Микробиом:современныйвзгляд

КафарскаяЛюдмилаИвановнаЕфимовБорисАлексеевичРНИМУим.Н.И.Пирогова

Кафедрамикробиологииивирусологии

Для изучения микробиоты на протяжении долгих лет использовались классические бактериологические методы. Значительные успехи в области изучения микробиотыв последние годы во многом связаны с использованием молекулярно - генетических технологий. В 2013 завершены Крупные международные многопрофильные проекты Human Microbiome Project (HMP) и metaHIT initiatives, 13 институтов из 8 стран В РФ «Метагеномный анализ биоценоза ЖКТ», выполняется в рамках консорциума «Русский метагеном» Реализуются новые направления – метагеномика, метаболомика, метатранскриптомика, протеомика.

Микробиота

Микробиота

•  В на с тоящее время микробио та(нормальная микрофлора) кишечникарассматривается как дополнительный( в и р т у а л ь ный ) м н о г о к л е т о ч ныйметаболически активный «орган»с а м о в о с с т а н а в л и в ающи й с я п р иизменениях, вызванных внешнимифакторами.

Концентрациямикроорганизмовв1фекалийот107втонкойкишке,до1012-14втолстой.

Наборгенов,входящихвсоставбактериальногометагенома,всторазпревышаетнаборгеновчеловеческогоорганизма.

ВДНКчеловекаидентифицировано23000генов.

Вмикробиоме—более10млнгенов.Около 60% фекальных масс составляет бактериальнаяпопуляция. Более 95% бактерий у взрослого человека, принадлежат коблигатныманаэробам;700-800могутбытьвыделеныкультуральнымиметодами.

Методы изучения микробиоты

Культуральныеметоды.Выделениеиидентификациямикроорганизмов

Некультуральные методы – молекулярно-генетические

Методы изучения микробиоты

•  Культуральные методы вмикробиологии остаютсяважными для изучениямикробногоразнообразия,д л я с е л е к т и в н о г ов ы д е л е н и япредставителей основныхфункциональных групп, втом числе патогенныхмикроорганизмов.

•  Ме т о ды т р у д о ем к и ,д л и т е л ь н ы е ,дорогостоящие.

Методы изучения микробиоты •  К у л ь т и в и р о в а н и е

облигатных анаэрбов. А к т и в н ы е ф о р м ы к и сл орода обладают высокой реакционной способностью, вызывают инактивацию ферментов, повреждают молекул ДНК, перекисное окисление липидов.

•  К у л ьт и в и р о в а н и е в анаэробных условиях, в

•  микроанаэростатах. •  С р е д ы Ш е д л е р а , Колумбийский агар с кровью

Методы изучения микробиоты•  Насосаудаляетсявоздухинакачиваетсябескислороднаягазоваясмесь,содержащая80%N2,10%CO2и10%H2.

•  ПалладиевыекатализаторыкатализируютсвязываниеO2сH2.

•  ВозможенпосевоблигатныханаэробовначашкиПетри

Методы изучения микробиоты•  Для культивирования облигатных

(особострогих)анаэробов•  Пробирки Хангейта, которые

закрываются завинчивающимисяпластиковыми крышками совставкойизрезины.

•  П р и п о с т о я н н о м п о т о к ебескислородногогазаразливаетсяп о п р о б и р к а м Х а н г е й т аагаризованнаяпитательнаясреда,проводитсяавтоклавирование

•  Посев в незастывшую средуосуществляется путём уколастерильным шприцом сквозьрезиновую вставку, с помощьювращения пробирки добиваютсяравномерного распределениясредыпоеёстенкам.

Биохимическаяидентификация

Методы изучения микробиоты•  «Классическаямикробиология»-фенотипическиеметодыидентификации

•  Отсутствиеединойконцепцииэволюцииисистематикибактерий

«Новаямикробиология»

•  Основананагеносистематике•  Физико-химическиеметодыанализа

Методы изучения микробиоты

•  М а с с - с п е к т р о м е т р и я — м е т о дидентификации молекул путем измеренияо тношения и х ма с сы к з аряду вионизированномсостоянии.

•  M A L D I ( M a t r i x A s s i s t e d L a s e rDesorpson' Ion izason) — ионизациявещества с помощьюматрицыи лазерногоизлучения.TOFMS(TimeOfFlightMass-Spectrometry)—времяпролетнаямасс-спектрометрия.

Выборколониидляидентификации Нанесениематериалаизколониинаслайд

Внесениеподготовленногослайдавприбордляполученияспектрабелковиидентификациибактерии(1минута/образец)

Нанесениематрицынаобразец(1μlαСHCA-коричнаяк-та)

СхемаиспользованияVitecMSPlusдляидентификациимикроорганизмоввклиническоймикробиологическойлаборатории

СхемаработыMALDI-TOF-MSанализатора

•  На подложку масс-спектрометра наносят биоматериал из колонии бактерий, смешивается с раствором матрицы, и при испарении растворителя образуется совместный кристалл из них

•  Образец помещают в прибор, в котором создается вакуум и подвергают воздействию лазерных импульсов, испаряются кристаллы матрицы содержимое микробных клеток ионизируется

•  Под дейс т вием эле к тричес к о го поля ионизированные белки движутся к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам

Масспектрометрия

9 . 0 0 1 0 . 0 0 1 1 . 0 0 1 2 . 0 0 1 3 . 0 0 1 4 . 0 0 1 5 . 0 0 1 6 . 0 0

1 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0 0

1 e + 0 7

1 . 1 e + 0 7

1 . 2 e + 0 7

1 . 3 e + 0 7

1 . 4 e + 0 7

1 . 5 e + 0 7

1 . 6 e + 0 7

1 . 7 e + 0 7

1 . 8 e + 0 7

1 . 9 e + 0 7

2 e + 0 7

2 . 1 e + 0 7

2 . 2 e + 0 7

2 . 3 e + 0 7

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : K A F - 3 - 2 - 1 . D

Программное обеспечение прибора оценивает время пролетачастиципреобразует этуинформациюв спектрмолекулярныхмасс (масс-спектр).Масс-спектр сравнивается со спектрами избазыданных,происходитидентификациямикроорганизмов наоснованиисведенийомассаххарактеристическихбелков.

Стандартныйвидрабочегоокнамониторавпроцессевыполнениямасс-спектрометрическогоисследованияприработеVitecMSPlus

Масспектрометрия

• Точность:достовернаяидентификациядоуровняподвидов.• Скорость:автоматическаяидентификацияклиническихизолятоввтечениенесколькихминут.• Универсальность:единыйпротоколпробоподготовкидлявсехмикроорганизмов.

ПЦР в реальном времени

•  Молекулярно-генетическиеметоды

•  При проведении Real-TimeП Ц Р о д н о в р е м е н н опроисходят амплификация,детекция и количественноеопределениеспецифическойпоследовательности ДНК вобразце, автоматическаяр е г и с т р а ц и я иинтерпретация полученныхрезультатов

Секвенирование•  Общее название физико-химических методов определения аминокислотных остатков в белках и последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах.

•  Секвенирование гена 16S рРНК – использует данные о нуклеотидных последовательностях выделенных чистых культур

•  Ген 16S рРНК выбран как универсальный маркер для видовой идентификации: он имеется в геномах всех прокариот и о б л а д а е т т н о с и т е л ь н о м а л о й изменчивостью.

Секвенирование•  Пр оч т е н и е п о с л ед о в а т ел ь н о с т и осуществляется с помощью постановки ПЦР с праймерами под ген 16S рРНК с п о с л е д у ю щ е й о ч и с т к о й Д Н К и секвенированием.

•  Далее последовательность сравнивается с к о м п ь ю т е р н о й б а з о й д а н н ы х с использованием алгоритма BLAST.

•  Методсеквенированиягена16SрРНКявляется«золотым стандартом» точности видовойидентификациибактерий.

Типысеквенированияразличаются:

• –Маркерныегены(16SrRNAидр.) • –Полногеномное(shotgun=whole-genome=WGS) • •Попроизводительности

• –ПоСенгеру(метод«обрывацепи») • –Высокопроизводительное(high-throughputsequencing)–Illumina,SOLiD,454,IonTorrent,…

• •Подлинеридов(ДНК-прочтений) • –Длинные(400-1000пн) • –Короткие(35-100пн)

СеквенированиеДНКпоСангеру•  Э т о т м е т о д б ы л

использован в проектахпо секвенированиюг е н о м а ч е л о в е к а ,бактерийивирусов.

•  Н е п о д х о д и т д л ябыстрого рутинногос е к в е н и р о в а н и ягеномов в клиническихцелях,дорогостоящее.

•  Пр е им уще с т в о – с е к в е н и р у е т с я длинный участок ДНК

Пиросеквенирование

•  Roche/454LifeSciences. •  В с е п л а т ф о рмы 4 5 4 т и п а

используютпиросеквенирование,•  Пиросеквенирование это метод секвенирования ДНК, основанный на принципе « с е к в е н и р о в а н и е п у т е м синтеза» . При включении нуклеотида происходит детекция в ы с в о б о ж д а ю щ и х с я п и р оф о сф а т о в , к о т о р ы й с в я з ы в а е т с я с б е л к о м лю ц иф е р а з о й ( б ел о к и з светлячков)

Секвенатор

Высокопроизводительное секвенирование

•  Высокопроизводительное секвенирование •  Ion Torrent Методология секвенирования: п о с л е д о в а т е л ь н о е у д л и н е н и е ол и г о н у к л е о т и д н о й з а т р а в к и ДНК -полимеразой с одновременной регистрацией л о к а л ь н о г о и з м е н е н и я р Н н а полупроводниковом микрочипе.

Метагеномика•  Метагеномика – наука, изучающая совокупность всего генетического материала, полученного из биологического материала или окружающей среды

•  Основным отличием при использовании мета геномно го подхода является учет некультивируемых микроорганизмов наряду с культивируемыми.

•  Задачи метагеномики: •  О п р е д е л и т ь т а к с о н о м и ч е с к о е

( филогенетическое) положение микроорганизмов – « Кто они?»

•  Определить функциональное состояние микробиоты, как осуществляют взаимодействие друг с другом «Что делают?»

Классификациямикроорганизмов•  Eukaryota- наличие ядра, внутренних мембранных

структур, сложный цитоскелет, наличие процессовмитозаимейоза.

•  Bacteria –отсутствие ядра, внутренних мембранныхструктур. В составе клеточной стенки пептидогликан,отсутствиеэндоцитозаиэкзоцитоза.

•  Archaea- особый химический состав мембран: онипостроенынаосновепростыхэфировфосфоглицеролаитерпеновыхспиртов.

•  Несодержатпептидогликанавклеточнойстенке,имеютособоестроениерибосомирибосомальныхРНК.

Микробиота(нормальнаямикрофлора)–совокупностьвсехмикроорганизмов,населяющихэкологическуюнишу

• Бактерии• Археи• Вирусы• Эукариоты(микроскопическиегрибы)

Микробиота

Все клеточные формы жизни на основании сравнительного анализапоследовательностиих16SрДНКидругихфундаментальныхразличий(аппараты трансляции и транскрипции, организация генетического материала идругое)разделенына

3домена

ВacteriaArchaeaEucaria(Eubacteria-истинныебактерии)Группированына27типов,вт.ч.:ProteobacteriaFirmicutesAc0nobacteriaBacteroidetesSpirochaetesChlamydiaeTenericutesCyanobacteria(сине-зеленыеводоросли)

•  Основнойсостав•  микробиотыинтестинального

тракта•  Представлен7основными•  Типами(филами)•  Микроорганизмов•  Firmicutes,•  Bacteroidetes,•  Ac0nobacteria,•  Proteobacteria•  Verrucomicrobia•  Fusobacteriа,•  Spirochaetes

Микробиота

Микробиота•  Низкоесодержаниебактерийвжелудкеи12-перстнойкишке103КОЕ/мл.

•  Увеличениеконцентрациив•  jejunumиileum104–108КОЕ/мл.•  Максимальнаяконцентрациядостигаетсявтолстойкишке109–1013КОЕ/мл.

Микробиота•  Б а к т е р и а л ь н а я э к о с и с т е м а пищеварительного тракта усиливает метаболические возможности хозяина, расщепляя сложные растительные полисахариды, в результате образуются короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) –ацетат, пропионат и бутират.

•  Бутират – масляная кислота, стимулирует рост и пролиферацию энтероцитов, является основным энергетическим субстратом для клеток кишечника.

• 

Микробиота•  Ацет а т – у кс усн ая к и слот а , метаболит многих индигенных бактерий кишечника проходит через печ ень , пос т у п а е т в к ровь , с т а н о в и т с я э н е р г е т и ч е с к им субстратом для клеток тканей и органов: мышечной ткани, сердца, почек.

•  Уксусная и молочная кислота регулируют уровень РН, моторную и секреторную активность кишечника

Микробиота•  Бутират регулирует экспрессию генов, связанных

с процессами пролиферации, дифференциации и

апоптоза эпителиальных клеток

•  Бутират индуцирует в эпителиальных клетках

кишечника продукцию антимикробных пептидов,

обладает и прямой антимикробной активностью

•  Стимулирует синтез муцина и секрецию слизи

•  Усиливает процессы репарации поврежденной

слизистой путем ускорения клеточной миграции,

участвуют в общем обновлении слизистого слоя

Анализ результатов секвенированиябиблиотек 16S рРНК и метагеномовбактериальных популяций, населяющихкишечникздоровыхлюдейразныхвозрастовпоказал высокий уровень встречаемостицелого ряда умеренно представленных,н о вых б а к т е ри ал ьных фило т ипо в ,относящихся в основном к трем филумам –Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, и(Wylieetal.,2012).

Микробиота

Микробиота•  Преобладающими в интестинальном трактечеловекаследуетсчитать

•  Firmicutes(49.%),•  Bacteroidetes(30%)•  Proteobacteria(3%),•  Ac0nobacteria(0.4-1%)•  Низкое содержание факульта тивноанаэробных энтеробактерий обусловленорядом факторов, в т.ч. строго анаэробнойсредойтолстойкишки

Микробиота•  ТипFirmicutes•  ПорядокClostridiales,•  Наиболее часто представлен семействамиLachnospiraceae(23.5%)

•  Ruminococcaceae(13.6%).•  Clostridiaceae(2%)•  Микроорганизмы, представители первых 2-хс е м е й с т в с п о с о б н ы э ф ф е к т и в н оферментировать пектин и целлюлозу-важнейшие пищевые волокна, которыеспособны расщепляться только ферментамибактерийвтолстойкишке

Микробиота

•  Около 30% от общей численности бактерий,населяющихтолстыйкишечникздоровоговзрослогочеловека принадлежат к порядку BacteroidalesфилумаBacteroidetes(Arumugametal.,2011).

•  Данная таксономическая группа включает в свойсоставоблигатно-анаэробные,неспорообразующие,неподвижные, Грам-отрицательные бактерии, восновномсферментирующимтипомметаболизма.

•  В последние полтора десятилетия достижения вмолекулярной филогении привели к существеннымизменениямвтаксономиипорядкаBacteroidales.

• 

Микробиота•  Множествовидов,ранееотносившихсякродуBacteroides были реклассифицированы вновые роды и семейства внутри порядкаBacteroidales (Rauso et al., 2003; Sakamoto &Benno,2006;Hardhametal.,2008).

•  Былооткрытоиописанобольшоечислоновыхродовивидов,включаяроды–представителисемейств Porphyromonadaceae (Petrimonas,Barnesiella, Macellibacteroides) и Rikenellaceae(AlisKpes) (Grabowski et al., 2005; Sakamoto etal.,2007;Jabarietal.,2012).

Микробиота•  Тип Bacteroidetes •  Порядок Bacteroidales (грамнегативные облигатные анаэробы, неспорообразующие, с ферментативным типом метаболизма).

•  Семейства: •  Bacteroidaceae (12.6 %), •  Prevotellaceae (6.6 %) •  Porphyromonadaceae (6%) •  Rickenellaceae (3.6%).

Микробиота•  Семейство Bacteroidaceae •  Род Bacteroides

B. ovatus, B.vulgatus, B. fragilis,

•  B. thetaiotaomicron. •  Не к от о рые штаммы B .

fragilis, •  продуцируют энтеротоксин- ф р а г и л и з и н - ц и н к с о д е р ж а щ а я металлопротеиназа,

•  н а р у ш а е т с т р у к т у р н о -функциональные контакты между э п и телиоци тами кишечника (Е -кадхерин ) , вызывая их эксфолиацию и гиперсекрецию жидкости.

Микробиота•  Продукция фрагилизина кодируется геном (bft)

•  У пациентов с колоректальным раком чаще обнаруживался B. fragilis,

•  имеющий гены bft, чем в контрольной популяции.

•  Возможность B. fragilis длительно поддерживать воспалительный процесс

Микробиота

•  Сем. Prevotellaceae •  Род Prevotella, •  P. melaninogenica

Микробиота

•  Сем. Porphyromonadaceae •  Род Porphyromonas gingivalis •  Porphyromonas endodontales •  Barnesiella viscericola •  Petrimonas •  Coprobacter fastidiosus новый род в 2013 году впервые описан на кафедре микробиологии РНИМУ

•  Coprobacter secundus – новый вид в 2015 впервые описан на кафедре микробиологии РНИМУ

Микробиота•  Rickenellaceae •  Rikenella •  Alistipes finegoldii •  Alistipes inops новыйвидв2015впервыеописаннакафедремикробиологииРНИМУ

Микробиота

•  Наиболее широко представлены с ем е й с т в а R u m i n o c o c c a c e a e , Lachnospiraceae и Clostridiaceae (Firmicutes phylum) и Bacteroidaceae, Rikenellaceae, Porphyromonadaceae and Prevotellaceae (Bacteroidetes phylum)

Факторы,влияющиенасоставмикробиоты

•  Изменение состава микрофлоры кишечника у детей раннего возраста связано со многими факторами , основными являются постепенные изменения в диете при переходе от естественного вскармливания к продуктам детского питания и продуктам, характерным для взрослых , а также созреванием иммунной системы под влиянием антигенной стимуляции.

Результаты метагеномного севенирования фекалий ребенка на протяжении 2,5 лет

•  Филогенетическое разнообразие микробиомы проявляется постепенно по мере взросления ребенка.

•  Гены, функционирование которых связано с метаболизацией углеводовов, содержащихся в продуктах растительного происхождения появлялись в микробиоме ребенк а находящегося исключительно на грудном вскармливании, еще до введения прикорма

Результаты метагеномного севенирования фекалий ребенка на протяжении 2,5 лет

•  На фоне лихорадочного состояния в метагеноме регистрировали гены вирусов и грибов.

•  Введение раститительной пищи, в к люч ающей г о р о х и б о б о вые с п о с о б с т в о в а л о п о в ы ш е н и ю численности порядка Bacteroidales, повышало концентрацию КЖК

Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке

•  П р о в е д е н о с е к в е н и р о в а н и е (высокопроизводительное 454 Roche) гена 16S рнк

•  94% всех образцов принадлежали к доминирующим у всех людей типам Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes,

•  and Proteobacteria. •  Значительные различия выявлены в соотношении этих типов.

Микробиота детей, в возрасте 1-6 лет проживающих в Западной Европе и Африке

•  Prevotel la, Xylanibacter (Bacteroidetes) абсолютно доминировали в БФ (Африка) 53% и 20% соответственно.

•  Firmicutes в Африканской стране (БФ) составляли лишь 12% (Acetitomaculum, Faecalibacterium, Subdoligranulum).

•  Микробиота детей в странах Европы – доминировали Firmicutes 51%

Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке

•  Диета играет очень важную роль и определяет состав микробиоты.

•  Пищевые продукты употребляемые в Африканских странах содержат клетчатку, бобовые, растительные полисахариды – преимущественно вегетарианская пища. При этом низкое содержанием жира и животного белка.

•  Диета с высоким содержанием волокон способствует увеличению «полезной» фракции микробиоты и ее разнообразию

Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке

•  Западная диета характеризуется высоким содержанием животного белка, жира, у г л е в о д о в , к р а х м а л а и н и з к и м содержанием волокон.

•  Способствует росту неинфекционных кишечных заболеваний ( НЯК, б-нь Крона).

•  Оказывает влияние географическое положение страны, уровень гигиены

Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке

Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке

•  П р о в е д е н о с е к в е н и р о в а н и е (высокопроизводительное 454 Roche) гена 16S рнк

•  94% всех образцов принадлежали к доминирующим у всех людей типам Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes,

•  and Proteobacteria. •  Значительные различия выявлены в соотношении этих типов.

Задачиисследования

••  Исследовать образцы фекалий от здоровыхлюдейразличноговозрастасиспользованиемвысокопроизодительного секвенированиябиблиотекгенов16SрРНК.

•  • И с с л е д о в а т ь т е ж е о б р а з ц ы сиспользованиембактериологическогометода

•  •Охарактеризовать штаммы бактерий,относящихся к новым видам путем изученияих хемотаксономических признаков исеквенированиягеномныхДНК.

•  •Описатьновыебактериальныевиды.

Результаты бактериологического исследования • Всего от 12 человек выделено 836 штаммов анаэробных и факультативно-анаэробных бактерий. • Среди них определены 121 вид, 48 родов, 11 порядков, 10 классов, 5 филумов домена Bacteria. • Cреди них определены 7 кандидатов в новые виды бактерий (роды Alistipes, Coprobacter, Bacteroides, Prevotel la, семейство Porphyromonadaceae, семейство Ruminococcaceae, Lachnospiraceae), каждый из которых представлен 1-2 штаммами

• Спасибозавнимание