Peptidinspirierte Materialentwicklung - E-LIBelib.suub.uni-bremen.de/edocs/00102824-1.pdf · 5.2.3 Partikel/Peptid-Hybride.....100 6 Zusammenfassung und Schlußfolgerung 107 7 Ausblick

PeptidinspirierteMaterialentwicklung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

vorgelegt demFachbereich der Fakultat fur Biologie und Chemie

Universitat Bremen

Dipl. Chem. Katharina Richter

Bremen, 2012

Dem Fachbereich II der Fakultat fur Biologie und Chemie als Dissertation vorgelegt.

Eingereicht am: 15.06.2012Tag der mundlichen Prufung: 26.07.2012

Promotionskommission

Vorsitzender Priv.-Doz. Dr. Andreas HartwigErstgutachter Priv.-Doz. Dr. Andreas HartwigZweitgutachter Prof. Dr. Franz-Peter MontfortsBeisitzer Prof. Dr. Wolf-Dieter Stohrer

Dr. Klaus RischkaArne StraßburgAnastassija Wittmer

Hiermit versichere ich, die vorliegende Dissertation ohne unerlaubte fremde Hilfeund nur unter Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt zuhaben. Alle wortlich oder inhaltlich entnommenen Stellen der benutzten Werke sindals solche kenntlich gemacht.

Aphorismus

”Die Curiositas war und ist die entscheidende Triebfeder der modernen Wissensgesellschaft.

Bis ins 18. Jahrhundert hinein bedeutete die Neugierde eine Todsunde. Aus der Perspekti-ve der Kirchen entsprang sie einem Vorstoß gegen das gottliche Privileg der Allwissenheit.(...)In dem Maße, wie sich die Curiositas aus dem Bannkreis der kirchlichen Verbote befrei-en konnte, trieb sie eine Bewegung voran, die das Denken der Welt im wissenschaftlichenMaßstab ermoglichteI

INachzulesen in ’Motive der Forschung’ von Peter-Andre Alt in der Frankfurter AllgemeinenZeitung - Feuilleton vom 10 Februar 2012.”

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Theorie 3

2.1 Marine Adhasive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2 Adsorptionsmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.3 Peptidvermittelte antimikrobielle Aktivitat . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.4 Synthese von Proteinen und Peptiddesigns . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.5 Analytische Ansatze zur Untersuchung der Wechselwirkungen vonPeptiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.6 Oberflachenchemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3 Zielstellung 29

3.1 Peptidsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.2 Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden mit Oberflachendurch Sequenzvariation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.3 Oberflachenmodifikation mit Peptiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

4 Materialien und Methoden 33

4.1 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.1.1 Peptidsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.1.2 Synthese Fmoc-L-DOPA-(TBDMS)2 (S1) . . . . . . . . . . . . 36

4.1.3 Abwandlungen vom SPPS-Protokoll . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.1.4 MALDI-ToF-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.1.5 QCM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.1.6 Spektroskopische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.1.7 Thermogravimetrische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.1.8 Antimikrobielle Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

v

vi Inhaltsverzeichnis

4.1.9 Prufung von Adhasivverbindungen . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1.10 Oberflachenmodifikation mit Peptiden . . . . . . . . . . . . . . 48

4.2 Chemikalien und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

5 Ergebnisse und Diskussion 59

5.1 Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden mit Oberflachendurch Sequenzvariation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

5.1.1 Betrachtung der Grenzflachensituation auf SiO2 und Titan inAdsorbatlosung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

5.1.2 Messung der Peptidadsorption mit QCM-Experimenten . . . . 66

5.1.3 Quantitative Analyse der Peptidadsorption durch XPS Mes-sungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

5.1.4 Analyse der Peptidadsorption durch IRRAS Messungen . . . . 78

5.1.5 Prufung von Adhasivverbindungen . . . . . . . . . . . . . . . . 79

5.1.6 Zusammenfassung der durch Sequenzvariation erzielten Ergeb-nisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

5.2 Oberflachenmodifikation mit Peptiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

5.2.1 Immobilisierung von Peptiden aufgrund elektrostatischerWechselwirkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.2.2 Immobilisierung von Peptiden uber gezielt aufgebaute Bindun-gen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.2.3 Partikel/Peptid-Hybride . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

6 Zusammenfassung und Schlußfolgerung 107

7 Ausblick 109

A Abkurzungen 111

B Ergebnisdetails QCM 113

C Veroffentlichungen 115

Literatur 117

Danksagung 124

Kapitel1Einleitung

Die erste, der im Duden vorgeschlagenen vier Definition, fur den Begriff Materi-al reprasentiert bereits einen Sammelbegriff:

”Ein Material ist ein Stoff, Werkstoff

oder Rohstoff, aus dem etwas besteht oder gefertigt wird“ [1]. Das sehr breite Spek-trum technischer Anwendungsgebiete, das sich aus dieser Definition ableiten lasst,beschreibt zutreffend das Potential, welches der Materialentwicklung innewohnt.Unter dem Eindruck der Ressourceneffizienz und leistungsstarker naturlicher Mate-rialien entstand der Zweig der bioinspirierten Materialentwicklung. Diese beinhaltetauch die peptidinspirierte Materialentwicklung, die sich auf die proteinogenen Vor-bilder von Organismen konzentriert.Die Faszination der biologisch orientierten Materialentwicklung ruhrt aus Beobach-tungen erstaunlicher naturlicher Phanomene wie der Haftwirkung des Geckofußesoder antimikrobieller Peptide im Rahmen der angeborenen Immunabwehr her. Diesenaturlichen Vorbilder treiben die Entwicklung verbesserter Materiallosungen voran.Die Motivation besteht darin, die Verknupfung einfacher physikalischer und chemi-scher Prinzipien, die die Natur mannigfach nutzt, wie der Adhasion unter Wasser,auf technische Losungen zu ubertragen. Dies zielt auf die bereits integrierte Ver-traglichkeit mit der Umwelt und im Rahmen sensibler Einsatzgebiete, wie in der Me-dizin, auf die Biokompatibilitat ab. Weiterhin erleichtert die Analogie zu naturlichenVorbildern die Integration neuer Materialien in den Stoffkreislauf ohne Ressourcenwie Nahrungsmittel zu belasten. Eine Herangehensweise, um ein besseres Verstandnisder naturlichen Wirkprinzipien zu entwickeln, stutzt sich auf die Betrachtung dermikroskaligen Ebene und der von molekularen Wechselwirkungen. Diese bilden dieBasis der belebten und unbelebten Natur. Molekulare Wechselwirkungen zu verste-hen, stellt eine notwendige Voraussetzung dar, um biologisch spannende Phanomenein der Technik nutzen zu konnen.Beispielsweise laßt sich die Funktion des

”an-der-Wand-laufens“, wozu Geckos in

der Lage sind, auf eine Mikrostrukturierung der Kontaktflachen, des Gecko-fußeszuruckfuhren. Dadurch werden die Gesetze der Physik in kleinsten Dimensionen ge-nutzt. Diese prazise fur die naturlichen Bedurfnisse angepaßten Losungen wurdenevolutionsbedingt in vielen Generationen optimiert. Dadurch sind naturliche Quellender Inspiration ausgesprochen attraktiv, was in die Forschungsbemuhungen der Bio-niker mundete [2].

1

2 Kapitel 1. Einleitung

Die Natur bietet weitaus mehr faszinierende Phanomene, als nur die oben genann-ten: Dazu zahlen vor allem neben okologischen und okonomischen auch pharmazeu-tisch/kosmetische Interessen [3]. Die Herausforderung im pharmazeutischen Sektorbesteht ebenso in der Aufklarung des ursachlichen Zusammenhangs zwischen Natur-stoffen und ihrer Wirkung. Ein wirtschaftlich bedeutsamer Markt liegt zum Beispielim Bereich der antimikrobiellen Wirkstoffe, die aus Reptilien isoliert werden konnen,wie im Fall der antimikrobiellen Peptide. Auch wenn in der Betrachtung des Immun-systems schnell deutlich wird, daß es nahezu unmoglich ist, dieses komplexe Netzwerkaus angeborener und erworbener Abwehr zu immitieren.Des Weiteren ist das Phanomen der Bioadhasion, die zum Teil beeindruckende Krafteauszuhalten im Stande ist, ein weites Feld unterschiedlichster Ursache-Wirkungs-Beziehungen[4] und damit Ausgangspunkt fur medizinische Anwendungen wie zumBeispiel Knochenklebstoffe.

Zielstellung

Die Ubertragung von Phanomenen aus der Natur in die Technik, besonders wenn essich um biochemische Prozesse und Interaktionen handelt, wird nur dann gelingen,wenn die zu Grunde liegenden molekularen Wechselwirkungen nachvollzogen wurden.

Fur den Bereich der peptidinspirierten Materialentwicklung werden in der vorliegen-den Arbeit unterschiedliche Phanomene exemplarisch behandelt, sowie deren Starkenund Schwachen diskutiert.Hierbei wird versucht, einen Bogen zu spannen von dem grundlegenden Verstandnisdieser Phanomene wie zum Beispiel den molekularen Wechselwirkungen der Adhasionbis hin zur Realisierung technischer Anwendungsmoglichkeiten fur neue Klebstoffe.

Vor dem Hintergrund dieser Fragestellung war es notwendig, die vorliegende Arbeitin zwei experimentelle Abschnitte zu untergliedern.Der erste Abschnitt (5.1) beschaftigt sich mit der Analytik und der Beschreibung desursachlichen Phanomens am Beispiel der Interaktion von Peptiden mit Oberflachenund untereinander.Im zweiten Abschnitt (5.2) steht die Oberflachenfunktionalisierung mit funktionellenPeptiden im Vordergrund.Bei den ausgewahlten Fallbeispielen handelt es sich um Themenfelder, die sowohlvon hohem wissenschaftlichem, als auch von wirtschaftlichem Interesse sind. Diesumfaßt unter anderem Peptide mit adhasiven oder antimikrobiellen Eigenschaften.Entsprechend der Zielstellung, wurden daraus zwei Fragestellungen abgeleitet: Diesbetrifft die Untersuchung des Wechselwirkungspotentials der Peptide und die Fragenach der Oberflachenfunktionalisierung mit Peptiden.

Kapitel2Theorie

”Adhesion is a way of life in the sea.“, Herbert Waite (1983), einer der Pioniere

auf dem Gebiet der marinen Adhasionsforschung, fasste mit diesem Satz die Faszi-nation der Haftung unter Wasser zusammen. Die Bestrebungen in der Medizin mitsynthetischen Adhasiven auf intrinsisch feuchten Substraten vergleichbare Haftungzu erzielen, stellen bis heute eine Herausforderung dar [5]. Ganz abgesehen von einerin wassrigem Milieu vorgenommenen Adhasivfugung. Dabei konzentriert sich das In-teresse im Zusammenhang mit den marinen Vorbildern vor allem auf proteinogeneAdhasive, da diese einen großen Anteil der nativen Adhasive unter Wasser ausmachen.Die Entwicklung daraus abgeleiteter Adhasivsysteme brachte neben weiteren bioin-spirierten technischen Losungen, wie antimikrobieller Oberflachen oder intelligenterHydrogele, die polymere Biokonjugation hervor [6]. Dabei handelt es sich um die An-bindung eines Biomolekuls oder seines AnalogonI an ein synthetisches Polymer. Diedaraus generierten hybriden Materialien vereinen schließlich sowohl die Eigenschaf-ten der Biomolekule, als auch die des gewahlten Polymers. Hierbei kann es sich umwirtschaftliche wie auch materialtechnische Vorzuge handeln. Jene Vorzuge optimalzu nutzen, bedingt die Identifikation geeigneter Biomolekule und Analoga. Dem gehtdie Analyse von Struktur-Wirkungs-Beziehungen voraus. Am Beispiel der Proteineleiten sich diese zuweilen aus Reaktionskaskaden ab und erfordern die Prasenz vonCofaktoren. In anderen Fallen spielen einzelne Domanen innerhalb der Peptidsequenzeine zentrale Rolle, um eine Wirkung zu vermitteln [7, 8]. So wurden fur die Adhasionan bestimmten Zellen unterschiedliche Domanen als ursachlich identifiziert. Das Be-streben von Proteinen auf Oberflachen zu adsorbieren, laßt sich demnach nicht ohneweiteres verallgemeinern, zu vielschichtig ist der Adsorptionsprozess. Dies gilt gene-rell fur Prognosen bezogen auf intermolekulare Wechselwirkungen zwischen Proteinenin komplexen Medien oder auf Oberflachen. Allgemein geht dem Verstandnis derar-tiger Wechselwirkungen die Aufklarung der Aminosaureabfolge und entsprechenderintramolekularer Wechselwirkung, ihrer Tertiarstruktur, in den gewahlten Medienvoraus. Die Berucksichtigung des Mediums ist sinnvoll, da die Aktivitat sich in derRegel auf das solvatisierte Protein beschrankt. Die darauf aufbauende Abschatzung zuweitergehendem Interaktionspotential mit weiteren solvatisierten Proteinen oder mitOberflachenmolekulen erfordert eine Systemreduktion. Davon betroffen ist zunachst

Ichemische Verbindung mit gleicher biologischer Wirkung.

3

4 Kapitel 2. Theorie

die Abstraktion des Proteins auf PeptiddimensionII, gleichermaßen wie die idealisier-te Annahme eines Festkorpers. Im Falle der Beschreibung der Adsorption auf einerOberflache folgt darauf eine Abstraktion der Grenzflache. Die Grundlagen zu denin dieser Arbeit vorgenommenen Annahmen bezuglich der Abstraktion werden hiervorgestellt. Dazu werden zunachst die Herkunft und Besonderheiten des im Fokusbefindlichen Proteins beleuchtet. Im zweiten Teil wird die Oberflachenchemie dergewahlten Oberflachen Siliziumdioxid und Titanoxid erlautert und der Begriff Ober-flachenaffinitat bezogen auf Literatur bekannte Systeme vorgestellt.

2.1 Marine Adhasive

Die Fahigkeit einiger mariner Organismen in Seewasser effektiv und daruber hinausan beliebigen Oberflachen anzubinden, spiegelt ihre Uberlegenheit gegenuber klassi-schen Fugetechnologien wider [9]. Der Reiz sich diese Fertigkeit durch Imitation derNatur technisch zunutze zu machen, zeigt sich in den Veroffentlichungen und Paten-tanmeldungen der letzten Jahrzehnte [4, 6, 10–13]. Dabei sind die Zusammenhangezwischen Struktur und adharenter Leistung noch immer nicht endgultig aufgeklart[5]. Dieser Abschnitt befaßt sich daher mit den anwendungsorientierten Aspekten furmarine Adhasive. Dazu werden die unterschiedlichen Adhasive vor dem Hintergrundihrer Verwendung innerhalb dieses Habitats vorgestellt. Außerdem beschaftigt sichdieser Abschnitt mit demMuscheladhasivsekret und seiner proteinogenen Zusammen-setzung. Diese Betrachtung mundet in der Behandlung mechanischer Details zu denausgebildeten Bindungen zwischen Muschel und Oberflache. Im letzten Teil werdenKorrelationen zwischen einigen mechanischen Eigenschaften und der den Proteinenzugrunde liegenden Aminosauresequenz angestellt. Eine Auffalligkeit innerhalb deradhasiven Proteine, die uber die Muschel hinaus gehen, wird ebenfalls behandelt. Indiesem Zusammenhang werden posttranslational modifizierte Aminosauren (pmaa)vorgestellt. Ihre chemische Relevanz wird knapp erlautert und in den Kontext dermarinen Adhasion geruckt.

Biofouling

Die marine Adhasion ist ein Phanomen, dem inzwischen nicht mehr nur Waits In-teresse gilt. Gerade im Bereich der Schifffahrt besteht der Bedarf die Ursachen des

”Micro-“ und

”Macrofoulings“ an Schiffsschrauben und allgemein am Unterwasser-

schiff aufzuklaren, um einem Befall vorzubeugen, da infolge von”Biofouling“ der Rei-

bungswiderstand immens zunimmt. Ein Vertreter dieser Gewinn schmalernden Launeder See ist die Seepocke. Die wirtschaftlichen Schaden, verursacht durch den Mehr-verbrauch an Kraftstoff und Geschwindigkeitseinbußen von bis zu 86%, belaufen sichauf mehrere Milliarden US-Dollar und werden auf Seepockenbewuchs zuruckgefuhrt[3, 14]. Nicht zuletzt, weil es sich bei Muscheln, wie auch bei Seepocken, um furRedereien unpopulare ’Macrofouler’ handelt, avancierten sie gerade aufgrund ihreslanglebigen Verankerungsmodels zu den bevorzugt studierten Organismen der mari-nen Adhasivforschung [12, 13].

IIProteine mit weniger als 100 Aminosauren werden als Peptide bezeichnet

2.1. Marine Adhasive 5

Unter anderem stellten Aldred et al. Untersuchungen zur Seepockenadhasion auf un-terschiedlichen Oberflachen an. In Korrelationen der ’Plaque’-Kontakte mit der Dickedes Adhasivs zeigte sich eine Praferenz gegenuber negativ geladener Oberflachen [10].Hierin handelt es sich um eine Anpassung an das alkalische Milieu, das im Seewassermit einem pH von 8,2 vorherrscht[15]. Oberflachen bilden darin eine elektrochemischeDoppelschicht aus und prasentieren eine negative Ladung [16]. Korrespondierend da-zu setzen sich adhasive Sekrete, wie sie die Seepocke absondert, zu großen Teilen ausbasischen Proteinen zusammen [8, 17]. Dieses Modell konnte durch die gemessenenDaten der Seepockenkontakte bestatigt werden. Dennoch ergab sich eine Diskrepanzzu den analog gefuhrten Messungen mit entsprechenden Proteinen, die aus dem See-pockenadhasiv extrahiert wurden. Diese agierten im Unterschied zu den direkt vonder Seepocke gebildeten Substratkontakten wider den Erwartungen und hafteten bes-ser an den positiv geladenen Modellsubstraten, als an den negativen.An diesem Bsp. wird deutlich wie sich bereits kleine Veranderungen in derAdhasivkomposition auf die Wechselwirkung mit dem Substrat auswirken konnen.

Diversitat mariner Adhasive

Neben Organismen, die wie die”Macrofouler“ darauf spezialisiert sind, permanent

an Oberflachen zu haften, nutzen andere marine Organismen ihre adhasivbildendenDrusen zur aktiven Fortbewegung, zur Verteidigung oder zur Jagd. Aber auch zumBau schutzender Exoskelette kommen marine Adhasive zum Einsatz, wie Abb. 2.1veranschaulicht [18].

FortbewegungVerankerung Schutz Verteidigung

Vorkommen natürlicher proteinogener Adhäsive im marinen Habitat

Abbildung 2.1: Beispiele mariner Organismen und die Rolle, die ihre Adhasive einnehmen (vonlinks nach rechts: Miesmuschel; Seestern und Seeigel; Rohrenwurm [19]; Seegurke [20]).

Seeigel nutzen ihr Adhasiv, das sie aus ihren Stacheln absondern, um sich durchstetiges Anhaften und Losen fortzubewegen [21, 22]. Die Seegurke hingegen schleu-dert in Streßsituationen ca. ein Dutzend feine, vom respirativen Apparat ausgehendeVerzweigungen (cuvierian tubules) aus ihrem Korperinneren dem Stressor entgegen.Diese Schleimfaden werden durch Kontraktion des Verdauungstraktes schlagartig mitWasser gefullt. Sie verlangern sich im Zusammenspiel mit dem resultierenden enor-men hydrostatischen Druck und durch eine explosionsartige Freisetzung um bis aufdas zwanzigfache ihrer Große. Sobald der Kontakt eines Fadens zu einer Oberflachebesteht, platzen die der Oberflache nahen Zellen, in denen sich das Adhasiv befindet.Handelt es sich bei der Oberflache um den Stressor, findet dieser sich schlagartigin einem Netz aus klebrigen Faden wieder. Der freigesetzte Klebstoff hartet inner-


halb von 10 Sekunden und besitzt nur eine Festigkeit von 0,03 bis 0,14 MPa. Diesermoglicht der Seegurke die Flucht, indem sie sich davon losen kann. Im Gegensatz zuSeepocken und Muscheln laßt die Wirkung des Seegurkenklebstoffes, einige Stundennach dem Verteidigungsschlag wieder nach [18, 23].Der Ringelwurm, als weiterer Vertreter der marinen Klebstoffspezialisten, nutzt sei-nen Adhasivcocktail zusammen mit Sandkornern und Muschelsplittern. Die Proteineharten nach der Sekretion schaumartig zwischen dem anorganischen Fullstoff als Bio-zement in Gestalt von Rohren aus. Dieses klassische Außenskelett bietet dem WurmSchutz vor Fressfeinden [17, 24]. Das Sekret des Ringelwurms erfullt, wie auch dasder Seepocke und der Muschel, die Anforderungen an eine stabile Adhasion.

Byssogenese

Muscheln haften unter Ausbildung von 10 bis 50 Byssusfaden an den unterschiedlich-sten Oberflachen [4, 9, 13]. Die Expression dieser Faden erfolgt uber Byssogenese.Diese beginnt mit dem Kontakt des Byssusfußes zur Oberflache. Der Fuß besteht ausMuskeln und Drusen. Entlang des Fußes zieht sich eine Furche, die an der Spitzezu einer Vertiefung auslauft. Wahrend des Auftreffens verdrangt der Fuß das umge-bende Wasser. Durch anschließende Muskelkontraktion und uber Anpressdruck wirdweiteres Wasser zwischen Fuß und Substrat entfernt, bis das Areal unterhalb der Fuß-spitze hermetisch von der Umgebung getrennt vorliegt. Auf diese Substratvorberei-tung folgt die Sekretion. Dabei wird uber eine Druse das dem Substrat entsprechendeAdhasivsekret abgesondert. Daraus bildet sich schließlich der Byssusfaden. Der Fußlost sich wieder und platziert durch Wiederholung der Byssogenese weitere Faden ineinem Radius von ca. 5 bis 6 cm. Von der Sekretion des Klebstoff bis zum fertigenByssusfaden vergehen zwei bis funf Minuten [13, 25].

Mechanische und strukturelle Eigenschaften des Muscheladhasivs

Eine Adhasivfugung unter Wasser vorzunehmen erfordert ein Vielfaches der Ener-gie, die fur eine Fugung unter Ausschluß von Wasser vonnoten ist. Der Vergleichder Adhasionsarbeit eines Epoxids auf Aluminiumoxid unter Reinraumbedingungen(WA = 232mJm−2) und unter Wasser (WA = −137mJm−2) vermittelt ein Gefuhldafur [26]. Die Byssogenese uberwindet zwar diese technische Barriere, doch auch diemechanische Beanspruchung durch den andauernden Wellengang und Unterwasser-stromungen stellt hohe Anforderungen an den Byssus. Nicht grundlos verwendet dieMuschel zwischen 8% bis 12% ihrer Stoffwechselenergie fur die Byssogenese und denErhalt der Faden [27]. Die Bindungsstarke, die von diesen wenigen Faden ausgeht, va-riiert von 0,1 bis 10 MPa, in Abhangigkeit vom Substrat und anderen Systemgroßen.Dabei belaufen sich die Abmessungen der direkten Kontaktflache des Byssusfadensmit dem Substrat, der Plaque, auf 3-7 mm2 und einer Dicke von ca. 150 μm. DerFaden selbst mißt einen Durchmesser von ca. 200 μm. Die TenazitatIII eines FadensIV

IIIDie Tenazitat oder Zahigkeit bezeichnet den Widerstand eines Werkstoffes gegen irreversibleSchadigung wie Bruch oder Riß und wird in potentieller Energie pro Volumenelement angegeben(Zahigkeit von Seide ca. 150 MJ/m3, von Kollagen 6 MJ/m3), abgeleitete Kennwerte wie die Zug-festigkeit sind das Produkt aus Spannungsmodul (Kraft pro Flache) mit der Auslenkung (Lange)infolge eines angelegten Zugs bzw. Drucks [28, 29].

IVMytilus californianus


betragt bis zu 45 MJ/m3 [30]. Der innere Kern des Byssusfadens ist von einer ca.10 μm dicken Schutzschicht umgeben [31]. Er ist hochelastisch, wobei seine Elasti-zitat sich longitudinal verandert [7]. Der gesamte Byssus besitzt eine Bruchdehnungvon maximal 100 %, zeigt Zugfestigkeiten von 75 bis 200 MPa und weist eine hoheDehnsteifigkeit von ca. 900 MPa auf. Letzteres wird in der Natur selbst nur durchSpinnenfaden ubertroffen [32].

OO

Me Me

*

O O

*

OHOH

*SH

OH OH

OO

Me Me

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*

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*SH

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O

*

SOH

OH

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Me Me

*

*

fp3

fp1

fp4

fp2fp5

fp6

preColDpreColNG

100-200 μm

2-5 cm

Substrat

rigid

e

Footprint

DOPA

ela

stisch

plaque

PreColD

PreColP

PreCol D

100%Bruch-dehnung

RelativeProportionen

Kovalenzbeitrag

NH

NH

NH+

R2

R1

O

NH

N

NH

R2

R1

O

NH

N

NH

R2

R1

O

H+

pK = 6,5a

Me2+

Me2+

mcfp6

mcfp5 mcfp3

O2 O2

pre

ColN

G

His-Domäne

‘Seiden’-Domäne

KollagenDomäne

X

X

Abbildung 2.2: Schema zum Aufbau des Byssus und strukturelle Merkmale in Anlehnung an Sil-verman und Roberto [13]. Vereinfachte Darstellung der relativen Proportion der Kollagene PreColP,PreColD und PreColNG, sowie der Aminosaure DOPA entlang des Byssus-Fadens ; dieser teiltsich in drei Regionen auf: den elastischen (proximal), den rigiden (distal) und der ’Plaque’ [7, 33].Querschnitte durch zwei Kompartimente (ganz rechts) zeigen strukturelle Auffalligkeiten wie die hi-stidinreichen Kollagenenden in PreColD (oberes Schema) und das Reaktionsprodukt aus Thiol mito-Chinon, das ca. 1 mol% des Plaque ausmachen (unteres Schema) in Anlehnung an Harrington undWaite sowie Zhao und Waite [8, 33].

In den Untersuchungen an Byssusfaden wurden hauptsachlich Proteine isoliert [31]. InAbb. 2.2 ist der schematische Aufbau eines Byssusfadens, unter Zuordnung relevanterstruktureller Merkmale gezeigt. Darin angedeutet sind die einzelnen Byssuskomparti-mente, in denen auffallige Unterschiede in der Proteinzusammensetzung vorherrschen.Die Verteilung einzelner Aminosauren konnte mit der longitudinal abnehmenden Ela-stizitat des Fadens korreliert werdenV. Daraus ergab sich der skizzierte sigmoidaleZusammenhang (Abb. 2.2 mittig) [7].Inzwischen sind die einzelnen Byssusproteine bekannt, uber deren Verteilung sich glei-chermaßen die Verteilung bestimmter Aminosauren erklart. Der Byssusfaden besteht

VDie vereinfachte Darstellung der relativen Proteinproportionen berucksichtigen nicht dieadhasiven Proteine, auf die ebenso ein Anteil entfallt, dafur wurde stellvertretend die AminosaureDOPA andeutungsweise (blau) aufgetragen.


vorwiegend aus Kollagenproteinen (preCol). Diese dominieren mit 96% den proxi-malen Teil und mit 66% den distalen Teil des Byssus. Die Kollagenproteine lassensich in drei Unterklassen einteilen, da sie sich hinsichtlich ihrer Struktureigenschaftenund ihrer Enddomanen unterscheiden. Im hochelastischen proximalen Teil laßt sichdemnach das Kollagen preCol-P nachweisen, dessen Enddomanen dem von Elastinahneln. Dieser Teil des Byssusfadens laßt sich um bis zu 200% dehnen, d.h das dop-pelte der Bruchdehnung des gesamten Fadens [33]. Der Anteil an preCol-P nimmtdistal zugunsten des steiferen Kollagen preCol-D ab. Dessen Enddomanen lassen sichmit denen der Spinnenseide vergleichen. Dies zeigt sich in der Zahigkeit. Die desproximalen Byssus entspricht mit 35 MJ/m3 nur ca. drei Viertel derer des distalenByssus, der mit Kevlar (50 MJ/m3) vergleichbar ist [30].Das dritte Kollagenprotein preCol NG, das sich durch einen hohen Anteil an Glycinin seinen Enddomanen auszeichnet, weist eine konstante Verteilung im Byssusfadenauf [32]. Dieses Kollagen zeigt Analogien zu denen, die in pflanzlichen Zellwandenvorhanden sind [34]. Allen drei Proteinen gemein sind die zentralen (Gly-X-Y)nKollagendomanen (siehe Abb. 2.2). Technisch interessant sind die selbstheilendenKrafte des Byssus. Diese werden den Enddomanen zugeschrieben und wurde an Hi-stidin demonstriert [33]. Dessen Seitenkette liegt bei einem pH > 6,5 einfach pro-toniert vor, der zweite Stickstoff verfugt uber ein freies Elektronenpaar. Mit die-sem koordiniert er zweiwertige Ubergangsmetallionen, wie Zn2+ oder Cu2+ (sie-he Abb. 2.2 oberes Schema). Da neben reichlich Histidin auch zwei bis vier 3,4-Dihydroxyphenylalaninseitenketten, einem potentiellen Vernetzer, zugegen sind, be-steht ebenfalls die Moglichkeit zur Ausbildung kovalenter Bindungen [32].

Die Proteine des Muscheladhasivs

Die inzwischen uber 25 charakterisierten Proteine lassen sich einzelnen Byssuskom-partimentenVI zuordnen (siehe Abb. 2.2). Nur funf dieser Proteine kommen aus-schließlich im Plaque vor. Das Muschelprotein 1 ist uberall in den Grenzflachen desByssus und dem umgebenden Wasser prasent. Es erfullt die Anforderungen an eineschutzende Haut, die daruber hinaus in der Lage ist sich selbst zu reparieren. Ob-wohl es sich um ein DOPA haltiges Protein handelt, aus denen sich seine kohasivenEigenschaften ableiten lassen, wird es nicht den adhasiven Proteinen der Plaque zu-geordnet. Diese beschranken sich auf die Muschelproteine mfp2 bis mfp6. Der großteAnteil der adhasiven Proteine entfallt mit 25% auf das Muschelprotein mfp2 [25].Dieses Protein zeichnet sich durch eine Haufung von DOPA-Seitenketten in den ter-minalen Domanen aus und durch ein Ca2+-Bindungsmotiv innerhalb der Sequenz[35]. Das Protein mfp3 kommt in 35 verschiedenen Modifikationen vor und ist gleich-zeitig das kurzeste der adhasiven Proteine. Das Protein mfp4 ist eines der großerenund verfugt uber eine histidinreiche Wiederholungseinheit mit entsprechenden Cu2+-Bindungskapazitaten. Es ist daher am Ubergang des Fadens in die volumnose Plaqueangesiedelt. Das Muschelprotein mfp5 besitzt ahnlich viele Modifikationen wie mfp3.Mit ca. 4,8% beinhaltet es jedoch den hochsten Anteil an Phosphoserin aller Mu-schelproteine. Das Protein mfp6 enthalt neben ca. 2,8% Phosphoserin auch Cystein

VIJeweils die ersten Buchstaben leiten sich aus der Gattung ab, bspw. me fur mytilus edulis. DieAbkurzung fp steht fur

”foot protein“, womit der gesamte Byssusfaden gemeint ist. Die Zahl ist die

Folge der chronologischen Nummerierung.


und ist ebenfalls eines der kleineren Proteine [8]. Die Verteilung dieser Plaqueprote-ine ergibt sich aus deren Anknupfungspunkten (siehe Abb. 2.3). Damit verbundensind einige Einschrankungen. So wechselwirkt mfp3 nur mit mfp5 und vernetzt mitmfp6, wahrend mfp5 sowohl mit mfp6 vernetzen, aber auch mit mfp2 wechselwir-ken kannVII [25]. Die kurzen Proteine mfp3 und mfp5 sind sehr oberflachenaffinVIII.Auch aufgrund der Wechselwirkungseinschrankungen fur mfp3 dominieren sie daherdie Grenzflache der Plaque mit dem Substrat [35]. Unmittelbar darauf folgt die be-reits erlauterte und in Abb. 2.2 skizzierte Vernetzung zu mfp6 uber Cysteinyldopaoder uber Interaktion mit mfp2. Da letzteres ebenfalls mit mfp6 vernetzen kann, er-gibt sich daruber ein indirekter Anknupfungspunkt zu mfp3. Aufgrund der Großebeansprucht das Protein mfp2 einen Großteil der Plaque. Es bildet uber koordina-tive Bindungen zu mehrwertigen Kationen (Ca2+IX, Fe3+X) ein Netzwerk aus undmundet uber den sich verjungenden Faden in einen, von Protein mfp4 dominiertenUbergang, in die Kollagenstrukturen.

mfp5

mfp4

mf6mfp6

mfp2

Fe3+

Ca2+

Fe3+

preCols

Fe3+

Fe3+

Ca2+

mfp3

Abbildung 2.3: Interaktionsschema der Plaqueproteine: dominante Anknupfungspunkte der einzel-nen Plaqueproteine untereinander und mit dem Substrat in Anlehnung an Hwang et al. [35].

Der Vergleich unterschiedlicher mariner Adhasivproteine, zeigte Gemeinsamkeitenin einigen posttranslational veranderten Aminosauren. Dabei handelt es sich umnaturliche Aminosauren, die erst im Nachgang der Proteinbiosynthese durch enzyma-tische Reaktionen modifiziert werden. Derartige Veranderungen konnen die Folge vonHydroxylierungen, Phosphorylierungen oder Halogenierungen sein [36]. In Abb. 2.4sind jeweils Beispiele dieser modifizierten Aminosauren dargestellt. Ein klassischer

VIImfp5/2 = 1,3 mJ/m2 uber SFA (surface force apparatus) bestimmt von Lee et al. [25]VIIIHaftung mfp3/mica = 0,4 mJ/m2, mfp5/mica = 1,4 mJ/m2 bestimmt anhand von SFA Mes-sungen von Hwang et al. [35]

IX0,3 mJ/m2 bestimmt anhand von SFA Messungen von Hwang et al. [35]X1,3 mJ/m2 (SFA), die starksten Fe3+ koordinierten Vernetzungen reichen an die Komplexbil-

dungskonstante einer Avidin-Biotin-Kopplung (KB ≈ 1014mol−1) [35].


Stellvertreter sind Hydroxylasen, die eine zusatzliche Hydroxylgruppe an der Ami-nosaurenseitenkette einfuhren. Sie oxidieren Tyrosin zu 3,4-Dihydroxyphenylalanin(DOPA), Arginin zu Hydroxyarginin, Lysin zu Hydroxylysin oder Prolin zu Hydro-xyprolin (Hyp) bzw. Dihydroxyprolin (DHyp). Wahrend die Enzymklasse der Phos-phorylasen die Alkoholgruppe am Serinrest zu Phosphoserin (pSer) verestert [15].Auffallig war der Fund der Aminosaure 3,4-Dihydroxyphenylalanin insbesondere amEnde des Byssusfadens, der

”Plaque“. Jene posttranslational modifizierten (pm) Ami-

nosauren identifizierten Taylor und Waite bereits in den 90iger Jahren als relevanteBausteine in Bezug auf die Adhasion [31, 37]. Wie im Zusammenhang mit den Kol-lagenenden bereits ausgefuhrt, kommt dieser Aminosaure auch eine Schlusselrolle inder Vernetzung der einzelnen Kollagenproteine zu [33].

Abbildung 2.4: Beispiele posttranslational veranderter Aminosauren, links gezeigt ist dasnachtraglich phosphorylierte Serin (Phosphoserin pSer), mittig ein Vertreter der zusatzlich hydro-xylierten Aminosauren DOPA (nicht gezeigt hydroxyliertes Prolin*, Lysin und Arginin) und rechtshalogeniertes DOPA.

Phosphoserin und 3,4-Dihydroxyphenylalanin konnen durch Komplexierung von Me-tallionen als Vernetzer auftreten und auch kovalente Bindungen ausbilden [38, 39].Die nach Sekregation des proteinogenen Cocktails ins Meerwasser zu einem dichtenNetzwerk fuhrenden elektrostatischen Wechselwirkungen sind am Beispiel des Phos-phoserins in Abb. 2.5 veranschaulicht. Verantwortlich dafur ist der drastische pHAnstieg und der Ionengradient [17, 40].

NO

O

H

PO

-

O-O

N

O

O

H

P

OO-

O-

Ca2+

Ca2+

N

OO

H

P-

O

O

O

-

N

O

O

H

P-O

OO

-Ca

2+

pH 5 pH 8,2

pK = 2,1s1 pK = 6,5s2

Abbildung 2.5: Links im Bild ist die Situation fur pSer innerhalb der Druse gezeigt, der Phosphor-rest liegt einfach protoniert vor und koordiniert uber Ca2+ zu einem losen Proteinnetzwerk; rechtsabgebildet ist die Situation nach Sekretation in Meerwasser (pH 8,2), der Phosphatrest liegt nun,aufgrund des pH-Sprungs vollstandig deprotoniert vor und koazerviert zu einem dichteren Netzwerk[15, 40].


Dieser Mechanismus der Koazervation verdeutlicht, dass diese Modifikation des Se-rins eine spezifische Anpassung an den Lebensraum Meer darstellt. Dies durfte derGrund sein, warum Phosphoserin bisher auch ausschließlich in marinen Organismengefunden wurde [17, 40, 41].Fur die kovalente Ausbildung von Bindungen, die von Phosphoserin bzw. 3,4-Dihydroxyphenylalanin ausgehen, bedarf es der Uberfuhrung dieser Aminosaurenin ein reaktives Zwischenprodukt. Diese initialen Reaktionen sind in Abb. 2.6 dar-gestellt. Phosphoserin wandelt sich durch eine basisch katalysierte β-Eliminierung,unter Verlust des Phosphats, in das reaktive Dehydroalanin um (Abb.2.6 Mitte).In Gegenwart von Lewisbasen, wie Aminen in Histidin und Lysin oder Thiolen inCystein, schließt sich daran eine konjungierte Addition an [38]. Durch diese Folgere-aktion kommt es zu komplexen vernetzten Strukturen.Aus dem Catechol, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, wird als reaktive Spezies ein Chinondurch Oxidation gebildet (Abb. 2.6 gelber Kasten) [42]. Die Oxidation kann basischinduziert oder in Gegenwart geeigneter Oxidationsmittel mit einem RedoxpotentialU� > 0, wie Fe3+ (U� = -0,1 V) ablaufen.

OO

N

OH

Chinon

+

N

OH

N OH

N

N

N

OH

N

NH

OH

2 H+

N

O

OH

PO3

N

OH

�-Eliminierung konjugierteAddition

pSer

-His-,-Lys-

2 e-

+

- 0,7 V

Oxidation

OHOH

N

OH

Dehydroalanin

Abbildung 2.6: Bildung reaktiver Zwischenprodukte (Dehydroalanin und Chinon) aus pSer bzw.DOPA, fur Dehydroalanin sind zwei mogliche Folgereaktionen durch konjugierte Addition gezeigt[36, 38].

Das resultierende Zwischenprodukt ist, mit Blick auf die Moglichkeit durch kovalenteBindungen ein Proteinnetzwerk auszubilden, vielseitiger als jenes des Phosphoser-ins (Abb. 2.7 rechts) [4]. Werden Thiole in Form von Cystein angeboten, erfolgt einnukleophiler Angriff seitens des Schwefels (Abb. 2.7 (d)). Amine greifen ebenfallsnukleophil unter Bildung einer Schiffschen Base an oder reagieren uber Michael-Reaktion weiter(Abb. 2.7 (e)). Thiole sind jedoch bis zu 4000 mal reaktiver alsAmine [44, 45]. Unter diesem Aspekt untersuchten Zhao et al. die Verteilung von5-S-Cysteinyldopa in Byssusfußabdrucken. Der Annahme folgend, dass sowohl 3,4-Dihydroxyphenylalanin, als auch Cystein bei einem pH von 8,2 oxidativ instabil sind,sollte sich 5-S-Cysteinyldopa nachweisen lassen. Das Cystein, das in mcfp6 vorliegt,greift Chinone, die aus den stark 3,4-Dihydroxyphenylalanin haltigen Proteinen mcf3


NH2

OH

OH

COOH

NH2

O

O

COOH

O

ORO

O

R

O

O

R

Fe3+

O

O

R

Ca2+

O

O

R

R

N

O

R

OH

OH

NH

R

HO

OHNH

O

R

OH

OHSNH

O

S

NH

O

R

OH

OH

S

NH

O

R

OH

OH

R

OH

OH

c

b

a

d

f

g

eOxidation

Chelation

VdW-WW

R

OH

OH

R

OH

OH

�-Stacking

Radikale Addition

Schiff Base

Michael Addition

R

OH

OH

R

OHOH

Fe3+ ��p-WW

NHOH

OH

COOHHO

Tautomerisierung

Abbildung 2.7: Catechole konnen als Chelatliganden auftreten und Metallkationen komplexieren(a), die Hydroxylgruppen sind in der Lage uber Wasserstoffbrucken zu wechselwirken (b), der Phe-nolring kann uber sein π-System mit p-Orbitalen und π-Orbitalen wechselwirken (c). Das Chinonhingegen ist in der Lage kovalente Bindungen uber die Reaktion mit einem Thiol auszubilden (d);weiterhin kann es Schiffsche Basen bilden und Michael artige Reaktion eingehen (e) oder durch radi-kalische Addition eine Aryl-Aryl-Kopplung ausbilden (f). Das DOPA-Chinon ist zudem in der Lagezu tautomerisieren, was eine Vorstufe des Melanins darstellt (g) [4, 43].

und mcf5 stammen, sofort nucleophil an. Das dadurch entstehende Netzwerk fordertdie Kohasion und konnte folglich verstarkt unmittelbar in den substratnahen Bys-susgrenzschichten nachgewiesen werden (siehe Abb. 2.2). Damit wurde der Nachweiseines Zusammenhangs der Gegenwart des Proteins mcfp6 in der grenzflachennahenPlaque mit der 3,4-Dihydroxyphenylalanin-Prasenz erbracht [8]. Innerhalb der Plaquelassen sich nur zwei cysteinhaltige Proteine mfp6 und mefp2 nachweisen [25]. Da dieProteine an der Substratgrenzflachen und in unmittelbarer Nahe sich im Vergleich zuden ubrigen Proteinen durch relativ geringe Molmassen auszeichnen, laßt sich darausdie lokale Beschrankung auf mfp6 ableiten.Durch die Bildung von Di-DOPA (Abb. 2.7 (f)) infolge einer Aryl-Aryl-Kopplung,erweitert sich das Potential kovalenter Bindungsbildung zusatzlich um eine weitereFolgereaktion, die von Chinon ausgeht [8, 46–48].Die Muschel setzt eine Kombination aus Adhasiv und einem Kollagenkomposit zurstabilen Verankerung unter Wasser ein. Damit schopft sie das Potential der ver-linkenden Aminosaure 3,4-Dihydroxyphenylalanin im Zusammenspiel mit anderenAminosauren und mit feuchten Substratoberflachen aus. Dies laßt sich aus dem Ver-teilungsprofil dieses Peptidbausteins ablesen (siehe blaue Flache (DOPA) in relativeProportionen aus Abb. 2.2). Die an der Muschel erorterten Zusammenhange zwischenstrukturellen Unterschieden und ihren molekularen Ursachen, verleiten zur Feststel-lung, dass die Betrachtung der Aminosaurenzusammensetzung Ruckschlusse auf dieRolle des spezifisches Proteins im Adhasiv zulaßt. Neben der Rolle der einzelnen

2.2. Adsorptionsmodelle 13

Tabelle 2.1: Ausgewahlte Beispiele fur Bindungsdomanen in Peptiden.

Proteinklasse Motiv Relevanz Literatur..

Integrine RGD Bindungsdomane zur Kopplung [53]an Zellen, hochaffin zu TiO2

Laminin Glycoprotein der Basallamina(auch Integrin) der extrazellularen MatrixMAP14XI KAK Muschelprotein, Zelladhasion [54]M13 HKH Virus, der E.coli -BakterienBakteriophage mit seiner DNA infiziert [55]M13 NHWSD- Bindet stark zu Gd2O3

Bakteriophage KRAQITI [56]Octaglutarsaure Glu8 In terminaler Position verleiht

Glu8 Peptiden signifikanteAffinitaten zu Hydroxylapatit [57, 58]

Aminosauren ist die bereits erwahnte Massenverteilung der Proteine fur die Adhasionebenso interessant.

2.2 Adsorptionsmodelle

Im vorangegangenen Abschnitt wurde der Beitrag einzelner Aminosauren zur Ver-ankerung einer Muschel in unruhigem Salzwasser vorgestellt. Die Aminosaure 3,4-Dihydroxyphenylalanin ist dabei fur die Adhasion an wasserbenetzten Oberflachenwesentlich. Diese Betrachtung wurde auf Proteine ausgeweitet, da eine Aminosaurenicht alleinig fur gute Adhasionseigenschaften verantwortlich gemacht werden kann.Die Differenzierung in einzelne adhasive Proteine, wie sie im Plaque des Muschelbys-sus vorliegen, brachten mit den Proteinen mfp3 und mfp5 Vertreter mit herausra-genden Adsorptionseigenschaften hervor. Eine gute Adsorption ist die Voraussetzungfur eine gute Adhasion. Neben den beschriebenen Adhasionsphanomenen in mari-nen Habitaten finden sich auch adhasions- bzw. adsorptionsgesteuerte Phanomeneim menschlichen Organismus. Ein klassisches Beispiel fur Adhasion zeigt sich in derWundschorfbildung, die durch das Gerinnungsprotein Fibrinogen eingeleitet wird [49].Dieses Protein zeichnet sich zugleich durch ausgewohnliche Adsorptionseigenschaftenaus [49–51]. Die Adsorption spielt auf zellularer Ebene eine tragende Rolle. Oft istdie Adsorption eines Proteins auf einer zellularen Oberflache der Auftakt einer bio-chemischen Reaktionskaskade. Das bedingt, dass sie in Gegenwart eines Feststoffeseine starke Tendenz zur Adsorption zeigen [52]. Es liegt in der Natur der Proteinbau-steine, die sich uber 20 Aminosauren und die Moglichkeit ihrer posttranslationalenModifikation erstrecken, dass die chemisch-physikalischen Eigenschaften jedes Prote-ins individuell sind.

Andrade nannte es die”einzigartige molekulare Personlichkeit“ [59]. Unter dieser

Maßgabe ist es jedoch schwer, Voraussagen uber das Adsorptionsverhalten eines Pro-teins zu treffen. Kleinste strukturelle Unterschiede konnen drastische Auswirkungenauf die Adsorption haben. Dennoch ist es moglich, strukturelle Gemeinsamkeiten in


der Aminosaurenabfolge zu identifizieren und diesen Eigenschaften zuzuordnen.Um dem Rechnung zu tragen, wird in Tab. 2.1 das Spektrum potentieller Ami-nosauren mit Fokus auf die Adsorption um einige interessante Sequenzmotive er-weitert. Darin sind die proteinogenen Bindungsdomanen mit Bezug zu den entspre-chenden Bioorganismen zusammengestellt.

Thermodynamische Betrachtung

Das Adsorptionsphanomen kann durch verschiedene Modelle dargestellt werden. DieBeschreibung durch das DifferentialXII der Freien Enthalpie ΔGads fordert, dass dieAdsorptionsreaktion exergonisch ist.

ΔGads(s) = ΔHads(s) − TΔSads(s) < 0. (2.1)

Es handelt sich um ein Wechselspiel zweier Anteile, da die Enthalpieanderung ΔHund die Entropieanderung ΔS einander bedingen. Aus diesem Grund kann der Falleintreten, dass obwohl eine Reaktion stark entropiebegunstigt ist, diese aufgrund einerEnthalpiezunahme (ΔH > 0) nicht freiwillig ablauft. Die Adsorption stellt in diesemZusammenhang eine Oberflachenreaktion dar. Die thermodynamische Bewertung sol-cher Reaktion erfordert zunachst die Betrachtung der koexistierenden PhasenXIII. DieAdsorptionsreaktion findet im wassrigen Milieu statt, da dies eine notwendige Bedin-gung fur das Peptid darstellt. Diese sind in der Regel nur in wassrigem Milieu in derLage die Tertiarstruktur uber Wasserstoffbruckenbildung auszubilden, dessen Kon-formation Bedingung fur die Entfaltung seiner Wirkung ist.Da die Peptide am Substrat auf eine Hydratschicht stoßen, lauft es in erster Instanzauf eine Substitutionsreaktion an der Oberflache hinaus. Wassermolekule werden da-bei verdrangt, an Positionen, an denen Peptide adsorbieren.Da Peptide uber mehr als eine funktionelle Gruppe, die mit der Oberflache wechsel-wirken konnen, verfugen, ergeben sich mehrere Konformationen fur die Adsorption.Die extremen Geometrien sind die ’side on’ und ’end on’ Adsorption, wie in Abb. 2.8dargestellt. Desorbiert je Peptid mehr als ein Wassermolekul, resultiert folglich einEntropiegewinn ΔSads > 0.

Dies wird in Abbildung 2.8 durch die verdrangten Dreiecke verdeutlicht. Daraus folgtfur die rechte Konformation eine entropische Bevorzugung.Damit die Adsorptionsreaktion thermodynamisch bevorzugt ist, muß die Adsorpti-onsenthalpie ΔHads, bei konstanter Entropie hinreichend negativ sein. Die resultie-rende 1. Adsorptionslage definiert sich uber Große, Gestalt und Struktur. Im Allge-meinen wird der Adsorptionsprozess in Physisorption und Chemisorption unterschie-den.Die Physisorption beschreibt Wechselwirkungen zwischen Substrat und Adsorbens,die auf van-der-Waals-Kraften, Wasserstoffbrucken- und koordinativen Bindungen be-ruhen. Die Chemisorption hingegen meint eine kovalente Bindung zwischen Substrat

XIIDas Differential der Freien Enthalpie dG = Vdp - SdT laßt sich durch Ersetzen des Terms Vdp= dH - TdS umformen in dG = dH - TdS + SdT, da hier nur isotherme Anderungen betrachtetwerden, entfallt der letzte Term. Der resultierende Ausdruck gibt Aufschluß uber die Moglichkeiteiner chemischen Umsetzung [29].XIIIIntensive Variablen wie Temperatur, Druck und chemisches Potential entsprechen sich bei Ko-existenz

2.2. Adsorptionsmodelle 15

OH OH

OH

OH

OHO

H

OH

NH

3

OH

OH

OH

OH

OH

OH

NH

3

OH

O

end on

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

NH3

OH

OH

OH

OH

OH

OH

NH3

OH

O

polare Gruppe

H O2

unpolare Gruppe

�-System

Peptid

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

NH3

OH

OH

OH

OH

OH

OH

NH3

OH

O

side on

Abbildung 2.8: Modelle zur Adsorptionskonformation eines Peptids auf einer vollstandig hydrati-sierten Substratoberflache.

und Adsorbat. Dabei sind die Orientierung an der Oberflache, anisotrope Wechsel-wirkungen und spezifische Bindungsstellen von Relevanz.

Kinetische Betrachtung

Jenseits der Thermodynamik ist der kinetische Verlauf des Adsorptionsprozesses re-levant. In Abb. 2.9 sind ausgesuchte Modelle fur kinetische Adsorptionseffekte vonPeptiden auf Oberflachen, wie sie in der Literatur diskutiert werden dargestellt [52].Aus diesen Beobachtungen leiten sich schließlich kinetische Modelle ab. In den indieser Arbeit gewahlten Systemen wurden kleine Peptide verwendet. Da einige dieserModelle keine Gultigkeit haben konnen, sind in Abb. 2.9 funf potentiell gultige Mo-delle gezeigt. Darin ist jeweils der Belegungsgrad der Oberflache mit einem Proteinuber die Zeit aufgetragen.

• kooperative Adsorption, bereits adsorbierte Proteine beeinflussen noch nicht ad-sorbierte Proteine, indem sie deren bindende Domane zum Substrat hinfuhren(Tracking-Model)

• Konformationsanderung fuhrt zu mehr Flachenbedarf, bei konstanter Be-deckung (Multi-States-Model)

• Affinitatszuwachs durch Konformationsanderung durch oder nach Adsorption(Two-States-Model)

• Zweidimensionale Adsorption durch Huckepack- oder diffuse Monomeraddition(Surface Clusters)

• Umorientierung in ’side-on’-Adsorption fuhrt zu kurzfristiger Uberladung(Rollover-Model)

Mit Blick auf den zeitlichen Verlauf der Adsorption und damit verbundenenAnderungen in der Belegung ergeben sich unterschiedliche Beobachtungen. Dies-bezuglich ergeben sich Erklarungsansatze, die die Moglichkeit der Reorientierungen


Ladungsverteilung

in -Lactoglobulin�

+-

positive Domäne

negative Domäne

- - - - - - - -

Belegungsdichte gering�

- - - - - - - -

Belegungsdichte hoch�

Reorientierung

a) Reorientierung

b) Spreiten

hydrophobes Substrat

hydrophiles Substrat

initialer Kontakt

initialer Kontakt

keine Verankerung

Verankerung Spreiten

keine Adsorption

c) elektrostatische WW

repulsive Kräfte

attraktive Kräfte

unpolar

+

d) Übersättigung

X

Ad

so

rptio

n

keine Adsorption

Adsorption

Adsorption -

X

“Vroman-Effekt”

Übersättigung nach Daly et al.

t

�

t

1) Tracking Modell

�

t

�

t

�

tt

�

t

2) Multi-States-Model

3) Two-States-Model

4) Surface Clusters

5) Surface Clusters

Abbildung 2.9: Adsorptionsmodelle fur Proteine auf Oberflachen; (a) Reorientierung fur hohePackungsdichten und das Vorliegen unterschiedlich geladener Domanen, (b) Spreitende Proteinclu-ster, (c) elektrostatische WW zwischen Proteinen und der Substratoberflache am Bsp. fur hydropho-be (oben), positiv geladene (unten) und negativ geladener Substrate mit einem 44-iger Peptid, (d)Ubersattigung durch Belegung der Substratoberflache in ’end-on’-Konformation, anschließend Um-orientierung in ’side-on’-Konformation; rechts: kinetische Modelle zur Adsorption und Desorption(gestrichelte Linie) [52, 60].

auf dem Substrat, als Folge unterschiedlich geladener Domanen fur hohe Packungs-dichten beschreiben (Abb. 2.9 (a)). Als weiterer Aspekt wird die Adsorption vonProteinclustern diskutiert. Auf hydrophoben Substraten spreitet dieser Cluster nachEintritt in die Interphase und adsorbiert, was er auf hydrophilen Oberflachen nichtvermag (Abb. 2.9(b)). Die elektrostatischen Wechselwirkungen wurden von Skepo amBeispiel eines 44-Peptides auf einer hydrophoben und zwei hydrophilen, positiv bzw.negativ geladenen, Oberflachen untersucht (Abb. 2.9(c)) [61]. Fur die Adsorptionauf der positiv geladenen, wie auch der hydrophoben Oberflache, ergaben sich dra-stische Konformationsanderungen, wahrend sich fur die negativ geladene Oberflachekeinerlei Affinitaten gegenuber dem Substrat zeigten. Darin laßt sich das Adsorpti-onsphanomen der Ubersattigung erklaren (Abb. 2.9 (d)).Die Ubersattigung spiegelt eine Belegungsspitze im zeitlichen Verlauf wider. Dazuzahlt u.a. der Vroman Effekt. Dabei befinden sich zwei Proteine in Konkurrenz. Die-se kompetitive Adsorption definiert sich uber ein langsam adsorbierendes Protein mithoherer Affinitat zur Oberflache, und einem schneller adsorbierenden Protein mit ge-ringerer Affinitat. Letzteres wird uber die Zeit verdrangt [62].Die Ubersattigung kann auch durch die Theorie von Daly et al. beschrieben werden.Die Dokumentation der Adsorptionskinetik durch Fluoreszenzmessungen, zeigte kor-respondierend zu den Belegungsspitzen, Intensitatshocker in der Fluoreszenz. Dies liessich durch die Anderung der Bindungsorientierung im zeitlichen Verlauf der Adsorp-tion erklaren [63]. Wertz et al. hingegen erganzt diese Theorie um die initiale ’end-on’-Adsorption, die zunachst eine hohere Packungsdichte erlaubt. Durch Anderungder Bindungsorientierung wird jedoch anschließend die entropisch begunstigte ’side-on’-Konformation eingenommen. Damit geht die Desorption uberschussiger Molekuleeinher [64]. Die Gleichgewichtslage kann durch die Beladung a (adsorbierte Stoff-

2.3. Peptidvermittelte antimikrobielle Aktivitat 17

menge) ausgedruckt werden. Die Beladung ist damit eine Funktion der TemperaturT (dissipativer Term) und der Konzentration c. Metall- und Metalloxidoberflachenneigen dazu organische Materialien bereitwillig zu adsorbieren, um die freie Ener-gie zwischen Oberflache und Umgebung zu senken [65]. Erganzt um die Studien vonRabe et al. zu den Einflussen, denen ein Protein wahrend des Adsorptionsprozessesunterliegt, ergeben sich daraus viele Anknupfungspunkte fur medizinische Anwen-dungen [52]. Daruberhinaus geben thermodynamische, wie auch die kinetische Be-trachtung Aufschluß uber essentielle Parameter fur spatere Anwendungen bzgl. derAushartebedingung peptidbasierter Adhesivsysteme.In diesem Kontext demonstrierten Richter et al. auch den Einfluß der Ionenstarkeund des Redoxpotentials von Peptiden auf die Peptidassoziation. Sie zeigten, dasselektrochemische Wechselwirkungen die Reaktivitat verbessern und zu hoherer Pep-tidassoziation fuhren [66].

2.3 Peptidvermittelte antimikrobielle Aktivitat

Antimikrobielle Aktivitat besteht, wenn Mikroorganismen in ihrer Vitalitat durchdas Wirkprinzip negativ beeinflußt werden [67, 68]. Diese Aktivitat zeichnet Anti-mikrobielle Peptide (AMP) aus, die BestandteilXIV der angeborenen Immunabwehrsind (griech. antibios: gegen Leben) [69]. Ihnen kommt eine Schlusselfunktion in derfruhen Phase der Abwehr gegen mikrobielle Erreger zu. Es handelt sich um endogenePeptide, die innerhalb von Minuten bis Stunden nach dem ersten Kontakt mit demPathogen nachgewiesen werden konnen.Zusatzlich zur ursprunglichen Abwehrfunktion aktivieren antimikrobielle Peptideauch Zellen des adaptiven Immunsystems und verzahnen dahingehend angeboreneund erworbene Immunantwort. Dies erfolgt durch chemotaktische Signale auf den-dritische Zellen, T-Zellen und Phagozyten. Ihr antimikrobielles Spektrum umfaßtgramnegative und grampositive Bakterien, Pilze und lipidumhullte Viren.Ahnlich wie die von Bakterien oder Pilzen gebildeten Antibiotika konnen antimi-krobielle Peptide bakteriostatisch oder bakteriozid wirken. Im Gegensatz zu anderenZellgiften agieren sie selektiv. Boman et al. fanden heraus, dass die Expression antimi-krobieller Peptide durch Bakterien induziert werden kann [70]. Fehlbaum spricht vonerregerabhangigen Expressionen dieser Peptide infolge von Signalkaskaden nach se-lektiver Erkennung verschiedener Mikroorganismen [71–76]. Antimikrobielle Peptidezeigen einen partiell additiven und synergistischen Effekt mit anderen wirtspezifi-schen Abwehrmolekulen wie Lysozym und Lactoferrin [77, 78].Der Mensch verfugt uber vier AMP-Gruppen, die Defensine [79], die Cathelicidine[80], die Histatinfamilie [81] und die Dermicidine [77, 82, 83]. Diese antimikrobi-ellen Peptide besitzen ein breites Wirkungsspektrum. Sie werden besonders starkin Phagocyten (speziell in Granulocyten) und in einigen Epithelmucosazellen expri-miert. Defensine lassen sich bspw. in neutrophilen Granulocyten, Makrophagen undim Dunndarm von Saugern nachweisen [84].

XIVDie antimikrobielle Konzentration bewegt sich mit 1-8 μg/mL (in vitro) im Rahmen der kon-ventionellen Antibiotika.


Wirkungsmechanismen

Es gibt verschiedene Mechanismen, die sich in Bezug auf die Immunantwort unter-scheiden [85]. Wird die Zellmorphologie durch den Wirkstoff geschadigt, so wird voneiner Primarwirkung gesprochen. Wird jedoch eine beliebige Stufe des Zellmetabo-lismus gehemmt, handelt es sich um eine indirekten Wirkung. Die antimikrobiellenPeptide, deren Spezifitat gering ist, finden in der Primarwirkung ihre Anwendung.Ihnen wird ein kolligativer Mechanismus unterstellt, bei dem die Wirkung durch vieleinteragierende Peptide vermittelt wird [69].Es ist bekannt, dass die Wirkung der AMP auf strukturelle Eigenschaften, wie zumBeispiel Disulfidbrucken im Falle der Defensine zuruckzufuhren ist. Die meisten an-timikrobiellen Peptide besitzen aufgrund basischer AS einen kationischen Charak-ter. Dies ist eine Vorraussetzung fur die Ausbildung amphipathischer Strukturen.Uberdies ist ein gewisser lipophiler Charakter vonnoten. Die spezifische Wirkung be-schrankt sich jedoch auf ein Gleichgewicht dieser Eigenschaften [69, 86–88].Ein Großteil der antimikrobiellen Peptide besitzt unter physiologischen Bedingungen(pH=7,4) eine positive Nettoladung und zeigt spharisch eine hydrophobe und hy-drophile Seite [89]. Dies lasst sich auf ihre Aminosauresequenzen zuruckfuhren. Sieenthalten oft mehr als eine der basischen bzw. kationischen Aminosauren Argininund Lysin. In Folge der positiven Ladung des AMP kommt es zu elektrostatischenInteraktionen mit der negativ geladenen Zellwand. Um sich in die Zellwand einlagernzu konnen, mussen die Peptide einen amphipatischen Charakter aufweisen. Es istdemnach erforderlich, dass das kationische Strukturelement vom hydrophoben An-teil raumlich getrennt ist. Dies ermoglicht die Aggregation mehrerer antimikrobiellerPeptide. Dabei sind die hydrophoben Abschnitte nach außen gekehrt. AggregierteKomplexe bilden einen lipophilen Ring, der die zytoplasmatische Membranschichtdurchdringt. Der Ionenkanal ermoglicht wasserloslichen Zellbestandteilen den Durch-tritt und fuhrt schließlich zum Zusammenbruch des Zellwandpotentials und zur Zell-lyse. Dieser mikrobizide Permeabilisierungs-Mechanismus wird von Brogden in wei-tere drei Modelle unterteilt [85]. Das Teppich-Modell (carpet-like) beschreibt AMP-Molekule, die bis zu einer Grenzkonzentration mit ihrem hydrophoben Sequenzan-teil und der Membranoberflache interagieren. Ist diese Konzentration uberschritten,dringen die Molekule ungeordnet in die Membran ein und induzieren die Lyse. Beimbarrel-stave-Modell wird eine Transmembranpore gebildet. Diese wird durch die In-teraktion des hydrophoben Anteils der AMP untereinander und mit der Membrangeneriert. Sie verlauft geordneter als im Teppich-Modell. Das toroidal-pore-Modell istanalog dem barrel-stave-Modell, jedoch ordnen sich die hydrophilen Sequenzbereicheflachendeckend um die Pore an und schneiden so ganze Zellwandstucke heraus. InAbbildung 2.10 sind die beschriebenen Permeabilisierungsmechanismen modellhaftdargestellt. Tierische Zellen besitzen gemeinhin aufgrund der zwitterionischen Phos-pholipide und des Cholesterols ein geringeres negatives Zellpotential als Bakterien.Daher ist die Zytotoxizitat seitens der AMP gegenuber tierischen Zellen geringer. DieZytotoxizitat steigt jedoch in Abwesenheit von Serum und in hoher Konzentration[84].

Ist die Wirkung auf die mikrobielle Zelle aufgeklart, wird ihre Selektivitat eruiert. Zielist es diese Selektivitat zu verstehen, um die antimikrobielle Wirkung zu maximieren.Ein Gegenspieler stellt die mikrobielle Resistenz dar, die eine Folge der Anpassungder mikrobiellen Zellen an den Wirkstoff ist [90].

2.4. Synthese von Proteinen und Peptiddesigns 19

hydrophil

hydrophob

Doppellipid-schicht

antimikrobiellesPeptid

Abbildung 2.10: Permeabilisierungsmechanismen modellhaft dargestellt: links barrel-stave-Modellund rechts toroidal-pore-Modell in Anlehnung an Steffen [84].

Die Kinetik der Hemmung gibt Aufschluß uber kompetitive (Verdrangungshemmung)oder allosterische (Veranderung des aktiven Zentrums eines Enzyms durch einen Ef-fektor) Ursachen. Die Wirkung wird unterschieden in zytozid (letal) und zytostatisch(hemmt die Zellteilung) [69, 85, 91].Im Rahmen dieser Arbeit wurden die antimikrobiellen Untersuchungen auf das Bak-terium Escherichia coli (E.coli) beschrankt. Daher konnen die gewonnen Aussagenbezuglich der AMP-vermittelten Wirkung nur hinsichtlich ihres bakteriostatischenbzw. bakteriziden Umfangs auf E.coli gedeutet werden [86].

2.4 Synthese von Proteinen und Peptiddesigns

Proteine stellen eine der Schnittstellen zwischen Biochemie, Medizin und Ingenieurs-wissenschaften dar. So interdisziplinar wie sich die Forschungsbemuhungen, die durchPeptide inspiriert wurden, gestalten, so komplex verhalten sich auch diese Biopoly-mere. Proteine bieten ein weites Spektrum an Funktionen, was sich von ihrer Rolleals Signalstoff, uber ihren Beitrag zur inerten Immunabwehr bis hin zur Verdauungerstreckt, um nur einige der vielseitigen Funktionen zu nennen [92]. Viele dieser Funk-tionen werden in Medizin und Technik nachgefragt [93].Die Prinzipien der Wirkungsweise von Proteinen zu verstehen, ist von großem In-teresse, um daraus abgeleitete Strukturen materialtechnisch zu nutzen [94]. Dazu istes erforderlich, dass die Proteine in hoher Reinheit und hinreichenden Ausbeutenverfugbar sind.Sofern eine nutzliche Eigenschaft auf eine Proteinfamilie zuruckgefuhrt werden kann,beginnt der Prozess der gezielten Strukturaufklarung. An erster Stelle steht die Auf-schlusselung der Aminosaurenabfolge, um mogliche Sequenzanalogien festzustellen.Dem schließt sich eine Untersuchung zu Unterschieden in der Sequenz ahnlicher Pro-


teine mit Fokus auf die erwunschte Funktion an [86, 95–97].Um zuverlassige Aussagen uber Struktur-Wirkungs-Beziehungen treffen zu konnen,eignen sich die Methoden der multiplen Peptidsynthese zur Aufklarung [98]. Kern istdie gezielte Veranderungen einer Peptidsequenz und durch Vergleich einer Kombina-tion unterschiedlich modifizierter Peptide, Ruckschlusse auf relevante Domanen bzw.einzelne Aminosauren zu ziehen [33, 99, 100]. Diese Praxis wird in der Pharmazie auch

”peptide fishing“ genannt. Dabei handelt es sich um kombinatorische Ansatze in de-nen die Aminosauresequenzlange und -abfolge sukzessive verandert wird und kleinsteMengen Protein synthetisiert werden [101]. Typische Vertreter in diesem Kontext sinddie

”Tea bag“ Synthese“ [102, 103], die Pinmethode [101] und die SPOT-Synthese

[86]. Jedoch mussen die Proteine in jedem Fall zunachst rein und spater in großerenMengen zuganglich gemacht werden.Die Gewinnung von Proteinen kann uber dreierlei Methoden erfolgen.

Naturstoffextraktion Auf naturlichem Wege werden Proteine nach der Transkrip-tion des genetischen Codes durch Proteinbiosynthese an den Ribosomen expri-miert. Dabei spielen eine Vielzahl von biochemischen Reaktionen ineinander.Diese werden unter anderem uber Transkriptions-, Replikations- und Repressi-onsfaktoren gesteuert. Die Naturstoffextraktion stellt damit eine Methode derProteingewinnung dar[3].

Expression Diese Methode bedient sich der Moglichkeit Fremdgene in Bakterien-zellen einzuschleusen. Die codierten Bakterien werden in einem Fermenter kul-tiviert und exprimieren nun das entsprechende Protein. [3, 104, 105]. Eine maß-gebliche Einschrankung stellt jedoch die Sicherheitsstufe dar, die fur die geneti-sche Veranderung und die Arbeit mit genetisch modifizierten Bakterien erfulltsein muß. Der Vorteil dieser Peptidgewinnung liegt sicherlich in den Mengen,die nach vorausgegangener erfolgreicher Bakterienmodifikation großtechnischexprimiert werden konnen [106, 107].

Merriefieldsynthese Die dritte Moglichkeit bietet die 1959 von Merriefield ent-wickelte Peptidsynthese. Aminosauren oder Peptidfragmentbausteine werdenin einzelnen Cyclen gezielt zu Peptiden verknupft. Dies geschieht unter Ver-wendung einer orthogonalen Schutzgruppenstrategie [95]. Die SPPS eignet sichzur Verifizierung von Primarstrukturen, die durch Sequenzanalysen ermitteltwurden. Sie gilt diesbezuglich als sicherste Methode fur den Strukturbeweis,da sie die Identifikation der Sequenzabschnitte, die fur eine biologische Akti-vitat verantwortlich sind, erleichtern kann. Im Hinblick auf Struktur-Aktivitats-Studien konnen Sequenzen synthetischer Analoga zu nativen Peptiden, unter-sucht werden. Die Moglichkeiten, die sich durch die Synthese an der Festphaseergeben, lassen sich auch auf andere Biopolymere, wie Nucleinsauren, anwen-den. In jedem Fall hilft die Festphasenpeptidsynthese dabei, ein prinzipiellesVerstandnis fur einzelne Peptiddomanen zu entwickeln. Das ursprungliche Pro-tokoll der Festphasenpeptidsynthese, das auf Butyloxycarbonyl basiert, erfor-derte den Einsatz von Fluorwasserstoff (HF) und limitierte den Maßstab da-durch auf einige Hundert Gramm. Nachdem ein alternatives Schutzgruppen-protokoll unter Verwendung von Fluorenylmethoxycarbonyl Fluorwasserstoffuberflussig macht, wurden bis zu hundert Kilogramm Ansatze durchgefuhrt[93].

2.5. Analytische Ansatze zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Peptiden 21

Fur aussagekraftige Experimente stellt die Moglichkeit, gezielt einzelne Ami-nosaurebausteine innerhalb der Peptidsynthese zu verandern, eine der elementarenAnforderungen dar.Ein Nachteil der Naturstoffextraktion stellt deren mangelnde Flexibilitat dar. Vomsynthetischen Standpunkt aus betrachtet, bieten lediglich die beiden zuletzt ge-nannten Methoden Spielraum hinsichtlich gezielter Veranderungen in der Ami-nosaurenabfolge. Damit ist es moglich, maßgeschneiderte Peptide zu synthetisieren[55]. Bezogen auf Screeningansatze gelten fur die Expression ebenso Einschrankungen,da sich die Darstellung einer Vielzahl unterschiedlicher Peptide durch Genmodifika-tion fur individuell modifizierte Mikroorganismen aufwendig gestaltet.Ein weiterer Vorteil der Festphasenpeptidsynthese besteht in der Moglichkeit, Biokon-jugate daran zu synthetisieren. Derartige Hybridsynthesen einzelner Sequenzblockedurch (Block)-Polymerisation oder terminale Kopplung an ein Polymer befinden sichim Fokus der grunen Materialentwicklung [6, 96, 108].Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Labormaßstab in Bezug auf die Peptidsynthe-se und die Betrachtung zweier Parameter genutzt, um das adhasive Potential derWiederholungssequenz aus dem Muschelpeptid Mefp1 naher aufzuklaren.

2.5 Analytische Ansatze zur Untersuchung der Wechsel-wirkungen von Peptiden

Die analytischen Ansatze zur Untersuchung des Wechselwirkungspotentials von Pep-tiden lassen sich in zwei Bereiche unterteilen. Intra-und intermolekularen Pep-tidwechselwirkung bestimmen das Vernetzungspotential und daraus resultierendekohasive Eigenschaften. Die Wechselwirkungen der Peptide mit Oberflachen bestim-men das Adsorptionspotential. Letztlich ist die Kombination dieser Eigenschaftenebenfalls von Interesse. In Abb. 2.11 sind einige Methoden zur Aufklarung bezogenauf Fragestellungen bezuglich der Kohasion oder Adhasion zusammengetragen. DieUntersuchung der adhasiven Eigenschaften wird unterschieden in zerstorende undzerstorungsfreie Prufung. Der Grad der Vernetzung kann durch unterschiedliche Me-thoden charakterisiert werden. Die Großen, wie das Elastizitatsmodul, die Viskositatoder der Diffusionsgradient, die eine Aussagekraft uber die Kohasion besitzen, lassensich durch dynamische mechanische Analysen (DMA), Rheometrie oder Diffusions-Penetrationstest bestimmen.Es handelt sich bei den oberflacheninvestigativen Methoden oft um speziell fur Ad-sorptionsphanomene weiterentwickelte Technologien, wie es fur die Reflektrometrieder Fall ist, die aus der Ellipsometrie hervorging [109].Es kann zwischen oberflachensensitiven und

”Bulk“-Methoden unterschieden wer-

den. Je nach oberflachensensitiver Methode bringt dies Einschrankungen wie die An-forderungen an prazise definierte Oberflachen mit sich. Damit konnen transparenteSubstrate fur spektroskopische Untersuchungen, wie die

”sum frequency generation

vibrational spectroscopy“ (SFG) gemeint sein, oder Kristallebenen fur RTM/AFMAufnahmen, um Korrelationen mit theoretischen Ergebnissen anstellen zu konnen[3, 110].Weiterhin gilt es zu berucksichtigen, dass unterschiedliche Methoden genutzt werden,um daraus dieselbe Große abzuleiten. Je nach Meßprinzip fuhrt die Bestimmung der-


Analytik

Adsorption Vernetzung

NMR,SDS-PAGE,DMA,Rheometrie,Diffusions-/Penetrationstest,...

QCM-D,(in-situ)-Ellipsometrie,ATR, TEM, RTMSPR, SERS,Reflektometrie,XPS, ToF-SIMS,MALDI-ToF-MS,Circular Dichroismus,OWLS,...

Adhäsionspotentialzerstörende Prüfung (Zugproben, Scher-, Schältests)zerstörungsfreie Prüfung (AFM, ,...)SFA

a)

Abbildung 2.11: Analysemethoden zur Messung der Adsorptions und Vernetzungseigenschaften,sowie zur Prufung von Adhasion; a) Der Surface Forces apparatus (SFA) mißt Krafte zwischen Ober-flache und kondensierter Phase mit Angstrom und Nanonewton Auflosung.

selben Große, wie der Schichtdicke, zu unterschiedlichen Werte. Dies demonstrierteder von Hook et al. erbrachte Vergleich aus

”optical waveguide lightmode spectrosco-

py“ (OWLS), Quartzkristallwaagen- (QCM) und Ellipsometrie Messungen [111]. Dieoptischen Methoden lieferten konsistente Werte, die mit der adsorbierte Trocken-masse an Protein im Einklang standen. Die entsprechenden QCM-D Meßergebnissewichen jedoch generell zu hoheren Werten ab. Die verwendeten Methoden werden bisauf die QCM als bekannt vorausgesetzt, weshalb auf letztere naher eingegangen wird.

QCM

Ahnlich wie die Oberflachen Plasmonen Resonanz (SPR) und die EllipsometrieXV,bietet die QCM Technik eine empfindliche Methode, die auch fur Echt-Zeit-Messungen zur Untersuchung der Adsorptionskinetik eines Molekuls geeignet ist. DieHauptanwendungen liegen in elektrochemischen (EQCM) und biotechnologischen Un-tersuchungen (QCM-D).

Ein Quartzkristallsensor ist ein piezoelektrisches Plattchen kontaktiert mit Goldelek-troden. Sobald Spannung an die Elektroden angelegt wird, beginnt der Kristall beieiner bestimmten Frequenz harmonisch zu oszillieren. Diese Frequenz ist empfindlichgegenuber Massenanderungen. Die Frequenz sinkt, sobald sich Masse auf dem Kristallabscheidet und sich um die Masse des Adsorbats erhoht. Die Massenanderung kannentsprechend der Sauerbrey Beziehung aus der Frequenzanderung berechnet werden:

XVunter Verwendung einer Flußzelle

2.6. Oberflachenchemie 23

Δm = −C ·Δf

n(2.2)

Die Sauerbrey Gleichung gilt nur fur adsorbierte Schichten, die dunn und rigide sind.Sofern diese Bedingung erfullt ist, liegt eine lineare Beziehung zwischen der Massen-zunahme Δm in mg/m2 und der Frequenzabnahme Δf in Hz vor. Der Proportiona-litatsfaktor setzt sich aus der Kristallkonstante C (17,7 ng cm−2 Hz−1 fur 5 MHzQuartzkristalle) und den harmonischen Obertonen n des Kristallsensors (n = 1, 3, 5,7, 9, 11, 13) zusammen.Die Beschrankung der Gultigkeit von Gleichung 1.2 auf rigide dunne Adsorbate wirdfur die meisten Proteine nicht erfullt und fuhrte zu einer Weiterentwicklung dieserMethode. Diese bestimmt uber einen Abgleich der zeitlichen Entwicklung der einzel-nen Obertone die Dissipation D. Die Dissipationsanderung ΔD gibt das Verhaltnisder Dissipationsenergie zur gespeicherten Energie wahrend einer Schwingungsperiodedes Systems wieder. Dadurch konnen Schwingungsdampfungen, die durch viskoela-stische Adsorbtionsschichten auftreten, mit den entsprechenden FrequenzanderungΔf korreliert werden. Mit der QCM-D Methode konnen weitere Parameter wie dieViskositat, die Schichtdicke, die Dichte oder das Schermodul des Adsorbats model-liert werden. Als Orientierung wird fur Adsorbate mit ΔD < 1 ·10−6 von rigiden undentsprechend fur ΔD > 1·10−6 von viskoelastischen Schichten ausgegangen [112, 113].

2.6 Oberflachenchemie

Im Rahmen der Arbeit wurde die Adsorption von Peptiden auf Silizium (Si02) undTitan untersucht. Im Folgenden werden einige Systemparameter fur die Adsorpti-onsreaktion herausgearbeitet. Darauf aufbauend wird der Zusammenhang zwischenOberflachenstruktur und molekularer Interaktion an Titan behandelt. Die Bezeich-nung Titan ist in diesem Kontext irrefuhrend, da Titan wie die meisten Metalle inGegenwart von Sauerstoff sofort oxidiert [114]. Unter Beachtung dessen wurde die Ad-sorption nicht, wie suggeriert auf Titan, sondern auf Ti02 untersucht. Die Adsorptionwird u.a. durch die Gitterparameter der Substratmaterialien determiniert. In Abb.2.12 ist TiO2 schemenhaft skizziert. Darin ist das vereinfachte Modell der idealisier-ten Titanoberflache (unten) den tatsachlichen Dimensionen, unter Berucksichtigungvon Fehlstellen und Defekten (daruber) gegenubergestellt [114]. Am Beispiel der Ad-sorption eines Katechols auf Ti02 wird in diesem Abschnitt der Zusammenhang zwi-schen den Gitterparametern mit der Adsorptionsenergie (Eads) erortert, da es sich beiTi02 um eine der am besten aufgeklarten Metalloxidoberflachen handelt und uberdiesKatechole sehr stabile Bindungen zu TiO2 ausbilden [115–119]. Dieses Grundlagen-verstandnis gewahrt Anregungen in Bezug auf die Oberflachenmodifikationen.

Zusammenhang zwischen Gitterparametern und Materialgroßen

Titan tritt in vier moglichen Oxidationsstufen auf, wobei nur Ti(IV) stabil ist. Ti(III)ist aus diesem Grund auch ein gutes Reduktionsmittel, das in saurer Losung als[Ti(H2O)6]

3+ vorliegt.


1.805

1.809

1.816 1.848

1.844 1.942

4a

Abbildung 2.12: Modell und Dimensionen (Abstande in A) zur Beschreibung der Titanoberflacheunter Berucksichtigung von Fehlstellen und Defekten des exponierten Titanoxidpolymers (a = 0,3786nm, Titan schwarz, Sauerstoff blau), grau unterlegt ist die idealisierte Vorstellung zur Titanoberflachein Anlehnung an Diebold [114].

Vierwertiges Titan bildet mehrere stabile Oxidphasen. Zu den naturlich vorkommen-den stabilen Titandioxidkristallstrukturen gehoren Rutil, Anatas und Brookit. DieKristallstruktur hat einen direkten Einfluß auf die Oberflachenchemie, wie sich ander systemabhangigen Große isoelektrischer Punkt (IP) zeigt. Dabei handelt es sichum den pH Wert, an dem die Oberflache ladungsneutral vorliegt [92]. AnorganischePolymere wie SiO2 und TiO2, liegen aus diesem Grund pH-abhangig positiv odernegativ geladen vor. Am Beispiel des Metalloxids TiO2 lassen sich die folgendenGleichgewichte formulieren [120]:

≡ T i−OH+2 � ≡ T i−OH +H+(pKs1)

≡ T i−OH � ≡ T i−O− +H+(pKs2)

Der isoelektrische Punkt laßt sich aus diesen Saure-Base-Gleichgewichten berechnen:

pHIP =1

2(pKs1 + pKs2). (2.3)

Der isoelektrische Punkt belauft sich fur die meisten Titanoxide auf 5,6 und 5,8. Inder Literatur existieren jedoch Werte, die von 2 bis 8,9 reichen. Diese Streuung laßtsich durch Verunreinigungen und die Bestimmungsmethode, die sich stark auf dieMessung auswirken, erklaren [121, 121].Der isoelektrische Punkt hangt direkt von der Kristallstruktur und der damit verbun-den Hydroxylierung ab. RutilXVI liegt starker hydroxyliert vor und ist damit leichtsaurer als AnatasXVII [121]. In seiner NaCl-Fehlstellenstruktur weist Titanoxid einenichtstochiometrische Zusammensetzung auf (TiOx mit 0,7≤ x ≤ 1,30) [114, 122].Die stabilste Titanoxidoberflache unter Normaldruck ist Rutil (110) [114].

XVIIP = 5,36 ± 0,83XVIIIP = 5,88 ± 0,95


Tabelle 2.2: Zusammenstellung relevanter Großen in Bezug auf Voraussagen zur Oberflachenchemie;es handelt sich in allen Falle um angenaherte Daten.

Große TiO2 SiO2

sites/nm2 1,7 (bulk) [124] 5 (amorphes SiO2) [125]2 P-25XIX 4 (001), 8 (111)

5,7 planar [121] 1-3 [126]IP 4,7 spharisch [127]

4,3 [55] 2,2 [55]

In diesem Abschnitt, der sich mit der Oberflachenchemie befaßt und dem Zusammen-hang zwischen Gitterparametern und Materialgroßen widmet, werden Phanomenebeschrieben, die sich in der Grenzflache zwischen Substrat und Losung abspielen.In diesem Bereich herrschen veranderte Bedingungen, verglichen mit dem Substra-tinneren und dem Hauptteil der Losung. Dies betrifft u.a. Adsorbate aus der um-gebenden Phase, die sich in Lagen auf der Festkorperoberflache abscheiden konnen.Oberflachenreaktionen verlaufen in dieser Grenzflache. Fur gewohnlich handelt essich um Verdrangungsreaktionen von kleinen Molekulen wie Wasser.Adhasion in feuchtem Milieu, wie es fur die marinen Organismen und auf zellularerEbene beschrieben wurde, funktioniert ohne eine Vorbehandlung der Oberflache.Desorbierte Wassermolekule leisten thermodynamisch einen positiven Entropiebei-trag wahrend sie uber starke Wasserstoffbruckenenergien mit dem Adsorbens wech-selwirken. Diese kooperative Koexistenz innerhalb der Grenzflache ist substratspezi-fisch und gibt Ruckschlusse auf technische Eigenschaften, wie die Hydrophilie. Dieletzten Lagen Wassermolekule lassen sich von hydrophilen OberflachenXVIII nur imUltrahochvakuum oder bei hohen Temperaturen entfernen [123].Die Beschreibung von Materialen kann uber die Angabe makroskopischer Großen wieder Oberflachenrauhigkeit (RA) und des Kontaktwinkels (ca) erfolgen. Diese Großengehen auf die oberflachenchemischen Gegebenheiten zuruck und hangen voneinanderab. Der Kontaktwinkel, der von der Rauhigkeit des Substrates und der homogenenBeschaffenheit der Oberflache abhangig ist, ist ein Maß fur die Ladungsverhaltnisseauf der Oberflache. Diese wiederum schlagen sich in ihrem isoelektrischen Punkt nie-der.So ergeben sich fur kleine spharische Partikel in der Konsequenz andere Materia-leigenschaften als fur planare Materialen (Tab. 2.2). Die Ursachen dieser Materia-leigenschaften konnen bis auf die molekulare Ebene heruntergebrochen werden. Aufdie Herleitung der Bindungsverhaltnisse in TiO2 wird an dieser Stelle verzichtet,dennoch soll hier die Kristallfeldtheorie erwahnt werden. Obgleich diese inzwischenuberholt ist, lassen ihre Ansatze dennoch Voraussagen uber die Bindungslangen undBindungsstarken zu. So auch fur die Ti-OH Bindung, die sich auf Titanoberflachenbefinden. Diese ist kurzer als die Ti-O Abstande innerhalb des Festkorpers und auchkurzer als die Ti-O Abstande innerhalb des exponierten TiO2 an der Grenzflache.Dies spricht fur eine starkere Bindung und deckt sich auch mit einem großeren Mo-lekulorbitaluberlap [128].Die Gitterparameter drucken diese Bindungsverhaltnisse durch Abstande und Winkelinnerhalb der Elementarzelle aus. Aus den Bindungsverhaltnissen ergibt sich uberdies

XVIIISofern die Oberflache nicht unter inerten Bedingungen geschnitten wurde und konserviert vorliegt


die Unterscheidung, der an der Oberflache befindlichen Atome in reaktive und inre-aktive Spezies.In Abb. 2.13 sind diese Spezies fur die in dieser Arbeit relevanten Oberflachen SiO2

und TiO2 dargestellt. Am Beispiel der oktaedrisch bzw. quadratisch pyramidalenGeometrie des TiO2 laßt sich dies nachvollziehen: Zweifach koordinierter Sauerstoffwird aufgrund seiner energetisch tiefer angesiedelten Molekulorbitale in der x-y-Ebeneim Vergleich zu Sauerstoffen, deren Elektronendichte parallel zur z-Achse verlauft,keine Veranlassung zum Bindungsbruch sehen. Er gilt daher als

”tote Spezies“ [128].

Fur die tetraedrische Geometrie des SiO2 verhalt es sich ahnlich [125].

O

O

Si

O

SiO

O

OH OH

Si

O

O

Si

O

O

O H+

O

O

OT i

O

O

OT i

O+

O H

X X

X X

X

XXx

yz

Abbildung 2.13: Reaktive (blau umrandet) und”tote“ (Kreuz) Spezies auf Titanoxid und SiO2-

Oberflachen.

Von Interesse ist die Dichte jener reaktiven Spezies. Diese in sites/nm2 angegebeneGroße stellt eine Funktion der Gitterparameter dar.Da die Hydroxylgruppen in Abhangigkeit vom pH auch protoniert vorliegen(pH < pKs1), werden sie auch als Lewissauren bezeichnet [55]. In Tab. 2.2 sindeinige Literaturwerte der erorterten Großen fur SiO2 und TiO2 zusammengestellt.

Adsorption Katechol auf Titan

Fur die Adsorption von Katechol ergeben sich die in Abb. 2.14 skizzierten moglichenAdsorptionskonstitutionen. Fur Titan/Katechol liegt ein Gleichgewicht zwischen demeinkernigen Chelatkomplex, bestehend aus funf Zentren, mit dem zweikernigen Kom-plex, bestehend aus sechs Zentren, vor. Da der zweikernige Komplex gegenuber demChelat entropisch begunstigt ist, sollte diese Konformation dominanter sein.

Das Gleichgewicht fur adsorbiertes Katechol auf SiO2 wird aus einem uber zwei Was-serstoffbrucken an

”toten Sauerstoff“ koordiniertem Katechol (Abb. 2.14 links) und

einem uber nur einen Sauerstoff (’einbeinig’) gebundenem Katechol (Abb. 2.14 ganzrechts) gebildet. Das Gleichgewicht dieser beiden Konstitutionen liegt jeweils rechts,auf Seiten des kovalent gebundenen Katechols. In Abb. 2.15 ist eine mogliche Ad-sorptionsreaktion fur Katechol zum ’uberbruckenden bi-Dentate-Katecholat’ skizziert[117].

Die Adsorptionsreaktion zwischen Titan und Katechol wird in zwei Gleichungen, wiein Abb. 2.16 veranschaulicht, zusammengefaßt [119].Auf diesen beiden Gleichgewichten basierend laßt sich die Kinetik der Ober-flachenbelegung Γ beschreiben.Die Kinetik des adsorbierten Katechols wurde uberdies auch fur großere Zeitinter-valle betrachtet. In diesem Zusammenhang entdeckten Li et al. unerwartet dynami-


OH

OTi

O

O

O

Ti

OH OO OH2OH2

OTi

O

O

O

Ti

O

O

0,32

0,29

0,17 rutil

0,20 anatas

OHO

OSi

O

O

Si

OH

OH

Si

O

O

Si

O

SiO

OH

OO

H H

0,29

0,28

Peptid ca. 2,7 nm

Abbildung 2.14: Adsorptionskonstitutionen fur Katechol auf Titanoxid und SiO2 (Abstande innm): 5-Zentren-Chelatkomplex und zweikernigen Komplex (links) und adsorbiertes Katechol uberWasserstoffbrucken im Gleichgewicht mit kovalent gebundenem, das ein Silanol substituiert (rechts);[115, 116].

Koordiniertes Catechol

O

OH

H

TiO

TiO

Ti

O O O

Ti+

OTi

OTi

OHOH

OH

O

O

TiO

TiO

Ti

O O O

TiO

TiO

Ti

OH O H

H

OH2

Wasserstoffbrückenbindung (blau gestrichelt)Chelat-Komplex (blaue unterlegt)

freies Catechol

OH OH

O

TiO

TiO

Ti

O O O

TiO

TiO

Ti

OH O

OH2

Abbildung 2.15: Skizzenhafte Darstellung des Adsorption eines zunachst freien Katechols in Losungauf eine TiO2-Oberflache.

OH+

OO

Ti

O O

OH+

OO

Ti

O O

OH+

Ti

O O

OH

OH

OH

OH

O+

O+

OO

Ti

O O

O

O

OO

Ti

O O

Ti

O O

+

+ H+

OH2

OH2+

2II

I

Abbildung 2.16: Gleichungen, die die Adsorptionsreaktion eines Katechols auf TiO2 beschreiben.


sche Katechole, auf denen von ihnen untersuchten Titanoberflachen [117]. Das adsor-bierte Katechol unterliegt einer fur diese Oberflachenreaktionen relevanten maßigenBindungsstabilitat. Dies eroffnet ihm im Umkehrschluß eine uber die Adsorpti-ons/Desorptionsreaktion hinausgehende Mobilitat an der Oberflache.Diese Mobilitat an der Oberflache erfordert die Interaktion unter den adsorbiertenMolekulen. In der Tat ist eine wesentliche Eigenschaft der TiO2-Oberflache, Inter-aktionen dieser Art aufgrund der Oberflachenenergie zu unterstutzen. BenachbarteMolekule wechselwirken ahnlich stark untereinander, wie mit dem Substrat oder mitCo-Adsorbaten [129]. Wie Scanning Tunneling Microscopy (STM) Aufnahmen zeigenbetrifft dies vor allem Wasserstoffatome [110]. Ihre Mobilitat durch Austausch mitbenachbarten adsorbierten Molekulen wie Wasser oder Peptiden, ubertragt sich aufdiese Co-Adsorbate. Die resultierende Dynamik an der Oberflache durch intrinsischdiffundierende Spezies wird in Sprunggeschwindigkeiten quantifiziert (hopping rate).Der Vergleich der Sprunge pro Minute fur intrinsisch diffundierenden Sauerstoff, mitca. 1 × 10−13 min−1 zu Wasserstoff mit ca. 1 min−1, spiegelt die geringe Relevanzdes Sauerstoffbeitrags zu diesem Phanomen wider [110].Zur Beschreibung der TiO2 Oberflache lassen sich die thermodynamischen und kine-tischen Beitrage zusammenfassen, wie in Abb. 2.17 dargestellt.

O

TiO

TiO

Ti

O O O

OH OHOH

E[eV]

0,16 0,37 0,16O

TiO

TiO

Ti

O O O

O OH

O

TiO

TiO

Ti

O O O

OH O

H

O

TiO

TiO

Ti

O O O

OHO

H

OH

O

TiO

TiO

Ti

OOO

OHO

H

O

TiO

TiO

Ti

OOO

OOH

Abbildung 2.17: Aktivierungsenergien fur die Konstitutionen eines Katechols auf TiO2 in Anleh-nung an Li et al., die als Hopping bezeichnete Bewegung zeigt potentielle Umorientierungsoptionendes adsorbierten Katechols auf der Oberflache [117].

Kapitel3Zielstellung

Dieses Kapitel gewahrt einen Uberblick zum Aufbau der Arbeit. Dem geht eine sche-matische Einteilung in zwei Themenfelder voraus. Dies beinhaltet jeweils einen Ein-blick in wesentliche Aspekte der Herangehensweise. In einer knappen Erlauterungenzu den, den Themenfeldern entsprechenden Abschnitten, folgt auf diese Kurzdarstel-lung eine detaillierte Ausfuhrung im Material- und Methodenteil.

Schema der Arbeit

Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit zielt darauf ab, ein besseres Verstandnis furdie Wechselwirkungen von Peptiden untereinander und mit Oberflachen zu generie-ren.Unter dem Eindruck des globalen Ziels einer Materialentwicklung wurde versucht, an-hand eines Modells generelle Aussagen bezuglich einer strukturvermittelten Wirkungzu formulieren. Diese Verallgemeinerung ist wunschenswert, um daraus einfachereund damit wirtschaftlich attraktivere Produkte abzuleiten. Eine mogliche Anwen-dung stellt die Oberflachenfunktionalisierung mit Peptiden oder peptidinspiriertenStrukturen dar.

Als Modelsystem wurde ein Sequenzabschnitt aus dem Muschelprotein Mefp1gewahlt, das als Wiederholungseinheit auftritt und uber die posttranslational modi-fizierte Aminosaure 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) verfugt. Dieser Aminosaurewird ein potentieller Einfluß auf die adhasiven und vernetzenden Eigenschaften in-nerhalb der Muschelproteine zugeschrieben (siehe Abschnitt 2.1 S. 8 ff.). Mit derZielstellung diesen Einfluß zu untersuchen, wurde die Arbeit in zwei Abschnitte un-terteilt: den ersten Abschnitt, der sich mit der Adhasionsforschung beschaftigt undden zweiten Abschnitt, der die Funktionalisierung einer Oberflache mit diesem Mo-delsystem verfolgt.

Im ersten Abschnitt wurde das Modelsystem einer Sequenzvariation unterzogenund eine Peptidserie synthetisiert. Die Peptide unterschieden sich nur in zwei Pa-rametern und sollten sich hinsichtlich ihrer Adsorption ebenfalls unterscheiden.Bei den Parametern handelte es sich um die Anzahl in der Sequenz enthaltener

29

30 Kapitel 3. Zielstellung

DOPA-Seitenketten und die Anzahl ihrer Wiederholungseinheiten. Durch den Ein-satz oberflachensensitiver Analytik, wie der QCM-Technik und der XPS- und IRRAS-Spektroskopie wurden die Unterschiede im Adsorptionsverhalten der einzelnen Pep-tide gemessen und miteinander verglichen.

Der zweite Abschnitt beinhaltet die Untersuchung einer moglichen Anwendung inForm der Immobilisierung eines Modelpeptids auf Oberflachen. Hierfur wurden Ex-perimente durchgefuhrt, die unterschiedliche Immobilisierungsstrategien verfolgen.Die einzelnen Experimente sind derart aufgebaut, daß sich an die jeweilige Metho-de zur Immobilisierung des Peptids ein Funktionsexperiment anschließt. In diesemFunktionsexperiment wird der Erhalt der Aktivitat des immobilisierten Peptids si-chergestellt.Da die Moglichkeiten zum Nachweis des Funktionserhaltes des vernetzend agieren-den Modelpeptid limitiert sind, wurden die Experimente im zweiten Abschnitt umein weiteres funktionelles Peptid, mit antimikrobiellen Eigenschaften, erweitert. Dieantimikrobielle Wirkung ist wie die Adhasion eine Materialeigenschaft, die sich furtechnische Anwendungen empfiehlt. Diese Erweiterung um ein antimikrobiell wirken-des Peptid wurde im Zusammenhang mit der Untersuchung eines weiteren Immobili-sierungskonzeptes, einer Mehrstufensynthese zur Partikelfunktionalisierung, genutzt.Da die Fahigkeit der Modelpeptide miteinander zu vernetzen in den gewahlten Di-mensionen verglichen mit dem Aggregationspotential der Partikel eine denkbar un-tergeordnete Rolle zukommt, wurden derartige Nachweise erganzt oder ersetzt durchdie Verwendung des antimikrobiellen Peptids und entsprechender Tests. Aus die-sem Grund und ob ihrer Eignung als einfaches System, an dem uberdies Stabi-litatsuntersuchungen gefuhrt werden konnen, wurde die antimikrobielle Funktiona-litat zusatzlich betrachtet. Vor dem Hintergrund die Aktivitat des immobilisiertenPeptids sicherzustellen, zielten die Untersuchungen der Funktionsexperimente entwe-der auf die veranderten Vernetzungseigenschaften, im Fall des Modelpeptids, oderauf die antimikrobielle Wirkung, im Fall des anderen Peptids bezogen auf die funk-tionalisierte Oberflache ab.

3.1 Peptidsynthese

Fur die Synthese wurde ein Festphasenpeptidsynthesizer (SPPS) eingesetzt. Hierfurwurde an einem Harz nach dem FastMoc-Protokoll synthetisiert. Das FastMoc-Protokoll beruht auf einer orthogonalen Schutzgruppenstrategie. Dies betrifft dieSchutzung des α-Amins einer Aminosaure mit einer temporaren Schutzgruppe, wie esfur 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) der Fall ist. Aminosauren, die uber reaktiveGruppen an ihren Seitenketten verfugen, sind mit permanenten Schutzgruppen aus-gestattet. Der Fmoc-geschutzte N-Terminus der eingesetzten L-Aminosauren wirdnach jedem Kopplungszyklus, und sofern mit Aminosauren beladene Harze einge-setzt werden, vor der ersten Kopplung, mit Piperidin entschutzt. Die basenstabilenSchutzgruppen werden erst nach der Festphasensynthese entfernt.

Die Aminosauresequenz des Modellpeptids mit den adhasiven Merkmalen lautet:Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys. Dieses Dekapeptid enthalt zweiposttranslational modifizierte Aminosauren, Hydroxyprolin (Hyp) und 3,4-Dihydroxyprolin (DOPA), von denen letztere zunachst nicht fur den Einsatz in der

3.2. Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden mit Oberflachen durchSequenzvariation 31

Festphasenpeptidsynthese bezogen werden konnte. Aus diesem Grund wurde zuvordas synthesekompatible Fmoc-L-DOPA-(TBDMS)2 (1) synthetisiert. Diese vorgela-gerte Synthese ergab sich aus der Anforderung an die orthogonalen Schutzgruppen[130–133].

3.2 Untersuchung der Wechselwirkung von Peptidenmit Oberflachen durch Sequenzvariation

Das Modelpeptid, das eine Sequenzdomane des Muschelproteins Mefp1 darstellt,wurde hinsichtlich seiner Wechselwirkungen mit zwei unterschiedlichen Oberflachen,amorphes Titandioxid und amorphes Siliziumdioxid, untersucht. Desweiteren wurdengenau zwei Parameter innerhalb der Sequenz variiert, um Unterschiede im Adsorpti-onsverhalten damit zu korrelieren. Dies betraf die Zahl der Wiederholungseinheitenund damit die Sequenzlange (x) und die Anzahl der Aminosaure DOPA in der Se-quenz (n). Hierfur wurde x = 1; 2 und n = 0; 1; 2; 4 gewahlt, wobei nicht jede dermoglichen Parameterkombination synthetisiert wurde.

NH3

+NH

NNH

O

O

NH3

+

O

OH

NH

O

NN

NHNH

O

OH

O

OOH

O

OH

NH

O

COOH

OH

OH

NH3

+

OH OH

NH3

+NH

NNH

O

O

NH3

+

O

OH

NH

O

NN

NHNH

O

OH

O

OOH

O

OH

NH

OOH

OH

NH3

+

OH OH

O

NHNH

NNH

O

O

NH3

+

O

OH

NH

O

NN

NHNH

O

OH

O

OOH

O

OH

NH

O

COOH

OH

OH

NH3

+

OH OHIteration x

nDOPA

= H; OH

Abbildung 3.1: Innerhalb der Peptidsequenz des adhasiven Mefp1 Peptids wurden Tyrosin undDOPA an den Aminosaurepositionen 5 und 9 variiert (n); weiterhin wurde der Einfluß der Iterationender Sequenz untersucht (x).

Tab. 3.1 faßt die Peptide zusammen, die synthetisiert wurden. Die Nomenklatur leitetsich aus der jeweiligen Parameterkombination [x-n] ab. Die erste Ziffer indiziert dieWiederholungseinheiten (x), wahrend die zweite Ziffer die Anzahl der in der Sequenzverbauten DOPA (n) indiziert. In Abb. 3.1 ist veranschaulicht, an welchen Positioneninnerhalb des Peptids die Veranderungen vorgenommen wurden. Die entsprechendveranderten Peptide wurden, wie unter Absatz 3.1 beschrieben, synthetisiert.

32 Kapitel 3. Zielstellung

Tabelle 3.1: Nomenklatur der synthetisierten Peptide, entsprechend ihrer Variation in x (Sequenz-iteration) und n (DOPA).

x-n 0 1 2 4

1 1-0 1-1 1-2 -2 - 2-1 2-2 2-4

Die [x-n] Peptide wurden mit dem im Methodenteil auf S. 38 ff. beschriebenen QCM-Verfahren hinsichtlich ihrer Adsorption analysiert. Hierfur wurden vier unterschied-liche Adsorptionsexperimente entworfen. Diese Experimente adressierten uber einOxidationsmittel die Chemie des Katechols DOPA. Die Intension dieser Experimentewar es, den Einfluß der Oxidation der DOPA-Seitenkette auf die Adsorption offen-zulegen. Die Oxidation wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten eingeleitet, um denUnterschied in der Adsorption eines Peptids, was bereits oxidiert vorlag, gegenubereinem nativen Peptids zu studieren. Uberdies wurde der Einfluß auf die Desorptionin Abhangigkeit der Oxidationsstufe des Katechols untersucht, um zu vergleichen, obein bereits adsorbiertes Peptid in Gegenwart eines Oxidationsmittels sich wahrenddes Spulschrittes (Desorption) anders verhalt, als ein Peptid, das nativ (keine Oxi-dationsmittelzugabe) belassen wurde. Weiterhin wurde in einem der Adsorptionsex-perimente sichergestellt, dass das verwendete Oxidationsmittel nur wahrend es uberdie Quarzoberflache geleitet wurde mit dieser wechselwirkte, jedoch nach dem Spulendes Substrates nicht adsorbiert vorlag.

Im Rahmen der Untersuchungen des Adsorptionsmusters der [x-n] Peptide wurdenin Erganzung zu den QCM-Messungen auf Titandioxid die mit Peptid behandeltenSubstrate spektroskopisch untersucht. Dazu wurden hochpolierte reflektierende Ti-tanscheiben analog zu den QCM-Experimenten mit [x-n] Peptiden prapariert. DieScheiben wurden durch Reflexions-Absorptions Infrarot Spektroskopie (IRRAS) undXPS analysiert. Die Untersuchung der [x-n] Peptide wurde auf Adhasionsstudien aus-gedehnt, um einen moglichen Trend hinsichtlich des Klebverbundes zu beobachten.

3.3 Oberflachenmodifikation mit Peptiden

Die Oberflachenmodifikation mit Peptiden wurde an unterschiedlichen Substratenvorgenommen. Allen gemein ist die Anforderung auf ein Peptid, dessen Aktivitatdurch die Immobilisierung nicht verloren geht. Mit dem Ziel Peptide auf einer Ober-flache stabil zu immobilisieren, wurden drei Immobilisierungskonzepte verfolgt. Diesbetrifft die Immobilisierung uber die Adsorption aufgrund elektrostatischer Wech-selwirkungen. Das zweite Konzept beruht auf einer Immobilisierung, die auf sehrstarken Wechselwirkungen im zuge der Adsorption basiert, mit dem Ziel einer ko-valenten Bindungsausbildung. Dazu wurden zwei Verfahren genutzt: die Reaktionzwischen Thiolen mit Gold und die Komplexbildung zwischen Avidin und Biotin.Das dritte Konzept verfolgt den gezielten Aufbau eines Partikel/Peptid-Hybrids. ImUnterschied zu dem vorangegangenen Konzept, ist der Linker nicht bereits am Pep-tidterminus integriert, sondern wird im Vorfeld auf dem Partikel eingefuhrt.

Kapitel4Materialien und Methoden

Dieses Kapitel unterteilt sich in zwei Abschnitte: der erste Abschnitt, der sich denMethoden und Synthesen widmet und dem zweiten Abschnitt, der die generellen Ar-beitsmittel, sowie die verwendeten Chemikalien und Materialien zusammenfaßt. Aus-gewahlte Methoden oder Gerate, die in dieser Arbeit zum Einsatz kamen, wurden umeine knappe Darstellung der entsprechenden Theorie erganzt. Weiterhin werden dieeinzelnen Experimente und Syntheseverlaufe, die sich aus dem methodischen Vorge-hen, wie in Kapitel 3 beschriebenen, ergaben, an dieser Stelle detailliert ausgefuhrt.

4.1 Methoden

4.1.1 Peptidsynthese

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Peptide wurden an einem Festphasensynthesisersynthetisiert. Vor dem Hintergrund der Untersuchung von Peptidwechselwirkungen,wurde ein funktionelles Peptid ausgesucht, dessen Affinitat zu Oberflachen, jene dergenerell oberflachenaffinen Proteine, noch ubertrifft [52]. Dieses Peptid wurde alsModel fur die Studie zu Abhangigkeiten des Adsorptionsverhaltens von der Peptid-sequenz und der Oberflache genutzt. Das Modelpeptid stellt eine Wiederholungs-einheit dar, die sich aus dem Muschelprotein Mefp1 ableitet und adhasive Merk-male aufweist [134]. Basierend auf diesem Modelpeptid wurden Modifikationen in-nerhalb der Sequenz vorgenommen, entlang der Fragestellung nach dem Einfluß derSequenzlange und der Aminosaure 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) auf die Ober-flachenaffinitat.Die im zweiten Teil der Arbeit eingesetzten antimikrobiellen Peptide, die im Rahmender Oberflachenfunktionalisierung untersucht wurden, sind wie auch die adhasivenPeptide literaturbekannt [86, 135].

Fur die Synthese wurde ein mit Fmoc-Aminosauren vorbeladenes TCP-PolystyrolharzI an einem 433A Festphasenpeptidsynthesizer (SPPS) der FirmaApplied-Biosystems (Farmington, USA) verwendet.Die Synthesen wurden im 0,1 mmol Maßstab durchgefuhrt. Sofern nur minimale

ISubstitutionsgrad fur Lysin und Alanin = 0,54 mmol/g

33

34 Kapitel 4. Materialien und Methoden

Mengen Peptid erforderlich waren oder eine Limitierung seitens der eingesetztenAminosauren auftrat, wurde der Maßstab 10 μmol fur die Synthese gewahlt. Es wur-de nach dem FastMoc-Protokoll gearbeitet. Dieses Protokoll nutzt die orthogonaleSchutzgruppenstrategie: Das α-Amin wird mit einer temporaren Schutzgruppe aus-gestattet. Diese Funktion erfullt das Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). Gleichzeitigsind Aminosauren, die uber reaktive Gruppen an ihren Seitenketten verfugen, mitpermanenten Schutzgruppen gegen die Synthesechemie gefeit. Der Fmoc-geschutzteN-Terminus der eingesetzten L-Aminosauren wurde nach jedem Kopplungszyklus undwenn die Harze bereits mit Aminosaure beladen eingesetzt wurden, zusatzlich vor derersten Kopplung mit 20 % Piperidin in NMP entschutzt. Die basenstabilen Seiten-kettenschutzgruppen wurden nach der Festphasensynthese entfernt.Die Kopplung einer Aminosaure an die am Harz heranwachsende Sequenz erfolgtdurch einen nukleophilen Angriff des N-Terminus am Carbonylkohlenstoff der zukoppelnden Aminosaure. Dieser Kohlenstoff wurde zuvor der standardisierten Akti-vierung mit HBTU oder mit HATU II in NMP unterzogen.

Die Abspaltung des Harzes und der permanenten Schutzgruppen erfolgte in einemSchritt durch die Zugabe von 4 mL (1 mmol Ansatz), bzw. 400 μL (0,1 mmol Ansatz)eines Trifluoressigsaure/Triisopropylsilan/Wasser-Gemisches im Verhaltnis (18:1:1).Das abgespaltene Peptid wurde nach 2 Stunden durch einen Spritzenfilter (0,45 μm)in eiskalten tert-Butyl-Methylether (MTBE) uberfuhrt. Das darin prazipitierte Pep-tid wurde weitere zwei Stunden bei -20◦C nachgefallt. Im Anschluss wurde die Losungzentrifugiert. Der Ruckstand wurde in Wasser gelost, in einen Kolben uberfuhrt undlyophilisiert.

Die Charakterisierung der Peptide erfolgte mit einer BioCad 700E HPLC-Anlageder Firma Applied Biosystems. Zur Analyse der Probe wurde eine Varian HPLCSaule eingesetzt (Polaris 5u C18-A 250 x 4,6 mm). Der Losungsmittelfluß betrug1 mL/min. Zur Auftrennung der Komponenten wurde ausgehend von 10% Acetoni-tril innerhalb von 15 Minuten linear auf 50% Acetonitril erhoht. Die Komponentenwurden bei 214 nm und im Anschluß manuell durch MALDI-ToF-MS detektiert. Ei-nige der Peptide wurden praparativ durch HPLC gereinigt. Dazu wurde mit einemFluß von 21,60 mL/min gearbeitet und ein Gradient uber 15 Minuten ausgehend von10% ACN + 0,1% TFA auf 45% ACN + 0,1% TFA gefahren.In Tab. 4.1 sind alle Peptide, die fur die Experimente in dieser Arbeit synthetisiertwurden aufgefuhrt. Alle Peptide und Peptidderivate wurden bei -20◦C gelagert.Die Ausbeuten der Peptidsynthesen beliefen sich generell auf uber 100%. Diese Un-verhaltnismaßigkeit laßt sich durch die in der Sequenz vorhandenen Aminogruppen,die durch Lysin vorgegeben sind erklarenIII. Diese bilden mit dem TFA-Anion Sal-ze. Das TFA-Gegenion mißt eine Molmasse von 114 g/mol und verzerrt daher dieAusbeutebestimmung.

IIDer Einsatz des effektiveren Aktivierungsreagenz wurde aufgrund des hohen Preises fur HATUnur in schwierigen Synthesen gewahlt.

IIIIn den Peptiden mit vier Lysinen lassen sich entsprechnend funf Produktmassen im MALDI-ToF-MS und funf produktzugehorige Retentionszeiten in der HPLC identifizieren.

4.1. Methoden 35

Tabelle 4.1: Zusammenstellung der am SPPS synthetisierten Peptidsequenzen (Y=DOPA, P=Hyp)und ihrer Molmassen, sowie die Massen, die im MALDI-ToF-MS bestimmt wurden; a Peptid wurdedurch praparative HPLC gereinigt; b Glycin (G) wurde als Fmoc-(Tmob)Glycin wahrend der Syn-these vorgelegt; c die Peptidsynthese erfolgt an einem Rinkharz; d nach dem letzten Kopplungszykluserfolgte keine Behandlung mit Piperidin; die durch praparative HPLC gereinigten Peptide wiesenRetentionszeiten von 7 min (Peptid [1-1 switch]), 6 min (Peptid [1-2]), 7 min (Peptid [2-2]) und 9,14, 17, 19 min (Peptid [2-4]) auf.

Peptid M MALDI-ToF Sequenz

.. [g/mol] m/z

1-0 1183 1184 [M+H]+ AKPSYP PTYK

1-1 1199 1200 [M+H]+ AKPSYP PTYK a

1222 [M+Na]+

1314 [M+TFA+H]+

1-1 switch 1199 1200 [M+2TFA+H]+ AKPSY P PTYK a

1222 [M+Na]+

1-2 1215 1216 [M+H]+ AKPSY P PTYK a

1238 [M+Na]+

2-1 2364 2365 [M+H]+ AKPSYP PTYKAKPSYP PTYKa

2387 [M+Na]+


2495 [M+TFA+H]+


2526 [M+TFA+H]+

2642 [M+2TFA+H]+

2755 [M+3TFA+H]+

Cys-1-1 1843 1844 CALGGGAKPSYP PTYKGGAb

Cys-1-0 1827 1828 [M+H]+ CALGGGAKPSYP PTYKGGA b

1850 [M+Na]+

Cf-1-1 1558 1828 (cf)AKPSYP PTYKd

3 1263 1264 [M+H]+ (pa)AKPSYP PTYK d

1286 [M+Na]+

1302 [M+K]+

S4b 1024 1025 [M+H]+ (pa)TPEDLNQKd

1047 [M+Na]+

1063 [M+K]+

S4a 1411 1412 [M+H]+ (pa)KRWWKWWR-Amidc,d

Tet000 944 945 [M+H]+ (pa)TPEDLNQK

967 [M+Na]+

983 [M+K]+

Tet127 1486 1487 [M+H]+ KRWWKWRR-Amidc

Biotin-Tet000 1170 1171 [M+H]+ (biotin)TPEDLNQKd

Biotin-Tet127 1557 1558 [M+H]+ (biotin)KRWWKWR-Amidc,d


4.1.2 Synthese Fmoc-L-DOPA-(TBDMS)2 (S1)

Die in der Modelpeptidsequenz enthaltene posttranslational modifizierte Ami-nosauren 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) wurde im Vorfeld der Festphasensyn-these mit othogonalen Schutzgruppen ausgestattet.Im ersten Schritt wurde die permanente Schutzgruppe t-Butyl-Dimethylsilan(TBDMS) an den Katecholgruppen eingefuhrt. Im zweiten Schritt folgte die Sub-stitution eines Protons am α-Stickstoff gegen 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc),die als temporare Schutzgruppe agiert (Abb. 4.1). Beide Syntheseschritte erfordertendas konsequente Arbeiten unter Argonatmosphare.

NH3

+ NH

NNH

O

O

NH3

+

O

OH

NH

O

NN

NH

NH

O

OH

O

OOH

O

OH

OH

NH

O

COOH

OH

OH

NH3

+

80

Ala Lys Pro Ser Tyr Hyp Hyp Thr DOPA Lys

NH2

OH

OH

OH

O

N

NSi

NH2

OH

O

O

O

Si

O O

O

N

O

O

DOPA

M = 197,19 g/molC H NO9 11 4

DOPA(TBDMS)2 Fmoc-DOPA(TBDMS)2

TBDMSCl

Si

NH

OH

O

O

O

Si

OO

M = 425,72 g/molC H NO Si

Ausbeute: 73 %21 39 4 2

M = 647,97 g/molC H NO Si36 49 6 2

Ausbeute: 67 %

Abbildung 4.1: Zweistufige Synthese zu Fmoc-L-DOPA-(TBDMS)2; unten ist eines der Peptidegezeigt, in dessen Sequenz diese Aminosaure verbaut wurde (blau hervorgehoben); DIPEA Diisopro-pylethylamin.

Es wurden 9 g (60 mmol) TBDMS-Chlorid (TBDMSCl) in 45 mL Acetonitril(trocken) gelost. Anschließend wurden 4 g (20 mmol) L-DOPA unter Ruhrenhinzugegeben. Die Suspension wurde unter Ruhren auf 0◦C gekuhlt. In die kalteSuspension wurden nun 9 mL (60 mmol) Diazabicycloundecen (DBU) langsamzugetropft. Die Reaktion wurde noch 4 h bei 0◦C geruhrt und nach Entfernen desEisbades ruhrte die Reaktionsmischung weitere 20 h bei Raumtemperatur.Der Kolbeninhalt wurde nun in ca. 130 mL eiskaltes technisches Acetonitril (-20◦C)gefallt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag. Diesem wurden 30 min im Eisbad zumabsetzen eingeraumt, bevor er abfiltriert wurde. Der Filterkuchen wurde zweimalmit eisgekuhltem technischem Acetonitril gewaschen, in einen Kolben uberfuhrt undgetrocknet.

4.1. Methoden 37

Das mit TBDMSCl und TBDMS-OH verunreinigte Rohprodukt wurdesaulenchromatographisch uber ein Kieselgelbett gereinigt. Als Eluent wurdeMethanolIV verwendet (Rf = 0,6, Detektion uber Ninhydrinreaktion).3,4-Bis(t-butyldimethylsilyloxy)-L-phenylalaninAusbeute: 6,4 g (15 mmol); 73% d. Th.MALDI-ToF-MS (Matrix: Dithranol gesattigte THF-Losung): m/z=426 [M+H]+,448 [M+Na]+1H-NMR (d6-DMSO, 200 MHz): 6,9-6,75 (m, 3 H, C6H3(OSi)2); 3,7 (q, 1H, CH);3,2-2,8 (m, 2H, NCO2CH2); 0,924-0,911 (d, 18 H, C(CH3)); 0,125-0,12 (d, 12 H,SiCH3)

3,8 g (9 mmol) L-DOPA-(TBDMS)2 wurden in 45 mL Dioxan unter Ruhren bei0◦C suspendiert. Zur Suspension wurden 24 mL einer 10 %-igen Na2CO3-Losungzugegeben. Nach 15 min Ruhren wurden 3 g (9 mmol) Fluorenylmethoxysuccinimid(Fmoc-OSuc) in die Reaktionsmischung eingetragen. Die Reaktionsmischung wurdenoch 4 h im Eisbad und weitere 18 h bei Raumtemperatur geruhrt.Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25 mL Wasser beendet. Das Reaktionsge-misch wurde dreimal mit Chloroform extrahiert und die vereinigten Chloroformpha-sen anschließend weitere dreimal mit 25 mL konzentrierter NaCl-Losung gewaschen.Der Produkt wurde eingeengt und der verbleibende braune Ruckstand als konzentrier-te Losung in Chloroform aufgenomme. Dieses Konzentrat wurde in 600 mL eiskaltesAcetonitril (technisch) eingetragen. Der Kolben wurde fur 2 h bei -20◦C gelagert.Das entstandene weiße Prazipitat wurde abgefiltert, der Filterkuchen mit eiskaltemAcetonitril gewaschen und zum Trocknen in einen Kolben uberfuhrt.3,4-Bis(t-butyldimethylsilyloxy)-N-Fluorenylmethoxycarbonyl-L- phenylalaninAusbeute: 4,4 g (6,8 mmol); 67% d. Th.MALDI-ToF-MS (Matrix: Dithranol gesattigte THF-Losung): m/z=670 [M+H]+, 692[M+Na]+1H-NMR (d6-DMSO, 200 MHz): 7,8-7,6 (d, 4 H,C13H8); 6,9-6,75 (m, 3 H,C6H3(OSi)2); 3,7 (q, 1 H, CH); 3,2-2,8 (m, 2H, NCO2CH2); 0,924-0,911 (d, 18 H,C(CH3)); 0,125-0,12 (d, 12 H, SiCH3)Das Produkt wurde bei -20◦C gelagert.

4.1.3 Abwandlungen vom SPPS-Protokoll

Aufgrund der aufwendigen Synthese von (S1) wurde der Festphasensynthesiser um-programmiert, um statt mit den ublichen 10 Aquivalenten Aminosaure nur mit 5Aquivalenten zu arbeiten. Dies ermoglichte den effizienteren Umgang mit geschutztemDOPA ohne Einbußen in der Peptidausbeute. Fur Peptide mit einem N-terminal ge-koppelten Biotin oder gekoppelter Pentinsaure wurde ebenfalls eine abgewandelteChemie am Festphasensyntesizer angewandt. In diesen Fallen erubrigte sich die letz-te basische Behandlung mit Piperidin aufgrund der fehlenden Fmoc-Schutzgruppesowohl fur Biotin, als auch fur die Pentinsaure.Die Anpassungen des Syntheseprotokolls, das wahrend der Festphasensynthese ver-wendet wurde, berucksichtigte neben der Einsparung uberflussiger Spaltungsschritte

IVObgleich Kieselgel sich in Methanol in Teilen lost und daher dieser Eluent ungeeignet ist, soerwies sich dieses Losemittel als das Einzige, in dem sich akzeptable Mengen des hitzeempfindlichenRohprodukts

”losten“


und dem sparsameren Einsatzes rarer Edukte auch sterische Hinderungen wahrendder Kopplung.Schwierige Peptidsequenzen mit hohem Aggregationspotential oder mit sterisch an-spruchsvollen Termini ergeben sich, wenn mehrere hydrophobe Aminosauren aufein-anderfolgend gekoppelt werden. Trimethoxybenzyl-Glycin (Tmob-Gly) wird in sol-chen Sequenzen statt der Aminosaure Glycin oder erganzend als Strukturbrechereingesetzt. Nach der Aufarbeitung verbleibt der Strukturbrecher Tmob als Glycinin der Sequenz. Der Einsatz dieses Strukturbrechers wurde im Rahmen von Peptid-synthesen mit Cystein-Tag erforderlich. Fur Experimente mit Gold-Partikeln wurdedurch ein N-terminal positioniertes Cystein auf die spatere Ausbildung einer Gold-Schwefel-Bindung abgezielt. Da die Goldpartikel uber eine hohe Elektronendichte ander Oberflache verfugen, ist es erforderlich die originare basische Mefp1(-Derivat)-Sequenz in kurzen Spacern einzubetten. Der Spacer selbst setzt sich aus hydropho-ben Aminosauren zusammen, was sich in Komplikationen wahrend der Kopplung amFestphasensynthesizer außert. Der Einsatz von Tmob-Gly beugte den, aus schwieri-gen Kopplungen resultierenden, Peptiddeletionen vor.

4.1.4 MALDI-ToF-MS

Die HPLC-Eluate der Peptide wurden massenspektroskopisch unter schonender Ma-trix unterstutzender Laserdesorptionsionisation an einem MALDI-ToF Voyager DEP,Applied Biosystems, Foster City, USA untersuchtV. Dazu wurden 10 μL einer fri-schen gesattigten Matrixlosung aus α-Cyano-4-Hydroxyzimtsaure in einem Gemischaus 50 % Acetonitril in Wasser (v%) mit 1 μL der gelosten Probe (1 mg/mL) gemischtund auf ein Target gespotted. Nach Schleusen des Targets in die Probenkammer wur-de mittels der Angiotensin-Reflektor Parameter im Reflektor Modus detektiert.

4.1.5 QCM

Die Quarzkristall-Mikrowaagen-Technik (Stanford Research System) wurde genutzt,um die Adsorption der unter Abschnitt 3.2 auf S. 31 beschriebenen [x-n] Peptide aufeiner Kristalloberflache zu messen. Es wurden drei Oxidationsexperimente entwickelt,da die in den Peptiden enthaltenen Katechol-Seitenkette(n) (DOPA) gezielt uber einOxidationsmittel angesprochen und chemisch verandert werden sollte(n). Die Oxida-tion des/der Katechol(e) zum Chinon wird hierin durch Periodat eingeleitet. DieseReaktion wurde zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten initiiert:

Q0 ..Zum Zeitpunkt t0 wurde das [x-n] Peptid mit gesattigter NaIO4-Losung versetztund lag bereits oxidiert im Reservoir vor.

Q1 ..Nachdem die Peptidlosung uber den Quarz geleitet wurde, wurde mit Wassergespult und uber das verbliebene adsorbierte Peptid eine NaIO4-Losung gelei-tet. Im Anschluß daran wurde der Quarz wieder mit Wasser gespult.

Q2 ..Neben Q1 wurde als Referenz das reine Adsorptionsexperiment ohne Verwen-dung eines Oxidationsmittels durchgefuhrt.

VFur pegylierte Verbindungen wurde eine in THF gesattigte Anthracentriol-Losung als Matrixverwendet.

4.1. Methoden 39

Q3 ..Die Adsorption des nativen Peptids auf dem Quarz wurde abgewartet und imAnschluß das Oxidationsmittel eingeleitet.

In Abb. 4.2 sind die Experimente Q2 und Q3 skizzenhaft dargestellt. Die Mas-senanderung ist entsprechend der Erwartungen in ihrem zeitlichen Verlauf aufge-tragen.

Q2

�m

t

dd-H O2 Peptid x-n[1 mg/mL]

2. Spülen1. Adsorption

�m

Peptid x-n[1 mg/mL]

2. Vernetzung1. Adsorption

3. Spülen

Na

IO4

Q3

t

dd-H O2 dd-H O2 dd-H O2

Abbildung 4.2: Schematische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der QCM-Experimente zur Ad-sorption (Q2) und zur Oxidation nach Sattigung der Oberflache mit Adsorbat (Q3).

Das Experiment Q0 wurde in Entsprechung zum Experiment Q2 durchgefuhrt, mitdem Unterschied, dass statt der reinen Peptidlosung eine Peptid-Oxidationsmittel-Losung uber den Quartzkristall geleitet wurde (Abb. 4.3).Im Zusammenhang mit dem Q0 Experiment stellte sich die Frage, welchen Einflußdie Zugabe des Oxidationsmittel nach erfolgtem Spulblock hat. Das entsprechendeExperiment Q1 wurde stellvertretend fur alle [x-n] Peptide nur mit einem Peptiddurchgefuhrt.

Q0 Q1

�m

t

Peptid x-n[1 mg/mL]

2. Spülen1. Adsorption

Peptid x-n[1 mg/mL]

1. Adsorption3. Vernetzung

NaIO 4

NaIO 4+

t

4. Spülen

2. Spülen

dd-H O2dd-H O2 dd-H O2 dd-H O2 dd-H O2

�m

Abbildung 4.3: Schematische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der QCM-Experimente zur Ad-sorption bereits oxidierter Peptide (Q0) und eingeleiteter Oxidation, nachdem ein Adsorptionszyklusdurchlaufen war (Q1).

Die benotigten Quartzkristallsensoren mit einem Durchmesser von 26 mm warenAT-geschnittenVI. Die Quarze waren mit Silizium (poliert) bzw. Titan (poliert) be-

VIDie Schwingeigenschaften von Schwingquarzen richten sich u.a. nach dem Quarzschnitt, der Geo-metrie des Schnittwinkel zur Kristallachse. Der ’AT-Schnitt’ gewahrt eine hohe thermische Stabilitatder Resonanzfrequenz (dies wird durch das T ausgedruckt). Der ’AT-Schnitt’ wird bevorzugt fur dieHerstellung von Dickenscherschwingern (thickness-shear-crystals) gewahlt


sputtert. Fur die 5 MHz Quartzkristalle von MexTex ist C = 0,177 mg/(Hz · m2).Die Quartzkristalle wurden bei ihrem Grundton 5 MHz angeregt.Fur jede Messung wurde der Quarzkristall in der Halterung positioniert und dar-auf eine Durchflußzelle positioniert. Dieser Aufbau wurde in einem Reaktions-gefaß aufgehangen, um die Messung gegen Temperaturschwankungen und leichteErschutterungen zu isolieren. Zunachst wurde die QCM jeweils 45 Minuten unter Luftequilbriert. Darauf folgte das Spulen der Meßzelle mit dd-Wasser. Da die Schwingun-gen eine Abhangigkeit von der Flußgeschwindigkeit zeigen, wurde diese manuell ubereine Klemme und spater uber einen Prazisionstropfenzahler eingestellt. Das Systemwurde nun weitere 45 Minuten mit dd-Wasser equilibriert. Dann erfolgte die Messungwie weiter unten beschrieben.Nach jeder QCM-Messung wurden die einzelnen Gerateteile, die mit der Peptidlosungin Kontakt waren, sowie der Kristall gereinigt. Dazu wurde zunachst das kompletteSystem zwei Mal mit dd-Wasser gespult. Anschließend wurde die Apparatur aus-einander gebaut und die Schlauche, zusammen mit der Flußzelle vier Minuten imUltraschallbad gereinigt. Wahrendessen wurde der Schwingquartz vier Minuten inPiranhawasserVII getaucht. Der Quartz, wie auch die Schlauche wurden nochmalssorgfaltig und vorsichtig mit dd-Wasser gespult und schließlich unter Stickstoffflußgetrocknet. Quartzkristalle, die diese Reinigungsprozedur zehn Mal unterzogen wur-den, wurden danach verworfen.Die Adsorptionsexperimente (Q2) wurden durch Zugabe einer frisch angesetzten [x-n]Peptidlosung der Konzentration 1 mg/mL eingeleitet. Dabei wurden z.T. unterschied-liche Volumina der Peptidlosung vorgelegt. Weiterhin wurden verschiedene Flußratenuntersucht.Die Adsorptionsexperimente wurden, nachdem sich keine Peptidlosung mehr in derVorlage befand, durch Spulung mit dd-Wasser unter Beibehaltung der Flußgeschwin-digkeit weitergefuhrt. Sofern sich wieder eine konstante Frequenz einstellte, wurdedas Experiment beendet. Analog wurde im Experiment Q0 vorgegangen. Mit demUnterschied, dass das Peptid gemeinsam mit 1 μL einer gesattigter NaIO4-Losung inder Reserve vorgelegt wurde.Im Experiment Q3 wurde zunachst analog dem Q2-Experiment verfahren. Nachdemdie Peptidlosung aufgebraucht war, wurde jedoch nur 1 Minute mit Wasser gespultund schließlich das Wasser gegen 5 mL einer 1 mM NaIO4-Losung ausgetauscht.Nachdem diese aufgebraucht war, wurde der Spulblock mit dd-Wasser fortgesetztund das Experiment nach Erreichung einer konstanten Frequenz beendet.Das Experiment Q1 wurde stellvertretend fur alle [x-n] Peptide mit dem Peptid [2-1]durchgefuhrt. Wie in der Durchfuhrung beschrieben, wurde zunachst die Adsorptionabgewartet, wie fur Q0 und im Anschluß mit 2 mL dd-Wasser gespult. Danach wurdedas verbleibende Peptid mit 5 mL einer 1 mM NaIO4-Losung oxidiert und erneut mit5 mL dd-Wasser gespult.Die aus den QCM-Messungen gewonnenen Informationen zur adsorbierten Massewurden in Mol umgerechnet. Hierfur wurde die Annahme getroffen, dass es sich furdie adsorbierten Masse mads ausschließlich um Peptid handelt. Diese Annahme dientin diesem Fall lediglich dem Zweck der Vergleichbarkeit und spiegelt nicht die Realitatwider:

mads = (1− a) ·mPeptide + a ·mH2O, ...a �−→ 0 (4.1)

VII4:1 Mischung konz. Schwefelsaure und 30 % iges Wasserstoffperoxid

4.1. Methoden 41

4.1.6 Spektroskopische Methoden

Infrarotspektroskopie

Die Aufklarung der chemischen Natur von Oberflachen kann in der Laborpraxis mitinfrarotspektroskopischen Methoden (IR) erfolgen. Die Infrarot Reflexions Absorp-tions Spektroskopie (IRRAS) stellt dabei eine geeignete Methode zur Untersuchungdunner Schichten, wie Monolagen mit Ausdehnungen von wenigen Nanometern aufder z-Achse, an Grenzflachen dar. Das Meßprinzip ist in der Fuhrung des Strahlsin einem Einfallswinkel �= 90◦ durch die Adsorbatschicht und seiner Reflexion ander Grenzflache begrundet. Die Analyse an der Luft/Feststoff Grenzflache erfordertdaher die Verwendung eines reflektierenden Substrats. Fur dunne Schichten wird einspitzer Eintrittswinkel (45◦) gewahlt, um den Weg durch die reflektierende Probezu verlangernVIII. Die resultierende Empfindlichkeit dieser Methode ermoglicht dieCharakterisierung von dunnen Adsorbatschichten wie die Peptidadsorption der [x-n]Peptide.Hierfur wurden hochpolierte reflektierende Titanscheiben mit einem Durchmes-ser von 15 mm und einer Starke von 1 mm bei Raumtemperatur mit 1 mLeiner Peptidlosung der Konzentration 1 mg/mL in dd-Wasser analog zu denQCM-Experimenten prapariert. Die Scheiben wurden zunachst 30 Sekunden inPiranha-Losung (siehe QCM-Protokoll) gereinigt, anschliessend mit dd-Wasserabgespult und schließlich im Stickstoffstrom getrocknet. Jede Scheibe wurde mit derpolierten Flache nach oben weisend in eine Vertiefung einer 12-well-Reaktionsplattepositioniert. Die Peptidlosungen wurden frisch in dd-Wasser angesetzt und 1 mL derentsprechenden Losung bzw. in der Referenz dd-Wasser auf die Scheiben pipettiert.Die abgedeckten Scheiben wurden 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Danach wurde die Peptidlosung vorsichtig wieder aufgenommen und die Scheiben inderselben Vertiefung behutsam mit 1 mL dd-Wasser bedeckt. Dieser Waschschrittwurde noch zwei weitere Mal jeweils 10 Minuten wiederholt. Wahrend der Inkubationin der Peptidlosung und auch wahrend der Waschgange wurde die Reaktionsplatteleicht mit 50 rpm auf einer Schuttelplatte bewegt. Die gewaschenen Scheiben wurdenschliesslich in Stickstoffstrom getrocknet und zeitnah durch IRRAS analysiert.Aufgrund starker Storungen durch Wasserbanden, die von der Luftfeuchtigkeitherruhren, wurde die Probenkammer eine Stunde vor jeder Messung mit N2 gesattigt(A514/Q Auto Seagull Automated reflectance accessory).Gemessen wurde an einem IFS-66S und einem TENSOR 27-IR-SpektrometerREVIEW der Firma Bruker mit externem Strahlenausgang (4000-400 cm−1, Reflek-tionswinkel 80◦).

VIIIDurch den IR-Strahl werden die isotrop an der Oberflache verteilten Dipolmomente angeregt.Aufgrund des elektrischen Anteils der elektromagnetischen Welle (IR-Licht), die als Kraft (elektri-sches Feld) auf die frei beweglichen Elektronen einwirkt, kommt es zu einer Ladungspolarisation. Dieelektromagnetische Welle wird an der Oberflache in senkrechte und parallele Komponenten aufgespal-ten, wobei die letztere Komponenten eine Translation der Elektronen parallel zur Oberflache bewirkt.Infolge dessen baut sich ein elektrisches Feld an der Oberflache auf. Die Auswahlregel beinhaltet,dass diese Translation solange erfolgt, bis sie die parallele Komponente des IR-Lichtes, die ursachlichwirkende Kraft, ausgleicht und die Ladungspolarisation aufhebt ( �Ex=0). Der senkrecht wirkendeAnteil der Ladungspolarisation hingegen wirkt gleichgerichtet zur senkrecht wirkende Komponentedes IR-Lichtes und verstarkt selbige ( �Ez = x�Ez)


Proteine zeigen aufgrund ihres Polymerruckgrates typische Absorptionen der NHStreckschwingung A and B (ca. 3300 und 3070 cm−1). Die Amid A Bande ist einTeil eines Fermiresonanzdubletts dessen zweite Komponente, die Amid B Schwin-gung, schwach zwischen 3100 und 3030 cm−1 absorbiert [136]. Uberdies lassen sichdie Amid I (1650 cm−1) und die Amid II Bande diesem Ruckgrat zuordnen. Die AmidI Bande ruhrt hauptsachlich von der C=O-StreckschwingungIX her und reagiert sehrsensibel auf Veranderungen der Seitenketten. Veranderungen der Sekundarstrukturlassen sich aus Veranderungen dieser Bande ablesen. Die Amid II Bande bei 1550cm−1 ist eine

”out-of-phase“ Kombination der NH Biegeschwingung und der C-N

Streckschwingung mit kleinen Anteilen der C-C und N-C Streckschwingung. Die-se Schwingungen reagieren ebenfalls sensibel aber weniger intensiv als die Amid ISchwingung auf Veranderungen in der Sekundarstruktur. Durch die Existenz derAmid I und Amid II Banden kann die Prasenz von Peptiden festgestellt und ferneruber die Veranderungen dieser Bandenpositionen auch Ruckschlusse auf Konforma-tionsanderungen im Protein gezogen werden [136–138]. Die unterschiedlichen Kon-formation, in denen Peptide vorliegen konnen, leiten sich aus Unterschieden in denAnteilen der vier Sekundarstrukturtypen α-Helix, β-Faltblatt, Random-coil und Po-lyprolin II (PPII) ab. In Tab. 4.2 sind die typischen Bereiche der Amid-I Bande furdie entsprechenden Strukturtypen zusammengefaßt.

Tabelle 4.2: Amid I Bandenpositionen fur charakteristische Sekundarstrukturtypen in Proteinen[139].

Sekundarstruktur Bandenposition in H2O cm−1 Bandenposition in D2O cm−1

α-Helix 1657-1648 1660-1642β-Faltblatt 1641-1623 1638-1615

1695-1674 1694-1672Schleifen 1686-1662 1691-1653Ungeordnet 1657-1642 1654-1639

Die Einschrankung auf reflektierende Oberflachen trifft auf die abgeschwachte Total-reflektion (ATR) nicht zu. Die molekulspektroskopische Quantifizierung uber FTIR-ATR zeigt jedoch eine starke Abhangigkeit vom Grundmaterial. Liegen die charakte-ristischen Absorptionsbanden des Grundmaterials im Bereich der zu analysierendenAdsorptionsschicht, so kann aufgrund der Uberlagerungen keine Aussage zur Quan-titat getroffen werden. Fur FTIR-ATR-Messungen wurde das Equinox 55 von Brukergenutzt.

Rontgenspektroskopische Methoden

Mittels Rontgenspektroskopie als oberflachenanalytisches Verfahren konnenVeranderungen der Oberflachenzusammensetzung im Vergleich zum Grundmaterialerfasst werden. Die Messung erfolgt im Hochvakuum (10−3 mbar) und ist somit aufnicht fluchtige Proben (d.h. trockene Oberflachen) limitiert.Das Messprinzip der Rontgen Photoelektronenemsissionsspektroskopie (XPS) beruhtauf Rontgenstrahlen, die auf eine Probenoberflache treffen. Dabei werden Pho-

IXKleine Beitrage stammen von der”out-of-phase“ C-N Streckschwingung, C-C-N Deformations-

schwingung und der NH in-plane Biegeschwingung.

4.1. Methoden 43

toelektronen infolge des photoelektrischen Effekts emittiert. Die Bestimmung derkinetischen Energie Ekin dieser Photoelektronen in Verbindung mit der bekanntenGesamtenergie Ehν laßt Ruckschlusse auf deren Bindungsenergie (Eb) zu. DieseBeziehung laßt sich vereinfacht beschreiben als,

Ehν = Ekin + Eb. (4.2)

Die Bindungsenergie des (Photo-)Elektrons gibt Aufschluß uber die Identitat des zu-gehorigen Elementes und uber dessen Bindungszustand.XPS erlaubt eine oberflachenempfindliche und quantitative Bestimmung der Element-zusammensetzung auf der Substratoberflache. Der Austrittstiefe der freigesetztenElektronen entsprechend ist die Informationstiefe durch XPS auf 10 nm beschrankt.Gegenuber Wasserstoff und Helium zeigt sich diese Methode als unempfindlich.Die XPS-Messungen wurden an einem KRATOS AXIS Ultra-Spektrometer im Ul-trahochvakuum durchgefuhrt. Als Rontgenquelle diente monochromatisierte Al-Kα-Strahlung. Die Gerateparameter sind Hybridmode, ein Abnahmewinkel der Photo-elektronen von 0◦, CAE-Mode mit 160 eV Passenergie in Ubersichtsspektren, sowie20 eV in hochaufgelosten Linienspektren, Probenneutralisation der Proben mit nie-derenergetischen Elektronen (2,6 eV). Der Meßpunkt ist elliptisch mit einem Durch-messer von 750 μm entlang der großen Achse und 350 μm entlang der kurzen Achse.Damit betragt die Analysenflache ca. 0,3 x 0,7 mm. Jede Probe wurde an zwei un-terschiedlichen Stellen vermessen und diese Werte gemittelt.

Weiterhin wurde die Energiedispersive Rontgenspektroskopie (EDX) im Zusammen-hang mit den TEM-Aufnahmen als ein weiters rontgenspektroskopisches Verfahrenverwendet. Dabei wirkt ein Elektronenstrahl auf die Probe ein. Die dadurch angereg-ten Atome geben Rontgenstrahlung ab, die detektiert wird. Diese ist elementspezi-fisch und erlaubt so eine Identifikation der Elemente aufgrund der charakteristischenMuster jedes Atoms. Dafur wurde ein FEI Tecnai F20 S-TWIN genutzt.

Im Rahmen der Adsorptionsuntersuchungen der [x-n] Peptide auf Titansubstratenwurden je vier hochpolierte Titanscheiben (d = 15 mm x 1 mm) zunachst vierMinuten in Piranha-Losung getaucht, im Anschluß mit dd-Wasser gespult und imStickstoffstrom getrocknet. Die Scheiben wurden in je eine Vertiefung einer 12-well-Zellkulturplatte gelegt und 1 mL einer frischen 1 mg/mL in dd-Wasser konzentrierten[x-n] Peptid Losung aufpipettiert. Die Platte wurde 90 Minuten bei Raumtemperaturauf einem Ruttler mit 50 rpm bewegt. Danach wurde die Peptidlosung abgenommen,gegen 1 mL Wasser vorsichtig ersetzt und weitere 20 Minuten auf dem Ruttler ge-waschen. Fur oxidierte Proben wurde anstelle des Wassers 1 mL einer 1 mM NaIO4

(aq.) Losung eingetragen und 10 min bei 50 rpm gemischt. Die Benennung lautetedann [1-0 ox] und [1-1 ox]. Danach wurde die NaIO4-Losung wieder abgenommen und1 mL dd-Wasser zugegeben und weitere 10 min bei 50 rpm gewaschen. Schließlichwurden die Scheiben vorsichtig im Stickstoffstrom getrocknet und direkt im Anschlußin das XPS geschleust.Als Referenz wurde eine Titanscheibe mit 1 mL dd-Wasser, anstelle der Peptidlosung,inkubiert.


UV-VIS-Spektroskopie

Absorptionen im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich wurden mit dem Mul-timodereaderX Mithras LB 940 von Berthold Technologies (Bad Wildbach, Germany)bestimmt. Dieses Gerat ist in der Lage Mikrotiterplatten auszulesen. Mikrotiterplat-ten sind Kunststoffplatten mit Vertiefungen, in denen ein Objekt oder eine Losungvorgelegt werden kann. Die Moglichkeit den Multimodereader zu programmieren,laßt die Dokumentation einer Bakterienwachstumskurve zu. Der integrierte Ruttlergewahrt eine ausreichende Durchmischung und eine atmungsaktive Folie, die auf dieMikrotiterplatte aufgespannt wird, sorgt fur eine ausreichende Sauerstoffversorgungder Bakterien ohne unerwunschte Austrocknung.

Bakterien pflanzen sich uber binare Zellteilung fort. Dies erfolgt durch Querwand-bildung, wobei aus einer Zelle zwei identische Tochterzellen entstehen [140]. DiesesWachstum kann durch eine Kurve, wie in Abbildung 4.4, abgebildet werden [141].Die Vermehrung entspricht einer geometrischen Progression und unterteilt sich invier Stufen [142]. Zu Beginn verzogert sich das Wachstum (Lag-Phase), da sich dieBakterien an das Medium und die Umgebungsbedingungen anpassen. Dann zeigtdie Zellkultur ein exponentielles Wachstum (Log-Phase) und befindet sich im Ma-ximum ihrer Teilungsgeschwindigkeit. Sobald das Angebot an Nahrung fur weiteresWachstum nicht mehr ausreicht oder Metabolite limitierend wirken, erschopft sich dieZellteilung (Stationare Phase), bis die Kultur schließlich verhungert (Sterbe Phase).Fur Versuche mit antimikrobiellen Wirkstoffen an Bakterien, die auf deren antibakte-rielle Wirkung abzielen, ist es notwendig diese in der Mitte der Log-Phase (Mitte-Log)zu starten, da sie sich dort in ihrem maximalen Wachstum befinden.

Stationäre Phase

Sterbe Phase

Lag Phase

Log Phase

Log

Zelle

n

Zeit

Mitte-Log

Abbildung 4.4: Wachstumskurve eines E.Coli Bakteriums [141]

Der Multimodereader wurde fur die Aufnahme von Wachstumskurven im Rahmender Experimente mit antimikrobiellen Peptiden, sowie quantitativer Fluoreszenzun-tersuchungen an Oberflachen, die mit entsprechend aktiven Substanzen behandeltwurden, genutzt.

XDer Multimodereader ist in der Lage sowohl Fluoreszenz- als auch Absorptionsmessungen vor-zunehmen. Dies ermoglicht die Detektion fluoreszenzaktiver Verbindungen. Ebenso lassen sich auchVeranderungen der optischen Dichte in Durchlichtmessungen bestimmen. Weiterhin ist das Geratuber ein Heizmodul temperierbar.

4.1. Methoden 45

Mikroskopie

Auflicht-, Durchlicht-, sowie Fluoreszenzmikroskopie wurden an einem Axio ImagerM1 von Zeiss (Oberkochen, Deutschland) durchgefuhrt. Die Ergebnisse wurden mitder dazugehorigen Farbkamera (AXIO CAM MRC von Zeiss) dokumentiert.Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (TEM) wurde an einem FEI Tecnai F20 S-TWIN durchgefuhrt.

4.1.7 Thermogravimetrische Methoden

Die TiO2 Partikel, die im Rahmen einer bottom-up Synthese uber drei Synthese-stufen modifiziert wurden, wurden nach jedem Syntheseschritt thermogravimetrischanalysiert (TGA). Dies wurde an einer TGA Q5000 von TA Instruments fur einenTemperaturbereich von 25-800◦C mit einer Heizgeschwindigkeit von 5 K/min durch-gefuhrt.

4.1.8 Antimikrobielle Untersuchungen

Antimikrobielle Testungen wurden gegen E.coli Bakterien durchgefuhrt XI. Die Testsberuhen auf dem reproduzierbaren und vergleichbaren Wachstum der Mikroben, indiesem Fall E.coli. Die Populationsentwicklung wird als Wachstumskurve in Auftra-gung der optischen Dichte (OD670) uber die Zeit dargestellt (siehe Abb. 4.4).Um die Tests standardisiert durchzufuhren, wurde immer eine Wachstumskurve imverwendeten Nahrmedium als Leerwert mitbestimmt.Fur jeden Test wurde eine frische E.coli Ubernachtkultur (8h, 37◦C) angesetzt. DieseE.coli Ubernachtkultur wurde auf die gewunschte Verdunnung mit frischem Mediumverdunnt. Alle verwendeten Medien wurden wahrend des Test hinsichtlich ihrer Ste-rilitat gepruft. Puffer, Medien und Wasser durfen keinen antimikrobiellen Effekt aufdie Bakterien ausuben. Der Einsatz eines erwiesenermaßen antimikrobiell wirkendenAgens (Ag, 70%-ige Isopropanollosung, TiO2) wurde mit Bakterien angeimpft undals Positivkontrolle mitgefuhrt.Alle Tests wurden in einer Mikrotiterplatte unter Verwendung einer aufgebrachtenluftdurchlassigen Folie durchgefuhrt, um das Austrocknen der Vertiefungen infolgeder Inkubationstemperatur (37◦C) und -dauer zu unterbinden.Die Erfassung der OD erfolgte aller 30 min mit dem Multimodereader (siehe Ab-schnitt 4.1.6 auf S.41), wahrend zwischenzeitlich durch elliptische Bewegung dieDurchmischung der Suspension gewahrleistet wurde.

Fur diese Tests wurden zunachst das synthetisierte antimikrobielle Peptid Tet127 unddas nicht antimikrobiell wirksame Referenzpeptid Tet000 (Negativreferenz) immobi-lisiert. Zum Zwecke eines aussagekraftigen Nachweises der erfolgreichen Peptidimmo-bilisierung, bei gleichzeitigem Erhalt der Funktion wurden unterschiedliche AM-Testsdurchgefuhrt.

XIDie Tests wurden in Zusammenarbeit mit Linda Gatjen ausgearbeitet und durch sie angeleitet.


Praparation von Adhasivverbindungen

Mit den [x-n] Peptiden wurden neben den Adsorptionsuntersuchungen auchAdhasivversuche durchgefuhrt. Im Zuge dessen wurden folgende Parameter variiert:

• Peptidkonzentration

• Aciditat des Solvenz

• Oxidationsstufe des Katechols.

Aufgrund der Limitierung durch die aufwendige Synthese der einzelnen Peptide wur-den jeweils nur Reprasentanten fur die unterschiedlichen Versuche verwendet.

Peptidkonzentration

Die Praparation der Proben, die durch Zugbeanspruchung gepruft wurden, ist inAbb. 4.5 dargestellt. Gezeigt ist das Fugen zweier ZrO2-Stifte (Geometrie 3 x 3 x9 mm) demonstriert. Zunachst wurden die Stifte in eine Vorrichtung aus Silikonpositioniert. Das Peptid [x-n] wurde in dd-Wasser (0,1 % TFA) gelost. Dann wurden2,5 μL einer 10 μmol/μL Peptidlosung mit einer Pipette aufgetragen und durchAuf- und Abbewegen des Ansaugstempels fur eine gute Durchmischung, wie auchgleichmaßige Benetzung des Substrates gesorgt. Auf den zweiten Stift wurde 1 μLgesattigte KIO3-Losung pipettiert (nicht gezeigt) und zugig gefugt. Nachdem derzweite Stift senkrecht verdreht zu dem Ersten ausgerichtet wurde, wurde nicht weiterkorrigiert. Der Uberlapp entspricht dem Quadrat der Dicke der Stifte (9 mm2). Derfertige Prufling wurde in der Vorrichtung belassen, mit 5 Gramm beschwert undsieben Tage ausgehartet. Die Prufung erfolgte an einer Zugmaschine von Zwick (siehePrufung Adhasivverbindungen).

Aciditat des Solvenz

Der Einfluß der Aciditat des Solvenz, in dem die Peptide gelost wurden, wurde durchFertigung von vier Adhasivverbindungen in zweifach Bestimmung auf Glassubstra-ten (75 x 25 x 1 mm) getestet. Es erfolgte der Auftrag eines in Isopropanol gelosten(1:1 w%) und eines in Trifluoressigsaure (TFA) gelosten Peptids (1:1 w%) auf polier-ten ZrO2-Stabchen. Jeweils zwei der Proben wurden unter zusatzlichem Eintrag von1 μL gesattigter KIO4-Losung gefugt. Untersucht wurden hierfur die Peptide [1-0]und [1-1].

Einfluß des Substrats und der Oxidation mit NaIO4

Der Zusammenhang zwischen Rauheit der Substratoberflache und der Adhasion wur-de auf polierten und nicht polierten ZrO2-Stabchen untersucht.Weiterhin wurden DruckscherprufungenXII an zwei unterschiedlichen Substraten, Ti-

XIIDiese an einem Bondtester vorgenommene Prufung kommt einer Zugprufung in Bezug auf dieScherbelastungen am nachsten. Der Meißel tragt gegen den gefugten Uberlapp der Pruflinge Kraftein und ubt dabei anstatt der Zugkraft einen punktuellen Vorschub ausubt. Die dadurch verursachteScherung ist im Vergleich zur Zugscherung geringer.

4.1. Methoden 47

a) b) c)

d) e) f)

Abbildung 4.5: Die Praparation einer Adhasivverbindung am Bsp. von ZrO2: a) Positionierung desZrO2-Stifts in der Klebvorrichtung, b) Auftrag der Peptidlosung, c) Fugung (im Fall der Oxidations-reaktion induziert durch ein Oxidationsmittel wurde dieses zuvor auf diesen Stift aufgetragen), d)senkrecht verdrehte Ausrichtung, e) Kontaktflache mit Gewicht beschweren, f) 7 Tage ruhen lassen.

tan und Al2O3, vorgenommen, von dessen Oberflache zusatzlich der Kontaktwinkelmit Wasser an einem Kruss G 2/G40 (Kruss GmbH, Hamburg, Germany) bestimmtwurde.Die Praparation dieser Proben verliefen nach dem folgenden Protokoll: Zwei Titan-bzw. Al2O3-plattchen (10 x 15 x 1 mm) wurden jeweils mit 10 μL einer [x-n] Pep-tidlosung ([1-n] Peptide a 50 mg/mL, [2-n] Peptide a 100 mg/mL, DOPA je 5 Probena 8 und 8 · 10−3 mg/mL) benetzt. Vor dem Fugen wurde auf eine der Seiten 1 μLeiner 0,2 mg/mL konzentrierten NaIO4-Losung gegeben (ca. 80 mm2 Uberlappung).Fur alle Peptide der Titanserie erfolgte eine siebenfach Bestimmung mit Ausnahmefur DOPA, die in zehnfach und das Peptid [1-1], die in funffach Bestimmung gepruftwurden. Die Hartung erfolgte acht Stunden unter Beschwerung mit Gewichten bei23◦C und 50% relativer Luftfeuchte. Die Prufung erfolgte an einem Bondtester wieunter Abschnitt 4.1.9 beschrieben. Die Charakterisierung der Bruchflachen erfolgtedurch Auflichtmikroskopie.

4.1.9 Prufung von Adhasivverbindungen

Die Adhasivverbindungen der [x-n] Peptide wurden unter Zug- und Scherbelastunggetestet. Die Zugversuche wurden zum Teil bei dem Projektpartner des Univer-sitatsklinikums Erlangen an einer Zwick/Roell Zugmaschine gepruft (Abb. 4.6).

Methode 1

In Abb. 4.6 ist zum einen die Zugprufung einer Adhasivverbindung mit den Sub-straten Zirkoniumoxid- bzw. Dentin in vier Schritten dargestellt. Beginnend mit dervorsichtigen Positionierung der Probe, folgt darauf das Legen von Schlaufen um dasrechte und linke Ende des oben aufliegenden Stiftes, der orthogonal verdreht auf sei-


nem Gegenstuck gefugt wurde (siehe Praparation von Adhasivverbindungen). Nach-dem die Schlaufen symmetrisch ausgerichtet wurden, wurden sie gespannt und mitder Prufung begonnen, bis zum Bruch der Klebverbindung.

Abbildung 4.6: Zugprufung der Adhasivverbindungen; von links nach rechts sind die Schritte derPrufung zusammengefaßt.

Methode 2

Mit veranderter Probengeometrie wurden weitere Adhasivverbindung an einem Da-ge Series 4000-2075911 Bondtester durch Druckscherung gepruft. Dazu wurde jedeProbe einzeln mit dem unteren Fugeteil in Gangrichtung des Meisels ausgerichtetpositioniert. Es wurde ein Meisel runder Geometrie gewahlt und auf eine Scherhohevon 100 μm justiert. Die Kraftvorgabe waren 4,9 N und gepruft wurde mit einerGeschwindigkeit von 200 μm/s.

4.1.10 Oberflachenmodifikation mit Peptiden

Die Oberflachenmodifikation wurde an unterschiedlichen Substraten vorgenommen.Ziel ist es Peptide stabil zu immobilisieren mit der Anforderung auf Erhaltung ih-rer Funktion wie der antimikrobielle Aktivitat oder der Vernetzungseigenschaften.Folgende Konzepte fanden hierfur Anwendung:

• Adsorption uber elektrochemische Wechselwirkung

• Adsorption uber Thiol auf Gold

• Adsorption uber Biotin auf einer mit Streptavidin funktionalen Oberflache

• Aufbau eines Partikel/Peptid-Hybrids.

Immobilisation von Peptiden aufgrund elektrostatischer Wechselwirkung

Die elektrostatische Immobilisierung von Peptiden wurde an zwei Systemen unter-sucht. Das eine System bestand aus dem Peptid [1-1] mit einem oberflachenaffinen

4.1. Methoden 49

Katechol in der Sequenz, das in eine TiO2-Partikeln Suspension eingebracht wurde.Das zweite System setzte sich aus dem antimikrobiellen Peptid Tet127, das mitdem Mineral Hydroxylapatit inkubiert wurde, zusammen. Letzteres wurde nach derInkubation gewaschen und anschliessend in Agar eingearbeitet. Dieser modifizierteAgar wurde einem antimikrobiellen Agar-Diffusionstest gegen E.coli unterzogen.Das andere System unter Verwendung von TiO2-Partikeln wurde im TEM unter-sucht, um Unterschiede hinsichtlich der Vernetzung ausmachen zu konnen.Im Zusammenhang mit den TEM-Aufnahmen wurde EnergiedispersiveRontgenspektroskopie (EDX) angewandt, um sicherzustellen, dass das verwen-dete Oxidationsmittel das Substrat nicht verandert.

Permanente Immobilisierung von Peptiden

Fur die Betrachtung einer permanenten Immobilisierung wurden unterBerucksichtigung der unterschiedlichen Peptide auch in diesem Kontext einvernetzendes und ein antimikrobielles System betrachtet.Hierfur wurde die Anbindung der Mefp1-Sequenz uber Thiol an Goldpartikeluntersucht, wahrend die Anbindung des antimikrobiellen Peptids uber eine stabileKomplexierung studiert wurde.Dafur wurde die Streptavidin-Biotin-Verbindungen mit einer hohen Komplexbil-dungskonstante (KB ≈ 1014mol−1) genutzt [143]. Diese Methode der Immobilisierungwurde auf bereits mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten angewendet. Dafurwurden die erforderlichen biotinylierten Peptide, Biotin-Tet127 und Biotin-Tet000,synthetisiert.Fur die Immobilisierung des vernetzenden Modelpeptids wurde ein System ausGold-Nanopartikeln und einem Mefp1 Peptid mit Cysteintag gewahlt. Da die Im-mobilisierung auf Goldnanopartikeln die Modifikation der Peptidtermini erfordert,wurde dies wahrend der Peptidsynthese berucksichtigt und entsprechende Spacerintegriert [144].Fur das Peptid wurde die Dekasequenz [1-1] mit einem enthaltenen Katechol gewahltund das Peptid [1-0] als Referenz ohne Katechol mitgefuhrt.

Partikel-Peptid-Hybrid

Das dritte Immobilisierungskonzept zielt auf eine umfangreichere Synthese ab. Darinwird das Konzept der Polymer-BiokonjugationXIII imitiert [6, 96].Eine Randbedingung fur den Funktionserhalt der immobilisierten Peptide ist dieVermeidung unkontrollierter Interaktion der Peptide mit der Oberflache, dies gilt imspeziellen fur Partikel. Um dies zu unterbinden, muß die Partikeloberflache zunachstpassiviert werden. Dies wird vorzugsweise durch Oberflachenreaktionen wie Silanisie-rungen vorgenommen [145, 146]. Silane konnen allgemein als Si(OR1)nR

24−n n = 1

bis 4 formuliert werden. Hydrolysierbare Silane werden in einer Alkoholyse zu Silano-len umgesetzt. Der Austausch der Alkoxygruppe findet bei Raumtemperatur durch

XIIIBiokonjugate sind hybride Materialien, die entweder eine Synergie der Vorzuge zweier Kompo-nenten bildet oder einen Nachteil, wie Toxizitat und Instabilitat, einer der beiden Komponentenausgleicht[96].


katalytische Mengen mineralischer Sauren oder Lewissauren oder unter dem kata-lytischen Einfluß einer starken Base statt. Unter Verwendung eines Silans, das ei-ne funktionelle Gruppe enthalt (R2), laßt sich dies gleichzeitig mit der Einfuhrungdefinierter funktioneller Gruppen auf der Partikeloberflache verbinden. An den ge-nerierten funktionellen Gruppen (R2) konnen nun direkt Peptide oder Peptide mitintegriertem Abstandshalter (polymere Spacer) immobilisiert werden [147, 148].Das Spacer/Peptid Konstrukt kann fur sich auch als ein Polymer-Biokonjugat be-trachtet werden. Das Peptid steuert die Funktionalitat bei und der Spacer erfullt denAnspruch einer Matrixkomponente. In Gestalt eines niedrig verzweigten bis linearenPolymers kann diesem Spacer eine potentielle Rolle zur Modulation der Materialei-genschaften zukommen.Die Wahl der Synthesestrategie mit Blick auf den Spacer ergab sich aus den Bedingun-gen der Kopplungsreaktion, als auch aus der Stabilitat des Peptids und des Substrats.Die Moglichkeiten der Umsetzung zwischen Partikel und Peptid, das basensensitiv ist,ist stark eingeschrankt fur Hydroxylapatitpartikel, die ihrerseits sauresensitiv sind.Unter Berucksichtigung dessen wurde das robustere TiO2-Peptid-System gewahlt, umdie Verfahrensalternativen wahrend der Syntheseentwicklung moglichst groß zu hal-ten. Als Peptid wurde das antimikrobielle Peptid Tet127 verwendet. Mit der darubereingebrachten Funktion konnte mit den bereits verifizierten antimikrobiellen Testme-thoden ein quantitativ messbarer Erfolg sowie die Stabilitat dieser Partikel-Peptid-Hybride kontrolliert werdenXIV.Die Umsetzung beinhaltet die Silanisierung von TiO2-Partikeln. Das gewahlte Silan(siehe Abb. 5.27) verfugt uber eine unpolare Kohlenstoffkette an dessen Ende eineBromfunktionalitat vorliegt. Dieses Brom wird durch Azid nucleophil substituiert. Imnachsten Schritt wird das Azid mit einem Alkin in einer 1,3-dipolaren Cycloaddition(Click Reaktion) zur Reaktion gebracht. Die komplementare funktionelle Gruppe, umdie angestrebte 1,3-dipolare Cycloaddition zu initiieren, stellt die Doppelbindung dar.Dieses wurde wahrend der Peptidsynthese am N-Terminus der fur dieses Experimenteingesetzten Peptide eingefuhrt.

Pufferlosungen/Medien

1 M Tris-HCl (pH 7,5) 121,14 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan in 800 mL ddWasser gelost, mit 65 mL HCl auf pH 7,5 eingestellt und auf 1 L aufgefullt;

0,05 M PBS (pH 7,4) 1 Paket P-3813 von Sigma in 100 mL dd Wasser;

NaHCO3 (pH 9,3) 450 mL einer 1 M NaHCO3 Losung (3,78 g in 450 mL) mit 50mL einer 1 M Na2CO3 Losung (0,53 g in 50 mL) auf 500 mL aufgefullt.

Minimalmedium 56,4 g M9 Minimal Salts, 5X in 1 L dd-Wasser autoklavieren (15min bei 121◦C);

LB-Medium 20 g LB-Medium in 1 L dd-Wasser autoklavieren (15 min bei 121◦C);

LB-Agar 35 g LB-Agar in 1 L dd-Wasser autoklavieren (15 min bei 121◦C).

XIVDer photokatalytische Effekt wurde im Experimentaufbau berucksichtigt und als Ursache derantimikrobiellen Aktivitat ausgeschlossen.

4.1. Methoden 51

Adsorption von Peptid [1-1] auf TiO2

Es wurde eine wassrige Partikelsuspension mit Peptiden inkubiert. Dazu wurde aus13 mg TiO2 Partikeln (flammenpyrolytisch hergestellte TiO2 P25 Partikel der FirmaDegussa) in dd-Wasser und 125 μL NaHCO3 (pH 9,3) eine Suspension hergestellt.Diese wurde 10 Sekunden auf einem Vortexer auf hochster Stufe durchmischt undim Anschluß 4 min bei 9000 rpm zentrifugiert. Der Uberstand wurde in ein frischesGefaß uberfuhrt. Die Partikel, die sich in diesem Uberstand befanden wurden durchAufnahme und Auslassen mithilfe einer Pipette durchmischt und schließlich zu glei-chen Teilen a 300 μL auf drei ’low-bind-Cups’XV verteilt. 10 μL der frisch bereite-ten Peptidlosungen in der Konzentration 10 mg/mL wurde jeweils in eine der dreiGefaße hinzupipettiert. Wieder wurde der Inhalt durch die Pipettenspitze durch-mischt. Schließlich wurde jeweils die Halfte der Peptid/TiO2 Mischung in ein frisches’low-bind-Cup’ uberfuhrt und zu jedem Gefaß zusatzlich 1 μL einer gesattigten Na-triumperiodat (NaIO4) Losung gegeben. Erneut wurde fur eine gute Durchmischunggesorgt. Die sechs Proben wurden zeitnah im TEM untersucht.

Adsorption von Peptid Tet127 auf Hydroxylapatit

Die Adsorption auf Hydroxylapatitpartikeln (HA) wurde unter Verwendung antimi-krobieller Peptide untersucht. Dazu wurden HA-Partikel eingesetzt, die nach Diaz etal. synthetisiert wurden [149] .In 50 mL einer 1 μM Peptidlosung wurden 80 mg Hydroxylapatitpartikel uber 12 hbei RT inkubiert. Anschließend wurde die Dispersion mit 10000 rpm zentrifugiert undein Aliquot von 500 μL des Uberstandes auf ’liquid broth’-Agarplatten ausgestrichen.Diese wurden 48 h bei RT ruhen gelassen. Die Partikel ihrerseits wurden nun nochdrei Mal gewaschen und schließlich 12 h bei 60◦C getrocknet.Nun wurden die Partikel in ’liquid broth’-Agar eingeruhrt, in Platten gegossen undweitere 12 h ruhen gelassen. Auf den Agarplatten mit Peptidlosung und jenen miteingeruhrten Partikeln, wurden je 100 μL einer 105 CFU/mL konzentrierten E.coliSuspension ausgestrichen und bei 37◦C inkubiert. Nach 48 h wurden die Koloniendokumentiert.Im Vorfeld der antimikrobiellen Tests gegen E.coli wurden Nitrocellulose beschich-tete Objektglaser (FAST-Slides) in 1 x 1 cm große Quadrate zurechtgeschnitten unddurch ringformiges Abkratzen der Nitrocellulose (NC) ein Spot mit einem Durch-messer von ca. 2 mm herausgearbeitet. Nun wurde eine Stammlosung der PeptideTet-127 und Tet-000 in Tris-HCl Puffer (pH 7.5) hergestellt (6,4 μmol/mL). Diesewurde jeweils 1:10 und 1:100 mit Tris-HCl-Puffer verdunnt und 0,3 μL davon auf dieNitrocellulose-Spots (2 mm) appliziert.Nachdem die Spots getrocknet waren, wurde jeweils 1 mL einer Bakteriensuspensionin Phosphatpuffer (PBS) auf die Proben pipettiert (Optische Dichte (OD670) = 0,05).Die Spots wurden bei 37◦C eine Stunde inkubiert. Danach wurde die Bakteriensus-pension abgenommen und jeweils mit dem ’Life/Dead-staining-kit’ XVI angefarbt.

XVspeziell beschichtete Gefaße, an deren Gefaßwand weniger Biomolekule adsorbierenXVIMethode zur Darstellung und Unterscheidung vitaler von leblosen Bakterien. Durch Einfarbenmit zwei Farbstoffkomponenten, die von den Bakterien eingelagert werden, werden diese in der Fluo-reszenz sichtbar. Lebende Bakterien erscheinen, von dem Farbstoff FITC SYTO9 angefarbt, unterFluoreszenz grun. Die Zellmembran toter Bakterien wird nach dem Zelltod permeabel fur den Farb-


Nach ca. zehn Minuten unter Lichtausschluß (RT) wurden die Nitrocellulosebereicheim Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Fur die mit Peptid Tet127 behandelte Pro-be wurden zusatzlich REM-Aufnahmen des Spots und eines Bereiches außerhalb desRings angefertigt.

Immobilisierung durch Bildung eines Streptavidin-Biotin4-Komplexes

Diese Methode der Immobilisierung durch Komplexierung ließ sich auf bereits mitStreptavidin beschichtete Mikrotiterplatten mit biotinylierten Peptiden anwenden.Die erforderlichen biotinylierten Peptide, Biotin-Tet127 und Biotin-Tet000, wurdenentsprechend synthetisiert und daraus Losungen in Tris-HCl Puffer (pH = 7,5) an-gesetzt (6,4 μmol/mL).Von diesen Losungen wurden jeweils 50 μL in eine Vertiefung mit Streptavidin be-schichteter Zellkulturplatten eingelassen. Dies wurde in Dreifachbestimmung durch-gefuhrt. Nach 12 Stunden Inkubationszeit bei 4◦C wurde die Peptidlosung abgenom-men und die Vertiefungen mit Hilfe einer Mehrkanalpipette zehnmal mit je 60 μLTris-HCl Puffer gespult.Im Anschluß wurden 50 μL einer E.coli -Suspension (OD670 = 0,05 in Minimalmedi-um) auf die gereinigten Vertiefungen uberimpft.Die Zellkulturplatte wurde 4 h bei 37◦C inkubiert. Danach wurden jeweils 35 μLder Bakteriensuspension (interne Referenzwachstumskurve in Achtfachbestimmng)aus den einzelnen Vertiefungen in eine sterile unbeschichtete 96er Mikrotiterplatteubertragen und mit LB-Medium auf 200 μL aufgefullt. Erganzend dazu wurden andieser Stelle 200 μL LB-Medium als Sterilitatsprufung sowie 35 μL Minimalmedi-um + 165 μL LB-Medium als Leerwert jeweils in Dreifachbestimmungen in freienVertiefungen mitgefuhrt. Die Optische Dichte (OD) wurde wahrend der Inkubationim Multimodereader (siehe Abschnitt 4.1.6 auf S. 41) uber einen Zeitraum von ca.24 h verfolgt. Nach Beendigung der Messung wurde der Leerwert von den ubrigenMessungen abgezogen und eine Zeit-Proliferations-Kurve erstellt.

Modifikation von kolloidalem Gold

Mithilfe eines Cysteintags wurde die kovalente Ankopplung des Peptids [1-1] an Golduntersucht. Weiterhin wurden neben der direkten Referenz (Cys-1-0) noch ein Peptidohne Cys-Tag, dafur mit drei Wiederholungseinheiten (3-3), sowie ein Histonsequenz-ausschnitt mit hohem Agglomerationspotential und Cys-Tag (’Histonfragment’), zumVergleich mitgefuhrt. Die Peptide wurden fur die Versuche mit kolloidalem Gold in-klusive gespacerter Termini und eines Cys-Tags (Cys-1-1), wie unter Abschnitt 4.1.1auf S. 33 beschrieben, synthetisiert. Die Sequenz dieser Peptide lautetXVII:

Peptid 3-3 ............ [AKPSYZ2TYK]3

Histonfragment ... C(A)4PATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKA.

Es wurden Losungen mit 5 mg/mL in dd-Wasser verwendet.

stoff Propidiumiodid. Dieser reagiert im Zellinneren mit der DNA und farbt diese rot.XVIIY = 3,4-Dihydroyphenylalanin, Z = Hydroxyprolin

4.1. Methoden 53

Weiterhin wurde eine mit Citratlosung stabilisierte Goldnanopartikelsuspension(≈ 0,01 %-ige Suspension, Partikeldurchmesser ≈ 20 nm von Sigma Adrich) miteinem NaHCO3-Puffer (pH = 9,3) auf pH 7 eingestellt.Die Goldnanopartikel-Suspension wurde nun in Portionen a 300 μL auf 5 ’low-bind-cups’ verteilt. Dazu wurden jeweils 10 μL der Peptidlosung hinzupipettiert. Die Par-tikel/Peptidsuspension wurde durch Aufsaugen und Ablassen uber die Pipettenspitzevorsichtig gemischt und anschließend die Halfte auf ein weiteres Gefaße uberimpft,um zwei Suspensionen derselben Konzentration und gleichen Volumens zu erhalten.Je eine der Partikel/Peptidsuspensionen wurde nun mit 1 μL einer gesattigten NaIO4-Losung versetzt und durchmischt.Diese Proben wurden zeitnah im TEM untersuchtXVIII, um Unterschiede im Ver-netzungsmuster auf den Einfluß des eingesetzten Peptides zuruckfuhren zu konnen.Diese Methode soll der indirekten Untersuchung des Funktionserhalts des vernetzendwirkenden Peptids dienen.In einem zweiten Nachweisverfahren zum Funktionserhalt des Peptids wurden diebereits verwendeten Goldnanopartikel und die Peptide Cys-1-0 und 3-3, durch dasEnzym Laccase zur Oxidation gebracht, um an den Unterschieden in der Kinetik dieVernetzungseigenschaften zu vergleichen. In beiden Fallen handelt es sich um Lacca-sesubstrate, die infolge der enzymatischen Oxidation vernetzend reagieren sollten.Dazu wurde zunachst eine frische Laccaselosung hergestellt. In 3 mL Acetatpuffer(pH = 4,65) wurden 100 mg Trameters Versicolor Laccase gelost. Die Losung wurdeauf 100 mL mit dd-Wasser aufgefullt und 60 min bei 30◦C geruhrt. Danach wurdedie Losung bei 4◦C gelagert.Nun wurde fur jedes Peptid eine Stammlosung der Konzentration 5 mg/mL(pH = 4,65) angesetzt. Diesmal wurde die Peptidlosung (100 μL) zusammen mit derEnzymlosung (100 μL) vorgelegt und zu dieser 100 μL Goldnanopartikel-Suspension(≈ 0,01 %-ig) zugegeben. In den mitgefuhrten Referenzen wurden die entspre-chenden Volumendefizite, die infolge der Aussparung der Peptid-, Enzym- bzw.Goldnanopartikel-Suspension auftraten durch dd-Wasser ersetzt. Von den Probenwurde vor Zugabe der Goldnanopartikel-Suspension, direkt im Anschluß und 2 Stun-den nachdem die Reaktionsgefaße bei 43◦C geschuttelt wurden photographische Auf-nahmen gemacht.

Synthese 11-Bromundecylsilan-TiO2 (S2)

Fur die Synthese von 11-Bromundecylsilan-TiO2 (S2) wurde 1 g TiO2 Parti-kel (TiO2 P25 Partikel, BET = 50 ± 15 m2/g, Degussa) 8 h im Hochvakuum(10−3 mbar) getrocknet. Unter Argonatmosphare wurde daraus eine Suspensionin 200 mL trockenem Toluol gebildet und 30 min mit Ultraschall behandelt. Nunwurde der Kolben unter stetigem Ruhren im Eisbad auf 0◦ C gekuhlt. 7 mL 11-Bromundecyltrimethoxysilan (ρ = 1,11 g/mL, Flachenbedeckung =390 m2/g) wur-den mit 150 mL trockenem Toluol verdunnt und langsam uber einen Tropftrichterzur Partikelsuspension zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wurde der Tropf-trichter gegen einen Kuhler und das Eisbad gegen ein Olbad ausgetauscht, um denKolbeninhalt 10 h bei 80◦C weiterzuruhren.

XVIIIDie Proben wurden zwischenzeitlich bei 4◦C gelagert bevor sie auf das TEM-Gitter gespottetund darauf getrocknet wurden, um sie danach einzuschleusen.


Das Losemittel wurde unter Vakuum abdestilliert und die Partikel dreimal mit je50 mL Toluol und weitere dreimal mit Isopropanol zunachst gevortext und im An-schluß zentrifugiert (3000 rpm), um die Partikel zu waschen. Schließlich wurdendie gereinigten Partikel (S2) getrocknet und einer thermogravimetrischen, sowie IR-spektroskopischen Analyse unterzogen.Partikel-O-Si(CH2)11Br (bezeichnen silanisierte TiO2-Partikel)Ausbeute: 960 mg (0,025 mmol Silan/gXIX)IR: 600-500 cm−1 (C-Br); 2921 cm−1, 2853 cm−1, 1467 cm−1 (C-H Aliphat)TGA: 5,79 m% Organische Substanz

Synthese 11-Azidoundecylsilan-TiO2 (S3)

950 mg der getrockneten Partikel (S2) wurden in 100 mL einer 2%-igen NaN3-Losungunter Argonatmosphare in DMF uber 12 h bei 80◦C geruhrt. Im Anschluß wurdedie Losung abdekantiert und die Partikel sechs Mal mit dd-Wasser gewaschen. Diegewaschenen Partikel wurden ein letztes Mal zentrifugiert und danach durch Gefrier-trocknung von Wasserspuren befreit.Die Partikel (S3) wurden anhand von ATR-und TGA-Spektren charakterisiert:Partikel-O-Si(CH2)11N3

Ausbeute: 850 mg (0,023 mmol/g)XX IR: 2095 cm−1, 2180-2170 cm−1 (Azid);2921 cm−1, 2853 cm−1, 1467 cm−1 (C-H Aliphat) TGA: 4,35 m% Organische Sub-stanz

Synthese TiO2-Click (S5a-c)

410 mg der trockenen Partikel (S3) wurden in drei Kolben aufgeteilt zu zwei Por-tionen a 200 mg (S5a) und (S5b) und einer Portion a 10 mg (S5c). Nun wurden diePartikel in jeweils 5 mL bzw. 1 mL eines tert-Butanol/Wasser-Gemisches (4:1) sus-pendiert. Speziell fur diese Reaktion wurde ein weiteres Derivat des antimikrobiellenPeptids Tet127, wie auch fur das Referenzpeptid Tet000 mit einem terminalen Alkinsynthetisiert (S4a) und (S4b). Dies war erforderlich, da es sich fur die 2,3-dipolareCycloaddition nach Huisgen um eine Kupfer(I) katalysierte Reaktion zwischen einemAzid und einer Mehrfachbindung handelt. Die beiden großeren Ansatze wurden mitden Peptiden S4a (85 mg, 0,07 mmol) und S4b (88 mg, 0,07 mmol) in einer Clickre-aktion umgesetzt. Der dritte Ansatz wurde in Referenz mit 4-Pentinsaure (1 mg, 0,01mmol) durchgefuhrt mitgefuhrt. Nachdem die beiden Reaktanden (S3) und das Alkinsuspendiert bzw. gelost vorlagen, wurden jedem Kolben 20 mg Natriumascorbat und1-2 mg Vitriol zugegeben, um die Reaktion zu starten.Der Reaktionsverlauf wurde anhand von ATR-Monitoring verfolgt. Nach drei Ta-gen wurde die Referenzreaktion (S5c) gegen Dichlormethan extrahiert, drei Mal mitWasser gewaschen und lyophilisiert und eine TGA angefertigt. Die beiden Reaktionen(S5a) und (S5b) wurden nach drei weiteren Tagen identisch aufgearbeitet.Schließlich wurden die beiden Partikel/Peptidhybride, (S5a) und (S5b), auf ihr

XIXAbgeleitet aus den TGA Ergebnissen unter Berucksichtigung der Molmasse des organischenRestes des Silans (M = 234 g/mol).

XXAbgeleitet aus den TGA Ergebnissen unter Berucksichtigung der Molmasse des organischenRestes des Silans (M = 193 g/mol).

4.1. Methoden 55

antimikrobielles Potential hin untersucht. Der Ablauf dieses Tests fur die Parti-kel/Peptidhybride ist in Abb. 4.7 veranschaulicht. Zunachst wurden jeweils 20 mg

1:100 supernatant/mediumspread on LB-Agar and

fill in 96-well, leave it 24 h, 37°C

O SiO

O

NN

N

OR

O SiO

O

Br

O SiO

O

N-

N+

N

TiO Click

Tet-0002 TiO Click

Tet-1272

20 mg TiO ClickTet

in 1 mL Minimalmedium+ 10 CFUt = 24 h; 37°C

2

Incubation

3E.Coli

Zentrifugieren

Recycling

SynthesePartikel-Peptid-Hybrid

Abbildung 4.7: Verlauf der antimikrobiellen Untersuchung der Partikel/Peptidhybride, beginnendmit der Sysnthese, uber die Inkubation der Partikel in Minimalmedium, die Trennung des Mediumsmit den Bakterien von den Partikeln durch Zentrifugation, Abnahme der Bakteriensuspension undAusplattieren dieser, Recycling der Partikel und wiederholte Testung auf antimikrobielle Aktivitat.

der Partikel (S5a) und (S5b), sowie 20 mg der unmodifizierten TiO2-Partikel in 1 mLMinimalmedium suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 103 CFU E.coli gegeben,gut vermischt und 24 h, unter stetigem Schutteln, bei 37◦C inkubiert.Die Partikel wurden nun zentrifugiert und der Uberstand von den Partikeln getrennt.Die Partikel wurden im Anschluß mit 70%-igem Isopropanol uber eine Dauer von 48 hunter schutteln desinfiziert, um sie fur einen weiteren Lauf zu recyclen. In diesem soll-te die Bestandigkeit der eingebrachten Funktion auf den Partikeln getestet werden.Der Uberstand wurde indessen 1:100 mit LB-Medium verdunnt und 100 μL davon aufLB-Agar ausplattiert. Nach 24 h Inkubation bei 37 ◦C wurden die Kolonien gezahltund Aufnahmen der einzelnen Petrischalen angefertigt.Weiterhin wurden zur Kontrolle im Multimodereader die den Petrischalen entspre-chenden Wachstumskurven in Sechsfach-Bestimmung erfaßt.


4.2 Chemikalien und Materialien

ABCR Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS)(Karlsruhe, Deutschland) Undecabromotrimethoxysilan

DEGUSSA TiO2 P25 Partikel,flammenpyrolytisch hergestelltBET 50±15 m2/gAerosil 90, pyrogene Kieselsaure

Eppendorf Reaktionsgefaße (0,5/1,5/2 mL Cups)(Hamburg, Deutschland) Mehr-/ Einkanalpipetten

Pipettenspitzen

IRIS Biotech Nα-Fmoc-geschutzte L-Aminosauren(Marktredwitz, Deutschland) mit folgenden Seitenkettenschutzgruppen:

-2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzo-furan-5-sulfonyl (Pbf) fur Arg-Trityl fur Gln, Asn-tert-Butyloxycarbonyl (Boc) fur His, Lys und Trp-tert-Butyl fur Asp, Cys,Glu, Hyp, Phe, Ser, Thr, Tyr2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU)2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetra-methyluroniumtetrafluoroborat (HOBt)EDC

JCM MAXTEX Schwingquartz, AT-geschnitten(Frankfurt-M, Deutschland) 5 MHz, Ti beschichtet, poliert

MAXTEX Schwingquartz, AT-geschnitten5 MHz, Ti/Au/SiO2 beschichtet, poliert

Merck Fmoc-L-DOPA-AcetonoidHistidin

Pechiney Parafilm(Chicago IL, USA)

PepChem Fmoc-L-Lys(Boc)-TCP-Polystyrolharz(Substgrd.0,54 mmol/g)Fmoc-Ala-TCP-Polystyrolharz(Substgrd.0,54 mmol/g)

(Tubingen, Deutschland) Rink-Harz (Substgrd.0,75 mmol/g)

Th.Geyer N-Methylpyrrolidon (NMP)(Hamburg, Deutschland) Acetonitril (ACN)

Thermo Fisher Scientific Nunc Immobilizer Streptavidin F96(Schwerte, Deutschland) transparente Zellkulturplatten

TPP Mikrotiter/Zellkulturplatten(Tasadingen,Deutschland) Petrischalen, steril (15 x 100 mm)

Carl Roth tert-Butylmethylether (MTBE)(Karlsruhe, Deutschland) Zentrifugenrohrchen

LB MediumLB Agar

4.2. Chemikalien und Materialien 57

VWR International Objekttrager, L/B/H 76/26/1(Hannover, Deutschland)

Whatmann FAST-Slides Nitrocellulose beschichtet(Dassel, Deutschland)

Sigma-Aldrich 3-Diethoxyphosphorylpropionsaureethylester(Steinheim, Deutschland) α-Cyano-4-Hydroxyzimtsaure

Acetonitril, trockenAnthracentriolCe(SO4)2, (NH4)6Mo7O24· 4H2O, H2SO4, NaHCO3

DeutereochloroformDicarbonsaure-Polyethylenglycol (PEG600DCA)DichlormethanEthanolEssigsaureFluorescein-5-IsothiocyanatFmoc-(Tmob)Gly-OHHCl (37 %)IsopropanolLB-BrothMalonsaurediesterMES-Natriumsalz(pH = 5,5-6,7)NatriumNatriumhydroxidN,N-Diisopropylethylamin (DIPEA)Phosphate Bufferes Saline (PBS) P-3813PiperidinePolyethylenglykol (M ≈ 600 g/mol)SalpetersaureTrifluoressigsaure (TFA)TriisopropylsilanTris(hydroxymethyl)aminomethan

SilChem Siliziumwafer 4P02/90(76,2 mm, Orientierung 100, Typ n/Phosphor)

Paul Marienfeld Superior Kalk-Natron-GlassubstrateLaboratory Glassware

Firma Rocholl TitansubstrateLegierung TiAl6V4Zuschnitt auf die Maße 15 x 10 x 1,5 mm

TPP Zellkultur Testplatten

Kapitel5Ergebnisse und Diskussion

In diesem Kapitel werden die Ergebnissen der zwei Abschnitte, in die sich diese Ar-beit unterteilt vorgestellt und diskutiert. Jeder Abschnitt wurde mit der Zielstellungkonzipiert einen konkreten Sachverhalt, wie im ersten Abschnitt die Wechselwirkungvon ’DOPA’-haltigen Peptiden mit Oberflachen (Abschnitt 5.1) und im zweiten Ab-schnitt die Oberflachenfunktionalisierung mit Peptiden (Abschnitt 5.2), durch dieKombination einzelner Experimente zu untersuchen.

5.1 Untersuchung der Wechselwirkung von Peptidenmit Oberflachen durch Sequenzvariation

Die Dekasequenz des Mefp1 Proteins wurde als zentrale Struktur vor dem Hinter-grund der Untersuchung zur Adsorption von Peptiden variiert. In der Muschel erfolgtdie Modifikation des Tyrosins zu Katechol (DOPA) durch das Enzym Tyrosinase, wel-ches bevorzugt das Tyrosin in Position neun oxidiert, aber auch teilweise das Tyrosinin Position funf [150]. Die untersuchten Peptide, die sich von der originaren Dekase-quenz ableiten basieren u.a. auf dieser zufalligen Variation des naturlichen Proteins.Diese Peptide unterscheiden sich untereinander in der Menge an Katechol innerhalbder Sequenz (n). Die zweite Variation greift die Unterschiede in der Sequenzlange derByssusproteine auf (x), wie sie die grenzflachenaktiven Proteine Mefp3 und Mefp5gegenuber den Matrixproteinen Mefp2 und Mefp4 aufweisen (siehe Abschnitt 2.1).Die Modelpeptide stellen eine Auswahl der moglichen Kombinationen dieser [x-n]Variationen dar (siehe Abschnitt 3.2 auf S. 31). Die [x-n] Peptide wurden auf ver-schiedenen Oberflachen durch QCM sowie XPS- und IR-Spektroskopie im Hinblickauf ihre Adsorption untersucht. Im Anschluß wurde studiert, inwieweit dies mit ihrenKlebeigenschaften korreliert.

5.1.1 Betrachtung der Grenzflachensituation auf SiO2 und Titan inAdsorbatlosung

In den folgenden Absatzen werden die Annahmen fur das in diesem Abschnitt be-trachtete System aus Substrat und Adsorbatlosung formuliert. Diese stellen die

59

60 Kapitel 5. Ergebnisse und Diskussion

Grundlage fur die Ergebnisdiskussion und das Resumee der Adsorptionsuntersuchun-gen und Klebversuche dar.Als Konsequenz der Exposition einer Metalloberflache mit Wasser, wird einevollstandig hydroxylierte Oberflache angenommen [114]. Im Folgenden wird daheranstelle von Titan von TiO2 Substraten gesprochen. Ungeachtet der amorphen Sub-strate, die eingesetzt wurden und der daraus resultierenden undefinierten Grenz-flachenstruktur, sollen idealisierte Modelle der Oberflachen zur Erklarung des Ad-sorptionsverhaltens (siehe dazu auch S. 23 ff.) hinzugezogen werden.

Dichte reaktiver Gruppen an den Oberflachen

In Abhangigkeit von der Substratgeometrie, Kristallstruktur und der Schnittebeneliegen fur ’TiO2’ ca. zwei aktive Zentren pro nm2 vor [124]. Fur SiO2 belaufen sichdie potentiellen Reaktionszentren auf vier bis acht, wobei fur amorphes SiO2 generell5 sites/nm2 postuliert werden [125].In jedem Fall liegen deutlich weniger aktive Zentren auf ’TiO2’ verglichen mit SiO2

vor [151].

Si

OH

Si Si

OH OH

O

H

SiO

O

Si

O

Si

O

OSi

O

OH

O

OTi

O

O

OTi

O

O

OH

H

reaktives Zentrum

Abbildung 5.1: Schema zur Situation auf der Substratoberflache.

Der Isoelektrische Punkt des Substrates

Neben der”Sites“-Dichte (Dichte reaktiver Gruppen an den Oberflachen) eroffnet

der isoelektrische Punkt einen weiteren quantifizierbaren Ansatz, um die Situationauf der Substratoberflache zu charakterisieren.Fur SiO2 handelt es sich um ein saures anorganisches Polymer mit einem isoelektri-schen Punkt (IP) von 1-2 [55, 126]. Das Saureanhydrid SiO2 ist, aufgrund der zu Si-O-Si kondensierten Silanolgruppen (Si-OH), sehr reaktionstrage aufgrund der Alterungvon amorphen SiO2. Frisch hergestelltes SiO2 wird daher von Laugen mehr angegrif-fen, als das “gealterte’ Anhydrid [122].’TiO2’ demgegenuber zeigt einen zu hoherenpH verschobenen isoelektrischen Punkt von 5-6. In den oberflachenanalytischen Expe-rimenten dieser Arbeit wurde dd-Wasser mit einem pH von 5,6 als Solvenz eingesetzt.Fur SiO2 muß daher von einer Oberflache mit einer leichten negativen Ober-flachenladung ausgegangen werden [152]. Dieses Argument wird gestutzt durch diepKa-Werte der vorhanden Silanole an der SiO2/Wasser-Grenzflachen (4,9 und 8,5[153]). Durch den zu hoherem pH verschobenen isoelektrischen Punkt von ’TiO2’


ist in diesem Fall von einer nahezu neutralen Oberflache auszugehen (pKa-Wert derTiOH-Gruppe ist 10 [154]).Die um ca. drei bis vier Zehnerpotenzen hohere Saurestarke der SiO2-Oberflachegegenuber ’TiO2’, sollte daher Auswirkungen auf die Adsorption [155] haben. Siedeterminiert sowohl die Anzahl und Ausdehnung von Adsorptionslayern wie Wasser-molekullagen [156].Durch die Definition der Adsorptionsreaktion als eine Verdrangung der an der Ober-flache befindlichen Wassermolekule durch das Adsorbat [52], laßt sich fur ’TiO2’ dieAnnahme formulieren, dass die Uberwindung einer kleineren Energiebarriere notwen-dig ist, als es fur SiO2 der Fall ist.

Betrachtung der Substratgrenzflache in Losung

Die Betrachtung der unmittelbaren Verhaltnisse an der Substratoberflache zeigt denEinfluß des Substrates auf die darauf folgenden Wassermolekullagen. Fur ’TiO2’wurde eine stark gebundene Wasserschicht (F ≈ -9 kcal/mol, 0,23 nm Distanz’TiO2’/Wasser) berechnet, auf die weitere drei Lagen strukturiert orientierter Was-sermolekule (F < −1 kcal/mol: 0,36; 0,48 und 0,60 nm Distanz ’TiO2’/Wasser) folgen[156].’TiO2’ weist einen amphoteren Charakter auf und verfugt sowohl uber basischeuberbruckende Sauerstoffe (Ti-O-Ti) als auch saure Ti(IV)-Zentren an der Oberflache[128]. Wasser als gleichermaßen amphoterer Ligand kann als Lewisbase auftreten undam sauren Ti(IV)-Zentrum adsorbieren, um daraufhin in eine Hydroxylgruppe undein Proton zu dissoziieren. Dieses Proton kann entweder an ein benachbartes Hydro-xyl oder an einen zweifach verbruckten Sauerstoff binden [119].Die verbruckten Sauerstoffe (Ti-O-Ti) treten innerhalb des TiO2-Polymers als Lewis-base auf . Am Beispiel von Rutil ergibt sich damit fur das dissoziierte Proton einebevorzugte Wechselwirkung mit Ti-O-Ti, wie in Abb. 5.2 durch den dickeren Pfeildargestellt ist. Die Moglichkeit alternativ ein benachbartes Hydroxyl zu protonieren,kann daher vernachlassigt werden (Abb. 5.2 dunner Pfeil). Aus diesem Grund ori-entieren sich die Hydroxyle entlang der TiO2-Achse, um eine optimale Wasserstoff-bruckenbildung mit den benachbarten Hydroxylgruppen zu ermoglichen (paralleleAnordnung) und so die Wasserstoffbruckenbindungen innerhalb der Grenzphase zumaximieren [128].

TiO O

OO

OH

H+

H

Abbildung 5.2: TiO2-Einheitszelle mit den moglichen Lewisbasen (Ti-O-Ti und Ti-OH) und einemProton auf der Oberflache; die Pfeile implizieren Bevorzugungen in der Anordnung des Protons;weiterhin dargestellt sind Unterschiede in den Bindungslangen: die Hydroxylgruppe liegt starkergebunden vor, damit ist die Ti-OH Bindungslange kurzer, als die ubrigen Ti-O Bindungen; in An-lehnung an Fahmi et al. [128].


In der Literatur wurde gezeigt, dass eine dissoziative Adsorption (H+ und OH−) wiein Abb. 5.2 beschrieben, gegenuber einer molekularen Adsorption (H2O) vorteilhaf-ter ist, da es innerhalb des Hydratationsprozesses energetisch gunstiger ist moglichstviele dieser Lewisbasen auf Seiten des Substrats zu involvieren [157].Diese Argumentation uber die Wasseradsorption sollte sich auch auf andere Substratewie das Saureanhydrid SiO2 ubertragen lassen.Fur SiO2 werden langere Bindungen im Vergleich zu TiO2 beschrieben (SiO-Abstand≈ 0,165-0,168 nm; TiO-Abstand ≈ 0,162 nm [122]), d.h. die Uberlappung der ’Mo-lekulorbitale’ ist fur die Si-O Bindung kleiner als fur die Ti-O Bindung, was in einemhoheren ionischen Charakter der Si-O Bindung resultiert. Wahrend das bisher dis-kutierte kristalline Siliziumdioxid nicht zur Komplexbildung tendiert und auch nichtals Lewissaure agiert [115, 125], verandert sich die Situation fur amorphes und ge-quollenes SiO2 [122].

Betrachtung der Peptidadsorption auf einem Substrat

Nach der Diskussion der Situation auf den Substratoberflachen folgt nun die Betrach-tung der Peptide, die ihrerseits Hydroxylgruppen exponieren und in diesem Systemals Adsorbat auftreten.Die Betrachtung des Systems Substrat-Peptid erfordert, wie schon fur das Substrat ei-ne Einschatzung der Ausgangssituation von Seiten des Peptids. Die folgende Betrach-tung stutzt sich auf Ergebnisse, die im Rahmen des DFG-Projekt ’Peptid basierteNanohybride als Adhasivsystem fur medizinische Anwendungen’ (ForderkennzeichenHA 2420/8-1, LO 1493/2-1, MU 1803/5-1) erarbeitet wurden und hier basierend aufdem Abschlussbericht reproduziert werden [158, 159].Die Hydroxylgruppen der einzelnen Aminosauren liegen exponiert vor, wie in Abb.5.3 (rot eingefarbt) stellvertretend am Beispiel des Dekapeptids [1-1] gezeigt ist (No-menklatur siehe Abschnitt 3.2 auf S. 31). Dargestellt ist ein atomistisches Model deraus Konformerensampling fur die DihedralwinkelI Φ9 (braune Pfeile) und Ψ5 (blauePfeile) resultierenden vier haufigsten Konformere [158]. Weiterhin liegen die [x-n]Peptide in Losung fur einen pH < IP, aufgrund der zwei ([1-n] Peptide) oder vier([2-n] Peptide) enthaltenen Lysine (IP ca. 10,5) positiv geladen vor.

Der Isoelektrische Punkt des Adsorbates

Fur die Situation, dass der pH der Losung dem isoelektrischen Punkt des Adsorba-tes, hier des Peptids, entspricht, laufen die repulsiven Krafte zwischen den Peptidenin ein Minimum. Keine Ionen und Wassermolekule konkurrieren um Ladungszentrenam Peptid. Daraus folgt eine verstarkte Peptidagglomeration. Dies außert sich nachAussagen von Rabe et al. letztlich in einer verbesserten Adsorption durch die Zunah-me der Packungsdichte auf der Substratoberflache [52, 55].Wie bei der Diskussion des isoelektrischen Punktes der Subtrate ausgefuhrt, wurdein den Experimenten dieser Arbeit dd-Wasser mit einem pH von 5,6 als Solvenz ein-gesetzt. In Verbindung mit dem isoelektrischen Punkt der verwendeten Peptide vonca. 9 folgt daraus eine positive Nettoladung fur die Peptide. Die Minimierung der

IDiese Winkel traten in den vorhergegangenen molekulardynamische Berechnungen am haufigstenauf, Molekulardynamik bei 300 K fur 10 ns (10.000.000 Schritte bei Zeitschritt von 1 fs).


��= -71.0

= 78.2

= 62.4 = 78.2��

= -71.0 = 125.5

= 62.4 = 125.5

��

��

Überlagerung der4 Konformere

��

Abbildung 5.3: Atomistisches Model, der aus Konformerensampling, fur die Dihedralwinkel Φ9

(braune Pfeile) und Ψ5 (blaue Pfeile) resultierenden vier haufigsten Konformere (uberlagerte Dar-stellung mittig), des [1-1] Dekapeptids; die DOPA-Gruppe (grun gestrichelte Ellipse) ist nach außenexponiert.

repulsiven Wechselwirkungen zwischen den Peptiden durch Wahl des entsprechendenpH-Wertes des Losemittels war fur die [x-n] Peptide nicht moglich, da es in diesemFall zur Vernetzung durch Reaktionen des Katechols gekommen ware. Damit warekeine eindeutige Unterscheidung der Effekte, die auf den pH-Wert Anstieg, bezogenauf die Deprotonierung von Lysin, zuruckgefuhrt werden und dem Effekt, der durchdie mit dem pH-Wert Anstieg beschleunigt ablaufende Oxidation des Katechols ver-bunden ist, moglich gewesen.Aus der Betrachtung der isoelektischen Punkte der Substrate und Peptide ergibt sichdemnach, dass Oberflache und Peptid entgegengesetzte Ladungen tragen. Dies solltesich innerhalb der kinetischen Betrachtung auch in einer beschleunigteren Adsorpti-ons niederschlagen [52], speziell fur SiO2 im Vergleich zu TiO2. Fur die untersuchtenSubstrate mit unterschiedlichen IPs wurde dieser Zusammenhang uberpruft. Dem-nach sollte sich mehr Peptid pro Flache durch eine hohere Massendifferenz (QCM)und in intensiveren Stickstoffsignalen (XPS) und Amidbanden (IR) nachweisen las-sen.

Betrachtung der Adsorptionsreaktion Substrat-DOPA

Auf die Erorterungen zur hydratisierten Substratoberflache und der Peptide inLosung laßt sich durch die Betrachtung des Systems Substrat-Katechol weiter auf-bauen. Diesem geht zunachst eine Einschatzung der Katechol-Gruppe, im Speziellender DOPA-Gruppe im Vergleich mit Wasser voraus.DOPA selbst verfugt uber zwei vicinalstandige Hydroxylgruppen. Der pKs des me-tastandigen Hydroxyls belauft sich auf 8,7 und des parastandigen auf 12,5 [36]. Unterden gewahlten Bedingungen liegt DOPA in dd-Wasser (pH 5,6) daher neutral vor.


Fur das DOPA ahnliche Katechol verhalt es sich analog (pKs1 = 9,2; pKs2 = 13,0[119]). Die Folge fur das System Substrat-DOPA wird letztlich durch die Betrachtungder Dissoziations- und der Bindungsenergien deutlich.In Tab. 5.1 sind einige Dissoziationsenergien und Bindungslangen fur Wasser, Ka-techol, DOPA und Methanol auf SiO2 und ’TiO2’, die der Literatur entstammen,zusammengestelltII. Der Vergleich der Dissoziationsenergie fur auf SiO2 adsorbiertesWasser (-11 kcal/mol) mit auf ’TiO2’ adsorbiertem Wasser (-9 kcal/mol) bestatigtdie Erwartungen zu ’harter’ gebundenem Wasser auf SiO2.Ein auf ’TiO2’ adsorbiertes DOPA weist eine Dissoziationsenergie von -22,2 kcal/molauf (Rastertunnelmikroskopie (RTM) [48]). Der Vergleich mit den SiO2-O(DOPA)zeigt kleinere Dissoziationsenergien (- 32,7 kcal/mol; 14 kcal/mol excl. Dispersions-wechselwirkungen), die einer starkeren Bindung zum Substrat gleichkommt [125].Damit ist die Bindungsenergie fur adsorbiertes DOPA auf SiO2 großer als fur ein aufTitan gebundenes DOPA und auch starker als fur Wasser auf SiO2.Dies bedeutet, dass bereits adsorbiertes Katechol, auf einer nachtraglich hydratisier-ten Oberflache keiner Verdrangung durch Wassermolekule unterliegt. Die Reaktioneines gelosten Katechols, das zunachst adsorbiertes Wasser verdrangen muß, wurdein diesem Zusammenhang nicht untersucht [125].Neben den Bindungsenergien zwischen DOPA und Wasser und mit den Substratensollte weiterhin der Effekt der Ladungspolarisation berucksichtigt werden.

Tabelle 5.1: Literaturquellen zu Adsorptionsenergien fur Wasser und Catechol auf Cristobalit undfur Wasser, DOPA und Methanol auf Titan; a) [125], 1) Es wird unterschieden in isolierte Silanole, in(111) beta-Cristobalit, und geminale Silanole, in (001) alpha-Cristobalit. Entsprechend unterscheidensich die Adsorptionsenergien 11,1 kcal/mol (111), 12,2 kcal/mol (001) excl. Dispersionswechselwir-kungen (disp. WW) und im Vakuum. Fur eine hydratisierte Oberflache bilden die Wassermolekulekeine drei Wasserstoffbruckenbindung mehr aus wie im Vakuum sondern nur eine und die Bindungs-energie drittelt sich zu 3,8 kcal/mol [125], a) isolierte Silanole (111), incl. disp. WW (excl. disp. WW11,7 kcal/mol), a) isolierte Silanole (111), incl. disp. WW (excl. disp. WW 11,1 kcal/mol), b) [156], c)kovalent gebundenes Bidentat [160, 161], c) Monodentat, c) molekular adsorbiert, nicht dissoziierteBindung, d) [48], e) bzw. 0,21 [48, 128], zum Vgl. die π − π-WW der Phenylringe belaufen sich auf2,7 kcal/mol [162] f) [128].

Substrat(s)

SiO2 TiO2 SiO2 TiO2 TiO2 TiO2

Adsorbat(a)

H2O H2O Catechol Catechol DOPA Methanol

Eads -11,1 a)1) -9 b) -32,7 a) -25- -30 c) -22,2 d) -25- -30 b)

[kcal/mol] -15,2 a) -7- -21 c)

-22 c)

Abstands-a [nm]

0,19 a) 0,21 f) 0,22 e)

IIDie Unterschiede in den Bindungsenergien fur DOPA und Wasser auf Titan und SiO2 lassensich aufgrund der unterschiedlichen Modelle, die der Literatur verwendet werden, nur unter Vor-behalt vergleichen. Mian et al. nehmen in ihren Berechnungen ein Cristobalit-Gitter fur SiO2 mitvollstandig protonierten OH-Gruppen (pH < 1) im Vakuum an, wahrend im betrachteten Experi-ment eine vollstandig hydratisierte Oberflache vorliegt. Die vorliegenden Werte bestatigen jedoch dieAnnahmen zu ’harter’ gebundenem Wasser auf SiO2 (-11 bis -12 kcal/mol), im Vergleich zu TiO2

(-9 kcal/mol) [156].


Einfluß der Ladungspolarisation auf die Adsorptionsreaktion

Auf ’TiO2’ liegt eine ’weichere’ Ladungspolarisation als auf SiO2 vor, die sich inder Moglichkeit zur Wasserstoffdiffusion auf der Oberflache widerspiegelt (sieheS. 28 Abb. 2.17). Fur hinreichend flache Energiehyperflachen steigt die Wahrschein-lichkeit der Diffusion kleiner Molekule an der Oberflache. Diese Mobilitat an derOberflache wird auf ’TiO2’ beobachtet [52, 110, 156, 163]. Die Hydroxylgruppen ver-lieren ihre Protonen an die verbruckenden Sauerstoffe und koordinieren uber ihreSauerstoffatome an zwei benachbarte Titanzentren (siehe S. 27 Abb. 2.15). DieseKonfiguration ist bekannt fur die Adsorptionskonformation von organischen Sauren[114].Die Dissoziation einer Ti-O(Katechol) Bindung reprasentiert eine reversible Reak-tion mit einer Aktivierungsenergie von nur 0,16 eV [110](Vergleich Photoaktivitatvon TiO2 E = 3,2 eV [164]). Damit ist die Moglichkeit einer Umorientierung auf derOberflache, eine fundamentale Bedingung fur die Oberflachenmobilitat des Katecholserfullt. Dies zeigten Li et al. anhand von RTM Aufnahmen, in denen die Ausbildungvon geordneten Katecholreihen auf Titan zur erkennen ist [117].Viele der an der Oberflache exponierten Hydroxyle verandern durch Wasser indu-zierte Diffusion auf hydratisierten Oberflachen ihre Position [110]. Im Umkehrschlußkonnte sich diese Form der Mobilitat durch eine hinreichend hohe Dichte funktionel-ler Gruppen innerhalb des Adsorbats ubertragen lassen. Fur Proteine ist dies bereitsbekannt [165]. Aufgrund ihrer Dimension und der damit verstarkten intermoleku-laren Wechselwirkung mit anderen Proteinen und dem Substrat ist diese Form derMobilitat fur Proteinadsorbate nachvollziehbar (siehe S. 16, Abb. 2.9) [51, 52].Inwieweit sich diese Eigenschaft der Proteine auch auf die betrachteten Peptide undDOPA im speziellen ubertragen laßt, ist offen. In Abb. 2.17 sind die ermittelten Ener-gien fur eine durch Wasserstoffdiffusion vermittelte Katechol-Bewegung den entspre-chenden Konstitutionen auf der Oberflache gegenubergestellt [48]. Ob diese Beschrei-bung der Situation auf der Oberflache den tatsachlichen Gegebenheiten gerecht wird,diskutierten Skelton et al. [166]. Aus ihren Daten ergeben sich stabil adsorbierte Pep-tide, die uber ihre Seitenketten Wasserstoffbruckenbindungen zu den ersten beidenWasserlagen, innerhalb der hydratisierten ’TiO2’-Grenzflache ausbilden [166]. Diesbedeutet im Umkehrschluß, dass in diesem Fall keine Verdrangung des Wassers imZuge der Adsorption erfolgt.Es stellt sich die Frage, ob DOPA als funktionelle Gruppe innerhalb eines Polymers inder Lage ist, sich infolge molekularer Flexibilitat auf der Oberflache umzuordnen undso moglicherweise stabilere Adsorbatschichten zu bilden oder hohere Belegungsgradezu erzielen. Dazu sammelten Dalsin et al. in QCM Messungen und einem Experi-mentaufbau aus ein bis drei terminal an einem PEG positionierten DOPA auf Titanzutreffende Indizien [167].

Einfluß der Oxidation von Katechol auf die Adsorption

In der Literatur wurde auf eine verschlechterte Adsorption fur oxidierte Peptide ver-wiesen [52]. Dies konnte in Desorptionsmessungen mit AFM fur DOPA (206 ± 66 pN)und DOPA-Chinon (180 ± 60 pN) auf ’TiO2’ demonstriert werden [48]. In IR-Spektren, die mit der ATR-Technik aufgenommen wurden, bestatigte sich dieserEffekt in Adsorptionsstudien zu Cyclohexanon auf Titan (5,7 - 8,8 kcal/mol, Vgl.


DOPA-Chinon 5,3 kcal/mol [48]) [168].

Der Einfluß der Oxidation auf die Adsorption wurde in dieser Arbeit anhand vonunterschiedlichen Oxidationsexperimenten untersucht. Es ist bekannt, dass DOPA-Chinon als Reaktionsprodukt der Oxidation von DOPA reaktiv ist und mit anderenPeptiden vernetzend reagieren kann.Der generellen Diskussion zu den chemischen Gegebenheiten des Systems [x-n] Pep-tid/Substrat, folgt nun die Betrachtung der Ergebnisse im Einzelnen.

5.1.2 Messung der Peptidadsorption mit QCM-Experimenten

Wie im Methodenabschnitt beschrieben (Abb. 4.2 und 4.3), wurde im Basisexpe-riment zunachst das Adsorptionsverhalten der [x-n] Peptide auf ’TiO2’ und SiO2

untersucht (Q2) (Details zu den Experimenten siehe Abschnitt 4.1.5 auf S. 38 ff.).Der Effekt einer der Adsorption vorgelagerten Oxidation wurde in einem weiterenExperiment (Q0) untersucht. Im Oxidationsexperiment (Q3) wurde das Oxidations-mittel erst eingeleitet, nachdem die Adsorption eine Sattigung zeigte (msat), d.h.bevor mit dem Spulen begonnen wurde, aber nach der eigentlichen Adsorption. Wei-terhin wurde der Einfluß des Oxidationsmittels auf das bereits gespulte Substrat mitadsorbierten Peptid untersucht (Q1).Die Peptide wurden unter anderem aufgrund ihres Katecholgehalts unterschieden.Darauf aufbauend wurden in den unterschiedlichen Experimenten die Moglichkeitender Vernetzung durch das Katechol untersucht.

Adsorptionsexperiment Q0

Das Experiment Q0, zur Untersuchung des Einflusses der Adsorption vorgelagertenOxidation von Katechol, auf die Adsorption wurde mit den Peptiden [1-1], [2-1] und[2-2] auf SiO2 durchgefuhrt. Als Oxidationsmittel wurde NaIO4 eingesetzt. Zusatzlichwurde der Einfluß der Komplexbildner und milderen Oxidationsmittel Fe3+ und Cu2+

untersucht. Abbildung 5.4 zeigt die Adsorptionsverlaufe fur die einzelnen Oxidati-onsmittel jeweils fur das getestete Peptid sowie den Verlauf fur das nicht oxidierte(native) Peptid (Kreis, rot). Die Masse bei Sattigung (msat) und nach dem Spulendes Kristalls (mrinse) konnen aus Tab. B.1 im Anhang B auf S. 113 ff. entnommenwerden.Fur alle drei Peptide kann eine veranderte Adsorptionskinetik unter Oxidationsmitte-leinfluß festgestellt werden. Der Adsorptionsverlauf erreicht z.T. fruher eine Sattigungfur die Peptide, die vor dem Auftreffen auf die SiO2 Oberflache oxidiert oder kom-plexiert wurden. Am starksten zeigt sich dies fur die Messungen mit Fe3+ (Dreieck,grun).Ein weiterer Unterschied besteht in einer starkeren Desorption der vor der Adsorp-tion oxidierten Peptide verglichen mit dem nativen Peptid. Die kleineren Massen furmrinse lassen auf eine schlechtere Adsorption schließen.Diese Resultate bestatigen den unter dem Absatz ’Einfluß der Oxidation von Ka-techol auf die Adsorption’ vorgestellten Trends hinsichtlich der Adsorption von Pep-tiden. Unter Verwendung eines Oxidationsmittels nehmen die Wechselwirkungen desPeptids mit dem Substrat ab und infolge dessen verschlechtert sich die Adsorption.Ein entscheidener Einfluß der Natur des Oxidationsmittels kann nicht beobachtet


0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120 140

DHypDOPA

ox. DHypDOPADHypDOPA - Fe

DHypDOPA - Cu

m(

g/c

m²)

Time (min)

1-11-1 NaIO

1-1 Fe1-1 Cu

43+

2+

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 20 40 60 80 100 120

DHypDHypDOPAox. DHypDHypDOPA

DHypDHypDOPA-Fe

DHypDHypDOPA - Cu

m(

g/c

m²)

Time (min)

2-12-1 NaIO

2-1 Fe2-1 Cu

43+

2+

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 50 100 150

DHypDOPA2ox. DHYpDOPA2

DHypDOPA2 - Fe

DHypDOPA2 - Cu

m(

g/c

m²)

Time (min)

2-22-2 NaIO

2-2 Fe2-2 Cu

43+

2+

Abbildung 5.4: Adsorptionsverlauf der nativen und oxidierten Peptide [1-1] (links), [2-1] (mitte)und [2-2] (rechts) fur das Experiment Q0 (Abb. 4.3) auf SiO2, durchgefuhrt mit NaIO4 (Diamant,blau), Fe3+ (Dreieck, grun) und Cu2+ (Quadrat, blau). Die Vegleichsmessung ohne Zusatz einesOxidationsmittels bzw. Komplexbildners ist dargestellt als (Kreis, rot).

werden wie die Desorptionsergebnisse (mrinse) zeigen. Weiterhin zeigen die Desorp-tionsexperimente (Δ mrinse/msat), dass die Wechselwirkung zwischen Adsorbat undOberflache durch die Oxidation von DOPA deutlich geschwacht wird, was einen wich-tigen Beitrag von DOPA zur Adsorption nahe legt.


Das Experiment Q1 diente der Untersuchung der Frequenzanderung, die einzig demeingesetzten Oxidationsmittel Natriumperiodat zugeschrieben werden konnen. Dieswurde nach der Adsorption des Peptids [2-1] auf SiO2 studiert. Der Verlauf der Ad-sorption in Abb. 5.5 zeigt nach Zugabe des Oxidationsmittels NaIO4 (bei t = 100min) zunachst mehr Adsorption. Nach erneutem Spulen mit dd-Wasser fallt die Ad-sorption auf den Wert von mrinse vor Zugabe des Oxidationsmittels zuruck.


Zum einen zeigt dies, dass das adsorbierte Peptid nach der Oxidation nicht desor-biert sondern auf dem Substrat verbleibt. Unter Berucksichtigung der in Abb. 2.14auf S. 27 dargestellten Annahme zur Adsorption eines Katechols bedeutet dies, dassdas an der Wechselwirkung mit der Oberflache beteiligte DOPA nicht oxidiert wurde,da kein Massenverlust beobachtet wurde. Weiterhin unterstreicht es die Erkenntnisaus Experiment Q0, dass DOPA einen wichtigen Beitrag zur Adsoption der unter-suchten Peptide leistet.Desweiteren zeigt das Experiment, dass das Oxidationsmittel Perjodat selbst keinepermanente Massenzunahme verursacht, sondern lediglich durch seinen Einfluß aufdie Peptide und auf DOPA im Speziellen eine Wirkung entfaltet.Auf diesem Resultat basiert das spatere Experiment Q3, in dem der Einfluß vonOxidation wahrend der Adsorptionsgleichgewichtsreaktion untersucht wird.

Q1 mit Peptid [2-1]

NaIO4 dd-H O2

Abbildung 5.5: Adsorptionsverlauf des Peptids [2-1] unter Durchfuhrung des Experimentes Q1 aufSiO2.


Die Ergebnisse des Basisexperimentes Q2 sind fur SiO2 und TiO2 jeweils fur alle[x-n] Peptide in Abb. 5.6 zusammengefaßt. Der gesamte Balken gibt die maximaleMassenanderung (mads = msat) wieder. Die blau/weiß gestreiften Bereiche zeigen dienach dem Spulen mit dd-Wasser verbleibende Masse (mrinse) an. Damit entsprichtder schwarze Bereich der Desorption. Der linke Graph zeigt die Ergebnisse der Mes-sungen auf SiO2, der rechte Graph die der Messungen auf TiO2.Fur SiO2 zeigt sich eine signifikant starkere Massenzunahme des Peptids [2-1] imVergleich zu den anderen Peptiden. Mit fast der doppelten adsorbierten Masse vordem Spulblock (msat) und auch nach dem Spulen (mrinse) zeichnet es sich durch diehochste Adsorption aus.


Abbildung 5.6: Adsorbierte Massen der [x-n] Peptide in der Sattigung (Balkenende), nach Spulen(blau gestreift) und die desorbiertes Masse (schwarz); oben auf SiO2 und unten auf nativ oxidiertenTitansubstraten.

Unerwartet sind die Ergebnisse fur das Peptid [1-0], d.h. ohne DOPA in der Sequenz,welches eine starke Adsorption zeigt und im Vergleich mit den DOPA-haltigen Pep-tiden nach der Desorption signifikant mehr adsorbierte Masse als die Peptide mitzwei oder mehr DOPA in der Sequenz ([2-4], [2-2], [1-2]) zeigt. Fur die Peptide mitzwei oder mehr DOPA in der Sequenz verblieb nach dem Spulschritt allgemein kaumadsorbiertes Peptid auf der SiO2-Oberflache.Von allen untersuchten Peptiden zeigt jenes mit der hochsten Anzahl von DOPA inder Sequenz ([2-4]) die geringste Adsorption und desorbierte nach dem Spulgang zu


100%.Fur TiO2 verhalt sich die Adsorption von [2-4] und [1-0] vollstandig invers zu dembeobachteten Verhalten auf SiO2 (Abb. 5.6). Fur das Peptid [2-4] wurde die starksteAdsorption beobachtet und nachdem sich eine Sattigung zeigte konnte durch Spulenkeinerlei Desorption beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte das Peptid [1-0]auf TiO2, im Vergleich zu den katecholhaltigen Peptiden, die geringste Adsoption vorund nach dem Spulen (msat, mrinse).Der Vergleich der adsorbierten Massen auf den beiden Substraten vor dem Spulenlegt fur SiO2 eine signifikant starkere Adsorption nahe, mit Ausnahme der Peptide[2-1] und [2-4].

Der Vergleich der [x-n] Peptide uber Δm berucksichtigt nicht ihre unterschiedlichenMolmassen, obgleich ein großeres Peptid auch sterisch anspruchsvoller ist und mehrRaum/Flache ausfullt. Da sich ein Teil der Peptide in ihren Molmasse um den Faktorzwei unterscheiden, wurde die Interpretation der Adsorptionsmessungen Q2 um dieBetrachtung der Molmenge erweitert. Dazu wurde die Annahme getroffen, dass essich bei der adsorbierten Masse ausschließlich um Peptid handelt. Diese Annahmedient in diesem Fall lediglich dem Zwecke der Vergleichbarkeit und spiegelt nicht dieRealitat wider.

In Abb. 5.7 sind die Adsorptionsergebnisse fur das Experiment Q2 unter der obendargelegten Annahme bzgl. der adsorbierten Molmenge gezeigt (nads, hohle Symbo-le, rechte y-Achse). Aufgetragen sind die adsorbierten Massen (mads, volle Symbole,linke y-Achse). Es wurden fur SiO2 (Abb. 5.7 oben) und TiO2 (Abb. 5.7 unten)die jeweiligen msat sowie nsat (links) und mrinse sowie nrinse (rechts) eingezeichnet.Zur besseren Orientierung wurden die Datenpunkte, die den Dekapeptiden [1-n] zu-gehoren und die Datenpunkte, die den Ikosapeptiden [2-n] zugehoren, miteinanderverbunden. Die Ergebnisse der Adsorbtionsmessungen Q2 sind in Tabelle B.2 (An-hang B) zusammengefaßt.

Durch Berucksichtigung der Molmasse ergibt sich nun das das originare Peptid [1-1]auf SiO2 (absolut betrachtet) starker adsorbierte als Peptid [2-1]. Dies betrifft glei-chermaßen die beiden ubrigen Dekapeptide, deren mengenmaßige Adsorption, die derIkosapeptide ubertrifft.Wie sich schon bei der Betrachtung der adsorbierten Massen angedeutet hat, zeigtsich, dass sich mehr als ein DOPA in der Sequenz negativ auf die adsorbierte Stoff-menge auswirkt (Abb. 5.7 rechts, oben).Im Fall von TiO2 zeigt sich nach Berucksichtigung der Molmasse ein deutlicher Un-terschied zwischen den Deka- und Ikosapeptiden bei gleicher Anzahl von DOPA inder Sequenz ([1-1] vs. [2-1] und [2-1] vs. [2-2]) was sich in dem großen Abstand derbeiden Kurven in Abb. 5.7 rechts unten manifestiert. Die Adsorption auf SiO2 zeigteine deutlich geringere Abhangigkeit von der Kettenlange.Weiterhin zeigt die Abhangigkeit der Adsorption vom DOPA-Gehalt fur TiO2 ein ge-genlaufiges Verhalten zu SiO2: mit steigendem DOPA-Gehalt nimmt die adsorbierteStoffmenge stetig zu.

Die gefunden Ergebnisse scheinen zwei gegenlaufige Trends widerzuspiegeln. Wie imAbschnitt 5.1.1

”Isoelektrischer Punkt des Adsorbats“ erortert, konnte die starker ne-

gative Oberflachenladung des SiO2 in einer verstarkten Adsorption resultieren. Diegefundenen Ergebnisse fur Peptid [1-0] legen diese Vermutung nahe. Andererseits ist


�m

t

�m

t

SiO2

TiO2 TiO2

SiO2

Abbildung 5.7: QCM-Ergebnisse fur die adsorbierten Massen am Sattigungspunkt (msat, links)und nach erfolgtem Spulblock (mrinse, rechts), der Adsorptionsexperimente auf SiO2 (oben) undTiO2 (unten) in blau; die linke Achse gibt jeweils die Massenanderung (mads) wieder, die rechte dieangenommenen Molmengenanderung (nads) entsprechend der Achsenfarbe werden die Molangabendurch schwarze Symbole verkorpert; die eingezeichneten Linien verbinden jeweils die Datenpunkte,die den Dekapeptiden und die den Ikosapeptiden zugeordnet werden; mittig ist die Entsprechung zurzeitlichen Einordnung des Experiment dargestellt (roter Pfeil).

der Effekt von DOPA in der Sequenz fundamental unterschiedlich fur TiO2 und SiO2

(Adsorption verstarkend fur TiO2 und hemmend fur SiO2). Dies hat zur Folge dasder Effekt der unterschiedlichen Oberflachenladung im Fall von TiO2 mit steigendemDOPA-Anteil (uber-)kompensiert wird, so das letztendlich auf TiO2 mehr adsorbiertwird als auf SiO2.Weiterhin legen die Ergebnisse zum Kettenlangeneinfluß, welcher auf TiO2 deut-lich ausgepragter ist, eine erhohte Mobilitat der Dekapeptide im Vergleich zu denIkosapeptiden nahe. Dies unterstutzt die in Abschnitt 5.1.1

”Ladungspolarisation“

diskutierten Zusammenhange.

Adsorptionsexperimente Q3

In Experiment Q3 wurden die [x-n] Peptide auf beiden Substraten hinsichtlich derVeranderung der erfolgten Adsorption, nach Zugabe des Oxidationsmittels vor demSpulen untersucht. In Abb. 5.8 sind die Ergebnisse des Q3 Experimentes (Quadrate)


zusammen mit denen des Basisexperimentes Q2 (hohler Diamant) in Abhangigkeitvon der Anzahl DOPA in der Sequenz (n) aufgetragen.Die Ergebnisse fur das Peptid [1-0] auf SiO2, bestatigt die allgemein publizierte An-nahme, dass oxidierte Peptide ein schlechteres Adsorptionsverhalten zeigen [52]. Wei-terhin legten die vorherigen Experimente nahe, dass die Adsorption auf SiO2 besten-falls unabhangig vom DOPA Gehalt ist. Die Ergebnisse des OxidationsexperimentesQ3 zeigen keinen Unterschied zum Basisexperiment und unterstutzen damit die Tat-sache, dass DOPA im Falle von SiO2 keinen Einfluß auf die Adsorption hat.Fur TiO2 zeigt sich, dass fur die Ikosapeptide der Unterschied zwischen Basisexperi-ment und Oxidationsexperiment Q3 fur steigenden DOPA-Gehalt kleiner wird. DieGrunde dafur konnten in der verstarkten Autooxidation der DOPA-reichen Peptideliegen, was den Effekt des externen Oxidationsmittels marginalisiert und zu einer sta-bilisierenden Quervernetzung in der Adsorbatschicht fuhren kann. Weiterhin zeigendie Peptide [2-1] und [1-1] den gleichen Effekt (Zunahme der adsorbierten Stoffmen-ge) verursacht durch das Oxidationsmittel. Basierend auf der Tatsache der erhohtenMobilitat fur die Dekapeptide (vergleiche Experiment Q2) konnte der starker ausge-pragte Effekt fur [1-1] darauf hindeuten, dass die an sich leicht hohere Adsorptiondurch eine bessere Quervernetzung verstarkt wird.

Abbildung 5.8: QCM-Ergebnisse der Experimente Q2 (Diamant, hohl) und Q3 (Quadrat, kompakt)fur die adsorbierten Molmengen am Ende des Experimentes (nrinse) auf SiO2 (oben) und Ti (unten);Dekapeptide (grau), Ikosapeptide (rot).

Abhangigkeiten der QCM-Messung von der Peptidkonzentration

Im Rahmen der Adsorptionsexperimente wurden neben der Zusammensetzung derPeptide [x-n] weiterhin das Volumen der vorgelegten Peptidlosung variiert.Abbildung 5.9 zeigt fur die beiden Peptide [2-2] (links) und [2-4] (rechts) fur un-terschiedliche Peptidvolumina die Adsorptionsverlaufe auf TiO2. Es zeigte sich, dassfur hohere Volumina, trotz identischer Peptidkonzentrationen, hohere Adsorptionengemessen wurden (Bsp. 5.9 links, Raute hohl).Die Analyse der einzelnen Adsorptionskurven laßt fur Messungen, in denen eingroßeres Volumen Peptidlosung vorgelegt wurde, mehrere Adsorptionsstufen erken-nen. Diese wurden den einzelnen Adsorptionslagen (Layer) zugeordnet und stellenin Abb. 5.9 die Abszisse dar. Unter Layer wird das Aufwachsen von i zum Substrat


hin orientierter Peptidlagen verstanden; die einzelnen Lagen besitzen zum Teil einendefinierten Abstand z zum Substrat; die Abfolge der Lagen ist charakteristisch furjedes System, stark vereinfacht wurde dies von Monti et al. fur unterschiedliche funk-tionelle Gruppen auf oxidierten Titansubstraten simuliert [156]. Die Zunahme derLayer i korreliert mit dem absoluten Volumen: i ∝ V.

Abbildung 5.9: Einfluß verschiedener Probenvolumina (Konzentration Peptid 1 mg/mL) auf denAdsorptionsverlauf und die Zahl der Adsorptionslayer i, bei gleicher Konzentration, fur die Peptide[2-2] (links) und [2-4] (rechts) auf TiO2.

5.1.3 Quantitative Analyse der Peptidadsorption durch XPS Mes-sungen

Fur eine weitergehende Untersuchung des Adsorptionsverhaltens der [x-n] Peptidewurden analog zu den QCM-Messungen (Q2 und Q3) Proben angefertigt, die durchXPS untersucht wurden (Q2 und Q3). Dafur wurden Titanscheiben in einer Pep-tidlosung inkubiert, gewaschen und getrocknet. Als Referenz wurde eine Titanscheibemitgefuhrt, die statt in einer Peptidlosung in dd-Wasser inkubiert wurde. Es wurdenjeweils zwei Positionen auf dem Subtrat gemessen und die Bindungsenergien (BE)der Elektronen aus den C 1s, N 1s, O 1s und Ti 2p Orbitalen bestimmt. Die prozen-tualen Stickstoffanteile zeigen signifikante Unterschiede. Deutlich wird dies in Tab.5.2. Zu erkennen ist zum einen eine Zunahme des prozentualen Stickstoffanteils inAbhangigkeit von Katechol in der Sequenz (n). Weiterhin sticht das Ergebnis fur dieReferenz (Ti-Disc H2O) heraus, die ein hoheres Stickstoffsignal als die Peptidprobenzeigt. Dabei ist zu berucksichtigen, dass in Titan geloster Stickstoff vorliegen [169]kann.Im Folgenden wurde mit zwei aussagekraftigeren Großen gearbeitet: der relativenVerhaltnisse der Atome zueinander und dem α-Shift, der sich aus der chemischenUmgebung des Atoms ergibt und weitergehende Aussagen uber die Bindungssituati-on zulaßt.In Abb. 5.10 ist die prozentuale Verteilung der Atome Titan, Sauerstoff, Kohlenstoffund Stickstoff der nativen [x-n] Peptide in Abhangigkeit von der Anzahl der Katecho-le innerhalb der Sequenz (n) gezeigt. Durch eingezeichnete Linien wird die Tendenzder jeweiligen Anteilsentwicklungen in Abhangigkeit von dem Katecholgehalt ange-deutet. Die zugehorigen Werte, inklusive der oxidierten Peptide [1-0 ox] und [1-1 ox]


Tabelle 5.2: Quantitative Analyse der XPS Daten bzgl. der Adsorption ausgesuchter [x-n] Pepti-de; die Werte bilden den Mittelwert zweier Meßpunkte (* fur [1-1 ox] ist nur Pos1 aufgefuhrt) inAtomprozent.

Atom % Ref 1-n Peptid 2-n Peptid ox-m-satH2O 1-0 1-1 2-1 2-2 2-4 1-0 ox 1-1 ox*

Ti2p 20,9 16,9 16,0 16,6 15,3 13,1 17,2 13,4O1s 52,8 45,7 44,6 46,3 43,3 38,9 46,7 40,1C1s 24,8 34,8 35,1 33,1 35,6 42,7 32,9 41,2N1s 1,5 2,4 4,2 3,8 5,1 5,3 2,4 4,2

sind in Tab. 5.2 zusammengestellt. Fur alle vier Atomarten sind Veranderungen nachInkubation mit einem der [x-n] Peptide festzustellen (Tab. 5.2). Die Grafik 5.10 zeigtweiterhin einen Anstieg der Kohlenstoff und Stickstoffanteile fur eine Katecholzunah-me innerhalb der Sequenz (n). Titan und Sauerstoff hingegen verlieren Anteile bei derZunahme an Katechol. Dies gilt sowohl fur die Dekapeptide (hohle Symbole) als auchfur die Ikosapeptide (kompakte Symbole). Die bisher gezeigten Ergebnisse lassen kei-ne Formulierung bezuglich der Aussagen zum Katecholbeitrag zur Adsorption zu. Da-her wurde die Bindungssituation fur Kohlenstoff und Sauerstoff mittels des α-Shiftsanalysiert. Die XPS-Signale setzen sich aus Signalen, die aus unterschiedlichen Bin-dungstypen herruhren, d.h. von Elektronen unterschiedlicher Bindungsenergie (BE),zusammen. Deren Zuordnung ermoglicht daher eine feinere Auflosung der jeweiligenSignalinformationen. Dieser sogenannte α-Shift der Bindungsenergie schlusselt diechemische Umgebung der Atome auf [170].Vor diesem Hintergrund wurde das C1s Signal in die Beitrage von vier unterschied-lichen Kohlenstoffbindungstypen unterteilt. Unterschieden wurden aliphatische undaromatische Kohlenstoffe, mit einer Bindungsenergie von 285 eV, von alkoholischen(+ 1,47 bis 1,73 eV), amidischen (+ 2,97 bis 3,59 eV) und Carbonsaurekohlenstoffen(+ 4,18 bis 4,33 eV). Das O1s-Signal wurde entsprechend analysiert. Es wurde un-terschieden zwischen Sauerstoff, der an Ti4+ gebunden vorlag (TiO), koordiniertemHydroxylsauerstoff (TiOH) und Sauerstoff mit einer Bindung zu einem Kohlenstoffoder in Wasser vorliegendem Sauerstoff (C-O und H2O). Abbildung 5.11 zeigt diesbeispielhaft an der Analyse des O1s (a) und des C1s (b) Signals fur die Probe [1-0].Eingezeichnet sind zudem die Werte der Verschiebungen zu hoheren Bindungsener-gien fur die einzelne Bindungstypen.

Die experimentell bestimmten α-Shifts sind in Tab. 5.3 zusammengetragen. Die rela-tiven Flachenanteile wurden aus Grunden der Vergleichbarkeit in die entsprechendenAtomprozent umgerechnet. In Abb. 5.12 sind die Verteilungen der Atome fur das C1sund O1s Signal entsprechend ihrer α-Shifts in einem Saulendiagramm zusammenge-faßt.Fur die gitterartig gemustert dargestellten Carbonylkohlenstoffe und die alkoholi-schen Kohlenstoffe wird eine Zunahme im Vergleich zur Referenzprobe festgestellt.Weiterhin wird deutlich, dass der Anteil aliphatischen Kohlenstoffs (Ca) starkenSchwankungen unterliegt. Diese Schwankungen lassen sich auf unvermeidbare Kon-taminationen mit ubiquitaren Kohlenwasserstoffen zuruckfuhren.Die Entwicklung des Anteils alkoholischen Kohlenstoffs (Cb) zeigt eine deutliche Zu-nahme mit steigendem Katecholgehalt in der Sequenz. Die Anteile der verbleibenden


Abbildung 5.10: Prozentualen Verteilung der Atome Titan (grau), Sauerstoff (blau), Kohlenstoff(schwarz) und Stickstoff (grun) uber die Anzahl Katechol in der Sequenz(n), [x-n] Peptid auf Titan imXPS detektiert; x=1 durch hohle und x=2 durch gefullten Symbole dargestellt; die eingezeichnetenLinien dienen der Ubersicht und spiegeln keinen funktionellen Zusammenhang wieder.

Carbonylkohlenstoffe (Cc) und Carbonsaurekohlenstoffe (Cd) folgen keinem klarenTrend. Dies kann zweierlei Ursachen haben: zum einen ist die Beschrankung aufzwei Gaußkurven fur die Analyse des XPS-Signal in diesem Bereich offenbar unzurei-chend. Zum anderen fehlen Informationen uber weiterreichende Bindungen, die sichim β-Shift außern. Diese Einschrankung wurde bewußt in Kauf genommen, da eineVerbesserung der Anpassung durch mehr Gausskurven keinen Informationsgewinnmit Blick auf die Peptidadsorption gebracht hatte.Da sich das Integral, der als Carbonylkohlenstoffe bezeichneten Spezies, aus einerVielzahl nicht aufgeschlusselter Bindungsspezies zusammensetzt und der Anteil anKontaminationen mit ubiquitaren Kohlenwasserstoffen stark schwankt, wird in allenweiteren Betrachtungen der Kohlenstoffanteil von den aliphatischen Kohlenstoffenbereinigt (bezeichnet als C(b+c+d)).Fur Sauerstoff zeigt sich fur die an Ti4+ gebundene Spezies ein abnehmender Anteil,wenn der Katecholanteil innerhalb der Sequenz zunimmt. Die Anteile der an Titankoordinierten Hydroxylsauerstoffe Ob und die an Kohlenstoff gebundenen Sauerstoffe


a) b)

3,1 eV

1,5 eV

4,6 eV

1,5 eV

1,3 eV

Abbildung 5.11: Analyse der XPS-Signale fur O1s und C1s zur Bestimmung des alpha-Shifts hin-sichtlich der Bindungsenergie [eV]; Dazu wurde das Gesamtsignal in drei (O1s) bzw. vier (C1s)Signale aufgesplittet, die Anpassungen laufen in vordefinierten Grenzen (BE shift, Signalhalbwerts-breite 1, 1 < x < 1, 3).

Tabelle 5.3: Quantitative Analyse der XPS Daten bzgl. der Adsorption ausgesuchter [x-n] Peptidein Entsprechung der Experimente Q0 und Q2; die Werte bilden den Mittelwert der gefitteten Signalezweier Meßpunkte (mit der Ausnahme [1-1 ox]); die Flachen (

∫) unter den O1s und C1s Signalen

wurden entsprechend ihrer Bindungsspezies unterteilt; a) Sauerstoff gebunden an vierbindiges Ti4+.

Abkurzung Ca Cb Cc Cd

Bindungssp. C-C/H,

&C=C

C-O NHC(=O) COOH

Einheit [%]∫

atom%∫

atom%∫

atom%∫

atom%

Ti Ref. 73 18,0 15 3,7 5 1,2 7 1,8

1-0 69 24,0 19 6,5 7 2,4 6 2,0

1-1 61 21,4 25 8,6 11 3,9 4 1,2

2-1 57 18,9 27 8,9 13 4,2 3 1,1

2-2 55 19,6 29 10,4 14 5,0 1 0,5

2-4 59 25,0 29 12,3 11 4,7 2 0,7

1-0 ox 69 22,7 18 6,0 8 2,5 5 1,8

1-1 ox 64 26,3 23 9,3 11 4,4 3 1,2

Abkurzung Oa Ob Oc

Bindungssp. TiO a) TiOH C-O,H2O

Einheit [%]∫

atom%∫

atom%∫

atom%

Ti Ref. 80 42,2 16 8,3 5 2,4

1-0 74 33,8 17 7,9 9 4,1

1-1 72 32,1 19 8,4 9 4,1

2-1 71 33,0 20 9,5 8 3,9

2-2 71 30,8 22 9,3 7 3,1

2-4 67 26,0 22 8,6 11 4,3

1-0 ox 74 34,4 19 8,7 8 3,6

1-1 ox 66 26,3 22 8,7 13 5,1


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Abbildung 5.12: Verteilung der Atomprozente von Ti 2p, N 1s, O1s und C1s auf den [x-n] Titan-scheiben inklusive der Aufteilung der O1s und C1s Signale in unterschiedliche Bindungstypen.

Oc lassen sich in Bezug auf den Katecholgehalt ahnlich schwierig interpretieren wiedie Cc und Cd Signale. Es konnte nicht zwischen an Titan koordiniertem Hydroxyl-sauerstoff und kohlenstoffgebundem Sauerstoff, der als Alkohol auftritt, unterschie-den werden. Daher wurde auch fur diese Sauerstoffspezies eine Fusion der Integraledurchgefuhrt und die weiteren Auswertungen unter Verwendung von O(b+c) vorge-nommen.Die Zunahme des Stickstoff zu Titan-Verhaltnisses in Abb. 5.13 spricht ebenso wie dieKohlenstoff zu Stickstoff-Verhaltnisse dafur, dass es sich bei den gemessenen Schich-ten um adsorbiertes Peptid und keine Verunreinigungen durch Kohlenstoff handelt.Das Stickstoff zu Titan-Verhaltnis nimmt mit steigendem Katecholgehalt zu und lauftab einer gewissen Belegungsdichte gleichbedeutend mit einer Schichtdicke d in eineSattigung.Dies entspricht den Ergebnissen der QCM-Messungen, in denen fur steigenden Ka-techolgehalt ebenso eine verstarkte Adsorbtion auf Titan festgestellt wurde. Weiter-hin zeigt sich in den XPS-Messungen in Ubereinstimmung mit den QCM-Ergebnissenfur das Peptid [1-1] eine Zunahme des adsorbierten Peptides verursacht durch dasOxidationsmittel sowie die Unabhangigkeit der Adsorption von Peptid [1-0] von derOxidation.


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Abbildung 5.13: Vergleich der mit XPS gemessenen N/Ti Verhaltnisse fur die Experimente Q2und Q3 (grun) mit den Ergebnissen der QCM-Messungen (rot) in Auftragung uber die AnzahlKatecholeinheiten in der Sequenz (n).

5.1.4 Analyse der Peptidadsorption durch IRRAS Messungen

Fur eine erganzende Untersuchung des Adsorptionsverhaltens der [x-n] Peptide wur-den IRRAS Messungen durchgefuhrt. Titanscheiben wurden mit Peptidlosung analogzu den QCM-Experimenten prapariert. Vorgelegt wurden die Peptide [2-2] und [2-4]mit einer Konzentration von 1 mg/mL. Die zwei Proben wurden mittels IRRAS ineiner stickstoffgesattigten Atmosphare gemessen.

Fur die mit Peptid [2-4] behandelte Probe wurden signifikante Banden gemessen. Pep-tid [2-2] zeigte hingegen keine verwertbaren Signale, was den Schluß einer geringerenAdsorption nahelegt. Dies deckt sich mit den geringeren Adsorptionen im Vergleichzu Peptid [2-4], die sich aus den QCM- und XPS-Ergebnissen ableiteten (siehe Abb.5.13). Auf Titan belief sich die adsorbierte Masse des Peptids [2-4] nach erfolgtemSpulblock (arinse = 107 %) auf das funffache verglichen mit [2-2] (arinse = 18 %).Die breite Bande bei 1669 cm−1 kann dem Amid II zugeordnet werden und korre-spondiert mit der Adsorption bei 1265 cm−1. Diese ist charakteristisch fur die C-OStreckschwingung von L-DOPA [54, 171]. Weiterhin wurde eine breite Bande imFingerprintbereich bei 818 cm−1 lokalisiert, die allgemeinhin Sauregruppen und sub-stituierten Phenolen zugeordnet wird. Einige erwartete Banden wie die Ring-Bandedes DOPA bei 1492 cm−1 sind andeutungsweise zu identifizieren. Diese Absorptionwird mit Vibrationsschwingungen substituierter Aromaten in Verbindung gebracht[172].Die identifizierten Banden und deren Intensitaten legen eine hohen Belegung fur dasPeptid [2-4] nahe. Obgleich die Intensitaten fur das Peptid [2-2] nicht die von Peptid[2-4] erzielten, existieren klare Indikationen fur eine Adsorption.


5.1.5 Prufung von Adhasivverbindungen

Fur die Untersuchung des adhasiven Potentials der Peptide wurden Klebproben mitverschiedenen Substraten hergestellt. Diese wurden im Anschluß einer der drei me-chanischen Prufmethoden aus Zugscherprufung, Druckscherprufung und Zugprufungunterzogen. Zur Untersuchung einzelner Einflußfaktoren wurde mit einer Reihe vonVoruntersuchungen auf verfugbaren Substraten wie Glas und Zirkonoxid (ZrO2) be-gonnen, um den Einfluß der Peptidkonzentration in der Losung, der Aciditat desLosemittel und der Oxidation zu untersuchen.

Einfluß der Konzentration

Der Einfluß der Peptidkonzentration auf die Klebwirkung wurde in einer wasserbasier-ten Konzentrationsreihe durch Auftrag der Losung auf ZrO2-Stifte (Geometrie 3 x 3 x9 mm; gefugte Flache 3 x 3 mm) untersucht. Die gefugten Stifte wurden unter Druckruhen gelassen (siehe Abb. 4.5, S. 47), so das das Wasser entweichen konnte. An-schließend wurden die gefugten Stifte mechanisch gepruft. Fur diese Untersuchungenwurde eine Verdunnungsreihe des Peptids [1-1] verwendet. Als Referenzen dientenzum einen reines 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) und ein Peptid (’Histonfrag-ment’), dem keine adhasiven Domanen innewohnen. Die Versuche wurden mit Blickauf die peptidvermittelte Adhasion nur qualitativ ausgewertet.Es zeigte sich, dass weder das Referenzpeptid noch reines DOPA in der Lage warendie ZrO2-Substrate adhasiv zu verbinden. Fur die mit Peptid [1-1] gefugten Substra-te hingegen liessen sich ausgehend von einer Peptidkonzentration von 10 mg/mL bis0,01 mg/mL nur bis zu einer Verdunnung von 1 mg/mL Zugfestigkeiten messen. Furdie ubrigen Experimente wurde daher nicht unterhalb dieser Peptidkonzentration(1 mg/mL)gearbeitet.

Aciditat des Losemittels

Der Einfluss der Aciditat des Losemittels auf die Klebeigenschaften der Peptidewurde auf Glassubstraten (75 x 25 x 1 mm; gefugte Flache 25 x 10 mm) mit einerPeptidkonzentration von 50 m% untersucht. Es wurden Proben fur die Peptide [1-0]und [1-1], die mit einer Peptid/TFA (1:1 m%; pK(sTFA) = 0,26)-Losung und einerPeptid/Isopropanol-Losung (1:1 m%, pKs(Isoprop) = 17,1) gefugt wurden, einerZugscherprufung unterzogen.Fur das Peptid [1-1] ergab sich fur die aus TFA geharteten Proben eine Zugfestigkeitvon 0,18 MPa (F = 45,5 ± 3,5 N) und 0,03 MPa (F = 7,5 ± 0,7 N) fur die ausIsopropanol geharteten Proben. Fur das Peptid [1-0] hingegen konnte fur die mitTFA gefugten Proben keine Adhasion festgestellt werden.Von den Proben deren [1-0] Peptide zuvor in Isopropanol gelost vorlagen, konnte nureine gepruft werden, die andere Probe zeigte bereits Adhasionsversagen beim Losenaus der Klebvorrichtung. Die Zugfestigkeit betrug 0,02 MPa (4,8 N). Die Ergebnissesind in Abb. 5.14 dargestellt, aufgetragen ist jeweils die mittlere Zugkraft bestimmtaus 2 Messungen und die einzelne Messung der Probe des Peptids [1-0], das zuvor inIsopropanol gelost vorlag.


Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen zum Einfluß der Aciditat desLosemittels, das Proben deren Peptid in einem Medium mit hoherer Acididat gelostvorlagen und aus dieser Losung heraus gefugt wurden, signifikant hohere Zugfestig-keiten erbrachten.

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Abbildung 5.14: Einfluß der Aciditat des Losemittels auf Adhasivverbindungen untersucht an denPeptiden [1-0] und [1-1]; die Peptidlosung unterschieden sich in dem pKs-Wert ihres Solvenz, eswurden je zwei Losungen zu 50 Gewichtsprozent vorgelegt und gefugt. Die getrockneten Probenwurden in einer Zugscheranlage gepruft (TFA 1:1 w% fur Peptid [1-0] betrug 0,00 MPa).

Einfluß von Oxidation

Der Einfluß der Oxidation auf die Klebfestigkeit wurden mit polierten ZrO2-Stiftenals Substrat in Zugprufungen untersucht. Gefugt wurde mit allen [x-n] Peptiden, so-wie der Aminosaure DOPA, und dem Peptid [1-1 switch]III.Fur die Proben, in der das Peptid durch Zugabe des Oxidationsmittels NaIO4 inner-halb von Sekunden oxidiert vorlag, wurden deutlich hohere Zugfestigkeiten gemessenals fur jene, die ohne Oxidationsmitteleintrag gefugt wurden (Abb. 5.15).Auffallig sind die hohen Standardabweichungen der Zugfestigkeiten. Mikroskopauf-nahmen der Bruchflachen zeigten weiterhin fur DOPA und das Peptid [1-2] frak-talahnliche Strukturen (Abb. 5.15 unten). Fur die mit Peptid [1-0] und [1-1] gefugtenProben wird hingegen ein betrachtlicher Anteil nicht benetzter Substratflache beob-achtet (Abb. 5.15 oben).Es besteht daher Grund zur Annahme, dass sich eine inhomogene Konzentrationsver-teilung innerhalb der gefugten Flache bildete. Wahrend das Losemittel entweichte,konnten lokale Konzentrationssenken und im Vergleich zur gefugten Flache auf klei-

III[1-1 switch] ist das originare Mefp1, dessen Position des Katechols DOPA jedoch mit der des inder Sequenz ebenfalls vorkommenden Tyrosin getauscht wurde.


nere Areale begrenzte Konzentrationsspitzen entstehen. Dies wird in den fraktalenMustern in Abb. 5.15 deutlich. Dieses schwer steuerbare Phanomen brachte generellKomplikationen im Zusammenhang mit den Klebungen mit sich.

1-0

DOPA

1-1

1-2

Abbildung 5.15: Einfluß von Oxidation der Peptide auf Adhasivverbindungen fur die [x-n] Peptideauf polierten ZrO2-Stiften. Ergebnisse der Zugprufung fur Proben aus denen das Losemittel hinausdiffundiert war, in die kurz vor dem Fugen Oxidationsmittel eingebracht wurde sind grun dargestellt;Mikroskopaufnahmen der Bruchflachen einer [1-0] Probe, einer DOPA Probe, einer [1-1] Probe undeiner [1-2] Probe sind links und rechts außen eingefugt.

Einfluß des Katecholgehaltes in der Peptidsequenz

Abschließend wurde auf der Basis der in den Voruntersuchungen gewonnen Erkennt-nisse (Konzentration der Peptidlosung, Oxidationmittel, Aciditat des Losemittels,Rauheit) der Einfluß der Anzahl der in der Sequenz enthaltenen Katecholbausteineauf die Haftfestigkeit untersucht.

Es wurden Klebproben in Zugschergeometrie (gefugte Flache ca. 80 mm2) mit den [x-n] Peptiden auf Titansubstraten angefertigt und mechanisch getestet (siehe Abschnitt4.1.9 auf S. 47). Hierfur wurden zwei Titanplattchen (10 x 15 x 1 mm) jeweils miteiner [x-n] Peptidlosung (1 mg/mL Peptidkonzentration) benetzt. Vor dem Fugenwurde auf eine der Seiten gesattigte NaIO4-Losung gegeben, nachdem das Losemittelabgeluftet war. Fur alle Peptide der Titanserie erfolgte eine siebenfach Bestimmungmit Ausnahme fur DOPA, die in zehnfach und das Peptid [1-1], das in funffachBestimmung gepruft wurden. Die Hartung erfolgte unter Beschwerung mit Gewichten(siehe Abschnitt 4.1.8, S. 46 ff.).Es zeigte sich, dass fur viele Proben, durch Adhasionsversagen noch vor der Prufungdurch den Bondtester, keine Verbundfestigkeit ermittelt werden konnte. PrufbareProben konnten nur fur wenige Peptide hergestellt werden und nur ein Teil dieserProben zeigt eine Druckscherfestigkeit von großer 2 MPa . Dies sind alleinig Proben,die mit den Peptiden [1-0] und [1-1] hergestellt wurde.

Zusammenfassend ergaben sich aus den Prufungen zur Adhasion die folgenden Er-kenntnisse. Eine Zunahme der Anzahl der DOPA-Gruppen in der Sequenz der Peptidegeht nicht einher mit einer verbesserten Klebfestigkeit. Die besten Klebfestigkeiten


Titan1-0

20 fache Vergrößerung

zoom in z-Richtung�

100 μm 50 μm

1-0 1-1

2,4 MPa

1-2

2-1 2-2 2-4 DOPA

Abbildung 5.16: Geprufte Adhasivverbindungen [x-n] Peptid gefugter Titansubstrate, rechts untensind die rigiden Bereiche des geharteten Peptids [2-4] in Vergroßerung dargestellt.

zeigen sich wider den Erwartungen fur das DOPA-freie Peptid [1-0]. Durch die Ap-plikation des Oxidationsmittels wird eine spontane Vernetzung mit hoher Geschwin-digkeit eingeleitet. Dies fuhrte zu einer Kontraktion der Peptidschicht und resultiertein einer inhomogenen Konzentrationsverteilung innerhalb der gefugten Flache, sowiein inselartigen rigiden Peptidarealen auf der Substratoberflache (siehe Abb. 5.16). Jehoher die DOPA-Dichte, desto rigider harteten die Peptide in Gegenwart von Peri-odat. Ein hier unerwunschter Effekt, jedoch mit Blick auf die naturliche Anwendungdurch die Muschel als Biolack zum Schutz des Byssusfadens ein zielfuhrender Mecha-nismus (siehe Abschnitt 2.1).


5.1.6 Zusammenfassung der durch Sequenzvariation erzielten Er-gebnisse

In der Peptidadhasion greifen zwei Prozesse ineinander. Zunachst muß das Peptidmit dem Substrat in Wechselwirkung treten, danach fuhren Wechselwirkungen mitden noch freien Peptiden zum Aufbau der nachsten Peptidschichten.Dem ersten Schritt, der Ausbildung der initialen Adsorptionsschicht, liegen Anfor-derung an eine stabile Adsorption zum Substrat zugrunde [112]. Dies trifft auf diedaruberliegenden Lagen, der Matrix, nicht zu. Diese kann durch kovalente Vernetzungund elektrostatische Wechselwirkungen oder auch Fullpartikel stabilisiert vorliegen.Essentiell ist jedoch eine starke Anbindung der Matrix an die erste Peptidlage.Die relevanten Einflußgroßen fur die Peptidadhasion sind daher unter anderem dieBelegung der Substratoberflache (z.B. in Peptid/nm2) und die Anbindungspunkte derPeptidmatrix. Darauf basierend kann folgende Erwartung formuliert werden: je hoherdie Belegung und die reaktiven Gruppen fur Vernetzungsreaktionen, desto starker dieAdhasion.

Die Untersuchungen zur Wechselwirkung der [x-n] Peptide zeigte, jedoch die folgen-den Trends:

• Mit steigendem DOPA-Gehalt zeigt sich in den QCM- und XPS-Messungeneine verbesserte Adsorption auf den TiO2-Substraten, wahrend auf SiO2 all-gemein eine geringe Adsorption sowie kein Einfluß des DOPA-Gehalts auf dieAdsorption festgestellt wurde.

• Fur die Adsorption auf TiO2 konnte eine Abhangigkeit von der Kettenlangedes Peptids gefunden werden: kurzere Peptide mit identischem DOPA-Gehaltzeigten eine starkere Adsorption.

• Fur die Adsorption auf TiO2 konnte ein positiver Effekt durch Oxidation fureinige der Peptide festgestellt werden.

• Die einzige Probe, die eine meßbare Druckscherfestigkeit auf TiO2 zeigte wardas Referenzpeptid [1-0] ohne DOPA.

Der Unterschied der beiden Substrate (TiO2, SiO2) hinsichtlich der Adsorption inAbhangigkeit vom DOPA-Gehalt, der in den QCM-Messungen beobachtet wurde,konnte auf die besseren Komplexbildungseigenschaften von DOPA mit Ti(IV) imVergleich zu Si(IV) Zentren zuruckgefuhrt werden.Der Kettenlangeneinfluß auf die Adsorption konnte hier erstmals fur DOPA-haltigePeptide demonstriert werden. Es zeigte sich das kurzere Ketten mit DOPA in derSequenz erhohte Adsorption gegenuber ihren langeren Pendants zeigten, was auf eineverbesserte Mobilitat des Adsorbats auf TiO2 zuruckgefuhrt wurde.Eine Mobilitat von Katechol selbst wurde schon fruher demonstriert. Genauso wiegezeigt wurde, dass Proteine auf Oberflachen durchaus wandern konnen. DiesesPhanomen scheint auch fur DOPA-haltige Peptide, die sich den Mechanismus derDOPA-Umlagerung zu Nutze machen, beobachtbar zu sein. Dies indizieren die Er-gebnisse fur das Peptid [2-4] der oberflachensensitiven Analysen mit QCM, XPS undIRRAS. Aufgrund der geringeren Festigkeit innerhalb der Peptidmatrix hielt von al-len Proben das Peptid [1-0] ohne DOPA den starksten Belastungen im Druckschertest


(Bondtest) stand. Die Grunde hierfur liegen in der Vernetzungsfahigkeit der DOPA-Peptide, welches beispielsweise in dem QCM-Experiment Q3 analysiert wurde. Eswurde eine zunehmende Rigiditat der Peptidschicht fur eine Zunahme an DOPA in-nerhalb der Sequenz beobachtet (Abb. 5.16), was auf eine verstarkte Quervernetzunghindeutet, die sich positiv auf die Kohasion innerhalb einer Matrix auswirken, derAdhasion auf der Substratoberflache jedoch abtraglich sein kann. Diese Fahigkeitzur Vernetzung dominieren in diesem Fall die hoheren Belegungsdichten der DOPA-haltigen Peptide und schmalern dadurch die Klebfestigkeit mit dem Substrat.

Auch unter Berucksichtigung der Fulle der hier gesammelten Informationen, ist esnicht moglich genaue Vorhersagen fur ein bestimmtes System, mit einem Peptid als’Klebstoff’ zu treffen. Daher gilt der von Andrade gepragte Begriff der ’molekularenPersonlichkeit’ bezogen auf Interaktionen zwischen Polypeptiden und Oberflachen.Die Adsorption laßt sich als eine vielschichtige Oberflachenreaktion beschreiben. Da-bei unterliegt das Reaktionssystem den klassischen Einflussen intrinsischer und ex-terner Großen. In Abb. 5.17 sind relevante Großen des Systems Peptid-Substrat ein-ander gegenubergestellt. Durch die mittig angedeuteten Verflechtungen werden dieAbhangigkeiten der Großen untereinander angedeutet.

Die vielfaltigen Abhangigkeiten der einzelnen Großen mussen als Grund fur die un-terschiedliche Adsorptionsphanomene herangezogen werden.

Der Einfluß der Oxidation auf die Adsorption konnte anhand der drei entwickeltenOxidationsexperimente Q0, Q3 und Q1 erstmals in einem Experiment differenziertuntersucht werden. Die thermodynamischen und kinetischen Aspekte der Peptidad-sorption lassen sich jedoch nur schwer getrennt voneinander betrachten. Durch diegewahlten Experimente ließen sich dennoch generelle Trends beobachten.

5.2 Oberflachenmodifikation mit Peptiden

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Immobilisierungskonzepte auf ihre Eignung zurModifikation von Oberflachen mit Peptiden hin untersucht. Darin flossen die Erkennt-nisse aus dem vorherigen Abschnitt bezogen auf die Wechselwirkungen von Peptidenmit einer vernetzenden und adsorptionsfordernden Aminosaure mit ein. Mit dem Zieleinem Material eine Funktion zu verleihen, die durch ein immobilisiertes Peptid ein-gebracht wird, wurden zwei Materialeigenschaften adressiert: die vernetzende undantimikrobielle Aktivitat. Dies wurde mit einem antimikrobiellen, als auch in paral-lelen Experimenten mit dem bereits in Abschnitt 5.1 auf S. 59 ff. untersuchten Peptid[1-1] verfolgt.Im Rahmen der Moglichkeiten, eine Funktionalisierung von Oberflachen uber elek-trostatische Wechselwirkungen, kovalente Anbindung oder mehrstufige Synthesen(’bottom-up’) zu erzielen, wurde sich dieser bedient. Daraus ergaben sich unter-schiedliche Experimente, die die Immobilisierung von den genannten Peptiden zumZiel hatten. Die Funktion und damit gleichbedeutend der Erhalt der Peptidaktivitatwurden mit entsprechenden Methoden anschließend getestet. In Tab. 5.4 sind alleExerimente der Oberflachenfunktionalisierungslinie zusammengetragen.

5.2. Oberflachenmodifikation mit Peptiden 85

Systemgrößen in der Proteinadsorption

extern intrinsich

Substrat

IonenstärkeMolmasse

leicht

hoch

IterationvonDomänen

IP Isoelektrischer Punktptm posttranslatinal modifiziertintensive Zusatndsgröße

Volumen/ Fläche

extensive Zustandsgröße

T

pH

Druck

Peptidkonzentration

zufälligeAA-Abfolge

AA Aminosäure

Sequenz

IP

Sekundärstruktur

Rauh-igkeit

Geo-metrie

A -

Energieo

exponierteStruktur

(Auto)-Oxidation

IP

Ord

nu

ng

de

sA

dso

rba

tsA -Mobilitäto

Anteileinzelner(ptm) AA

Pe

ptid

asso

zia

tio

n

Hofmeisterreihe

Abbildung 5.17: Parameterraum des Systems Peptidadsorption; die externen Großen befinden sichlinks und sind nach intensiven (orange) und extensiven (rot) Großen eingeteilt; rechts sind die Pep-tid intrinsischen Großen aufgefuhrt; in der Mitte sind Verflechtungen dargestellt, die horizontalenBegriffe sind aus den intrinsischen und externen Großen abgeleitete Parameter, die wiederum dieKonformation des Adsorbats und assoziierter Peptide vor und nach der Adsorption determinieren(Ao Oberflache).

5.2.1 Immobilisierung von Peptiden aufgrund elektrostatischerWechselwirkung

In den folgenden Experimenten wurde das Konzept der elektrostatischen Wechsel-wirkungen zwischen Peptid und Partikel ausgenutzt. Dazu wurde das vernetzendePeptid [1-1] mit TiO2 und das Mineral Hydroxylapatit mit dem antimikrobiellenPeptid ’Tet127’ inkubiert.Nachdem die Partikel gewaschen wurden, folgte ein Funktionsexperiment in dem dieangestrebte Materialeigenschaft: netzwerkbildende TiO2-Partikel und antimikrobiellwirkende Hydroxylapatitpartikel, getestet wurde. Die Partikelnetzwerke der TiO2-Partikel mit physisorbierten Peptiden wurde im TEM auf Unterschiede hinsichtlichdes vernetzend agierenden Peptids [1-1], im Vergleich zum Referenzpeptid [1-0] unter-sucht. Die Aktivitat der physisorbierten antimikrobiellen Peptide auf Hydroxylapatitwahrenddessen wurde gegen E.coli getestet.


Tabelle 5.4: Experimente zur Oberflachenfunktionalisierung mit Peptiden (* Partikel, ◦ Nitrocellu-lose, # Streptavidin auf Polypropylen, § Streptavidin-Biotin4-Komplex, ’bottom-up’ Partikel/Peptid-Synthese, HA Hydroxylapatit, antim. Akt. antimikrobielle Aktivitat, gg. gegen, WWWechselwirkun-gen).

Immobilisations- Substrat Peptid Funktions Methodekonzept experiment

elektrostatische WW TiO∗2 [1-1] Δ Vernetzung TEMelektrostatische WW TiO∗2 [1-0] Δ Vernetzung

elektrostatische WW NC◦

Tet127 antim. Akt. Tests

elektrostatische WW NC◦

Tet000 ¬antim. Akt. gg. E.coliREM

elektrostatische WW HA◦

Tet127 antim. Akt. Testselektrostatische WW HA∗ Tet000 ¬antim. Akt. gg. E.coli

kovalent (Au-S) Au∗ Cys-1-1 Δ Vernetzung TEMenzym. Polym. Kinetik

kovalent (Au-S) Au∗ Cys-1-0 Δ Vernetzungenzym. Polym.

koordinativ§ PP# Tet127 antim. Akt. Testskoordinativ§ PP# Tet000 ¬antim. Akt. gg. E.coli

’bottom-up’ TiO∗2 Tet127 antim. Akt. TestsMehrstufensynthese’bottom-up’ TiO∗2 Tet000 ¬antim. Akt. gg. E.coliMehrstufensynthese

Verhalten von adsorbiertem Peptid [1-1] und Peptid [1-0] auf TiO2

Untersucht wurden zwei Peptide, die sich von dem adhasiven Mefp1 ableiten. DerUnterschied dieser beiden Peptide belauft sich lediglich auf die in Position neunbefindliche Aminosaure. Diese Aminosaure wurde im ersten Teil der Arbeit aufihren Einfluß zur Adsorption und die Vernetzung der Peptide untereinander hinuntersucht. Das Peptid [1-1] verfugt in Position neun uber das vernetzend wirkendeKatechol DOPA, an dessen Position in Peptid [1-0] sich ein Tyrosin befindet.Zunachst wurde eine TiO2-Partikel-Suspension, wie in Abschnitt 4.1.10 auf S. 48beschrieben hergestellt, und mit den jeweiligen Peptiden inkubiert.

FunktionsexperimentDas Partikel-Peptid Gemisch (’TiO2 1-0’ und ’TiO2 1-1’) sowie jeweils eine Probezu der Natriumperiodat als Oxidationsmittel zugegeben wurde (’TiO2 1-0 ox’ und’TiO2 1-1 ox’) und die reine TiO2 Suspension nach Zugabe von Periodat (’TiO2 ox’)wurden getrocknet, um davon TEM-Aufnahmen angefertigt. In Abb. 5.18 sind dieErgebnisse einander gegenubergestellt.Die mitgefuhrte Referenz der reinen TiO2 Suspension, die nicht mit Peptiden in-


TiO 1-02 TiO 1-12

TiO 1-1 ox2TiO 1-0 ox2 TiO ox2

nativ

oxidiert

1-11-0

TiO2 TiO2

Abbildung 5.18: TEM-Aufnahmen der TiO2-Partikel nach Inkubation mit den Peptiden [1-0] (grau)und [1-1] (weiß) unvernetzt (oben) und vernetzt in Gegenwart von Periodat auch fur die Partikel-suspension ohne Peptid (unten).

kubiert wurde, zeigt uberwiegend kleine Agglomerate (< 500 nm) neben einigengroßeren (ca. 1-2 μm), die großtenteils separiert vorliegen. Sie sind damit um einVielfaches kleiner als die der peptidmodifizierten Partikel. Der Vergleich fuhrt zudem Schluß, dass die Agglomeration in ’TiO2 1-0’ eine Folge der elektrostatischenWechselwirkungen sein muß.Der Vergleich in Gegenwart eines Oxidationsmittels zeigte fur das katecholfreie Sy-stem ’TiO2 1-0 ox’ keine offensichtlichen Unterschiede zu dem nativen System (TiO2

1-0). Es entspricht den Erwartungen, dass die Oxidation auf diese Systeme keineWirkung ausubt.Ein deutlicher Unterschied besteht jedoch zwischen den Partikeln ’TiO2 1-0’ und’TiO2 1-1’. Wahrend das System ’TiO2 1-0’ ein ausgedehntes Agglomerat zeigtprasentiert sich das katecholhaltige System diffuser mit einer Flachenausdehnungvon ca. 70%. Daruberhinaus bildet ’TiO2 1-0’ dichtere Agglomerate als ’TiO2 1-1’,zu erkennen an den starkeren Kontrasten im TEM. Dieser Vergleich legt nahe, dassdas Katechol im System ’TiO2 1-1’ einen Einfluß auf die Partikelaggregation hat.Fur das oxidierte katecholhaltige System ’TiO2 1-1 ox’ bilden sich vernetzte Sruktu-ren, die sich aus weit verzweigten Anteilen mit hohen Aspektverhaltnissen (ca. 100)und kontraststarkeren kompakten Partikelagglomeraten zusammensetzen. Wobei diefeineren Strukturen Distanzen von ca. 4-5 μm zwischen den Agglomeraten gerich-tet uberbrucken. Damit unterscheidet sich das native System deutlich von seinemoxidierten Pendant. ’TiO2 1-1 ox’ wirkt im Vergleich zu ’TiO2 1-1’ entzerrt. Vorder Zugabe des Oxidationsmittels (’TiO2 1-1’) kam die Oberflachenaffinitat des Ka-


techols zum Tragen, wie auf S. 59 ff. in Abschnitt 5.1.1 erortert. Aufgrund dieserWechselwirkungen mit den TiO2-Partikeln bildet sich das eher zweidimensional auf-gefacherte Netzwerk aus. Diese weitlaufigen Strukturen aus vielen kleinen Agglome-raten kontrahierten spater infolge der Oxidation. Die Agglomeratgroße innerhalb desNetzwerkes steht im Zusammenhang mit der Oxidation des Katechols. Die nativenPeptid-Partikel ordnen sich uber π − π- und vdW-Wechselwirkungen an. Uberdiessind die Katechole der ’TiO2 1-1’-Partikel in der Lage koordinative Bindungen zuTiO2 auszubilden oder teilweise infolge von Autooxidation miteinander zu vernetzen.Dies hemmt die Flexibilitat der einzelnen Partikel und ein feinmaschiges Netzwerkentsteht. Da die einzelnen Agglomerate feiner verteilt sind, erscheinen sie im TEMauch heller. Die Gegenwart von Periodat beschleunigt diesen Vernetzungsprozess le-diglich.

Ein weiterer Einfluß auf die beobachteten Vernetzungsmuster stellt die Trocknung derProben dar. Die ’TiO2 1-1’-Partikel stellen das einzige System im Vergleich zu denanderen Referenzsystemen und seinem oxidierten Pendant dar, dass sich relativ homo-gen uber die Flache verteilt (ca. 70%). In diesem Kontext laßt sich vermuten, dass die-se ’TiO2 1-1’-Partikel ein stabileres Netzwerk formen, dass der durch den Trocknungs-prozess induzierten Aggregatbildung entgegenwirkt. Dies steht in Ubereinstimmungmit der Theorie zur koordinativen Bindung, die durch die Katechole zu den Titanzen-tren ausgebildet werden und moglichen Autooxidationsreaktionen, die Vernetzungennach sich ziehen.

Uberdies wurden auch Zetapotentialmessungen an diesem System durchgefuhrt, umsuspendierte modifizierte Partikel zu untersuchen. Die Zetapotentialunterschiede vorund nach der Peptidadsorption bewegten sich jedoch im Bereich des Meßfehlers derZetapotentialmessung.Durch diese Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Peptide durch elektrostati-sche Wechselwirkungen auf den TiO2-Partikeln adsorbieren. Weiterhin ließ sich in denTEM-Aufnahmen feststellen, dass die einzige Aminosaure, in der sich die beiden ge-testeten Peptide unterscheiden, zu einem signifikanten Effekt fuhrte. Die schwacherenKontraste im TEM und das entzerrte Agglomeratnetz stehen im sichtbaren Zusam-menhang mit den koordinierenden und vernetzenden Eigenschaften des Katechols.

Verhalten von adsorbiertem Peptid Tet127 auf Nitrocellulose

Eine Bewertung des Funktionalitatserhaltes wurde auch fur das adsorbierte antimi-krobielle Peptid Tet127 zunachst auf Nitrocellulose (NC) vorgenommen. Diese Vor-untersuchung wurde vor dem Hintergrund der generellen Aktivitat immobilisiertenPeptids Tet127 durchgefuhrt. Mit dem Ziel unter geringem Peptideinsatz die geeigne-te Konzentration mit einem antimikrobiellen Effekt nach erfolgter Adsorption diesesPeptids zu bestimmen, wurden hierfur Peptidlosung einer Konzentrationsreihe aufNitrocellulose, die sich auf einem Glassubstrat (FAST-Slides mit Nitrocellulose be-schichtet von Whatmann) befand, appliziert.

FunktionsexperimentIm Anschluß an die Inkubation wurde in einem ’Life/Dead-staining’ die Wirkunggegen das Bakterium E.coli aufgeklart. Dieser Test ermoglicht eine Unterscheidung invitale (grun) und letale (rot) Bakterienzellen in der Fluoreszenz. Der Unterschied dergetesteten Konzentrationen ist in Abb. 5.19 (oben) dargestellt. Fur die Stammlosung


(6,4 μmol/mL) konnte die angestrebte rote Farbung beobachtet werden. Die 1:10 und1:100 Verdunnungen dieser Peptidstammlosung zeigten noch Einflusse vitaler Zellen,deren Grunanteil eine orange Farbgebung infolge der Mischung rot angefarbter undgrun angefarbter Zellen verursacht.Erganzend wurden REM-Aufnahmen angefertigt, von einer Bakterienzelle innerhalbund von einer Zelle außerhalb des Bereiches, auf dem zuvor Peptid Tet127 appliziertwurde. Die Bakterienzellwand zeigte nach dem Kontakt mit Peptid Tet127 sichtbareSchaden im Vergleich zu einer intakten E.coli -Zelle. Die typische Bildung von Beulenauf der Zellwand ist ein sicherer Indiz fur die Aktivitat des Peptids [86].

Tet127 vs E.Coli E.Coli

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6,4 μL/mL 0,64 μL/mL 0,06 μL/mL

Abbildung 5.19: Ergebnisse der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen nach Life/Dead-Stainingder Nitrocellulose-Proben (oben); die Konzentration nimmt von links nach rechts um eineGroßenordnung ab; darunter sind links die REM-Aufnahmen der Bakterienzellen, die sich auf ei-nem mit Tet127 kontaminierten Spot (durch Schema Versuchsaufbaus in der Mitte des Bildes undentsprechende Pfeile angedeutet) und rechts abgebildet ist eine Zelle, die sich außerhalb der Konta-mination befand.

Mit diesem Test konnte der Erhalt der Funktionalitat fur das antimikrobielle PeptidTet127 auch nach einer Adsorption auf Nitrocellulose bestatigt werden, wobei die mi-nimale Konzentration fur Tet127 um eine letale Wirkung auf E.coli -Zellen zu erzielenzwischen 0,64 und 6,4 μmol/mL liegt. Gegen das ebenfalls gram-negative BakteriumPseudomonas aeruginosa wurde dies fur Tet127 bereits nachgewiesen [86]. Die zuvorermittelte ’Minimale Inhibitions Konzentration’ (MIC) gegen E.coli fur das PeptidTet127 in Losung belauft sich auf 0,06 nmol/mL. Dies bedeutet, dass nach der Ad-sorption auf Nitrocellulose noch ca. 1 % der Peptide, verglichen zu den Peptiden inLosung, aktiv waren.

Verhalten von adsorbiertem Peptid Tet127 auf Hydroxylapatit

Unter Berucksichtigung dieser Ergebnisse wurde die Adsorption von Peptid Tet127und dem Referenzpeptid Tet000 auf Hydroxylapatitpartikeln untersucht. Dazu wurdeeine Partikelsuspension mit den Peptiden inkubiert und im Anschluß gegen das Bak-terium E.coli getestet. Dies erfolgte in einem komplementaren Test, der sowohl denUberstand der abzentrifugierten Partikel mit den noch in Losung befindlichen Pep-tiden, als auch die Partikel mit potentiell physisorbierten Peptiden, berucksichtigt.


FunktionsexperimentDer Uberstand wurde nach der Inkubation der Partikel (80 mg) mit Peptid (50 mL,1 μM) wie auch die Partikel selbst einem Test gegen E.coli unterzogen.Hierfur wurden die Partikel in den Agar eingeruhrt und daraus Platten gegossen.Parallel dazu wurde ein Aquivalent des Uberstandes auf herkommlichen Agarplattenausplattiert. Diese Platten wurden schließlich mit einer Bakterienkultur uberimpftund hinsichtlich ihrer Unterschiede in der Bildung eines Bakterienrasens miteinanderverglichen. Die dabei entstanden Aufnahmen sind in Abb. 5.20 dargestellt.

HAp-127-Überstand HAp-127-Agar

HAp-000-AgarHAp-000-Überstand

Abbildung 5.20: Agar-Diffusions-Tests zu Physisorptionsuntersuchungen mit Peptid Tet127 undPeptid Tet000 auf Hydroxylapatit (ca. 0,05 μM Peptid pro m2 Partikeloberflache) gegen E.coli (jePlatte 100 μL einer 105 CFU/mL Kultur): mit dem Uberstand der Peptidlosung mit der die Partikelinkubiert wurden und der gewaschenen Partikel nach Inkubation, die vor dem Gießen der Platten inden LB-Agar eingeruhrt wurden.

Auf den ersten Blick lassen sich keine Unterschiede feststellen. Es handelt sich inallen vier Fallen um einen zu großen Teilen homogenen Bakterienrasen. Die nahereBetrachtung der Agarplatten mit eingearbeiteten Partikeln, die zuvor mit dem PeptidTet127 inkubiert wurden, zeigt Storungen der Bakterienbesiedelung. Da die Partikelagglomeriert vorliegen und sich nicht direkt an der Oberflache befinden, lassen sichdiese Hemmhofe eher als Hemmspharen beschreiben. Dies soll die Vergroßerung ei-nes Agglomerates in Abb. 5.20 verdeutlichen. Daraus laßt sich schlußfolgern, dassdas Peptid Tet127 wie schon fur Nitrocellulose demonstriert wurde, auch auf Hy-droxylapatitpartikeln adsorbiert. Das der Uberstand der Inkubationslosung, von derein Aliquot (500 μL) ausplattiert wurde, keinen bakteriziden Effekt zeigte, kann zweiGrunde haben:

Wenn die Konzentration der Peptide auf 1 normiert betrachtet wird, ergeben sichnach der Inkubation der Peptide mit den Hydroxylapatit-Partikeln (1-x) Tet127Peptide im Uberstand. Dabei entspricht x dem Anteil auf den Partikeln adsorbier-


ter Peptide. Entsprechend konnte der beobachtete Effekt des homogenen Bakteri-enrasens fur eine starke Adsorption der Peptide auf den Partikeln und damit eingroßes x sprechen. Die gegen E.coli bestimmte MIC von Tet127 in Losung betragt0,06 nmol/mL. Zu Beginn war die Konzentration der Peptidlosung 1 μmol, davonwurden 50 mL zugegeben und zuruckgewonnen. Eine Denaturierung der Peptidedurch Kontakt mit den Partikeln wird ausgeschlossen. Die Peptide sind zu klein, umSekundarstrukturelemente auszubilden, die eine Relevanz fur ihre Aktivitat hatten.Weiterhin ist bekannt, dass der antimikrobielle Wirkmechanismus dieser antimikro-biellen Spezies ihrem amphiphilen Charakter aus unpolaren Anteil und den positivgeladenen Seitengruppen zugeschrieben wird [173]. Es liegen folglich (50 − x) nmolPeptid in dieser Losung vor (x = 50x). Davon wurden im Aliquot 500 μL ausplat-tiert, die schließlich mit E.coli uberimpft wurden. Unter den folgenden Annahmenzur BET der Partikel (BETHA ≥10 m2/g) und der Belegung durch die Peptide inOrientierung an die Ergebnisse aus dem Abschnitt 5.1.1 (θ ≈0,5 Peptide/nm2) erge-ben sich fur 80 mg eingesetzter Partikel Belegungskapazitaten von ≥ 0,7 μmol. DieBerucksichtigung der eingesetzten Molmenge Peptid (50 nmol) bestatigt diese Ver-mutung zu x �−→ 50 nmol. Fur eine Adsorptionskapazitat von x �−→ 50 nmol waredie Peptidkonzentration im Uberstand unterhalb der MIC.

Insgesamt konnte die Ursache dieses Verlustes der Aktivitat auch im Versuchsauf-bau liegen. Um dies auszuschließen, wurde der Versuch zusatzlich mit Partikeln auspyrogener Kieselsaure (SiO2) mit einer BET von 90 m2/g (Aerosil90) durchgefuhrt.Das Protokoll zur Physisorption wurde analog dem vorausgegangenen Versuch an-gewandt. In Abb. 5.21 sind die Ergebnisse zusammengefaßt. Die resultierenden vierAgarplatten konnten mit Blick auf mogliche Schwachen des Tests bewertet werdenund bestatigten die Gultigkeit dieses Funktionsexperiments.

Aerosil-127-Agar

Aerosil-000-Überstand

Aerosil-000-Agar

Aerosil-127-Überstand

Tet-127Tet-000

Aerosil90

Aerosil90

�

Abbildung 5.21: Agar-Diffusions-Tests zu Physisorptionsuntersuchungen mit Peptid Tet127 undPeptid Tet000 auf pyrogener Kieselsaure (Aerosil90) gegen E.coli : mit dem Uberstand der Pep-tidlosung mit der die Partikel inkubiert wurden (oben) und der gewaschenen Partikel nach Inkuba-tion, die vor dem Gießen der Platten in den Agar eingeruhrt wurden (unten).

Darin sind deutliche Unterschiede zwischen der mitgefuhrten Referenz des nicht wirk-


samen Peptids Tet000 (Abb. 5.21 oben links) und den Agarplatten mit dem antimi-krobiell aktiven Peptid Tet127 (Abb. 5.21 rechts) zu erkennen. Dies laßt sich fur diePlatten, in denen die Partikel mit adsorbiertem Peptid eingearbeitet wurden, nichtfeststellen. Mit Ausnahme einer Agarplatte bildete sich uberall ein dichter Bakteri-enrasen. Die Agarplatte, die zuvor mit einem Aliquot des Uberstandes aus der In-kubationslosung mit Peptid Tet127 prapariert wurde, zeigte keinen homogenen Bak-terienrasen, sondern (noch) unterscheidbare ’Kolonien formende Einheiten’ (CFU).Das Bakterienwachstum verlief gehemmt im Vergleich zu den ubrigen Agarplatten.

Die Agarplatte mit den Aerosil90-Partikeln, die mit Tet127 inkubiert wurden, zeigtekeine Hemmspharen. Damit laßt sich im Umkehrschluß sagen, dass die Adsorptionder angebotenen Peptide auf der Aerosiloberflache nicht ausreichte, um einen meßba-ren Effekt zu erzielen. Dieser Effekt konnte hingegen fur das Mineral Hydroxylapatit,auf dem Tet127 adsorpiert vorlag, beobachtet werden. Dass es sich mit großer Wahr-scheinlichkeit nicht um konformationsbedingte Einbußen der antimikrobiellen Akti-vitat handelt, laßt sich ebenfalls aus dem Vergleich mit den komplementaren Plattender Uberstandsaliquote schliessen. Im Uberstand der Tet127-Losung nach Inkubati-on mit Aerosil90 genugte die Peptidkonzentration um einen wachstumshemmendenEffekt auf E.coli auszuuben. Dies verhielt sich fur Hydroxylapatit invers.Es handelt sich in den durchgefuhrten Experimenten um qualitative Betrachtungen.Fur eine quantitative Auswertung bedarf es einer Kalibrierreihe. In dieser mussendefinierte Peptidkonzentrationen auf Agarplatten ausgestrichen werden und in einerMehrfachbestimmung, nach Uberimpfen mit E.coli hinsichtlich der gebildeten Kolo-nien (CFU) korreliert werden.

5.2.2 Immobilisierung von Peptiden uber gezielt aufgebaute Bin-dungen

Die folgenden beiden Experimente greifen zwei Moglichkeiten einer Immobilisierungvon Peptiden auf Partikeln uber starke Bindungen auf. Eine Moglichkeit besteht inder Ausbildung einer kovalenten Bindung, die an Peptid Cys-1-1 auf kolloidalem Golduntersucht wurde. Die andere Moglichkeit stutzt sich auf die Nutzung hoher Kom-plexbildungskonstanten wie sie fur das antimikrobielle Peptid Tet127 getestet wurde.Wie schon im vorherigen Abschnitt wurden die Anderungen der Materialeigenschaf-ten, die durch das katecholhaltige Peptid [1-1] und das antimikrobielle Peptid Tet127beabsichtigt wurden, in entsprechenden Funktionsexperimenten verfolgt.

Modifikation von kolloidalem Gold

Die Immobilisierung durch Chemisorption wurde am System, in Losung stabilisierterGoldnanopartikel mit Peptiden durchgefuhrt. Neben der ’originaren’ Dekasequenzdes Mefp1 inspirierten Peptids [1-1], welches in Spacer eingebettet und mit einemCys-Tag ausgestattet wurde (Cys-1-1), wurde auch das entsprechend getaggte Pep-tid, mit einem Tyrosin anstelle des Katechols in der Sequenz, Cys-1-0 untersucht.Die Notwendigkeit eines Spacers an dieser Stelle wird in Abschnitt 4.1.3 auf S. 37besprochen. Weiterhin wurden Systeme mitgefuhrt, in denen das vorgelegte Peptidkein Cystein-Tag, dafur drei Wiederholungseinheiten von Peptid [1-1] vorwies (Peptid


[3-3]) und ein Histonsequenzausschnitt mit einem Cys-TagIV. Histone sind globulareChromatinstrukturproteine mit hohem Aggregationspotential [91].Diese beiden Proteine wurden als Positivkontrolle, im Fall des Strukturproteinaus-schnitts und als interne Referenz fur ein vernetzendes Peptid ohne Cys-Tag genutzt.

Funktionsexperiment aVon den Partikel/Peptid Mischungen (3/50 m%) wurde je die Halfte abgenommenund mit dem Oxidationsmittel Natriumperiodat versetzt. Im Anschluß wurden alleSysteme im TEM untersucht. Die TEM-Aufnahmen sind in Abb. 5.22 dargestellt.Die Aufnahmen bestatigen in Teilen die Erwartungen, die diesem Experiment vor-ausgingen. Es zeigten sich aber auch unerwartete Bilder.

Au-Cys-1-1 Au-Cys-1-0 Au-Cys-Histon Au + 3-3

nativ

oxidiert

Abbildung 5.22: TEM-Aufnahmen der Goldpartikel/Peptid-Systeme mit nativen Peptiden (oben)und den entsprechenden Systemen in Gegenwart eines Oxidationsmittels (unten); von links nachrechts: Partikel die mit Peptid Cys-1-1, Peptid Cys-1-0, ’Histon’-Fragment und Peptid [3-3] inkubiertwurden; die Referenz der reinen Partikel in Gegenwart von Natriumperiodat (rechts unten); zusatzlichsind STEM-Aufnahmen dieser Systeme von einer anderen Position auf dem Grid dargestellt (MaßstabTEM/STEM 1:10).

Das katecholhaltige System mit Cys-Tag (Au-1-1) ahnelt im nativen Zustand seinemTyrosinpendant (Au-1-0). Die Partikel von ’Au-1-1’ liegen feiner verteilt vor und bil-den zuweilen kleine Agglomerate (siehe STEM in Abb. 5.22). Das oxidierte System(Au-1-1-ox) hingegen bildet großere Agglomerate aus 200-300 Partikeln, wahrend dasZwillingssystem ohne DOPA sich nicht sichtbar von dem nicht oxidierten (Au-1-0)unterscheidet.Die ubrigen mitgefuhrten Referenzen zeigen ebenfalls Agglomerate. Das System mitder Positivreferenz (Au-’Histon’) bildet im nativen Zustand gigantische Partikelkon-strukte (siehe STEM in Abb. 5.22), die um eine Großenordnung ausgedehnter als diedes Systems ’Au-1-1-ox’ sind.Im Gegensatz zu ’Au-1-1-ox’ nehmen die Agglomerate der Positivreferenz (Au-’Histon’) fur das oxidierte System zahlenmaßig zu und folglich in ihrer Große starkab.

IVC(A)4PATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKA


Das Peptid ohne Cystein-Tag (Au-3-3) zeigte sowohl im nativen als auch im oxidiertenZustand Agglomerate ahnlicher Ausdehnung. Die Agglomerate der beiden katechol-haltigen Systeme in Gegenwart eines Oxidationsmittels (Au-3-3-ox und Au-1-1-ox)unterscheiden sich in ihrer Große und hinsichtlich ihrer Packungsdichte. Das Systemmit Cys-Tag ist dichter und bildet nur etwa halb so große Agglomerate im Vergleichzum Referenzsystem (Au-3-3-ox).Die reinen Goldpartikel, die oxidiert wurden, zeigten ebenso interessanteVeranderungen der Partikel. Einige der 20 nm großen Partikel bildeten Agglome-rate. Und im Gegensatz zu den ubrigen TEM-Aufnahmen sind in diesem Systemdiffuse Verteilungen kleinerer Partikel erkennbar. Im EDX wurde sichergestellt, dasses sich bei den Partikeln, die deutlich kleiner sind als 20 nm, um Gold handelte.

Den Erwartungen folgend wurde ersichtlich, dass das katecholhaltige System ’Au-1-1’auf das Oxidationsmittel anspricht, wahrend sich das System ’Au-1-0-ox’ unverandertgegenuber dem nativen System zeigte.Damit laßt sich festhalten, dass der gewahlte Spacer am Cystein-Terminus in derLage ist, die Stabilisierung durch Citrat aufzubrechen und gegen eine Gold-Schwefel-Bindung auszutauschen, wie es auch von Lvy et al. fur diesen Spacer beschriebenwurde [144]. Die resultierenden Goldnanopartikel liegen schließlich durch die Pep-tidhulle stabilisiert im wassrigen Milieu vor. Ware dies nicht der Fall, wurden furdiese Systeme Agglomerate zu erwarten sein, wie es fur die interne Referenz (Au-3-3)zu beobachten war [174].Die Beobachtungen entsprechen den durch die unterschiedlichen Sequenzen beding-ten Erwartungen. Die in ’Au-1-1’ enthaltene Aminosaure DOPA ist in der Lage durchOxidation querzuvernetzen. Unter der Annahme, dass sich die Peptide auf der Gold-oberflache gleichmaßig verteilt haben, konnen diese oder assoziierte Peptide intermo-lekular wechselwirken und kovalente Bindungen untereinander ausbilden. Die Partikelliegen somit integriert in einem dreidimensionalen Peptidnetzwerk vor. Eine Entwick-lung, die das Referenzsystem (Au-1-0-ox) nicht erwarten lies und auch nicht zeigte.Die Positivreferenz (Au-’Histon’) hingegen zeigte Agglomerate, die die Große der’Au-1-1-ox’-Agglomerate um den Faktor 10 uberschritten und mit hohen Packungs-dichten sehr helle Kontraste im STEM zeigten.Den Histonen wohnt ein hohes Agglomerationspotential inneV, weshalb sie als Po-sitivreferenz mitgefuhrt wurden. Im Vergleich zu den beiden anderen Peptiden miteinem Cys-Tag, ist dieses Peptid schwerer (M′Histon′=2638,21 g/mol). Demnach se-dimentierten die Partikel schneller, wahrend die anderen peptidstabilisierten Partikelnoch stabil in Losung vorlagen. Als Konsequenz der Sedimentation kam es schnellerzu einer lokalen Erhohung der Partikelkonzentration. Dadurch konnten mehr Partikeluber ihre oberflachengebundenen Peptide miteinander wechselwirken und ausgedehn-te Agglomerate bilden.Offenbar wirkt sich die Oxidation des Histonfragmentes nachteilig auf die Aggregationaus, wie sich aus den bedeutend kleineren und zahlenmaßig gehaufteren Agglomera-ten schliessen laßt. Dies stimmt mit der Feststellung uberein, dass oxidierte Proteineschlechter adsorbieren [52] (Abschnitt 5.1, S. 59).Das IO−4 -Ion tritt moglicherweise als Gegenion an den Lysinseitenketten auf. Damitwurde die Wasserstoffbruckenbildung gestort und die intermolekularen Wechselwir-

VDies ruhrt von ihrer Funktion als DNA-Faltungshelfer-Protein her. Als basische Proteine agierensie wie eine Spule an die sich das Chromatin bindet [91].


kungen und daruber die Agglomeratbildung behindert.Interessant verhielt sich ebenso das Peptid [3-3] ohne Cys-Tag. Hier wird eine Che-misorption ausgeschlossen. Die gebildeten Agglomerate sind einzig den adsorbiertenPeptiden und deren intermolekularen Wechselwirkungen zuzuschreiben.Es muß zunachst von einer lysinvermittelten Wechselwirkung mit der Goldober-flache ausgegangen werden. Unter Berucksichtigung dessen ergeben sich neben derMoglichkeit der ’end-on’ Konformation, wie sie fur die Cys-Tags postuliert wird,erhohte Wahrscheinlichkeiten fur die ’side-on’ Adsorption. Diese beiden Extrema die-nen an dieser Stelle nur der besseren Vorstellung, tatsachlich handelt es sich um eineMischordnung mit entsprechenden Konformationsanteilen (siehe Abschnitt 2.2 aufS. 15). Dies außert sich in einem kleineren Belegungsgrad θ. Im direkten Vergleichmit dem ca. 30 % leichteren Histonfragment laßt sich dies aus den Unterschieden inder Partikelgroße ableiten. Da θAu−′Histon′ > θAu−3−3 ist, ist ein ’Au-3-3’-Partikelleichter und sedimentiert langsamer.

Desweiteren kommt der absoluten Anzahl an Katecholen im System eine Rolle zu. Dadie Sequenz ein dreifach iteriertes Peptid [1-1] darstellt, muß von derselben DOPA-Dichte innerhalb dieser Peptide ausgegangen werden. In der Losung des Peptids [3-3]liegen dreimal soviel DOPA-Gruppen vor, wie fur die des Peptids Cys-1-1 (infolge derverwendeten Massenkonzentration und der Molmassenunterschiede die zugrundelie-gen). Aufgrund der unterstellten hoheren DOPA-Konzentration nahe der Goldpar-tikeloberflache infolge der Adsorptionskonformation verstarkte sich die Interaktionund fuhrte zu Aggregation unter gleichzeitiger Partikelinkooperation (Au-3-3).Uberdies mussen auch die Autooxidationsreaktionen berucksichtigt werden. Dieskonnte erklaren, weshalb kein erkennbarer Unterschied zwischen dem nativen undoxidierten System vorliegt (Au-3-3 und Au-3-3-ox). Dies konnte auch der Grund furdie eher gerichteten Agglomerate denn dichteren Packungen wie fur ’Au-Histon’ und’Au-1-1-ox’ sein.Ein weiteres Mysterium ergab sich in der als Negativreferenz mitgefuhrten Probe derreinen Goldpartikel in Gegenwart des Oxidationsmittels. Das Auftreten der Goldpar-tikel, mit deutlich weniger als 20 nm Durchmesser legt nahe, dass sich das Oxida-tionspotential infolge der Nanodimensionen zu negativeren Werten verschoben hat.Der hohe pH-Wert fuhrt ebenfalls zu einer Absenkung des Potentials. Damit konntees dem Anschein nach zu einer Oxidation von Gold kommen, die jedoch reversibelist. Aus diesem Grund entstanden kleinere Partikel. Dass es in den ubrigen Systemennicht zur Bildung dieser Partikel kommt, konnte der Passivierung der Oberflachedurch adsorbierte oder kovalent angebundene Peptide zugeschrieben werden.

Es handelt sich bei diesem Experiment um die Einfuhrung eines potentiell vernetzendagierenden Peptids auf Goldpartikeln. Mit den Aufnahmen im TEM konnte auchfur die uber eine Schwefel-Gold-Bindung kovalent gebundener Peptide der Erhaltdieser Funktionalitat, uber die Immobilisierung hinaus, gezeigt werden. In einemanalogen Experiment, jedoch in Gegenwart von Laccase als ein oxidierendes Enzymanstelle des NaIO4, wurde die Kinetik dieser modifizierten Systeme uber einenFarbumschlag studiert. Statt des in den vorherigen Experimenten verwendetenNaIO4, mit hohem Oxidationspotential und folglich zugigem Umsatz, wurde diePhenoloxidase Laccase eingesetzt. Dies wurde in Bildern zu drei Zeitpunktenfestgehalten. Da Tyrosin ebenso wie Katechol durch das verwendete Enzym Laccaseoxidiert wird, wurden hierfur lediglich die Systeme Au-Cys-1-0 und Au-3-3 verwendet.


Funktionsexperiment bZunachst wurde die Peptidlosung kurz nach Zugabe der Enzymlosung und vor Zuga-be der Goldnanopartikel in Bildern festgehalten (t0). Danach wurden die Goldparti-kel eingeimpft (≈ 0,01 %-ige Suspension) und davon ein Bilddokument erstellt (t1).Schließlich wurde nach 2 Stunden Inkubationszeit bei 43◦C ein letztes Bild aufge-nommen (t2). In Abb. 5.23 sind die einzelnen Bildreihen zusammengefaßt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

t0, before adding Au-Nanoparticle

t1 immediatly atfer adding Au (20 nm)

t2

3-3 3-3Laccase

3-3LaccaseAu 20 nm

LaccaseAu 20 nm

Cys-1-03-3

Au 20 nm

Cys-1-0LaccaseAu 20 nm

Cys-1-0

Au 20 nm Au 20 nmLaccase

Abbildung 5.23: Dokumentation der Modifikation von kolloidalem Gold (20 nm) mit einem Laccase-substrat vor der Zugabe von Goldpartikeln (t0), direkt danach (t1) sowie nach 2 Stunden Inkubation(t2). Folgende Referenzen und Proben wurden untersucht: reine Peptidlosung des cysteinfreien Pep-tids [3-3] (1) und des Peptids Cys-1-0 (5), die Goldpartikel (8) und die Laccaselosung (10); das Peptid[3-3] mit Laccase (2) und zusatzlich in Gegenwart von Goldpartikeln (3), ebenfalls Peptid [3-3] inGegenwart von Goldpartikeln ohne Laccase (4), analog das Peptid Cys-1-0 mit Laccase (6), Laccaseund Goldpartikel (7) und Goldpartikel in Gegenwart von Laccase ohne Peptid (9).

Die Reihe t0 zeigte keinerlei optische Unterschiede, mit Ausnahme der Reaktions-gefaße, in denen sich die gelblich gefarbte Enzymlosung zusammen mit Peptid [3-3]befand. Direkt nach der Goldpartikelzugabe laßt sich fur zwei Proben bereits ein Un-terschied feststellen:Die Losung des Peptids Cys-1-0 im Gemisch mit Enzym und Goldpartikeln (7) zeigtim direkten Vergleich mit den reinen Partikeln in identischer Verdunnung (8), eineVerschiebung der Farbe der Losung von rot (8) zu blau (7). Fur das Gemisch ausPeptid [3-3]/Partikel/Enzym (3) ergibt sich ebenfalls eine Farbanderung zu orange-rot.Nach der Inkubation (t2) verstarken sich die beobachteten Farbeffekte. Die Peptid[3-3]/Enzym-Losung (2) schlug in einen rotbraunen Farbton um, wahrend die Losungin Gegenwart der Partikel (3) tiefbraun erscheint. Auf die Goldpartikellosung ubt dasPeptid [3-3] keinen sichtbaren Effekt aus (4). Der Vergleich mit Peptid Cys-1-0 zeigtdagegen eine optische Veranderung in Gegenwart des Peptids in der Losung (7). Dieswurde bereits direkt nach Beimpfen der Peptidlosung mit den Partikeln sichtbar. Diezunachst nach blau verschobene Farbung verblasst wahrend der Inkubation deutlich.Das Gemisch aus Peptid Cys-1-0 mit Au-NP und Enzym (6) zeigt ebenso, verglichen


mit reinem kolloidalen Gold (8) eine Verschiebung der Farbgebung. Diese Losung be-sitzt nun einen violetten Anteil, wobei es sich nicht um dieselbe Kolorierung handeltwie in (7) zum Zeitpunkt t1 oder t2.Die mitgefuhrten Referenzen (1),(5),(8),(9) und (10) ist allen gemein, dass sie keiner-lei Farbanderungen oder Prazipitation vorweisen.

Die moglichen Reaktionen, die durch den enzymatischen Umsatz mit Laccase ange-nommen werden, sind in Abb. 5.24 skizziert. Das Enzym oxidiert an seinem kup-ferhaltigen Reaktionszentrum den Phenolring. Dieser ist nun in der Lage in einerMichaelreaktion weiter zu reagieren (rot-blau) oder auch di-Phenole (blau-blau) zubilden [175].

NH

2

+NH

NNH

O

O

NH3

+

O

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NH

O

NN

NH

NH

O

OH

O

OCH

3OH

O

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NH3

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Abbildung 5.24: Erwartung basierend auf den theoretischen Uberlegungen an die enzymatischeOxidation eines auf Goldpartikeln immobilisierten Enzymsubstrates: dargestellt sind zwei moglicheReaktionen, die durch das Enzym katalysiert werden (ganz rechts und links, in Anlehnung an [175]),die resultierenden Vernetzungsreaktionen (jeweils zur Mitte hin) und eine Vorstellung des Netzwerkes(Mitte), an den Flanken sind die Vernetzungsstellen ubertrieben hervorgehoben.

In Abb. 5.25 ist die zuletzt aufgenommene Situation, der Systeme nach Inkubati-on, photographisch festgehalten und zusammen mit den beschriebenen Erwartungenschematisch skizziert.

Vor der Zugabe der Goldpartikel (t0) hebt sich die Losung des Peptids [3-3], dasmit Enzymlosung versetzt wurde (2) und (3), durch eine gelbliche Farbung von denubrigen Proben ab. Dies laßt sich auf den DOPA-Gehalt in der Losung zuruckfuhren.Das Peptid Cys-1-0 enthalt kein DOPA und spricht daher nicht so rasch auf diePhenoloxidase (6) an. Zum Vergleich: in Peptid [3-3] sind drei Tyrosine und dreiDOPA-Seitenketten vorhanden, wahrend in Peptid Cys-1-0 zwei Tyrosine als Lacca-sesubstrate zur Verfugung stehen. Die gelbliche Farbung ist ein Indiz fur die Oxidati-on der DOPA-Gruppen, diese Farbanderungen ließen sich fur die bisher untersuchtenDOPA-Oxidationen ebenfalls beobachten (siehe Bruchflachen in Abb. 5.15 auf S. 81).Eine Oxidation aufgrund des pH liegt nicht vordergrundig vor, da der Farbumschlagerst nach Zugabe der Enzymlosung eintrat.

Das gleichermaßen als Laccasesubstrat geltende Cys-1-0 zeigte zum Zeitpunkt der


t2

NH2

NNH

O

OH

O

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NH2

NNH

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O H

O

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O

O

3-3 3-3Laccase

3-3LaccaseAu 20 nm

LaccaseAu 20 nm

Cys-1-03-3

Au 20 nm

Cys-1-0LaccaseAu 20 nm

Cys-1-0

Au 20 nm Au 20 nmLaccase

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abbildung 5.25: Photodokumentation der Modifikation von kolloidalem Gold (20 nm) mit unter-schiedlichen Laccasesubstraten (Peptid [3-3] und Cys-1-0) nach Inkubation (2h). Dargestellt sind diereinen Peptidlosung, des cysteinfreien Peptids [3-3] (1) und des Peptids Cys-1-0 (5), die Goldpartikel(8), die Laccaselosung (10), Peptid [3-3] mit Laccase (2), Peptid [3-3] mit Laccase in Gegenwart vonGoldpartikeln (3), Peptid [3-3] in Gegenwart von Goldpartikeln ohne Laccase (4), analog das PeptidCys-1-0 mit Laccase (6), im Gemisch aus Laccase und Goldpartikeln (7) und mit Goldpartikeln ohneEnzym (6), ebenfalls zum Vergleich die Goldpartikel in Gegenwart von Laccase ohne Peptid (9); imoberen Teil des Bildes sind die Erwartungen zu den Verhaltnissen in Losung schemenhaft dargestellt.

Enzymzugabe keinen Farbumschlag (6), sondern die Farbe der Referenzmischungaus den Partikeln mit Laccase (9). Diese Diskrepanz in der Kinetik gegenuber Pe-riodat war aufgrund der chemischen Unterschiede absehbar. Dennoch verandertensich beide Peptid/Partikel/Enzym-Systeme (3) und (6) wahrend der Inkubation. ImFall der 3-3-Enzym-Au-NP (3) farbte sich die Losung von orange, zum Zeitpunkt t1,zu tiefbraun (t2). Da die Goldnanopartikel ihrerseits ebenfalls infolge der Plasmo-nenresonanz optisch in Erscheinung treten, uberlagern sich diese im Gemisch aus (3)mit der typischen Farbe von Oxophenol. Die Betrachtung des Vergleichssystems ohnePartikel (2) unterscheidet sich daher um einige Farbnuanzen.

Die Goldnanopartikel zeigen infolge der Plasmonenresonanz eine großenabhangigeWellenlangenabsorption [176]. Mit der Zunahme der Große ist eine Farbverschiebungzu erkennen. Diese konnte in der Losung des Systems Cys-1-0/Partikel/Enzym beob-achtet werden (7). Aufgrund des fehlenden Cys-Tag zeigte die entsprechende Probemit Peptid [3-3] (4) keine Farbanderung. Die Partikelgroße hat sich nicht sichtbargeandert, was der veranderten Adsorptionskonformation mit resultierendem kleine-ren θ zugeschrieben werden kann.Da die Farbverschiebung mit der Große der Partikel korreliert, folgen aus dem Ver-gleich der Systeme Cys-1-0/Partikel mit (6) und ohne Enzym (7), sowie mit derLaccasereferenz (9) vor der Inkubation (t1), großere Partikel fur die Losung ohneEnzym (7) [144, 177, 178]. Dies kann auf die chemisorbierten Peptide zuruckgefuhrtwerden [179].

Das die Farbe der Losung des Systems Cys-1-0/Partikel (7) wahrend der Inkuba-tion verblaßte, deutet dies auf eine Sedimentation hin. Dies ware eine Folge derUberschreitung einer kritischen Masse, die von Wechselwirkungen zwischen Peptidenunterschiedlicher Partikel herruhren. Die assoziierten Partikel sinken ab und die Far-be der Losung verblaßt. Diese Entwicklung konnte fur das enzymhaltige System (6)nicht verfolgt werden. Die Farbe der Losung nach der Inkubation erfuhr eine farblicheVeranderung und unterschied sich indes von der Referenz ohne Peptid (9). Infolgeder Argumentation zur Vernetzung durch das Enzym wurden netzwerkstabilisierte


Partikel in dieser Losung vermutet, wie auch schemenhaft in Abb. 5.25 uber Probe(6) dargestellt [180].

Die beiden Funktionsexperimente a) und b) konnten den Erhalt der Funktionalitatmittels Au-S-Bindungen fur chemisorbierte Peptide bestatigen. Dies gelang in denUntersuchungen im TEM und auch durch Bewertung von Veranderungen der Plas-monenresonanz, die die kolloidalen Goldpartikel verursachen, wahrend einer enzyma-tischen Polymerisation.

Immobilisierung durch Ausbildung eines Streptavidin-Biotin4-Komplexes

Unter eine Immobilisierung eines Peptids uber definierte starke Bindungen fallenauch die Ausbildung koordinativer Bindungen, wie sie in Komplexen vorliegen. Dasgewahlte System aus Streptavidin und Biotin eignet sich aufgrund seiner hohenKomplexbildungskonstante (KB ≈ 1014mol−1) [143]. Dieses Experiment wurdeunter Einsatz des antimikrobiellen Peptids Tet127 hinsichtlich seiner Aktivitatgegen E.coli getestet. Durch die Ausbildung von Streptavidin-Biotin4-Komplexenwurde das biotinylierte Peptid auf die Wand einer mit Streptavidin-immobilisiertenMikrotiterplatte (Nunc Immobilizer Streptavidin F96 auf Polypropylen von ThermoFisher Scientific) gebracht. Die Vertiefung wurde nach Inkubation mit dem Peptidmehrfach gewaschen, um sicherzustellen, dass eine Physisorption von Peptidenausgeschlossen werden kann.

FunktionsexperimentIm Anschluß an die Inkubation der biotinylierten Peptide mit den Avidinmodifi-zierten Mikrotiterplatten wurde diese mit einer Bakteriensuspension uberimpft undinkubiert. Danach wurde die Suspension in eine sterile Zellkulturplatte uberfuhrt undeine Wachstumskurve aufgenommen.

In Abb. 5.26 sind die einzelnen Schritte zusammen mit der aufgenommenen Wachs-tumskurve dargestellt. Darin ist neben der Wachstumskurve des immobilisierten Pep-tids Tet127 auch die des Referenzpeptids Tet000 und die einer unbehandelten Vertie-fung dargestellt. Die beiden Referenzen zeigen einen nahezu identischen Verlauf. DieKultur, die der Vertiefung mit angebundenem Tet000 entstammt, geht ca. 30 minspater, als die Referenzlosung, in das progressive Wachstum uber. Beide verlaufenjedoch nach ca. sechs Stunden deckungsgleich.

Die Kultur, die in den Vertiefungen mit immobilisierten Tet127 inkubiert wurde, zeigtkein Wachstum und verlauft parallel zur x-Achse. Dies entsprach den Erwartungenan die uber starke koordinative Bindungen immobilisierten Peptide [177, 180].

Zusammenfassend kann fur die Immobilisierung von Peptiden uber kovalente oderstarke koordinative Bindungen konstatiert werden, dass in den durchgefuhrten Ex-perimenten fur jedes Peptid der Erhalt seiner Funktion nachgewiesen werden konnte.Dies betrifft die Nutzung der effizienten Reaktion zwischen Thiolen mit Gold, dieden Aufbau gerichteter Monolagen auf Goldoberflachen ermoglicht [179]. Dies wurdedurch die Peptide mit Cys-Tag realisiert und mit Blick auf die vernetzende Funktiondes Peptids im TEM gezeigt. Im Zusammenhang mit der ausgepragten Plasmonenre-sonanz der verwendeten Goldnanopartikel eignet sich die Kombination der uber dasCystein mit Thiol terminierten Peptide als indikatives System [177, 180]. Dies wurde


Avidin /Streptavidin

Biotyniliertes Peptid

Biotin

Biotin-Tet-000 Biotin-Tet-127

Waschen

Inkubation

InkubationBakterien

Abbildung 5.26: Skizze der einzelnen Prozessschritte fur die Testung der Funktionalitat des ge-richtet und permanent immobilisierten Peptids Tet127 um die Wachstumskurve (Mitte, rechts) auf-zunehmen: Streptavidin praparierte Zellkulturplatte inkubiert mit Peptid, danach Aufnahme derPeptidlosung und Mehrfachwaschungen der Vertiefungen, Zugabe einer Bakterienkultur in Minimal-medium, nach vier Stunden Inkubationszeit Uberfuhrung von zwei Drittel der Suspension in einesterile Zellkulturplatte und Dokumentation des Wachstums durch einen Multimodereader.

anhand der kinetischen Studien unter Verwendung des Enzyms Laccase gezeigt.Die Immobilisierung eines Peptids unter Nutzung der hohen Komplexbildungskon-stante von Streptavidin mit Biotin wurde unter Verwendung des biotinylierten anti-mikrobiellen Peptids demonstriert. Auch hier konnte kein Verlust der Funktionalitatdes Peptids verzeichnet werden.

5.2.3 Partikel/Peptid-Hybride

Inspiriert durch andere Arbeiten, die sich mit der Funktionlisierung von TiO2-Nanopartikeln als potentielle Fullstoffe fur Kondensatoren beschaftigen, wurde dasdarin angewandte ’bottom-up’ Konzept auf die Studie einer mehrstufigen Immobi-lisierung von Peptid ubertragen [148]. Die Kombination mit einer ’Click’-Reaktionfuhrte zum Synthesekonzept eines Partikel/Peptid-Hybrids (S5) [147].Die Partikel wurden zunachst silanisiert und gleichzeitig mit einer Bromfunktion aus-gestattet. Diese sollte im nachsten Schritt in ein Azid uberfuhrt und schließlich einer’Click’-Reaktion mit unterschiedlichen Alkinen unterzogen werden. Nach jeder Syn-


thesestufe wurden die Partikel IR-spektroskopisch und thermogravimetrisch unter-sucht. Das immobilisierte funktionelle Peptid sollte nach der bottom-up-Synthese imVergleich zu einem entsprechend immobilisierten funktionslosen Referenzpeptid, eineantimikrobielle Wirkung gegen das Bakterium E.coli zeigen. In Abb. 5.27 sind dieeinzelnen Stufen der Umsetzung der TiO2-Partikel zu einem Partikel/Peptid-Hybridzusammengefaßt.

O SiO

O

NN

N

OR

O SiO

O

Br

O SiO

O

N-

N+

N

b) NaN3

a) Br-(CH ) Si(OCH )2 11 3

Toluol

DMF

c) Alkin

t-BuOH/H O2

R = OH, Tet000, Tet127

TiO2

Abbildung 5.27: Synthese des Partikel/Peptid-Hybrids an TiO2 (graue Kugel); a) Silanisierungmit 11-Bromundecyltrimethoxysilan (S2), b) Azidierung mit NaN3 (S3), c) Clickreaktion mit dreiunterschiedlichen Alkinen (4-Pentinsaure, sowie den Peptiden pa-Tet000 und pa-Tet127) (S4a-c).

11-Bromundecylsilan-TiO2 (S2)Die TiO2-Partikel wurden mit 11-Bromundecyltrimethoxysilan wie in Abschnitt4.1.10 auf S.53 beschrieben silanisiert (S2). Die IR-spektroskopische Untersuchung,der intensiv gewaschenen Partikel zeigte eine Absorption zwischen 600-500 cm−1,die der C-Br Bindung zugeordnet werden kann. Außerdem wurden die typischenAbsorptionsbanden der aliphatischen -CH2 Deformationsschwingungen (1467 cm−1)gemessen. Die thermogravimetrische Analyse (TGA) zeigte zwei Stufen des Massen-verlustes. Die erste im Bereich 268◦C ± 20◦C (2,6 %) und die zweite im Bereich405◦C ± 30◦C (3,2 %). Daraus ergab sich eine absolute Massenzunahme von 5,8 %fur die organischen Bestandteile.

Fur die Silanisierung von SiO2-Partikeln wurde von Ranjan und Brittain eineOberflachenbeladungen mit ca. 3,7 Bromgruppen/ nm2 bestimmt [147]. Durch dieAbschatzung, dass die Partikel mit einer BET von 50 ± 15 m2/g nach der Suspensionin einer 2%-igen 11-Bromundecyltrimethoxysilanlosung vollstandig silanisiert vorlie-gen, folgt daraus eine theoretische Beladung der Oberflache mit ca. 1,84 ·1020 Brom-gruppen pro Gramm fur (S2). Ungeachtet der Tatsache, dass die Partikel wahrendder Silanisierung teilweise agglomeriert vorgelegen haben konnten und die Chemieder Silanisierung sich nicht eins zu eins von SiO2 auf TiO2-Partikel ubertragen laßt.Die Ergebnisse der thermogravimetrisch bestimmten Massen fur den organischen An-teil (5,78%), ergibt fur die silanisierten Partikel eine Belegung von 0,25 mmol/g mitdem organischen Rest Bromundecyl (M = 234 g/mol, ohne SiOx siehe Abb. 5.29).Dies wurde 1,5·1020 Bromgruppen pro Gramm entsprechen. Im Vergleich zur theoreti-


schen Abschatzung ( 1,84 ·1020 Bromgruppen pro Gramm TiO2) weicht das Ergebnisder gravimetrischen Untersuchungen 20% ab. Es liegt jedoch im Rahmen der angege-benen Großenverteilung (50 ± 15 m2/g resultiert in 1,3 bis 2,4 ·1020 Bromgruppen).Dies deutet darauf hin, dass es sich um agglomeriert vorliegende Partikel handelt.Ein weiterer Grund fur die Abweichung von der theoretischen Abschatzung ist in denvielschichtigen Netzwerken zu vermuten, die wahrend der Silanisierung durch Kon-densation entstehen. Durch Kuhlen der Reaktion und hohe Verdunnung (1-2 m%)wurde der Bildung von Kondensationsprodukten in der Losung entgegengesteuert, ummoglichst viele reaktive Silane fur die Partikeloberflachenreaktion zuruckzubehalten.Diese Form der kinetische Kontrolle hatte sich in Vorversuchen als vorteilhaft erwie-sen.

Synthese 11-Azidoundecylsilan-TiO2 (S3)Das Produkt der darauf aufbauenden Synthesestufe (S3), wie in Abschnitt 4.1.10auf S.54 beschrieben, wies im IR eine zusatzliche Absorption bei 2110 cm−1 auf.Das Auftreten dieser Bande indizierte eindeutig das Vorhandensein einer Azidgruppe[147, 148].Auch der gravimetrische Unterschied zwischen Brom (79,9 g/mol) und Azid(42 g/mol) spiegelt sich mit einem Massenverlust von 24 % in den thermogravimetri-schen Analysen wider. Wie schon fur (S2) zeigte die TGA zwei Stufen. Die erste lagmit 1,3 % Massenverlust bei 239◦C ± 40, wahrend die zweite Stufe bei 316◦C ± 40(1,4 %) lag. Weiterhin mussen Massenverluste infolge der Waschungen berucksichtigtwerden.

Synthese TiO2-Click (S5a-c)Fur das Referenzsystem (S5c), bei dem die Umsetzung von (S3) mit 4-Pentinsaureerfolgte, zeigte das IR Spektrum kein Signal mehr bei der zuvor identifizierten Azid-bande bei 2110 cm−1. Dafur entwickelte sich eine breite Bande bei 1700 cm−1. Ent-sprechend der unterschiedlichen funktionellen Gruppen innerhalb der Peptide, wur-den fur (S5a) und (S5b) mit den Peptiden S4a (pa-Tet127) und S4b (pa-Tet000)charakteristische Banden in den IR Spektren gefunden (siehe Amidbanden in Tab.4.2 auf S. 42 und die durch die Seitengruppen verantworteten Absorptionen (Arginin= Guaningruppe, Tryptophan = Indolring, etc. [137]. ). Von der Referenz (S5c) wur-de stellvertretend fur alle S5-Partikel eine TGA angefertigt, die einen Massenanteilan organischer Substanz von 5,4 % ausgab. Im Gegensatz zu den TGAs der vorhe-rigen Synthesestufen (S2) und (S3) handelt es sich hierbei um eine einstufige TGAmit einem Wendepunkt der Massenverlustkurve uber der Temperatur bei 280◦C.Auf Grundlage dieser Beobachtung laßt sich vermuten, dass die zuvor bei niedrigerenTemperaturen abgespaltenen Stoffe schwach gebunden vorlagen. Nachdem sie infolgeder nachgelagerten Synthesestufen eine Großenzunahme erfahren haben, ist es ihnennicht langer moglich, unzersetzt zu verdampfen. Aus diesem Grund kann nur nocheine einstufige TGA beobachtet werden.In Abb. 5.29 sind die Ergebnisse der TGA-Untersuchungen fur jede der einzelnen Syn-thesestufen aufgetragen. In Erganzung dazu wurden die Ergebnisse dieser Analysenunterteilt in feinere Temperaturbereiche und ihren entsprechenden Massenverlustengegeneinander aufgetragen (Abb. 5.28).

Die Partikel wurden in Vorbereitung auf die TGA nach den einzelnen Synthesestu-fen weitgehend gleich behandelt und lassen sich daher miteinander vergleichen. DiePartikel wurden nach jeder Synthesestufe mehrfach gewaschen, dies erforderte je-


OSi

O

O

BrO

SiO

O

N-

N+

N

OSi

O

O

NN

N

O

OH

Abbildung 5.28: Ergebnisse der thermogravimetrischen Analysen fur die einzelnen Synthesestufender TiO2 Partikelmodifikation, unterteilt in Temperaturbereiche und den entsprechenden Massen-verlusten.

OSi

O

O

Br

OSi

O

O

N-

N+

N

OSi

O

O

NN

N

O

OH

234 g/mol

196 g/mol

294 g/mol

R= H , Cu+ +

R

Abbildung 5.29: Beladung der TiO2-Partikel entsprechend der jeweiligen Synthestufe, basierendauf den TGA-Ergebnissen fur zwei unterschiedliche Temperaturintervalle (300-400◦C und 0- 800◦C)berechnet; links sind die erwarteten Produkte der einzelnen Synthesestufen: (S2), (S3) und (S5c)mit den entsprechenden Molmassen ihrer organischen Reste (grau eingerahmt) abgebildet; Fur (S5c)wurden die Szenarien mit einem Proton und mit einem Cu+ als Gegenion kalkuliert.


doch den Gebrauch unterschiedlicher Losemittel, die ihrerseits die TGA-Ergebnissebeeinflussen. Die Molmasse, die den organischen Resten der jeweiligen Synthesestufezugeordnet wurden, sind jeweils unter der Struktur in Abb. 5.29 dargestellt. Es wirdangenommen, dass dies der organischen Substanz, die wahrend des Aufheizens desPartikels zersetzt oder verdampft, entspricht.Nach der Azidierung des Bromundecyls ergab sich ein etwas großerer Massenver-lust, als durch den Austausch des Broms gegen Azid zu erwarten gewesen ware. DasVerhaltnis der Molmassen der organischen Reste Undecylazid zu Bromundecyl (0,84)weicht leicht, um 0,09, von dem Verhaltnis der TGA-Ergebnisse ab (0,75).Die TGA-Ergebnisse der Partikel nach dem dritten Syntheseschritt lassen sich eben-falls uber die Verhaltnisse der Massenverluste miteinander vergleichen. Die Molmassedes organischen Restes nach der Huisgenreaktion (S5’) betragt 294+Cu+ g/mol. DasVerhaltnis (S5c’) zu Undecylazid (196 g/mol) ergibt damit 1,82.Damit liegt das erwartete Verhaltnis der Massenverluste fast ein Viertel uber demexperimentellen Verhaltnis der gravimetrisch bestimmten Massenanteile (1,23). Die-se Differenz laßt zwei mogliche Schlußfolgerungen zu: Wahrend des haufigen Wa-schens der Partikel, uber alle drei Synthesestufen konnten immer wieder einige aufder Oberflache adsorbierte Silankondensationsprodukte desorbiert sein. Damit sinktdie effektive Beladung mit jedem Syntheseschritt von anfanglich 0,25 mmol/g uber0,22 mmol/g auf schließlich 0,15 mmol/g (unter der Annahme eines Cu+ als Gegenionder Saure, siehe Abb. 5.29).Hierin wird weiterhin unterstellt, dass es sich fur die gravimetrisch bestimmte Masse,tatsachlich um den organischen Rest des Silans (siehe grau gerahmt in Abb. 5.29)handelt.

FunktionsexperimentErganzend zu den klassischen Analysen wurden die Partikel mit den immobilisiertenPeptiden antimikrobiellen Tests unterzogen. Dazu wurden sie zunachst mit Bakte-rien inkubiert. Nachdem diese Partikel durch Zentrifugation abgetrennt vorlagen,wurde ein Aquivalent des Uberstandes in ein Nahrmedium uberimpft. Von dieserVerdunnung wurde die Kinetik des Bakterienwachstums, sowie die Koloniebildung aufAgar-Platten verfolgt. Sowohl die Petrischalen als auch die Zellkulturplatte wurden24 h inkubiert, wahrend die Zellkulturplatte sich in einem Multimodereader befand.Dieser erfaßte aller 30 Minuten die optische Dichte (OD) der Bakteriensuspensionund dokumentierte die Wachstumskurven, die in Abb. 5.30 dargestellt sind. Die ODfur Bakterien wird bei einer Wellenabsorption von 800 nm gemessen, wobei eine ODvon 1 ca. 109 E.coli Bakterienzellen entspricht. Uberdies ist in Abb. 5.30 dargestellt,wie sich die Partikel/Peptid-Hybride in einem zweiten antimikrobiellen Test verhal-ten. Dafur wurden die Partikel bereits zuvor einmal gegen E.coli getestet und imAnschluß intensiv mit 70%igem Isopropanol zur Desinfektion recycled.

Die Kurve der reinen Bakteriensuspension (rot), die sich keiner Partikel ausgesetztsah, zeigt den typischen Verlauf einer Wachstumskurve (siehe Abb. 4.4, S. 44). DieSterilitatsnachweise fur die verwendeten Medien und Puffer verlaufen erwartungs-gemaß entlang der Nulllinie (grau). Fur die Bakterienkultur, die zuvor mit TiO2-Tet127 (S5a) inkubiert wurde, zeigt sich keine Veranderung der OD (violett). InAbb. 5.30 konnte eine verzogerte Kinetik des Populationszuwachses der Bakterienim Vergleich zur Negativreferenz (rot), die der TiO2-Tet000-Suspension (orange voll)entstammten, festgestellt werden. Die Bakterien zeigten nicht nur eine ausgedehnte-


Abbildung 5.30:Wachstumskurven von E.coli in LB-Medium, nach Inkubation der Partikel/Peptid-Hybride, aufgenommen mit einemMultimodereader, gemessen in der Absorption bei 800 nm (OD800):klassische Wachstumskurve der Bakterien (rot), mitgefuhrter Sterlitatsnachweise fur das Mediumund den Puffer (grau), Verdunnung des Uberstandes nach Inkubation mit TiO2-Tet127 (violett) undVerdunnung des Uberstandes nach Inkubation mit Tet000 modifizierten TiO2 Partikeln (orange).

re lag-Phase (vermehrungslose Phase zu Beginn), sondern verließen viel fruher dieprogressive Phase und verlangsamten ihr Wachstum. Die Bakterien, die mit den re-cycelten Hybride inkubierten (orange hohl), verließen die progressive Phase im Ver-gleich zu den Bakterien, die mit den frischen Partikeln inkubierten (orange voll), nochfruher.Die Bakterienkulturen, die zuvor mit TiO2-Tet000 (S5b) inkubierten (orange), tretenerst mit einer Verspatung von ca. 6 Stunden in die exponentielle Wachstumsphaseein. Auch der exponentielle Verlauf ist im Vergleich zu den unbehandelten Bakteriengestauchter. Diese Beobachtungen zur Kinetik des Populationswachstums verstarkensich fur die recycelten Hybride.Entsprechend fallt auch die Anzahl der Kolonien (CFU), die in den Petrischalen aus-gezahlt wurden, unterschiedlich aus: Die entsprechenden Agarplatten bildeten nurca. die Halfte der Kolonien (46 CFU), die auf der Negativreferenz (82 CFU) gezahltwurden (siehe Abb. 5.31). Die recycelten Partikel hingegen zeigten keine Veranderungin der Koloniebildung.

Die Betrachtung der mitgefuhrte Referenz der TiO2-Partikel (Abb. 5.31 zweite vonlinks unten) legt nahe, dass es zu keiner vollstandigen Passivierung der TiO2-Partikel-Oberflache gekommen ist. Die Referenz bestatigte die antimikrobielle Wirkung dieserPartikel, die auf einen photokatalytischen Effekt zuruckgefuhrt wird [181].Abbildung 5.31 faßt alle Referenzen, Sterilitatsnachweise und frische (zweite von


freshrecycl.

TiO Click Tet-1272 TiO Click Tet-127 recycled2

TiO Click Tet-000 recycled2TiO Click Tet-0002 TiO Click Tet-000 fresh2

TiO Click Tet-127 fresh2

TiO2

LB-Agar 10 CFU3

freshrecycl.

Abbildung 5.31: Ergebnisse des Agar-Diffusionstests, der antimikrobiellen Versuche gegen E.colimit den modifizierten TiO2 Partikeln (gelb und violett umrandet), einer Positivreferenz des EduktesTiO2 (links oben), der Negativreferenz (rot umrandet); die Partikel/Peptid-Hybride jeweils einmalfrisch (zweite und vierte Spalte) und zusatzlich die recycelten Hybride getestet(dritte Spalte).

rechts) neben bereits einmal recycelten Partikel/Peptid-Hybriden (ganz rechts) zu-sammen. In der Mitte sind die Ergebnisse des ersten Test mit den spater recyceltenPartikeln abgebildet.Als Positivreferenz wurden silberdotierte Hydroxylapatitpartikel eingesetzt. Auf die-sem Agar konnte keine kolonieformende Einheit (CFU) festgestellt werden. Die Ste-rilitatsnachweise zeigten ebenfalls keine CFUs, wie auch die mitgefuhrte Probe derunmodifizierten TiO2-Partikel. Die Negativreferenz mit der unbehandelten Bakteri-enkultur (rot umrandet) bildete 82 CFUs. Auf der Agar-Platte, auf der die Bakteri-ensuspension der TiO2-Tet000-Hybride ausgestrichen wurden, ließen sich nach demersten Test 16 Kolonien auszahlen (Abb. 5.31 Mitte oben). Dieselben Hybride fuhrtenim zweiten Lauf wieder zu 16 Kolonien (Abb. 5.31 rechts oben), wahrend die mitge-testeten frischen Hybride diesmal 46 Kolonien vorwiesen (Abb. 5.31 zweite von rechtsoben).Fur Bakterien, die zuvor mit den TiO2-Tet127-Hybriden inkubiert wurden, ergabenim Anschluß weder Kolonien auf den Agarplatten, noch ließ sich eine Wachstumskur-ve aufnehmen.

Die TiO2-Tet127-Hybride hatten einen bakteriziden Effekt. Aus diesem Grund konntekein Wachstum fur E.coli verfolgt werden. Die gezeigten Ergebnisse legen nahe, dasses sich um einen Peptid vermittelten und keinen photokatalytischen antimikrobiellenEffekt handelt, wie der Vergleich mit den TiO2-Tet000-Hybriden zeigte.

Kapitel6Zusammenfassung undSchlußfolgerung

Die initiale Fragestellung, die dieser Arbeit vorausging, beschaftigte sich mit derpeptidinspirierten Materialentwicklung. Vor dem Hintergrund Funktionalitaten, diesich aus Peptiden ableiten, technisch zu nutzen, wurden zwei Perspektiven der Ma-terialentwicklung unterschieden: die Charakterisierung der Struktur-Eigenschafts-Beziehungen zur Aufklarung der Funktionsweise des Peptids und die Konzeptionie-rung der Funktionsintegration in ein Material.

Die Charakterisierung der Funktionalitat des Peptids wurde exemplarisch an einemPeptid mit vernetzenden Eigenschaften untersucht. Es handelte sich um eine von demMuschelprotein Mefp1 abgeleitete Sequenz. Diese Sequenz wurde hinsichtlich ihresAnteils der posttranslational modifizierten Aminosaure 3,4-Dihydroxyphenylalanin(DOPA) und uberdies in der Sequenzlange variiert. Unter Nutzung einiger Ana-lysetechniken der Adhasionsforschung wie QCM, XPS, IRRAS und mechanischerPrufungen mit Peptiden gefugter Klebproben, erfolgte die Untersuchung der diffusi-onskontrollierten Wechselwirkung von Peptiden untereinander und mit Oberflachen.Fur die beiden untersuchten Substrate SiO2 und TiO2 ergaben sich darin unter-schiedliche Trends in Bezug auf die adsorbierten Peptide. Die Ergebnisse der Ad-sorptionsuntersuchungen bestatigten den Einfluß der Aminosaure DOPA, die in denuntersuchten Peptiden variiert wurde.

In dieser Arbeit wurde erstmals der Effekt des Sequenzlangeneinflusses mit dem Ein-fluß des variierten DOPA-Anteils korreliert. Hierin erwiesen sich kurzere Peptide alsder Adsorption zuganglicher. Zudem legen die Ergebnisse die Vermutung nahe, dassder Effekt der Sequenzlange den des absoluten DOPA-Anteils dominiert: kurzerePeptide mit identischem DOPA-Gehalt zeigten eine starkere Adsorption.

Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Adsorption der DOPA-Gruppe in unterschiedli-chen Oxidationsexperimenten untersucht. Auf TiO2 Substraten zeigte sich fur bereitsadsorbiertes und nachtraglich oxidiertes DOPA-haltiges Peptid eine stabilere Adsorp-tion als fur ein solches Peptid, das vor der Adsorption oxidiert vorlag.Diese Beobachtungen ließen sich in den korrespondierend dazu durchgefuhrten Druck-scherprufungen bestatigen. Die oxidierten Peptide bildeten rigide Strukturen aus.

107

108 Kapitel 6. Zusammenfassung und Schlußfolgerung

Infolge der dadurch verbesserten Adhasion ist damit gleichermaßen eine Abnahmeder Schichtdicke und ihrer Flexibilitat verbunden, da die Peptide auch innerhalb derMatrix rigide vernetzen. Die Verbundfestigkeit nimmt daher ab, so dass das Refe-renzpeptid ohne DOPA die hochsten Klebfestigkeiten ergab.

Die Studien zur Wechselwirkung von Peptiden untereinander und mit Oberflachenlieferten wichtige Erkenntnisse fur das Kleben auf der Grundlage biologischer Prin-zipien: Die Rigiditat des peptidbasierten Klebstoffsystems ist eine Konsequenz desDOPA-Anteils, wahrend die Adsorption ebenfalls maßgeblich durch DOPA verbessertwird. Die Adsorption ihrerseits zeigt uberdies Abhangigkeiten von der Sequenzlangeder untersuchten Peptide. Die Betrachtung fuhrt zu einem Zielkonflikt zwischenAdhasion und Verbundfestigkeit. Dieser Konflikt laßt sich nicht ohne die Einfuhrungeiner weiteren Komponente wie eines ’Harzes’ oder eines ’Fullstoffes’ losen.

Der zweite Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die Integration von vernetzendenund antimikrobiellen Funktionen in ein Material. Diese Modifikation erfolgte an denMaterialoberflachen anhand unterschiedlicher Konzepte: (a) der Nutzung elektrosta-tischer Wechselwirkungen auf mineralischen Substraten (TiO2 und Hydroxylapatit)und auf einem Nitrocellulosesubstrat; (b) unter Verwendung starker gerichteter Bin-dungen uber Biotin zu Streptavidin funktionalisiertem Polypropylen und der Aus-bildung einer Gold-Schwefelbindung auf Goldpartikeln und (c) weiterhin wurde eineMehrstufensynthese auf TiO2-Partikeln verfolgt.

Eine entscheidende Fragestellung hierzu war einerseits das Verhalten der Peptide un-tereinander und andererseits der Erhalt der Funktionalitat der immobilisierten Pep-tide. Dazu wurde die Versuchsanordnung auf ein literaturbekanntes antimikrobiellesPeptid ausgeweitet.

Fur jedes Immobilisationskonzept konnte im Funktionsexperiment der Erhalt derPeptidaktivitat bestatigt werden:

(I) Die auf TiO2-Partikeln uber elektrostatische Wechselwirkungen immobilisiertenDOPA haltigen Peptide waren in der Lage infolge von Oxidation mit anderen Parti-keln querzuvernetzen.

(II) Die TEM Aufnahmen dieser TiO2-Partikel/Peptid-Systeme bestatigen uberdiesdie Beobachtungen aus den mechanischen Prufungen. Die Aufnahmen legen na-he, dass die TiO2-Partikel/Peptid-Agglomeratstruktur durch Oxidation entscheidendverandert werden, dies hat mit hoher Wahrscheinlichkeit auch Auswirkungen auf diemechanischen Eigenschaften.

(III) Desweiteren wurde anhand des antimikrobiellen Peptides demonstriert, dass dieantimikrobielle Aktivitat gegen E.coli auch fur immobilisierte Peptide erhalten bleibtwie die durchgefuhrten Experimente nahelegen.

(IV) Ebenfalls anhand des antimikrobiellen Peptides und unter Nutzung des Immobi-lisierungskonzeptes (c) wurde demonstriert, dass diese Partikel/Peptid-Systeme sichohne Einbußen in der Aktivitat wiederverwenden lassen.

Kapitel7Ausblick

Es ist bekannt, dass adsorbierte Muschelproteine sich nur viskoelastisch verhalten,solange sie nicht oxidiert wurden und vernetzt vorliegen [182]. Daraus laßt sich eindirekter Zusammenhang mit der Beschaffenheit der daruber liegenden Schichten, diedie Kohasion adressieren, herstellen. Gelingt es das adsorbierte Peptid mit hoherDOPA-Dichte initial uber das Substrat zu leiten und anschließend eine zweite Schichtmit geringerer DOPA-Dichte durch Layer-by-Layer-Adsorption aufzubringen, konntedieser Rigiditat entgegengewirkt werden. Dieses Konzept steht in Analogie zur Pro-teinverteilung und den Vernetzungsmechanismen innerhalb der Plaque wie in Abb.2.3 auf S. 9 in Anlehnung an die Arbeiten von Hwang et al. [35] dargestellt und istBestandteil weiterfuhrender Untersuchung an diesem System.

Mit dem materialbezogenem Aspekt dieser Arbeit, sollte in der Konsequenz dieMoglichkeit einer konkreten Anwendung untersucht werden. Hierin richtet sichder Fokus auf Polymer-Biokonjugation (siehe S. 3, [6]), um daruber die Rigiditatdes Peptidnetzwerkes aufzubrechen. Dies beinhaltet die Idee der Integration einerpeptidinspirierten Funktionalitat anhand unterschiedlicher Synthesekonzepte. ZumBeispiel uber die Synthese eines funktionalen linearen oder verzweigten Polymers[55, 56, 167, 183, 184]. Dieses Polymer fungiert als ’Harz’ und verleiht dem spaterenMaterial mehr Flexibilitat, wie in den Arbeiten von Schwemmer et al. in denen einPeptid als Immobilisationsvermittler fur PEG auf Gd2O3-Partikeln agiert [56].Eine weitere Integration einer peptidinspirierten Funktionalitat konnte direkt am Po-lymerruckgrat [58, 185–187] erfolgen. In beiden Fallen sollte uber die Funktionalitatdes Peptids eine Steuerung der Materialeigenschaften moglich sein. Dies beinhaltetGroßen wie die Rigiditat und das Schermodul, oder antimikrobielle Aktivitat. UnterVerwendung einer vernetzenden Domane wie DOPA konnen damit auch Hydroge-le entworfen werden [186, 188]. In der Arbeit von Welsch et al. wurden Enzyme inein solches Netzwerk eingearbeitet und daruber die Enzymaktivitat sogar gesteigert[189].

Die in dieser Dissertation erarbeiteten unterschiedlichen Synthesekonzepte eroffnenweitreichende Perspektiven im Kontext der peptidbasierten Materialentwicklung.

109

AnhangAAbkurzungen

AO OberflacheACN AcetonitrilAMP Antimikrobielle PeptideAPTMS Aminopropyltrimethoxysilan

ATR Attenuated Total Reflectanceaa aminoacidsBoc tert-Butyloxycarbonylca contact angleCf CarboxyfluoresceinCFU Colony-Forming-UnitCPS counts per second

DCC N,N’-DicyclohexylcarbodiimidDCM Dichlormethandd Wasser doobled destilled waterDIPEA Diisopropylethylamin (Hunigbase)

disp. dispersiv

DOPA Dihydroxy-PhenylAlaninE.coli Echerischia coliEDC N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethyl-carbodiimid

hydrochloridEDX EnergyDispersive X-Ray-Spectroscopyeq Aquivalente (equivalent)

EtOH EthanoleV elektronenVoltexcl. exclusiveFITC Fluorescein-5-IsothiocyanatFmoc 9-FluorenylmethoxycarbonylHA HydroxylaatitHBTU 2-(1H)-Benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-tetramethyluronium-

hexafluorophosphatHPLC High-Performence-Liquid-ChromatographieHyp Hydroxyprolin

111

112 Anhang A. Abkurzungen

incl. inclusiveIP Isoelektrischer PunktIRRAS Infrared Reflection Absorptions SpectroscopyiSPR Imaging Surface Plasmon ResonanceLB Liquid BrothHOBt 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetra-

fluoroboratMALDI-ToF-MS Matrix assisted Laser Desorption Ionisation-Time of

Flight-Mass Spectrometrymefp1 mytilus edulis foot proteine 1

MES 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acidMIC Minimum Inhibitory Concentrationmin minutenMO MolekulOrbitalMTBE tert-Butyl-MethyletherNC NitrocelluloseNHS N-HydroxysuccinimidNMP N-Methylpyrolidon

OD Optische DichteOxm Oxidations mittelPA 3-PentinsaurePBS Phosphate Bufferes SalinePEG Polyethylenglykol

PPS 3-PhosphonQCM Quartz Crystal Microbalance

Oxm. Oxidationsmittelrpm rounds per minute

RT RaumtemperaturSAM Selbstassemblierende MonolayerSP Solidphase

SPPS Solid-Phase-Peptide-SynthesizerSPR Surface Plasmone- ResonanceSTM Scanning Tunneling Microscopy

TBDMS tert-Butyl-DimethoxysilanTCP Ttritylchlorid-Linker an PolystyroltragerTEM Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

TGA Thermogravimetrische Analyse

THF TetrahydrofuranTmob TrimethoxybenzylTFA TrifluoroaceticacidUV Ultra-ViolettVdW Van der Waals-WechselwirkungenVIS Visible lightWW WechselwirkungXPS X-Ray Photoelectron Spectroscopy

AnhangBErgebnisdetails QCM

Tabelle B.1: Zusammenstellung der Adsorptionsergebnisse fur Experiment Q1: msat und mrinse.

Peptid [μg/cm2] nativ NaIO4 Fe3+ Cu2+

1-1 msat 0,46 0,46 0,53 0,51mrinse 0,25 0,16 0,19 0,14

2-1 msat 0,78 0,60 0,58 0,53mrinse 0,46 0,16 0,16 0,11

2-2 msat 0,48 0,55 0,51 0,48mrinse 0,18 0,16 0,09 0,09

Tabelle B.2: Ergebnisse aus dem Experiment Q0: Molmassen in [g/mol], msat, nsat und mrinse,nrinse jeweils in [μg/cm

2] und [nmol/cm2], fur die Substrate SiO2 und TiO2.

1-n Peptid 2-n PeptidSubstrat 1-0 1-1 1-2 2-1 2-2 2-4

Molmasse 1183 1199 1215 2364 2380 2412

msat SiO2 0,41 0,46 0,44 0,76 0,42 0,27mrinse SiO2 0,18 0,25 0,02 0,46 0,07 0

msat Ti 0,19 0,34 0,50 0,26 0,29 0,73mrinse Ti 0,04 0,14 0,32 0,07 0,12 0,73

nsat SiO2 0,35 0,38 0,36 0,32 0,18 0,11nrinse SiO2 0,15 0,21 0,02 0,19 0,03 0

nsat Ti 0,16 0,28 0,41 0,11 0,12 0,30nrinse Ti 0,03 0,12 0,26 0,03 0,05 0,30

113

AnhangCVeroffentlichungen

Wissenschaftliche Veroffentlichungen

K. Richter; G. Diaconu; K. Rischka; M. Amkreutz; Frank A. Muller und AndreasHartwig, Adsorption studies of mussel inspired peptides. Bioinspired, Biomimeticand Nanomaterials, eingereicht Juli 2012

Biological Adhesive Systems: From Nature to Technical and Medical Applications”,Kapitel 13: Bio-inspired Polyphenolic Adhesives for Medical and Technical Applica-tions, S. 201-211 von K. Rischka, K. Richter, A. Hartwig, M. Kozielec, K. Slenzka, R.Sader, I. Grunwald; herausgegeben von J. von Byern, I. Grunwald; Springer Wien,2010

Konferenzbeitrage

Vortrage

K. Richter (Speaker); G. Diaconu; L. Gatjen; K. Rischka; I. Grunwald featured by M.Amkreutz; M. Hoffmann, Adsorption studies of peptide based adhesive material. In-ternational School and Conference on Biological Material Science, (Euro Bio-inspiredMaterials), Potsdam, 20.-23. Marz 2012

K. Richter (Speaker); L. Gatjen; M. Kozielec; N. Salk; P. Imgrund and I.Grunwald,Functional Materials for Selective Coupling of Biomolecules. 1st European Symposiumon Biomaterials and Related Areas (Euro BioMat 2011), Jena, 13.-14. April 2011

Poster

M. Amkreutz; K. Richter and K. Rischka, Adsorption Properties of Mussel BasedPeptide Sequences. 1st International Conference on Biological and Biomimetic Ad-hesives, Lissabon, 9.-11. Mai 2012

K. Richter; K. Rischka; M. Amkreutz; U. Lohbauer; F. Muller; A. Wagner and A.Hartwig, Promising Hybrid Adhesive System based on Hydroxylapatite Perticles and

115

116 Anhang C. Veroffentlichungen

Marine Peptides. Polymers in Biomedicine and Electronics (Biannual Meeting of theGDCh-Division

”Macromolecular Chemistry“ and Polydays), Berlin-Dahlem, 3.-5.

Oktober 2010

K. Richter; K. Rischka; M. Amkreutz; U. Lohbauer; F. Muller; A. Wagner andA. Hartwig, Promising Hybrid Adhesive System based on Hydroxylapatite Pertic-les and Marine Peptides. COST Strategic Workshop-Principles and Development ofBio-Inspired Materials, Vienna, 13.-15. April 2010

K. Richter; I. Grunwald; A. Hartwig and K. Rischka, Concepts for the Immobilisationof Antimicrobial Peptides on Technically Relevant Substrates. 454. WE-Heraeus-Seminar, Bad Honnef, 28.-31. Marz 2010

Patente

Neue Methode zur kovalenten Markierung von Molekulen in vivo und in vitro DEPatentanmeldung im Prozess der Einreichungvon K. Rischka, M. Szardenings, I. Grunwald, K. Richter

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Danksagung

Mein Dank gilt an dieser Stelle Herrn Priv. Doz. Dr. Andreas Hartwig fur das Ver-trauen in meine Arbeit und die Hilfestellung im besonderen wahrend der Niederschriftder Arbeit. An dieser Stelle mochte ich auch Herrn Prof. Dr. Franz-Peter Montfortsdanken fur sein Wirken als Zweitgutachter. Mein Dank gilt nicht zuletzt allen Mit-gliedern der Prufungskommission.

Dr. Klaus Rischka gebuhrt großer Dank fur die Hilfestellung wahrend der praktischenArbeit und im Prozess des Zusammenschreibens. Ohne die geduldige Einarbeitung amSPPS, MALDI-ToF und der HPLC durch ihn, ware die Arbeit nicht durchfuhrbargewesen. In diesem Zusammenhang mochte ich herausstellen, daß ich die mir ein-geraumte uneingeschrankte Nutzung der Infrastrukturen des Instituts als Privilegbetrachte. Dr. Ingo Grunwald mochte ich fur die Unterstutzung in der Auseinander-setzung mit der ersten Veroffentlichung danken. Beiden danke ich fur die geduldigeBetreuung, die stetige Hilfsbereitschaft und nutzlichen Anregungen.In diesem Kontext mochte ich eine von mir innig geschatzte Diskussionsrundewurdigen, aus der im Beisein von Dr. Michael Hoffmann und Dr. Marc Amkreutz beiKeksen, Leberwurst und Tee, einige meiner wissenschaftlichen ’Heureka’-Momentehervorgingen.

Besonderer Dank gilt auch all jenen Kollegen, die mich im Verlauf der Arbeit tech-nisch und moralisch unterstutzt haben. Insbesondere Linda Gatjen danke ich fur dieHilfestellungen in mikrobiologischen Fragen. Ebenso danke ich meinen tatkraftigenstudentischen Kraften Alexandra Patras, Tobias Hahn und besonders der ’Patte’ aliasPatricia Wand.

Fur die Geduld mit mir als Buromitbewohner, danke ich Andreas, Katharina, Maria,Christian, Tobias, Eduard, Sarah, ... und Dan.Fur die XPS-Messungen danke ich Christian Tornow und Christin Harves fur dieUnterstutzung in jeglichen Fragen und vor allem in der Beschaffung der sonderbarstenSachen (exotische Fugeteile, Meßzellen, etc.). Dr. Karsten Thiel und Kirsten Toebedanke ich fur die TEM Aufnahmen und Sascha Korfe danke ich fur die Prufungenam Bondtester. Dr. Malte Kleemeier danke ich fur die interessanten Gedankenspieleim Zuge jeglicher absurder Interpretationen und Hilfestellungen mit der DLS, demZetasizer und der Feinsage.

Naturlich gilt mein Dank auch den Madels, die in unseren konspirativen Contain-errunden fur heitere Momente sorgten. Allgemein gilt dies fur alle Kollegen, die furfruchtbare Diskussionen unersetzlich sind und hier ein freundliches Klima durch guteLaune und großartige Ideen schaffen: eine fur mich notwendige Voraussetzung fur diegute Zusammenarbeit.

Nicht zuletzt gilt mein Dank jenen, die in den vergangenen Jahren viel zurucksteckenmussten, obwohl diese Arbeit ohne sie unmoglich gewesen ware. Dies sind in erster Li-nie jene geliebten Personen, die meine fruhkindliche Pragung zu verantworten haben,wie die Mutti, der Vati, meine Schwester, die Corina und R. Bobby. Damit ist aberauch der Rest der Familie also der gesamte ’Wetter’-Clan, meine Oma vaterlicherseitsund die herzliche Familie gemeint, in der ich erst seit jungerer Vergangenheit meinUnwesen treibe.

Meine Dankbarkeit gegenuber der guten Seele, die mich sicher, mit viel Zuspruch

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und mit gebetsmuhlenartiger Geduld durch die unbequemsten Monate meiner Arbeitmanovriert hat, kann ich nicht in Worte fassen und die Opfer, die in dieser Zeit furmich erbracht wurden werde ich ohnehin nie wieder aufwiegen konnen. Das hindertmich jedoch nicht daran dies zu versuchen!

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Peptidinspirierte Materialentwicklung - E-LIBelib.suub.uni-bremen.de/edocs/00102824-1.pdf · 5.2.3 Partikel/Peptid-Hybride.....100 6 Zusammenfassung und Schlußfolgerung 107 7 Ausblick