostatische Aufladung geschützte Transferleitung direkt in die Plasmafackel des

ICP-MS. Die Abbildung 4.3-5 zeigt ein Foto des verwendeten Interface.


Abbildung 4.3-5: Verwendetes Interface

Im unteren linken Bildrand ist die Transferleitung, die direkt in die Plasmafackel führt,

zu sehen. Im Vordergrund befinden sich zwei Röhrchen mit Reinstwasser für die Reini-

gung des Interface. Das mittlere Gefäß (PFA9-Gefäß) beinhaltet die Make-up Flüssig-

keit, die durch den Zerstäuber selbst angesogen wird.

4.3.2 SEC-Chromatographie mit UV-Detektion

Die SEC-Chromatographie mit UV-Detektion gehört zu den etablierten analytischen

Chromatographietechniken [6/30/167]. Sie wird im Verlauf der Arbeit zur Massenkali-

brierung der SEC-Säule benutzt. Dazu werden verschiedene UV-aktive Proteinstan-

dardlösungen mit bekannten Molmassen auf die Säule gegeben und bei 254 nm de-

tektiert. Über die Beziehung Retentionszeiten / Molmassen wird die Massenkalibrie-

rung der SEC-Säule durchgeführt. Mithilfe dieser Kalibriergeraden kann den aufge-

trennten Nickelspezies eine Molmasse zugeordnet werden. Der Aufbau der Kopplung

ist sehr einfach (siehe Abbildung 4.3-6).

9 PFA= Perfluor-Alkoxy-(Polymere)


Abbildung 4.3-6: Schematischer Aufbau einer SEC mit einem UV-Detektor

Hierzu wird eine HPLC-Pumpe mit integrierter Probenschleife (500 µL) und eine SEC-

Säule benötigt. Das Vorfiltersystem dient zum Schutz der SEC-Säule vor möglichen

Bestandteilen des Cytosols, die das Säulenmaterial belegen und somit das Trennvermö-

gen der Säule verschlechtern. Ein solches Filtersystem ist im Anhang abgebildet. Das

Eluat gelangt aus der Säule in die Durchflußzelle des UV-Detektors, in dem die UV-

aktiven Probenbestandteile detektiert werden. In dieser Arbeit wurde eine präparative

SEC-Säule verwendet, da im weiteren Verlauf die Fraktionen der SEC analysiert wer-

den sollten. Die genauen Daten bezüglich Säule und Messparameter sind in der Tabelle

5.5-1 aufgelistet.

4.3.3 SEC / ICP-MS Kopplung

Zur Trennung der Elementspezies wurde eine Superdex Säule eingesetzt (Trennbe-

reich: 3000-70000 Da). Mithilfe dieser Säule können Proteine sehr schonend getrennt

werden. Die Abbildung 4.3-7 stellt den schematischen Aufbau der SEC / ICP-MS

Kopplung dar.

Injektions-

schleife

Vorfilter SEC-Säule Teflon

Kapillare


Abbildung 4.3-7: Schematischer Aufbau einer SEC / ICP-MS Kopplung [168]

Im Falle der SEC / ICP-MS Kopplung kann die Trennsäule direkt mit dem Meinhard-

Zerstäuber (Leistung bis 2,7 mL/min) verbunden werden. Das gebildete Aerosol gelangt

durch eine gekühlte Sprühkammer in die Plasmafackel. Die Fotos in Abbildung 4.3-8

zeigen neben der Kopplung (A) eine solche gekühlte Sprühkammer (B).

A B

Abbildung 4.3-8: Kopplung SEC mit ICP-MS (A), Sprühkammer (B)

Um das Plasma nicht zu überlasten, wurde die Flussrate (2 mL/min) der SEC durch ei-

nen selbst konstruierten Split (Foto siehe Anhang) um den Faktor 5 (auf 400 µL/min)

reduziert. So konnten stabile Verhältnisse im Plasma erreicht werden. Der Split besteht

aus einem T-Stück (PTFE10), welches an der einen Seite mit einer peristaltischen

Pumpe und an der anderen Seite mit dem Meinhard-Zerstäuber verbunden ist. Über die

10 Polytetrafluorethylene

Injektions-schleife

Vorfilter SEC-SäuleTeflonKapillare

Zerstäuber

Sprüh-kammer

ICP-MS

Pumpe

Zerstäuber-gas

Split


Pumpe kann das Splitverhältnis variiert und über gravimetrische Methoden bestimmt

werden.

Das Cytosol wurde über eine Probenschleife (Volumen 500 µL) und nach Passieren

eines Vorfilters auf die Trennsäule gegeben. Die optimierten Messparameter der SEC /

ICP-MS Kopplung sind in Tabelle 5.5-1 aufgelistet.

4.4 Totalreflexionsröntgenfluoreszensanalyse (TXRF)

Die TXRF wurde in der Arbeit zur Bestimmung der Gesamtnickelgehalte im Cytosol

eingesetzt. Sie wurde weiterhin für die Überprüfung der Reinheit der eingesetzten Che-

mikalien bzw. zur Identifizierung möglicher Kontaminationsquellen genutzt.

Hierzu wurden 10 µL des Cytosols jeder Probe auf eine vorher gereinigte und silikoni-

sierten TXRF-Träger (Quarzglas) gegebenen. Zu dem Cytosol wurden zusätzlich 10 µL

einer 10%igen HNO3 und 5 µL eines internen Yttrium-Standards (250 µg/L) auf den

Träger pipettiert und auf einer Heizplatte eingedampft. Die absolute Masse des Yttrium-

Standards auf der Quarzplatte betrug 5 ng. Die gesamte Probenvorbereitung fand in

einer Reinraumwerkbank der Klasse 1000 statt. Als Anregungsquelle diente eine

Molybdän-Röhre, wobei die Röhrenspannung 50 kV betrug. Es wurde mit einem Zr2O-

Filter bei einer Messzeit von 1000 s gearbeitet.

4.5 Gesamtproteinbestimmung nach Biuret-Lowry

Die Bestimmung der Gesamtproteingehalte der Cytosole erfolgte nach der Biuret-

Lowry-Methode [170]. Zu diesem Zweck wurde ein Analysen-Kit der Firma Sigma-

Aldrich verwendet. Die Detektion erfolgte photometrisch.

Das hergestellte Cytosol wurde mit dem Biuret-Reagenz (bestehend aus 0,75 mmol/ L

Kupfersulfat und 94 mmol/ L Natriumchlorid) versetzt und 10 Minuten inkubiert. Der

entstehende Komplex (in alkalischer Lösung) reduziert das zugesetzte Folin (0,1 mL)-

Ciocalteu-Phenol-Reagenz (2N laut Hersteller) [170]. Es entsteht eine intensive blaue

Färbung, die nach 30 Minuten bei 660 nm photometrisch detektiert wurde. Die Aus-

wertung der Messungen (nur für die Proben 1-5) wurde anhand einer Kalibriergerade

durchgeführt.

Optimierung der Analysenmethoden 32

5 Optimierung der Analysenmethoden

In den folgenden Abschnitten werden sowohl apparative wie auch messtechnische

Optimierungen der eingesetzten Kopplungstechniken CE / ICP-MS und SEC / ICP-MS

zur Nickelspeziesanalyse beschrieben.

5.1 Reduzierung von Nickelkontaminationen

Blindwerte spielen im spurenanalytischem Bereich eine bedeutende Rolle. Vor allem

ubiquitäre Elemente wie Zink, Kupfer und Nickel erschweren die Analytik im Ul-

traspurenbereich. Für diesen analytischen Bereich müssen sowohl alle benutzten Gefäße

und Verbrauchsmaterialien als auch die eingesetzten Chemikalien eine sehr hohe

Reinheit besitzen.

5.1.1 Reinigung der Gefäße

Um die unter 5.1 beschriebenen Kriterien erfüllen zu können, wurden nur Gefäße aus

PFA eingesetzt und sämtliche Verbrauchsmaterialien wie Pipettenspitzen mit ver-

dünnter unter dem Siedepunkt destillierter Salpetersäure gereinigt und anschließend mit

Reinstwasser (Wasseraufbereitungssystem Milli-Q-Element der Firma Millipore) ge-

spült. Die PFA Gefäße wurden vor jedem Gebrauch mithilfe einer Dampfreinigungsap-

paratur, die mit nachgereinigter Salpetersäure gefüllt wurde, gesäubert. In Abbildung

5.1-1 ist eine solche Dampfreinigungsapparatur abgebildet.


Abbildung 5.1-1: Dampfreinigungsapparatur zur Reinigung der PFA-Gefäße

Nach der Reinigung wurden die Gefäße mit Reinstwasser unter einer Clean-Bench

mehrfach gespült und abschließend getrocknet.

5.1.2 Reinigung der Chemikalien

Bei der Reduzierung der Blindwerte kam den eingesetzten Chemikalien eine zentrale

Rolle zu (Liste der benutzen Chemikalien siehe Anhang). Es wurden, soweit sie kom-

merziell erhältlich waren, Chemikalien der Reinheit „suprapur“ eingesetzt. Die Salpe-

tersäure wurde vor ihrer Verwendung mithilfe einer „Subboiling“-Apparatur nachge-

reinigt. Trotz suprapurer Qualität musste auch der verwendete Tris-Puffer nachgereinigt

werden, wobei eine etwas aufwendigere Reinigungsprozedur entwickelt werden musste,

da der Tris-HNO3-Puffer starke Kontaminationen von Zink, Natrium und Kupfer

aufwies. Das enthaltene Natrium verursachte mit dem Plasmagas Argon, eine Inter-

ferenz auf der Masse von 63Cu, was zu erhöhten Blindwerten für Kupfer und zu einem

systematischen Fehler bei einer möglichen quantitativen Kupferbestimmung führte [6].

Mithilfe des Ionenaustauschermaterials Chelex 100 wurde der Tris-HNO3-Puffer in

mehreren Schritten gereinigt [6/172]. Im Anhang der Arbeit sind solche Reinigungssäu-

len abgebildet.


Da Chelex 100 nur in der Na+-Form kommerziell vertrieben wurde, wurden aus dem

oben schon beschriebenen Grund (Interferenz auf der Masse von 63Cu) die Na+-Ionen

gegen NH4+-Ionen ausgetauscht (NH4

+-Ionen rufen keine Interferenzen hervor). In der

folgenden Tabelle 5.1-1 sind die durchgeführten Konditionierungsschritte aufgelistet.

Tabelle 5.1-1: Konditionierungsschritte des Chelex 100 für die anschließende Reinigung des

Tris-HNO3-Puffers

Reinigungsschritt Auswirkung

Spülen der Säule mit Salpetersäure (1 mol/L) Überführung des Austauscherharzes von der

Na+- in die H+-Form

Spülen des Säulenmaterials mit Reinstwasser Entfernen der Salpetersäurereste aus dem

Austauscherharz

Spülen der Säule mit einer NH3-Lösung

(1mol/L)

Überführung des Austauscherharzes von der

H+-Form in die NH4+-Form

Spülen des Säulenmaterials mit Reinstwasser Entfernen der NH3-Reste aus dem

Austauscherharz

Spülen der Säule mit einer Tris-HNO3-

Puffer-Lösung (250 mmol/L, pH: 7,4)

Einstellen des pH-Wertes im Säulenmaterial

Spülen der Säule mit einer Tris-HNO3-

Puffer-Lösung (20 mmol/L, pH: 7,4)

Einstellen der Konzentration des Tris-HNO3-

Puffers im Säulenmaterial

Nach der Konditionierung des Säulenmaterials wurde der zur Cytosolherstellung ver-

wendete und als Laufpuffer dienende Tris-HNO3-Puffer auf die Säule gegeben und trop-

fenweise in einem PFA-Gefäß aufgefangen, anschließend entgast und bei 4°C unter

Argon gelagert.


5.1.3 Reduzierung der Nickelkontamination durch apparative Veränderungen

Da sowohl der „Sampler Cone“ wie auch der „Skimmer Cone“ der ICP-MS (siehe Abb.

5.1-4) üblicherweise aus Nickel gefertigt sind, waren beide Conen eine Hauptkontami-

nationsquelle für Nickel. Dies äusserte sich in einem hohen Hintergrundsignal für

Nickel.

Abbildung 5.1-2: Aufbau des Conensystems eines ICP-MS [167]

Sowohl der „Sample Cone“ als auch der „Skimmer Cone“ wurden durch Conen aus

Platin ersetzt, wodurch die Blindwerte bezüglich Nickel um den Faktor 10 reduziert

werden konnten.

Die Abbildung 5.1-3 zeigt eine Gegenüberstellung von zwei Elektroferrogrammen eines

Cytosols derselben Probe. Bei dieser Probe handelte es sich um eine normale Gewebe-

probe des humanen Darmtrakts. Die Detektion des Nickels erfolgte auf der Masse 60,

da das Hauptisotop 58 des Nickels durch starke Interferenzen (NaCl, Ar-O, Ar-O-H) ge-

stört wurde [171]. Anhand der beiden an den y-Achsen ablesbaren Blindwerte wird die

Reduzierung derselben bei Einsatz der Platinconen deutlich.

Bei Verwendung der Nickelconen war eine Nickelspeziesanalyse des Cytosols nicht

möglich, da der Untergrundwert für Nickel zu hoch war, sodass mögliche Nickelsignale

vom Untergrund überlagert wurden. Dagegen wurde durch den Einsatz der Platinconen

der Untergrundwert für Nickel so minimiert, dass gut aufgetrennte Peaks erkennbar

waren.


Abbildung 5.1-3: Gegenüberstellung von zwei Elektroferrogrammen eines humanen Gewebe-

cytosols unter Einsatz verschiedener Conen; Detektion 60Ni

5.2 Optimierung der CE-Trennbedingungen mithilfe eines gemisch-

ten Metallothionein-Standards

Die Optimierung der kapillarelektrophoretischen Trennbedingungen wurde mithilfe

einer Standardmischung aus Cadmium beladenen Metallothionein (MT) der Isoform I

(MT I) und der Isoform II (MT II) durchgeführt. Die Wahl eines Standards für die Op-

timierung der Trennung fiel auf Metallothionein, da keine Nickel beladenen

Proteinstandards, sowohl auf dem amerikanischen wie auf dem europäischen Markt

kommerziell erhältlich waren. Alternativ wurde ein Standard gesucht, dessen

Eigenschaft wie Ladung, Größe und molare Masse ungefähr den im Cytosol der

Humanproben enthaltenen Nickelspezies entsprach. Die Abbildung 5.2-1 illustriert

einen Vergleich der Elektroferrogramme des ausgewählten Standards mit einem Cytosol

einer Humanprobe. Bei dieser Probe handelt es sich um das Cytosol einer malignen

Probe des Colon-transversums.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

(Pt-C

onen

)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

(Ni-C

onen

)

mit Pt-Conenmit Ni-Conen


Abbildung 5.2-1: Vergleich eines Elektroferrogramms eines Cd-beladenen Metallothioneinge-

misches mit einem Elektroferrogramm eines Cytosols von einer malignen Kolongewebeprobe

unter optimierten Bedingungen

Wie der Vergleich zeigt, liegt nur der Peak 2 im Bereich der MT´s. Da die beiden ande-

ren Peaks nicht wesentlich frühere bzw. spätere Migrationszeiten besitzen, kann man

davon ausgehen, dass das MT-Gemisch für die Optimierung der Kopplungsparameter

für die Nickelspeziesanlayse in Cytosolen humaner Kolongewebeproben geeignet ist.

Die Zuordnung der Peaks des MT-Standards wurde aus der Literatur entnommen [132].

Im Folgenden werden nur einige der Optimierungsschritte näher beschrieben.

Für die Optimierungsversuche wurden CE Quarzkapillaren mit einem Außendurchmes-

ser von 360 µm benutzt (dieser Außendurchmesser ergibt keine Probleme im Interface).

Die Kapillaren wurden vor jeder Messung neu konditioniert. Sie wurden jeweils 5 min

mit einer KOH-Lösung (0,1 mol/L), 3 min mit Wasser und anschließend 5 min mit

Laufpuffer (Tris-HNO3-Puffer) gespült. Nach einer Wartezeit von 3 min wurde die MT-

Standardlösung hydrodynamisch (10 mbar 2 s lang) in die Kapillare injiziert und eine

Spannung von 30 kV an die Kapillare angelegt. Die Flussrate des Interfaces bzw. des

Zerstäubers betrug bei einem Zerstäubergasfluss von 0,9-1,1 mL/min 8,5 µL/min. Die

Make-up Flüssigkeit bestand aus einem HNO3-NH3-Gemisch (10 mmol/L + 5 µgGe/L)

mit einem pH-Wert von 7,4. Das ICP-MS arbeitete bei einer Massenauflösung von 300

(niedrige Auflösung) mit einer RF-Leistung von 1075 W bei einem Hilfsgasfluss von

0,9 L/min. Der Plasmagasfluss wurde auf 15 L/min eingestellt. Die Dauer eines

Massenscans lag bei 800 ms.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

100 200 300 400 500 600 700 800

Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e74

0

5

10

15

20

25

cps

Cd

114

/ cps

Ge

74

Probe 5NormalgewebeCd-MT-Mix Standard

MT 1MT 2

Peak 1Peak 2

Peak 3Ni 2+


5.2.1 Optimierung der Kapillarentemperatur

Die Temperatur der Kapillare besitzt einen Einfluss auf die Viskosität, auf den Elek-

troosmotischer Fluss (EOF), auf die Diffusion, auf den Strom, auf die Ionenstärke und

damit auf die Mobilität der Analyten [173]. Durch das angelegte elektrische Feld wird in

der Kapillare ein Stromfluss induziert. Die dadurch entstehende Wärme (Joulesche

Erwärmung) kann ausschließlich über die Kapillarwand abgeführt werden. Aus diesem

Abtransport der Wärme resultiert ein radialer Temperaturgradient (verläuft von innen

nach außen, siehe Abbildung 5.2-2) und damit verbundener Viskositätsgradient (2-3%

pro °C) senkrecht zur elektrophoretischen Migration der Analyten im Puffersystem

[173]. Beide Gradienten bewirken ein parabolisches Profil des Trennpuffers.

Abbildung 5.2-2: Verlauf des Temperaturgradienenten innerhalb einer Kapillare [173]

Die Kühlung der Kapillare verstärkt zwar den Temperaturgradienten, aber so wird ein

Ausgasen des Trennpuffers und die damit verbundene Unterbrechung des Stroms ver-

hindert. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Unterdrückung von lokalen Überhitzungen

in der Kapillare, was bei Proteinen zu Denaturierung führen kann [173].

Die Temperatur der Kapillare wurde in 5°C Schritten von 10°C bis 25°C variiert (die

restlichen Parameter sind in Tabelle 5.2-1 aufgelistet).


Tabelle 5.2-1: Gewählte Messparameter für die Optimierung der Kapillarentemperatur

Parameter Einstellungen

Kapillare Quarz, Länge: 70 cm

Innendurchmesser: 75 µm

Puffer Tris-HNO3-Puffer; pH-Wert: 7,4;

Konzentration: 20 mmol/L

Angelegte Spannung 30 kV

Probenaufgabe 20 mbar×s

Bei einer Temperatur von 15°C wurde die beste Trennung des MT-Gemisches erzielt.

Bei dieser Temperatur war das aus Abbildung 5.2-1 schon bekannte

Aufspaltungsmuster des Standards erkennbar. Die entstehende Joulesche Wärme wurde

bei dieser Einstellung gut abgeführt und die Effizienzverluste der Trennung durch

Temperatureffekte innerhalb der Kapillare konnten als sehr gering eingestuft werden.

Bei niedrigeren Temperaturen nahm die Viskosität des Puffers zu und gleichzeitig sank

auch der EOF (elektroosmotischer Fluss). Eine direkte Folge war eine Verlängerung der

Retentionszeiten und eine Verringerung des Injektionsvolumens, was sich in der

geringeren Signalhöhe deutlich zeigte. Ab einer Temperatur von 20°C wurde der

Stromverlauf zunehmend instabiler und der Puffer begann auszugasen, was sich im

Zusammenbruch des Stromes äußerte.

Die optimale Temperatur der Kapillare unter den beschriebenen Bedingungen lag bei

15°C und wurde bei den weiteren Optimierungsschritten und den späteren Messun-

gen beibehalten.

5.2.2 Optimierung der Kapillarenlänge

Die Kapillarenlänge beeinflusst neben der Temperatur der Kapillare und dem

Injektionsvolumen auch den Strom. Der Strom nimmt mit zunehmender Länge der

Kapillare ab [173]. Zum Einsatz kamen Kapillaren mit verschiedenen Längen (55 cm, 70

cm und 100 cm). Kürzere Kapillaren als 55 cm konnten bei der eingesetzten CE / ICP-

MS Kopplung nicht verwendet werden, da der Abstand von der Kathode zum Interface

Mindestlänge verlangt [130].

Beim Einsatz der Kapillarlängen mit einer Länge von 55 bzw. 70 cm konnte eine ver-

gleichbar gute Auftrennung der MT-Isoformen erzielt werden, wobei die Retentions


zeiten beim Einsatz der 55 cm Kapillare signifikant kürzer waren als bei den beiden

anderen Längen (70 bzw. 100 cm). Ein Problem bei der Verwendung kürzerer Kapilla-

ren lag in der Zunahme der Stromstärke. Als Folge des erhöhten Stromes konnte eine

Temperaturerhöhung innerhalb der Kapillare beobachtet werden, was sich wiederum

auf die Stabilität des Stromes negativ auswirkte (Ausgasen des Puffers) [173]. Ferner

konnte häufig ein Stromzusammenbruch bei der Verwendung der 55 cm Kapillare regi-

striert werden. Bei Einsatz der 100 cm Kapillare war die Peakverbreiterung nachteilig,

die sich negativ auf die Auflösung auswirkte.

Daher wurde im weiteren Verlauf eine 70 cm Kapillare für die elektrophoretische

Trennung der Cytosolspezies eingesetzt.

5.2.3 Optimierung des Innendurchmessers der Kapillare

Bei zunehmendem Innendurchmesser der Kapillare steigt neben Temperatur und EOF

auch die Stromstärke bei konstanter Spannung an. Die Folgen einer solchen Zunahme

wurden bereits unter Punkt 5.2.1 und 5.2.2 beschrieben.

Für diesen Optimierungsschritt wurden zwei verschiedene Innendurchmesser der Ka-

pillare (50 µm und 75 µm) gewählt. Die Verwendung der Kapillare mit einem Innen-

durchmesser von 50 µm wirkte sich positiv auf den Abtransport der Jouleschen Wärme

aus. Nachteilig wirkte sich die geringe Langzeitstabilität aus. Vor allem häufiges Kon-

ditionieren der Kapillare führte zu deren Bruch. Obwohl der Wärmeabtransport bei der

Verwendung der Kapillare mit einem Innendurchmesser von 75 µm geringer war,

konnte eine ausreichende Trennung des MT-MIX Standards (MT I und MT II) erreicht

werden. Diese war vergleichbar mit der Auftrennung, die mit einer Kapillare mit einem

Innendurchmesser von 50 µm erzielt wurde.

Aus diesen Gründen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit eine Kapillare mit einem

Innendurchmesser von 75 µm eingesetzt.


5.2.4 Optimierung der Konzentration des Puffers

Der Puffer übernimmt bei der kapillarelektrophoretischen Trennung drei wichtige

Funktionen:

1. Der Puffer muss für die pH-Wert-Konstanz sorgen (gute Pufferkapazität)

2. Der Puffer sollte mögliche Überladungseffekte durch zu hohe Konzentrationen mi-

nimieren

3. Der Puffer sollte noch einen EOF zulassen, der schnelle Analysenzeiten erlaubt,

wobei die Bandenverbreiterung durch thermische Effekte verhindert werden soll

[173].

Auch hier musste wieder ein Kompromiss zwischen Joulescher Erwärmung,

Bandenverbreiterung durch thermische Konvektion, EOF, Analysenzeiten,

Wandabsorption und Elektrodispersion gefunden werden. Grundsätzlich sollte die

Konzentration der Puffer-ionen größer sein als die Konzentration der Ionen in der

Probenlösung [173].

Es wurden zwei verschiedene Pufferkonzentrationen (20 mmol/L und 50 mmol/L) gete-

stet. Unabhängig von der Pufferkonzentration konnte eine Auftrennung beider MT-Iso-

formen (MT I und MT II) erzielt werden. Die Analysenzeiten stiegen erwartungsgemäß

bei der Verwendung des Puffers mit der höheren Konzentration im Vergleich zu dem

mit der niedrigen Konzentration an. Ein weiteres Problem der höheren Pufferkonzentra-

tion lag im Anstieg der Stromstärke. Eine bessere Trennung der beiden MT-Isoformen

konnte bei einer Pufferkonzentration von 20 mmol/L erreicht werden. Dieses wird in

den beiden folgenden Abbildungen (5.2-3; 5.2-4) verdeutlicht.

Abbildung 5.2-3: Elektroferrogramm des MT-Gemisches bei einer Pufferkonzentration von 20

mmol/L


Abbildung 5.2-4: Elektroferrogramm des MT-MIX Standards mit einer Pufferkonzentration von

50 mmol/L

Bei diesen und den folgenden Optimierungsschritten wurde auf die Normierung des

Cadmium-Signals auf das Germanium-Signal verzichtet, da hier nicht die Intensität son-

dern einzig die Trennleistung unter den unterschiedlichen Bedingungen beurteilt wer-

den musste.

Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde eine Pufferkonzentration von 20 mmol/L ge-

wählt.

5.2.5 Optimierung des pH-Wertes des Puffers

Der pH-Wert des Puffers beeinflusst die auf elektrophoretische Migration beruhende

Trennung, die durch den EOF überlagert wird. Die Größe des EOFs hängt wiederum

von der Dissoziation der Oberflächensilanolgruppe ab. Auf der anderen Seite wird die

Beweglichkeit der Analytionen durch ihren Dissoziationsgrad im Puffersystem be-

stimmt. Beide Dissoziationsgrade werden durch den pH-Wert des Puffers geregelt,

sodass eine direkte Beziehung zwischen der elektrophoretischen Trennung und dem pH-

Wert des Puffers besteht [173].

Um den Einfluss des pH-Wertes auf die Trennung von amphoteren Verbindungen, wie

in diesem Fall Proteine, festzustellen, wurde der Puffer mit drei verschiedenen pH-

Werten (6,9; 7,4 (entspricht dem physiologischen pH-Wert) und 9,0) geprüft. Die ent-

sprechenden Elektroferrogramme zeigt die Abbildung 5.2-5 .


Abbildung 5.2-5: Einfluss des pH-Wertes des Puffers auf die elektrophoretische Trennung eines

Cadmium beladenen MT-MIX Standards

Wie den Elektroferrogrammen in Abb.5.2-5 zu ersehen ist, wurde die beste

Auftrennung des MT-MIX Standards bei einem pH-Wert von 6,9 erzielt. Die

Analysenzeiten lagen dabei um ca. 100 s höher als bei einem pH-Wert von 7,4. Bei

einem pH-Wert von 9,0 war keine deutliche Trennung von MT I und MT II von ihren

Subisoformen zu erkennen. Grund dafür ist die Zunahme des EOF mit steigendem pH-

Wert, wobei negativ geladene Analytionen wie MT I und MT II schneller durch die

Kapillare migrieren. Die schnelle Migrationszeit wirkt sich negativ auf die Trennung

der Isoformen aus.

Für die Trennung eines solchen MT-MIX Standards wäre ein saurer pH-Wert von 6,9

eine gute Wahl, da bei noch vertretbaren Analysenzeiten eine sehr gute Trennung erzielt

wird.

Da im weiteren Verlauf mit Cytosolproben humaner Herkunft gearbeitet wurde, sollte

der physiologische pH-Wert von 7,4 beibehalten werden, um die native Form der im

Cytosol enthaltenen Spezies zu erhalten.


5.2.6 Optimierte Messparameter für die CE / ICP-MS Kopplung

Die Ergebnisse der Optimierungsversuche sind in der Tabelle 5.2-2 aufgelistet.

Tabelle 5.2-2: Auflistung der optimierten Parameter der CE / ICP-MS Kopplung

Parameter der Kapillarelektrophorese

Kapillare

Quarz, Länge: 70 cm

Innendurchmesser: 75 µm

Aussendurchmesser: 360 µm

Konditionierung der Kapillare 5 min 0,1 mol/L KOH; 3 min H20

5 min Puffer; 3 min Warten

Puffer Tris-HNO3-Puffer; pH-Wert: 7,4


Temperatur der Kapillare 15°C

Angelegte Spannung 30 kV

Probenaufgabe für Standardlösungen 20 mbar×s = 2,2 nL

Interface

Flussrate 8,5 µL/min

Interface-Puffer (Make-up Lösung) HNO3-NH3; 10 mmol/L;

pH 7,4; 5 µgGe/L

ICP-MS

RF-Leistung 1075 W

Plasmagasfluss 15 L/min

Hilfsgasfluss 0,9 L/min

Zerstäubergasfluss 0,9-1,1 L/min

Dauer eines Massenscans 800 ms

Massenauflösung 300


5.3 Vergleich zweier unterschiedlicher Cytosolherstellungsverfahren

Um die unter Punkt 4.2 beschriebenen Herstellungsverfahren zur Cytosolgewinnung aus

Gewebeproben miteinander vergleichen zu können, wurde eine Probe mit größerem

Probenvolumen jeweils mechanisch und mittels Ultraschall aufgeschlossen. Die erhalte-

nen Cytosole wurden unter gleichen Bedingungen mithilfe der CE / ICP-MS Kopplung

analysiert. Die Abbildung 5.3-2 zeigt die Elektroferrogramme in Abhängigkeit von dem

Herstellungsverfahren des Cytosols. Die Intensität der Nickelspezies-Signale wurde auf

die Intensität des Signals von 74Ge normiert.

Abbildung 5.3-1: Elektroferrogramme von Nickelspezies in Abhängigkeit von der Cytosolge-

winnung

Aus den Elektroferrogrammen ist ein signifikanter Unterschied bezüglich der Effizienz

des Zellaufschlusses zur Nickelspeziesanalyse erkennbar. Bei der Behandlung der Probe

mit dem Potter-Eveljhem Homogenisator (mechanischer Zellaufschluss) waren im

Elektroferrogramm drei deutliche Peaks zu erkennen. Im Gegensatz dazu wies das

Elektroferrogramm des Cytosols, welches mit dem Ultraschalldesintegrator gewonnen

wurde, keine deutlichen Peaks auf.

Dieses Ergebnis wurde durch TXRF Messungen beider Cytosole untermauert. Die Ab-

bildung 5.3-2 zeigt einen Vergleich der Gesamtnickelkonzentration der Cytosole, die

auf die beiden verschiedenen Arten hergestellt wurden.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

mech. Zellaufschluss

Zellaufschluss mittelsUltraschall

Ni 2*

Spezies 1

Spezies 2


Abbildung 5.3-2: Vergleich der Gesamtnickelkonzentration im Cytosol in Abhängigkeit von der

verwendeten Aufschlussmethode (mechanisch und mittels Ultraschall)

Mithilfe des mechanischen Zellaufschlusses es möglich Darmgewebe (Muskelgewebe:

hart bzw. feste Konsistenz) effizienter aufzuschließen als mit dem Ultraschalldesinte-

grator. Letzterer wird häufig bei weichen Gewebearten wie Leber eingesetzt. Ein

weiterer Vorteil des mechanischen Zellaufschlusses ist die effiziente Matrixzerstörung,

was sich positiv auf die elektrophoretische Trennung auswirkt (kürzere Analysenzeiten,

bessere Auftrennung der Peaks). Auch zur Analyse von Kupfer-, Zink- und Bleispezies

ist der mechanische Zellaufschluss geeignet (siehe Anhang).

Alle weiteren Cytosole wurden mechanisch aufgeschlossen.

5.4 Optimierung der Probenvorbehandlung

Hochmolekulare Zellbestandteile des Cytosols können die elektrophoretische Trennung

negativ (z.B. durch Wandadsorption) beeinflussen. Um diese Bestandteile aus dem

Cytosol zu entfernen, kann das Cytosol mit organischen Lösungsmitteln versetzt wer-

den. Die hochmolekularen Bestandteile denaturierten durch die Zugabe des organischen

Lösungsmittels und werden ausgefällt, wobei die niedermolekularen Bestandteile

unverändert im Cytosol erhalten bleiben [177].

Acetonitril wurde bereits erfolgreich als Denaturierungsmittel angewendet [110/178]. Um

den Einfluss der Abtrennung höhermolekularer Cytosolbestandteile auf die elektropho-

retische Trennung zeigen zu können, wurde ein mit Acetonitril behandeltes und ein un

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Kon

zent

ratio

n/ µ

g/L

Cytosol nach mechanischemAufschluss

Cytosol nachUltraschalldesintegration

Probe

Cytosol nach mechanischemAufschlussCytosol nachUltraschalldesintegration


behandeltes Cytosol elektrophoretisch getrennt. Für die Fällung wurde jeweils ein Ali-

quot eines Cytosols einer nicht malignen und einer malignen Darmprobe im Verhältnis

1:1 mit Acetonitril versetzt [180]. Nach einer Reaktionszeit von 5 Minuten wurden die

Proben kurz geschüttelt und anschließend 30 Minuten bei 4°C und 25.000g zentrifu-

giert. Das Zentrifugat wurde abpipettiert und unter Argon bis zur Messung bei –25 °C

gelagert. Alle vier Cytosolproben wurden unter den optimierten Bedingungen (siehe

Tabelle 5.2-7) auf die CE gegeben und Nickel mit dem ICP-MS auf der Masse 60 de-

tektiert.

Die resultierenden Elektroferrogramme sind in Abbildung 5.4-1 bis 5.4-2 dargestellt.

Die Abbildung 5.4-1 zeigt die Elektroferrogramme der beiden Cytosole (maligne und

nicht maligne Probe) vor der Acetonitrilfällung und die Abbildung 5.4-2 nach der

Acetonitrilfällung.

Abbildung 5.4-1: Elektroferrogramme von zwei Cytosolen (NG und TG) vor der

Acetonitrilfällung

Abbildung 5.4-2: Elektroferrogramme von zwei Cytosolen (NG und TG) nach der

Acetonitrilfällung

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

Cytosol NG vor AcetonitrilfällungCytosol TG vor Acetonitrilfällung

Ni2+

Ni Spezies I

Ni Spezies II

Ni Spezies III

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

Cytosol NG nach AcetonitrilfällungCytosol TG nach Acetonitrilfällung

Ni2+

Ni Spezies I

Ni Spezies II

Ni Spezies III


In den Abbildungen 5.4-1 bis 5.4-2 ist erkennbar, dass durch die Acetonitrilfällung eine

signifikante Verkürzung der Analysenzeiten erreicht werden kann. Aufgrund der

Matrixabtrennung und der damit verbundenen geringen Wandadsorptionseffekte können

auch die Halbwertsbreiten der Peaks verringert werden [178/182]. Diese Effekte können

vor allem bei der Trennung der Nickelspezies im Cytosol der normalen Probe

beobachtet werden. Hingegen wird die Trennung der Nickelspezies im Cytosol der

malignen Probe eher negativ beeinflusst (schlechtere Auftrennung). Es kann trotzdem

eine klare Trennung der drei Spezies erreicht werden.

Aus den Abbildungen 5.4-1 und 5.4-2 kann aber nicht der Hauptvorteil der Acetonitril-

fällung abgeleitet werden. Dieser liegt in der Reduktion der Leitfähigkeit durch die

Matrixabtrennung, was sich positiv auf die Stromstärke und damit auf die Joulesche

Erwärmung auswirkt. Ein weiterer Vorteil der Fällung ist die Reduzierung der

Viskosität des Cytosols. Die Messungen der beiden Cytosole ohne Vorbehandlung

mussten aufgrund von Stromzusammenbrüchen oder Zerstäuberverstopfungen häufig

abgebrochen werden.

Um sicher zu gehen, dass nur die hochmolekularen Bestandteile des Cytosols denaturie-

ren [110/178], wurde die SEC / ICP-MS Kopplung (Optimierung siehe Punkt 5.5) zur

Verifizierung der Ergebnisse eingesetzt. Hierzu wurde ein Aliquot eines Cytosols un-

behandelt und eins nach der Acetonitrilfällung auf die SEC-Säule gegeben und Nickel

mithilfe des ICP-MS elementspezifisch detektiert. Um eine Vergleichbarkeit der Chro-

matogramme zu gewährleisten, wurde das unbehandelte Cytosol nochmals 1:1 mit

Puffer verdünnt, damit keine Verdünnungsunterschiede zwischen unbehandeltem Cyto-

sol und Cytosol nach der Acetonitrilfällung bestand. In der nachfolgenden Abbildung

5.4-3 sind die SEC-Chromatogramme gegenübergestellt.


Abbildung 5.4-3: SEC / ICP-MS Chromatogramme eines Cytosols vor und nach der Acetoni-

rilfällung

Mittels der SEC / ICP-MS Chromatogramme konnte gezeigt werden, dass bei der Ace-

tonitrilfällung nur die hochmolekularen Bestandteile des Cytosols denaturieren und aus-

fallen [178]. Beide Chromatogramme unterscheiden sich nur im ersten Drittel des Chro-

matogramms. In diesem Zeitintervall konnte ein deutlicher Nickelpeak vor der Fällung

(grün) detektiert werden. Hingegen nach der Fällung (blau) war kein ausgeprägter Peak

mehr zu erkennen. Da bei der SEC die Trennung ausschließlich aufgrund der unter-

schiedlichen Größe der Analyten (je größer der Analyt, desto kürzer die Analysezeit)

beruht [30], ist das Fehlen des Nickelpeaks, im Bereich von 1000-2000 Sekunden ein

klares Indiz, dass die hochmolekularen Bestandteile des Cytosols abgetrennt wurden.

Da sich die beiden Chromatogramme im weiterem Verlauf nicht unterschieden, be-

wirkte die Acetonitrilfällung keine Veränderung bei den niedermolekularen Bestandtei-

len des Cytosols.

Aus all diesen Gründen wurde im weiterem Verlauf bei allen Cytosolen, die mithilfe

der CE / ICP-MS Kopplung analysiert wurden, eine Matrixabtrennung mittels Ace-

tonitrilfällung durchgeführt, während bei der SEC / ICP-MS Kopplung auf eine Ab-

trennung höhermolekularer Cytosolbestandteile verzichtet werden konnte.

In Abbildung 5.4-4 ist die gesamte Probenvorbereitung der Cytosolherstellung zur

Nickelspeziesanalyse mithilfe der CE / ICP-MS und der SEC / ICP-MS Kopplung gra-

phisch dargestellt.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t cps

(Ni 6

0) /

vor F

ällu

ng

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

Inte

nsitä

t cps

(Ni 6

0) /

nach

Fäl

lung

vor Fällungnach Fällung


Abbildung 5.4-4: Probenvorbehandlung zur Nickelspeziesanalyse mittels CE / ICP-MS und

SEC / ICP-MS Kopplung

Normales Gewebe / malignes Gewebe

Zugabe von Tris-HNO3-Puffer zum excisierten Gewebe

im Verhältnis 1:2, Ultra-Turraxbehandlung bei 4°C

unter Schutzgasatmosphäre

Mechanischer Zellaufschluss bei 4°C unter

Schutzgasatmosphäre

Zentrifugation mit 100.000g (Probe 1-5) bzw. mit 25.000g

(Probe 10-15) bei 4°C, Dauer 99 min

Cytosol

Zugabe von Acetonitril im Verhältnis 1:1;

Inkubationszeit von 5 Minuten

Zentrifugation mit 25.000g

bei 4 °C; Dauer 45 min

Nachbehandeltes Cytosol

SEC / ICP-MS

CE / ICP-MS


5.5 Trennbedingungen der SEC-Trennung

Die Bedingungen zur SEC-Trennung der cytosolischen Bestandteile wurden weitestge-

hend aus der Literatur übernommen [109-110/184], da diese in den ersten Vorversuchen

zu guten Ergebnissen geführt hatten. Daher wurden nur zwei Messparameter optimiert,

nämlich der Einfluss der Temperatur und der Einfluss eines Antioxidationsmittels auf

die SEC Trennung (Trennschärfe bzw. Retentionszeiten) untersucht.

5.5.1 Einfluss der Temperatur auf die Stabilität des Cytosols während der SEC-

Trennung

Da die Analysenzeit eines SEC-Chromatogramms (bis 7000 s) wesentlich länger ist als

die eines CE-Elektroferrogramms (ca. 800 s), besteht die Gefahr, dass sich während des

Trennvorgangs Bestandteile des Cytosols verändern können. Zur Klärung dieses Effekts

wurde jeweils ein Aliquot eines Cytosols einer malignen Probe bei 5 °C und bei 20°C

Säulentemperatur auf die SEC-Säule gegeben und Nickel (Masse 60) online mithilfe

des ICP-MS detektiert. Bei der SEC konnte keine Normierung durchgeführt werden, da

kein interner Standard nach der Trennung hinzugeführt werden konnte.

Abbildung 5.5-1: SE-Chromatogramme eines Cytosols in Abhängigkeit von der Säulentempe-

ratur

Wie die Abbildung 5.5-1 verdeutlicht, sind keine signifikanten Unterschiede in den bei-

den Chromatogramme erkennbar. Bei einer Temperatur von 20°C war eine deutlichere

Auftrennung der Peaks als bei einer Temperatur von 5°C zu erkennen. Das lässt den

Schluss zu, dass die Nickelspezies bei 20°C während der Trennung stabil waren.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t / c

ps (N

i60)

bei 20°Cbei 5 °C


Da die Temperatur keinen Einfluss auf die Stabilität und auf die Trennung der

Nickelspezies hatte, wurden im weiteren Verlauf der Arbeit die SEC-Trennung bei

20°C durchgeführt.

Da die gesamten Arbeiten in einem klimatisierten (auf 20°C) Reinraum der Stufe 1000

durchgeführt wurden, konnte auf eine Kühlung der SEC-Säule verzichtet werden.

5.5.2 Einfluss eines Antioxidationsmittels auf die SEC-Trennung

Wie schon unter 5.5 erwähnt wurde, dauert eine SEC-Trennung bis zu 7000 Sekunden.

Aus diesem Grund stellte sich die Frage, ob alle Bestandteile eines Cytosols unter

diesen Bedingungen oxidationsstabil sind oder ob der Probe ein Antioxidationsmittel,

wie DTT (Dithiotreitol) hinzugefügt werden muss. Die Problematik ist, dass ein solches

Antioxidationsmittel auch als Komplexbildner fungieren kann und so lose gebundene

Metallionen von den Bindungspartnern entfernen kann.

Das Cytosol eines malignen Gewebes wurde folgendermaßen vorbereitet.

1. Cytosol und Tris-HNO3-Puffer ohne DTT Zusatz

2. Cytosol ohne DTT Zusatz und Laufpuffer mit DTT Zusatz (5 mmol/L)

3. Cytosol und Laufpuffer mit DTT Zusatz (5 mmol/L)

Abbildung 5.5-2 zeigt die drei erhaltenen Chromatogramme (es handelt sich hier zur

besseren Vergleichbarkeit um eine offset-Darstellung der Elektroferrogramme)

Abbildung 5.5-2: SE-Chromatogramme eines Cytosols in Abhängigkeit von der Zugabe eines

Antioxidationsmittels

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Puffer und Probe ohne DTT

Puffer ohne / Probe mit DTT

Puffer und Probe mit DTT


Die drei Chromatogramme in Abbildung 5.5-2 zeigen keine signifikanten Unterschiede.

Die Anzahl der Signale waren in alle Chromatogrammen gleich, wobei sich die Intensi-

täten etwas unterschieden.

Die Trennung der Nickelspezies war ohne Zugabe von DTT am besten, sodass für die

weitere Probenvorbereitung auf die Zugabe des Antioxidationsmittels verzichtet

wurde.

Ein weiterer Grund für den Verzicht auf ein Antioxidationsmittel war, dass jede weitere

eingesetzte Chemikalien eine weitere Kontaminationsquelle darstellen kann.

5.5.3 Zusammenfassung der Trennbedingungen der SEC / ICP-MS Kopplung

In Tabelle 5.5-1 sind die optimierten Messparameter für die SEC / ICP-MS Kopplung

aufgelistet.

Tabelle 5.5-1: Optimierte Messparameter für die SEC / ICP-MS Kopplung

Parameter der SEC

Säule

Hi Load 16/60 Superdex 75 prep grade

Länge 60 cm

Innerer Durchmesser 1,6 cm

Säulentemperatur 20°C

mobile Phase Tris-HNO3-Puffer; pH-Wert: 7,4


Probenaufgabe 500 µL über eine Probenschleife

Flussrate 2,0 mL /min.

Zerstäuber (Meinhard)

Flussrate11 400 µL / min.

Zerstäubergasfluss 0,9-1,1 L/min

Temperatur 4°C

ICP-MS

RF-Leistung 1075 W

Plasmagasfluss 15 L/min

Hilfsgasfluss 0,9 L/min

Dauer eines Massenscans 8,4 s

Massenauflösung 300

11 Wurde durch den eingebauten Split von 2 mL/min auf 400 µL reduziert

Nickelspeziesanalyse im Cytosol kolorektaler Humangewebeproben 54

6 Nickelspeziesanalyse im Cytosol kolorektaler Humange-

webeproben

Im weiteren Verlauf der Arbeit werden alle durchgeführten Analysen und Speziesanaly-

sen beschrieben und die Ergebnisse der einzelnen Messungen vorgestellt und diskutiert.

Die Gesamtnickelgehalte der Cytosole wurde mithilfe der TXRF bestimmt. Neben der

Bestimmung der Gesamtproteingehalte werden die Ergebnisse der Nickelspeziesanalyse

mittels CE / ICP-MS und SEC / ICP-MS zusammengefasst und erörtert.

6.1 Bestimmung der Gesamtnickelgehalte im Cytosol mithilfe der

TXRF

Die Gesamtnickelkonzentration der Cytosole wurde sowohl vor als auch nach der Ace-

tonitrilfällung mithilfe der TXRF bestimmt (Durchführung siehe Punkt 4.3).

In Abbildung 6.1-1 und 6.1-2 sind die Ergebnisse der TXRF-Messungen für Nickel dar-

gestellt. Die Zahlen, die über den Balken zu sehen sind, geben den Wert der

gemessenen Nickelkonzentration in µg/L an (siehe Anhang: TXRF-Messungen). Die

Proben 6-9 wurden mittels TXRF untersucht, da bei diesen Proben nur Tumorproben

vorlagen (siehe Tabelle 4.1-1).


Abbildung 6.1-1: Ergebnisse der TXRF-Messung für die Cytosole vor der Acetonitrilfällung

Abbildung 6.1-2: Ergebnisse der TXRF-Messung für die Cytosole nach der Acetonitrilfällung

(blau = Cytosol normal Gewebe (NG); rot = Cytosol malignes Gewebe (TG); grün =

Cytosol entzündetes Gewebe (entz.G.))

12,724,7 35,9

104,3

42,8

108,6

43,2

92,4

186,4

146,7

107,6117,4

72,9

274,8

94,0

445,2

92,0121,6

44,754,733,131,9

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

350,0

400,0

450,0

500,0

Kon

zent

ratio

n (N

i) / µ

g/L

NG

1TG

1N

G 2

TG 2

NG

3TG

3N

G 4

entz

.G 4

NG

5TG

5

NG

10

TG 1

0N

G 1

1TG

11

NG

12

TG 1

2N

G 1

3TG

13

NG

14

TG 1

4N

G 1

5TG

15

Probe

12,417,4 11,7

46,9

19,324,119,635,0

90,7

54,5

29,036,417,4

94,1

36,3

259,1

41,634,9

15,517,413,7 9,6

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

Kon

zent

ratio

n (N

i) / µ

g/L

NG

1TG

1N

G 2

TG 2

NG

3TG

3N

G 4

entz

.G 4

NG

5TG

5

NG

10

TG 1

0N

G 1

1TG

11

NG

12

TG 1

2N

G 1

3TG

13

NG

14

TG 1

4N

G 1

5TG

15

Probe


6.1.1 Diskussion der Ergebnisse

Beim Vergleich der beiden Messreihen wird deutlich, dass die Nickelkonzentrationen

durch die Denaturierung der hochmolekularen Bestandteile aufgrund der Acetonitrilfäl-

lung zwar reduziert, aber das Verhältnis der Konzentrationen der Tumor- und Normal-

gewebeproben zueinander nicht stark verändert wurden. Dies stimmt mit den durchge-

führten elektrophoretischen und chromatographischen Messungen der Cytosole vor und

nach Acetonitrilfällung überein (siehe Kapitel 5.4 und Abb. 5.4-1 bis 2).

Als allgemeiner Trend der TXRF-Messungen lässt sich festhalten, dass die Nickelkon-

zentration in den Cytosolen der Tumorproben höher liegen als im Cytosol der Normal-

proben. Diese erhöhten Werte lassen sich durch die Störung der normalen Zellwachs-

tumskontrolle während der Karzinogenese erklären. Die Störungen führen zu einer un-

kontrollierten Steigerung der Zellvermehrung, die sowohl zu biochemischen wie auch

physikalischen Veränderungen in der Zelle führen, wodurch zelluläre und histologische

Abnormalitäten und eine Abnahme des Differenzierungsgrades der Tumorzelle bewirkt

werden. Gleichzeitig zeigen Tumorzellen einen gesteigerten Stoffwechsel, der zu einer

übersteigerten Produktion von Proteinen und Enzymen führt, sodass sich die Konzen-

tration möglicher Bindungspartner für Metalle erhöht.

Eine Ausnahme stellt die Probe 5 dar. Bei diesen Cytosolen ist die Nickelkonzentration

im Cytosol des Normalgewebes deutlich größer als in dem entsprechenden Cytosol des

malignen Gewebes. Ein möglicher Grund könnte hier das fortgeschrittene Stadium (T4)

des Tumors sein.

Bei den Proben 10, 14 und 15 sind keine großen Unterschiede in den Nickelkonzentra-

tionen zu erkennen. Ein möglicher Grund könnte auch hier das Stadium des Tumors

sein. Bei Probe 10 handelt es sich um ein Adenom, also einer Vorstufe des Karzinoms.

Das unkontrollierte Zellwachstum befindet sich im Anfangsstadium, sodass noch keine

großen Unterschiede in den Nickelkonzentrationen zu erwarten sind. Bei den beiden

anderen Proben befand sich der Tumor in einer recht frühen Phase (T2), sodass auch

hier das unkontrollierte Zellwachstum noch nicht soweit fortgeschritten war, dass große

Unterschiede in den Nickelkonzentrationen zwischen dem Cytosol des Normal- und des

Tumorgewebes zu erwarten waren. Bei Probe 14 dagegen liegt ein undefiniertes Nor-

malgewebe vor. Es könnte sich möglicherweise um adenomatöses Gewebe handeln,

wodurch der geringe Unterschied zwischen den beiden Gewebearten zu erklären wäre.


6.2 Gesamtproteinbestimmung der Cytosole der Proben 1-5

Die Gesamtproteingehalte der Cytosole wurden nach dem in Punkt 4.7 beschriebenen

Verfahren bestimmt. Die Bestimmung wurde nur für die ersten fünf Proben (1-5) durch-

geführt, da nur bei diesen Proben nach der Nickelspeziesanalyse mithilfe der koppelten

Systeme noch genug Cytosol vorhanden war. Die notwendige Kalibrierung wurde mit

Proteinstandardlösungen in Tris-HNO3-Puffer durchgeführt (Werte und Kalibriergerade

siehe Anhang). Die Nachweisgrenze wurde durch zehn Blindwertmessungen abge-

schätzt und lag bei 0,19 ± 0,01 mg/mL Protein.

In Abbildung 6.2-1 sind die Ergebnisse der Proteinbestimmung dargestellt.

Abbildung 6.2-1: Gesamtproteingehalte der Cytosole (Probe 1-5) [164]

6.2.1 Diskussion der Ergebnisse

Die Probe 1, 2 und 5 weisen einen deutlich höheren Proteingehalt im Cytosol des

Tumorgewebes als im Cytosol des Normalgewebes auf. Durch den gesteigerten Stoff-

wechsel der malignen Zellen, steigt gleichzeitig der Gehalt der Proteine im Cytosol. Bei

der Probe 4 liegen fast gleiche Gehalte vor, da es sich bei dieser Probe, wie schon er-

wähnt, um ein entzündetes Gewebe handelte. Die Probe 3 fällt durch umgekehrte Ver-

hältnisse auf. Hier war der Proteingehalt des Cytosols des Tumorgewebes geringer als

im Cytosols des Normalgewebes. Der sehr geringe Gehalt an Proteinen in Probe 2

könnte auf die Probenart zurückzuführen sein. Bei dieser Probe handelte es sich um eine

1,49

2,55

0,29

3,05

6,41

2,54

5,67

6,55

1,35

4,94

0

1

2

3

4

5

6

7

Prot

eing

ehal

t / µ

g/L

NG1 TG1 NG2 TG2 NG3 TG3 NG4 entz.G4 NG5 TG5 Proben


Rektumprobe, im Gegensatz zu den anderen Proben, bei denen es sich um Kolonproben

handelte.

6.3 Nickelspeziesanalyse mithilfe der CE / ICP-MS Kopplung

Die Nickelspeziesanalyse der Cytosole der Proben 1-5 und 10-15 wurden unter den zu-

vor optimierten Bedingungen (siehe Tabelle 5.2-7) mithilfe der CE / ICP-MS Kopplung

jeweils 5 mal durchgeführt. Statt einem Probeaufgabevolumen von 2,2 nL (20 mbar×s)

wurden bei den Cytosolproben 43,4 nL (400 mbar×s) in die Kapillare injiziert, da die

Konzentration der Nickelspezies im Cytosol so gering war, dass nur bei dieser Aufga-

bemenge eine Nickelspeziesanalyse überhaupt möglich war. Wie bereits erwähnt, wurde

der Make-up Flüssigkeit Germanium als interner Standard zugesetzt (siehe Tabelle 5.2-

7). Dies hatte zwei Gründe:

1. Während der Messung kann die Qualität der Zerstäubung kontrolliert werden

2. Es wurden alle Elektropherogramme auf das Germaniumsignal normiert, sodass

eine optimale Vergleichbarkeit der Elektropherogramme gegeben ist.

Jedes Cytosol wurde fünf Mal in die Kapillare injiziert, wobei permanent sowohl der

Strom wie die angelegte Spannung kontrolliert wurde. Es kamen keine Messung zur

Auswertung, bei denen Stromabbrüche oder Zerstäuberprobleme auftraten. Die Variati-

onskoeffizienten der Migrationszeiten der Nickelspezies eines Cytosols lagen zwischen

1-2 %. Die Variationskoeffizienten der Peakflächen der Nickelspezies betrugen 10-

12%, die der Peakflächenverhältnisse dagegen nur 1-2 % (Werte siehe Anhang). Die

Nachweisgrenze der gesamten Kopplung wurde mithilfe von verschieden konzentrierten

Ni2+-Standardlösungen abgeschätzt, da es keine kommerziell erhältlichen Ni-Pro-

teinstandards gab. Die Abschätzung erfolgte aus den Kalibrierdaten mit 3,7 µg/L. Die

Bestimmungsgrenze lag bei 14,7 µg/L. Die relative Verfahrensstandardabweichung

konnte mit 2,4 % ermittelt werden (Werte siehe Anhang).

Die nachfolgenden Abbildungen 6.3-1 bis 3 zeigen ausgesuchte Elektropherogramme

der Nickelspeziesanalyse (alle anderen Elektropherogramme siehe Anhang). Es sind

jeweils die Elektropherogramme von zwei Cytosolen (Normalgewebe (NG) /

Tumorgewebe (TG)) nach Acetonitrilfällung einer Probe in einer Abbildung

zusammengefasst.


Abbildung 6.3-1: Elektropherogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 3


Abbildung 6.3-3: Elektropherogramme der Cytosole (NG/entz.G) der Probe 4

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

NGentz.G Spezies II

Ni 2+

Spezies I

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74 NG

TG

Ni 2+

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

100 200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

NGTG

Ni 2+

Ni-Spezies INi-Spezies II

Ni-Spezies III


6.3.1 Auswertung und Aussage der Speziesanalyse

Bei genauer Betrachtung der Abbildung 6.3-1 (Probe 3) können keine qualitativen Un-

terschiede hinsichtlich der Nickelspezies im Cytosol des Tumor- bzw. des Normalge-

webes festgestellt werden. In beiden Cytosolen konnten neben freien Nickel-Ionen zwei

weitere Nickelspezies (I und II) detektiert werden. Bei dem ersten Peak in beiden Elek-

tropherogrammen handelt es sich um freie Ni2+-Ionen. Zur Identifizierung dieses Peaks

wurde eine Nickelstandardlösung (20 µg/L in Tris-HNO3-Puffer bei pH 7,4) vermessen.

Die Migrationszeit von Ni2+ stimmt nahezu mit der Zeit des ersten Peaks im

Elektropherogramm des Cytosols überein (siehe Abb. 6.3-4).

Abbildung 6.3-4: Elektropherogramme einer Ni-Standardlösung (20 µg/L) und eines Cytosols

der Probe NG 3

Die Zuordnung der Peaks zu den Spezies I und II gestaltet sich sehr schwierig, da wie

schon in Kapitel 5 erwähnt wurde, keine kommerziellen Nickelproteinstandards erhält-

lich waren und so keine Spike-Versuche zur Identifizierung unternommen werden

konnten. Die Peaks mussten auf eine andere Weise den Spezies I und II zugeordnet

werden. Ein möglicher Weg der Zuordnung ist die Migrationszeit. Diese unterscheiden

sich aber aufgrund der unterschiedlichen Matrizes (siehe Abbildung 6.2-1) in einigen

Fällen doch erheblich (± 100s). Höhere Matrixbelastung führte zu höheren

Migrationszeiten. Zusätzlich wurden die Spezies von anderen Elementen untersucht.

Hierbei fiel auf, dass die Nickelspezies I immer die gleiche Migrationszeit zeigte wie

eine Kupferspezies. Für die Nickelspezies II konnte keine Spezies gefunden werden, die

die gleiche Migrationszeit aufwies. Die Abbildung 6.3-5 zeigt stellvertretend für alle

0

5000

10000

15000

20000

25000

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

Inte

nsitä

t / c

ps (N

G 3

)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Inte

nsitä

t / c

ps (N

i-Sta

nd.)

NG 3Ni-Standard (20µg/L)

Ni2+

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II


Cytosole die Übereinstimmung der Nickelspezies I und der Kupferspezies im Cytosol

der Normalgewebeprobe 3 (weitere Elektropherogramme siehe Anhang).

Abbildung 6.3-5: Übereinstimmung der Migrationszeit der Nickelspezies I und der Kupferspe-

zies im Cytosol von NG 3

Über diese als Nickel/Kupfer-Korrelation bezeichnete Übereinstimmung der Migrati-

onszeiten konnte eine Zuordnung der vorkommenden Nickelspezies zu Nickelspezies I

und II getroffen werden.

Die Nickelspezies weisen, wie gerade schon erwähnt wurde, zwar keine qualitativen

Unterschiede auf, wohl aber quantitative, die beim Vergleich der Größe der Peakflächen

der Spezies I und II zueinander erkennbar sind. Das Flächenverhältnis der Spezies I zu

Spezies II ist im Cytosol des Normalgewebes in allen Proben signifikant höher als im

Cytosol des Tumorgewebes der entsprechenden Probe (Ausnahme Probe 4 und 14). Die

Signifikanz wurde mithilfe des erweiterten t-Tests mit einer Signifikanzebene von 0,01

und n = 5 überprüft (Ergebnisse des t-Tests siehe Anhang). In Tabelle 6.3-1 sind die be-

rechneten Flächenverhältnisse (Fläche Spezies I zu Spezies II) aller Proben zusammen-

gefasst.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Zeit / s

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74


Tabelle 6.3-1: Peakflächenverhältnisse der Nickelspezies I zu Spezies II

Probe FlächenverhältnisSpezies I zu II

Probe FlächenverhältnisSpezies I zu II

NG 1 1,00 NG 11 1,04

TG 1 0 (Spezies I nicht

detektierbar)

TG 11 0,40

NG 2 0,38 NG 12 0,61

TG 2 0,10 TG 12 0,48

NG 3 0,46 NG 13 0,28

TG3 0,09 TG 13 0 (Spezies I nicht

detektierbar)

NG 4 0,37 NG 14 0,23

entz.G 4 0,37 TG 14 0,24

NG 5 1,14 NG 15 0,62

TG 5 0,19 TG 15 0,28

NG 10 0,99

TG 10 0,10

Bei Betrachtung der Peakflächenverhältnisse fallen einige Proben auf. Bei Probe 1 und

13 konnten im Cytosol des malignen Gewebes die Nickelspezies I nicht detektiert wer-

den, deren Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze lag. Aus diesem Grund ist das

Verhältnis der Flächen gleich 0 gesetzt worden. Die Identifizierung der detektierten

Spezies II konnte über die bereits beschriebene Nickel-Kupfer-Korrelation (in beiden

Fällen keine Überlappung der detektierten Ni-Spezies mit der Cu-Spezies) erreicht wer-

den. Die CE / ICP-MS Messungen der beiden Cytosole (NG/TG) stimmen mit den

Ergebnissen der TXRF Messungen überein. Die Cytosole, bei denen hohen Nickelinten-

sitäten bei der CE / ICP-MS Analyse erzielt wurden, wiesen auch hohe Konzentrationen

an Nickel auf (siehe TXRF-Messungen). Die Peakflächen der Spezies I bzw. II sind im

Cytosol der Probe 1 und 13 sehr gering im Vergleich zu den Cytosolen der anderen Pro-

ben, was einem sehr geringen Nickelgehalt entspricht, was auch wieder durch die

Ergebnisse der TXRF bestätigt wird (siehe Tabelle 6.1-2).

Bei Probe 4 sind die Elektropherogramme (siehe Abbildung 6.3-3) der beiden Cytosole

(NG/entz.G) fast identisch. Im Cytosol des entzündeten Gewebes liegen neben den der

Nickelspezies I und II noch freie Ni2+-Ionen vor, was durch den etwas höheren Nickel-

gesamtgehalt des Cytosol zu erklären ist (siehe Abb. 6.1-2). Außerdem war der Unter


grund bei der Nickelspeziesanalyse des entzündeten Gewebes geringer als bei der des

Normalgewebes, so dass im letzteren Fall die freien Ni2+-Ionen nicht detektiert werden

konnten. Die Peakflächenverhältnisse der Cytosole beider Gewebearten sind ebenfalls

identisch. Da es sich bei entzündetem Gewebe um Normalgewebe mit erhöhtem Gehalt

an Enzymen, die am Entzündungsprozess beteiligt sind, jedoch nicht um malignes

Gewebe handelt, sind die übereinstimmden Ergebnisse der Nickelspeziesanalyse zu

erklären (siehe auch TXRF Messungen).

Eine ähnliche Auffälligkeit zeigt Probe 14, auch hier unterscheiden sich die Elektro-

pherogramme beider Gewebearten nur in den Migrationszeiten, aber nicht im

Peakmuster bzw. in den Peakflächenverhältnissen. Der pathologische Befund gibt an,

dass sich im Resektat weitere tumoröse Gewebeanteile befanden. Die CE / ICP-MS

Daten als auch die TXRF-Messungen (siehe Abb. 6.1-2) lassen den Schluss zu, dass es

sich bei den beiden Gewebeproben um eine ähnliche Gewebeart handelt,

möglicherweise auch um adenomatöses Gewebe. Dieser Eindruck wird durch das

Aussehen der beiden Gewebeproben bestätigt. Normalerweise kann aufgrund des

Aussehens ein Unterschied zwischen normalen und malignen Gewebe getroffen

werden. Das maligne Gewebe ist im Vergleich zum normalen Gewebe härter. Bei der

Probe 14 sahen beide Proben sehr ähnlich aus und unterschieden sich auch nicht in ihrer

Konsistenz, sodass schon aufgrund dieser Befunde davon ausgegangen werden konnte,

dass es sich um die gleiche Gewebearten handeln könnte.

Neben den bisher erwähnten zwei Nickelspezies wurden nur in beiden Cytosolen der

Probe 5 eine dritte Nickelspezies gefunden (siehe Abb. 6.3-2). Diese beiden Cytosole

wiesen eine sehr hohe Nickelgesamtkonzentration im Vergleich zu den ersten vier Pro-

ben auf (siehe Tab. 6.1-2). Da Dithiotreitol (DTT), wie schon in Kapitel 5 erwähnt

wurde, neben den antioxidativen Eigenschaften auch gute

Komplexierungseigenschaften besitzt, könnte es sich bei der dritten Nickelspezies um

eine Ni-DTT-Komplex handeln. Aufgrund des hohen Nickelgehaltes in den Cytosolen

konnte sich nur bei diesen beiden Cytosolen der Komplex in ausreichender,

detektierbarer Konzentration bilden. Um diese Vermutung bestätigen zu können, wurde

mithilfe der CE / ICP-MS Kopplung eine 20 µg/L Nickelstandardlösung mit 5 mmol

DTT-Lösung und einmal ohne DTT-Zusatz gemessen. Um Informationen über den

Ladungszustand der gefundenen Nickelspezies zu erhalten, wurde zusätzlich eine

Arsenobetain-Standardlösung in die CE-Kapillare injiziert, da Arsenobetain nach außen

neutral ist und durch den EOF aus der Säule eluiert wird. Damit konnte eine Aussage


über die Ladung der Spezies vor und nach dem Peak für Arsenobetain getroffen werden.

Die Elektropherogramme sind in der Abbildung 6.3-6 zusammengefasst.

ß-As = Arsenobetain

Abbildung 6.3-6: Elektropherogramme zur Identifizierung der Nickelspezies III

Als erste zentrale Aussage der Abbildung lässt sich festhalten, dass es sich bei den

Nickelspezies I und II in allen Cytosolen um positiv geladene Spezies handeln muss, da

sie bei der gewählten Polung (siehe Abb. 4.3-1) der CE vor dem EOF-Marker (Arseno-

betain) die Kapillare verlassen. Als zweites lässt sich feststellen, dass der gebildete Ni-

DTT-Komplex (Nickel in DTT Lösung) nach außen neutral ist, da er fast zur selben

Zeit wie das Arsenobetain die Kapillare verlässt. Die Migrationszeit der Nickelspezies

III (blau) liegt etwa im gleichen Bereich wie die des Arsenobetains (hellblau) bzw. die

des Ni-DTT-Komplexes (rot). Da die Arsenobetain- als auch die Ni-DTT-Lösung keine

Matrix enthalten, werden scharfe Peaks erreicht. Der Peak der Nickelspezies III ist

dagegen sehr breit und die Migrationszeit der Spezies ist aufgrund der Matrix des Cyto-

sols zu längeren Zeiten hin verschoben, sodass davon ausgegangen werden kann, dass

die Nickelspezies III ein neutraler Nickel-Dithiotreitol-Komplex ist.

Um Aussagen über die Bindungsstärke von Nickel innerhalb der beiden Spezies tätigen

zu können, wurde das Verhalten der Nickelspezies gegenüber dem Komplexbildner

EDTA analysiert. Hierzu wurde das Cytosol der Probe NG 10 mit verschieden konzen-

trierten EDTA-Lösungen versetzt und anschließend mithilfe der CE / ICP-MS

Kopplung vermessen. Es wurden folgende EDTA-Cytosol-Lösungen eingesetzt:

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

Inte

nsitä

t / c

ps

Probe TG 5 Ni-Standardlsgß-As StandardlsgNi+DTT Lösung

Ni2+ Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

Ni-Spezies III

Ni-DTT-Komplex

ß-As


1. pures Cytosol der Probe 10

2. Zugabe von 0,03 mmol EDTA zum Cytosol




6. Ni-Standardlösung und 3,39 mmol EDTA

Abbildung 6.3-7: Verhalten der Nickelspezies im Cytosol gegenüber niedrig konzentrierten

EDTA-Lösungen

Abbildung 6.3-8: Verhalten der Nickelspezies im Cytosol gegenüber hoch konzentrierten EDTA-

Lösungen

Die Abbildung 6.3-7 zeigt das Verhalten der Nickelspezies im Cytosol der Probe NG 10

gegenüber niedrig konzentrierten EDTA-Lösungen. EDTA ist bis zu einer Zugabe von

0,07 mmol nicht in der Lage das Nickel aus den Spezies zu komplexieren. Es ist das

gleiche Aufspaltungsmuster der beiden Nickelspezies in den beiden Cytosolen bei Zu

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

3,39 mmol EDTA+NiNG 10 purNG 10 + 3,39 mmol EDTANG 10 + 0,34 mmol EDTA

Ni-Sepzies I

Ni-Spezies II

Ni-EDTA-Komplex

Ni-EDTA-Komplex in NG 10

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

NG 10 purNG 10 + 0,07 mmol EDTANG 10 + 0,03 mmol EDTA

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II


gabe von 0,03 und 0,07 mmol EDTA zu erkennen, sodass davon ausgegangen werden

kann, dass Nickel fest an die Spezies I und II gebunden ist. Die Migrationszeiten und

die Intensitäten der Spezies haben sich im Gegensatz zum Cytosol ohne Zugabe von

EDTA verändert, was an der Verdünnung des Cytosols, aber auch an der

Komplexierung von Cytosolbestandteilen durch die EDTA-Lösung zu erklären ist.

Abbildung 6.3-8 gewährt einen Einblick in das Verhalten der Spezies gegenüber höher

konzentrierten EDTA-Lösungen ( ≥ 0,34 mmol). Ab einer Zugabe von 0,34 mmol ist

EDTA in der Lage, das Nickel aus den beiden Spezies herauszulösen und zu komplexie-

ren. Die Konzentration des Ni-EDTA-Komplexes ist aber zu niedrig, sodass keine

Nickelspezies detektiert wurden. Erst ab einer Zugabe von 3,39 mmol EDTA wird das

gesamte Nickel der Probe komplexiert und der Ni-DTT-Komplex detektiert. Die höhere

Matrixbelastung im Cytosol im Gegensatz zur Ni-EDTA-Standardlösung sorgt für

längere Migrationszeiten.

Erstes Fazit:

Mit der vorgestellten CE / ICP-MS Kopplung ist eine Nickelspeziesanalyse in Cyto-

solen humaner Proben möglich. Es hat sich gezeigt, dass keine qualitativen Unter-

schiede im Cytosol von normalen und malignen Gewebeproben des humanen

Intestinaltrakts hinsichtlich der Nickelspezies festzustellen sind, aber quantitative

Unterschiede bestehen. Diese werden durch die Bildung der Peakflächenverhältnisse

der Nickelspezies I und II sichtbar. Dieses ist im Cytosol der normalen Gewebeproben

signifikant höher als im Cytosol der malignen Gewebeproben. Bei den ersten beiden

Nickelspezies (I und II) handelt es sich um positiv geladene Spezies, wobei Nickel fest

an die Spezies I und II gebunden ist.


6.4 Nickelspeziesanalyse mithilfe der SEC / ICP-MS Kopplung

Zur Verifizierung der Ergebnisse der CE / ICP-MS Messungen wurden dieselben Cyto-

solproben mit der SEC / ICP-MS analysiert. Die Vorteile der SEC gegenüber anderen

chromatographischen Trennmethoden sind in vorherigen Abschnitten schon eingehend

erläutert worden.

6.4.1 SEC mit UV-Detektion

Mithilfe von Proteinstandards wurde eine Massenkalibrierung für die verwendete SEC-

Säule durchgeführt (Durchführung / Messparameter siehe 4.2.2). Tabelle 6.4-1 zeigt die

eingesetzten Proteinstandards mit ihren molaren Massen.

Tabelle 6.4-1: Proteinstandards für die Massenkalibrierung der SEC-Säule.

Proteinstandard molare Massen / DaAprotinin 6500

Myoglobin 17800Chymotrysinogen 25000

Ovalbumin 43000Rinderserumalbumin 67000

Transferrin 80000Ferritin 450000

Dextranblau 2000000

Die Proteinstandards wurden jeweils einzeln bei einer Wellenlänge von 254 nm gemes-

sen und die Massen gegen die Zeit ausgetragen. Anhand der Kalibriergeraden wurde der

selektive Permeationsbereich der SEC-Säule bestimmt (siehe Abbildung 6.4-1).

Abbildung 6.4-1: Massenkalibriergerade für die SEC-Säule

y = -950,9x + 57886

0,00E+00

1,00E+04

2,00E+04

3,00E+04

4,00E+04

5,00E+04

6,00E+04

7,00E+04

8,00E+04

9,00E+04

1,00E+05

0 10 20 30 40 50 60 70Zeit / min

Mol

mas

se /

Da

gesamte Kurve

Bereich selektiverPermeation

Kalibriergerade

Ausschlussgrenze

Permeationsgrenze

Bereich selektiver Permeation


Anschließend wurde jeweils ein Chromatogramm eines Cytosols einer normalen und

einer malignen Gewebeprobe (Probe 1) aufgenommen (sieh Abbildung 6.4-2)

Abbildung 6.4-2: SE-Chromatogramme der Cytosole von Normalgewebe und Tumorgewebe der

Probe 1(UV-Detektion bei 254 nm)

6.4.1.1 Ergebnis und Diskussion

Wie aus Abbildung 6.4-1 hervorgeht, liegt der selektive Permeationsbereich zwischen 3

und 35 kDa (Trennbereich Hersteller: 3-70 kDa). Mithilfe der Kalibrierfunktion

(y=950,9x + 57886) können die molaren Massen der im weiterem Verlauf der Arbeit

mit der SEC / ICP-MS detektierten Nickelspezies bestimmt werden.

Der Vergleich der Chromatogramme der beiden Cytosole (NG/TG) zeigt, dass sich die

SE-Chromatogramme nur im Bereich kleiner molarer Massen, unterscheiden. Zwischen

3500-4000s wurden im Cytosol des Normalgewebes einen UV-aktive Spezies

detektiert, während diese im Cytosol des Tumorgewebes fehlen. Da es sich bei der UV-

Detektion um eine elementunspezifische Detektion handelt, können keine Aussagen

über mögliche Metallspezies getroffen werden. Daher wurde das Cytosol (TG) mit der

SEC / ICP-MS Kopplung (gewählte Messparameter siehe Tabelle 5.5-1) analysiert und

die Chromatogramme zum Vergleich übereinander gelegt (siehe Abbildung 6.4-3).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

tNGTG


Abbildung 6.4-3: Vergleich Chromatogramm eines Cytosol (TG) mit UV und mit ICP-

MS Detektion

Aus Abbildung 6.4-3 wird deutlich, dass im Bereich zwischen 3500-4000 s (Bereich in

dem die Unterschiede bei der UV-Detektion (bei 254 nm) zwischen beiden Cytosolen

vorlagen) keine Nickelspezies oder Nickelspezies in derart niedrigen Konzentrationen

vorhanden waren, sodass auf weitere Analysen der Cytosole mithilfe der UV-Detektion

verzichtet wurde.

6.4.2 Nickelspeziesanalyse mithilfe der SEC / ICP-MS Kopplung

Die Nickelspeziesanalysen der Cytosole der Proben 1-5 und 10-15 wurden mittels SEC

/ ICP-MS Kopplung unter den zuvor optimierten Bedingungen (siehe Tabelle 5.5-1) je-

weils 3 mal durchgeführt, mit Ausnahme von Probe 2 und 12, bei denen das vorhandene

Cytosolvolumen zu gering war.

Der Variationskoeffizient der Retentionszeiten der fünf Nickelspezies in einem Cytosol,

die detektiert wurden, lag zwischen 0,3-1,3 % und der der Peakflächen betrug je nach

Nickelspezies zwischen 15 und 65 % (Peak 1: 20-25 %, Peak 2: 30-40 %, Peak 3: 50-55

%, Peak 4: 60-65 %, Peak 5 15-20%). Grund für die hohen Variationskoeffizienten der

Peakflächen ist der Einsatz eines Vorfilters in der SEC (siehe Abbildung 4.3-7), der

nicht definierte Menge von partikulären Cytosolbestandteilen herausfiltert. Da auch

hier, wie später erläutert wird, eine entsprechende Auswertung durchgeführt wird und

Aussagen über die Peakflächenverhältnisse getroffen werden, wurden die

Variationskoeffizienten für die Verhältnisse bestimmt. Diese lagen zwischen 10-15 %

(Werte siehe Anhang).

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t IC

P-M

S / c

ps

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

ICP-MSUV

UV


Die nachfolgenden Abbildungen 6.4-4 bis 6.4-6. zeigen die Chromatogramme der Cyto-

sole der Proben 3 bis 5. Die Proben 3 bis 5 wurden zum Vergleich herangezogen, da

auch die Elektropherogramme bei Einsatz der CE / ICP-MS Kopplung von den Proben

3 bis 5 abgebildet sind (siehe Abb. 6.3-1 bis 6.3-3).

Abbildung 6.4-4: SE-Chromatogramme der Cytosole (NG/TG) der Probe 3


0

50000

100000

150000

200000

250000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGTG

35 kDa 33 kDa

9 kDa6 kDa

5 kDa

< 3 kDa

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGTG

35 kDa 31 kDa

9,5 kDa

6 kDa

< 3 kDa


Abbildung 6.4-6: SE-Chromatogramme der Cytosole (NG/entz.G) der Probe 4

6.4.2.1 Auswertungen und Aussagen der Nickelspeziesanalyse

Aus den Abbildungen 6.4-4 bis 6 geht hervor, dass in den Cytosolen bis zu 5 Nickelspe-

ziesfraktionen detektiert werden konnten (in den Cytosolen 11-15 wurde noch eine wie-

tere Fraktion nachgewiesen). In Tabelle 6.4-2 sind die in den Peakmaxima ermittelten

Molmassen der Fraktionen der einzelnen Nickelspezies aufgelistet.

Tabelle 6.4-2: Molmassen der Nickelspeziesfraktionen

Probe MM1 Peak12

MM1 Peak2

MM1 Peak3

MM1 Peak4

MM1 Peak5

MM1 Peak6

NG 1 ≥ 35 -- -- 9 6 3-5TG 1 ≥ 35 -- -- 9 -- 3-5NG 3 ≥ 35 -- -- 9 6 3-5TG 3 ≥ 35 -- -- 9 6 3-5NG 4 ≥ 35 30-33 -- 9 6 --

entz.G 4 ≥ 35 30-33 -- 9 6 --NG 5 ≥ 35 30-33 -- 9 6 < 3TG 5 ≥ 35 30-33 -- 9 6 < 3

NG 10 ≥ 35 30-33 -- 9 6 3-5TG 10 ≥ 35 30-33 -- 9 6 3-5NG 11 ≥ 35 30-33 28 9 6 3-5TG 11 ≥ 35 30-33 -- 9 6 3-5NG 13 ≥ 35 30-33 28 9 6 3-5TG 13 ≥ 35 30-33 -- 9 -- --NG 14 ≥ 35 30-33 28 9 6 3-5TG 14 ≥ 35 30-33 28 9 6 --NG 15 ≥ 35 30-33 28 9 6 3-5TG 15 ≥ 35 30-33 28 9 6 3-5

1 MM = Molmassen in kDa; 2 es handelt sich um die Permeationsgrenze der SEC-Säule

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGentz.G

35 kDa30 kDa

9 kDa

6 kDa


Da die Chromatogramme teilweise sehr breite Peaks bzw. breite Peakmaxima zeigen,

können die Molmassen nicht immer genau bestimmt sondern nur ein Molmassenbereich

angeben werden.

Die Cytosole weisen mit Ausnahme des Cytosols der Probe NG 4, entz.G 4, TG 13 und

TG 14 Nickelspezies mit den Molmassen von 4, 6 und 9 kDa auf. In den Cytosolen der

Proben 4 und 14 konnte die Spezies mit einer Molmasse von 4 kDa nicht detektiert

werden. Bei dem Cytosol der Probe TG 13 konnte wie schon bei der Nickelspeziesana-

lyse mithilfe der CE / ICP-MS Kopplung gezeigt werden, dass keine klare Auftrennung

der Speziesfraktion erreicht werden kann. Im höher molekularen Bereich konnte in allen

Cytosolen eine Nickelspezies mit einer molaren Masse von ≥ 35 kDa gefunden werden.

Hierbei muss beachtet werden, dass in diesem Molmassenbereich die Permea-

tionsgrenze der Säule lag und so auch alle höher molekularen Spezies (> 35 kDa) eluiert

werden. Daher kann über diese Fraktion keine konkrete Aussage gemacht werden. Bis

auf die Cytosole der Proben 1 und 3 enthalten alle Cytosolproben eine zusätzliche

Nickelspeziesfraktion im Bereich von 30-33 kDa. Bei den Proben 11-15 wird noch eine

weitere höher molekulare Nickelspeziesfraktion detektiert (MG= 28 kDa). Da bei

diesen Proben bei der Cytosolgewinnung nur mit 25.000g zentrifugiert wurde (Probe 1-

5 mit 100.000g), verblieben vermutlich mehr hochmolekulare Bestandteile im Cytosol.

Die Nickelspezies der beiden Cytosole der Probe 4 (siehe Abbildung 6.4-6) zeigen wie

schon bei der Nickelspeziesanalyse mittels CE / ICP-MS ein fast identisches Peakmu-

ster auf. Sowohl beim Cytosol der Probe TG 1 (Fehlen einer Spezies) wie auch bei den

Cytosolen der Probe 4 (identisches Peakmuster) stimmen die Ergebnisse der Nickel-

speziesanalyse mittels CE / ICP-MS mit denen, die mit der SEC / ICP-MS ermittelt

wurden, überein.

Die Zuordnung der Fraktionen ist bei der SEC-Trennung einfacher als bei der CE, da

bei der SEC die Fraktionen der Spezies über ihre Retentionszeit zugeordnet werden

können.

Die Chromatogramme weisen bei den Fraktionen der Nickelspezies wie bei den Elek-

tropherogrammen auch keine qualitativen Unterschiede zwischen dem Cytosol der ma-

lignen im Vergleich zu dem Cytosol der normalen Gewebeprobe auf. Die Anzahl der

Fraktionen von Nickelspezies sind bei der Betrachtung der korrespondierenden

Cytosole (NG/TG der Gewebeproben) gleich. Ausnahme ist die Probe 1, bei der beim

Cytosol des Tumorgewebes, wie schon durch die CE / ICP-MS Messungen gezeigt, eine


Spezies fehlt. Die Molmasse dieser Speziesfraktion beträgt 6 kDa (siehe Anhang bzw.

Tabelle 6.4-2).

Um die Nickelspezies, die mithilfe der SEC / ICP-MS gefunden wurden, mit den

Nickelspezies I und II aus den CE / ICP-MS Messungen vergleichen zu können, müssen

die Spezies der SEC den Spezies aus den CE-Messungen zugeordnet werden. Die

Nickelspezies mit der molaren Masse von 28-35 kDa können bei diesem Vergleich der

Daten der beiden Trennmethoden vernachlässigt werden, da diese Spezies bei der Pro-

benvorbereitung für die CE (Acetonitrilfällung) denaturiert werden (siehe Abbildung

5.4-2). Es kann sich also bei den Nickelspezies I und II nur um Spezies mit einer mola-

ren Masse 4, 6 oder 9 kDa handeln. Ein möglicher Ansatzpunkt zur Klärung, welche

Spezies welche Molmasse besitzt, ist die aus der Nickelspeziesanalyse mittels CE / ICP-

MS bekannte Korrelation der Nickelspezies zu einer simultan detektierten Kupferspe-

zies. Die Abbildungen 6.4-7 und 6.4-8 zeigen die Chromatogramme bei elementspezifi-

scher Detektion der Elemente Kupfer und Nickel.

Abbildung 6.4-7: Zuordnung der Nickelspezies über eine Kupferspezies (Molmasse 6 kDa) der

Probe NG 1

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa6 kDa

4 kDa


Abbildung 6.4-8: Zuordnung der Nickelspezies über eine Kupferspezies (Molmasse 6 kDa) der

Probe TG 1

Beide Abbildungen (6.4-7/8) stellen die als Nickel/Kupfer Korrelation bezeichnet Über-

einstimmung der Retentionszeiten zwischen der Nickelspezies I und der Kupferspezies

dar.

Es liegt der Schluss nahe, dass die Nickelspezies I, die mittels CE / ICP-MS Messun-

gen detektiert wurde, mit dem 6 kDa Peak, der bei den SEC / ICP-MS Messungen

auftritt, übereinstimmt.

Als weiterer Beweis dieser Annahme ist die Abbildung 6.4-7 zu werten. Bei der

Nickelspeziesanalyse des Cytosols der Probe TG 1 mittels CE / ICP-MS konnte die

Spezies I nicht detektiert werden. Im Chromatogramm des Cytosols dieser Probe (siehe

Abbildung 6.4-7) fehlt die Nickelspezies mit der molaren Masse von 6 kDa ebenfalls,

wobei die Kupferspezies klar zu erkennen ist. Es ist eine eindeutige Übereinstimmung

der Ergebnisse der SEC- mit denen der CE / ICP-MS Messungen erkennbar.

Weiterhin kann aus der SEC-Messung geschlussfolgert werden, dass die Nickelspezies

II im Elektropherogramm entweder die Molmasse 4 oder 9 kDa besitzt. Die Molmasse

von 4 kDa kann ausgeschlossen werden, da sowohl in beiden Cytosolen der Probe 4, im

Cytosol der Probe TG 13 und TG 14 keine Nickelspezies mit einer molaren Masse von

4 kDa detektiert wurde, aber in allen Cytosolen die Nickelspezies II analysiert wurde

(siehe Tabelle 6.4-2). Weiterhin wird unter Annahme der gleichen Ladung der Spezies

diese Aussage durch das Trennprinzip der CE (nach Größe und Ladung) gestützt. Je

größer der Analyt bei gleicher Ladung ist desto höher ist die Migrationszeit.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 639 kDa

4 kDa


Dies lässt den Schluss zu, dass die Nickelspezies II, die in den CE / ICP-MS Messun-

gen erfasst wurde, mit der 9 kDa Fraktion der SEC / ICP-MS Messungen überein-

stimmt.

6.4.2.2 Fraktionierung mittels SEC und anschließende Speziesanalyse mithilfe der

CE / ICP-MS Kopplung

Um die Frage nach der Zuordnung endgültig klären zu können, wurde eine Fraktionie-

rung der Cytosole mittels SEC durchgeführt. Es wurden die gleichen Messbedingungen

wie zuvor gewählt. Das Eluat wurde mittels eines Fraktionssammlers in Fraktionen von

2 mL aufgefangen. Um Oxidationsvorgänge zu unterdrücken, wurden die Fraktionen

während der Trennung (siehe Abbildung 6.4-9) unter einer Schutzgasatmosphäre auf-

bewahrt. Da die Fraktionen durch die hohe Flussrate der SEC stark verdünnt wurden,

wurden die 4 und die 9 kDa Fraktionen mithilfe von Ultrazentrifugenröhrchen (viva-

spin 2) mit einer Ausschlussgrenze von 3 kDa bei 4 °C und 15.000g auf ein Volumen

von 30 µL eingeengt. Die Zentrifugenröhrchen besaßen eine vertikale Membrankon-

struktion sowie eine Engspalt-Filtrationskammer. Die eingesetzte Membran bestand aus

Polyethersulfon. Die eingeengte Probe wurde anschließend einer Nickelspeziesanalyse

mittels CE / ICP-MS unterzogen (siehe Abbildung 6.4-10).

Abbildung 6.4-9: Fraktionierung des Cytosols der Probe TG 1

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t / c

ps

TG

35 kDa

Fraktion 1 (9 kDa)

Fraktion 2 (4 kDa)


Abbildung 6.4-10: Elektropherogramme der SEC-Fraktionen (4 kDa und 9 kDa)*

* Hierbei handelt es sich um eine Offset-Darstellung zur besseren Vergleichsmöglichkeit. Die Probe TG

1 besitzt, wie schon erwähnt, keine 6 kDa Fraktion.

6.4.2.3 Ergebnisse und Diskussion der Fraktionierung

Die Elektropherogramme der beiden Fraktionen bestätigten die unter Punkt 6.4.2.1

getätigten Aussagen. In der eingeengten 4 kDa Fraktion der SEC-Trennung wurde keine

Nickelspezies detektiert, da entweder die Konzentration der Nickelspezies zu gering

war oder die Spezies so stark negativ geladen ist, dass der EOF nicht ausreicht, um die

Spezies dem Detektor zuzuführen. In der 9 kDa SEC Fraktion ist hingegen eine

Nickelspezies zu erkennen, die eine etwas längere (50 s) Migrationszeit als die Nickel-

spezies II des Cytosols der Probe TG1 aufweist (siehe Abbildung 6.4-10). Die

Verschiebung der Migrationszeit kann auf die Aufkonzentrierung der jeweiligen Frak-

tion zurückgeführt werden, da sich bei dieser Aufkonzentrierung (von bis zu 16 mL auf

30 µL), der Salzgehalt der Probe erhöhen kann. Dies wurde auch an der Zerstäuberka-

pillare sichtbar. Nach jeder Analyse musste das Interface aufgrund der Salzablagerun-

gen gereinigt werden.

6.4.2.4 Semiquantitative Nickelspeziesanalyse

Wie schon in Punkt 6.4.2.1 erwähnt wurde, sind bei der Nickelspeziesanalyse mithilfe

der SEC / ICP-MS Kopplung keine qualitativen Unterschiede zwischen den Cytosolen

maligner und Cytosolen normaler Gewebe erkennbar. Um wie bei den CE / ICP-MS

Messungen Aussagen über mögliche quantitative Unterschiede machen zu können, wur

300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

Cytosol TG1 Fraktion 9 kDaFraktion 4 kDaNi-Spezies II


den die Peakflächenverhältnisse der 6 und 9 kDa Fraktionen berechnet. Die Ergebnisse

sind in der folgenden Tabelle 6.4-3 zusammengefasst.

Tabelle 6.4-3: Peakflächenverhältnisse der Nickelspezies I (6 kDa) zu Nickelspezies II (9 kDa);

SEC / ICP-MS Messungen

Probe Flächenverhältnis Spezies I (6 kDa)

zu II (9 kDa)

Probe Flächenverhältnis Spezies I (6 kDa) zu

II (9 kDa)NG 1 0,63 NG 11 0,89

TG 1 0 TG 11 0,60

NG 3 2,08 NG 13 1,20

TG 3 0,09 TG 13 0

NG 4 0,32 NG 14 0,46

entz.G 4 0,29 TG 14 0,48

NG 5 0,90 NG 15 0,86

TG 5 0,49 TG 15 0,33

NG 10 0,59

TG 10 0,47

Das Flächenverhältnis der Spezies I zu Spezies II ist im Cytosol des Normalgewebes in

allen Proben signifikant höher als im Cytosol des Tumorgewebes der korrespondieren-

den Probe (Ausnahme Probe 4 und 14). Die Signifikanz wurde mithilfe des erweiterten

t-Tests mit einer Signifikanzebene von 0,01 (bei Probe 10 und 11 von 0,05) und n = 3

überprüft (Ergebnisse des t-Test siehe Anhang).

Allgemein lässt sich feststellen, dass bei der Auswertung der SEC / ICP-MS Messungen

die gleichen Trends wie bei denen der CE / ICP-MS zu erkennen sind. Die Peakflä-

chenverhältnisse stimmen zwar, was den Zahlenwert betrifft, nicht exakt überein, aber

die Ergebnisse zeigen unabhängig von der analytischen Methode den gleichen Trend.

Ein Grund für die unterschiedlichen Verhältnisse liegt in den verschiedenen Trennprin-

zipien und -parametern beider Verfahren. Zum Beispiel wird bei der SEC im Vergleich

zur CE mehr als das 10.000 fache Volumen auf die Säule gegeben. Des weiteren hat bei

der CE die Matrixbelastung einer Probe eine wesentlich größere Bedeutung als bei der

weniger matrix-beeinflussten SEC Trennung, was deutliche Auswirkung auf das

Trennvermögen eines analytischen Verfahren hat. Aufgrund der höheren Flussraten bei

der SEC liegen auch die Nickeluntergrundwerte höher als bei der CE, was sich auch auf

die Bestimmung der Verhältnisse auswirkt.


Bei der Nickelspeziesanalyse mithilfe der SEC / ICP-MS zeigen die gleichen Cyto-

solproben Auffälligkeiten wie bei der Analyse mittels CE / ICP-MS. In beiden Fällen

konnte beim Cytosol der Probe TG 1 und TG 13 die Spezies I nicht detektiert werden.

Die Ergebnisse der SEC / ICP-MS Analyse der Cytosole der Proben 4 und 14 stimmen

ebenfalls mit den Ergebnissen der CE / ICP-MS Analyse überein. Dies unterstreicht die

in Punkt 6.3.1 getätigten Aussagen.

Es lässt sich festhalten, dass die Ergebnisse der Nickelspeziesanalyse mittels SEC /

ICP-MS Kopplung mit den Ergebnisse der Analyse mithilfe der CE / ICP-MS Kopp-

lung übereinstimmen.


6.5 Verdrängungsreaktionen der Ni2+- durch Zn2+-Ionen

Um weitere Informationen über die Nickelspezies im Cytosol von Gewebeproben des

humanen Intestinaltrakts zu bekommen, wurde ein Cytosol mit einer Zn2+ bzw. Ni2+

Lösung versetzt. Mit diesen Versuchen sollte geklärt werden, wie stark die Nickelbin-

dungen an den Bindungspartner sind. Weiterhin sollte das Verhalten der Nickelspezies

bei weiterer Zugabe von Ni2+-Ionen analysiert werden. In den Fällen, in denen Nickel-

Ionen nur locker an den organischen Bindungspartner gebunden sind, können sie durch

Zink-Ionen verdrängt werden. Für die Analyse wurden die beiden Cytosole (NG/TG)

der Probe 10 genutzt, um den Einfluss auf beide Gewebearten zu untersuchen.

6.5.1 Durchführung der Verdrängungsreaktion

Zum Ansetzen einer 1000 µg/L Zinklösung wurde die entsprechende Menge von

Zinknitrat eingewogen und in gereinigtem Tris-HNO3 Puffer (pH= 7,4) gelöst. Ebenso

wurde beim Ansetzten der Nickellösung verfahren (Nickelnitrat). Die erhaltende

Nickellösung wurde noch einmal 1:10 mit Tris-HNO3 Puffer verdünnt (wurde nur bei

dem Cytosol der malignen Probe verwendet). Von jeder Standardlösung wurden 50 µL

entnommen und auf 450 µL Cytosol gegeben. Die Probe ohne Zugabe von Stan-

dardlösung wurde in gleichem Verhältnis mit Tris-HNO3 Puffer verdünnt, damit die

Vergleichbarkeit der Proben gegeben war. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten

wurden die sieben Cytosole (zwei Cytosole ohne Zugabe und fünf mit Zugabe von

Standardlösung) jeweils einer Speziesanalyse mittels SEC / ICP-MS unterzogen. Diese

Technik wurde gewählt, da bei der SEC Trennung alle Nickelspezies detektiert werden

und so der Einfluss der Standardlösung auf alle Spezies untersucht werden konnte und

nicht wie bei der CE / ICP-MS nur der Einfluss auf die Nickelspezies I und II. Es

wurden die schon bekannten Messparameter für die SEC / ICP-MS gewählt. Die folgen-

den Abbildungen 6.5-1 und 2 zeigen die Chromatogramme der Messreihe.


Abbildung 6.5-1: SE-Chromatogramme nach Zusatz von Zn2+- und Ni2+-Ionen zum Cytosol der

Probe NG 10

Abbildung 6.5-2: SE-Chromatogramme nach Zusatz von Zn2+- und Ni2+-Ionen zum Cytosol der

Probe TG 10

6.5.2 Ergebnisse und Diskussion

Zunächst lässt sich feststellen, dass die Nickelbindungsstärken unabhängig vom Gewe-

betyp sind. Nickel wurde weder im Cytosol des Normalgewebes noch im Cytosol des

Tumorgewebes durch Zn2+-Ionen verdrängt. Dies spricht, wie schon die Versuche bei

der Zugabe des Komplexierungsmitteles EDTA (CE / ICP-MS-Messungen) gezeigt

haben, für eine starke Bindung des Nickels an alle detektierten Spezies. Da vor allem

Nickel an histidinreiche Proteine fest gebunden wird, kann davon ausgegangen werden,

dass es sich bei den detektierten Nickelspezies um histidinreiche Proteine handelt.

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

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0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit /s

Inte

nsitä

t / c

ps

CytosolCytosol + Ni (100 µg)Cytosol + Zn (100 µg)

9 kDa 6 kDa

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t / c

ps

CytosolCytosol + Ni (100 µg)Cyotosol + Zn (100 µg)Cytosol + Ni (10 µg)

9 kDa6 kDa


Möglicherweise ist die Konzentration der unspezifischen Bindungspartner im Cytosol

relativ hoch und erst durch weitere Zugabe von Ni2+-Ionen erfolgt eine quantitative

Bindungsbildung.

Diese Messungen (siehe Abb. 6.5-1 und 6.5.2) haben bestätigt, dass die

Bindungspartner für Nickel in Spezies I und II besonders starke Bindungen mit Ni2+-

Ionen eingehen. Um weitere Aussagen diesbezüglich treffen zu können, müsste das

molare Massenverhältnis genauer bestimmt werden.

Das relative Verhältnis der Spezies I zu Spezies II verändert sich nach Zugabe der Ni2+-

Ionen deutlich. Die Intensität der Spezies II (6 kDa) steigt stärker als der Spezies I (9

kDa) an. Diese Veränderung vollzieht sich sowohl im Cytosol des malignen Gewebes

als auch im Cytosol des normalen Gewebes (siehe Abb. 6.1-1 und 6.5-2), was als

weiteres Indiz gewertet werden kann, dass die Bindungspartner beider Spezies bevor-

zugte Nickelbindungspartner darstellen. Daher liegt es nahe, dass es sich sowohl bei

Spezies I als auch bei Spezies II um histidinreiche Proteine handelt.

Es lässt sich festhalten, dass die Bindungspartner der Spezies I und der Spezies II

bevorzugte Bindungspartner für Ni2+ Ionen sind.

Zusammenfassung 82

7 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass mit den vorgestellten ICP-MS

Kopplungen (CE / ICP-MS und SEC / ICP-MS) eine Nickelspeziesanalyse im Cytosol

von humanen Gewebeproben des Intestinaltrakts möglich ist. Hierzu muss das verwen-

dete ICP-MS einigen Ansprüchen gerecht werden. Eine solche Speziesanalyse ist nur

mit dem Einsatz von Platinkonen und eines Shield-Torch-Systems durchführbar, da

sonst die Nachweisgrenze nicht ausreicht. Außerdem müssen alle Gefäße und Chemika-

lien speziell gereinigt und dadurch dekontaminiert werden.

Die Optimierung der Cytosolherstellung hat gezeigt, dass nur ein mechanischer Zellauf-

schluss eingesetzt werden kann, um das Gewebe des humanen Intestinaltrakts effizient

genug aufzuschließen. Zur Probenvorbereitung für die CE / ICP-MS-Kopplung hat sich

die Acetonitrilfällung als geeignet herausgestellt.

Der Vorteil der CE / ICP-MS Kopplung gegenüber der SEC / ICP-MS-Kopplung liegt

in dem geringen Probenaufgabenvolumen von wenigen Nanolitern, sodass auch sehr

kleine Mengen an Gewebeproben analysiert werden können. Nach der Optimierung

aller Messparameter konnten die Elektropherogramme von elf Cytosolen humaner

Gewebeproben aufgenommen werden. Sie wiesen keine qualitativen Unterschiede

zwischen dem Cytosol des malignen Gewebes und des normalen Gewebes auf. Es

wurden jeweils die gleiche Anzahl von Nickelspezies (Nickelspezies I und II) im

Cytosol beider Gewebearten gefunden. Die Zuordnung der Nickelspezies zu Spezies I

und II erfolgte über die Korrelation der Nickelspezies I zu einer Kupferspezies

(möglicherweise handelt es sich hierbei um kupferbeladenes Metallothionein). Nach

Auswertung der Peakflächen-verhältnisse von Nickelspezies I zu II zeigte sich bei neun

von elf Cytosolen ein signifi-kanter Unterschied zwischen dem Cytosol maligner

Gewebeproben und ihrer korrespon-dierenden Normalgewebeproben. Mittels

Nickelspeziesanalyse konnte das Cytosol einer entzündeten Gewebeprobe als das

Cytosol eines solchen Gewebetyps identifiziert werden. Denn sowohl die

Peakfächenverhältnisse als auch die Elektropherogramme beider Cytosole (normales

Gewebe und entzündetes Gewebe) waren nahezu gleich. Mithilfe der vorgestellten

Kopplung ist es also möglich, das Cytosol von malignem Gewebe von dem Cytosol von

normalem Gewebe zu unterscheiden.

Mithilfe eines EOF-Markers konnte die Ladung der beiden Nickelspezies bestimmt

werden. In beiden Fällen liegen die Spezies positiv geladen vor. Die Ergebnisse der

Zusammenfassung 83

Gesamtnickelbestimmung mittels TXRF stimmten gut mit den Ergebnissen der CE /

ICP-MS Analysen überein. Cytosole mit geringen Gesamtnickelkonzentrationen

wurden z.B. auch bei der CE / ICP-MS Messungen mit geringen Intensitäten für Nickel

analysiert.

Im weiteren Verlauf der Arbeit hat sich gezeigt, dass eine Nickelspeziesanalyse auch

mittels einer SEC / ICP-MS Kopplung möglich ist. Da die SEC sehr schonend und nur

nach Größe des Analyten trennt und eine Probenvorbereitung des Cytosols nicht nötig

war, konnten im Gegensatz zur CE-Trennung mehr Spezies (bis zu 6 Nickelspezies,

abhängig vom Permeationsbereich (4-35 kDa) der Säule) im Cytosol beider Gewebear-

ten detektiert werden.

Weiterhin stellte sich heraus, dass es sich bei den detektierten Nickelspezies um nicht

oxidationsempfindliche Substanzen handelte, da die Zugabe eines Antioxidants bei

einer Trennzeit von fast zwei Stunden keinen Einfluss auf das Aussehen der Chro-

matogramme hatte.

Bei der Auswertung der SE-Chromatogramme waren, wie schon bei den CE / ICP-MS

Messungen, keine qualitativen Unterschiede zwischen dem Cytosol der malignen und

der normalen Gewebeprobe erkennbar. Um die Ergebnisse der SEC / ICP-MS mit denen

der CE / ICP-MS vergleichen zu können, mussten die Nickelspezies I und II den ent-

sprechenden Peaks der SEC-Anaylse zugeordnet werden. Dabei stellte sich heraus, dass

die Nickelspezies I eine molare Masse von ca. 6 kDa und die Spezies II eine molare

Masse von ca. 9 kDa besitzt. Die Peakflächenverhältnisse von Spezies I zu Spezies II

waren im Cytosol des normalen Gewebes signifikant höher als im Cytosol des malignen

Gewebes, während sie im Cytosol des entzündeten Gewebes mit dem korrespondieren-

den Cytosol des Normalgewebes identisch waren. Mithilfe der SEC / ICP-MS Messun-

gen konnten die Ergebnisse der CE / ICP-MS Messungen verifiziert werden.

Um die Bindungsstärke von Nickel mit dem organischen Bindungspartner zu untersu-

chen, wurden Verdrängungsreaktionen durch Zn2+-Ionen initiiert. Auch bei der Zugabe

von hohen Zn2+-Konzentrationen konnte die Nickel nicht durch Zn2+-Ionen verdrängt

werden, was für eine starke Bindung des Nickels an den entsprechenden Bindungspart-

ner spricht. Ferner ließ sich Nickel erst nach der Zugabe konzentrierter EDTA-Lösung

aus dem Komplex entfernen, wodurch die Hypothese der hohen Bindungsstärke gestützt

wurde.

Zusammenfassung 84

Allgemein ist bekannt, dass histidinreiche Proteine privilegierte Bindungspartner für

Nickel sind. Zu diesen zählt ein großer Teil der Onkogene, die durch Genprodukte (so-

genannte Onkoproteine) an der Kontrolle von Wachstums- und Differenzierungsprozes-

sen von Zellen beteiligt sind, die in Tumorzellen ausser Kontrolle geraten sind (z.B.

undefinierter Zellwachstum). Es liegt der Schluss nahe, dass die Onkoproteine im

Cytosol von malignen Gewebeproben in anderen Verhältnissen zueinander vorliegen als

im Cytosol von normalen Gewebeproben, in denen ein normales Zellwachstum abläuft.

Dieses würde die unterschiedlichen Flächenverhältnisse der Nickelspezies I zu II erklä-

ren.

Mithilfe von Proteindatenbanken wurden nach in Frage kommenden Proteinen gesucht

[185]. Hierzu wurden folgende Kriterien berücksichtigt:

• Molare Masse zwischen 4 und 10 kDa

• Histidinreiche Proteine

• Onkogene

Eine große Anzahl von Transkriptions-Faktoren erfüllen diese Kriterien, hier vor allem

Ap-1 (C-Jun und C-Fos, Proto-Onkogen-Produkte). Hierbei handelt es sich um histidin-

reiche Proteine mit einer molaren Masse von 6549 Da (4832 Da C-Jun Homodimer)

bzw. 6694 Da. Die Proteine liegen im Massenbereich der Nickelspezies I. Das Onkogen

C-Myb, der humane Estrogen Rezeptor, und das Rezeptor Protein Rev-Erb(α) sind

ebenfalls histidinreiche Proteine mit molaren Massen von 6130, 9675 und 10863 Da.

Diese Proteine spielen eine zentrale Rolle bei der Entstehung von Darmkrebs.

Die Ergebnisse (molare Masse, Unterschiede der Flächenverhältnisse der Nickelspezies

I zu II) der Nickelspeziesanalyse mittels beider Kopplungen weisen stark darauf hin,

dass es sich bei den Nickelspezies I und II um die oben genannten Onkogene handelt.

Das gleiche Verfahren mit auf Kupfer abgestimmten Suchkriterien wurde zur Identifi-

zierung der Kupferspezies (6-7 kDa), die mit der Nickelspezies I in Korrelation steht,

verwendet. Die Suche ergab, dass es sich sehr wahrscheinlich um die Kupfer-Form des

Metallothionein I (MT 1) handeln muss, da sowohl das Vorkommen im Kolon als gesi-

chert gilt als auch die molare Masse von 6,2 kDa mit der im Experiment ermittelten

molaren Masse übereinstimmt.

Zusammenfassung 85

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die eingesetzten Kopplungstechniken

nach Optimierung zur Nickelspeziesanalyse im Cytosol humaner Gewebeproben ge-

eignet sind. Unterschiede hinsichtlich Nickelspezies im Cytosol von malignen Gewebe

und Cytosol von normalen Gewebe konnten aufgezeigt werden und können als

Grundlage weiterer Untersuchungen zur Qualifizierung der entwickelten Methoden

als Diagnoseinstrument dienen .

Ausblick 86

8 AusblickMit dieser Arbeit wurde der Grundstein zur Nickelspeziesanalyse im Cytosol humaner

Gewebeproben gelegt. So könnten zum Beispiel spezielle Beschichtungen für die CE-

Kapillare zur Verbesserung der Trennung entwickelt werden, mit denen weitere

Nickelspezies detektiert werden könnten. Ein weiterer interessanter Punkt sind die

höher molekularen Bestandteile des Cytosols. Bei der eingesetzten SEC-Säule konnten

nur Spezies bis zu einer maximalen molaren Masse von 35 kDa detektiert werden.

Durch den Einsatz von SEC-Säulen mit einem höheren Permeationsbereich (z.B. 200

kDa) können die höher molekularen Spezies getrennt werden und es werden weitere

Informationen über die Zusammensetzung der Nickelspezies in den Gewebecytosolen

zugänglich. Der Einsatz von analytischen SEC-Säulen anstelle von präparativen Säulen

wird zudem zu einer verbesserten Auftrennung der Nickelspezies führen.

Eine weitere wichtige Frage stellt die Quantifizierung der Nickelspezies dar. Hierzu

müsste eine online Isotopenverdünnungsanalyse mittels CE / ICP-MS entwickelt wer-

den, um den Gehalt jeder einzeln Nickelspezies bestimmen zu können. Dafür muss ein

Komplexbildner für einen Nickelstandard gefunden werden, der Nickel-Ionen komple-

xiert und nach außen positiv geladen ist, da der Nickel-Komplex sonst bei der CE-

Trennung aufgrund der Polung der CE vom Detektor wegwandert.

Um die Identifizierung (mithilfe von Online-Proteindatenbanken) der Nickelspezies I

und II zu verifizieren, könnten die Spezies mithilfe einer SEC oder CE / ESI-MS/MS

Kopplung (ESI= Elektrosprayionisation) weitergehend charakterisiert und identifiziert

werden. Hierzu müssten allerdings beide Trennmethoden speziell auf die ESI-MS/MS

abgestimmt werden, d.h., es müssten gegebenenfalls neue Trennbedingungen für die

SEC bzw. CE entwickelt werden.

Um die Ergebnisse zu verifizieren, könnten kommerziell erhältliche Zelllinien genutzt

werden. Durch Inkubation mit Nickel-Ionen könnte geprüft werden, ob sich in den Zel-

len die gleichen Nickelspezies wie im Cytosol von realen Proben bilden. Anschließend

könnte eine CE oder SEC / ESI-MS/MS Analyse des Cytosols der Zelllinen durchge-

führt werden, um eine Identifizierung durchzuführen.

Ein langfristiges Ziel könnte in der medizinischen Diagnostik liegen. Wie die Arbeit

gezeigt hat, können Cytosole von malignen Gewebeproben vom Cytosol einer

normalen bzw. entzündeten Gewebeproben mithilfe der vorgestellten analytischen

Methoden unterschieden werden. Da es sich bei den Nickelspezies I und II mit hoher

Ausblick 87

Wahrscheinlichkeit um Onkoproteine handelt, kann davon ausgegangen werden, dass

sich schon bei der Entstehung von Krebs die Verhältnisse der Onkoproteine zueinander

ändern. Genau diese Veränderung kann mittels CE / ICP-MS bestimmt werden, sodass

eine Alternative zu molekularbiologischen Untersuchungen zur Verfügung stehen

würde. Weiterhin müsste geklärt werden, ob eine Abhängigkeit der

Peakflächenverhältnisse vom Tumorstadium vorliegt.

Ein weiteres langfristiges Anwendungsgebiet der durchgeführten Experimente könnte

der Einsatz der Nickelspezies als Additiv zu herkömmlichen Chemotherapeutika sein.

Nickel und Nickelverbindungen sind zwar karzinogen, ab einer bestimmten Konzentra-

tion aber auch cytotoxisch. Nach der gesicherten Identifizierung der Nickelspezies,

könnten diese in einer cytotoxischen Konzentration den herkömmlichen Chemothera-

peutika zugeführt werden und auf diesem Weg maligne Zellen zerstören.

Die Arbeit hat auch gezeigt, dass andere Elemente in diesem Zusammenhang wichtig

sein könnten. Hier kann als Beispiel Kupfer genannt werden. Es konnten drei Kupfer-

spezies detektiert werden. Eine davon ist die bereits erwähnte erste Isoform des

Metallothioneins (MT I). Bei den anderen beiden Spezies könnte es sich möglicher-

weise um die kupferbeladene Superoxid-Dismutase (SOD) und um das SOD assoziierte

Chaperon handeln. Die SODs sind im Organismus für die Entgiftung toxischer Sauer-

stoffspezies verantwortlich, die Chaperone gehören zu der Gruppe der intrazellulären

Proteine, die die Ausbildung einer definierten Raumstruktur (durch Faltung) neu-

synthetisierter Polypetidketten beschleunigt. Sowohl veränderte Raumstrukturen von

Proteinen, die zu Funktionsänderungen führen können wie auch toxische Sauer-

stoffspezies sind an der Entstehung von Krebs beteiligt. Mit der SEC / ICP-MS

Kopplung steht eine Methode zur Verfügung um mögliche Unterschiede bezüglich der

SOD und den Chaperonen im Cytosol beider Gewebearten zu bestimmen. Mit diesen

Informationen könnten vielleicht neue Behandlungsmethoden zur Krebsbekämpfung

entwickelt werden, da dann fundierte Informationen über Veränderung der SOD (Kup-

fer beladen) und der Chaperone im Cytosol der malignen Gewebeprobe zur Verfügung

stehen.

Diese Punkte zeigen, dass sich viele weitere Forschungsaspekte aus der vorgelegten

Arbeit ergeben können.

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Tabellenwerk der Firma Finnigan MAT, Bremen (1998)

[172] Informationsblatt von Bio Rad zu Chelex 100, München (2001)

[173] Engelhardt, H., Beck, W., Schmitt, T.

Kapillarelektrophorese

Vieweg & Sohn, Braunschweig/Wiesbaden (1994)

[174] Kägi, J.

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[175] Knudsen, C., Bjornsdottir, I., Jons, O., Hansen, S.

Anal Biochem 265 (1998), 167

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[178] Shihabi, Z.K.


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[181] Meyer, Th., Böhler, J., Frahm, A.W.

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Electrophoresis, 19 (1998), 2791


[184] Richardz, A.

Diplomarbeit im Fachbereich 5- Chemie der Technischen Universität Berlin,

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[185] Proteindatenbank hptt//:www.rcsb.org/pdb

[186] Watt, R., Ludden, P.

Cell Mol Life Sci 56 (1999), 604

Anhang 101

10 Anhang

10.1 Geräteliste

• CE/ICP-MS Interface CEI 100 CETAC Omaha, USA

• CE-Vials 100-1000µL Agilent Waldbronn, Deutschland

• Cryoröhrchen 1-2 mL Roth Karlsruhe, Deutschland

• Dampfreinigung für PFA Gefäße Trabold Bern, Schweiz

• Diverse PFA Gefäße VitLab, Seeheim-Jugenheim,

Deutschland

• Diverse Pipetten Eppendorf Hamburg, Deutschland

• Potter-Eveljhem-Homogenisator Fa. B. Braun Biotech. International

Melsungen , Deutschland

• Fraktionssammler Foxy jr. ISCO Lincoln, USA

• Glove Beutel Roth Karlsruhe, Deutschland

• HPLC Anlage 626/606 S Waters Eschborn, Deutschland

• Induktiv gekoppeltes Plasma Sektorfeld Thermo-Finnigan Bremen

Massenspektrometer Element 1 Deutschland

• KPG-Rührer Fa. IKA Labortechnik Staufen,

Deutschland

• Kapillarelektrophoerese 3 D CE Agilent Waldbronn, Deutschland

• Konzentrator Vivaspin 2 PES Satorius Göttingen, Deutschland

• Konzentrator Vivaspin 6 PES Satorius Göttingen, Deutschland

• Kühler CETAC Omaha, USA

• Küvette, 1cm Schichtdicke mit Deckel Fa. Hellma Jena, Deutschland

• Meinhard Zerstäuber (2,7ml/min) Spetec Erdingen, Deutschland

• pH Meter inolab level 2 WTW Weilheim, Deutschland

• Pumpe Perimax 12 Spetec Erdingen, Deutschland

• Quarzskalpelle Kürner Rosenheim, Deutschland

• Reinstwasseranlage Milli-Q-Element Millpore Eschborn, Deutschland

• SEC Säule Hi Load 16/60 Superdex 75 Pharmacia Biotech, Uppsala,

prep grade Schweden

• Spektralphotometer CADAS 100 Dr. Lange Düsseldorf, Deutschland

Anhang 102

• Titrator TitroLine 96 Schott Mainz, Deutschland

• TXRF 8030 C Atomika Waldbronn, Deutschland

• Ultraschallbad Sonorex RK 102 H Bandelin Berlin, Deutschand

• Ultraschalldesintegrator Sonfier 450 Branson Carouge/Geneva, Schweiz

• Ultra Turax T 8 IKA Staufen, Deutschland

• UV Detektor 1100 Serie Agilent Waldbronn, Deutschland

• Vorreinigung zur Q-Element Elix 3 Millipore Eschborn, Deutschland

• Zentrifuge 5417 R Eppendorf Hamburg, Deutschland

• Zentrifuge 5804 R Eppendorf Hamburg, Deutschland

10.2 Verwendete Chemikalien

• α-Chymotrypsinogen A Sigma, Steinheim, Deutschland

• Acetonitril Uvasol Merck, Darmstadt, Deutschland

• Albumin Rinderserum Acros Organica, Geel, Belgien

• Albumin vom Ei Acros Organica, Geel, Belgien

• Ammoniaklösung 25% suprapur Merck, Darmstadt, Deutschland

• Aprotinin Sigma, Steinheim, Deutschland

• Arsenobetain Standard 1g/L Sigma, Steinheim, Deutschland

• Blue Dextran Sigma, Steinheim, Deutschland

• Chelex 100 Na+-Form Fluka, Buchs, Schweiz

• Cyanocobalamin 96% Acros Organica, Geel, Belgien

• DL-Dithiotreitol sigmaUltra Sigma, Steinheim, Deutschland

• Ethanol absolut p.a. Merck, Darmstadt, Deutschland

• Ethylendiamintetraacetic Acid

Trispotassium Salt Dihydrat Sigma, Steinheim, Deutschland

• Germanium Standard 1g/L Merck, Darmstadt, Deutschland

• Kaliumhydoxid-Monohydrat suprapur Merck, Darmstadt, Deutschland

• Kupfer 1g/L Standardlösung Merck, Darmstadt, Deutschland

• MT-Mix Standard Cd Form Sigma, Steinheim, Deutschland

• Myoglobin 90% Sigma, Steinheim, Deutschland

• Natriumchlorid, p.A. Merck, Darmstadt, Deutschland

• Natriumdibenzyldithiocarbamat Fluka, Buchs, Schweiz

Anhang 103

• Nickel Standard 1g/L Merck, Darmstadt, Deutschland

• Nickel Chlorid Hexahydrat Merck, Darmstadt, Deutschland

• Protein-Bestimmungs-Kit Sigma, Steinheim, Deutschland

• Salpetersäure konz. suprapur Merck, Darmstadt, Deutschland

• Transferrin 98 % Sigma, Steinheim, Deutschland

• Tris(hydroxymethyl)-aminomethan p.a. Merck, Darmstadt, Deutschland

• Tune-up Lösung für die ICP-MS Merck, Darmstadt, Deutschland

• Zink 1g/L Standardlösung Merck, Darmstadt, Deutschland

10.3 Verwendete Abkürzungen

• ICP Induktiv gekoppeltes Plasma

• ICP-MS Kopplung induktiv gekoppeltes

Plasma / Massenspektrometer

• CE Kapillarelektrophorese

• CE / ICP-MS online-Kopplung von CE u. ICP-MS

• EOF Elektroosmotischer Fluss

• HPLC Hochdruckflüssigkeitschromato-

graphie

• SEC Größenausschlusschromatographie

• SEC / ICP-MS online-Kopplung von SEC und ICP-

MS

• RPLC Reversed-Phase Liquid Chromato-

graphie

• IPC Ionenpaarchromatographie

• IEC Ionenaustauschchromatographie

• TXRF Total-Refections X-Ray Fluorescence

• Tris HNO3 Puffer eine Lösung aus Tris(hydroxymethyl)

Aminomethan und Salpetersäure

• DMA Dimethylarsensäure

• NWG Nachweisgrenze

• NG normales Gewebe

Anhang 104

• Entz.G entzündetes Gewebe

• TG malignes Gewebe (Tumorgewebe)

• L Liter

• mmol Milli-Mol

• nL Nano-Liter

• mL Milli-Liter

• µL Mikro-Liter

• nm Nano-Meter

• mA Milli-Ampere

• kV Kilo-Volt

• mbar Milli-Bar

• min Minute

• s Sekunde

• W Watt

• UV Detektion Detektion mit ultraviolettem Licht

• Da Dalton

• kDa Kilo Dalton

• PFA Perfluor-alkoxy

• MT-MIX Gemisch aus Metallothionein I und II

• MM Molmasse

Anhang 105

10.4 Experimetelles

Das Vorfiltersystem für die SEC-Chromatographie

Vorfilter an SEC-Säule Filtersystem auseinandergeschraubt

Das Spiltsystem

Der Splitter für die SEC / ICP-MS Kopplung

Aufbau der Pufferreinigung

Reinigungssäulen für den Tis-HNO3-Puffer

Anhang 106

10.5 Optimierung

10.5.1 Cytosolherstellung mit dem Potter Eveljhem Homogenisator

Ultra Turrax Probe Probe geschnitten Probe im Homogenisator

Probe + Puffer Ultra Turrax Probe nach Zentrifuge

10.5.2 Cytosolherstellung mit dem Ultraschalldesintegrator

Probe zerkleinern Probe + Puffer unter Argon Proben vor Ultraschalldes.

Anhang 107

Probe über dem Ultraschalldes. im Ultraschalldes. Proben in der Zentrifuge

Umfüllen des Cytosols unter Argon

Anhang 108

10.6 Optimierung der Cytosolherstellung

Abbildung 10.6-1: Elektropherogramme von Kupferspezies in Abhängigkeit von der

Cytosolherstellung

Abbildung 10.6-2: Elektropherogramme von Zinkspezies in Abhängigkeit von der

Cytosolherstellung

Abbildung 10.6-3: Elektropherogramme von Bleispezies in Abhängigkeit von der

Cytosolherstellung

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

200 300 400 500 600 700 800 900 1000Zeit / s

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

mech. Zellaufschluss

Zellaufschluss mit Ultraschall

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

200 300 400 500 600 700 800 900 1000Zeit / s

cps

Zn 6

4 / c

ps G

e 74

meach. Zellaufschluss

Zellaufschluss mit Ultraschall

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

200 300 400 500 600 700 800 900 1000Zeit / s

cps

Pb 2

08 /

cps

Ge

74

mech. ZellaufschlussZellaufschluß mit Ultraschall

Anhang 109

10.7 TXRF Messungen

Tabelle 10.7-1: Ergebisse der TXRF-Messung für die Cytosolproben vor der Acetonitrilfällung

Probea

Nickel-

konzentration /

[µg/L]

Varianz /±

[µg/L]

Kupfer-

konzentration /

[µg/L]

Varianz /±

[µg/L]

Zink

konzentration /

[µg/L]

Varianz /±

[µg/L]

NG 1 12,7 6,90 12,2 6,9 105,2 2,3

TG 1 24,7 4,40 34,7 3,3 433,2 1,8

NG 2 35,9 6,70 334,2 3,5 2146,6 3,3

TG 2 104,3 3,20 271,2 2,7 2195,9 2,5

NG 3 42,8 6,60 333,5 3,6 3963,1 3,5

TG 3 108,6 4,38 428,1 3,6 3449,8 3,5

NG 4 43,2 6,60 284,7 4,2 2884,7 4

entz.G 4b 92,4 5,00 273,7 4,2 3067,8 4

NG 5 186,4 3,1 268,8 2,9 2561,2 2,8

TG 5 146,7 6,5 678,3 5,9 3426,9 5,8

NG 10 107,6 10,1 877,0 37,34 5210,7 205

TG 10 117,4 5,9 261,6 8,4 2227,2 50,1

TG 10 Ultrac 25,1 3,8 282,2 8,9 1957,0 45,4

NG 11 72,9 5,9 199,2 8,8 3837,8 110,6

TG 11 274,8 8,6 173,7 6,4 2115,3 46,7

NG 12 94,0 4,1 132,3 4,4 1270,9 22,81

TG 12 445,2 9,3 136,6 4,6 3707,9 59,9

NG 13 92,0 2,9 48,2 2,1 474,9 6,9

TG 13 121,6 9 209,6 11,3 3357,9 121,76

NG 14 44,7 6 324,7 12,8 3176,8 96,4

TG 14 54,7 6,1 511,9 18,5 4702,1 145,63

NG 15 33,1 4,4 209,2 7,7 2086,2 51,9

TG 15 31,9 6,2 280,9 12,7 3106,2 106,7aTG= Tumorgewebe; aNG= Normalgewebe; bentz.G.= entzündetes Gewebe; cUltra= Cytosolherstellung mit dem

Ultraschalldesintegrator;

Anhang 110

Tabelle 10.7-2: Ergebisse der TXRF-Messung für die Cytosolproben nach der Acetonitrilfällung

Probea

Nickel-

konzentration /

[µg/L]

Varianz /±

[µg/L]

Kupfer-

konzentration /

[µg/L]

Varianz /±

[µg/L]

Zink

konzentration /

[µg/L]

Varianz /±

[µg/L]

NG 1 12,4 7,4 13,5 7,4 102,8 2,4

TG 1 17,4 4,3 18,6 3,6 17,5 7,84

NG 2 11,7 7,1 46,6 3,4 62,1 2,9

TG 2 46,9 2,6 96,6 1,9 318,5 1,6

NG 3 19,3 4,2 108,2 1,9 368,6 1,6

TG 3 24,1 3,4 62,3 2,1 380,7 1,5

NG 4 19,6 5,2 55,6 2,9 110,5 2,4

entz.G 4b 35,0 3,3 81,8 2,3 407,1 1,85

NG 5 90,7 2,1 55,8 2,4 197,8 1,7

TG 5 54,5 3,3 145,3 2,5 164,6 2,4

NG 10 29,0 1,9 29,0 1,8 217,6 3,8

TG 10 36,4 1,2 49,9 1,3 325,9 3,4

TG 10 Ultrac 6,4 1,3 55,4 1,8 152,9 2,8

NG 11 17,4 1 25,4 1,04 172,2 2,3

TG 11 94,1 2,9 27,6 1,8 141,0 3,09

NG 12 36,3 1,1 28,0 1 122,0 1,7

TG 12 259,1 4,3 77,8 2,3 1776,7 19,3

NG 13 41,6 1,1 9,8 0,7 160,9 1,8

TG 13 34,9 2,1 52,3 2,3 836,5 11,79

NG 14 15,5 1,5 227,6 3,9 1178,5 13,5

TG 14 17,4 1,5 271,0 4,3 1425,7 15,6

NG 15 13,7 1,3 101,8 2,2 677,5 7,3

TG 15 9,6 1,8 63,3 2,5 230,8 4,5aTG= Tumorgewebe; aNG= Normalgewebe; bentz.G.= entzündetes Gewebe; cUltra= Cytosolherstellung mit dem

Ultraschalldesintegrator;

Anhang 111

10.8 Gesamtproteinbestimmung

Tabelle 10.8-1: Ergebnisse der Kalibrierung für die Gesamtproteinbestimmung (n=3)

Protein-Standard-

Konz. / [µg/ mL]

mittlere

Extinktion Varianz

Variationskoeffizient

/ [%]

125 0,155 ± 0,0031 9,61×10-6 1,78

250 0,277 ± 0,0035 1,231×10-6 1,27

375 0,413 ± 0,0031 9,61×10-6 0,74

500 0,585 ± 0,0061 3,72×10-5 1,05

y = 0,0011x + 0,0004

R2 = 0,9968

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 100 200 300 400 500

Proteinkonz./[µg/mL]

Abbildung 10.8-1: Kalibriergerade zur Bestimmung des Gesamtproteingehaltes der

Cytosolproben

Extinktion

Anhang 112

Tabelle 10.8-2: Ermittelte Extinktionen und die berechneten Gesamtproteingehalte (n=3)

Probe mittlere

Extinktion

Proteinkonz. /

[mg/ mL]

Varianz /

[mg2/ mL2]

V /

[%]

TG1 0,141 2,55 ± 0,08 6,62×10-3 3,19

NG1 0,165 1,49 ± 0,04 1,37×10-3 2,48

TG2 0,168 3,05 ± 0,20 3,88×10-2 6,46

NG2 0,081 0,29 ± 0,02 4,37×10-4 7,21

TG3 0,140 2,54 ± 0,06 3,48×10-3 2,32

NG3 0,353 6,41 ± 0,22 4,80×10-2 3,42

entz.G4 0,312 5,67 ± 0,64 0,41 11,25

NG4 0,361 6,55 ± 0,24 0,06 3,69

TG5 0,272 4,94 ± 0,27 0,07 5,38

NG5 0,149 1,35 ± 0,09 7,99×10-3 6,62

V = Variationskoeffizient

10.9 Berechnung statistischer Größen für die CE / ICP-MS Kopplung

Tabelle 10.9-1: Wiederholpräzision eines Cytosols für die CE / ICP-MS Kopplung (n=10)

Messungen Zeit Peak 1/[s]

Zeit Peak 2 /[s]

FlächePeak 1

FlächePeak 2

Verhältnis Peakfläche 1zu Peakfläche 2

1 416 439 0,26786 0,21989 1,22

2 430 445 0,27492 0,22255 1,24

3 419 439 0,1977 0,16417 1,20

4 414 434 0,2433 0,20166 1,21

5 429 442 0,2285 0,18679 1,22

6 420 441 0,2177 0,1777 1,23

7 424 439 0,2389 0,1933 1,24

8 423 438 0,2543 0,2099 1,21

9 420 440 0,2789 0,2235 1,25

10 422 437 0,2346 0,1899 1,24

arith. Mittel 421,7 439,4 0,24367 0,198936 1,22Varianz 5,10 2,95 0,0259 0,02013 0,016

Varianz (%) 1,21 0,67 10,63 10,12 1,35

Anhang 113

Tabelle 10.9-2: Abschätzung der Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze der CE / ICP-MS

Kopplung

Gehaltsgröße Meßwert Produkt Quadrat Abw-Quadratexi/ µg/L yi

(Fläche)xi*yi x1^2 (xi-xm)^2 y^i (y^i-yi)^2 yi-ym

5 14666 73330 25 264,06 12537,24531789,4

4

2128,800

10 21107 211070 100 126,5623001,5230

83589217,6

89

-1894,523

20 43263 865260 400 1,5643930,1692

3445114,78

25

-667,169

50 107149 5357450 2500 826,56106716,107

7187395,75

01

432,892

Steigung y-Achsena

bsch

Arithm.Mittel

Arithm. Mittel Sum Abw-Qu

Rest StabMeß

Verf-Stabw

b a xm ym Qx S y,x S xo2092,8646 2072,877 21,250 46546,250 1218,750 2092,0705 0,9996

NWG* BG*µg/L µg/L3,7 14,8

* NWG = Nachweisgrenze; BG = Bestimmungsgrenze (NWG×4 = BG)

10.10 Nickelspeziesanalyse mithilfe der CE / ICP-MS (Probe 1-2 und

10-15)


0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

NGTG

Ni 2+Ni-Spezies I Ni-Spezies II

Anhang 114




0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

NGTG

Ni 2+

Peak 1 Peak 2

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

100 200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

TGNG

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

100 200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

TGNG

Ni-Spezies I

Ni 2+

Ni-Spezies II

Anhang 115




0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

100 200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

NGTG

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

Ni-Spezies II

Ni 2+

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

100 200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

TGNG

NI-Spezies II

Ni 2+Ni-Spezies I

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

100 200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

TGNG

Ni2+

Ni-Spezies II

Anhang 116


Tabelle 10.10-1: berechnete Flächen der Nickelspezies I und II für die CE / ICP-MS und

Flächenverhältnisse für die Proben 1-5 und 10-15

Probe Fläche Spezies I Fläche Spezies II FlächenverhältnisSpezies I zu II

NG 1 0,10371 0,10386 1,00

TG 1 nv 0,08637 0

NG 2 0,15149 0,4008 0,38

TG 2 0,03616 0,37785 0,10

NG 3 0,07169 0,1559 0,46

TG3 0,04542 0,50149 0,09

NG 4 0,04448 0,11868 0,37

entz.G 4 0,04273 0,11702 0,37

NG 5 0,54261 0,47641 1,14

TG 5 0,16283 0,87444 0,19

NG 10 0,47941 0,48335 0,99

TG 10 0,11322 1,09351 0,10

NG 11 0,18375 0,17701 1,04

TG 11 0,12444 0,30753 0,40

NG 12 0,26737 0,43801 0,61

TG 12 1,48654 3,08857 0,48

NG 13 keine klare Auftrennung nv

TG 13 0,09875 0,34881 0,28

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

100 200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

TGNG


Ni 2+

Anhang 117

NG 14 0,0256 0,10961 0,23

TG 14 0,03368 0,13954 0,24

NG 15 0,08506 0,13677 0,62

TG 15 0,06763 0,24257 0,28

Tabelle 10.10-2: Wertetabelle zur Durchführung des t-Test (auf der Ebene von 0,01) für die

Peakflächenverhältnisse (CE / ICP-MS)

Probe NG TG signifikantunterschiedlich

1

1,011,000,991,030,98

00000

ja

2

0,380,370,410,360,40

0,100,090,110,080,11

ja

3

0,460,420,480,450,49

0,090,080,100,070,11

ja

4

0,370,380,390,360,38

0,380,390,360,350,37

nein

5

1,151,141,161,141,13

0,180,170,200,210,19

ja

10

0,991,000,990,970,98

0,090,100,110,110,09

ja

11

1,031,051,041,061,04

0,390,420,400,410,39

ja

12

0,600,610,630,590,64

0,520,480,460,470,48

ja

130,300,290,270,280,27

00000

ja

Anhang 118

14

0,220,230,240,260,22

0,230,250,260,240,24

nein

15

0,600,640,630,620,61

0,270,280,290,300,26

ja

Tabelle 10.10-3: Ergbenisse des t-Test der Peakflächen

Probe 1

Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 1,002 3,7E-4 5B 0 0 5------------------------------------------------------------t = -116,48013p = 3,29823E-14Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

Probe 2Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,384 4,3E-4 5B 0,098 1,7E-4 5------------------------------------------------------------t = -26,10811p = 4,97474E-9Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.


Probe 4Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,376 1,3E-4 5B 0,37 2,5E-4 5------------------------------------------------------------t = -0,68825p = 0,51076Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte NICHT signifikant unterschiedlich.

Anhang 119


Probe 10Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,986 1,3E-4 5B 0,1 1E-4 5------------------------------------------------------------t = -130,63357p = 1,3184E-14Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.



Probe 13Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,282 1,7E-4 5B 0 0 5------------------------------------------------------------t = -48,3626p = 3,6966E-11Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

Anhang 120

Probe 14Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,234 2,8E-4 5B 0,244 1,3E-4 5------------------------------------------------------------t = 1,10432p = 0,30156Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte NICHT signifikant unterschiedlich.

Probe 15Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,62 2,5E-4 5B 0,28 2,5E-4 5------------------------------------------------------------t = -34p = 6,11792E-10Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

10.10.1 Nickel/Kupfer Korrelation bei der CE / ICP-MS


Kupferspezies im Cytosol von NG 1

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies INi- Spezies II

Anhang 121


Kupferspezies im Cytosol von TG 1


Kupferspezies im Cytosol von NG2


Kupferspezies im Cytosol von TG2

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies II

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63


0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60 Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

Anhang 122




Kupferspezies im Cytosol von NG4


Kupferspezies im Cytosol von entz.G4

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60 Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

200 250 300 350 400 450 500 550 600Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

Anhang 123







0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I Ni-Spezies II

Ni-Spezies III

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60 Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

Ni-Spezies III

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63


Anhang 124







0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63Ni-Spezies I Ni-Spezies II

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63


Anhang 125







0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies II

Ni-Spezies II

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

cps

Cu

64 /

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

Anhang 126







0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies II

Ni-Spezies I

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60 Kupfer 63Ni-Spezies II

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

200 300 400 500 600 700 800Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63Ni-Spezies II

Anhang 127





0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

200 300 400 500 600 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Zeit / s

cps

Ni 6

0 / c

ps G

e 74

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

cps

Cu

63 /

cps

Ge

74

Nickel 60Kupfer 63

Ni-Spezies I

Ni-Spezies II

Anhang 128

10.11 Berechnung statistischer Größen für die SEC / ICP-MS

Kopplung

Tabelle 10.11-1: Wiederholpräzision (Rententionszeit) eines Cytosols für die SEC / ICP-MS

Kopplung (n=5)

Peak arith. Mittel der Zeit / [s]

Varianz Variationskoeffizient / [%]

1 1408,71 18,51 1,312 1641,57 6,80 0,413 3025,50 13,28 0,444 3203,29 10,40 0,325 3478,29 13,20 0,38

Tabelle 10.11-2: Wiederholpräzision (Peakflächen) eines Cytosols für die SEC / ICP-MS

Kopplung (n=5)

Messung FlächePeak 1

FlächePeak 2

FlächePeak 3

FlächePeak 4

FlächePeak 5

Flächen-verhältnisse

1 3,70E+07 1,22E+07 1,48E+07 1,34E+07 1,17E+08 1,102 4,72E+07 2,63E+07 2,11E+07 4,77E+07 1,36E+08 1,253 5,33E+07 2,09E+07 4,35E+07 2,28E+07 1,75E+08 0,924 3,00E+07 1,23E+07 1,76E+07 1,44E+07 1,37E+08 1,225 3,55E+07 1,57E+07 1,63E+07 1,85E+07 1,33E+08 0,96

Summe 2,03E+08 8,74E+07 1,13E+08 1,17E+08 6,98E+08 5,45arith. Mittel 4,06E+07 1,75E+07 2,27E+07 2,34E+07 1,40E+08 1,09

Varianz 9,44E+06 6,07E+06 1,19E+07 1,41E+07 2,14E+07 0,14866Variations-koeffizient /

[%]23,25 34,68 52,42 60,25 15,50 13,64

Anhang 129

10.12 Nickelspeziesanalyse mit Hilfe der SEC / ICP-MS Kopplung




0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

sNGTG

35 kDa

9 kDa 6 kDa

4 kDa

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGTG

35 kDa

9 kDa 6 kDa

4 kDa

30 kDa

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGTG

35 kDa9 kDa

6 kDa

4 kDa33 kDa

28 kDa

Anhang 130




0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGTG

35 kDa

9 kDa

6 kDa

4 kDa

33 kDa

28 kDa

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGTG

35 kDa 9 kDa

6 kDa

30 kDa

28 kDa

4 kDa

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

NGTG

35 kDa

9 kDa

6 kDa

4 kDa

30 kDa

28 kDa

Anhang 131

10.12.1 Nickel/Kupfer Korrelation bei der SEC / ICP-MS

Abbildung 10.12-7: Zuordnung der Ni-Spezies über eine Cu-Spezies (6 kDa) der Probe NG 3

Abbildung 10.12-8: Zuordnung der Ni-Spezies über eine Cu-Spezies (6 kDa) der Probe TG 3


0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60 Kupfer 63

9 kDa6 kDa

4 kDa

0

50000

100000

150000

200000

250000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa6 kDa

4 kDa

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

N ickel 60Kupfer 639 kDa

6 kDa

Anhang 132

Abbildung 10.12-10: Zuordnung der Ni-Spezies über eine Cu-Spezies (6 kDa) der Probe

entzündetes G 4



0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

N ickel 60Kupfer 63

9 kDa

6 kDa

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa 6 kDa

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa 6 kDa

4 kDa

Anhang 133




0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa

6 kDa

4 kDa

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa

4 kDa

6 kDa

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa 6 kDa

Anhang 134




0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

Inte

nsitä

t (cu

63)

/ cp

s

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa

6 kDa

4 kDa

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa 6 kDa

4 kDa

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsitä

t (Zn

64)

/ cp

s

Nickel 60Kupfer 63

Anhang 135




0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa6 kDa 4 kDa

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 639 kDa

6 kDa

4 kDa

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

-1000

1000

3000

5000

7000

9000

11000

13000

15000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa6 kDa

4 kDa

Anhang 136


Tabelle 10.12-1: berechnete Flächen der Nickelspezies I und II für die SEC / ICP-MS und

Flächenverhältnisse für die Proben 1-5 und 10-15

Probe Fläche Peak I Fläche Peak II FlächenverhältnisSpezies I zu II

NG 1 1,63E+06 1,02E+06 0,63

TG 1 1,10E+06 nv 0

NG 3 4,62E+06 9,61E+06 2,08

TG 3 5,52E+07 5,11E+06 0,09

NG 4 8,15E+06 2,63E+06 0,32

entz.G 4 4,59E+07 1,32E+07 0,29

NG 5 5,89E+07 5,30E+07 0,90

TG 5 6,69E+07 3,24E+07 0,49

NG 10 3,12E+07 1,83E+07 0,59

TG 10 3,23E+07 1,59E+07 0,47

NG 11 1,56E+07 1,39E+07 0,89

TG 11 1,43E+07 8,63E+06 0,60

NG 13 1,24E+07 1,49E+07 1,20

TG 13 keine Auftrennung Nv

NG 14 6,43E+06 2,96E+06 0,46

TG 14 6,20E+06 3,00E+06 0,48

NG 15 151663,19 130740,57 0,86

TG 15 529376,13 175832,03 0,33

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000Zeit / s

Inte

nsitä

t (N

i 60)

/ cp

s

0

5000

10000

15000

20000

25000

Inte

nsitä

t (C

u 63

) / c

ps

Nickel 60Kupfer 63

9 kDa

6 kDa

Anhang 137

Tabelle 10.12-2: Wertetabelle zur Durchführung des t-Test (Ebene 0,01) für die

Peakflächenverhältnisse (SEC / ICP-MS)

Probe NG TG signifikantunterschiedlich ?

10,580,720,59

000

ja

32,272,091,88

0,080,090,10

ja

40,280,360,32

0,290,330,25

nein

51,010,850,84

0,570,430,47

ja

100,650,550,57

0,420,510,48

ja1

110,990,890,79

0,680,550,57

ja1

131,321,081,2

000

ja

140,550,400,49

0,500,420,44

nein

150,950,750,88

0,380,280,33

ja

1 nur auf einer Ebene von 0,05 nicht auf 0,01

Tabelle 10.12-3: Ergebnisse des t-Test der PeakflächenProbe 1

Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,63 0,0061 3B 0 0 3------------------------------------------------------------t = -13,97128p = 1,52236E-4Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

Probe 3Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 2,08 0,0381 3B 0,09 1E-4 3------------------------------------------------------------t = -17,63527p = 6,07254E-5Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

Anhang 138

Probe 4

Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,32 0,0016 3B 0,29 0,0016 3------------------------------------------------------------t = -0,91856p = 0,4103Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte NICHT signifikant unterschiedlich.

Probe 5

Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,9 0,0091 3B 0,49 0,0052 3------------------------------------------------------------t = -5,9385p = 0,00403Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

Probe 10



Probe 11


Anhang 139


Probe 13

Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 1,2 0,0139 3B 0 0 3------------------------------------------------------------t = -17,62928p = 6,08071E-5Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

Probe 14


Probe 15Daten Mittel Varianz N------------------------------------------------------------A 0,86 0,0103 3B 0,33 0,0025 3------------------------------------------------------------t = -8,11393p = 0,00125Auf der 0,01 Ebenesind beide Mittelwerte signifikant unterschiedlich.

Documents

Nickelspeziesanalyse im Cytosol humaner intestinaler ... · für die Einführung in die Tiefen der CE / ICP-MS Kopplung und seine Hilfestellung bei auftretenden Problemen der Kopplung