Praktikum Biochemie II - biochem.uni-frankfurt.de · Praktikum Biochemie II WS 2010/2011 3-wöchiges Praktikum im Hauptstudium der Biochemie Paul-Ehrlich-Institut Paul-Ehrlich-Str

Praktikum

Biochemie II

WS 2010/2011

3-wöchiges Praktikum im Hauptstudium der Biochemie

Paul-Ehrlich-Institut Paul-Ehrlich-Str. 51-59

D-63225 Langen Tel.: 06103-77-0

Wichtig: Alle Teilnehmer bitte am Montag, den 22.11.2010 um 8:30 Uhr an der Pforte des Paul-Ehrlich-Institutes melden

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Praktikumsleitung: Prof. Dr. Christian J. Buchholz Tel.: 06103-774011 Email: [email protected] Prof. Dr. Ralf Tönjes Tel.: 06103-774010 Email: [email protected] Beteiligte Arbeitsgruppen Abt. Medizinische Biotechnologie (Leiter Prof. Dr. Cichutek): Fachgebiet 6/5 „Virale Gentransferarzneimnittel“ (Prof. Dr. Buchholz) Fachgebiet 6/2 „Nicht-virale Gentransferarzneimittel“ (Prof. Dr. Schweizer) Fachgebiet 6/3 „Tissue Engineering, Zelltherapeutika“ (Prof. Dr. Schumann) Fachgebiet 6/4 „Xenogene Zelltherapeutika“ (Prof. Dr. Tönjes) Sachgebiet 6/01 „Rekombinante Masernviren und Impfstoffe“ (Dr. Mühlebach) Abt. Immunologie Fachgebiet 3/01 Dr. Kirberg Fachgebiet 3/3 „Morphologie“ (Dr. Boller) Abt. Virologie Sachgebiet 2/01 „Forschung beim Abteilungsleiter“, (Dr. Schwantes/Dr. Suezer) Abt. Veterinärmedizin Fachgebiet 4/1 „Bakterielle Impfstoffe und Immunsera“ (Dr. Lößner) Fachgebiet 4/3 „Virusimpfstoffe II“ (Dr. Bastian) Nachwuchsgruppen NG1 Experimentelle Allergiemodelle (Dr. Toda) NG2 Neue Vakzinierungsstrategien und frühe Immunantworten (Dr. Waibler)

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Themenblöcke des Praktikums:

Exp. 1: Immunologische Nachweismethoden I Gr. 1-3: Labor Kirberg Gr. 4-6: Labor Toda

Exp. 2: Immunologische Nachweismethoden II

Gr. 1-3: Labor Schweizer Gr. 4-6: Labor Waibler

Exp. 3: Virusquantifizierung/siRNA

Gr. 1-3: Labor Toenjes Gr. 4-6: Labor Schwantes/Suezer

Exp. 4: Zellengineering (Bakterien und Säugerzellen)

Gr. 1-3: Labor Lößner/Bastian Gr. 4-6: Labor Schumann

Exp. 5: Viraler Gentransfer

Gr. 1-3: Labor Buchholz Gr. 4-6: Labor Mühlebach

Exp. 6: Elektronenmikroskopie

Gr. 1-6: Labor Boller

Tierhausbesichtigung Dr. Plesker, Dr. Coulibaly, Fr. Völker

Protokolle: Jede Gruppe (also A1, B1, usw.) fertigt zu jedem Experiment ein Protokoll an. Das Protokoll wird bis spätestens 16.12.10 an den jeweiligen Versuchsbetreuer per eMail geschickt. Das Protokoll wird einmal korrigiert (üblicherweise auf Papier). Das Protokoll wird entsprechend den Korrekturen überarbeitet. Danach muss eine akzeptable Endversion vorliegen, die dann abgezeichnet wird. Achtung, nur wenn Ihre erste Protokollversion bereits halbwegs akzeptabel ist, wird eine Korrekturrunde ausreichend sein!

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Übersicht zum Zeitplan

1. Woche 22.11.-25.11.

2. Woche 29.11.-2.12.

3. Woche 6.12.-9.12.

Mo Gr. 2/5: Exp. 2 Gr. 1/4: Exp. 3 Gr. 3/6: Exp. 5

Gr. 1/4: Exp. 2 Gr. 3/6: Exp. 3 Gr. 2/5: Exp. 5


Di Gr. 1/4: Exp. 1 Gr. 2/5: Exp. 4 Gr. 3: Exp. 5 Gr. 6: Exp. 6+ Tierhaus

Gr. 3/6: Exp. 1 Gr. 1/4: Exp. 4 Gr. 5: Exp. 5 Gr. 2: Exp. 6+ Tierhaus


Mi Gr. 2/5: Exp. 2 Gr. 1/4: Exp. 3 Gr. 6: Exp. 5 Gr. 3: Exp. 6+ Tierhaus



Do Gr. 1/4: Exp. 1 Gr. 2/5: Exp. 4 Gr. 3/6: Exp. 5



Fr Riedberg Tag Riedberg Tag Riedberg Tag

Gruppeneinteilung: A1/B1=PEI 1, A2/B2=PEI 2, … A6/B6=PEI 6

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Theoretischer Teil BCII Praktikum (jeweils 9.00-10.00, wenn nicht anders angegeben) 22.11.10 Vorbesprechung/Einweisung (8.30 Hörsaal) 23.11.10 Schweizer: Retroviren und retrovirale Vektoren (Hörsaal) 24.11.10 Buchholz/Mühlebach: Oberflächenengineering von viralen Vektoren für Anwendungen in der Molekularen Medizin (Hörsaal) 25.11.10 Toda: Molecular mechanisms of allergic diseases: understanding of signal transduction in inflammatory cells (Hörsaal) 29.11.10 Kirberg: (11.00-12.00 Hörsaal)

30.11.10 Waibler: FACS-Analyse von Immunzellen im Blut (H4 Seminarraum) 01.12.10 Schumann: Transponierbare Elemente im humanen Genom und ihre biomedizinische Anwendung (H4 Seminarraum) 02.12.10 Tönjes: Genome, endogene Retroviren und Suppression der viralen Genexpression durch siRNA (H4 Seminarraum) 06.12.10 Schwantes/Suezer: Virustitration und Pockenvirus-Biologie (Hörsaal) 07.12.10 Boller: Mikroskopie und Elektronenmikroskopie: Ein Überblick über Methoden und Möglichkeiten (Hörsaal) 08.12.10 Lößner/Bastian: Maßgeschneiderte bakterielle Lebendimpfstoffe (Hörsaal) 09.12.10 Abschlußbesprechung (Hörsaal, 15.00-16.00)

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Montag 22.11.2010

Dienstag 23.11.2010

Mittwoch 24.11.2010

Donnerstag 25.11.2010

Freitag

8.30 9.00 9.00 9.00 Riedberg 8.30-10.00 - Vorbesprechung - Einweisung

GenTG

9.00-10.00 - Einführung I

9.00-10.00 - Einführung II

9.00-10.00 - Einführung III

Gr. 2/5: Zellen markieren (Exp. 2) Gr. 1: Lightcycler (Exp. 3) Gr. 4: Primäre Fibroblasten (Exp. 3) Gr. 3/6: Transduktion, Isolierung viraler RNA (Exp. 5)

Gr. 1: LPS Blasten ansetzen (Exp. 1) Gr. 4: T-Zellstimulation (Exp. 1) Gr. 2/5: Zellmanipulation (Exp. 4) Gr. 3: DNA-Präp/PCR (Exp. 5) Gr. 6: EM + Tierhaus (Exp. 6)

Gr. 2/5: FACS (Exp. 2) Gr. 4: Virustitration (Exp. 3) Gr. 1: RT-Test (Exp. 3) Gr. 6: DNA-Präp/PCR (Exp. 5) Gr. 3/6: X-gal Färbung (Exp. 5) Gr. 3: EM + Tierhaus (Exp. 6)

Gr. 1: Killerassay (Exp. 1) Gr. 4: IL-2 Detektion (Exp. 1) Gr. 2/5: Zellanalyse (Exp. 4) Gr. 3/6: Auswertung (Exp 5)

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Montag 29.11.2010

Dienstag 30.11.2010

Mittwoch 1.12.2010


Freitag

9.00 9.00 9.00 9.00 Riedberg 9.00-10.00 - Einführung IV

9.00-10.00 - Einführung V

9.00-10.00 - Einführung VI

9.00-10.00 - Einführung VII


Gr. 3: LPS Blasten ansetzen (Exp. 1) Gr. 6: T-Zellstimulation (Exp. 1) Gr. 1/4: Zellmanipulation (Exp. 4) Gr. 5: DNA-Präp/PCR (Exp. 5) Gr. 2: EM + Tierhaus (Exp. 6)

Gr. 1/4: FACS (Exp. 2) Gr. 3: RT-Test (Exp. 3) Gr. 6: Virustitration (Exp. 3) Gr. 2: DNA-Präp/PCR (Exp. 5) Gr. 2/5: X-gal Färbung (Exp. 5) Gr. 5: EM + Tierhaus(Exp. 6)

Gr. 3: Killerassay (Exp. 1) Gr. 6: IL-2 Detektion (Exp. 1) Gr. 1/4: Zellanalyse (Exp. 4) Gr. 2/5: Auswertung (Exp 5)

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Montag

6.12.2010 Dienstag 7.12.2010

Mittwoch 8.12.2010


Freitag

9.00 9.00 9.00 9.00 Riedberg 9.00-10.00 - Einführung VIII

9.00-10.00 - Einführung IX

9.00-10.00 - Einführung X

16.00 - Abschluss-

besprechung


Gr. 2: LPS Blasten ansetzen (Exp. 1) Gr. 5: T-Zellstimulation (Exp. 1) Gr. 3/6: Zellmanipulation (Exp. 4) Gr. 1: DNA-Präp/PCR (Exp. 5) Gr. 4: EM + Tierhaus (Exp 6)

Gr. 3/6: FACS (Exp. 2) Gr. 2: RT-Test (Exp. 3) Gr. 5: Virustitration (Exp. 3) Gr. 4: DNA-Präp/PCR (Exp. 5) Gr. 1/4: X-gal Färbung Gr. 1: EM + Tierhaus (Exp 6)

Gr. 2: : Killerassay (Exp. 1) Gr. 5: IL-2 Detektion (Exp. 1) Gr. 3/6: Zellanalyse (Exp. 4) Gr. 1/4: Auswertung (Exp 5)

BC II

WS 2010/2011

Experiment 1:

Immunologische Nachweismethoden (I)

Jörg Kirberg Masako Toda Gruppen 1,2,3 Gruppen 4,5,6

[email protected] [email protected]

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D - 63225 Langen Tel.: 06103-77-0

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Teil Kirberg : Zytotoxischer T Lymphozyten Test (Killer Assay)

Zytotoxische T Lymphocyten (CTL - cytotoxic T lymphocytes) erkennen Zielzellen

über ihren T Zell Rezeptor (TCR - T cell receptor). Natürliche Liganden sind dabei die

MHC Moleküle (Major Histocompatibility Complex molecules) welche Peptide

präsentieren. Bindet der TCR eines CTL spezifisch an diesen Liganden (MHC +

Peptid), kommt es zur Induktion des Effektor-Mechanismus, bei dem durch Fas-

und/oder Perforin/Granzyme B-vermittelte Apoptose die Zielzelle abstirbt. In vivo sind

zytotoxische T Zellen für die Immunantwort gegenüber intrazellulären Pathogenen,

z.B. Viren, oder auch Transplantaten oder Tumoren bedeutsam.

CTL können gegen viele Antigene erzeugt werden. Dazu gehören z.B.

(I) Alloantigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC),

(II) Antigene welche auf Polymorphismen zwischen verschiedenen Individuen

zurückzuführen sind (Minor Histocompatibility Antigens),

oder

(III) Antigene welche auf syngenen Zellen in Folge von Infektion, Mutation ('fremd’-

Peptide) oder nach Derivatisierung mit Hapten, präsentiert werden.

CTL entstehen aus ihren ruhenden, nicht zytolytisch aktiven Vorläufern (pCTL -

precursorCTL) nach Stimulierung ihres TCRs innerhalb weniger Tage. In vivo z.B. in

Folge einer Immunisierung oder in vitro während der Co-Kultur mit Zellen, die den

spezifischen Peptid/MHC-Komplex präsentieren.

Ohne vorhergehende in vivo Immunisierung lassen sich in der Regel in vitro nur CTL

gegen MHC-Alloantigene oder gegen bestimmte Haptene (z.B. Trinitrophenol, TNP)

die an syngenen Zellen gekoppelt wurden erzeugen. Vermutlich liegt dies an der

hohen pCTL Frequenz welche spezifisch für diese Antigene sind.

Nach in vivo Immunisierung und in vitro Co-Kultur lassen sich CTL auch gegen

andere Antigene nachweisen (z.B. virale Peptide, Minor Histokompatibility Antigens).

Ex vivo können CTL kurz nach dem Höhepunkt einer viralen Infektion nachgewiesen

werden.

Prinzipiell können alle Zelltypen als Zielzellen (in der Folge Targets genannt) für CTL

(Effectors) verwendet werden. Experimentell am einfachsten zu beherrschen sind

Lymphoblasten, Zellen aus Zellkultur oder Tumorzellen.

Zwei Verfahren werden oft für die Messung der Target-Zell-Zytolyse angewendet:

51Cr-release oder JAM (just another method). Bei dem 51Cr-release Test werden die

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Target Zellen mit radioaktivem 51Cr (in Form von Na251CrO4) markiert und die CTL

vermittelte Zytolyse der Targets führt zur Freisetzung von 51Cr in den Überstand:

CrO42- CrO4

2-

PM

Cr O72-

PM

2

Bei dem JAM wird die Target Zell DNA mit radioaktivem 3H markiert indem

3H-Thymidin zu Zellen gegeben wird welche proliferieren. Nach CTL vermittelter

Zytolyse wird gemessen ob die DNA der Target Zellen in Folge von Apoptose

degradiert wurde. Dazu werden die Zellen mit Wasser durch einen Glasfiberfilter

gewaschen. Hochmolekulare genomische DNA bindet an den Filter während DNA

Fragmente nicht zurückgehalten werden.

Anschließend wird die erhaltene radioaktive Menge ausgezählt und eine CTL

vermittelte Zytolyse/Apoptosis in Bezug zu Kontrollen gesetzt, welche die spontane

und maximal mögliche Zytolyse/Apoptosis ermittelt.

Kursprogramm

Im Kurs soll ein Killer Assay gegen allogene MHC Moleküle durchgeführt werden.

Dazu werden allo-MHC spezifische CTL aus pCTL (Responders) während einer Co-

Kultur mit bestrahlten allogenen Zellen (Stimulators) innerhalb von fünf bis sieben

Tagen erzeugt. Diese Kulturen werden auch als primäre gemischte Lymphozyten

Kultur bezeichnet (1°-MLR - mixed lymphozyte reaction).

Als Quelle für die verschiedenen Lymphozyten dienen Milzzellen von Mäusen mit

unterschiedlichem MHC Haplotyp. Dabei sind C57BL/6 (abgekürzt B6) Mäuse vom

H-2b MHC Haplotyp und BALB/c (B/c) Mäuse vom H-2d MHC Haplotyp.

Lymphozyten aus B6 Mäusen exprimieren daher auf ihrer Zelloberfläche MHC

Moleküle des H-2b Allels, während solche aus BALB/c (B/c) Mäusen MHC Moleküle

des H-2d Allels aufweisen.

Als Target Zellen im Killer Assay (s.u.) dienen aus den beiden Mausstämmen

abstammende Tumorzellinien oder B Zell Lymphoblasten. Letztere werden durch

Stimulation mit LPS (Lipopolysaccarid) für 48 Stunden erhalten (LPS Blasten).

Der Killer Assay wird (siehe Protokoll) hier ohne radioaktive Nuklide durchgeführt.

Stattdessen werden die Target Zellen (LPS Blasten oder Tumorzellen) mit einem

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fluoreszierenden Farbstoff [CFDA(SE)] kovalent markiert. Dies ermöglicht die

Unterscheidung zu den Zellen aus der 1°-MLR; vor allem den CTLs.

Die durch CTL erfolgte Zytolyse wird anschließend im Durchflußcytometer (FACS -

fluorescent activated cell sorter) ermittelt. Sie ist zum einen erkennbar an der

Abnahme von grossen Lymphoblasten relativ zu einer Zunahme von kleinen Zellen

(Apoptotic bodies) innerhalb der fluoreszierenden Target Zell Population. Zum

anderen kann die Zytolyse anhand der Zunahme von fluoreszierenden Target Zellen

mit perforierten Membranen bestimmt werden. Letzteres kann mittels einer Färbung

mit PI (propidium iodide) erfolgen: Nach dem die Zellmembranen bei der Apoptose

durchlässig wurden kann PI in den Zellkern eindringen. PI interkaliert dort in die DNA

und weisst in dieser Form eine deutlich erhöhte Fluoreszens auf.

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1. Arbeits-Tag (Nur Betreuer): Ansetzen der 1°-MLR

Freitag, 20.11.2010 / 27.11.2010 / 4.12.2010

Benötigte Materialien

Sterilbank (Flowhood)

Zentrifuge (bei 5°C)

Responder bzw. Stimulator Zellen (hier Milzzellen aus C57BL/6 bzw. BALB/c

Mäusen; Stimulator Zellen sind zu bestrahlen (137Cs Quelle oder

Röntgenstrahlung; 22 Gy). An diesem Tag evtl. Tumorzellinien auftauen.

CO2 zum Töten der Spendertiere (bzw. per Genickbruch durch Betreuer)

FACS-Puffer (PBS mit 2 % FCS (fetal calf serum)), steril

ACT Puffer (Ammoniumchlorid-Tris Puffer), steril

Trypan Blau Lösung, 0.4 % (w/v)

Medium (SF-IMDM mit % FCS), steril

Plastik Pipetten (10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml), steril

Pipetten Spitzen, Gelb und Blau, steril

Eppendorf Tubes (1.5 ml) für Verdünnungen bei der Zellzahlbestimmung

14 ml Falcon Röhrchen mit Deckel, steril

6 ml Falcon Röhrchen mit Deckel, steril

2 ml Spritzen, Plastik, steril

Petrischalen (6 cm Ø), steril

T-25 Gewebekulturflaschen mit Normal- oder Filterdeckel, steril

Nylon Netze (100 m, 'grob'), steril

Spritzen mit aufgesetzten 40 m ('fein') Nylon Netzen, steril

Pasteur Pipetten aus Glas, kurz, steril

70 % Ethanol in H20 zum Desinfizieren in Spritzflasche

> 95 % Ethanol zum Abflammen

Instrumente (Schere, Pinzette)

Bechergläser mit 95 % Ethanol für Instrumente

Zählkammer (Neubauer/Bürki)

Gestelle für Röhrchen

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Eisbox

Accuboy oder Pipettierball

Stifte

Pipetten (P20, P200, P1.000)

Pipettierball für Pasteur Pipetten

Versuchsprotokoll

Die Spendertiere werden von den Betreuern mit CO2 getötet. Jede Gruppe erhält

mindestens ein Tier, also eine C57BL/6 (schwarze Fellfarbe) und/oder eine

BALB/c (Albino, d.h. weisse Fellfarbe) Maus.

Alle Arbeitsschritte werden steril ausgeführt !

Entnahme der Milz

Die toten Tiere werden äußerlich mit 70 % Ethanol desinfiziert. Auf der rechten

Flanke liegend erfolgt median ein Einschnitt hinter dem Brustkorb durch die

angehobene Haut. Brustkorb und Peritoneum werden durch das

Auseinanderziehen der Hautlappen exponiert.

Die Instrumente werden kurz (!) abgeflammt. Caudal zu der durch das Peritoneum

sichtbaren Milz wird das Peritoneum geöffnet. Die Milz wird entnommen und in

eine Petrischale mit ca. 10 ml FACS-Puffer gegeben.

Herstellen von Einzelzellsuspension und RBC (red blood cell) - Lyse

Die Milz wird zwischen zwei Nylon Netzen in den Deckel der Petrischale, mit

wenig FACS-Puffer, plaziert. Mit Hilfe des Kolbens einer 2 ml Spritze oder einer

gebogenen Pinzette wird die Milz langsam ausgequetscht. Dazu wird die Milz mit

einer zweiten Pinzette zwischen den beiden Nylon Netzen fixiert.

Die Zellsuspension wird unter mehrmaligem Auswaschen (Pasteur Pipette) der

Nylonnetze in ein 14 ml Falcon Röhrchen übertragen.

Die Zellen werden pelletiert (Zentrifuge 10 min., 1.200 rpm (ca. 300xg))

Die Zellen werden in ca. 2.0 ml ACT-Puffer resuspendiert (Pasteur Pipette) und

sofort für 1 min. 30 sec. bei 37°C inkubiert.

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Sofort danach wird die RBC-Lyse durch Auffüllen des Röhrchens mit FACS-Puffer

gestoppt. Den Deckel des Röhrchens vollständig schliessen. 1-2 x Mischen durch

invertieren.

Die Zellen werden pelletiert (Zentrifuge 10 min., 1.200 rpm (ca. 300xg), 5°C)

Die Zellen werden in 2.0 ml Medium resuspendiert (nicht exzessiv schäumen !).

Die Zellsuspension wird durch filtration (40 m Nylon Netz auf Spritzen) von

Klumpen befreit.

Die Röhrchen auf Eis und geschlossen halten um CO2 Verlust zu minimieren.

Zellzahl Bestimmung

Vorverdünnung ca. 1 : 10 (je nach Zelldichte)

(Dabei besteht 1 : 10 aus 1 Volumen Zellen + 9 Volumen FACS-Puffer !)

Die Vorverdünnung 1 : 2 mit Trypan Blau verdünnen

(d.h. 1 Volumen vor-verdünnte Zellen + 1 Volumen Trypan Blau)

Auf die Zählkammer geben und lebende Zellen bestimmen

Trypan Blau färbt tote Zellen - nicht aber Erythrozyten

Erythrozyten verhalten sich doppelbrechend (charakteristische Ringe)

Für eine Neubauer Kammer gilt:

Zellzahl/ml = (16 große Quadrate) x 2 (Trypan Blau Verd.) x Vor-verd. x 104

C57BL/6: x 106 Zellen/ml (2.0 ml) --> x 106 Zellen total

BALB/c: x 106 Zellen/ml (2.0 ml) --> x 106 Zellen total

Überlegung wieviel Zellen wie verwendet werden

Von jeder Gruppe sollten folgende Kulturen angesetzt werden:

a) 10 x 106 Zellen C57BL/6 ---> 10 x 106 X-bestrahlte BALB/c Zellen

b) 10 x 106 Zellen BALB/c ---> 10 x 106 X-bestrahlte C57BL/6 Zellen

d.h., von jeder Milz werden mindestens 20 x 106 Zellen benötigt, wobei eine Hälfte

davon (10 x 106 Zellen) bestrahlt werden soll, die andere Hälfte nicht.

Falls weniger Zellen vorhanden sind bzw. nur Zellen eines Mausstamms, bitte bei

den KurskollegInnen nachfragen. Bei zu wenigen Zellen nur eine der Kulturen

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nach Wahl ansetzen. Falls noch mehr Zellen benötigt werden bitte bei den

Betreuern nachfragen.

Zum Bestrahlen die Zellen bei den Betreuern abgeben.

Bitte in ca. 3 ml Volumen in 6 ml Falcon Röhrchen. Die Zellen werden mit

2.200 rad (22 Gy) in einer 137Cs Quelle bestrahlt.

Ansetzen der 1°-MLR

10 x 106 Responders werden mit 10 x 106 X-bestrahlten Stimulators in einem

Gesamtvolumen von 8 ml Medium kultiviert.

Zur Kultivation werden die Zellen in senkrecht stehende T-25

Gewebekulturflaschen gegeben und aufrecht bei 37°C, 5 % CO2, für 5 bis 7 Tage

kultiviert. Der Deckel ist im Inkubator nicht ganz zu schliessen, es sei denn es

handelt sich um Kulturflaschen mit Filterdeckel.

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2. Arbeits-Tag (1. Arbeits-Tag für Studenten): LPS Blasten ansetzen

Dienstag, 23.11.2010 / 30.11.2010 / 7.12.2010

Benötigte Materialien (zusätzlich zu denen vom 1. Tag)

LPS Stocklösung (5 mg/ml); 1 : 250 verdünnt zu gebrauchen (= 20 g/ml)

T-75 Gewebekulturflaschen mit Filterdeckel, steril

Versuchsprotokoll

Jede Gruppe erhält mindestens eine C57BL/6 (schwarze Fellfarbe) und/oder eine

BALB/c (Albino, d.h. weisse Fellfarbe) Maus.

Alle Arbeitsschritte werden steril ausgeführt !

Beschreibung der folgenden Arbeitsschritte siehe 1. Arbeits-Tag:

Entnahme der Milz

Herstellen von Einzelzellsuspension und RBC (red blood cell) - Lyse

Zellzahl Bestimmung

C57BL/6: x 106 Zellen/ml (2.0 ml) --> x 106 Zellen total

BALB/c: x 106 Zellen/ml (2.0 ml) --> x 106 Zellen total

Überlegung wieviel Zellen wie verwendet werden

Optimal sollten folgende Kulturen angesetzt werden:

a) 30 x 106 Zellen aus C57BL/6, +LPS

b) 30 x 106 Zellen aus BALB/c, +LPS

Beide Kulturen werden benötigt.

Ansetzen der LPS Blasten

30 x 106 Milz Zellen werden in 30 ml Medium mit 120 l LPS (5 mg/ml) kultiviert.

Zur Kultivierung werden die Zellen in T-75 Gewebekulturflaschen gegeben und bei

37°C, 5 % CO2, für 2 Tage liegend kultiviert. Deckel leicht öffnen bzw. Flasche mit

Filterdeckel verwenden.

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Ansetzen der Tumorzellinien (falls geplant)

Je nach Bedarf an Zellen werden die Zellinien gesplittet und Kulturen in T-75

Gewebekulturflaschen angesetzt.

Zentrifugen auf Raumtemperatur für den folgenden Versuchstag stellen!

3. Arbeits-Tag (2. Arbeits-Tag für Studenten): Killer Assay

[es wird ein längerer Tag !]

Donnerstag, 25.11.2010 / 2.12.2010 / 9.12.2010

Benötigte Materialien (zusätzlich zu denen vom 1. bzw. 2. Arbeits-Tag)

Zentrifuge auf Raumtemperatur am Morgen

Zentrifuge für 96-well Platten

FACS (FACScan bzw. FACSCalibur)

Vortex

Repetitive Pipette

[Eppendorf Mulipette, 1-5 (alt) oder 0.5 - 9 Einheiten (neues Modell)]

Eisbehälter

'Rad' für 6 ml Falcon Röhrchen (oder 8 min. -langsam- per Hand bewegen)

evtl. Tumorzellinien (falls nicht am 2. Tag vorbereitet).

Ficoll Paque (bei Raumtemperatur)

PBS

5(6)-CFDA, SE (Molecular Probes, C-1157) = CFSE , 10 mM in DMSO

Medium + 1 % Saponin (w/v)

[evtl. PI Stocklösung (0.5 mg/ml in H2O)]

14 ml Falcon Röhrchen, Polypropylene

14 ml Konisches (V-Bottom) Polypropylene Röhrchen

Spitzen für Repetitive Pipette (0.5 ml, 2.5 ml)

96-well Platten, U-Boden, mit Deckel

Micron Röhrchen für FACS Analyse

Gestell für Micron Röhrchen

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Pasteur Pipetten aus Glas, lang

Schema für 96-well Platten

Versuchsprotokoll

Isolierung der LPS Blasten über Ficoll Dichtegradienten

Die Kulturen der LPS Blasten von C57BL/6 bzw. BALB/c Mäusen vom 2. Tag

werden geerntet. Jeweils max. 10 ml einer Kultur wird in ein 14 ml Rundboden-

Falcon Röhrchen gegeben – d.h. drei Röhrchen pro Kultur.

In jedes der Röhrchen wird eine lange Pasteur Pipette gegeben. Durch die

Pasteur Pipette werden ca. 3 ml Ficoll unterschichtet.

Zentrifugation: Bei langsamem Anlauf, langsamen Abbremsen !

40 min. 1.600 rpm, 21°C

Die LPS Blasten befinden sich nach dem Zentrifugieren an der Interphase

zwischen Ficoll und Medium. Zum Ernten erst einen Teil des oben befindlichen

Mediums mit einer Pasteur Pipette entfernen. Dann die Blasten mit der Pasteur

Pipette in ein frisches 14 ml Falcon Röhrchen übertragen ohne zu viel von dem

Ficoll mit zu nehmen. Zellen aus gleicher Kultur werden dabei gepoolt. Alle

Schritte nun auf Eis bzw. bei 4°C.

Die LPS Blasten bzw. Tumorzellen 2 x mit PBS waschen (Zentrifugation 10 min.,

1.200 rpm, 4°C).

In 1.2 ml PBS resuspendieren. 1.0 ml in ein 6 ml Falcon Röhrchen geben. Die

übrigen 0.2 ml auf Eis aufbewahren (nicht färben) und etwas Medium (ca. 0.2 ml)

zugeben.

Evtl. die Tumorzellinien ernten. Evtl. teilen sich dazu je zwei Gruppen eine 20 ml

Kultur von P815 oder EL-4 Tumorzellen.

Färbung der LPS Blasten bzw. Tumorzellen mit CFSE

Die verdünnte Lösung des CFSE Farbstoffes ist nur sehr kurz haltbar, daher erst

alles für die folgenden Schritte vorbereiten.

Der CFSE Farbstoff (10 mM Stocklösung) wird 1 : 2.500 in PBS vor-verdünnt (d.h.

0.8 l in 2 ml).

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Zu 1 ml LPS Blasten bzw. Tumorzellen in 6 ml Falcon Röhrchen werden dann

sofort 1 ml frisch vor-verdünnte Farbstofflösung unter ständigem Mischen

(langsam eingestellter Vortex) gegeben.

Färbereaktion: 8 min., bei Raumtemperatur, unter ständigem Mischen (z.B. auf

einem 'Rad' oder -langsam- per Hand).

Nach der Färbung werden die LPS Blasten bzw. Tumorzellen mindestens 2 x mit

FACS-Puffer und einmal mit Medium gewaschen.

[Alternativ: Zentrifugieren durch einen Gradienten. Zellen dazu in PBS oder FACS-

Puffer resuspendieren, mit Medium unterschichten, zentrifugieren (langsamer

Anlauf, langsames Abbremsen), Überstand absaugen, in kleinem Volumen

resuspendieren und in ein frische Röhrchen überführen].

Die gefärbten LPS Blasten bzw. Tumorzellen zuletzt in 1 ml Medium

resuspendieren (ohne Schaum !) und auf Eis aufbewahren.

(Eine Hälfte der Gruppe soll nun beginnen die Effektor-CTLs zu ernten und diese

für den CTL Assay in 96-well Platten auszuplattieren, siehe Pipettierreihenfolge.

Die LPS Blasten bzw. Tumorzellen als Targets werden zuletzt zugegeben. Bitte

sich in das Pipettierschema hineindenken bevor die Betreuer gefragt werden!).

Zelldichte der LPS Blasten bzw. Tumorzellen bestimmen

C57BL/6: x 106 Zellen/ml (1 ml) --> x 106 Zellen total

BALB/c: x 106 Zellen/ml (1 ml) --> x 106 Zellen total

P815: x 106 Zellen/ml (1 ml) --> x 106 Zellen total

EL-4: x 106 Zellen/ml (1 ml) --> x 106 Zellen total

Die LPS Blasten bzw. Tumorzellen auf 2 x 105 Zellen/ml einstellen. Bei 100 l pro

Vertiefung entspricht dies 20.000 LPS Blasten bzw. Tumorzellen pro Vertiefung.

Es werden ca. 2 ml benötigt (also 4 x 105 Zellen - das sollte möglich sein!).

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Ernte der Effektor-CTLs (Killers)

Mit einer Pasteur Pipette werden die Zellen der 1°-MLR Kulturen resuspendiert

und jeweils eine Kultur in ein 14 ml Konisches (V-Bottom) Polypropylen Röhrchen

übertragen.

Die Zellen werden pelletiert (Zentrifugation 10 min., 1.200 rpm, 4°C) und in 1 ml

Medium resuspendiert. Sollten mehrere Kulturen angesetzt worden sein bitte

Zellen gleicher Kultur (B6 -> B/c irrad. oder B/c -> B6 irrad.) zusammengegeben

und dann entsprechend höher verdünnen.

Jede Gruppe benötigt 600 l von jeder der beiden (B6 -> B/c irrad. und

B/c -> B6 irrad.) Kulturen. Evtl. Reste an andere Gruppen verteilen.

Ausplattieren der Effektor-CTLs

In der unten angegebenen Reihenfolge die Zellen entsprechend dem

Pipettierschema ausplattieren. Bitte sich in das Pipettierschema hineindenken

bevor die Betreuer gefragt werden!

Das Pipettieren sollte zügig erfolgen um zu vermeiden das der pH-Wert des

Mediums durch CO2-Verlust zu stark ansteigt ("Pink“-colour).

Prinzipiell wird der CTL Assay in 96-well Platten, mit U-Boden, durchgeführt.

Die einzelnen Bestimmungen erfolgen einfach. Bei Konstanter LPS Target- bzw.

Tumorzellen-Anzahl wird eine Effektor-CTL Verdünnungsreihe in Schritten von

1 : 3 Verdünnungen durchgeführt.

Als positiv bzw. negativ Kontrollen dienen Vertiefungen, in die wohl Target Zellen,

aber keine Effektor-CTL zugegeben werden. Neben den Target Zellen enthalten

diese nur Medium (zur Bestimmung der spontanen Zytolyse) bzw. Medium mit

Saponin (ein Detergens welches zur Lyse führt; zur Bestimmung der maximalen

Zytolyse). Dies erfolgt jeweils für B6 bzw. B/c LPS Targets bzw. Tumorzellen

getrennt.

Pipettierreihenfolge:

1). In die Vertiefungen mit der höchsten Effektor-CTL-Anzahl werden 150 l der

geernteten Effektor-CTLs vorgelegt.

Siehe Pipettierschema: 1 (Einfache Bestimmung) x 4 (B6 bzw. B/c LPS Targets,

zwei Tumorzellinien) x 150 l = 600 l.

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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2). Alle anderen Vertiefungen der Effektor-CTL Verdünnungsreihe erhalten 100 l

Medium. Mit einer Pipette wird dann die 1 in 3 Verdünnungsreihe pipettiert (dazu

werden 50 l fortlaufend verdünnt und weitergeführt bzw. am Ende der

Verdünnungsreihe verworfen).

3). negativ Kontrolle: einige Vertiefungen erhalten 100 l Medium (Spontaner

Zelltot, d.h. ohne Effktor-CTLs). Evtl. in zweifacher Anzahl.

4). positiv Kontrolle: einige Vertiefungen erhalten 100 l Medium + 1 % Saponin

(maximaler Zelltot durch Saponin, d.h. ohne Effektor-CTLs).

Sollten die Taget Zellen noch nicht bereit stehen ist die 96-well Platte mit den

CTLs im Inkubator (37°C, 5 % CO2) aufzubewahren.

5). Zuletzt werden zu allen Vertiefungen 100 l der verschiedenen Targets

(B6 bzw. B/c LPS Targets, evtl. von den zwei Tumorzellinien) zugegeben.

6). In die verbleibenden Vertiefungen werden zum einen die noch vorhandenen

LPS Blasten bzw. Tumorzellen gegeben, und in andere Vertiefungen evtl.

Übriggebliebene Reste der Effektor-CTLs. Diese Vertiefungen dienen dazu, nach

der Inkubation genügend Zellen zu erhalten mit deren Hilfe der FACS eingestellt

werden kann.

Schließlich wird die 96-well Platte (mit aufgesetztem Deckel) 5 min. 500 rpm

zentrifugiert. Dann erfolgt die Inkubation bei 37°C, 5 % CO2, für 4 Stunden.

Bestimmung der Zytolyse von fluoreszensmarkierten Blasten

Nach Inkubation werden die Zellen in der 96-well Platte 1 x mit FACS-Puffer

gewaschen (zentrifugation 2 min., 2.000 rpm, Überstand wird durch beherztes

einmaliges Auskippen ('flicken') entfernt, direkt danach weiterhin 'auf dem Kopf'

auf Zellstoff aufsetzen, Zellen vor Zugabe von FACS-Puffer auf dem Vortex

resuspendieren).

Zuletzt die Zellen in 50 l FACS-Puffer resuspendieren und in kalte Micron

Röhrchen überführen. Auf Eis aufbewahren.

Von den Vertiefungen, welche für die FACS Einstellung nur LPS Targets bzw.

Tumorzellen oder nur Effektor-CTLs enthielten, jeweils die Zellen gleicher Art in

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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ein Micron Röhrchen zusammen geben. Ebenso von den übrig gelassenen nicht

gefärbten LPS Blasten jeweils ein Micron Röhrchen bereithalten (Kontrolle der

Färbung).

Anschließend mit einem der Betreuer den FACS aufsuchen.

Da normalerweise gut zu sehen ist wie die Zellgrösse nach Zytolyse abnimmt ist

vorläufig eine Zugabe von PI nicht vorgesehen. Falls dies doch gewünscht wird

wie folgt vorgehen: PI erst kurz vor Analyse der Zellen auf dem FACS zugeben.

Dazu wird die PI Stocklösung vor-verdünnt, so das nach Zugabe von z.B. 10 l

eine PI Konzentration von 2.5 g/ml in der Probe resultiert.

Effektor-CTL zu Target (LPS Blasten) Verhältnis (E:T Ratio)

Für die einzelnen Verdünnungen wird dieses Verhältnis errechnet. Dabei wird bei

der Berechnung der Anzahl von Effektor-CTLs pro Vertiefung die Anzahl Zellen,

welche zu Beginn in die 1°-MLR eingesetzt wurden, zugrunde gelegt, unter

Berücksichtigung der verschiedenen Verdünnungs- und Konzentrierungsschritte.

Die Anzahl der Targets pro Vertiefung ergibt sich zu 20.000 (s.o.).

Spezifische Lyse

Im Fall der Messung der Zytolyse per FACS ergibt sich z.B. folgende Möglichkeit:

% specific blast lysis experimental blast % - spontaneous -

x 100

experimental PI %+ -- spontaneous PI %

x 100% specific lysis (PI )

minnimal (saponin) blast %

blast %

spontaneous blast %

+spontaneous PI %

+

maximal (saponin) PI %+ +

Alternativ kann man für jede Messung das Verhältnis aus 'lebende Blasten’ zu

’tote Zellen’ bestimmen und analog in obige Formel setzen (s.u.).

Bei dieser Art der experimentellen Ausführung sollte bei den Ergebnissen der

Prozentsatz an Blasten ohne Behandlung (spontaneous blast % bzw. das

Verhältnis 'lebende Blasten’ zu ’tote Zellen’) bzw. der Prozentsatz von spontan PI+

Zellen als 'Gütewert' mit angegeben werden.

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Die spezifische Lyse wird bei JAM bzw. 51Cr-release wie folgt berechnet:

Um Ergebnisse dieser Assays interpretieren zu können ist es üblich neben der

Standart-Abweichung der experimentellen Ergebnisse folgende Daten mit

anzugeben: 3H-Thymidin Einbau (JAM), spontane 51Cr Freisetzung als

Prozentsatz der total möglichen 51Cr Freisetzung (51Cr-release).

Auswertung

In einem Diagramm wird die spezifische Lyse in Abhängigkeit der E:T Ratio

aufgetragen. Beispiel:

Experimental values

% big cells % small cells % spec. lysis

E/T = 50:1 36 43 70.9 % specific lysis=100*((36/43)-(62/22))/((2/84)-(62/22))



spontaneous lysis 62 22 0.0 % specific lysis=100*((62/22)-(62/22))/((2/84)-(62/22))

maximal lysis 2 84 100.0 % specific lysis=100*((2/84)-(62/22))/((2/84)-(62/22))

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'Living blast’ to 'dead cell’ fraction was 62 % to 22 %, respectively.

B/c -> B6 on B6 targets

-20.0

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

50:1 17:1 6:1

E:T ratio

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Teil Toda: Messung der antigen-spezifischen CD4+ T-Zellaktivierung

T-Zellen stellen eine Untergruppe der Lymphozyten dar. Sie spielen eine kritische Rolle in

der adaptiven Immunantwort. T-Zellen werden in zwei große Untergruppen unterteilt,

basierend auf der Expression der Co-Rezeptoren CD4 oder CD8 auf der Zelloberfläche.

CD4+ T-Zellen, auch T-Helfer-Zellen genannt, assistieren anderen Leukozyten bei der

Ausführung ihrer immunologischen Aufgaben: Sie unterstützen die Reifung von B-Zellen in

Plasma-Zellen (Antikörper-produzierende Zellen) und die Aktivierung und Expansion von

CD8+ T-Zellen und Makrophagen. Dagegen differenzieren CD8+ T-Zellen überwiegend in

zytotoxische Zellen welche Virus-infizierte Zellen und Tumor-Zellen eliminieren können.

Für die Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen werden zwei Signale benötigt. Das erste Signal

besteht aus der Interaktion des T-Zell-Rezeptors (TCR) mit Antigen-Peptid/MHC-Klasse II-

Molekül Komplexen, welche auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs),

z.B. dendritischen Zellen und Makrophagen, präsentiert werden. Der TCR bindet dabei

neben dem MHC Molekül nur an ein Peptid-Fragment des Antigens, welches im Inneren der

präsentierenden Zelle vorher aus dem Antigen prozessiert wurde. Diese Prozessierung

findet in lysosomalen bzw. endosomalen Kompartimenten der APCs statt. Die Peptide

werden also durch die MHC-Klasse II Moleküle auf der Oberfläche der APCs den CD4+ T-

Zellen präsentiert. Aufgrund der großen Variabilität der möglichen Antigene ist für eine

effektive Immunantwort eine mindestens ebenso große Variabilität der TCRs erforderlich.

Diese wird durch die VDJ-Rekombination der Gen-Elemente der TCR Ketten während der T-

Zell-Reifung im Thymus gewährleistet.

Das zweite Signal zur T-Zell-Aktivierung ist Antigen-unspezifisch und wird als 'Co-Stimulus’

bezeichnet. Die bedeutendsten co-stimulatorischen Signale für die Aktivierung von naiven T-

Zellen werden durch Mitglieder der B7-Familie (B7-1: CD80; B7-2: CD86) vermittelt, welche

ebenfalls auf der Oberfläche von APCs präsentiert werden. Der dazugehörige

Interaktionspartner auf den T-Zellen ist CD28.

Naive T-Zellen exprimieren den IL-2 Rezeptor (IL-2R), welcher aus einer - und einer -

Kette gebildet wird. Dabei hat die -Kette eine niedrige Bindungsaffinität für IL-2. Bei der Co-

Stimulierung von T-Zellen über CD28 mit B7-1 oder B7-2, in Kombination mit einer TCR-

Aktivierung, wird die Synthese von IL-2 induziert. IL-2 ist ein essentieller Wachstumsfaktor

für T-Zellen, der die T-Zellproliferation fördert. Die autokrine und/oder parakrine

Verfügbarkeit von IL-2 ist daher ein entscheidender Schritt für die adaptive Immunantwort.

Es ermöglicht den wenigen für ein bestimmtes Antigen spezifischen T-Zellen sich effizient zu

vermehren. Ohne diese Expansion kann keine effektive Immunantwort ausgeführt werden

(z.B. gegen Pathogene).

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Um die T-Zell vermittelte Immunität zu untersuchen werden vielfach transgene Mäuse

verwendet, die einen vorgefertigten TCR von bekannter Spezifität in den T Zellen

exprimieren. Dies hat gegenüber normalen [Wildtyp (WT)]-Mäusen den Vorteil, dass in

diesen Tieren T-Zellen einer bestimmten Antigen-spezifität in großer Zahl produziert werden.

Dies vereinfacht die experimentelle Detektion einer Antigen-spezifischen Immunantwort

erheblich. WT-Mäuse haben dagegen eine große Variabilität in ihrer T-Zell-Antigen-Spezifität

(polyklonale TCRs), und haben deswegen nur eine sehr geringe Anzahl von T-Zellen, welche

spezifisch für ein gegebenes Antigen sind.

DO11.10 Mäuse sind ein Beispiel für eine Mauslinie, die einen transgenen TCR trägt. Die

meissten CD4+ T-Zellen aus diesen transgenen Mäusen tragen auf ihrer Oberfläche einen

TCR, der an den Komplex aus den Aminosäuren 323-339 des Ovalbumins (ein

Hauptallergen des Eiweißes) und präsentiert auf I-Ad Klasse II MHC Molekülen bindet.

In diesem Praktikum detektieren wir die Ovalbumin-induzierte T-Zellaktivierung von

Lymphozyten aus DO11.10 Mäusen. Dazu wird den Mäusen die Milz entnommen. Als

sekundäres lymphatisches Organ enthält die Milz sowohl T-Zellen wie APCs. Es wird eine

Einzel-Zellsusupensionen hergestellt und die Zellen werden in vitro mit OVA stimuliert. Falls

OVA-spezifische T-Zellen aktiviert wurden sollte IL-2 sekretiert werden und im Überstand der

Zellen zu detektieren sein. Das produzierte IL-2 wird mittels Enzyme Linked-Immuno-Sorbent

Assay (ELISA) detektiert und quantifiziert.

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1. Arbeits-Tag: Ansetzen der T-Zell Stimulation

Dienstag 23.11.2010 / 30.11.2010 / 7.12.2010

Tag 1

Mäuse

Der verwendete Mausstamm DO11.10 wurde unter spezifiziert pathogen-freien Bedingungen

(SPF) in den S1-Räumen der zentralen Tierhaltung im PEI gezüchtet.

Als Kontrollmäuse werden wildtyp Mäuse (Stamm BALB/c, von Charles River) verwendet.

Die Haltung/Zucht/Tötung der Mäuse erfolgt im Einklang zur relevanten Gesetzgebung. Das

PEI wird durch das Regierungspräsidium Darmstadt dementsprechend überwacht.

Medium

Als Basalmedium wird RPMI 1640, dem 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und

5x10-5 M 2-Mercaptoethanol zugegeben werden, genutzt. Sollte das Medium kein Glutamin

enthalten, muss diese Aminosäure noch zugegeben werden. Dies ist das "Komplettmedium“:

Materialien für "Komplettmedium“:

RPMI 1640 (Invitrogen) : 500 ml

Penicillin, Streptomycin-Lösung : 5.0 ml

(100x konzentriert Invitrogen)

Glutamine (100x konzentriert PEI) : 5.0 ml

2-Mercaptoethanol (14 M, Sigma Aldrich) : 3.5 µl

Es sind ZWEI verschiedene Medienansätze [(A) mit/ohne Antigen, (B) "Zellkulturmedium“]

daraus zu erstellen:

(A): Dem Komplettmedium wird kein/wird Antigen/Mitogen zugegeben (s.u.)

(B): Dem Komplettmedium wird FCS (fötales Rinderserum) zugegeben:

500 ml Komplettmedium + 50 ml FCS = "Zellkulturmedium“

Herstellung der Antigen-Lösung (A)

- als Antigen wird OVA (Sigma Aldrich; Grade V) verwendet

- Es werden Lösungen mit einer Konzentration von 20, 200 und 2000 g/ml OVA in

Komplettmedium (also ohne FCS) angesetzt

- als T-Zell Mitogen (positive Kontrolle) wird, Concanavalin A (Con A, Sigma Aldrich)

verwendet

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- Es werden Lösungen mit einer Konzentration von 2,0 und 10 g/ml Con A in

Komplettmedium (also ohne FCS) angesetzt

- 100 µl der gewünschten Antigen-Lösung werden in die vorgesehen Wells der 96er

Multiwellplatte einpipettiert

- Während der Präparation der Zellen sollte die Platte bei Raumtemperatur gelagert werden

(sollte die Präperation der Zellen längere Zeit in Anspruch nehmen, ist es besser sie in den

Kühlschrank zu stellen; die Platte sollte aber Raumtemperatur haben, wenn die Zellen

ausgesät werden)

Herstellung der Milz-Zellsuspension

- die Milz wird unter sterilen Bedingungen aus der Maus entnommen, die Arbeit erfolgt unter

der sterilen Bank (Laminar Air Flow)

- das Organ wird in eine Petrischale (Ø 6 cm) mit 5.0 ml Zellkulturmedium gelegt

- um die Zellen der Milz zu erhalten, wird diese mit dem Rücken eines Stempels einer Spritze

zerquetscht. Die Zellen schwimmen nun im Medium.

- Zellsuspension über ein Zellsieb in ein 50 ml Falcon geben

- die Petrischale mit 5.0 ml Zellkulturmedium spülen um restliche Zellen aufzunehmen

- nun wird die Zellsuspension in ein 15 ml Falcon überführt

- mit Zellkulturmedium auf 15 ml auffüllen

- 10 min bei 1300 rpm bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren

- den Überstand verwerfen; etwas Überstand im Falcon belassen, damit das Pellet bedeckt

ist, nun das Falcon schütteln, bis sich das Pellet gelöst hat

- Lysierpuffer zugeben (150 mM NH4Cl; 1-2 ml je Milz) um die Roten Blutzellen zu lysieren, 1

min bei RT inkubieren

- 10 min bei 1300 rpm bei RT zentrifugieren

- der Überstand sollte rot sein, das Pellet weiß

- der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in 12 ml RPMI mit 10 % FCS gelöst

- 10 min bei 1300 rpm bei RT zentrifugieren

- der Überstand wird verworfen und der Waschschritt 2 x wiederholt

- die Zellen werden in einer geeigneten Menge Zellkulturmedium gelöst (5 ml je Milz)

- die Zellen werden gezählt und die Zellzahl auf 8 x 106 Zellen eingestellt

- 100 µl der Zellsuspension werden je Well in eine 96er Multiwellplatte einpipettiert

- zusätzlich sollte 100 µl Antigen-Lösungen in den Wells sein, somit ist das Gesamtvolumen

je Well 200 µl

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Platte

jeweils als Dreifachbestimmung/pro gleichen Probenbedingung (z.B.: A1,2,3; A4,5,6;

...)

Milzzell-Kultur

- die Zellen werden in einem CO2-Inkubator bei 37°C , 5% CO2 und 95% relative Luftfeuchte

kultiviert

- Der Zellüberstand wird nach 24 h kultivieren abgenommen

- der Überstand sollte, bis zur ELISA-Messung, bei -20°C gelagert werden

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2. Arbeits-Tag: Detektion von IL-2 mittels ELISA

Donnerstag, 25.11.2010 / 2.12.2010 / 9.12.2010

Tag 3

Beobachtung der Zellen

- an Tag 3 der Zellkultur werden die Zellen unter dem Mikroskop angesehen

- wenn die T-Zellen durch die Antigenstimulation aktiviert wurden, bilden sie „Blasten“,

welche größer sind als nichtaktivierte Zellen

- die Zellen werden unter dem Mikroskop fotografiert

Zytokin ELISA

Die IL-2 Konzentration im Zellkulturüberstand wird mit Hilfe eines ELISA ermittelt.

(Medien/Puffer/Reagenzien untenstehend)

- der anti-Maus-IL-2-Antikörper wird in Coating-Puffer auf eine Konzentration von

0.5 µg/ml verdünnt

- eine ELISA-Platte wird mit 50 µl/well Erstantikörper (=anti-MausIL-2) gecoatet

- die Platte wird über Nacht im Kühlschrank inkubiert

- die Platte wird 3x mit je 150 µl/well Waschpuffer gewaschen

- die freien Bindungsstellen werden durch Zugabe von 100 µl/well Blocking-Puffer und

Inkubation der Platte für 1 h bei RT und 80 rpm auf dem Schüttler abgeblockt


- die Proben und der Zytokin-Standard (von 4000 pg/ml, 2000 pg/ml, 1000 pg/ml …,

serielle Verdünnungsreihe; mindestens 4 verschiedene Konzentrationen werden für

die Standardkurve benötigt, mehr wären besser) werden in RPMI (mit 5 % FCS)

verdünnt. Von den Verdünnungen werden 50 µl/well in die Platte gegeben

- die Platte wird für 2 h bei RT und 80 rpm auf dem Schüttler inkubiert


- der Detektionsantikörper wird in Assay-Puffer auf eine Konzentration von 0.5 µg/ml

verdünnt

- es werden 50 µl/well Detektionsantikörper in die Platte gegeben

- die Platte wird für 1 h bei RT und 80 rpm auf dem Schüttler inkubiert


- Streptavidin konjugiert mit Meerrettichperoxidase (= HRP-Strep) wird 1:4000 in

Assay-Puffer verdünnt

- es werden 50 µl/well verdünnte HRP-Strep Lösung in die Platte gegeben

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- die Platte wird für 30 min bei RT und 80 rpm auf dem Schüttler inkubiert

- die Platte wird mindestens 3x mit je 150 µl/well Waschpuffer gewaschen

- die TMB-Substratlösungen A und B werden im Verhältnis 1:1 gemischt

- es werden 100 µl/well TMB-Substrat in die Platte gegeben

- die Platte wird maximal 30 min bei RT, 80 rpm und im Dunkeln auf dem Schüttler

inkubiert (klar blau)

- zum Abstoppen der Reaktion werden 50 µl/well 1 N H2SO4 in die Platte gegeben

(blau → gelb)

- Messung der Absorption bei 450 nm und 630 nm Referenzfilter im ELISA-Reader

Platten-Layout:

Jede Probe von Tag 1with doppelt im ELISA bestimmt

Puffer und Lösungen für den ELISA

Coating-Puffer:

50 mmol/l Natriumcarbonatpuffer pH 9,6

(1.696 g Na2CO3 + 2.856 g NaHCO3 ad 1 l mit Reinstwasser)

Waschpuffer:

PBS + 0.05 % Tween 20 (250 µl Tween in 500 ml PBS)

Blocking-Puffer:

PBS + 2 % BSA

Medium:

RPMI 1640 + 5 % FCS

Medium wird NUR für die Verdünnung der Proben und des Standards verwendet!!!

Assay-Puffer:

PBS + 0.05 % Tween 20 + 1 % BSA

TMB-Substrat:

Tetramethylbenzidine (TMB) substrate reagent set (BD Bioscience)

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Antikörper

Anti-Maus-IL-2 monklonaler Antikörper (Klon; JES6-1A12, Biolegend )

Biotin markierter anti-murine IL-2 monklonaler Antikörper (Klon; JES6-5H4, Biolegend)

Standard

rekombinantes murines IL-2 (PeproTech)

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Experiment 2: Immunologische Nachweismethoden II

Wichtig

Die Gruppen 1-3 führen das Experiment an humanen Zellen (PBMC) in der AG

Schweizer durch (A), die Gruppen 4-6 an murinen Zellen in der AG Waibler (B).

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Inhalt des Praktikums

In diesem Versuch sollen periphere humane Blutlymphozyten (PBMCs= peripheral blood

mononuclear cells) oder Immunzellen der Maus isoliert und auf charakteristische

Oberflächenmarker mittels FACS-Analyse untersucht werden. Grundsätzlich spielen

Lymphozyten eine bedeutende Rolle für den Ablauf von Immunreaktionen. Normalerweise

sind sie für die erworbene (adaptive) Immunität verantwortlich und dienen der Abwehr z.B.

von Mikroorganismen oder entarteter Zellen im Körper. Die Phänotypisierung erfolgt mittels

Bestimmung populationsspezifischer Zelloberflächenproteine (Clusters of Differentiation

oder CD-Marker). Diese lassen sich durch spezifische Antikörper identifizieren und

durchflußzytometrisch analysieren. Durchflußzytometrische Analysen werden zunehmend

bei zahlreichen immunologischen Fragestellungen auch zu diagnostischen Zwecken

durchgeführt, z.B bei der Immunphänotypisierung und Therapieüberwachung bei HIV-

Patienten.

Im Rahmen des Versuchs mit humanen PBMCs werden die Anteile an B-Lymphozyten

(CD19+), T-Lymphozyten (CD3+) und Monozyten (CD14+) bestimmt. Die beiden

Hauptklassen der T-Lymphozyten (d.h. aller CD3+) lassen sich durch den Nachweis der

Oberflächenmoleküle CD8 (für Zytotoxische T-Zellen) und CD4 (für T-Helferzellen)

voneinander unterscheiden.

Bei den Maus-Experimenten werden Immunzellen aus dem Blut, der Milz und dem

Thymus untersucht. Dafür werden unterschiedliche Mauslinien eingesetzt, bei denen (i) die

vier J-Elemente der variablen Region der schweren Kette von Immunglobulinen deletiert

sind (JHT), (ii) das Recombination Activating Gene 1 inaktiviert ist (RAG1-/-), oder (iii) bei

denen es sich um ganz normale wildtyp Mäuse handelt (WT). Im Rahmen des Versuchs

soll bestimmt werden, in welchen Organen sich B-Lymphozyten (CD19+), T-Lymphozyten

(CD3+) oder antigenpräsentierende Zellen (CD11c+) befinden, und welchen Einfluss die

Deletion der J Elemente oder die von RAG1 auf die Entwicklung der verschiedenen

Immunzelltypen hat.

Prinzip der Durchflusszytometrie

Das FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) stellt eine schnelle Methode zur

Untersuchung von Oberflächenproteinen dar. Hierbei können Oberflächenproteine auf

Zellen detektiert und quantifiziert, und damit Subpopulationen in Zellgemischen untersucht

werden.

Hierfür werden Zellen mit Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern gefärbt

und nach Lichtstreuung und Fluoreszenzintensität analysiert. Die Lichtstreuung in 180°

Vorwärtsrichtung (Forward Scatter) gilt als Maß für die Größe der Zellen (kleine dichte

Zellen streuen weniger Licht), die in 90º (Side Scatter) als Maß für die die Granularität.

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Die an die Antikörper gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B.

Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE) werden bei der gleichen

Wellenlänge (480 nm) von einem Argon-Laser zur Emission von Lichtimpulsen angeregt.

Der Emissionsbereich von FITC (Grünfluoreszenz) liegt zwischen 500 und 570 nm, der von

PE (Rotfluoreszenz) reicht von 570-600 nm.

Abb. 1: Schematische Abbildung des optischen Systems eines FACS-Geräts. Die Zellprobe

(sample) wandert in einer Küvette an einem Argonlaser (488 nm) vorbei. Hierbei wird das Licht zum

einen durch die Zellen gemäß ihrer Größe und Granularität gestreut, zum anderen wird das

Fluorochrom des entsprechend markierten Antikörpers angeregt und emittiert das Licht in einer für

das Fluorochrom typischen Wellenlänge. So genannte Photodetektoren registrieren das emittierte

Licht und setzen dieses in digitale Signale um, die dann mit Hilfe einer entsprechenden Software

dargestellt und analysiert werden können.

Da die Emissionsmaxima von Fluoreszenz 1 (FITC-530 nm) und Fluoreszenz 2 (PE-585

nm) oder Fluoreszenz 3 (z.B. PJ-615 nm) in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen

liegen, die von entsprechenden Photodetektoren registriert werden, lassen sich mehrere

Farbstoffe gleichzeitig messen (Mehrfarben-Immunfluoreszenz). Auf Grund der teilweise

überlappenden Emissionsbereiche müssen die Detektoren für die Fluoreszenzen 1 und 2,

so wie 2 und 3 gegeneinander kompensiert werden. Ein elektronisches System, der

Photomultiplier, erhält die Lichtimpulse von der optischen Einheit und übermittelt sie zur

Datenauswertung an den Computer.

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Abb. 2: Beispiel für eine Auftrennung von Blutzellen nach Größe (FSC) und Granularität (SSC)

in einer Dot-Blot-Analyse. Jeder Punkt (Dot) repräsentiert eine Zelle oder Zellfragment, deren

Signal vom entsprechenden Photomultiplier an den PC übermittelt und im Dot-Blot entsprechend

ihrer Größe und Granularität dargestellt wird.

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A) Versuchsablauf humane PBMCs (AG Schweizer)

Teil I PBMC-Präparation und Kultivierung

Teil II FACS-Färbung und -Messung

FACS-Auswertung und Besprechung der Ergebnisse

Teil I

Isolierung von PBMCs aus humanem Vollblut

Die PBMCs werden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation (Ficoll-Hypaque) aus frisch

gewonnenem Vollblut eines gesunden Spenders isoliert. Hierbei sammeln sich die

Lymphozyten und Monozyten (PBMC), entsprechend ihrer spezifischen Dichte, in der

Interphase zwischen Überstand (Plasma/Thrombozyten) und Ficoll-Histopaque an. Das

Zellsediment bilden Erythrozyten und Granulozyten, die eine höhere Dichte besitzen (siehe

Abb.).

Durchführung

15 ml Ficoll (Histopaque von Sigma 1077) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen vorgelegen

20 ml Vollblut je Falcon vorsichtig über das Ficollkissen schichten.

VORSICHT!: Ist das Vollblut einmal mit Ficoll-Lösung vermischt, ist es unbrauchbar.

die Proben 30 min bei 2.000 rpm und bei Raumtemperatur zentrifugieren, ohne Bremse!

die PBMCs bilden einen milchig-trüben Ring zwischen der oberen Plasmaphase und der

unteren Ficollphase

Interphasenring vorsichtig mit einer 2 ml Pipette abziehen und in ein neues 50 ml

Falcon-Röhrchen pipettieren in dem 10 PBS vorgelegt wurden

um das restliche Ficoll zu entfernen werden die PBMCs mit PBS gewaschen. Falcons

mit 37°C warmem PBS auffüllen!

Zentrifugation bei 1.200 rpm, 10 min, RT (mit Bremse)

Ficoll Ficoll

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um die Erythrozyten vollständig aus der Lymphozytenfraktion zu entfernen, werden

diese mit Ammoniumchloridlösung lysiert.

Überstand verwerfen, PBMCs in 10 ml 0.86%iger Ammoniumchloridlsg.

resuspendieren und 10 min bei 37°C im Wasserbad inkubieren

um das Ammoniumchlorids zu entfernen, wird das Falcon mit warmen PBS aufgefüllt

und die PBMCs erneut bei 1.200 rpm / 10 min abzentrifugiert

Überstand verwerfen und die PBMCs nochmals mit 45 ml PBS resuspendieren und 10

min, bei 1.200 rpm zentrifugieren

Zellpellet in 20 ml RPMI-Medium aufnehmen, Zellzahl bestimmen (s.u.)

Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität

Zur Bestimmung der Zellzahl und der Vitalität der Zellen werden die PBMCs im Verhältnis

1:1 mit Trypanblau gefärbt. Trypanblau wird aufgrund der Membrandurchlässigkeit nur von

den toten Zellen aufgenommen. Die Zellen werden in eine Neubauer Zählkammer überführt

und gezählt. Die Zellkonzentration ergibt sich aus der Multiplikation von Zellzahl,

Verdünnungsfaktor und Kammerfaktor (104).

Beispiel:

Die Neubauerkammer hat in der Mitte ein Kreuz aus engen Linien. Die 4 Eckfelder

(Gruppenquadrate) sind in je 16 Einzelquadrate unterteilt. Zellen in mindestens 2 (bei

besonders wenig Zellen 4) Eckfeldern zählen.

Berechnung (Beispiel):

150 Zellen wurden in 2 Eckfeldern gezählt

15 µl Zellsuspension wurde mit 15 µl Trypanblau verdünnt » Faktor 2

der Kammerfaktor (um vom Einschlussvolumen auf 1 ml umzurechnen) beträgt 10.000

150 : 2 x 2 x 10.000 = 1.5x106 Zellen/ ml

Insgesamt sind von der Zellsuspension 40 ml vorhanden:

1.5 x 106 Zellen x 40 ml = 6x107 Zellen insgesamt

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40

Kultivierung der PBMCs

Zellen in einer Dichte von 1x106/ml in RPMI Medium (plus 10% FCS, 2 mM Glutamin,

Antibiotikacocktail, 200 U IL-2/ml und 0.22µg PHA/ml) aufnehmen

2 ml der PBMC-Zellsuspension je 6-well aussäen

Teil II

FACS-Färbung und Analyse der PBMCs

Zellen in 15 ml Falcon überführen, wichtig: durch resuspendieren auch die adhärenten

Zellen ablösen

Medium bei 1.200 rpm, 10 min und RT abzentrifugieren

Zellpellet in 5-10 ml PBS aufnehmen

Zellzahl mit Hilfe Neubauer-Zählkammer bestimmen

15 µl Zellsuspension mit 15 µl Trypanblau mischen

5x105 Zellen pro Ansatz in FACS-Röhrchen überführen (insgesamt 10 Ansätze) und die

Röhrchen mit FACS-Waschpuffer auffüllen

bei 1.500 rpm, 5 min und 4°C abzentrifugieren und Überstand verwerfen

das Zellpellet in je 200 µl Waschpuffer aufnehmen und die folgenden

fluoreszenzmarkierten Antikörper zupipettieren (Die Menge der Antikörper wird vom

Kursassistenen vorgegeben)

1. Isotypkontrolle

2. CD19-PE

3. CD3-FITC

4. CD4-Cy5

5. CD8-PE

6. CD3-FITC/CD19-PE

7. CD3-FITC/CD4-Cy5/CD8-PE

die Proben 20 min bei 4°C (im Kühlschrank) inkubieren

zum Waschen der Zellen, die FACS-Röhrchen auffüllen und 5 min, bei 1.500 rpm, 4°C

zentrifugieren

Überstand dekantieren und Zellen erneut in 500µl Fixierlösung (1% PFA)

resuspendieren

FACS-Messung (FACS Galaxy, Software: FloMax):

1. Dot-Plot: FSC/SSC (Zellpopulation festlegen)

2. Geräteeinstellung (Kompensation) mit Hilfe der Einzelfärbungen

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41

3. Dot-Plot: CD3/CD19

4. Dot-Blot: CD4/CD8 im Gate der CD3+ Zellen

5. Histogramm CD3 und CD19

Aufgaben

Vervollständige die prozentualen Angaben der Lymphozyten-Populationen in folgendem

Schaubild:

1. Wieviel Prozent der Leukozyten sind T-Zellen, wieviel B-Zellen?

2. Wieviel Prozent der T-Zellen sind Zytotoxische T-Zellen bzw. T-Helferzellen?

3a. Beurteile die prozentuale Verteilung der gemessenen Lymphozytenpopulationen des

Spenders.

3b. Wie ist das Verhältnis von CD4+ zu CD8+ und welches Verhältnis ist liegt bei einem

gesunden Donor vor?

3c. Wie verändert sich dieses Verhältnis im Verlauf einer HIV-Infektion?

4. Wo würde man nach Vollblutfärbung in einem FSC/SSC Dot Blot die Granulozten

uund Monozyten finden?

5. Fülle folgende Tabelle aus:

CD-

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Zelltyp Marker Funktion

T-Helfer-Zelle

Zytotoxische T

Zelle

B-Zelle

Monozyt

Makrophage

Granulozyt

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B) Versuchsablauf murine Zellen (AG Waibler)

Teil I Präparation von Blutzellen, Milzzellen und Thymuszellen aus WT, JHT und

RAG1-/- Mäusen

FACS-Färbung

Teil II FACS-Messung

FACS-Auswertung und Besprechung der Ergebnisse

Teil I

Präparation von Blutzellen, Milzzellen und Thymuszellen aus WT, JHT und RAG1-/-

Mäusen

Für dieses Experiment werden je eine WT, JHT und RAG1-/- Maus eingesetzt. Für die

Blutentnahme werden die Tiere kurz betäubt. Nach dem Töten der Tiere werden die

Immunorgane entnommen.

Blut

Die Maus wird durch Inhalations-Narkose mit Isofluran betäubt (erfolgt durch Betreuer)

Das Blut wird retrobulbär abgenommen (erfolgt durch Betreuer)

Das Blut wird in heparinisierte Microcontainer gegeben

15 µl heparinisiertes Blut wird für einen Färbeansatz eingesetzt

Milz

Maus wird durch cervicale Dislokation getötet (erfolgt durch Betreuer)

Maus wird auf die rechte Seite gelegt (Kopf zeigt nach links)

Mit einer stabilen Schere wird eine Öffnung ins Fell geschnitten

Die Öffnung wird weiter aufgerissen

Die Milz wird mit einer chirurgischen Schere und Lidpinzetten entnommen

Die Milz wird in eine Petri-Schale gelegt, ca. 5 ml PBS werden zugegeben und die Milz

wird mit Pipettenspitzen ausgeklopft

Die Milzzellen werden durch Auf- und Abpipettieren mit einer 10 ml Stab-Pipette

resuspendiert, Proben werden mit PBS auf 10 ml aufgefüllt

Zentrifugation (5 min, 1200 rpm), Überstand verwerfen

Zellpellet in 5 ml RBC-Lysis-Puffer resuspendieren und ca. 1 min bei RT inkubieren

Zugabe von 5 ml PBS


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Zellpellet in ca. 10 ml PBS resuspendieren und durch ein 70 µm Filicon filtrieren

Zellzahlbestimmung (siehe unten)

Thymus

Nach Entnahme der Milz wird die Maus auf den Rücken gelegt und der Brustkorb

entlang des Sternums mit einer stabilen Schere geöffnet

Rippenbögen aufziehen

Thymus entnehmen (Vorsicht: nicht ins Herz schneiden)

Der Thymus wird in eine Petri-Schale gelegt, ca. 5 ml PBS werden zugegeben und das

Organ wird wie die Milz ausgeklopft

Thymuszellen werden durch Auf- und Abpipettieren mit einer 10 ml Stab-Pipette

resuspendiert, Proben werden mit PBS auf 10 ml aufgefüllt

Zellsuspension durch ein 70 µm Filicon filtrieren

Zellzahlbestimmung (siehe unten)

Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität

Zur Bestimmung der Zellzahl und der Vitalität der Zellen werden diese seriell mit Trypanblau

verdünnt und gefärbt (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). Trypanblau wird aufgrund der veränderten

Membrandurchlässigkeit toter Zellen nur von diesen aufgenommen, lebende Zellen bleiben

farblos. Eine geeignete Verdünnung wird in eine Neubauer Zählkammer überführt und die

lebenden (ungefärbte) Zellen ausgezählt. Die Zellkonzentration ergibt sich aus der

Multiplikation von Zellzahl (Mittelwert aus allen vier Quadranten), Verdünnungsfaktor und

Kammerfaktor (104).

Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer mit vier

Quadranten à 16 Kleinquadraten.

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FACS-Färbung und Analyse der Proben

In diesem Experiment werden die zuvor präparierten Blut-, Milz- und Thymuszellen aus WT,

JHT und RAG1-/- Mäusen mittel spezifischer, Fluorochrom-gekoppelter Antikörper angefärbt.

Blut

Pro Färbeansatz 15 µl heparinisiertes Blut in FACS-Röhrchen überführen

Zugabe der Antikörper nach dem Schema der Färbeansätze (siehe unten), vortexen

Inkubation der Proben für 15 min bei 4°C (Proben sollen dunkel aufbewahrt werden)

Zugabe von 1 ml Blut-Lyse-Puffer (nicht RBC-Lysis-Puffer)

Inkubation der Proben für 20-30 min bei RT (Proben sollen dunkel aufbewahrt werden)


Zugabe von 1 ml FACS-Puffer

Zentrifugation (5 min, 1200 rpm), Überstand verwerfen und Zellpellet im verbleibenden

Restvolumen resuspendieren (vortexen)

Milz und Thymus

2x105 bis 1x106 Zellen in 50 µl FACS-Puffer pro Färbeansatz in FACS-Röhrchen

überführen (Zellen ggf. vorher auf gewünschte Zellzahl einstellen)

Zugabe der Antikörper nach dem Schema der Färbeansätze (siehe unten), vortexen

Inkubation der Proben für 15 min bei 4°C (Proben sollen dunkel aufbewahrt werden)

Zugabe von ca. 1 ml FACS-Puffer


Zellpellet in 100 µl FACS-Puffer und 100µl 1%iger Paraformaldehyd-Lösung

resuspendieren (vortexen)

Schema der Färbeansätze

1. ungefärbt

2. 1 µl anti-CD3 PE

3. 1 µl anti-CD19 FITC

4. 1 µl anti-CD11c APC

5. 1 µl anti-CD3 PE + 1 µl anti-CD19 FITC + 1 µl anti-CD11c APC

WT Blut: Färbeansätze 1. – 5. durchführen

WT Milz: Färbeansätze 1. – 5. durchführen

WT Thymus: Färbeansätze 1. – 5. durchführen

JHT Blut: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

JHT Milz: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

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JHT Thymus: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

RAG1-/- Blut: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

RAG1-/- Milz: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

RAG1-/- Thymus: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

Die gefärbten Zellen können bis zur Messung am Durchflusszytometer bei 4°C gelagert

werden.

Teil II

FACS-Messung und Auswertung der Daten

Die FACS-Messung der in Teil I isolierten und gefärbten Zellen erfolgt am

Durchflusszytometer LSR II der Firma BD. Die gewonnenen Daten werden mit der BD

FACSDiva ™ Software analysiert. Zur Besprechung der Ergebnisse beantworten Sie bitte

folgende Fragen:

1. Welche Zelltypen können Sie mit Hilfe der verwendeten Antikörper detektieren?

2. Wie sieht die prozentuale Verteilung von T-Zellen, B-Zellen und antigenpräsentierenden

Zellen in Blut, Milz und Thymus aus?

3. Welche absoluten Anzahlen von T- und B-Zellen finden sich in der Milz und im Blut von

Mäusen?

4. Welchen Einfluss hat die Deletion der J Elemente auf die Entwicklung von Immunzellen

in den verschiedenen Organen?

5. Welchen Einfluss hat die Deletion von RAG1 auf die Entwicklung von Immunzellen in

den verschiedenen Organen?

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Experiment 3: Virusquantifizierung/siRNA

Wichtig

Experiment 3 wird an zwei verschiedenen Viren durchgeführt. Die

Gruppen sind wie folgt eingeteilt:

Gruppen 1-3: Reduktion der Virusbelastung in PERV-infizierten humanen

Zellen durch siRNA (AG Toenjes)

Gruppen 4-6: Quantifizierung von Vacciniaviren (AG Schwantes/Suezer)

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Experiment 3: Reduktion der Virusbelastung in PERV-infizierten humanen Zellen durch siRNAs AG Toenjes Ziele des Versuchs: 1. Ermittlung der absoluten Viruslast in infizierten Zell-Linien. 2. Nachweis der spezifischen Reduktion der Virusbelastung durch porzine

endogene Retroviren (PERV) in Zellkultur-Überständen mittels PERV-spezifischer siRNAs.

Theorie: Hemmung der Genexpression durch siRNA 1990 wurde das Posttranscriptional Gene Silencing (PTGS) in Petunien (Solanaceae) gefunden, nachdem Forschergruppen um Mol und Jorgensen versuchten, die Blütenfärbung von Petunien durch das Einbringen eines zusätzlichen Pigmentgens zu verstärken und dabei das genaue Gegenteil erreichten. Es konnte gezeigt werden, dass die Gene nicht nur auf der Ebene der Transkription abgeschaltet wurden, sondern ebenso die zugehörige mRNA schnell abgebaut wurde. Etwas später wurden ähnliche Erkenntnisse bei Pilzen (Neurospora; „Quelling“), Würmern, Fliegen und Mäusen gewonnen (1, 2). Die Technik der RNA Interferenz (RNAi) wurde 1998 durch A. Fire und C. Mello in Caenorhabditis elegans nachgewiesen (1, 2, 3). Doppelsträngige RNA (dsRNA) führte zu einem effizienten und spezifischen Gene-Knockdown. Wird eine doppelsträngige (ds) RNA mit homologer Sequenz zu einer zelleigenen mRNA in eine Zielzelle eingebracht, startet der Vorgang des PTGS, indem Dicer, eine ATP-abhängige Ribonuklease, die dsRNA in viele kleine Stücke schneidet. Es entstehen sogenannte small interfering RNAs (siRNAs). Diese siRNAs wandern zu einem Enzymkomplex, dem sog. RNA-induced-silencing-complex (RISC). Anhand der siRNA wird das komplementäre Stück der zelleigenen mRNA gefunden, zerschnitten und somit die Proteinsynthese des entsprechenden Gens unterbunden (Abb. 1). In höheren Eukaryoten führt lange, dsRNA (mehr als 30 Basenpaare) zu unspezifischen Auswirkungen bzw. zur Apoptose, da diese die enzymatische Zerstörung aller mRNAs und den Stop der Proteinsynthese bewirkt. Erst die Arbeit von S. Elbashir unter der Leitung von T. Tuschl konnte 2001 dieses Problem umgehen, indem kurze dsRNAs von 21 nt Länge verwendet wurden, die am 3’-Ende jeweils 2-3 Nukleotide überstehen. Solche kurzen siRNA-Moleküle können synthetisch hergestellt und in die Zielzellen eingebracht werden. Man steigt dadurch in den Prozess des PGTS zwar erst später ein, erzielt jedoch den gleichen Effekt (1, 2, 4; Abb. 2). Weiterführende Informationen zu siRNA und MicroRNA siehe http://opengenomics.org/CSB2005_RNAiTutorial/3-CSB2005-B&WSlides.pdf

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Die Lage der synthetischen siRNAs innerhalb der Genomstruktur von PERV, die im Versuch verwendet werden, ist in Abb. 3 dargestellt. Die Nukleotidangaben beziehen sich auf eine Referenzsequenz (PERV-B(33)ATG; Acc.No. AJ133816) und bezeichnen die Positionen, die von den siRNAs erkannt werden. Abb. 1:

Modell der molekularen Schritte des Posttranskriptional Gene Silencing (PTGS) http://www.laborjournal.de/rubric/archiv/stichwort/w_02_07.html (2) Abb. 2:

RNA Interferenz (RNAi) mit siRNA http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10075 (5)

BCII am PEI, 22.11.2010-09.12.2010

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Abb. 3

Genomstruktur von PERVPosition der synthetischen siRNA‘s

Nukleotidangaben bezogen auf PERV-B(33)ATG (Czauderna et al. 2000)

3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag



3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag



3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag


3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA 3’-LTR

poly A site

env

3’-LTR

poly A site

3’-LTR

poly A site

envenv5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gaggag pol

SA

polpol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag

11541154 27282728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag

Zum Versuch: PERV-infizierte humane Zellen (293/PERV-B(33)) werden 48 Std. vor Beginn des Versuches mit PERV-spezifischen siRNAs in verschiedenen Kombinationen und einer nicht PERV-spezifischen siRNA, sowie MOCK (nur Transfektionsreagenz, keine siRNA im Ansatz) transfiziert. Als Negativkontrolle dienen nicht-transfizierte Zellen. Aus den Überständen der transfizierten Zellen wird virale RNA von PERV mittels des High Pure Viral RNA Kit (Roche) isoliert. Daraufhin wird mittels quantitativer One-Step RT-PCR (LightCycler, Roche) die Anzahl der Virionen pro µl Zellkultur-Überstand bestimmt. Aliquots der Überstände werden bei –80°C eingefroren und dienen als Template für einen reversen Transkriptase (RT)-Test (C-type-RT Activity Assay, Cavidi Tech). Es soll gezeigt werden, dass es durch den Einsatz spezifischer siRNA's möglich ist, die Anzahl der Virionen im Zellkultur-Überstand zu verringern und, dass unspezifische siRNAs keinen Einfluss auf die Virusexpression haben.

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Durchführung: ACHTUNG: Die Transfektion wird nicht von den Praktikanten durchgeführt, die folgende Beschreibung dient nur zum besseren Verständnis des Versuches! Pro Reaktionskammer (well) werden am Vortag der Transfektion 2x105 293/PERV-B(33)-Zellen ausgesät. Ansätze (je 1 µg siRNA/well): siRNA 7 (Eurogentec), siRNA I, III u. IV (Dharmacon) bei 2-er-Kombi je 2,5 µl siRNA/Ansatz bei 3-er-Kombi je 1,7 µl siRNA/Ansatz

Transfektion: die zu transfizierenden siRNAs zu 0,1 ml Opti-MEM I (Invitrogen) in

Polystyrolröhrchen geben (A) Mastermix aus 0,9 ml Opti-MEM I und 90 µl Transfektionsreagenz

Lipofectamine ansetzen und vortexen (B) je Probe 0,1 ml B zu A geben, vortexen 15–30 min bei RT inkubieren, damit sich die siRNA-Lipidkomplexe bilden

können in der Zwischenzeit Zellen 1x mit 2 ml Opti-MEM I pro well waschen je 0,8 ml Opti-MEM I zu A/B’s geben (= Transfektionsmix) je 1 ml Transfektionsmix pro well bei 37°C im Brutschrank 4-5 Std. inkubieren Transfektionsmix absaugen je well 2 ml Medium (DMEM + 10% FKS + Streptomycin/Penicillin + L-

Glutamin) zugeben nach 72 Std.: Überstände (Supernatant, SN) zellfrei filtrieren, Isolierung der viralen RNA aus 200 µl SN, SN für RT-Test aliquotieren (je 1x 100 µl)

72 3

4 5

98

106

1

sisi7 + + IV

si I III + IV

si7 + MOCK Neg. control siRNA

untr.Zelle

I III IV

X X

72 3

4 5

98

106

1

sisi7 + + IV

si I III + IV

si7 + MOCK

untr.Zelle

I III IV

X X

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Filtration der Überstände und Aliquotierung: 2x 10 Eppi’s analog den 6-well-plates beschriften (also: si7+I+IV,

siI+III+IV, … ODER von 1-10) [1x 10 Eppi’s für Isolierung viraler RNA, 1x 10 Eppi’s für RT-Test]

10 5-ml-Röhrchen beschriften und in Ständer einsetzen (= Auffanggefäße für filtrierte SN’s)

je ca. 2 ml SN pro well mittels 2-ml-Spritze aufnehmen durch 0.45 µm Sartorius-Filter in vorbereitete 5-ml-Röhrchen filtrieren je 1x 100 µl zellfrei filtrierten SN in vorbereitete Eppi’s geben (für RT-

Test), bei -80°C (Gruppe A) bzw. auf Eis (Gruppe B) lagern

Isolierung viraler RNA (High Pure Viral RNA Kit, Roche): 1) Arbeitslösung herstellen: 5 ml Bindepuffer (grüner Deckel) ergänzt mit

50 µl poly(A) carrier-RNA 2) pro Eppi je 400 µl Arbeitslösung vorlegen, je 200 µl zellfrei filtrierten SN

zugeben und gut mischen (vortexen) 3) Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 10 min 4) High Pure Filter-Tubes in Auffanggefäße setzen und Proben in das

obere Reservoir pipettieren 5) 15 sec bei 10.000 rpm in Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugieren 6) Filter-Tubes in neue Auffanggefäße setzen, alte Auffanggefäße

verwerfen 7) je 500 µl Inhibitor Removal Puffer (Gefäß 3a, schwarzer Deckel) in die

oberen Reservoirs pipettieren (geht am besten mit einer Eppendorf Multipette und 12,5 ml-Combitip)

8) 1 min bei 8.000 rpm zentrifugieren 9) Filter-Tubes in neue Auffanggefäße setzen, alte Auffanggefäße

verwerfen. Es folgen zwei Waschschritte. 10) Für den ersten Waschschritt 500 µl Waschpuffer (blauer Deckel) in die

oberen Reservoirs pipettieren (Eppendorf Multipette, 5 ml-Combitip) 11) 1 min bei 8.000 rpm zentrifugieren 12) Filter-Tubes in neue Auffanggefäße setzen. Für den zweiten

Waschschritt je 400 µl Waschpuffer zugeben. 13) 1 min bei 8.000 rpm zentrifugieren, anschliessend 10 sec bei 13.200

rpm zentrifugieren (um Reste des Waschpuffers zu entfernen) 14) Auffanggefäße verwerfen und Filter-Tubes in sterile, Nuclease-freie 1,5

ml-Eppis einsetzen 15) Je 50 µl Elutionspuffer (Gefäß 4, farbloser Deckel) in die oberen

Reservoirs pipettieren (Eppendorf Multipette, 2,5 ml-Combitip) 16) 1 min bei 10.000 rpm zentrifugieren 17) Filter-Tubes verwerfen, Eppis mit vRNA verschließen und auf Eis stellen

(Gruppe A) bzw. bei –80°C lagern (Gruppe B). Die Proben dienen als Template für die One-Step RT-PCR mittels LightCycler.

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Quantitative One-Step RT-PCR (LightCycler, Roche): Die PCRs werden mittels des QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kits (Qiagen, Cat.No.: 204243) durchgeführt. Die PERV RT-PCR dient zur Bestimmung der Virionenzahl im Überstand PERV-infizierter Zellen. 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix, RNase-freies Wasser und Primer (F und R, je 10 µM) auftauen (im PCR-Raum), Template-RNAs (vRNA) und externen homologen Standard auf Eis auftauen (im Labor). Der PCR-MasterMix wird im PCR-Raum pipettiert, die Verdünnung des Standards und die Templatezugabe findet im Labor statt. Externen homologen Standard verdünnen (auf Eis; Wasser in Eppis vorlegen): Externer homologer Standard (= 326 bp T7-in-vitro transkribierte RNA): F/R (NdeI) [126 ng/µl] Berechnung der Kopienzahl: 6x1023 [Kopien/µl] x Konz. [g/µl] / MW [g/mol] MW (RNA) = Basepairs x 340 daltons/bp MW = 326 bp x 340 daltons/bp MW = 1,108x105 daltons Für die Konzentration von 126 ng/µl gilt also: 6x1023 x 1,26x10-7 / 1,108x105 = 6,82x1011 copies/µl

Verdünnungsreihe: 1:6,8 (1 µl RNA + 5,8 µl H2O) = 1x1011 copies/µl, dann seriell 1:10 verdünnen von 1010 bis 103

Als Standard einsetzen:103 - 109 copies/µl Proben als Doppelbestimmung einsetzen! MasterMix ansetzen (PCR-Raum!): pro Probe: 5,8 µl RNase-freies Wasser 10 µl 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix 1 µl Primer F (0,5 µM Endkonz.) 1 µl Primer R (0,5 µM Endkonz.) 0,2 µl QuantiTect RT Mix 18 µl Gesamtvolumen gesamt (n+2 = 30): 174 µl RNase-freies Wasser 300 µl 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 30 µl Primer F 30 µl Primer R 6 µl QuantiTect RT Mix

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540 µl vortexen 18 µl pro Kapillare + je 2 µl Standard und Template-RNA (erst im Labor zugeben!) Probenreihenfolge: 1: Wasser 15: Probe 4 2: Standard 2 x 103 16: Repl. von Probe 4 3: Standard 2 x 104 17: Probe 5 4: Standard 2 x 105 18: Repl. von Probe 5 5: Standard 2 x 106 19: Probe 6 6: Standard 2 x 107 20: Repl. von Probe 6 7: Standard 2 x 108 21: Probe 7 8: Standard 2 x 109 22: Repl. von Probe 7 9: Probe 1 23: Probe 8 10: Repl. von Probe 1 24: Repl. von Probe 8 11: Probe 2 25: Probe 9 12: Repl. von Probe 2 26: Repl. von Probe 9 13: Probe 3 27: Probe 10 14: Repl. von Probe 3 28: Repl. von Probe 10 Kapillaren mit Deckel verschließen und mit Proben zum LightCycler gehen. Probenkarussell mit Kapillaren beladen und in Zentrifuge kurz zentrifugieren. Probenkarussell in LightCycler platzieren. PCR: RT-Reaktion 50°C 20 min Denaturierung 95°C 15 min Amplifikation (40 cycles) 94°C 15 sec 58°C 15 sec 72°C 16 sec slope 2°C/s, single

measurement Schmelzkurve 95°C 10 sec 65°C 10 sec 97°C 0 slope 0,1°C/s, cont.

measurement Cooling 40°C 30 sec (wenn nicht anders angegeben: slope 20°C/s) Nach Beendigung des PCR-Laufs werden die Proben entsorgt und es erfolgt entweder direkt die Auswertung der Daten oder aber am zweiten Tag (je nach Gruppeneinteilung). RT-Test (C-Type-RT Activity Assay, Protokoll B, Cavidi-Tech)

Bestimmung der Enzymaktivität der reversen Transkriptase im Überstand PERV-infizierter Zellen (d.h. in den Viruspartikeln, die sich im Überstand befinden).

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Sample Dilution Buffer (Flasche B) Reconstitution Buffer (Flasche C2) bei 37°C im Wasserbad auftauen Benötigte Anzahl poly(A)-beschichteter Streifen (siehe Tab.1), Sample Dilution Buffer (2x Flasche B2, weißer Deckel), RT Reaction components (Flasche C1, grüner Deckel, 1 Flasche pro 96-well-plate) und MMuLV-Standard (Flasche D, gelber Deckel, Lot-Nr. 05133) aus –20°C nehmen. Für Gruppe A: Proben aus -80°C nehmen und auf Eis auftauen. Reaktionsmix herstellen: pro Platte 12 ml Reconstitution Buffer (C2) zu einer Flasche C1 geben,

gut mischen und in 50 ml Falcon geben 6 ml Wasser zugeben Sample Dilution Buffer (B) herstellen (je 5 ml aus B1 pro Flasche B2, gut

mischen und Inhalt beider B2‘s wieder in B1 geben, mischen) 6 ml Sample Dilution Buffer (B) in Falcon geben, mischen Poly(A)-Platten vorbereiten: entsprechende Anzahl 8-er-Streifen in 96-well-plate-Rahmen spannen

(Tab. 1) pro well 200 µl Reaktionsmix mit elektronischer Mehrkanalpipette

zugeben Platten mit selbstklebender Folie schließen Präinkubation der Platten für 20-60 min bei 33°C

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Tab. 1: Probenauftragung RT-Test

1

2

3

4

A 1

767 mU/ml

B 2

341 mU/ml

C 3

151 mU/ml

D 4

67,3 mU/ml

E 5

29,9 mU/ml

F 6

13,3 mU/ml

G 7

5,91 mU/ml

H 8

2,63 mU/ml

MMuLV-Standard verdünnen (gilt für Lot-Nr. MUL 05133 !): 420 µl Sample Dilution Buffer (B) zu MMuLV-Lyophilisat geben, gut

mischen 8 Eppi’s vorbereiten, je 250 µl Sample Dilution Buffer (B) vorlegen 200 µl resuspendierten MMuLV Standard ins erste Eppi geben, vortexen Pipettenspitze wechseln, 200 µl aus dem ersten ins zweite Eppi geben,

vortexen Pipettenspitze wechseln, 200 µl aus dem zweiten Eppi ins dritte geben,

vortexen, usw. bis Eppi Nr. 8 RT-Reaktion starten: Poly(A)-Platten aus 33°C-Inkubator nehmen Standard (je 10 µl/well) in die erste Reihe pipettieren (von oben nach

unten abnehmend, entsprechend Tab. 1) Proben zugeben (als Duplikate, Pipettierschema ist selbst zu entwerfen

und in Tab. 1 einzutragen), je 10 µl/well Platten mit selbstklebender Folie verschließen

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Platten für 2-3 Std. bei 33°C inkubieren Platten waschen: Waschpuffer (2.5 ml Waschpufferkonzentrat, 75 ml 10% Triton X-100 ad

1 l H2O) Platte im ELISA-Washer 3x mit 200 µl Waschpuffer pro well waschen

(Programm RT, last strip = 4) Platte umgedreht auf Celltorks aufklopfen Platte kann jetzt entweder eingefroren (-20°C, Gruppe B) oder der

Versuch fortgesetzt werden (Gruppe A) Inkubation mit Product Tracer: 12 ml 1% Triton X-100 zu einer Flasche Product Tracer (O) geben,

vortexen benötigt ca. 10-20 min, bis sich das Lyophilisat gelöst hat, zwischendurch

vortexen je 100 µl Product Tracer pro well zugeben Inkubation bei 33°C für 90 min Inkubation mit AP-Substrat: Flasche mit AP Substrat Puffer bei 37°C im Wasserbad auftauen AP-Substrat Tablette (P1) zu AP Substrat Puffer (Flasche mit Alufolie

umwickeln) geben, vortexen (braucht ca. 10 min zum Lösen) Platte im ELISA-Washer 3x mit 200 µl Waschpuffer pro well waschen

(Programm s.o.) Platte umgedreht auf Celltorks aufklopfen je 125 µl AP-Substrat pro well, Platten mit Kunststoffdeckel schließen, im

Dunkeln 15-30 min inkubieren Platten im ELISA-Reader messen (A405)

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Auswertung:

a) Berechnung der Anzahl der PERV Virionen in den Proben und

Darstellung im Balkendiagramm (Mittelwerte bilden und Standardabweichung [Fehlerbalken] eintragen)

Anhand der PERV-Standardreihe der RT-PCR ermittelt die LightCycler-Software die RNA-Kopien in 2 µl Probe. Viruspartikel enthalten einen doppelten Satz virale Nukleinsäure (2x vRNA), daher muss dieser Wert durch 4 geteilt werden, um die RNA-Kopienzahl pro µl Probe zu erhalten.

RNA-Kopienzahl (in 2 µl) / 4 = Anzahl der Viruspartikel pro µl Probe

b) Berechnung bzw. grafische Auswertung (Balkendiagramm aus

Mittelwerten der Proben, Standardabweichung eintragen) des RT-Tests

c) Vergleich der erhaltenen Daten von RT-PCR und RT-Test Frage: Kann durch spezifische siRNA eine Reduktion der Virusbelastung in PERV-infizierten humanen Zellen qualitativ und quantitativ erreicht werden? Literatur:

1) http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=RNA-Interferenz&printable=yes

2) Hien K. RNA-Interferenz (RNAi). Laborjournal-Ausgabe 07/2002 aus http://www.laborjournal.de/rubric/archiv/stichwort/w_02_07.html

3) Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC: “Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans.” Nature 391, 806-811, (1998).

4) Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T: “Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture.“ Nature 411, 494-498 (2001).

5) http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10075 6) http://opengenomics.org/CSB2005_RNAiTutorial/3-CSB2005-

B&WSlides.pdf 7) Laborjournal 11/2008, S. 60-63

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Experiment 3 (Tönjes) Tag 1

ca. 10:15h

Tag 2 ca. 10:15h

ca. 12:00h

ca. 13:00h

ca. 15:00h

•Filtration Zellüberstand •Aliquots pipettieren •RNA präparieren

ca. 17:00h

ca. 12:00h

ca. 13:00h

ca. 15:00h

ca. 17:00h

Gruppe A

•Pause

•LightCycler

Gruppe A

•RT Test (komplett) •LightCycler Auswertung

•Vorbereitung

Gruppe B

•Pause

Gruppe B

•Vorbereitung RT-Test

•Inkubation RT-Test

•Waschen RT-Test

•LightCycler Auswertung

•LightCycler

•Pause

•Waschen RT-Test

•Inkubation mit AP- Substrat •Messung bei 405 nm

•Vorbereitung quantitative RT-PCR

•Inkubation Product Tracer RT-Test

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Quantifizierung von Vacciniaviren

AG Schwantes/Suezer

Allgemeine Einleitung In diesem Versuch soll die Herstellung einer Virus-Impfpräparation und deren Quantifizierung behandelt werden. Dazu werden einzelne Arbeitsschritte durchgeführt, welche die Herstellung und Anzucht von primären Zellen für die Amplifikation von Viren, die Aufreinigung von Viruspartikeln und die Quantifizierung einer fertigen aufgereinigten Virus-Stammlösung (Virus-Stock) beinhalten. Pockenviren gehören zu den behüllten Viren und besitzen ein doppelsträngiges DNA-Genom. Im Gegensatz zu anderen Viren mit einem DNA-Genom replizieren sie ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zelle. Sie durchlaufen während des Replikationszyklusses verschiedene Reifungsstadien, die in die Bildung verschiedener Formen infektiöser Partikel münden. Diese infektiösen Virionen werden von den unreifen Viren (engl.: immature virion, IV) abgegrenzt und in folgende Klassen eingeteilt: intrazelluläre reife Viren (engl.: intracellular mature virion, IMV), intrazelluläre behüllte Viren (engl.: intracellular enveloped virion, IEV) und extrazelluläre bzw. zellassoziierte behüllte Viren (engl.: extracellular/cell-associated enveloped virion, EEV/CEV). Die extrazellulären behüllten Virionen knospen von infizierten Zellen und sorgen vorrangig für die Verbreitung des Virus innerhalb eines infizierten Wirtsorganismus. Die intrazellulären infektiösen Viren werden zusammen mit infizierten Zellen bzw. Zellresten freigesetzt und dienen vermutlich der Übertragung auf neue Wirte.

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Abbildung 1 Schema des Replikationszyklus von Orthopockenviren. e) frühe, i) intermediäre und l) späte Genexpression, f) virale Fabriken, MV = reifes Viruspartikel, IV = intrazelluläre unreife Viruspartikel (immature virions), IMV = intrazelluläre reife Viruspartikel (intracellular mature virions), IEV = intrazelluläre behüllte Viruspartikel (intracellular enveloped virions), CEV = zellassoziierte behüllte Viruspartikel (cell-associated enveloped virions), EEV = extrazelluläre behüllte Viruspartikel (extracellular enveloped virions). Unter den Pockenviren wurden die Vacciniaviren (VACV) ehemals als Impfstoffe gegen die Pockenerkrankung beim Menschen erfolgreich eingesetzt, was die Ausrottung dieser Erkrankung zur Folge hatte. Heutzutage sind Pocken-Virusimpfstoffe, vor allem als Vektorimpfstoffe, wieder gefragt. Hierbei dient das Pockenvirus lediglich als Träger für Antigene, um damit gegen andere Krankheitserreger oder Erkrankungen eine Immunantwort zu induzieren. Aufgrund der früher gelegentlich beobachteten und teilweise erheblichen Nebenwirkungen der replikationskompetenten Vacciniaviren wurden attenuierte Pockenviren entwickelt, welche ein hohes Sicherheitsprofil aufweisen und die auch bei Menschen mit. Immunsuppression oder bei Schwangeren ohne Risiko verabreicht werden können. Ein solcher wichtiger Impfstoffkandidat ist das in diesem Praktikum verwendete modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA). Im Gegensatz zu VACV ist MVA nicht mehr in der Lage, sich produktiv zu vermehren. Es infiziert noch Zellen und exprimiert alle Gene, besitzt aber einen Block in der Virionen-Morphogenese. Daher bildet es auch in Zellkultur, anders als seine replikationskompetenten Verwandten, keine lytischen Plaques aus, sondern infiziert nur einzelne Zellen. Auch der sonst typische zytopathische Effekt ist nicht vorhanden. Eine Ausnahme bilden dabei primäre Hühnerembryofibroblasten (engl. chicken embryo fibroblast cells, CEF) oder Baby-Hamster-Nierenzellen (engl. baby hamster kidney cells, BHK), auf denen MVA noch replizieren kann und welche auch zur Anzucht von MVA genutzt werden.

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Überblick über den Ablauf der einzelnen Experimente: Tag 1: Experiment 1: Präparation primärer Hühnerembryofibroblasten Experiment 2: Herstellung eines gereinigten Virus-Stocks mittels Sucrose-

Gradienten- Zentrifugation

→ Vorbereitung des Gradienten Experiment 3: Bestimmung des Virus-Titers einer Virus-Präparation mittels

Immunostain und Kristallviolettfärbung

→ Vorbereitung und Titration der Virus-Stammlösungen auf verschiedenen Zellen

Tag 2: Experiment 2: Herstellung eines gereinigten Virus-Stocks mittels Sucrose-Gradienten-

Zentrifugation

→ Beladen und Lauf des Gradienten mit der Virus-Stammlösung; Ernte des gereinigten Virusmaterials

Experiment 3: Bestimmung des Virus-Titers einer Virus-Präparation mittels

Immunostain und Kristallviolettfärbung

→ Fixieren und Färben der Titrationen, Auszählen, Bestimmung des Virustiters

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Versuch 1: Präparation primärer Hühnerembryofibroblasten

Einleitung: Zur Virusanzucht werden sogenannte permissive Zellen benötigt, das sind solche Zellen, die ein produktives Wachstum des jeweiligen Virus erlauben. Dabei erfolgt die Anzucht des MVA auf CEF- bzw. BHK-Zellen und die eines replikationskompetenten Pockenvirus, hier verwenden wir das Mäusepockenvirus (Ectromelievirus, ECTV), auf BS-C-1-Zellen (epitheliale Nierenzellen der grünen Meerkatze). Die Zellen werden mit einer niedrigen MOI (engl. multiplicity of infection, Menge an infektiösen Virionen pro Zelle) infiziert, und 3-4 Tage nach der Vermehrung des Virus können diese geerntet werden. Innerhalb der Zellen befinden sich die meisten infektiösen Virionen, aber auch extrazellulär sind Viren enthalten. Daher werden sowohl der Zellkulturüberstand als auch die Zellen geerntet. Durch wiederholte Einfrieren-Auftauen-Schritte und die Behandlung durch Ultraschall werden die Zellen zerstört und die intrazellulären Viruspartikel freigesetzt und vereinzelt. Durch anschliessende Zentrifugationsschritte werden die Virionen angereichert und gereinigt. CEF-Zellen werden aus den Embryonen von 10 - 11 Tage lang bebrüteten Hühnereiern hergestellt. Da die Embryonen zur Virusanzucht verwendet werden sollten die Eier aus speziell überwachten Haltungen, d.h. aus sogenannten spezifisch-pathogen freien (spf-)Hühnern stammen (z.B. Lohmann Tierzucht GmbH). Zur Präparation der Zellen werden zunächst die Embryonen aus dem Ei entnommen, durch Entfernung des Kopfes getötet und das differenzierte Gewebe (Herz, Leber, Niere) von dem undifferenzierten Fibroblasten-Gewebe (Körper) getrennt. Das Fibroblastengewebe wird anschliessend durch die Methode der fraktionierten Trypsinierung in einzelne Zellen aus dem Zellverband gelöst. Diese noch undifferenzierten Zellen können einige Tage in Kultur gehalten werden, während der sie ein normales Zellwachstum zeigen. Während dieser primären Phase sind sie effektive Produzenten von neuen Viruspartikeln, insbesondere von MVA. Nach einigen Zellteilungen differenzieren die Zellen aus. Dabei verlieren sie die Fähigkeit zur Teilung und sind, vermutlich aufgrund veränderter Genexpressionsmuster innerhalb der Zelle, für eine Anzucht von MVA nicht mehr geeignet. Material:

o PBS, Trypsin o Kulturmedium mit 10 % FCS (fötales Kälberserum) (v/v), 1x NEA (nicht-essentielle

Aminosäuren), 2mM L-Glutamin, Penicillin (60 µg/ml) and Streptomycin (100 µg/ml).

o Kühl-Zentrifuge, Gasbrenner, Feuerzeug o 2-4 Pinzetten, 2 Scheren, steril o Bechergläser 200 ml, 300 ml, 500ml oder 1 l, steril o Bechergläser (400ml), die mit 2 Lagen Gaze bespannt wurden, steril o Erlenmeyerkolben, 300-500 ml, steril o große Petrischalen, steril o Magnetrührer und Magnetrührerstäbchen („Rührfische“), steril o Falcon-Röhrchen (50 ml) o Zellkulturflaschen (T175)

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o 200 ml Spritzen Versuchsablauf:

Vorbereitung: o ca. 20 Eier 10 Tage vor Präparation in einen Brutschrank (37,8°C, 53 % Luftfeuchte)

legen Durchführung (Tag 1): o Eier mittels einer Schier-Lampe auf lebende Embryonen überprüfen o Eier mit Ethanol abspülen o Schale am stumpfen Pol mit Schere aufschlagen und Schalenteile mit steriler

Pinzette entfernen o Eihaut mit neuer steriler Pinzette „wegklappen“ o Embryo mit Pinzette aus dem Ei entnehmen, in einer große, mit PBS gefüllte

Petrischale geben und sofort „köpfen“ (Tierschutz! Kopf wird verworfen) o alle weiteren Eiern so prozessieren o Embryonen in eine frische, mit PBS gefüllte Petrischale überführen und Eingeweide

entfernen o gesäuberte Teile (Rumpf mit Beinen und Flügeln) in eine Petrischale mit frischem

PBS überführen, schwenken, Schritt wiederholen o Embryonenteile zur Zerkleinerung durch eine 20 ml-Spritze direkt in einen 300-

500ml-Erlenmeyerkolben mit sterilen Magnetrührerstäbchen drücken o Zugabe von ca. 2,5 ml Trypsin (37°C) pro Ei o Zugabe von PBS (ad ca. 6,25 ml pro Ei) o Suspension 20-25 min auf dem Magnetrührer bei RT rühren nach der Inkubation erhält man flüssigen Überstand () und Restgewebe ()

zu : o flüssigen Überstand in ein mit steriler Gaze bespanntes Becherglas geben und so

filtrieren (Gazebespannung dazu ein bisschen ins Becherglas zur Vertiefung eindrücken)

o Filtrat in 2 x 50 ml-Falcon-Röhrchen überführen (jeweils gleiche Mengen zum Austarieren der Zentrifuge!)

o Filtrat zentrifugieren, 1.500 rpm, 4°C, 7 min, es entsteht ein lockeres Zellpellet o Überstand vorsichtig in steriles Becherglas abgießen (Pellet schwimmt leicht ab!) und

verwerfen o Waschschritt: Pellets in ca. 15 ml PBS aufnehmen, gut durch Schütteln mit der Hand

mischen (nicht vortexen!!!), beide Zelllösungen vereinen o Zelllösung zentrifugieren, 1.500 rpm, 4°C, 7 min o Waschschritt mit PBS wiederholen o Überstand verwerfen, Pellet in ca. 10 ml CEF-Medium aufnehmen, durch Schütteln

mit der Hand mischen, auf Eis stellen

zu : o Restgewebe im Erlenmeyerkolben (Volumen: ca. 40 ml) o Zugabe von vorgewärmtem Trypsin (37°C, ad ca. 80 ml, ca. 2 ml Trypsin pro Ei) zum

Restgewebe o Zugabe von PBS (ad ca. 125 ml, ca. 6.25ml Gesamtvolumen inkl. Trypsin pro Ei) o Suspension 20 min bei RT rühren nach der Inkubation: flüssiger Überstand (, wieder wie bei verfahren) und Restgewebe ()

zu : o Restgewebe im Erlenmeyerkolben (Volumen: ca. 30 ml)

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o Zugabe von vorgewärmtem Trypsin (37°C, ad ca. 60 ml, ca. 2ml Trypsin pro Ei) zum Restgewebe

o Zugabe von PBS (ad ca. 100 ml, ca. 5ml Gesamtvolumen inkl. Trypsin pro Ei) o Suspension 15 min bei RT rühren nach der Inkubation: flüssiger Überstand (, wieder wie bei verfahren) und Restgewebe (verwerfen)

o die 3 Ansätze CEF-Zellen poolen o Zellen nochmals über frische Gaze filtrieren o Zugabe von CEF-Medium (37°C, ca. 2ml entsprechen einem Ei) o Zellen in Zellkulturflaschen (T175) einsäen (ca. ½-1 Ei/Embryo pro T175), bei 37°C,

5 % CO2, 90 % Luftfeuchte bis zur Konfluenz der Zellen inkubieren (24 bis 48 Stunden)

aus Hühnerembryonen präpariertes Zellmaterial

Trypsin- behandlung

Filtration durch Gaze

Zellsuspension + Gewebereste

Zentrifugation, Zellpellet 1

Trypsin- behandlung

Schema für die CEF-Präparation:




Trypsin- behandlung




verwerfen

Zellen vereinen, Aussäen

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Versuch 2: Herstellung eines gereinigten Virus-Stocks mittels

Sucrose-Gradienten-Zentrifugation Einleitung: Die Virusaufreinigung erfolgt durch mehrere Zentrifugationsschritte. In einer ersten Zentrifugation werden alle größere Bestandteile (Virionen des Zellkulturüberstandes, Zell-assoziierte Virionen, Zellreste) pelletiert. Dieses Pellet wird nun mit Ultraschall behandelt, um zell-assoziierte Virionen (CEV) freizusetzen. Um die Virionen aufzureinigen, wird das Pellet über ein Sucrosekissen definierter Dichte (36% Sucrose (V/V)) pelletiert. Dabei passieren die Virionen das Kissen, dagegen bleiben größere zelluläre Bestandteile auf oder in dem Kissen liegen/stecken. Das Viruspellet wird weiter aufgereinigt, indem eine Gradientenzentrifugation angeschlossen wird. Der Gradient besteht aus Sucrose zunehmender Dichte (20% bis 50 oder 60% Sucrose). Hier reichern sich die Virionen in einer bestimmten Dichte an und bilden eine Bande aus. Diese Bande wird geerntet und anschliessend werden die Virionen gewaschen, um die Sucrose aus der Viruslösung zu entfernen. Material:

o 50 % (V/V) Sucrose-Lösung in 10mM TrisCl pH 9,0, steril o 20 % (V/V) Sucrose-Lösung in 10mM TrisCl pH 9,0 , steril o UZ-Röhrchen für rote (kleine) Buckets (Beckman Nr. 337986 Polyallomer), Rotor

SW32Ti o 10 mM TrisHCl pH 9,0 o Ultraschallgerät, Pipetten, Ultrazentrifuge Beckman, Kryo-Röhrchen (1-2ml)

Versuchsablauf:

Herstellung des Gradienten (Tag 1): o 50 % und 20 % Sucrose-Lösung zu gleichen Teilen (7 + 7ml) im UZ-Röhrchen

vorsichtig und langsam übereinander schichten, unten die 50%ige, oben die 20%ige Sucrose-lösung

o zu 4°C stellen (12-48h) Gradient bildet sich über Nacht aus (Gradient immer mit äußerster Vorsicht transportieren und behandeln) Beladung und Lauf des Gradienten (Tag 2): o Virus-Suspension (Sucrose-Kissen gereinigt) 3x1 min beschallen (100 %),

zwischendurch gut vortexen o Sucrose-Gradienten mit Virus-Suspension überschichten (max. 1 ml pro Röhrchen,

bzw. Flüssigkeitsspiegel sollte minimal 0,5 cm vom oberen Rand des Röhrchen enfernt sein, sonst kollabieren die Röhrchen ) ACHTUNG: Verwirbelungen vermeiden!!!

o UZ-Röhrchen in Buckets einsetzen und gegeneinander austarieren o zentrifugieren, Rotor SW32Ti, rote Buckets, 13.300 rpm, 4°C, 50 min, kein Bremsen

(„no brake“) nach der Zentrifugation sind eine Bande (, aufgereinigtes Virus) und ein Pellet (, Reste von Virus an Zellwand gebunden & Zelltrümmer) zu erkennen

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zu : o Sucrose über der Bande abpipettieren o Bande vorsichtig mit der Pipette entnehmen und in 50ml Falcon überführen o Zugabe von ca. 20ml 10 mM Tris pH 9,0 zum Waschen o zentrifugieren, Rotor SW32Ti, rote Buckets, 14.000 rpm, 4°C, 60 min, maximales

Bremsen nach der Zentrifugation ist ein Pellet zu erkennen o Überstand vorsichtig abkippen o Pellet in ca. 500µl 10 mM Tris pH 9,0 resuspendieren, bei -80°C lagern

zu : o Nach Entnahme der Bande restliche Sucrose abkippen o Röhrchen umgekehrt auf ein mit Alkohol getränktes Papier stellen o Pellet in ca. 500µl 10 mM Tris pH 9,0 resuspendieren, bei -80°C lagern

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Versuch 3: Bestimmung des Virus-Titers einer Virus-Präparation mittels

Immunostain und Kristallviolettfärbung Einleitung: Die Quantifizierung von Pockenviren wird im Zellkultursystem durchgeführt, wobei mit dieser Methode die infektiösen Partikel (IMV, IEV, EEV und CEV) bestimmt werden. Dabei können normalerweise bei ausreichender Verdünnung der Viruslösung Löcher im Zellrasen beobachtet werden, die jeweils auf die Infektion mit einem einzelnen Virus zurückzuführen sind. Daher bestimmt die Anzahl dieser Löcher (engl. plaques) die Menge an infektiösen Viren und werden entsprechend als sogenannten Plaque-formende Einheiten pro Milliliter (engl. plaque forming units/ml bzw. pfu/ml,) angegeben. Würde man die Quantifizierung mittels des Nachweises der viralen DNA-Genome durchführen, würde man auch Viruspartikel nachweisen, welche zwar ein Genom enthalten, aber nicht-infektiös wären. Diese nicht-infektiösen Viren liegen in höherer Anzahl als die infektiösen Viren vor und bezeichnet den Faktor des Verhältnisses beider Formen als den "Particle-to-Pfu-Ratio". Dieses Verhältnis liegt bei den Pockenviren bei ca. 100:1. Von einer Virussuspension mit unbekannter Menge an (infektiösen) Virionen wird eine Verdünnungsreihe in 10er Schritten angelegt und in einem definierten Volumen (1ml) auf Zellen in einer 6 Loch-Platte gegeben. Zur Verifizierung des Ergebnisses wird stets ein Doppelansatz durchgeführt. Ausgehend von einer -1 Verdünnung, das heißt, einer 10fachen Verdünnung der Virussuspension, bis zu einer -9 Verdünnung, werden die Verdünnungsstufen in jeweils ein Loch einer 6 Loch-Platte im Doppelansatz transferiert. Verdünnungsschema der Viruslösung und Ausbringen in 6-Loch-Platten

Nach 2 Tagen, in denen die Viren sich vermehrt haben, können bereits makroskopisch Löcher im Zellrasen beobachtet werden, die durch die lytische Aktivität und den zytopathischen Effekt der Virusinfektion hervorgerufen wurden. Dabei bilden die Viren in Abhängigkeit vom genutzten Zelltyp unterschiedlich große Plaques aus. MVA bildet dabei auf CEF größere Plaques aus als auf BHK und das ECTV bildet auf BS-C-1 nur kleine, im Mikroskop sichtbare, Plaques aus. Um die Plaques als Herd einer Virusinfektion zu verifizieren, können Färbemethoden die Analyse unterstützen. Insbesondere bei MVA-

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

-4 -5 -6

-6-5-4

-1 -2 -3

-3 -2 -1

je 1ml

Virus

serielle Verdünnungen

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Infektionen wird auf eine immun-histochemisch vermittelte Färbung mit VACV-spezifischen Antikörpern zurückgegriffen. Der VACV-spezifische Antikörper wird durch einen Zweit- Antikörper detektiert, der gegen die leichte und schwere Kette des ersten Antikörpers gerichtet ist. Der Zweit-Antikörper ist mit der Meerrettichperoxidase (Engl. horse raddish peroxidase, HRP) gekoppelt, welche das Substrat TMB (3,3´,5,5´Tetramethylbenzidine) in Anwesenheit von H2O2 oxidiert, wobei das Substrat in einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Dadurch erscheinen infizierte Zellen dunkelblau. Dagegen werden Plaques von Zellen, die mit replikationskompetenten Viren infiziert wurden, indirekt durch Färbung und gleichzeitiger Fixation der noch intakten Zellen mit Kristallviolett sichtbar gemacht. Hierbei erscheinen die Plaques als weiße Punkte oder Löcher vor violett-blauem Hintergrund. Der Virustiter berechnet sich dabei folgendermaßen: Es wird das Loch, in dem sich mindestens 20-30 Plaques auszählen lassen gewählt und die Anzahl der Plaques gezählt. Dann wird diese Zahl mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert und man erhält einen Titer von Plaque-bildenden Einheiten pro ml. Titer = Anzahl Plaques * Verdünnung des ausgezählten Loch´s Die Plaques werden in beiden Doppel-Ansätzen ausgezählt und gemittelt, woraus der endgültige Titer errechnet wird. Vorarbeit:

CEF-Herstellung, Virus-Amplifikation Type 19 Ultrazentrifugation Surcose-Kissen (36% V/V Sucrose in 10mM TrisCl pH 9,0)

Material:

o gereinigter Virus-Stock, dessen Titer bestimmt werden soll o 6-well-Platten mit sekundären CEF Zellen oder BHK-Zellen sowie BS-C-1 Zellen o Kulturmedium mit 2 % FCS (CEF EMEM, BHK RPMI, BS-C-1 DMEM) o Aceton-Methanol Gemisch (1:1) o Kristallviolettlösung (0,1 % Kristallviolett, 20 % Ethanol in H2O) o PBS mit 3 % FCS o rabbit-anti-Vacciniavirus-Antikörper (von Acris) o goat-anti-rabbit-HRP-Antikörper (von JacksonResearch) o PBS o TrueBlue (von Medac) o Ultraschallgerät, Falcon-Röhrchen, Pipetten, Rockerplattform

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Versuchsablauf:

Vorbereitung am Vortag: o Zellen in 6-well-Platten aussäen, so dass sie bis zum nächsten Tag etwa 80 %

Konfluenz erreichen

Durchführung (Tag 1): o Virus-Suspension 3 x 1 min mit Ultraschall (100 %) behandeln, zwischendurch

vortexen o Virus-Verdünnungen ansetzen, zwischendurch gut vortexen:

20 µl Virus + 180 µl Medium 10-1 100 µl Virus-Verdünnung 10-1 + 900 µl Medium 10-2 500 µl Virus-Verdünnung 10-2 + 4.500 µl Medium 10-3 500 µl Virus-Verdünnung 10-3 + 4.500 µl Medium 10-4

usw. bis 10-9

o Medium von Zellen abnehmen o Virus-Verdünnungen auf Zellen ausbringen, je 1 ml/well im Doppelansatz o Zellen bei 37°C, 5 % CO2, 90 % Luftfeuchte 2 h inkubieren o Virus-Verdünnungen abnehmen o 2 ml Kulturmedium/well zufügen o Zellen bei 37°C, 5 % CO2, 90 % Luftfeuchte 48 h inkubieren Durchführung (Tag 2): CEF oder BHK Immunostain: o Medium abnehmen (infektiös! In den Flüssigabfallbehälter und dann autoklavieren) o Zellen mit 1-2 ml/well Aceton-Methanol (1:1) fixieren, 5 min einwirken lassen,

abnehmen (gesonderter Abfall!) und Methanolfilm komplett verdunsten lassen o 2 ml PBS/3 % FCS pro well zufügen, 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren o Lösung abnehmen o 1. Antikörper zugeben: 500µl/well, Verdünnung 1:4000 in PBS/3 % FCS o Platte mindestens 1 Std. bei RT auf Rockerplattform inkubieren o Antikörper-Lösung abnehmen o Platte dreimal mit PBS waschen (Volumen ca. 2ml) o 2. Antikörper zugeben: 500µl/well, Verdünnung 1:4000 in PBS/3 % FCS o Platten 45 min bis max. 1 Std bei RT auf Rockerplattform inkubieren o Antikörper-Lösung abnehmen o Platte dreimal mit PBS waschen o Substrat zugeben (500µl/well), auf Rockerplattform färben o nach 10 Minuten Färbe-Lösung abnehmen, mit Aqua dest. 5 Minuten waschen o Aqua dest abnehmen und Platten trocknen lassen

BS-C-1 Kristallviolettfärbung: o Medium abnehmen (infektiös! In den Flüssigabfallbehälter und dann autoklavieren) o 2 ml/well Kristallviolettlösung pro Vertiefung zugeben 5 min inkubieren (= Fixation und

Färbung) o Kristallviolett-Lösung abnehmen (gesonderter Abfall!) o Platte umdrehen auf Zelltork und komplett trocknen lassen

CEF/BHK & BS-C-1: o Titer auszählen (mindestens 30-100 Plaques)

Beispiel: 30 Plaques bei einer Verdünnung von 10-8 Titer 3 x 109

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Experiment 4: Zellengineering (Bakterien und Säugerzellen)

Die Gruppen 1-3 führen das Experiment in der AG Bastian/Lößner,

die Gruppen 4-6 in der AG Schumann durch.

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Maßgeschneiderte bakterielle Lebendimpfstoffe (Gr. 1-3)

Holger Lößner und Max Bastian (Abteilung Veterinärmedizin)

Bakterielle Lebendimpfstoffe sind seit langem wichtiger Bestandteil des präventiven Gesundheitsschutzes für Mensch und Tier. Darüber hinaus wird die Anwendung lebender rekombinater Bakterien für die Behandlung von Krebs, Autoimmunerkrankungen, Allergien oder Gendefizienzen gegenwärtig intensiv erforscht. Die Immunisierung mit lebenden attenuierten Salmonellen steht exemplarisch für den sicheren und wirksamen Einsatz bakterieller Lebendimpfstoffe insbesondere in der Tiermedizin. Diese Impfstoffe wurden meist durch ungerichtete chemische Mutagenese von Feldisolaten abgeleitet, wobei der vollständige Umfang attenuierender Mutationen bislang unbekannt geblieben ist. Vor dem Hintergrund des zunehmenden Verständnisses der komplexen Wechselwirkungen zwischen Bakterien und dem Wirt sowie der Verfügbarkeit neuer Technologien, z.B. Hochgeschwindigkeitssequenzierung, neue Verfahren der Gensynthese, globale Analysemethoden, Recombineering, wird eine zunehmend rationale Entwicklung von maßgeschneiderten bakteriellen Vektoren für verschiedene medizinische Anwendungen möglich. Eine Seite stellt dabei die Herstellung von geeigneten bakteriellen Trägerstämmen dar, die zuverlässig attenuiert und genetisch stabil sein müssen, sowie phänotypisch markiert und von überflüssiger Stoffwechsellast befreit sein sollten. Dafür sind umfangreiche Modifikationen des bakteriellen Genoms nötig. Eine zweite Seite stellt die jeweilige Programmierung des Trägerstammes für die Expression und Freisetzung von Impfantigenen, therapeutischen Molekülen oder anderweitig unterstützenden Faktoren entsprechend der vorgesehenen Anwendung dar. Hierfür werden oftmals Plasmide in die Bakterien eingebracht oder Expressionskassetten in das bakterielle Genom integriert. Im praktischen Teil wird der Salmonellen-Impfstamm Salmonella enterica Serovar Typhimurium SL7207 gentechnisch auf verschiedene Weise manipuliert und anschließend werden die eingebrachten Modifikationen molekular und funktionell analysiert. Zuerst wird ein Salmonellen-Impfstamm durch ein Minitransposon mit GFP markiert. Die Markierung von Impfstämmen ist für die Entwicklung von Lebendimpfstoffen hilfreich und dient später der leichten Identifizierung solcher Impfstoffe im Feld. Anschließend wird mittels homologer Rekombination das Gen für die Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (asd) gezielt deletiert. asd ist essentiell für die Synthese von Diaminopimelischer Säure (DAP), einem wichtigen Bestandteil des Peptidoglykans gramnegativer Bakterien. Eine solche Mangelmutante bietet die Möglichkeit, ein Expressionsplasmid durch Komplementation mit asd zu stabilisieren (balanced lethal system). Mit einem Plasmid werden schließlich zwei Lyseproteine unterschiedlicher Herkunft und Funktion in Salmonellen eingebracht. Das vom Bakteriophagen phiX174 abgeleitete Lyseprotein E ist geeignet, Bakterienzellen durch Eingriff in die Zellwandsynthese zu zerstören. Gekoppelt mit einem speziellen Sensor kann dieses Protein eingesetzt werden, um Impfstämme bei Komplikationen während der Immunisierung zu beseitigen. Andererseits können zytoplasmatisch exprimierte Impfantigene oder therapeutische Faktoren durch die bakterielle Lyse freigesetzt werden. Ein weiteres Lyseprotein ist das porenformende Toxin Listeriolysin O (LLO) aus Listeria monocytogenes. LLO vermittelt die Zerstörung der phagosomalen Membran von Säugerzellen, so dass Listerien kurz nach ihrem Eindringen in die Wirtszelle aus dem Phagosom in das Zytoplasma gelangen. Wird LLO in andere intrazelluläre Bakterien, z.B. Salmonellen, übertragen, so können auch diese Bakterien sich aus einem Phagosom befreien und Antigene direkt in das Zellzytoplasma übertragen.

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Versuchsplan :

Versuche Tag 1 (Dienstag)

Tag 2 (Donnerstag)

A) Transposon-vermittelte chromosomale Markierung eines Salmonellen-Impfstammes

gfp wird Tn7-vermittelt in das Genom des Salmonellen-Impfstammes integriert. Dazu wird eine Konjugations-mischkultur mit dem Salmonellen-Impfstamm, dem Transposasehelferstamm und dem Transposonkarrierstamm hergestellt.

HeLa-Zellen werden mit GFP-markierten Salmonellen infiziert und fluoreszenzmikroskopisch analysiert.

B) Rekombinase-vermittelte Deletion des Gens für die Aspartat-Semialdehyd Dehydrogenase eines Salmonellen-Impfstammes

Ein PCR-Produkt mit kurzen homologen Sequenzen zum chromosomalen Zielgen asd und einem Selektionsmarker wird aufgereinigt und in den -RED-Rekombinase haltigen Salmonellen-Impfstamm transferiert.

Die Gendeletion wird anhand einer Kolonien-PCR sowie biochemisch bestätigt.

C) Transformation eines Expressionsplasmides für zwei lytische Faktoren in einen Salmonellen-Impfstamm

Ein Expressionplasmid für das bakterielle Zellwandlyseprotein E sowie für das Säuger-zellmenbran-lytische Toxin Listeriolysin O werden in einen Salmonellen-Impfstamm eingebracht.

Die induzierbare Protein E-vermittelte Lyse wird anhand der optischen Kulturdichte verfolgt. Die Aktivität von Listeriolysin O wird in einem Hämolyseassay nachgewiesen.

Versuchsdurchführung :

Versuch A

Chromosomale Integration einer konstitutiven GFP-Expressionskassette mittels eines Minitransposons. Im Gegensatz zu den meisten bakteriellen Transposons (Tn) inseriert Tn7 stellenspezifisch in das Genom gramnegativer Bakterien. Die Integrationsstelle attTn7 befindet sich downstream vom essentiellen Gen glmS. Die Transposonenden Tn7-L (150bp) und Tn7-R (90bp) sind die Ansatzpunkte für die Transpositionsproteine und vermitteln die Integration in einer bestimmten Orientierung. Vorbereitung : Die Tn7-Transpositionsproteine befinden sich auf dem mobilisierbaren Helferplasmid pUX-BF13 [1]. Für die Tn7-vermittelte chromosomale Integration wurde ein sogenanntes Minitransposon mit einer GFP-Expressionskassette, einem Selektionsmarker sowie den flankierenden Transposonenden Tn7-L und Tn7-R kloniert (pHL326). Beide Plasmide wurden jeweils in den mobilisierenden E. coli Stamm SMpir transformiert. Der Helferstamm, der Stamm mit dem Minitransposon (Karrierstamm) sowie der Salmonellen-Zielstamm SL7207 wurden auf einer Medienplatte übernacht bei 30°C angezogen.

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Durchführung : Dienstag Von den Medienplatten werden jeweils Bakterien mit einer Impföse gewonnen und in 1ml LB-Medium resuspendiert. Davon werden jeweils 200 µl zur Inokulation von 4 ml LB-Flüssigkulturen verwendet. Die Flüssigkulturen für die beiden E. coli-Stämme werden mit 100 µg/ml Ampicillin supplementiert und für den Salmonellenstamm mit 30 µg/ml Streptomycin. Die Kulturen werden 60 min im Schüttelinkubator bei 150 rpm und 37°C agitiert. Jeweils 1 ml Kultur mit einer OD600 von ca. 1 werden bei 5000 x g für 5 min abzentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgesaugt und das Pellet in 8 µl LB-Medium resuspendiert. Die resuspendierten Zellen der drei Stämme werden gemischt und für die Konjugation auf ein Zellulosemischestherfilter, aufgelegt auf einer LB-Agar-Platte, pipettiert. Diese Platte wird für 24 Stunden bei 30°C inkubiert. Mittwoch Bakterien werden vom Filterplättchen abgewaschen und auf LB-Kanamycin-Platten ausgestrichen. Zellen der humanen Zervixkarzinomzellinie HeLa werden in 24-Lochplatten auf runde Deckgläschen eingesäht. Donnerstag Zur Bestätigung der Transposition in das Salmonellengenom wird eine Kolonie-PCR durchgeführt. Dazu wird ein Primer homolog zum Kanamycin-Resistenzgen des Minitransposons und ein Primer homolog zum flankierenden chromosomalen Gen glmS verwendet. Im PCR-Ansatz (50 µl) wird 1 µM je Primer, 200 µM dNTPs, 2,5 U TrueStart Taq-Polymerase und 1 x TrueStart Taq-Puffer (Fermentas) eingesetzt. Mit einer gelben Pipettenspitze wird etwas Bakterienmaterial einer einzelnen Kolonie gewonnen und in dem PCR-Ansatz resuspendiert. Die PCR-Amplifikation erfolgt bei folgenden Temperaturzyklen : 2 min 95°C // 35x 20s 94°C / 20s 55°C / 30s 72°C // 7 min 72°C / 5 min 4°C. Die Größe des amplifizierten Fragmentes wird in einem 1%igen TAE-Agarosegel überprüft. Salmonellen mit der chromosomalen GFP-Kassette werden für die Infektion von HeLa-Zellen eingesetzt. Dazu wird ein positiver Klon in 4 ml LB-Flüssigmedium supplementiert mit 30 µg/ml Streptomycin inokuliert und bei 37°C und 100 rpm agitiert. Im Anschluß werden die HeLa-Zellen mit frischem RPMI-1640-Medium (supplementiert mit 2 mM Glutamin und 5% fötalem Kälberserum) versorgt. Sobald die Bakterien eine OD600 von ca. 0,5 erreicht haben, werden jeweils 1 ml Kultur in Eppis überführt und bei 5000 x g für 5 min abzentrifugiert. Die Bakterien werden dann in RPMI-1640-Medium resuspendiert und in unterschiedlichen Volumina zu den Zellen pipettiert. Die 24-Loch-Platte wird dann 1 min bei 1000 x g zentrifugiert, die Infektionskultur mikroskopisch betrachtet und dann für 30 min im Zellkulturschrank inkubiert. Im Anschluß wird das Medium abgesaugt, die Zellen mit warmen PBS wiederholt gewaschen und frisches Medium supplementiert mit 50 µg/ml Gentamycin zugegeben. Während der folgenden 90 minütigen Inkubation tötet Gentamycin lediglich die extrazellulären Bakterien ab, die intrazellulären Bakterien bleiben unbeeinträchtigt. Schließlich werden die Zellen erneut zweimal mit PBS gewaschen, die Deckgläschen entnommen und auf Objektträgern für die fluoreszenzmikroskopische Analyse eingebettet.

Versuch B

Die gezielte Deletion des asd Gens erfolgt mit Hilfe der RED-Rekombinase des Bakteriophagen Lambda [2]. Vorbereitung : Rekombinase-haltige elektrokompetente Zellen werden vorbereitet. Dazu wird der Salmonellen-Zielstamm SL7207 mit dem RED-Rekombinaseplasmid pKD46 transformiert. In diesem Plasmid befindet sich die RED-Rekombinase unter der Kontrolle des Promotors des Arabinose-Operons aus E.coli. Die Expression der RED-Rekombinase wird in der logarithmischen Wachstumsphase einer Schüttelkultur (200 ml, 30°C, 180 rpm,) durch

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Zugabe von 0,05% (g/v) L-Arabinose induziert. Anschließend werden die Bakterien weitere 90 min kultiviert, dann 10 min auf Eis abgekühlt und 5 min bei 4°C 5000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wird in 200 ml eiskaltem Wasser vollständig resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Dieser Waschschritt wird ein weiteres Mal unter Verwendung von eiskaltem Glycerinwasser (10% v/v Glycerin) wiederholt. Nach dem Zentrifugieren wird das Pellet in 1 ml Glycerinwasser resuspendiert, auf Eis jeweils 50 µl Zellsuspension (ca. 5x108 Bakterien) in Eppi's aliquotiert und schließlich auf Trockeneis für die Lagerung bei -70°C schockgefroren. Ein lineares DNA-Fragment mit endständigen homologen Sequenzabschnitten und einem Selektionsmarker wird für die Rekombinase-vermittelte Deletion des chromosomalen asd-Gens benötigt. Dieses Fragment wird durch eine PCR erzeugt, in der zwei Primer mit 42bp-langen asd-Homologiesequenzen und ein Plasmid mit dem Selektionsmarker als Template (pKD4) verwendet werden. Im PCR-Ansatz (50µl) werden 1 µM je Primer, 200µM dNTPs, 10 ng Plasmid-Template sowie 2,5 U TrueStart Taq-Polymerase und 1x TrueStart Taq-Puffer (Fermentas) eingesetzt. Die PCR-Amplifikation erfolgt bei folgenden Temperaturzyklen : 2 min 95°C // 35x 20s 94°C / 20s 56°C / 30s 72°C // 7 min 72°C / 5 min 4°C. Primersequenzen : asdFW : ATGGTGAAGGATGCGCCACAGGATACTGGCGCGCATACACAGTG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC asdREV : CTACGCCAACTGGCGCAGCATTCGACGCAGCGGCTCGGCGGC CATATGAATATCCTCCTTAG Durchführung : Dienstag Das PCR-Produkt (1562 bp) wird mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt, die DNA-Konzentration photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt und die Fragmentgröße in einem 1%igen TAE-Agarosegel bestimmt. Die Konzentration der DNA wird auf 100 ng/µl in Reinstwasser eingestellt. Rekombinase-haltige elektrokompetente Salmonellen werden auf Eis aufgetaut, 200 ng des DNA-Fragmentes mit den Zellen vermischt, in eine vorgekühlte 2 mm Küvette überführt und dann mit dem Bio-rad Gene Pulser elektroporiert. Dafür werden folgende Einstellungen gewählt : Kapazität 25 μF, Widerstand 400 Ω, Spannung 2,5 KV. Direkt nach der Elektroporation wird die Bakteriensuspension in 1 ml SOC-Medium aufgenommen, für eine Stunde bei 37 °C inkubiert und schließlich auf LB-Kanamycin-Platten supplementiert mit 50 µg/ml DAP ausgestrichen. Mittwoch Nach Übernachtinkubation bei 37°C werden einzelne Kolonien auf LB-Kanamycin-Platten mit und ohne DAP überimpft, um den Phänotyp der asd Mutante zu bestätigen. Donnerstag Zur Bestätigung der asd Deletion wird eine Kolonie-PCR durchgeführt. Dazu wird ein Primer homolog zum Kanamycin-Resistenzgen und ein Primer homolog zur asd upstream Region verwendet. Im PCR-Ansatz (50µl) wird 1 µM je Primer, 200 µM dNTPs, 2,5 U TrueStart Taq-Polymerase und 1x TrueStart Taq-Puffer (Fermentas) eingesetzt. Mit einer gelben Pipettenspitze wird etwas Bakterienmaterial einer einzelnen Kolonie gewonnen und in dem PCR-Ansatz resuspendiert. Die PCR-Amplifikation erfolgt bei folgenden Temperaturzyklen : 2 min 95°C // 35x 20s 94°C / 20s 55°C / 30s 72°C // 7 min 72°C / 5 min 4°C. Die Größe des amplifizierten Fragmentes wird in einem 1%igen TAE-Agarosegel überprüft. Der DAP-auxotophe Stamm wird zunächst in 100 ml DAP-supplementiertem LB-Medium angezogen und die optische Dichte verfolgt. Bei einer OD600 von ca. 0,5 werden die Bakterien abzentrifugiert und in DAP-freien LB-Medium resuspendiert. Die bakterielle Zelllyse wird anhand des weiteren Verlaufes der Wachstumskurve verfolgt.

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Versuch C

Plasmidvermittelte Expression des Lyseproteins E vom Bakteriophagen phiX174 sowie des membranlytischen Proteins LLO aus Listeria monocytogenes in einem Salmonellen-Impfstamm. Durchführung : Dienstag Der Salmonellen-Impfstamm SL7207 wird mit einem Expressionsplasmid für Protein E und LLO transformiert. Dieses Plasmid vermittelt die Arabinose-induzierbare Expression von Gen E und eine konstitutive Expression von LLO. Elektrokompetente Bakterien werden mit 200 ng Plasmid-DNA vermischt und analog zu Versuch B elektroporiert. Die transformierten Zellen werden auf LB-Ampicillin-Platten ausgetrichen. Mittwoch Nach Übernachtinkubation bei 37°C werden einzelne Kolonien auf neuen Medienplatten vermehrt. Donnerstag Plasmidhaltige Salmonellen werden von den Medienplatten mit der Impföse gewonnen und in eine 50 ml LB-Schüttelkultur überführt. Die Bei einer OD600 von ca. 0,5 wird die Expression von Lyseprotein E durch Zugabe von 0,05% g/v L-arabinose induziert. Die bakterielle Zelllyse wird anhand des weiteren Verlaufes der Wachstumskurve verfolgt. Zusätzlich werden im Abstand von 30 min jeweils 0,5 ml Proben für den LLO-Hämolyseassay gewonnen. Diesen Proben werden bei 7000 x g für 5 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und auf Eis gelagert. Die Freisetzung von LLO aus Bakterien wird anhand der lytischen Aktivität des Kulturüberstandes gegenüber Schafserythrozyten bestimmt. Zunächst wird zu 0,5 ml Schafsblut 1 ml PBS pH 5,1 zugegeben, leicht gemischt und die Zellen bei 3000 x g für 5 min in der Tischzentrifuge sedimentiert. Dieser Waschschritt wird zweimal wiederholt. Danach werden die Zellen in 1 ml Lyse-PBS (PBS, pH 5,1, 1 mM 2-Mercaptoethanol) resuspendiert. 100 μl dieser Suspension werden mit 3,9 ml Lyse-PBS verdünnt, davon 400 μl mit 400 μl Überstand der Bakterienkultur vermischt und dieses Gemisch 1 h lang bei 37°C inkubiert. Die Proben werden anschließend bei 3000 x g für 5 min zentrifugiert und die Absorption des durch die Erythrozytenlyse freigesetzten Hämoglobins im Überstand photometrisch bei einer Wellenlänge von 541 nm gemessen. Die vollständige Erythrozytenlyse, und damit der maximale Absorptionswert, wird durch die Inkubation mit 1%igen Triton-X-100 in PBS erreicht.

Literatur

1. Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H. and Roberts, G. P. (1991) An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of gram-negative bacteria. Gene 109, 167-168.

2. Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97, 6640-6645.

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Transaktivierung der HIV-LTR durch das virale Tat Protein (Gr. 4-6)

Ziele des Versuchs: 1.) Ermittlung der Transfektionseffizienz in der humanen T-Zelllinie A3.01 durch

Transfektion eines GFP-Expressionsplasmids. 2.) Nachweis der LTR-Transaktivierung durch das virale Tat-Protein mittels Reporter-Assay. Theorie: Transaktivierung der HIV-LTR durch Tat: Im HIV-Genom befindet sich vor den viralen Genen der sogenannte LTR-Bereich („long terminal repeats“). Dieser Bereich enthält eine TATA-Box und zahlreiche Bindestellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren und stellt damit einen Promotor/Enhancer für die viralen Gene dar. Am LTR-Promotor erfolgt eine effiziente Initiation der Transkription, die Elongation des Transkriptionskomplexes ist allerdings ohne das Tat-Protein („transactivating protein“) stark eingeschränkt. Das Tat-Protein des HI Virus ist ein kleines regulatorisches Protein, dessen Funktion u. a. darin besteht, die Expression der viralen Gene zu kontrollieren. Tat bindet über eine spezifische Interaktion an ein regulatorisches Element der entstehenden mRNA. Dieses Element wird TAR („transactivation-responsive region“) genannt und bildet eine Haarnadelstruktur aus, an die Tat bindet. Über eine assoziierte Protein-Kinase vermittelt Tat die Hyperphosphorylierung der RNA Polymerase II im Elongationskomplex, was zu einer erhöhten Prozessivität des Enzyms führt. Zum Versuch:

Zunächst wird die Transfektionseffizienz bestimmt, indem ein EGFP-Expressions-plasmid („enhanced green fluorescent protein“, pEGFP-N1) transfiziert wird. Die erfolgreich transfizierten Zellen exprimieren das fluoreszierende Protein und können so im Fluoreszenzmikroskop identifiziert werden. Durch Auszählen des Anteils der grün leuchtenden Zellen kann die Transfektionseffizienz ermittelt werden. Zur Untersuchung der LTR-Aktivierung durch das Tat-Protein verwenden wir ein Reportergensystem. Es wird ein Reporterplasmid verwendet, in dem der virale Promotor LTR (inklusive TAR-Region) vor ein Firefly-Luciferasegen geschaltet ist (pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc). Tat wird über das Expressionsplasmid pBS- kRSPA-TATNL4-3 in die Zellen eingebracht. Wird am Promotor die Transkription initiiert, kommt es zur Expression des Luciferasegens. Durch Messung der Luciferaseaktivität kann dann eine Aussage über die Stärke der Aktivierung des Promotors getroffen werden. Das Enzym Luciferase bietet sich als Reportergen an, weil seine Aktivität relativ leicht gemessen werden kann. Bei der Umsetzung des Substrats Luciferin wird Fluoreszenzlicht emittiert und kann im Luminometer nachgewiesen werden. In Anwesenheit von ATP, Mg2+ und O2 katalysiert die Luciferase die Oxidation des Luciferins über das Intermediat Luciferyl-AMP zu Oxyluciferin nach folgender Reaktion:

Luciferin + ATP Lucifery-AMP + PP

Lucifery-AMP + O2 Oxyluciferin + Licht

Die Plasmide werden durch transiente Transfektion in die Zellen eingebracht. Hierzu verwenden wir das Transfektionsreagenz DMRIE-C, welches ein Lipid enthält, das mit DNA

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interagieren kann. Es bilden sich Lipid-DNA-Komlexe, die von den Zellen aufgenommen werden können. Zusätzlich wird in alle Ansätze ein Expressionsplasmid für Renilla-Luciferase (phRG-TK) transfiziert. Im Unterschied zur Firefly-Luciferase, die durch den indizierbaren LTR-Promotor reguliert wird, wird die Renilla-Luciferase konstitutiv exprimiert und dient daher als interne Kontrolle. Alle gemessenen Firefly-Luciferaseaktivitäten werden auf den entsprechenden Renilla-Luciferasewert normalisiert. Dadurch können Pipettierfehler und Unterschiede in der Transfektionseffizienz ausgeglichen werden. Da beide Enzyme unterschiedliche Substrate umsetzen, kann zwischen beiden Luciferaseaktivitäten unterschieden werden. Durchführung: 1. Kurstag - Ganztägig Teil 1: Tat- vermittelte Transaktivierung der HIV-LTR: Transfektionen Alle Versuchsansätze werden in drei identischen Ansätzen durchgeführt. - je Ansatz DNA und 0,5 ml Opti-Mem in Polystyrolröhrchen vortexen (dreifache Menge für

Triplikate) - Mastermix (für alle Ansätze): je Ansatz 0,5 ml Opti-Mem und 3,5 µl DMRIE-C - je 0,5 ml Mastermix in ein 6well geben und im gesamten well verteilen - je 0,5 ml DNA-Lösung dazu geben, kurz schütteln - 30 min. bei RT inkubieren, DNA-Lipidkomplexe bilden sich

- A3.01 T-Zellen abzentrifugieren (1200 rpm, 7 min. RT) - in 10 ml RPMI ohne alles resuspendieren - Zellen zählen, mit RPMI auf eine Konzentration von 1x106/ml bringen

- je well 0,5 ml Zellen zugeben (entspricht 5x105 Zellen) - bei 37°C im Brutschrank 4-5h inkubieren - je well 1,5 ml Vollmedium (RPMI+10%FCS+Penicillin+Streptomycin+L-Glutamin)

zugeben Folgende Plasmide werden transfiziert: 1-3) 1 µg pEGFP-N1 + 100 ng phRG-TK

4-6) 0,5 µg pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc + 1 µg pBS-kRSPA + 100 ng phRG-TK

7-9) 0,5 µg pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc + 0,5 µg pBS-kRSPA + 0,5 µg pBS-

kRSPA-TATNL4-3 + 100 ng phRG-TK

10-12) 0,5 µg pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc + 1 µg pBS-kRSPA-TATNL4-3 + 100 ng phRG-TK

Teil 2: Kompartimentierung von zellulären Proteinen Viele virale und zelluläre Proteine sind in der eukaryotischen Wirtszelle nicht gleichmäßig verteilt, sondern in definierten zellulären Kompartimenten lokalisiert. So zum Beispiel findet man retrovirale reverse Transkriptase ausschliesslich im Zytoplasma der infizierten Zelle während retrovirale Integrase auch im Zellkern zu finden ist. Auch eine Vielzahl der von der Wirtszelle kodierten Proteine liegt, je nach ihrer Funktion, entweder im Zellkern oder im Zytoplasma vor. So zum Beispiel findet man den Transkriptionsfaktor OCT-4 (Octamer binding transcription factor 4), der für eine normale Embryonalentwicklung essentiell ist, nur im Zellkern. Oct-4 wird in pluripotenten Stamzellen sowie in Teratokarzinomzelllinien exprimiert, nicht jedoch in ausdifferenzierten Zellen. Im Gegensatz dazu ist das

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Strukturprotein Aktin, das in allen eukaryotischen Zellen vorkommt, nur im Zytoplasma zu finden. Im folgenden Experiment soll die unterschiedliche Lokalisierung von Oct-4 und Aktin mittels Immunofluoreszenz-Analyse anchgewiesen werden: Durchführung: Für die Immunfluoreszenzfärbung werden Teratocarcinomzellen der Linie NCCIT verwendet. Die Zellen wurden bereits am Vortag vom Betreuer auf Deckgläschen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 80% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 im Brutschrank weiter kultiviert. Gefärbt werden verschiedene Markerproteine (Oct4, Aktin) und der Zellkern (Dapi-Färbung). - Fixierung der Zellen Das Medium wird zunächst von den Zellen abgesaugt und die Zellen mit 1ml PBS gewaschen. Es folgt die Fixierung mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd/PBS (pH 7.4) auf dem Schüttler bei Raumtemperatur für 15 min. - Permeabilisierung der Zellen Die Paraformaldehyd-Lösung wird abgesaugt und die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler in 0,5 ml 1% Triton-X-100/PBS (pH 7.4) inkubiert. - Waschen der Zellen und Blockieren Die Permeabilisierung-Lösung wird vorsichtig abgesaugt und die Zellen 3x2 min in 1 ml PBS auf dem Schüttler bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend werden unspezifische Bindestellen durch Blockieren mit 0,5 ml 5% BSA/ 0,1% Triton-X-100/PBS (pH 7.4) für 30 min bei Raumtemperatur abgesättigt. - Inkubation mit dem Erstantiköper Nach dem Absaugen der Blockierungslösung wird der erste Antikörper zugegeben. Für den Nachweis von Oct 4 wird ein Antikörper aus der Maus verwendet in einer Verdünnung von 1:500 in 5% BSA/PBS (pH 7.4). Es folgt eine Inkubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur. Pro Deckgläschen werden 120µl Antikörper-Ansatz benötigt.

- Waschen der Zellen und Inkubation mit dem Zweitantikörper Nach der Inkubation werden die Zellen 3x5 min mit 1 ml PBS gewaschen, um nicht gebundenen Erstantikörper zu entfernen. Anschließend wird mit dem Zweitantikörper im Dunkeln inkubiert. Dabei handelt es sich für Oct4 um einen Fluoreszenz-gekoppelten Anti-Maus-Antikörper (AlexaFluor® 488 goat anti mouse) in einer Verdünnung von 1:1000. Zum Nachweis von Aktin wird ein ebenfalls Fluoreszenz-gekoppelter Phalloidin-Antikörper (AlexaFluor® 633 Phalloidin) in einer Verdünnung von 1:500 eingesetzt. Die Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur erfolgt im Dunkeln. Pro Deckgläschen werden 120µl Antikörper-Ansatz benötigt. - Waschen der Zellen und Zellkernfärbung Nach Ende der Inkubationszeit werden die Zellen 3x5 min in 1 ml PBS (pH7.4) gewaschen. Parallel wird die Lösung mit Dapi zum Anfärben der Zellkerne angesetzt. Die Stammlösung hat eine Konzentration von 1mg/ml und wird 1:1000 in PBS (pH7.4) verdünnt. Pro Deckglas werden 500µl verwendet und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht gebundenes Dapi wird durch Waschen mit PBS (pH 7.4; 3x10 min) bei Raumtemperatur auf dem Schüttler entfernt. - Einbetten der Zellen Zum Abschluss werden die Zellen in Aquapolymount eingebettet. Dazu wird pro Deckgläschen ein Tropfen Aquapolymount auf einen entsprechend beschrifteten Objektträger aufgetropft und die Deckgläschen mit der „Zellseite“ zum Objektträger auf den Tropfen aufgelegt und überschüssiges Einbettmedium vorsichtig abgetupft. Die Proben werden bis zur weiteren Analyse bei 4°C im Kühlschrank gelagert.

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2. Kurstag – Vormittag: Auswertung der Immunfluoreszenzanalysen zum Nachweis der Kompartimentierung der zellulären Proteine OCT-4 und Aktin 2. Kurstag – Nachmittag:

Tat- vermittelte Transaktivierung der HIV-LTR:

Bestimmung von Luziferaseaktivität und Transfektionseffizienz

Lyse:

- Zellen in 15 ml-Falcons abzentrifugieren (1300 rpm, 7 min.)

- Zellen 1x in PBS waschen

- Pellets in je 100 µl Lysispuffer (PLB, Promega) resuspendieren, in Eppis überführen

- 30 min. auf Eis inkubieren

- mit 13000 rpm abzentrifugieren (10 min., 4°C)

- für Luciferase –Assay je 20 µl in 96well-Platte geben

Messung der Luciferaseaktivität:

Die Substratzugabe erfolgt durch das Luminometer:

- Zugabe von je 50 µl Luciferase Assay Reagenz (Substrat für Firefly-Luciferase)

- nach 2 sec. beginnend wird über 10 sec. die Fluoreszenz gemessen

- Zugabe von 50 µl Stop&Glow (unterdrückt die Firefly-Fluoreszenz und enthält das

Substrat für die Renilla-Luciferase)

- nach 2 sec. beginnend wird über 10 sec. die Fluoreszenz gemessen

Auswertung:

Transfektionseffizienz:

- Bestimmung der Transfektionseffizienz durch Auszählen des Prozentsatzes der

EGFP-exprimierenden Zellen

Einfluss von Tat auf die LTR-Aktivität:

- Normalisierung der Meßwerte auf Renilla-Luciferaseaktivität, Berechnung der Mittelwerte

der Dreifachbestimmungen.

- Erstellen von Säulendiagrammen (Mittelwerte der Dreifachbestimmungen sollen mit

Standardabweichung dargestellt werden), um welchen Faktor erhöht die Tat-Expression

die LTR-Aktivität?

Literatur:

Funktion des Tat Proteins:

http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/COMPENDIUM/2000/partI/Karn.pdf

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Experiment 5:

Gentransfer mit retroviralen Vektoren

Wichtig

Die Gruppen 1-3 führen das Experiment in der AG Buchholz durch, die

Gruppen 4-6 in der AG Mühlebach.

Verlaufsplan: Tag 1: - Transduktion der Zielzellen

- Isolierung viraler RNA

Tag 2: - EGFP

- lacZ-Färbung

- Isolierung zellulärer DNA

Tag 3: - reverse Transkription viraler RNA

- PCR an RNA , cDNA und genomischer DNA

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Versuchshintergrund und -ablauf:

Retrovirale Vektoren, die zur genetischen Veränderung von bestimmten Zielzellen

verwendet werden sollen, können durch verschiedene Methoden hergestellt werden:

zum einen gibt es stabil transfizierte Verpackungszellen, welche alle

Komponenten des Vektors (Transfervektor, Gag/Pol, Env) konstitutiv bilden.

Andererseits können die für diese Vektorbestandteile kodierenden Plasmide transient

(nicht stabil, „vorübergehend“) in geeignete Zelllinien ko-transfiziert (d.h. mit einer

speziellen Technik in die einzelnen Zellen eingebracht) und so „transient

transfizierte Verpackungszellen“ generiert werden (Abb. 1). Hierfür sind 293T-

Zellen (humane embryonale Nierenmarkszellen) aufgrund der hohen erreichbaren

Transfektionseffizienzen besonders geeignet.

Für diesen Versuch wurden in Vorbereitung ausgehend von 293T-Zellen

verschiedene transient transfizierte Vepackungszellen zur Produktion von Murinen

Leukämie Virus (MLV)-abgeleiteten Vektoren hergestellt und die entsprechenden

Vektoren präpariert. Die dabei erzeugten Vektormengen und die Eigenschaften der

Vektorpartikeln werden innerhalb des Praktikums untersucht.

Die zu erzeugenden Vektoren bestehen alle aus MLV-Kapsidpartikeln (Gag/Pol),

unterscheiden sich aber durch die verwendeten Transfervektoren, die

unterschiedliche Reportergene (lacZ/-Gal bzw. gfp/GFP) beinhalten, und die

Hüllproteine, welche das Wirtszellspektrum (Tropismus) der Vektorpartikel durch die

Bindung an spezifische zelluläre Rezeptoren bestimmen (Abb. 2). Folgende

Hüllproteine (Env) sollen hier verwendet werden:

1. Env des ecotropen MLV: Ecotropes MLV (vollständiges Virus, nicht der Vektor!)

repliziert nur in Nagerzellen und nutzt den zellulären Rezeptor MCAT-1 zum

Anbinden und den Eintritt in die Wirtszelle.

2. Env des amphotropen MLV: Amphotropes MLV repliziert in Nagerzellen sowie

auch in humanen Zellen und nutzt den Rezeptor RAM-1 (receptor for amphotropic

MLV 1).

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3. Env des GaLV (Gibbon Ape Leukemia Virus): Das Hüllprotein des GaLV bindet

an den Rezeptor Glvr-1 (GaLV receptor 1), der (wie RAM-1) in fast allen

humanen Zelltypen, jedoch nicht in murinen Zellen gebildet wird. Allerdings

scheint Glvr-1 in einigen für die Gentherapie besonders interessanten

Zellpopulationen (z. B. hämatopoetischen Stammzellen) stärker exprimiert zu

werden als RAM-1. Daher wird GaLV Env zur Pseudotypisierung (Verwendung

eines heterologen Env, d.h. Verwendung eines Hüllproteins eines anderen Virus

auf der Vektoroberfläche) von retroviralen MLV-abgeleiteten Vektorpartikeln

verwendet. Somit verändert man den Vektortropismus und kann in bestimmten

Zielzellen die Gentransfereffizienz erhöhen.

Zunächst wurden durch Lipofektion (= Transfektionsmethode) 293T Zellen mit den

für die Vektorkomponenten kodierenden Plasmiden (Transfervektor,

Verpackungskonstrukt, Hüllproteinkonstrukt) transfiziert. Zwei Tage nach

Transfektion konnten die vektorhaltigen Zellkulturüberstände dieser

Verpackungszellen (viral packaging cells; VPC) „geerntet“ werden. Diese werden

Ihnen im Praktikum zur Verfügung gestellt. Der eigentliche Praktikumsversuch

beginnt dann mit der Transduktion verschiedener Zielzellen, d.h. die Zielzellen

werden mit vektorhaltigem Überstand inkubiert, um die Zielzellen durch Einschleusen

des Transfervektors ins Genom genetisch zu verändern. Zwei Tage nach erfolgter

Transduktion werden die Zielzellen auf die Anwesenheit der transferierten

Reportergene (auf Transfervektor) hin untersucht. Die Menge der generierten

Vektorpartikel und deren Tropismus lassen sich so nachweisen. Im Rahmen dieses

Versuches sollen auch die RNA Genome aus den Vektorpartikeln isoliert, in cDNA

umgeschrieben werden und dann mit PCR detektiert werden.

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Abb. 1: Herstellung und Analyse von retroviralen Vektoren durch Triple-

Transfektion

Dreifach-Transfektion in 293T Zellen

Vektorhaltige Überstände werden ingeeigneten Zielzellen titriert.

293T-Transfektanden (Verpackungszellen)exprimieren gag, pol, env und einen -positivenTransfervektor.

Nachweis des Reportergens (Fluoreszenz,bzw. X-Gal-Test)

Mikroskopische Auswertung

Verpackungskonstrukt

Transfervektor LTR LTR

Reportergen

gag/polLTR LTR

Hüllproteinkonstrukt envLTR LTR

gag/pol

Nachweis der Expression der Reporterproteine (X-Gal bzw. Fluroeszenz) und eines Reportergens (PCR) in den Zielzellen

DNA-Isolierung

PCR auf Markergensequenzen Mikroskopische Auswertung (Reporterproteine)

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Vor dem Praktikum vorbereitet und durchgeführt:

Herstellung von MLV abgeleiteten Vektoren

Lipofektion:

24 h vor Versuchsbeginn werden in 35 mm Kulturschalen 6 x 105 Zellen

ausgesät

je 1µg DNA pro Konstrukt (Transfervektor, Verpackungskonstrukt,

Hüllproteinkonstrukt), also insgesamt 3 µg werden in Eppis vorgelegt

(siehe Pipettierschema nächste Seite).

4 µl Lipofektamin PLUS werden in 100 µl DMEM- angesetzt (Eppi) und für

15 min bei RT mit den DNA-Lösungen inkubiert.

je 10 µl Lipofectamin in 100 µl DMEM- werden zugegeben - weitere 15 min

bei RT

nach der Inkubation wird mit DMEM- auf 1 ml aufgefüllt.

die Transfektionslösungen werden auf die Zellen gegeben (Medien zuvor

entfernen).

Inkubation für 2 bis 5 h bei 37° C

Mediumwechsel (komplettes Kulturmedium)

Inkubation über Nacht

Mediumwechsel (je 2 ml komplettes Kulturmedium)

zwei Tage nach Transfektionsbeginn können die Überstände geerntet und

zur Vektorpräparation sowie nachfolgend zur Transduktion der Zielzellen

eingesetzt werden.

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A

nsat

z

Verpackungs-

konstrukt

(MLVgag/pol)

Hüllprotein-

konstrukt

(GaLV env,

MLVeco env,

MLVampho env)

Transfervektor

(MLV LTRs

und

Verpackungssignal

1 pHIT60

pALF-GaLVwt

pMg--Gal-LNGFR

2 pHIT60

pALF-GaLVwt

pMg-EGFP-NGFR

3 pHIT60

pHIT123

pMg--Gal-LNGFR

4 pHIT60

pHIT123

pMg-EGFP-NGFR

5 pHIT60

pHIT456

pMg--Gal-LNGFR

6 pHIT60 pHIT456 pMg-EGFP-NGFR

Tab.: Kombinationen der Vektorkomponenten kodierenden Plasmid-DNAs (je 1 µg)

zur Transfektion von 293T Zellen.

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Transfervektoren

Verpackungskonstrukt

Hüllprotein(Env)-Konstrukte

pMg -ß- Gal- LNGFR:

LTR LTR

LNGFR

SD SA

lacZ

ATG ATG

SD SA

pMg -EGFP- LNGFR:

LTR LTR

LNGFR egfp

ATG ATG

Fig .2

pHIT60: LTR LTR

ATG

pHIT123: env (ecotrop. MLV)LTR LTR

ATG

pHIT456: env (amphotrop. MLV)LTR LTR

ATG

pALF - GaLVwt :

ATG

env (GaLV )LTR LTR

MLV gag/pol

Die Transfervektoren (pMg--Gal-∆LNGFR, pMg-EGFP--∆LNGFR) besitzen die von MLV abgeleiteten flankierenden LTRs (long terminal repeats), das Verpackungssingnal "", welches die Verpackung der Transkripte in MLV-Kapsidpartikel gewährleistet, sowie einen Splicedonor (SD) bzw. –akzeptor (SA). Als Reportergenprodukte dienen die trunkierte Variante des "low affinity nerve growth factor receptor" (∆LNGFR) sowie -Gal bzw. EGFP. Das Verpackungskonstrukt pHIT60 beinhaltet die Strukturgene gag und pol des MLV, deren Genprodukte in der Lage sind, leere, nicht umhüllte Kapsidpartikel des MLV zu bilden. Die Hüllproteinkonstrukte kodieren für die Hüllproteine des eco- oder amphotrophen MLV bzw. des GaLV. Alle Strukturgene werden von modifizierten LTRs getrieben.

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Versuchsdurchführung:

Alle Arbeiten werden steril und unter der Werkbank durchgeführt

Experiment Transduktion von Zielzellen:

Zielzellen: NIH 3T3, HT1080, und D17 (canine [„Hunde“] Osteosarkomzellen)

3,5x105 NIH 3T3 und 3x105 HT1080 bzw. D17 Zellen wurden in Sechs-Loch-Platten

am Tag zuvor ausgesät und werden zur Verfügung gestellt:

Es werden jeweils 3 Zellkulturplatten benötigt: a) für GFP-Detektion b) für LacZ

Detektion, c) für die Isolierung von zellulärer DNA (s. Schema S. 76).

Vektorhaltige Überstände (SN) wurden vor Beginn des Praktikums generiert und

stehen nun für Transduktionsversuche zur Verfügung. 550 µl einer 1:10

Verdünnung herstellen (nach Absprache mit Versuchsbetreuern).

Zielzellen mit PBS waschen

je 500 µl der unverdünnten und 1:10 verdünnten vektorhaltigen filtrierten

Überstande zu den Zielzellen geben (siehe Schema S. 76; beschriften!).

2h nach Transduktion Zellen mit frischen Medien versorgen.

Weiterhin stehe DNAse-vorbehandelte Vektorüberstände für die Isolierung viraler

RNA zur Verfügung.

Experiment Isolierung von Nukleinsäuren und PCR Detektion:

Isolierung viraler RNAs

Um die viralen RNAs aus den Vektor-Partikeln zu isolieren, wird der vektorhaltige

Überstand direkt eingesetzt und mittels des QIAamp Viral RNA Kit aufgereinigt.

QIAamp viral RNA Mini Kit

The sample is first lysed under highly denaturing conditions to inactivate RNases

and to ensure isolation of intact viral RNA. Buffering conditions are then adjusted to

provide optimum binding of the RNA to the QIAamp membrane, and the sample is

loaded onto the the QIAamp spin column. After contaminants are washed away,

high-quality RNA is eluted in a special RNase-free buffer, ready for direct use or

safe storage.

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Preparation of virus RNA (according to Qiagen)

Use RNase-free material only after the lysis with buffer AVL

Pipet 560µl of prepared Buffer AVL (containing carrier RNA) into a 1.5ml tube

Add 140µl virus-containing supernatant, mix by votexing for 15 sec.

Incubate at RT for 10 min.

Briefly centrifuge tube to remove drops from inside the lid

Add 560µl EtOH (96-100%), mix by vortexing, briefly spin down

apply 630µl of sample to provided column (in a 2-ml collection tube)

centrifuge 1 min (8000rpm) and discard filtrate, place the QIAamp column in a

clean collection tube

apply residual sample to column

centrifuge 1 min (8000rpm) and discard filtrate, place the QIAamp column in a

clean collection tube

add 500µl buffer AW1, centrifuge 1 min (8000rpm) and discard filtrate, place the

QIAamp column in a clean collection tube

add 500µl buffer AW2, centrifuge 3 min (13000rpm) and discard filtrate, place the

QIAamp column in a clean collection tube.

repeat centrifugation to get rid of residual filtrate, place the QIAamp column in a

clean 1.5-ml microcentrifuge tube

add 60µl buffer AVE, incubate 1 min at RT

centrifuge 1 min (13000rpm)

Take off 20 µl for DNase digest (see page 69), store on ice

store rest of eluate at –80°C

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DNAse digestion of RNA

20 µl + 67.5 µl H2O

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Experiment Transduktion von Zielzellen:

48h nach Transduktionsbeginn können die Zielzellen mittels

Fluoreszenzmikroskopie (eGFP) bzw. nach Fixierung mittels X-Gal-Test

(-Gal) auf den erfolgten Gentransfer hin untersucht werden.

X-gal-Färbung von Monolayer-Kulturen Fixierlösung: - PBS (ohne Ca und Mg) - 2 % Formaldehyd - 0,2% Glutaraldehyd Stammlösungen: - 5- Bromo-4-Chloro-3-Indolyl ß-D-Galactopyranoside (x-Gal) in DMSO (40mg/ml) - Kaliumhexacyanoferrat III (1M) (Kaliumferricyanid = rotes Blutlaugensalz) - Kaliumhexacyanoferrat II (0,5M) (Kaliumferrocyanid = gelbes Blutlaugensalz) - MgCl2 (1M) Reaktionsmix: - PBS (ohne Ca + Mg) 20ml - X-Gal (40mg/ml) 500µl (=1mg/ml) - R-Ferricyanid (1M) 100µl (=5mM) - R-Ferrocyanid (0,5M) 200µl (=5mM) - MgCl2 (1M) 40µl (=2mM) Ablauf: - Medium von Zellen entfernen - (Zellen 1x PBS waschen) - Fixierlösung auf Zellen geben (6well: +1-2ml), 10Min./RT - 1x (-3x) vorsichtig mit PBS waschen - X-Gal-Lösung (s.o. Reaktionsmix, frisch angesetzt) auf Zellen geben (6well: +1-

2ml) - 37°C stellen (Färbung ist nach einigen Stunden erkennbar – kann aber auch über

Nacht stehen)

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Auswertung des Experiments Transduktion von Zielzellen (eGFP + lacZ):

Die transduzierten Zellen werden unter dem Axiovert (Mikroskop) untersucht und

die Zahl der transduzierten Zellkolonien pro betrachteter Fläche bestimmt.

Hochgerechnet auf die gesamte Fläche der Kulturschale kann die Zahl der

infektiösen Vektorpartikel pro Volumeneinheit Überstand bestimmt werden

(t.u./ml; t.u. = transducing units).

Diese Titer können graphisch dargestellt werden.

Vergleiche die Titer der verschiedenen Vektorpartikel in den

unterschiedlichen Zielzellen;

- Gibt es Unterschiede zwischen den verschiedenen Reportergenen in der

Hinsicht, welche Zellen bei welchen Vektoren positiv werden? Warum?

- Bei den NIH3T3 und HT1080-Zellen handelt es sich um eine humane und eine

murine Zellinie. Welche ist was? (Hinweis: Der Tropismus der verwendeten

Hüllproteine sollte eine Aussage erlauben!)

- Welche Rezeptoren sind auf der caninen Zellinie D17 vorhanden?

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Isolierung zellulärer DNAs

Die Gesamt DNA der Vektor-transduzierten Zellen soll isoliert werden und

die Anwesenheit der Vektorsequenzen mit PCR nachgewiesen werden. Wir

nutzen zur Isolierung der DNA das QIAGEN DNeasy Tissue Kit.

DNeasy Tissue procedure:

The kit uses advanced silica-gel-membrane technology for rapid and efficient

purification of total cellular DNA. The buffer system is optimized to allow

direct lysis followed by selective binding of DNA to the to the DNeasy

membrane. DNeasy purified DNA typically has an A260/A280 ratio between

1.7 and 1.9, and is up to 50 kb in size. The DNeasy procedure also efficiently

recovers DNA fragments as small as 100 bp.

Before lysis of cells, these have to be detached from monolayer culture and

washed :

Remove medium

Wash cells 1x with 1 ml PBS/well

Detach cells by adding 500 µl Trypsin-EDTA + 500 µl PBS and

incubation for 5 min at RT

Transfer cells into Eppendorff Tube

Spin down (5 min 2000 rpm)

Wash cells with 1 ml PBS

Spin down (5 min 2000 rpm)

Purification of total DNA from cultured animal cells:

Resupend pellet in 200µl PBS

Add 20µl proteinase K and 200µl buffer AL (do not add proteinase

k directly to buffer AL), mix by votexing

Incubate 56°C 10 min

Add 200 µl EtOH, mix by vortexing

Transfer mixture to DNeasy mini spin column (placed in a 2 ml

collection tube)

spin 1 min at 8000 rpm

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Replace the collection tube, add 500µl buffer AW1


Replace the collection tube, add 500µl buffer AW2


place the column in clean 1.5 ml centrifuge tube

add 200 µl buffer AE on the membrane

incubate 1 min

spin 1 min at 8000 rpm to elute DNA

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→ Herstellung von cDNA der viralen RNA

heat one incubator to 80°C and one to 37°C

prepare RT-reaction-Mastermix for all samples: for one sample (=13µl): 5x Buffer 4µl dNTP (10mM) 1µl RNase OUT 0,5µl Reverse Transkriptase 0,5µl DTT 2µl H20 5µl

preparation of the RNA samples: mix 4µl RNA + 1µl (10pmol) Primer + 2µl H2O (control: one sample without template) incubate these 7µl samples 1min at 65°C, then put them directly on ice

add 13µl reaction-mix to each sample, incubate 1h at 42°C

→ Detektion von GFP und lacZ Sequenzen mittels PCR an RNA, cDNA und DNA

prepare PCR-reaction-mix for all samples (additional: one plasmid control to check the PCR and to check for DNA content in the RNA: Instead of cDNA use 0,5µl RNA as Template in the PCR): for one sample=50µl: sample (cDNA or DNA or RNA or H20) in 10µl 10x Buffer 5µl dNTP (10mM) 1µl Primer 1 (10pmol/µl) 1µl Primer 2 (10pmol/µl) 1µl Taq-Polymerase 0,5µl H20 31,5µl

program: 1. 4min 95°C 2. 40sec 95°C 3. 40sec 58°C (Temp depends on the Primer)

4. 1min 72°C (Time depends on expected product length: 1 min / kb) 5. 10min 72°C 6. hold at 4°C

30 repeats from step 2 to 4

Analyse samples on agarose gels.

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HT

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Experiment 6:

GRUNDLAGEN DER ELEKTRONENMIKROSKOPIE

Das Auflösungsvermögen eines optischen Gerätes ist definiert als der Abstand

zweier Punkte, die man gerade noch getrennt wahrnehmen kann. Das theoretische

Auflösungsvermögen des Lichtmikroskopes ist im Wesentlichen bestimmt durch die

Wellenlänge des sichtbaren Lichtes und eine Eigenschaft des Objektives, die

numerische Apertur (NA). Die numerische Apertur ist ein Maß für den Öffnungswinkel

des Objektives. Ernst Abbe fand 1873 die Formel für das Auflösungsvermögen d als

d= 0.61 /NA. Nach der Theorie von de Broglie (Dualismus Welle-Teilchen) kann

man Elektronen als elektromagnetische Wellen betrachten. Die Wellenlänge ist

dann umgekehrt proportional zur Geschwindigkeit des Elektrons. Das theoretische

Auflösungsvermögen des Elektronenmikroskopes berechnet sich danach zu 0,23 nm,

also ca. 1000 mal besser als das des Lichtmikroskopes. In der Praxis der

biologischen Elektronenmikroskopie ist allerdings meistens die Präparation

auflösungsbegrenzend.

Der Aufbau des Elektronenmikroskops entspricht grundsätzlich dem des

Lichtmikroskopes. Beide besitzen zunächst eine Strahlquelle: Der Glühlampe beim

Lichtmikroskop emtspricht beim Elektronenmikroskop eine Kathode, aus der bei

Stromdurchfluß durch Erhitzen Elektronen austreten. Diese werden auf eine auf

Hochspannung gebrachte Anode hin beschleunigt. Die Elektronen treten gebündelt

durch ein Loch in der Kathode und bilden den eigentlichen Strahl. Die Licht- bzw.

Elektronenstrahlen werden durch Kondensorlinsen auf das Präparat gebündelt; die

eigentliche Vergrößerungslinse ist das Objektiv, es entwirft ein Zwischenbild. Dieses

wird entweder - beim Lichtmikroskop - mit dem Okular betrachtet, oder - beim

Elektronenmikroskop - von einem "Projektiv" auf einen fluoreszierenden

Leuchtschirm projiziert. Der Fluoreszenzschirm ist nötig, da das Auge keine

Elektronen wahrnehmen kann, er wandelt die Elektronen in sichtbares Licht um. Da

Elektronen durch Zusammenstoß mit den Molekülen der Luft abgelenkt, gebremst

und adsorbiert würden, herrscht im Elektronenmikroskop Vakuum.

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Der geometrische Strahlengang im Elektronenmikroskop ist dem im Lichtmikroskop

also prinzipiell gleich. Anstelle von Glaslinsen, die durch ihre

Lichtbrechungseigenschaften Lichtstrahlen ablenken, werden jedoch Magnetlinsen

verwendet, die die negativ geladenen Elektronen des Elektronenstrahls durch

elektromagnetische Felder ablenken. Die Brechungsgesetze gelten für

Elektronenlinsen genauso wie für Glaslinsen.

Abb. 1: Schema Lichtmikroskop vs. Elektronenmikroskop

Um biologische Objekte im Lichtmikroskop sichtbar zu machen, muß man sie in der

Regel mit Farbstoffen einfärben. Farbstoffe sind chemische Substanzen, die Licht

bestimmter Wellenlängen absorbieren, andere Wellenlängen hingegen ungehindert

durchlassen. Je nach der Natur des Farbstoffes lagert er sich spezifisch an

bestimmte Zell- oder Organstrukturen an. Im Elektronenmikroskop verfährt man ganz

ähnlich: Das biologische Material besteht im wesentlichen aus den Elementen

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Wasserstoff, Sauerstoff und Kohlenstoff sowie Stickstoff und Phosphor. Das sind

alles Elemente mit niedriger Ordungszahl im Periodensystem der Elemente (niedriger

Kernladungszahl). Da Elektronen vorwiegend mit den Atomkernen wechselwirken,

werden sie von Elementen mit hoher Kernladungszahl (z.B. Schwermetallen)

wesentlich stärker gestreut bzw. absorbiert, als von Elementen mit niedriger

Ordnungszahl. Aus diesem Grunde imprägniert man die Präparate mit

Schwermetallsalzen (z. B. Bleicitrat und Uranylacetat) um genügend Kontrast für die

Beobachtung im Elektronenmikroskop zu erzeugen (man spricht folgerichtig nicht von

"färben", sondern von "kontrastieren").

Während die Farbstoffe für die Lichtmikroskopie bestimmte Wellenlängen

absorbieren, entsteht im Elektronenmikroskop das Bild also durch Streuung der

Elektronen an den Schwermetallatomen. In großem Winkel abgelenkte Elektronen

Abb. 2: Ablenkung der Strahlelektronen in Abhängigkeit von der Kernladungszahl im Präparat und der Hochspannung des Elektronenmikroskopes.

werden durch eine Blende, die „Kontrastblende“, von der Bildentstehung

ausgeschlossen. Präparatstellen, die Schwermetallsalze eingelagert haben

erscheinen im Bild also dunkel. Die Energie, die die Elektronen bei Absorption und

Ablenkung auf das Präparat übertragen wird als Wärme frei, sie kann das Präparat

schnell beschädigen und verändern.

Die für die Praxis wichtigsten Unterschiede zwischen dem Licht- und dem

Elektronenmikroskop bestehen also darin, dass 1. im Elektronenmikroskop Vakuum

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herrscht, 2. anstelle von Lichtstrahlen, welche durch Glaslinsen abgelenkt werden,

Elektronenstrahlen verwendet werden, die durch Magnetlinsen abgelenkt werden..

DDaarraauuss eerrggiibbtt ssiicchh,, wwiiee eeiinn ggeeeeiiggnneetteess PPrrääppaarraatt ffüürr ddaass EElleekkttrroonneennmmiikkrroosskkoopp

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sseeiinn,, uunndd eess mmuußß ggeennüüggeenndd „„kkoonnttrraassttrreeiicchh““ sseeiinn –– aallssoo EElleemmeennttee hhoohheerr

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eerrzziieelleenn.. EEiinnee KKoonnttrraassttiieerruunngg dduurrcchh cchheemmiisscchhee KKoonnttrraassttiieerruunnggssmmiitttteell iisstt ddaannnn nniicchhtt

mmeehhrr zzwwiinnggeenndd nnoottwweennddiigg..

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PRAKTISCHER TEIL

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eeiinn ffrriisscchh bbeegglliimmmmtteess GGrriidd iinn PPiinnzzeettttee eeiinnssppaannnneenn eeiinneenn TTrrooppffeenn VViirruussssuussppeennssiioonn aauuff ddaass GGrriidd aauuffbbrriinnggeenn VViirruussppaarrttiikkeell 22 MMiinnuutteenn aaddhhäärriieerreenn llaasssseenn nnaacchh ddeerr AAddhhäässiioonnsszzeeiitt 22 mmaall nnaacchheeiinnaannddeerr kkuurrzz mmiitt AAqquuaa--ddeesstt.. wwaasscchheenn üübbeerrsscchhüüssssiiggee FFllüüssssiiggkkeeiitt aann eeiinneemm FFiilltteerrppaappiieerr aabbfflliieeßßeenn llaasssseenn ((VVoorrssiicchhtt!!

nniicchhtt ttrroocckkeenn ssaauuggeenn)) eeiinneenn TTrrooppffeenn 22%% UUrraannyyllaacceettaatt mmiitt PPaasstteeuurrppiippeettttee aauuffppiippeettttiieerreenn nnaacchh 1100 SSeekkuunnddeenn aann eeiinneemm FFiilltteerrppaappiieerrssttrreeiiffeenn ddaass KKoonnttrraassttmmiitttteell vvoollllssttäännddiigg

aabbfflliieeßßeenn llaasssseenn ((FFllüüssssiiggkkeeiittssffiillmm ddaarrff nniicchhtt aabbrreeiißßeenn,, dd..hh.. ddeerr KKoonnttaakktt zzuumm FFiilltteerrppaappiieerr mmuussss ssoollaannggee ggeehhaalltteenn wweerrddeenn,, bbiiss ddiiee FFllüüssssiiggkkeeiitt vvoollllssttäännddiigg aabbggeezzooggeenn iisstt !!))

SScchhrrääggbbeeddaammppffuunngg FFüürr eeiinnee SScchhrrääggbbeeddaammppffuunngg ddeerr OObbjjeekkttee wwiirrdd iinn eeiinneerr BBeeddaammppffuunnggssaannllaaggee iimm VVaakkuuuumm eeiinnee MMiisscchhuunngg aauuss KKoohhllee uunndd PPllaattiinn aallss sseehhrr ffeeiinneess KKoorrnn uunntteerr eeiinneemm sscchhrrääggeenn WWiinnkkeell aauuff ddaass PPrrääppaarraatt ggeeddaammppfftt ((„„EElleekkttrroonneennssttrraahhllvveerrddaammppffuunngg““)).. DDiiee OObbjjeekkttee eerrsscchheeiinneenn ddaannnn ppllaassttiisscchh,, ddaa ssiicchh MMeettaallll vvoorr ddeenn SSttrruukkttuurreenn aannllaaggeerrtt,, ddaahhiinntteerr jjeeddoocchh eeiinn mmeettaallllffrreeiieerr BBeeddaammppffuunnggss--„„SScchhaatttteenn““,, lliieeggtt.. DDuurrcchhffüühhrruunngg::

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RReezziippiieenntteenn eeiinnbbrriinnggeenn,, EEvvaakkuuiieerreenn,, VVaakkuuuumm << 55xx1100--66,, VVeerrddaammppffeerrkkooppff aauussrriicchhtteenn,, BBeeddaammppffuunnggsswwiinnkkeell eeiinnsstteelllleenn,,

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ggeebbeenn GGrriidd ddaarraauuff ppllaattzziieerreenn,, SScchhnniittttee nnaacchh uunntteenn,, IInnkkuubbaattiioonn 77 MMiinnuutteenn iimm DDuunnkkeellnn 55 xx iinn aaqq.. BBiiddeesstt.. wwaasscchheenn GGrriiddss aauuff 00,,22%% BBlleeiicciittrraatt iinn aaqq.. bbiiddeesstt.. lleeggeenn,, 22 MMiinnuutteenn IInnkkuubbaattiioonn 55 xx iinn aaqq.. BBiiddeesstt.. WWaasscchheenn,, aannsscchhlliieeßßeenndd üübbeerrffllüüssssiiggeess WWaasssseerr mmiitt

FFiilltteerrppaappiieerr aabbssaauuggeenn..

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HINWEISE ZUM PRAKTIKUM

Zeitplan: Vormittags:

Kurze theoretische Einführung Vorbereitungen (Herstellung der Präparateträger, Beglimmung) Negativkontrastierung Einweisung am Mikroskop, Mikroskopieren und Fotografieren Vorbereiten der Schrägbedampfung (Vakuum)

Nachmittags:

Schrägbedampfung Demonstration einer Einbettung und der Herstellung von Ultradünnschnitten Mikroskopieren und Fotografieren verschiedener Präparate

Mittagspause je nach Bedarf zwischen 12 und 14 Uhr Aufgabenstellung für die praktische Arbeit:

Wie groß sind die verschiedenen Viruspartikel, welche Details erkennt man im Elektronenmikroskop?

Welchen Einfluss hat das Kontrastierungsmittel auf die Darstellung der Präparate?

Wie äußern sich Strahlenschäden an den Präparaten? Welches Kontrastierungsmittel ist stabil, welches weniger?

Welche Strukturdetails sind besonders gut darstellbar mit Negativkontrastierung, welche mit Schrägdedampfung, welche in Ultradünnschnitten?

Welche Zellorganelle erkennt man in Ultradünnschnitten? Welchen Einfluss hat die Größe der Aperturblende auf das Bild? Welchen Einfluss hat die Hochspannung auf das Bild? Was ist Astigmatismus? Wieso kommt es zur Bilddrehung beim Vergrößerungswechsel? Wie verändert sich das Bild, wenn sehr helle oder sehr dunkle Strukturen

vorhanden sind (automat. Kontrastausgleich)? Was ist „förderliche Vergrößerung“?

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Praktikum Biochemie II - biochem.uni-frankfurt.de · Praktikum Biochemie II WS 2010/2011 3-wöchiges Praktikum im Hauptstudium der Biochemie Paul-Ehrlich-Institut Paul-Ehrlich-Str