Plus strand RNA viruses and their host interactions Birke ... · Merkmale von Plusstrang RNA-Viren Einzelsträngiges RNA-Genom, das direkt als mRNA fungieren kann.-> das virale Genom

Plus strand RNA viruses and their host interactions

Birke A. Tews

Merkmale von Plusstrang-RNA-

Viren

Life cycle of plus strand RNA viruses

1. Eintritt

2. Genomfreisetzung

3. Translation und

Polyproteinprozessierung

4. RNA Replikation

5. Partikelzusammenbau

6. Freisetzung

Merkmale von Plusstrang RNA-Viren

Einzelsträngiges RNA-Genom, das direkt als mRNA fungieren kann.

-> das virale Genom ist bereits infektiös (Abgrenzung Retrovirus)

5‘ Ende:

Cap -> Flaviviren, Coronaviren

VPg -> Caliciviren, Picornaviren

Unmodifiziert -> Pestiviren, Hepaciviren

3‘ Ende

Poly-A -> Coronaviren

Unmodifizierte Enden -> Pestiviren, Flaviviren, Hepaciviren

Subgenomische RNAs

Ja: -> Coronaviren, Caliciviren, Ateriviren, Astroviren, Togaviren

Nein: -> Flaviviren, Picornaviren

Picornaviridae – kleine RNA-Viren

Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

- Nicht-umhüllt

- 7-9kb

- 5‘ Vpg & 3‘ poly-A-tail

- IRES

- Ein Polyprotein

Realm: Riboviria

Order: Picornavirales

Family: Picornaviridae

Genus: Aphthovirus

Species: Foot-and-mouth disease virus

Genus: Enterovirus

Species: human enterovirus C (polio)

Coronaviruses – die größten RNA-Viren

- umhüllt

- 27-32kb

- 5‘ Cap & 3‘ poly-A tail

- Zwei Polyproteine (ribosomal frameshift)

- Subgenomische RNAs für (Struktur-)Proteine

Realm: Riboviria

Order: Nidovirales

Suborder: Cornidovirineae

Family: Coronaviridae

Subfamily: Orthocoronavirinae

Genus: Alphacoronavirus

Species: Human coronavirus 229E

Genus: Betacoronavirus

Species: Severe acute respiratory

Syndrome-related coronavirus


Flaviviridae


- Umhüllt

- 10-12kb

- Ein Polyprotein

- Flaviviruses:

- 5‘cap & 3‘ loop

- Hepaciviruses, Pestiviruses

- Naktes, strukturiertes 5‘ &

strukturiertes 3‘ Ende

- IRES

Realm: Riboviria

Order: Unassigned

Family: Flaviviridae

Genus: Flavivirus -> Species: Yellow fever virus

Genus: Hepacivirus -> Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)

Genus: Pestivirus -> Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)

Caliciviridae

- Nicht-umhüllt

- 7-8kb

- 5‘ VPg & 3‘ poly-A-tail

- Subgenomische RNA

Realm: Riboviria

Order: Unassigned

Family: Caliciviridae

Genus: Norovirus

Species: Norwalk virus


Revers-genetische Systeme


„einfacher“ als für Negativstrang RNA-Viren.

Einbringen viraler RNA in die Zelle reicht theoretisch aus, um infektiöse Viren zu

bilden.

Klassischer Ansatz:

Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor

In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen

Einbringen der RNA in Zielzellen


Klassischer Ansatz:

Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor

In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen

- Für Viren mit VPg oder Cap muss dieses in der Reaktion mit eingefügt werden

- Für Viren mit Poly-A-Schwanz muss dieser vom Plasmid kodiert sein, oder

durch Poly-A-tailing angefügt werden

- Für Viren mit „nackten“ Enden ist meist das definierte Ende wichtig.


Genom hat häufig ausgeprägte Sekundärstrukturen -> toxisch/instabil in

Bakterien

-> cDNA auf mehrere Plasmide aufgeteilt.

Die einzelnen Sequenzen werden vor der in vitro Transkription zu einem DNA-

Molekül zusammengefügt.


In vivo Herstellung der „genomischen“ RNA durch transfizierte Zellen

- Durch Wahl eines RNA-Polymerase II Promotors wird die RNA mit einem Cap

modifiziert (gut für Viren mit einem VPg oder Cap-Genom)

- Ein Poly-A-Schwanz kann durch entsprechende Signale und die zellulären

Enzyme dafür angehängt werden.

- Für Viren mit exakten Genomenden kann hier durch die Klonierung eines

Ribozyms das exakte 3‘ Ende generiert werden.

Interaktion mit dem Wirt:

essentielle Wirtsfaktoren

Life cycle of plus strand RNA viruses

1. Entry ->

Receptors/proteases

2. Uncoating -> pH-shift,

endocytotic pathways,

enzymes

3. Translation and

polyprotein processing

-> ribosome, initiation

factors, elongation

factors, proteases,

chaperones

4. RNA replication

5. Assembly

6. Release/Maturation ->

proteases

Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor

Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen

Poliovirus: CD155

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch

Affen)

Realm: Riboviria

Order: Picornavirales

Family: Picornaviridae

Genus: Aphthovirus

Species: Foot-and-mouth disease virus

Genus: Enterovirus

Species: human enterovirus C (polio)



Poliovirus: CD155

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch

Affen)

DNA

Sequenzierung



MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4

(DPP4, CD26)

Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,

Menschen…Realm: Riboviria

Order: Nidovirales

Suborder: Cornidovirineae

Family: Coronaviridae

Subfamily: Orthocoronavirinae

Genus: Alphacoronavirus

Species: Human coronavirus 229E

Genus: Betacoronavirus

Species: Middle eastern respiratory

syndrome-related coronavirus




(DPP4, CD26)


Menschen…

Protein Massenspektrometrie




(DPP4, CD26)


Menschen…

+




(DPP4, CD26)


Menschen…

Jan-Berend Bosch et al. Cell Res 2013 23:9-169-70

Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren

MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung

der Membranfusion. Wirtsfaktor TMPRSS2

Alexandra C. Walls et al. PNAS 2017;114:42:11157-11162


„Scaffolding“-Funktion


der Membranfusion

Protease und Virus müssen zusammenkommen

Earnest et al, Plos Pathogens 2017

ZellkulturMaus



der Membranfusion

Hepatitis C: ein Virus – viele Rezeptoren


Realm: Riboviria

Order: Unassigned


Genus: Hepacivirus

Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)

1 2 3

Hepatitis C is a viral infection, which is

chronic in 80% of the cases (1) and can lead

to cirrhosis (2) and hepatocellular

carcinoma (3)

Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren

Hepatitis C Virus

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell Schimpansen)

- „Attachment factors“: LDL-R & Glykosaminoglykane

- Rezeptoren: SR-BI & CD81

- Notwendige Eintrittsfaktoren: Claudin-1 & Occludin

Model by Sophana Ung

Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren

Hepatitis C Virus

Anfällige Spezies: Mensch (experimentell Schimpansen)

- Nur die humane Isoform möglich: CD81 & OCLN

- SR-BI hochexprimiert in Leberzellen

- Weitere nicht-essentielle Faktoren fördern die Aufnahme

Model by Sophana Ung

Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine

Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?

Exkurs: miRNA

Winter et al. Nature Cell Biology, 2009

Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine

Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?

- HCV hat zwei Bindestellen für miR-122 im 5‘ Ende des Genoms

- miR-122 ist hochkonzentriert in der Leber und reguliert Lipid- und

Cholesterolstoffwechselfunktionen und wirkt als Tumorsuppressor

Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198

HCV ist miR-122 abhängig

Mutierte Bindungsstellen

Details der Interaktion


Details der Interaktion


Stabilisierung der IRES

Chahal J et al, Nucleic Acid Research 2019 Volume 47, Issue 10, 04 June 2019, Pages 5307–5324

miR-122 & HCV

- Stabilisierung der IRES

- Steigerung der Translation

- Schutz der RNA vor Abbau durch Xrn1/2

Kincaid et al, PNAS 2018

Chahal J et al, Nucleic Acid Research 2019

Wirtsfaktoren zur Persistenzetablierung - Pestiviren

Realm: Riboviria

Order: Unassigned


Genus: Pestivirus

Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)

Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)

BVDV

• Zwei Biotypen: nicht-zytopathogen (ncp), zytopathogen (cp)

– Unterscheiden sich durch ihren Effekt in Zellkultur

– Was ist die biologische Relevanz?

Pathogenese: BVD / “Mucosal Disease”

• Infektion

– Meist klinisch inapparent

– Fieber

– Durchfall

– Schleimhautläsionen

– Tod

• Infektion in trächtigen Kühen

– Infektion mit ncp Virusen zwischen Tag 40

und 120 führt zur Infektion des Fetus und zur

Geburt persistent infizierter (PI)Tiere

• PI Tiere:

– Haben keine adaptive Immunantwort

– Haben hohe virale Titer im Blut

– Sind das Virusreservoir

• Überinfektion der PI-Tiere mit einem cp

Virus führt zur “Mucosal Disease”.

Was ist der genetische Unterschied zwischen ncp und cp

Isolaten?

• Marker für cp Viren ist freies NS3 in infizierten

Zellen.

Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)

Regulierung der NS2-3-Spaltung

• Ncp Viren produzieren NS3 zu

frühen Zeiten der infektion

• Cp Viren produzieren NS3 zu

jedem Zeitpunkt der Infektion

• NS2 ist eine Autoprotease, die

sich selbst abspaltet

• Schlußfolgerung: NS3-

Produktion ist in ncp Viren

streng geregelt

• Was sind die molekularen

Grundlagen für die strenge

Regelung in ncp und die

konstitutive Spaltung in cp

Viren?

T. Lackner et al. J. Virol. 2004;78:10765-10775

Molekulare Grundlagen – cp Virusgenome

cp Viren enthalten (zelluläre) Sequenzen, die zur NS2-NS3-Spaltung

führen

Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015

Molekulare Grundlagen – cp Virusgenome

Ausnahme

Regel

Vollständige NS2-3-Spaltung -> kein infektiöses Virus

Insertion einer IRES oder Ubiquitins zwischen NS2 und NS3 -> kein

infektiöses Virus


Ubiquitin verwandte

Proteine -> Spaltung

durch zelluläre Proteasen

Molekulare Grundlage – cp Virusgenome

Einige cp Viren haben ungewöhnliche Insertionen

- 90as des 699as „J-domain protein“ (Jiv = J-domain protein interacting

with viral protein, oder DNAJ-C14)

- Jiv ist ein zelluläres Chaperon, das zur Hsp40 Familie gehört

- Die 90as Sequenz hat keine Proteaseaktivität


Jiv/Jiv90 erlaubt die Spaltung

- NS2 ist eine Autoprotease

- Jiv90 ein essentieller Kofaktor

Rinck et al. A Cellular J-Domain Protein Modulates Polyprotein Processing and Cytopathogenicity of a Pestivirus, J Virol 2001

Jiv-negative Zellen sind resistent

- CRISPR/Cas9 induzierte Zerstörung von Jiv90

- Cp-Viren können sich gleichermaßen in ko Zellen und WT Zellen

vermehren

- Ko Zellen sind resistent gegenüber ncp Viren

O. Isken et al. J. Virol. 2019; doi:10.1128/JVI.01714-18

Die Spaltung in der Infektion

NS3 wird für die Replikation benötigt

NS2-3 wird für den Partikelbau benötigt

Warum? – Adaptierung an NS2/NS3 alleine

Chimäre aus ncp7 und Ossloss

Je ein Aminosäureaustausch in NS2 und NS3 nötig

Sowohl NS2-3 als auch NS3 bilden einen Komplex mit NS4A

Dubrau et al. Plos Pathogens 2017

NS4A interagiert unterschiedlich mit NS3 und NS2-3

Einfluss auf Interaktion mit NS4A


Kompakte Interaktion

NS3/NS4A -> RNA

Replikation

Depletion von Jiv in der

Infektion -> keine Spaltung

NS2-3

Veränderte Interaktion

NS2-3/NS4A ->

Partikelzusammenbau

Zeitliche Regulierung der

Infektion

Jiv Depletion reguliert Replikation und Zusammenbau


Warum die zeitliche Regulierung?

Ncp Virus IFN-Antwort unterdrückt -> Foetus

überlebt

Cp Virus IFN-Antwort vorhanden -> Abort

RNA

Npro/Erns

RNA

Npro/Erns

Take Home?

- Bei Plus-strang RNA Viren ist schon die RNA infektiös

- Wirtsfaktoren sind z.T. verantwortlich für den (Spezies-/Zell-)

Tropismus von Viren

- Und/oder können die Replikation/Partikelproduktion regulieren

- Rezeptoren

- Essentielle Kofaktoren

- Wirtsfaktoren können ganz unterschiedlich sein

- Proteine

- Nukleinsäuren

- Lipide (?? Evtl einen Abschnitt zu Lipoproteinen und HCV

einbringen?

• Xrn und HCV ausbauen

• NS2-3 und NS4A kürzen Evtl DNAJ14C und Flaviviren?

• Lipoproteine und HCV einbauen?

• Ansonsten anderes Bsp für weitere Kofaktornutzung

FRAGEN?

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