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Phytochemische
Untersuchungsmethoden
10.03.2016
Mariam Moussa (Apothekerin)
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Methodenspektrum
Phytochemische Untersuchungsmethoden 2
Extraktion l Mazeration & Digestion l Erschöpfende Extraktion mittels Soxhlet-Apparatur l Extraktion ätherischer Öle l Besondere Extraktionsverfahren (z.B. überkritisches CO2, Mikrowellen)
Chromatographie l Differenzierung nach System (stationär / mobil):
² fest / flüssig: Dünnschichtchromatographie (DC) Säulenchromatographie Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC)
² flüssig / flüssig: Extraktionschromatographie ² flüssig / gasförmig: Gaschromatographie (GC)
Spektroskopie l Infrarotspektroskopie (IR) l Massenspektrometrie (MS) l Kernspinresonanzspektrometrie (NMR)
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Extraktion
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Mazeration l Vermischen des Extraktionsgutes (in vorgeschriebenem Zerkleinerungsgrad) mit
einer definierten Menge an Lösungsmittel (je nach Polarität der zu extrahierenden Zielstoffe z.B. Methanol, Ethylacetat, n-Hexan)
l Extraktionsprozess unter Rühren / Schütteln bei Raumtemperatur
l Filtration und Auspressen des Rückstandes
l mehrfaches Waschen des Rückstandes mit Extraktionsmittel
Digestion l entspricht der Mazeration unter Zufuhr von Wärme
→ kürzere Extraktionszeiten und höhere Ausbeuten, aber cave (!) thermolabile Naturstoffe (z.B. Artabsin aus Wermut, viele marine Naturstoffe)
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Extraktion
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l fest-flüssig Extraktion unter kontinuierlichem Rückfluss
l Apparatur nach Professor Franz von Soxhlett (1848-1926, München)
l ursprünglich zur Bestimmung des Fettgehaltes in Lebensmitteln Extraktionsgut in
Extraktionshülse
Extraktionsmittel
1. Extraktionsmittel wird im Kolben zum Sieden erhitzt
2. am Kühler kondensiertes Extraktionsmittel tropft in die Extraktionshülse
3. periodischer Rückfluss des Extraktes durch Saugheberwirkung
4. Anreicherug der extrahierten Stoffe im Kolben
5. „Auslaugen“ des Extraktionsgutes durch Kontinuität der Methode
Erschöpfende Extraktion nach Soxhlet
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Extraktion
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Ätherische Öle – Definition l flüchtig, im Gegensatz zu fetten Ölen keine Rückstände hinterlassend
l sehr aromatisch im Geruch
l ölartige Konsistenz, meist unlöslich in Wasser
l oft sehr komplexe Zusammensetzung von bis zu hundert Bestandteilen (z. B. Mono-, Sesquiterpene)
l aus pflanzlichen Ausgangsstoffen
l Vorkommen in der Pflanze: Ölbehälter, Drüsenhaare, -schuppen, Ölzellen
l geringere Dichte als Wasser
l stark lichtbrechend
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Extraktion
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Extraktion von ätherischen Ölen –Wasserdampfdestillation (WDD)
1. Erhitzen des zerkleinerten Extraktionsgutes in Wasser
2. Verdampfen der in der Droge enthaltenen volatilen Bestandteile, welche vom aufsteigenden Wasserdampf „mitgerissen“ werden
3. Wasserdampf und ätherische Öle gehen in die Destillationsvorlage (z. B. Toloul) über
4. Phasentrennung stellt sich ein, sodass die gewünschte organische Phase gut von der wässrigen separiert werden kann
5. Qualitative und quantitative Analyse des extrahierten ätherischen Öls mittels chromatographischer Methoden, z.B. Gaschromatographie (GC)
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Extraktion
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Extraktion von ätherischen Ölen – Enfleurage
1. frische Blüten werden über einen Zeitraum von 3 Monaten auf Schweine- oder Rinderschmalz gestreut
2. täglicher Wechsel der Blüten
3. mit ätherischem Öl gesättigtes Fett (Pomade) wird mit Alkohol gewaschen
→ Blütenöl (Essence absolue d' enfleurage)
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Chromatographie
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Allgemein l „Physikalische Methode, bei denen eine Stofftrennung durch Verteilung von
Substanzen zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erfolgt. Adsorptions- und Desorptionsprozesse sowie die Elutionskraft der mobilen Phase beeinflussen maßgeblich die Retentionszeit der jeweiligen Analyten.“
l analytisch: Probe wird in ihrer Zusammensetzung durch das erhaltene Chromatogramm qualitativ und quantitativ charakterisiert
l (semi-)präparativ: Isolation einzelner Komponenten nach ihrer Auftrennung, um diese in Reinform zu erhalten, z. B. in Form eines Peaks bei einer semipräparativen HPLC oder eine Bande in einer präparativen DC
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Chromatographie
9 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Dünnschichtchromatographie (DC) l „Entwicklung einer mit einem Stoffgemisch beschickten DC-Platte mit einem
geeignet gewählten Fließmittel in einer Dampf-gesättigten DC-Kammer über eine definierte Laufstrecke mit anschließender Detektion der Analyten mittels Fluoreszenzlöschung, Eigenfluoreszenz oder nach Behandlung mit einem geeigneten Sprühreagenz“
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Chromatographie
10 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Dünnschichtchromatographie (DC) l Charakteristik
² Trennprinzip: Adsorption
² planarchromatographisches Verfahren
² geringer apparativer und zeitlicher Aufwand (++)
² hohe Trennleistung (++)
² geringer Substanzbedarf (++)
l Einsatzgebiete ² Identitätsprüfungen mit Referenzsubstanzen
² Reinheitsprüfungen
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Chromatographie
11 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Dünnschichtchromatographie (DC) l stationäre Phase
² Siliciumoxid (Kieselgel, Silica) für semipolare und unpolare Substanzen
² Silanisiertes Kieselgel (RP-Material) für stark polare Substanzen
² Aluminiumoxid, Cellulose, Polyamid, Magnesiumsilicat
² enthält meist Fluoreszenz- bzw. Phosphoreszenzindikatoren zur Detektion der Analyten
l mobile Phase
² Auswahl nach geeigneter Polarität, elutrope Reihe an Kieselgel:
Wasser > Methanol > Acetonitril > Ethylacetat > Aceton > Dichlormethan > n-Hexan
² reine Lösungsmittel oder Mischungen
² eventuell mit Säure- / Basezusatz (z.B. TFA oder NH3)
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Chromatographie
12 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Dünnschichtchromatographie (DC) l praktische Durchführung
1. Vorbereitung: DC-Platte beschriften, Probe zu geeigneter Konzentration lösen, Kammer mit Fließmittel befüllen, Filterpapier an Innenwand anhaften (Kammersättigung nach ca. 10 Minuten etabliert)
2. Auftragen der Proben: geeignete Kapillare wählen, Abstände einhalten, Überprüfen der Konzentration unter einem UV-Betrachter
3. Entwicklung: warten, bis Fließmittelfront obere Markierung erreicht
4. Auswertung: Fluoreszenzlöschung (durch π-Elektronen-Systeme im Analyten, z. B. Aromaten) unterm UV-Betrachter bei λ = 254 nm, bzw. mittels Anregung zur Eigenfluoreszenz der Analyten bei λ = 366 nm oder durch Behandlung mit geeigneten Sprühreagenzien
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Chromatographie
13 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Dünnschichtchromatographie (DC) l Sprühreagenzien
² Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz
² Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz
² Dragendorffs Reagenz (Alkaloide)
² Ethanolische KOH-Reagenz (Phenole)
² Naturstoff-PEG-Reagenz (Flavonoide)
² Cerammoniumsulfat-Reagenz
² Iod-Chloroform-Reagenz
² Iod-Platinat-Reagenz
² Kaliumpermanganat-Schwefelsäure-Reagenz
² Phosphormolybdänsäure-Reagenz
² Salzsäure-Eisessig-Reagenz
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Chromatographie
14 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Dünnschichtchromatographie (DC) l Probleme
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Chromatographie
15 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Säulenchromatographie – Allgemein l stationäre Phase befindet sich im Gegensatz zur Flachbett- oder
Schichtchromatographie in einer Röhre
l füllt die stationäre Phase den kompletten Querschnitt des Rohres, so spricht man von gepackten Säulen
l stationäre Phasen
² Kieselgel (Silica)
² silanisiertes Kieselgel (RP-Material)
² Aluminiumoxid, Magnesiumoxid, Magnesiumsilikat (Florisil)
² Kieselgur
² Aktivkohle
² Molekularsiebe
² Poröse Polymere
Adsorption
Größe
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Chromatographie
16 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Säulenchromatographie l mobile Phase
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Chromatographie
17 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Säulenchromatographie l praktische Durchführung
1. Aufschlämmen der stationären Phase in einem geeigneten Laufmittel
2. Befüllen der Röhre (Packen der Säule)
3. vorsichtiges Einleiten des Laufmittels unter Vermeidung von Aufwirbelungen der stationären Phase, kontinuierliche Zufuhr von Laufmittel sicherstellen (Trockenlaufen der Säule unbedingt vermeiden!), Säule mit 1-2 Säulenvolumen äquilibrieren
4. Lösen der Probe (Rohextrakt, Fraktion) in kleinem Volumen (1-2 mL) des Laufmittels, Rückstände ggfs. abzentrifugieren
5. Beschicken der Säule mit der Probe
6. Beginn des Elutionsprozesses
7. Sammeln des Eluats in Kolben oder Reagenzgläsern im Fraktionssammler
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Chromatographie
18 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Säulenchromatographie l Aufbau
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Chromatographie
19 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Vakuumflüssigchromatographie (VLC) l Anfangslokalisierungsverfahren für große
Mengen an Probe
l Filtertrichter aus gesintertem Glas (ca. 50 cm lang, Durchmesser ca. 10-12 cm)
l stationäre Phase meist Kieselgel (Silica)
l stationäre Phase wird unter Vakuum gepackt, Probe wird auf einer kleinen Menge des Säulenmaterials adsorbiert und oben auf die Säule gegeben
l Elution unter Vakuum bei schrittweiser Erhöhung der Polarität der mobilen Phase (Bsp. Hexan → EtOAc → MeOH)
l Fraktionen werden gesammelt und mittels DC kontrolliert und ggfs. kombiniert Rohextrakte!
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Chromatographie
20 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kieselgel (Silica)-Säule l Normalphasenchromatographie unter
Verwendung einer polaren stationären Phase
l apolare mobile Phase (z.B. Hexan oder DCM) isokratisch oder mit stufenweise zunehmenden Mengen polarer Lösungsmittel (z.B. EtOAc oder MeOH) während der Elution
l Korngrößen: 0.04 – 0.063 mm semipolare und apolare Analyten!
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Reversed Phase-(RP)-Silica-Säule l Umkehrpasenchromatographie unter Verwendung
einer apolaren stationären Phase
l je länger kovalent gebundener n-Alkylrest, desto größer die Tendenz der Matrix, hydrophobe Substanzen zu retinieren
l polare mobile Phase (z.B. H2O oder MeOH) mit stufenweiser Erhöhung des Methanolanteils während der Elution
Chromatographie
21 Phytochemische Untersuchungsmethoden
polare Analyten!
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Größenausschlusschromatographie l Fraktionierung von Stoffgemischen an stark
porösen Gelen als stationäre Phase nach Molekülgröße
l große Moleküle werden vom Innenraum der Partikel ausgeschlossen und eluieren vor kleineren Molekülen, welche in die Partikel eindringen und somit stärker zurückgehalten werden
l Trennbereich eines Gels ist festgelegt durch die Porengröße, bzw. die Quervernetzung der Partikel
l je länger kovalent gebundener n-Alkylrest, desto größer die Tendenz der Matrix, hydrophobe Substanzen zu retinieren
l Elutionsmittel z. B. MeOH oder DCM
Chromatographie
22 Phytochemische Untersuchungsmethoden
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Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) l flüssigchromatographisches Verfahren zur Trennung, Identifikation oder
Quantifizierung von Substanzen
l (semi-)präparative Nutzung ideal als finaler Aufreinigungsschritt bei der Naturstoffisolation
l die Trennung beeinflussende Parameter
² Art und Maße der verwendeten Trennsäule
² mobile Phase
² Temperatur
² pH-Wert
² Durchflussgeschwindigkeit der mobilen Phase (Flussrate)
Chromatographie
23 Phytochemische Untersuchungsmethoden
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Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)
Chromatographie
24 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Autosampler
Pumpe
Eluenten
UV/VIS- Detektor
Säule
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Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)
Chromatographie
25 Phytochemische Untersuchungsmethoden
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Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)
Chromatographie
26 Phytochemische Untersuchungsmethoden
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Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)
Chromatographie
27 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Externer Standard Probe
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Chromatographie
28 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) l (semi-)präparative HPLC
v Ziel: Isolation eines oder mehrerer Probenbestandteile in einer gewünschten Reinheit mit minimalem Zeitaufwand
v die Trennung beeinflussende Parameter
o Probenmenge
o Säulenlänge (10-25 cm)
o Partikelgröße (3-7 µm)
o Flussrate (0,2-1,5 ml/min)
o mobile Phase (Gradient / isokaratisch)
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Chromatographie
29 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) l (semi-)präparative HPLC
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Chromatographie
30 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Hoch-Leistungs-/Druck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) l (semi-)präparative HPLC
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Chromatographie
31 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Gaschromatographie (GC) l Verteilungschromatographie zum Auftrennen von Gemischen in einzelne
chemische Verbindungen
l nur volatile Komponenten trennbar (Siedebereich bis 400 °C), ggfs. durch Derivatisierung
l sehr lange, spulenartig gewickelte Säulen (bis 30 m) ermöglichen eine höhere Trennleistung als in der Flüssigchromatographie (LC)
l stationäre Phase: fest (GSC) oder flüssig (GLC)
l mobile Phase: v.a. Inertgase wie Stickstoff, Helium, selten Wasserstoff
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Chromatographie
32 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Gaschromatographie (GC)
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Spektroskopie
33 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Infrarotspektroskopie (IR) l Verfahren der optischen Spektroskopie zur qualitativen bzw. quantitativen Analyse
und zur Konstitutionsermittlung
l Prinzip
v Aufnahme von Absorptionsspektren von festen, flüssigen oder gasförmigen organischen Verbindungen im Bereich des nahen (NIR), mittleren (MIR) und fernen Infrarot (FIR)
v die IR-Strahlen passieren die Moleküle der Analyten, wobei es zu Valenz- und Deformationsschwingungen kommt, welche Strahlen von bestimmter Wellenlänge in bestimmten Prozentsätzen absorbieren
v Absorptionsspektren sind für jede Substanz spezifisch
v Erkennung funktioneller Gruppen wie Säuren, Ketonen, Doppelbindungen oder Estern
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Spektroskopie
34 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Infrarotspektroskopie (IR)
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Spektroskopie
35 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Massenspektroskopie (MS) l Verfahren zur Bestimmung von chemischen Elementen, Molekülmassen und
Molekülfragmenten
l wichtige Methode der analytischen Chemie für die Aufklärung der Struktur von Verbindungen bzw. der Zusammensetzung von Gemischen
l qualitativer und quantitativer Nachweis kleinster Substanzmengen ist möglich
l Prinzip
v für einen Analyten wird die Häufigkeit, mit der geladene Moleküle (Ionen) und deren Massenfragmente auftreten, bestimmt
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Spektroskopie
36 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Massenspektroskopie (MS) l harte Ionisation
v Elektronenstoß-Ionisation (EI)
l weiche Ionisation
v Chemische Ionisation (CI)
v Elektrospray-Ionisation (ESI)
l Ionisation größerer Analyten (Proteine)
v Fast Atom Bombardment (FAB)
v Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)
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Spektroskopie
37 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Massenspektroskopie (MS) l Elektrospray-Ionisation
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Spektroskopie
38 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Massenspektroskopie (MS) l Quadrupol-Massenspektrometer
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Spektroskopie
39 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Massenspektroskopie (MS) m = [M+H]+
m = [M-‐H]-‐
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Spektroskopie
40 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR)
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Spektroskopie
41 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l „spektroskopische Methode zur Untersuchung der elektronischen Umgebung
einzelner Atome und der Wechselwirkung zu Nachbaratomen innerhalb eines Moleküls“
l Basis: Atomstrahlexperiment (Stern-Gerlach-Versuch) von Otto Stern im Jahr 1922 (Nobelpreis für Physik 1943)
v Strahl von Silberatomen wird durch ein Magnetfeld in zwei Teilstrahlen aufgespalten, die den beiden Spinzuständen zugeschrieben wurden
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Spektroskopie
42 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l Voraussetzung: Atomkerne besitzen einen Kernspin und dadurch ein
magnetisches Moment ((µ) ≠ 0)
v Nuklide mit ungerader Massenzahl, v.a. 1H, 13C und 15N
l (µ) kann in einem äußeren Magnetfeld B0 nur bestimmte Orientierungen annehmen
l Zahl der Orientierungen wird durch Kernspinquantenzahl I bestimmt, jeder Orientierung wird magnetische Kernspinquantenzahl mI zugeordnet
l 2I + 1 Orientierungen zu jeder Kernspinquantenzahl existent
v für einen Wasserstoffkern mit Kernspinn I = ½ zwei Orientierungen mit mI = +½ und −½
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Spektroskopie
43 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l Wasserstoffkerne verhalten sich in B0 wie kleine Stabmagneten, d.h. sie nehmen
entweder eine dem äußeren Feld gegenüber parallele oder antiparallele Ausrichtung ein
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Spektroskopie
44 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l antiparallel energetisch höher / ungünstiger
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Spektroskopie
45 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l Energie (Δ E) wird durch Einstrahlung von resonanten elektromagnetischen
Wellen eingebracht (Larmor-Frequenz ω0)
l Protonenresonanzfrequenzen zwischen 300 MHz und 1 GHz
l Larmor-Frequenz wird bestimmt durch den Einfluss der elektronischen Umgebung eines Atomkerns oder durch magnetische Wechselwirkung zwischen benachbarten Atomkernen
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Spektroskopie
46 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR)
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Spektroskopie
47 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l deuterierte Lösungsmittel
v Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium
v z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO-d6), Deuterochloroform (CDCl3), Deuteromethanol (CD3OD)
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Spektroskopie
48 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l 1H-NMR-Spektren liefern Strukturinformationen über
v elektronische Umgebung des betrachteten Protons (chemische Verschiebung)
v Anzahl von Wasserstoffatomen (Signalintegration)
v magnetische Wechselwirkung zu benachbarten Wasserstoffkernen (Spin-Spin-Kopplung)
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Spektroskopie
49 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l chemische Verschiebung
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Spektroskopie
50 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l Spin-Spin-Kopplung
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Spektroskopie
51 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l 1H-NMR
10 11
13 12
98
5
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Spektroskopie
52 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l 13C-NMR
v Anzahl der Signale entspricht der Anzahl an Kohlenstoffatomen im Molekül
v Elektronendichte beeinflusst auch hier die chemische Verschiebung (0-220 ppm)
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Spektroskopie
53 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l 13C-NMR
2 4 2 6 8 7 8 3 5 9 12 10 13 11
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Spektroskopie
54 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l 2D-NMR-Spektren
v über Bindungen
o Homonukleare Korrelationsspektroskopie (COSY)
o Heteronukleare Korrelationsspektroskopie (HMBC oder HECTOR)
o Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)
v im Raum
o Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (NOESY)
o Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy (ROESY)
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Spektroskopie
55 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Kernresonanzspektroskopie (NMR) l COSY
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Spektroskopie
56 Phytochemische Untersuchungsmethoden
Naturstoffisolation
Auswahl eines bestimmten Organismus, z.B. Schwämme, Pilze, Bakterien
Rohextrakt
Extraktion mit geeignetem Lösungsmittel (MeOH, EtOAc, Aceton...)
Fraktionen
Fraktionierung mittels Säulenchromatographie (VLC, Silica, Sephadex...)
Isolierung (v.a. semipräparative HPLC)
Reinsubstanzen
Strukturen
Strukturaufklärung (UV, MS, NMR...)
Bioaktivität
z.B. Bioassays mit Krebszellinien, humanpathogenen Keimen oder Kinase-Inhibition
