kurstag 7 - kalbacher.uni-tuebingen.de · Kurstag 7: Komplexometrie und Chromatographie Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität

Kurstag 7

Komplexometrie und Chromatografie

Stichworte zur Vorbereitung

Aufbau von Metallkomplexen, Chelatkomplexe, Ligandenaustauschreaktionen,

Stabilität von Metallkomplexen (wovon hängt die Stabilität der Komplexe ab?),

Chromatographiearten (kurz), Prinzipien der Dünnschichtchromatographie

Ziel des Versuchstags

Das Kennen lernen zweier wichtiger komplexbildender Metalle Magnesium und

Calcium ist das Hauptziel des Versuchstages. Des Weiteren soll der Blattfarbstoff

Chlorophyll, der Mg2+-Ionen enthält, erst isoliert und dann mit Hilfe der

Dünnschichtchromatographie in seine Bestandteil aufgetrennt werden.

Kurstag 7: Komplexometrie und Chromatographie

Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen

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Theorie

Die hohe Stabilität von Metall-Chelatkomplexen mit organischen mehrzähnigen

Liganden kann man dazu nutzen, diese Metallionen quantitativ zu bestimmen. Diese

Methode nennt man komplexometrische Bestimmung. Der wichtigste organische

Komplexbildner in dieser Beziehung ist Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA):

Sie entsteht, indem man im Ethylendiamin NH2-CH2-CH2-NH2 die vier H am Stickstoff

durch Essigsäure ersetzt. Sie wird wie oben abgekürzt, besitzt aber auch eine Reihe

von Trivialnamen wie z.B.: Komplexon oder Titriplex.

Komplexon ist eine kristalline, farblose Verbindung (Di-Na+-Salz, Tetra-Na+-Salz). In

alkalischer Lösung liegt das Molekül, wie oben gezeigt, als vierfaches Anion vor.

Dann besitzt es sechs freie Elektronenpaare, die koordinative Bindungen zu den

entsprechenden Metallionen ausbilden können. Durch die geeignete Wahl des pH

lässt sich erreichen, dass nur zwei der Carboxylgruppen als Carboxylatanionen

vorliegen, so dass nur vier koordinative Bindungen ausgebildet werden können.

Komplexon hat also wie Glycin (siehe Kurstag 7) zwei verschiedene funktionelle

Gruppen, die als Liganden fungieren:

1. das Amin und

2. das Carboxylat-Anion

Komplexon bildet mit fast allen Metallionen sehr stabile Chelatkomplexe im

Verhältnis 1:1, wobei 1 Mol Komplexon vier oder sechs koordinative Bindungen mit

dem gleichen Metallion ausbildet.

Für ein Kation Men+ mit der Koordinationszahl sechs ergibt sich folgender Komplex:



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Mit einer Komplexonlösung bekannter Konzentration kann durch komplexometrische

Titration der Metallionen-Gehalt von Lösungen bestimmt werden. Wenn man davon

ausgeht, dass ein Mol Komplexon mit einem Mol Metallionen reagiert, kann man aus

der verbrauchten Menge der Komplexonlösung die Menge der Metallionen

berechnen.

Dies setzt allerdings voraus, dass man eine Möglichkeit hat, das quantitative

Verschwinden von freien Metallionen aus der Lösung zu erkennen. Dazu verwendet

man Metallindikatoren. Dies sind mehrzähnige, gefärbte organische Liganden, die

mit den Metallionen ebenfalls einen Chelatkomplex bilden. Um als Indikator bei einer

komplexometrischen Titration fungieren zu können, muss dieser organische Farbstoff

einige Bedingungen erfüllen:

1. Der Farbstoff muss mit dem Metallion einen Komplex bilden.

2. Der Metall-Farbstoffkomplex muss eine andere Farbe haben als der freie

Farbstoff.

3. Der Metall-Farbstoff-Komplex muss wesentlich instabiler sein als der Metall-

Komplexon-Komplex.

Dies soll anhand der Titration von Mg2+-Ionen mit Komplexon unter Verwendung von

Erichromschwarz T als Indikator verdeutlicht werden, der obige Bedingungen erfüllt:

1. Eriochromschwarz T bildet zu Mg2+ drei koordinative Bindungen aus, die vierte

Bindungsstelle wird von einem Wassermolekül besetzt.

Abb.: ErioT



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2. Der freie Farbstoff Eriochromschwarz T ist in verdünnter Lösung blau gefärbt.

Er bildet mit Mg2+-Ionen einen roten Komplex.

3. Der Mg2+-Eriochromschwarz T-Komplex ist instabiler als der Mg2+-Komplexon-

Komplex, welcher bevorzugt gebildet wird.

Bei der Titration von Mg2+- Eriochromschwarz T-Lösung mit Komplexon laufen

folgende Reaktionen ab:

Vor der Titration liegen viele Mg2+-Ionen frei vor, während einige als Mg2+-

Eriochromschwarz T-Komplex vorliegen und die Lösung dadurch rot färben.

Nun versetzt man langsam mit Komplexonlösung, wobei zunächst die freien Mg2+-

Ionen zum Mg2+-Komplexon-Komplex reagieren. D.h. der Mg2+- Eriochromschwarz T-

Komplex bleibt zunächst erhalten und die Lösung bleibt rot.

Kurz vor dem Äquivalenzpunkt ist quasi kein freies Mg2+ mehr vorhanden. Wird

weiterhin Komplexlösung hinzugetropft, so konkurrieren nun Komplexon und

Eriochromschwarz T um die Mg2+-Ionen. Da der Mg2+-Komplexon-Komplex stabiler

ist als der Mg2+- Eriochromschwarz T-Komplex, wird er bevorzugt gebildet und

entzieht dem Eriochromschwarz T die Mg2+-Ionen. Eriochromschwarz T liegt nun in

freier Form vor und färbt die Lösung blau.

Auf diese Art und Weise lassen sich die meisten Metallionen quantitativ bestimmen,

wobei man für jedes Metallion einen spezifischen Indikator benötigt.

Zugabe von EDTA, Komplexierung aller davor von Erio T gebundenen Mg2+-Ionen

Zugabe von EDTA, Komplexierung aller freien Mg2+-Ionen

Lösung mit freien und von ErioT gebundenen Mg2+-Ionen

Lösung mit von EDTA -oder ErioT-gebundenen Mg2+-Ionen

Lösung von EDTA -gebundenen Mg2+-Ionen



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Komplexometrische Ca2+-Bestimmung im Serum

Ca2+-Ionen werden mit Komplexon analog in Gegenwart eines Mischindikators

(Eriochromblau SE und Naphtholgrün B) bei alkalischem pH-Wert titriert. Unter

diesen Bedingungen stören Mg2+-Ionen nicht.

Der freie Mischindikator ist blau, der Ca2+-Indikator-Komplex rot.

Wegen der sehr niedrigen Ca2+-Konzentration ändert sich die Farbe nicht schlagartig,

es tritt zunächst eine Mischfarbe auf. Um den Äquivalenzpunkt einigermaßen genau

zu erreichen, titriert man eine der drei Proben absichtlich über. Der dabei erzielte

Blauton sollte bei den anderen genaueren Titrationen erreicht werden.

Der Normalwert im Humanserum schwankt zwischen 9-11 mg Ca2+ in 100 ml Serum.

Erniedrigte Ca2+-Spiegel findet man hauptsächlich bei der Tetanie (Unterfunktion der

Nebenschilddrüse, sie produziert zu wenig oder kein Parathormon mehr. Als

Parathormonersatzt dient ein Vitamin D-Derivat: Dihydrotachysterin = AT10), aber

auch bei Niereninsuffizienz, Resorptionsstörungen, kindlicher Rachitis in der

Heilphase und Hypoproteinämie.

Erhöhte Ca2+-Spiegel findet man bei AT10 – Überdosierung oder primärem

Hyperparathyreoidismus, Vitamin D-Überdosierung, Hyperproteinämie,

Hyperphophatasie und Knochentumoren.

Chromatographie

Als Chromatographie bezeichnet man eine Methode zur Trennung von chemischen

Verbindungen. Die Trennung in einzelne Komponenten kann dabei durch

unterschiedliche Ladung (Ionenaustauschchromatographie), unterschiedliche Größe

und Form (Gelchromatographie) und unterschiedliche starke Bindung an geeignete

Materialien (SiO2, Cellulose, Al2O3, Adsorptionschromatographie:

Dünnschichtchromatographie oder Gaschromatographie) erfolgen.

Die Ionenaustauschchromatographie und Gelchromatographie verwendet man

bevorzugt zur präparativen Trennung in Säulen: man füllt das Trennmaterial

(Ionenaustauscher, Gel) in eine Säule, trägt das zu trennende Gemisch auf und

wäscht dann mit einem geeigneten Laufmittel (siehe auch Kurstag 4).

Die Adsorptionschromatographie wird vor allem zu analytischen Zwecken verwendet

und auf dünnen, fest haftenden Schichten durchgeführt (SiO2 oder Cellulose auf

Alufolie).



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Dünnschichtchromatographie

Die Möglichkeit, Stoffe dünnschichtchromatographisch zu trennen, beruht auf einer

geschickten Ausnutzung geringer Löslichkeitsunterschiede der zu trennenden

Substanzen in einem aus zwei Phasen bestehenden Lösemittelgemisch.

Üblicherweise setzt sich das Gemisch aus einem polaren Lösemittel und einem

apolaren Lösemittel, das im Überschuss vorliegt, zusammen. In dieses Gemisch wird

die Dünnschichtplatte gestellt und die Lösemittel werden auf dieser durch

Kapillarkräfte nach oben gesaugt. Das polare Lösemittel (im Praktikum Methanol)

wird aber von der Oberfläche der Dünnschichtplatte, also der Zellulose oder dem

SiO2, auf Grund von Wasserstoffbrücken zurückgehalten und fließt damit langsamer

nach oben als das apolare Lösemittel. Aufgrund dieses Verhaltens wird die

langsamer fließende Phase (Methanol) als stationäre, die schneller fließende als

mobile Phase bezeichnet.

Ein Stoff läuft umso langsamer, je stärker er mit der stationären Phase in

Wechselwirkung treten kann bzw. je besser seine Löslichkeit in dieser ist. Stoffe, die

sich gut in der mobilen Phase lösen, wandern folglich schneller.

Meist sind die Löslichkeitsunterschiede der zu trennenden Verbindungen im

Substanzgemisch nur relativ klein. Da sich aber der Trennprozess in jeden ∆s der

Laufstrecke abspielt, ergibt sich ein Multiplikationsprozess, der die Trennung

vervielfacht: der stärker wasserlösliche Stoff A (hydrophiler) bleibt zurück, der in der

mobilen Phase besser lösliche Stoff B (hydrophober) läuft weiter. Das Laufmittel

selbst läuft beiden voran.

Die zurückgelegte Strecke der einzelnen Stoffe bezogen auf die des Laufmittels

(Laufmittelfront) ist also ein Maß für die Löslichkeitseigenschaften der Stoffe. Bildet

man daher das Verhältnis der von einem Stoff zurückgelegten Strecke zu der von der

Laufmittelfront zurückgelegten Strecke, so ist dieses Verhältnis bei konstanten

Bedingungen (gleiches Laufmittel, Trennschicht, Temperatur) konstant,

reproduzierbar und für den betreffenden Stoff charakteristisch. Man bezeichnet es

als Rf-Wert (Retensionsfaktor).

Substanz

f

Laufmittel

lR =

l

Für niedermolekulare, leicht flüchtige Substanzen eignet sich die

Dünnschichtchromatographie nicht. Diese Gemische lassen sich mit Hilfe von

Gaschromatographie auftrennen, wobei das Trennprinzip das gleiche wie bei der



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Dünnschichtchromatographie ist. Als stationäre Phase fungiert ein fein gepulvertes

inertes Material, das sich in einer langen, sehr dünnen Säule befindet und mit einem

hochsiedenden Öl belegt ist. Als mobile Phase verwendet man ein inertes Gas (He,

Ar). Der Trenneffekt beruht auf Löslichkeitsunterschieden der Komponenten des zu

trennenden Gemisches im Öl des Säulenmaterials.

Nachweis von Mg2+-Ionen aus Chlorophyll

Chlorophyll, der grüne Blattfarbstoff, ist ein Tetrapyrrol-Magnesium-Komplex, der

maßgeblich an der Umwandlung von Lichtenergie in chemisch gespeicherte Energie

in der Photosynthese beteiligt ist. Mg2+-Ionen haben dabei neben der Stabilisierung

das Tetrapyrrolgerüstes eine beschleunigende Funktion bei der Energieübertragung.

Durch Protonen wird Mg2+ über das Säure-Base-Gleichgewicht des Liganden aus

dem Komplex verdrängt und lässt sich als freies Mg2+ mit Hilfe von Titangelb

nachweisen, das mit Mg2+ einen roten Komplex bildet.

Trennung der Blattfarbstoffe von Spinat durch Dünnschichtchromatographie

Spinatblätter enthalten im Wesentlichen 4 Farbstoffe: Chlorophyll a (R=-CH3,

blaugrün), Chlorophyll b (R = -CHO, gelbgrün), β-Carotin (gelb) und verschiedene

Xanthophylle (Sauerstoffhaltige Cartinoide, gelb). Im verwendeten Laufmittel

Hexan/Methanol läuft β-Carotin mit der Laufmittelfront, gefolgt von Chlorophyll a,

einem Xanthopyll nicht bekannter Struktur, Chlorophyll b und verschiedenen

Xanthophyllen.

Man beachte die gute Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b, die sich nur

dadurch unterscheiden, dass in einem hochkomplizierten Molekül eine Methylgruppe

durch eine Aldehydgruppe ersetzt ist. Die erhöhte Methanollöslichkeit der

Aldehydgruppe gegenüber der Methylgruppe ist für den Trenneffekt verantwortlich.



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Neue Geräte und Methoden

Dünnschichtchromatographie

Auf die ausliegenden DC-Platten wird ca. 2cm über dem Rand mit einem Bleistift

eine feine Linie gezogen ohne das Material zu zerkratzen.

Das zu trennende Gemisch wird an der Startstelle (Punkt auf der Linie) als Lösung in

Wasser oder Methanol aufgetragen. Hierbei ist darauf zu achten, dass die Lösung

möglichst konzentriert auf einem Punkt aufgetragen wird.

Dann wird die „Dünnschichtplatte“ in ein Gefäß gestellt, das am Boden ca. 1 cm des

Laufmittelgemisches enthält. Bis das Laufmittel beinahe die komplette Strecke

zurückgelegt hat, vergehen 15-60 Min (abhängig von der Trennschicht und vom

Laufmittelgemisch).

Sind die zu trennenden Substanzen gefärbt, lässt sich die Trennung direkt mit dem

Auge verfolgen. Sind sie nicht gefärbt, dann muss das Chromatogramm danach

getrocknet und mit geeigneten Reagenzien besprüht werden, die mit den zu

trennenden Substanzen eine gefärbte Verbindung eingehen (siehe auch Kurstag 12:

Trennung von Aminosäuren).



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Vorfragen

1. Beschreiben Sie analog zur Mg2+-Bestimmung die Vorgänge während einer

komplexometrischen Bestimmung von Ca2+-Ionen.

2. Worauf beruht die Auftrennung eines Substanzgemisches bei der

Dünnschichtchromatographie. Beschreiben Sie mit eigenen Worten.

3. Warum ist Komplexon im Vergleich zu Eriochromschwarz T der bessere

Komplexbildner?



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Durchführung

1. Aufgabe: Komplexometrische Bestimmung von Mg2+ Ionen

Man pipettiert in einen Erlenmeyer 10 ml der ausstehenden MgSO4-Lösung mit

einem Gehalt von 0,5 mg Mg2+ pro ml. Zu dieser Lösung gibt man 2 ml Pufferlösung

(NH3/NH4+, pH 10) und einige Tropfen Indikatorlösung (Eriochromschwarz T). Hierbei

nimmt die Lösung eine rote Farbe an: Farbe des Komplexes aus Mg2+ und

Erichromschwarz T. Man titriert nun diese Lösung mit der ausstehenden 0,02 M

Komplexonlösung bis zum Farbumschlag nach blau: Eigenfarbe von

Eriochromschwarz T. Aus dem Verbrauch an 0,02 M Komplexonlösung berechnet

man die vorgelegte Menge an Mg2+-Ionen.

Der berechnete Wert sollte auf ca. 1% mit dem theoretischen Wert übereinstimmen.

2. Aufgabe: Komplexometrische Bestimmung von Mg2+-Ionen

Man holt sich an der Ausgabe in einem Reagenzglas die Mg2+-Analyse, gießt diese

in einen Erlenmeyer um und spült gut nach. Dann versetzt man diese Lösung wie

oben mit 2 ml Pufferlösung (NH3/NH4+, pH 10) und einigen Tropfen Indikatorlösung

(Eriochromschwarz T) und titriert wie in Aufgabe 1 mit 0,02 M Komplexon-Lösung bis

zum Farbumschlag nach blau. Aus der verbrauchten Menge an 0,02 M Komplexon-

Lösung berechnet man die in der Analyse enthaltene Menge an Mg2+-Ionen.

3. Aufgabe: Komplexometrische Bestimmung von Ca2+-Ionen im Serum

In 3 Weithals-Erlenmeyer gibt man je 40 ml 1 % NaOH, 5 Tropfen

Mischindikatorlösung (→ Blaufärbung) und genau 4 ml Serum (→ Farbumschlag

nach rotviolett).

Man stellt sich 100ml 0,001M Komplexonlösung aus der ausstehenden 0,02 M

Lösung durch Verdünnen im Verhältnis 1:20 her. Aus der Bürette lässt man in den

ersten Erlenmeyer einen Überschuss (ca. 15ml) von 0,001 M Komplexonlösung

einfließen. Der dabei erzielte Blauton soll bei den anschließenden genauen

Titrationen am Endpunkt erzielt werden. Das verbrauchte Volumen (in ml) an 0,001

M Komplexonlösung gibt direkt den Ca2+-Gehalt von 100 ml Serum in mg an

(Normalwert ca. 10 mg Ca2+ /100 ml Serum).



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4. Aufgabe: Nachweis von Mg2+-Ionen mit Titangelb

2 ml der ausstehenden MgSO4-Lösung mit einem Gehalt von 0,5mg Mg2+ pro 100ml

werden in ein Reagenzglas pipettiert. Zu dieser Lösung gibt man 2ml 2M NaOH,

anschließend einige Tropfen 0,05%ige Titangelblösung und schüttelt gut durch.

Dieser Nachweis ist sehr spezifisch.

Was beobachten Sie?

5. Aufgabe: Nachweis von Mg2+-Ionen in Chlorophyll (Efeu, Brennnesseln)

Die Extraktion von Mg2+-Ionen aus Chlorophyll wird 2 x pro Tisch durchgeführt, den

Mg2+- Nachweis führt jede Gruppe durch.

Ca. 10 g Efeu- oder Brennnesselblätter werden mit 20ml 2M HCl in einem 100ml

Erlenmeyer einmal kurz aufgekocht (Dreifuß, Drahtnetz, Bunsenbrenner). Um

Siedeverzüge zu vermeiden, schüttelt man öfters oder rührt mit dem Glasstab. Nach

dem Aufkochen neutralisiert man durch Zugabe von 20ml 2M NaOH und filtriert die

abgekühlte Suspension über einen Faltenfilter in einen 100ml Erlenmeyer. Man füllt

2ml dieser Lösung in ein Reagenzglas, gibt 2ml 2M NaOH und 0,5ml 0,05 %ige

Titangelblösung zu und schüttelt gut durch.

Was beobachten Sie?

6. Aufgabe: Trennung der Blattfarbstoffe von Brennnessel- bzw. Efeublättern durch

Dünnschichtchromatographie an Kieselgel

Extraktion der Farbstoffe:

1g frische Efeu- oder Brennnesselblätter werden möglichst fein zerkleinert, in einem

Reagenzglas mit 5 ml Methanol versetzt und mit dem Glasstab gut durchgerührt.

Wenn die Efeu- oder Brennnesselblätter nur noch schwach gelb gefärbt sind und die

Lösung eine intensiv grüne Farbe angenommen hat, wird sie zur Chromatographie

verwendet. Da die Extraktion relativ lange dauert, wird auch bereits vorgefertigter

Extrakt + ß-Carotin ausgestellt.

Chromatographie:

Auf eine der ausliegenden Chromatographieplatten wird obiger Extrakt mit Hilfe einer

Kapillare in zwei verschiedenen Konzentrationen aufgetragen.

Anschließend wird in einem 250 ml Becherglas das Laufmittel zugegeben

(Petrolether / Isopropanol im Verhältnis 20 : 2 mischen und 1 Tropfen Wasser



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zugeben); steht im Abzug. Die Höhe des Laufmittels soll nicht mehr als 1cm betragen

und auf jeden Fall unter der Auftragsstelle im DC liegen. Dann wird das

Chromatogramm in das Becherglas gestellt und das Becherglas mit Alufolie bedeckt.

Das Laufmittel wandert in ca. 15 Minuten über das Chromatogramm und nimmt die

verschieden Farbstoffe verschieden weit mit. Da die zu trennenden Verbindungen

gefärbt sind, lässt sich die Trennung direkt verfolgen.

Die Extraktion der Farbstoffe wird 2x pro Tisch durchgeführt, die chromatographische

Trennung 1 x pro Gruppe.

Das Ergebnis könnte folgendermaßen aussehen:

Entsorgung:

Die verwendeten Lösungen sind in den verwendeten Mengen nicht umweltbelastend

und können dem Abwasser beigegeben werden.

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