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BIOCHEMISCHES

PRAKTIKUM

für Toxikologen

Fassung vom Februar 2012

Universität Kaiserslautern

Fachbereich Chemie

Prof. Dr. W. E. Trommer

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Inhaltsverzeichnis

Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Toxikologen zum WS 2011/12 .............................. 3

Bestimmung der katalytischen Konstanten und der Michaelis-Konstanten von

Chymotrypsin für N-Succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanin-4-nitroanilid (Suc-AAPF-

pNA) ............................................................................................................................. 4

Disk-Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) ............................................. 12

Enzymatische Bestimmung von ADP (Adenosindiphosphat) ........................................ 20

Quantitative Proteinbestimmungsmethoden .................................................................... 24

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) .............................................................. 30

Gezielte Mutagenese ...................................................................................................... 40

3

Zeitplan zum Biochemie-Praktikum für Toxikologen zum WS 2011/12

Datum Zeit Raum Versuche Betreuer

Di., 7.2.12 9:30 570A Quantitat. Proteinbestimmung Lucas Weishaupt

Mi., 8.2.12 9:30 568A Chymotrypsin-Kinetik Tom Seibel

Do., 9.2.12 13:00 568A ADP-Bestimmung Alexander Cartus

Fr., 10.2.12 8:00-12:30 572A Disk-Elektrophorese Mohammed Chakour

Mo., 13.2.12 14:00 570A+B ELISA Christian Kopp

Di., 14.2.12 9:00

Mi., 15.2.12 9:00

Mutagenese Mohamed Badr Do., 16.2.12 9:00

Fr., 17.2.12 9:00

Versuchsauswertungen sind spätestens in der Woche nach dem Versuch abzugeben.

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Bestimmung der katalytischen Konstanten und der Michaelis-Konstanten von Chymotrypsin für

N-Succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanin-4-nitroanilid (Suc-AAPF-pNA)

Bestimmung der katalytischen Konstanten und der Michaelis-Konstanten von

Chymotrypsin für N-Succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanin-4-nitroanilid (Suc-AAPF-

pNA) ............................................................................................................................. 4

Graphische Bestimmung von KM und vmax ..................................................................... 6

Aufgabe ......................................................................................................................... 8

Herstellung der Lösungen .............................................................................................. 9

Testansatz ..................................................................................................................... 9

Auswertung .................................................................................................................. 10

Benötigte Angaben: ..................................................................................................... 10

Die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatisch katalysierten Reaktion hängt u. a. auch

von der Substratkonzentration ab. Bei der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (vmax) ist

das Enzym vollständig mit Substrat abgesättigt, während bei geringeren Substrat-

konzentrationen nicht alle Enzymmoleküle abgesättigt sind.

5

KM

[S]

v

vmax

vmax/2

Abb. 1

1923 lieferten Michaelis und Menten die mathematische Analyse dieses Verhaltens. Sie

nahmen folgenden Reaktionsverlauf an:

E + S k2

k1 ES

k4

k3 P + E

E = Enzym, S = Substrat, ES = Enzymsubstratkomplex, P = Produkt. [E] ist die

Gesamtkonzentration an Enzym, ([E] - [ES]) die Konzentration an freiem Enzym. Die

Menge an S, die an E gebunden wird, ist, bezogen auf die Gesamtmenge an S, sehr klein

und kann vernachlässigt werden. [S] entspricht dann zu Beginn der Messung der

eingesetzten Substratkonzentration, da noch kein P gebildet wurde. Aus demselben

Grund ist bei Messung der Anfangsgeschwindigkeit die Bildung von ES aus P + E mit der

Geschwindigkeitskonstante k4 vernachlässigbar.

Ist die Bildungsgeschwindigkeit von ES,

k1 · ([E] - [ES]) · [S],

gleich seiner Zerfallsgeschwindigkeit,

k2 · [ES] + k3 · [ES],

so besteht ein Fließgleichgewicht (stationärer Zustand, steady state). Gleichsetzen der

beiden Ausdrücke und Zusammenfassen der drei Geschwindigkeitskonstanten ergibt die

Michaeliskonstante

6

Kk k

kM

2 3E ES S

ES

1

(1)

Wenn k2 k3, kann k3 vernachlässigt werden, und KM k2/k1 = KD ist die Dissoziations-

konstante des Gleichgewichts E + S ES.

Eine Bestimmung von KM ist dann möglich, wenn [ES] bestimmt werden kann. Dies ist auf

direktem Weg sehr schwierig, aber die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional [ES]:

v = k3 · [ES] (2)

Aus Gleichung (1) wird [ES] errechnet:

ES

E S

SM

K

Dieser Wert wird in Gleichung (2) eingesetzt:

vk

K

3

M

E S

S

Wenn [S] so groß ist, dass die gesamte eingesetzte Enzymmenge als Enzymsubstrat-

komplex vorliegt ([E] = [ES]), ist die maximale Geschwindigkeit erreicht:

vmax = k3 · [E]

Daher:

vv

K

max

M

S

S

Dies ist die von Michaelis und Menten entwickelte Gleichung. Bei halbmaximaler

Geschwindigkeit wird KM = [S]. KM hat somit die Dimension einer Konzentration.

Graphische Bestimmung von KM und vmax

Die Michaelis-Menten-Gleichung kann in verschiedener Weise zur Bestimmung von vmax

und KM graphisch dargestellt werden:

a) v wird gegen [S] aufgetragen und ergibt eine Hyperbel. Für v = vmax/2 wird [S] = KM

(Abb. 1).

7

b) v wird gegen log([S]) aufgetragen; es resultiert eine S-förmige Kurve, die Ähnlichkeit mit

der Dissoziationskurve eines Elektrolyten hat. Der Wendepunkt dieser Kurve, der mit

Hilfe zweier paralleler Tangenten und deren Mittelparallelen bestimmt werden kann,

liegt beim Punkt (log(KM), vmax/2) (Abb. 2).

log([S])

.

.

.

log(KM)

v

vmax

vmax/2

Abb. 2

Die Verfahren a und b haben die Schwierigkeit, dass sehr hohe Substrat-

konzentrationen angewandt werden müssen, um vmax zu erhalten. Andererseits können

hohe Substratkonzentrationen zu einer Substrathemmung des Enzyms führen.

c) Das Verfahren von Lineweaver und Burk umgeht diese Schwierigkeit. Die Michaelis-

Menten-Gleichung wird folgendermaßen umgeformt:

1 1 1

v

K

v

K

v v

M

max

M

max max

S

S S

Diese Gleichung hat die allgemeine Form y = ax + b und stellt die Gleichung einer

Geraden dar. Es resultiert daher eine Gerade, wenn die experimentell gewonnenen

Daten in Form von 1/v gegen 1/[S] aufgetragen werden. Die Steigung m der Geraden

entspricht KM/vmax, der Ordinatenabschnitt 1/vmax und der Abszissenabschnitt –1/KM

(Abb. 3).

8

2/vmax

1/[S]–1/KM

m=KM/vmax

1/KM

1/v

1/vmax

Abb. 3

Aufgabe

Bestimmung der katalytischen Konstanten und der Michaelis-Konstanten für die

Chymotrypsin-katalysierte Hydrolyse von N-Succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanin-4-

nitroanilid (Suc-AAPF-pNA, Abb. 4)

O HN

HO

Ort der Hydrolyse

NO2

3O

O

NH O

NHN

O

O

NH

Abb. 4: Suc-AAPF-pNA

Bei der Bestimmung von KM ist zu beachten, dass in die Gleichung die Anfangssubstrat-

konzentration eingeht. Deshalb muss man möglichst rasch nach Zugabe des Enzyms

messen. Nachdem das Substrat einpipettiert ist, wird die Extinktion auf ca. 0,01

eingestellt. Dann wird das Enzym einpipettiert, der Küvetteninhalt gut gemischt und die

Extinktionsänderung (E) alle 20 sec über einen Zeitraum von 3 Minuten bestimmt. Die

Werte werden auf E/min umgerechnet. Die Messung wird für 7 Substratkonzentrationen

durchgeführt und jede Aktivitätsbestimmung doppelt unternommen.

Bei allen Messungen darf die Enzymkonzentration nicht verändert werden!

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Herstellung der Lösungen

Molmassen: Tris: 121,14 g/mol; CaCl2: 147,02 g/mol; Suc-AAPF-pNA: 624,6 g/mol

Verdünnungspuffer (100 mM Tris, 10 mM CaCl2):

1,21 g Tris

147 mg CaCl2

pH 7,8 mit HCl

ad 100 ml Wasser

Substratstammlösung (1 mM):

3,1 mg Suc-AAPF-pNA

ad 5 ml Verdünnungspuffer

Enzymlösung:

2 mg Chymotrypsin ad 1 ml Verdünnungspuffer c = 2 mg/ml;

hiervon 250 l ad 1 ml Verdünnungspuffer c = 0,5 mg/ml;

hiervon 10 l ad 2 ml Verdünnungspuffer c = 0,0025 mg/ml

Pipettierschema:

Für die Messung ist es zweckmäßig, mit stärkster Verdünnung zu beginnen.

Testansatz

0,5 ml der verschiedenen, oben hergestellten Substratverdünnungen

0,1 ml Enzymlösung (0,0025 mg/ml)

Verdünnungspuffer [ml]

1,98 1,96 1,94 1,90 1,80 1,70 1,50

Substratstammlösung [ml]

0,02 0,04 0,06 0,10 0,20 0,30 0,50

Substratkonz. [mM] nach Verdünnen

0,01 0,02 0,03 0,05 0,10 0,15 0,25

Substratkonz. [mM] nach Enzymzugabe

0,0083 0,0167 0,0250 0,0417 0,0833 0,1250 0,2083

10

Auswertung

1) Bestimmen Sie die Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten der jeweils vermessenen

Konzentrationen. Auftragung von E gegen die Zeit.

Ermitteln Sie graphisch die Anfangs-Steigung, indem Sie an den Anfang der

Messkurve eine Tangente anlegen.

(Die Messkurve ist eine Hyperbel, die entweder vom Computer an die Messdaten

gefittet oder von Hand näherungsweise eingezeichnet werden kann.)

2) Bestimmen Sie die spezifische Aktivität A für die vermessenen

Substratkonzentrationen nach:

3) Tragen Sie die spezifischen Aktivitäten gegen die Substratkonzentrationen auf

(Michaelis-Menten-Plot) und bestimmen Sie anhand des erhaltenen Graphen KM

und vmax.

4) Ermitteln Sie mit Hilfe der Auftragung nach Lineweaver-Burk ebenfalls KM und die

katalytische Konstante kcat.

Anhand der erhaltenen Geradengleichung lassen sich diese Konstanten

rechnerisch bestimmen.

5) Vergleichen Sie die von Ihnen ermittelten Werte von KM (aus graphischer und

rechnerischer Bestimmung)

6) Ergebnis und Fehlerdiskussion

Benötigte Angaben:

Das bei der Hydrolyse des Substrates freiwerdende 4-Nitroanilin wird in Abhängigkeit von

der Zeit bei 405 nm gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient bei dieser Wellenlänge

beträgt 9 600 l mol–1 cm–1.

Die spezifische Aktivität A U/ mgmol Substrat

min mg Enzym

errechnet sich nach:

AE V

t d m

106

11

t = Zeit [min]

V = Volumen des Testansatzes in der Küvette [l]

d = Schichtdicke [cm]

m = Enzymmenge in Küvette [mg]

Bei den Hydrolasen, zu denen auch Trypsin und Chymotrypsin gehören, verwendet man

häufig anstelle von vmax die katalytische Konstante kcat:

kcat [1/s] = v max [U/mg] · MG [g/mol] / 60 000

MG = Molekulargewicht des Enzyms (hier: 23 000 g/mol)

60 000: Umrechnungsfaktor von mmol auf mol und von min auf s

In ein Diagramm sind einzutragen:

a) v gegen [S] und

b) v–1 gegen [S]–1,

wobei [S] = jeweilige Substratkonzentration in der Küvette. Anzugeben sind: KM [M],

vmax [U/mg] und kcat [s–1].

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Disk-Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE)

Neben ihrer großen Bedeutung zur Reinheitskontrolle bei Proteinisolierungen ist die SDS-

Polyacrylamidgelelektrophorese (abgek.: SDS-PAGE) auch eine Methode zur

Molekulargewichtsabschätzung von Proteinen. Zur Trennung von Proteinen im Poly-

acrylamid-Gel wird hauptsächlich der Siebeffekt des Gels ausgenutzt. Um eine gute und

gleichsinnige Beweglichkeit der Proteinmoleküle im elektrischen Feld zu erreichen,

werden diese vor der Elektrophorese mit dem Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS)

beladen. Durch die Bindung von SDS werden Proteine zu Polyanionen, und das Protein

wird denaturiert. Da Proteine mit Disulfidbrücken in der SDS-PAGE häufig ein anomales

Verhalten zeigen, werden die Disulfidbrücken vor der Elektrophorese mit 2-Mercapto-

ethanol reduziert.

Die Vorinkubation der Proteine in SDS und 2-Mercaptoethanol schafft die Voraussetzung

für die Molekulargewichtsabschätzung im SDS-Gel, da jetzt die Beweglichkeit globulärer

Proteine bei gleicher Gelkonzentration (gleicher Porengröße) nur eine Funktion der Größe

des Moleküls ist.

Für die Molekulargewichtsbestimmung wird die relative Beweglichkeit von Proteinen mit

bekanntem Molekulargewicht in Bezug auf einen internen Standard (meist Bromphenol-

blau) verglichen und eine Eichkurve aufgestellt, indem der Logarithmus des Molekular-

gewichtes gegen den Rf-Wert (relative Beweglichkeit) aufgetragen wird. Aus dem Rf-Wert

des unbekannten Proteins kann somit dessen Molekulargewicht abgeschätzt werden.

Probleme: Die Beweglichkeit der Proteine im Polyacrylamid-Gel ist nicht allein von ihrem

Molekulargewicht abhängig, sondern zu einem erheblichen Teil auch von der jeweiligen

Form der denaturierten Eiweiße (globuläre Proteine wandern schneller als vollständig

entfaltete, lange Proteinfäden). Außerdem verändern bestimmte, natürlich vorkommende

Modifizierungen der Eiweiße, wie z. B. Glykosylierungen, deren Wanderungstendenz im

elektrischen Feld. Das SDS-Gel kann deshalb nur zur Abschätzung des Molekular-

gewichts dienen.

Das Trennmedium

Durch Kopolymerisation des monomeren Acrylsäureamids,

13

O

CCHCH2 NH2 ,

und eines quervernetzenden bifunktionellen Reagenzes, meist

N,N’-Methylenbisacrylsäureamid,

O

C CHCH CH2CH2 NH CH2 NH

O

C ,

wird ein dreidimensionales Netzwerk aufgebaut:

y. . .. . .

OC

CHCH2

NH2

OC

CHCH2

NH2

CH2

z

OC

CHCH2

NH2

w

. . .. . .

OC

CHCH2

NH2

OC

CHCH2

NH2 x

OC

CHCH2

NH2

Die Porengröße ist in einem recht weiten Bereich variabel, die Bisacrylamidkonzentration

kann in einem Bereich zwischen 2 % und 30 % der Acrylamid-Konzentration liegen. Bei

zu geringer Vernetzerkonzentration zerfließen die Gele, bei zu hoher werden sie brüchig.

Beispielsweise entspricht ein 7,5-%iges Gel einem Porendurchmesser von 50 Å und ein

30-%iges einem solchen von 20 Å. Zum Vergleich sei die räumliche Ausdehnung eines

Serumalbuminmoleküls angegeben: 40 Å × 150 Å. Die Polymerisation geschieht

radikalisch unter Zuhilfenahme von Radikalbildnern (hier: Ammoniumpersulfat).

Die Elektrophorese

Die Ausrüstung für eine Elektrophorese besteht aus zwei Teilen, einem Strom-

versorgungsteil (gewöhnlich ein Gleichspannungsgerät 0 - 550 V bzw. 0 - 200 mA) und

einer Elektrophoresekammer. Abb. 1 zeigt deren prinzipiellen Aufbau. Die Kammer

besteht aus einem oberen und unteren Pufferreservoir, die über die Gelplatte miteinander

verbunden sind. Da bei der SDS-Gelelektrophorese alle Proteine negativ geladen sind,

enthält das untere Reservoir die Anode, das obere die Kathode.

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Kathode

Anode

unteres Pufferreservoir

Glasplatten

Trenngel

oberes Pufferreservoir

Sammelgel

Abb. 1: Prizipieller Aufbau einer Vertikal-Elektrophoresekammer

In der Praxis verwendet man diskontinuierliche Gele und Puffer. Man spricht deshalb auch

von einer diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (abgekürzt SDS-Disk-

Elektrophorese). Das obere Drittel des Gels besteht aus einem weitporigen Sammelgel

(engl. stacking gel), die unteren zwei Drittel des Gels bestehen aus einem engerporigen

Trenn- oder Laufgel (engl. running gel). Das Sammelgel hat die Aufgabe, die Probe,

sobald sie durch das Gel läuft, zu konzentrieren, sodass sie, sobald sie in das Laufgel ein-

dringt, eine extrem schmale Bande bildet. Im Laufgel findet dann die Trennung des

Proteingemisches statt. Die Wanderungsgeschwindigkeit von Proteinen im Sammelgel

entspricht der in freier Lösung. Der Reservoirpuffer ist ein Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan/Glycin-Puffer (Tris/Glycin) pH 8,3, während die Sammel- und Trenngelpuf-

fer aus Tris/HCl bestehen, pH 6,8 bzw. 8,8. Der pH des Sammelgels ist also um zwei pH-

Einheiten niedriger als der des oberen Reservoirs. Bei pH 8,3 liegen nur ca. 5 % des

Glycins als Glycinat vor, das bedeutet, dass die Glycinationen eine relativ geringe effek-

tive Beweglichkeit besitzen. Nach Auftragen der Proteinproben wird das elektrische Feld

angelegt, und die Proteine wandern mit den Glycinationen in das Sammelgel. Die

Chloridionen im Gel fangen natürlich ebenfalls an zu wandern, so dass während der

Elektrophorese zusammen mit den Proteinen zwei verschiedene Ionenarten in

Trennrichtung wandern. Sie werden als Leitionen (Cl–) und als Folgeionen (Glycinat)

bezeichnet.

Zu Beginn der Trennung befinden sich die Leitionen (Cl–) in Sammel- und Trenngel,

während die Folgeionen nur in der Pufferlösung der Elektrodengefäße vorhanden sind.

Durch die Wahl des pH-Wertes von 6,8 für das Sammelgel ordnen sich die effektiven

Beweglichkeiten u (u = Beweglichkeit, = Dissoziationsgrad) folgendermaßen an:

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uLeitionen > uProtein > uFolgeionen,

wobei Leitionen, Proteine und Folgeionen dasselbe Ladungsvorzeichen tragen, also zur

gleichen Elektrode wandern.

Im Sammelgel bei pH 6,8 wandert Glycinat etwa 100 mal langsamer als bei pH 8,8 im

Trenngel. Unterwirft man das ganze Gelsystem einem elektrischen Stromfluss, so eilen

die Leitionen infolge höherer Beweglichkeit den Proteinen und Folgeionen voraus und

lassen eine Zone geringerer Leitfähigkeit hinter sich.

Nun ist die spezifische Leitfähigkeit umgekehrt proportional zur Feldstärke. Diese Zone

gewinnt daher eine höhere Feldstärke, welche die Proteine und Folgeionen derart

beschleunigt, dass sie hinter den Leitionen mit gleicher Geschwindigkeit wandern und

sich dadurch ansammeln.

Es bewegen sich alle Ionenarten mit gleicher Geschwindigkeit, wenn die Produkte aus

Feldstärke und Beweglichkeit einander gleichen:

v = E · u

(v = Geschwindigkeit, E = Feldstärke, u = Beweglichkeit)

Es stellt sich ein regulierendes Gleichgewicht ein, das die Gleichheit der Produkte

aufrechterhält. Zwischen den Leit- und Folgeionen bildet sich daher eine Grenzschicht

aus, die gleichzeitig die Front zwischen Gebieten niedriger und hoher Feldstärke darstellt.

Man kann sie als eine von oben nach unten wandernde Schlierenfront im praktischen

Versuch wahrnehmen. Diese Grenzschicht wandert nun rasch durch das Sammelgel. Da

die Beweglichkeiten der Proteine zwischen denen der Leit- und Folgeionen liegen, werden

die Proteine von der wandernden Grenzschicht erfasst und zu einer schmalen,

hochkonzentrierten Proteinzone zusammengestaucht.

Erreicht nun die wandernde Proteinzone, eingezwängt zwischen Leit- und Folgeionen, die

Grenze zwischen Sammel- und Trenngel, so trifft sie dort zwei Diskontinuitäten an,

nämlich einen pH-Wechsel und einen Porengrößenwechsel. Der „neue“ pH-Wert im

Trenngel ist so gewählt, dass der Dissoziationsgrad der Folgeionen - und damit deren

Beweglichkeit - um ein Vielfaches zunimmt. Dadurch gewinnen die Folgeionen eine

Beweglichkeit, die der der Leitionen fast gleicht. Die Folgeionen überholen nun alle

Proteine und wandern direkt hinter den Leitionen den Proteinen voraus, die nun in einem

homogenen elektrischen Feld entsprechend ihrer Molekülgröße aufgetrennt werden.

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Versuchsdurchführung

SDS-PAGE nach Smith, Methods in Molecular Biology, Volume1 (Proteins), 41-56.

Lösungen

Für alle Lösungen und Puffer entgastes destilliertes Wasser verwenden!!

Bemerkung: „Wasser ad 250 ml“ bedeutet, dass die Substanzen in ungefähr 150 ml dest.

Wasser gelöst und anschließend auf 250 ml Gesamtvolumen aufgefüllt werden.

Vorsicht: Acrylamid ist für Haut und Lunge sehr giftig. Abwiegen nur mit Handschuhen

und unter dem Abzug! Nicht mit dem Mund pipettieren! Die mit Acrylamid in Berührung

gekommenen Geräte sofort nach Gebrauch mit Wasser spülen!

2) Trenngelpuffer: SDS 1 g

Tris 45,5 g

HCl bis pH 8,8

Wasser ad 250 ml

Bemerkung: „Wasser ad 250 ml“ bedeutet hier, dass die Substanzen in ungefähr 200 ml

Wasser gelöst werden, der pH eingestellt und anschließend auf 250 ml Wasser aufgefüllt

wird.

Auf 2 l auffüllen. Es stellt sich ein pH von ca. 8,3 ein (Kontrolle!).

1) Acrylamidlösung: Acrylamid 73 g

Bisacrylamid 2 g

Wasser ad 250 ml

3) Sammelgelpuffer: SDS 1 g

Tris 15,5 g

HCl bis pH 6,8

Wasser ad 250 ml

4) Elektrophoresepuffer: Glycin 28,8 g

Tris 6 g

SDS 2 g

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Bemerkung: Bromphenolblau schädigt die Membran der pH-Elektrode und darf deshalb

erst nach Einstellung des pH-Werts dazugegeben werden.

5) Ammoniumpersulfatlösung: Ammoniumpersulfat 1 g

Auf 10 ml Wasser auffüllen.

6) Trenngel (10 %): Acrylamidlösung 5 ml

Wasser 6,25 ml

Trenngelpuffer 3,75 ml

Gut entgasen!

Ammoniumpersulfatlsg. 25 l

TEMED 10 l

7) Sammelgel (4,5 %): Acrylamidlösung 0,75 ml

Wasser 3 ml

Sammelgelpuffer 1,25 ml

Gut entgasen!

Ammoniumpersulfatlsg. 15 l

TEMED 5 l

8) Probenpuffer (doppelt stark): SDS 0,92 g

Glycerin 4 g

Tris 0,3 g

Mercaptoethanol 2 ml

mit Wasser auf 7 ml

HCl bis pH 6,8

0,1 % Bromphenolblau 2 ml

mit Wasser auf 7 ml

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9) Probenbereitung:

Proteinlösung wird 1:1 mit Probenpuffer versetzt. Die Lösungen können mit Wasser

verdünnt werden. Proteinmenge einer Auftragung: 5-25 g Protein in 10 l

Gesamtvolumen.

Arbeitsgang:

1) Zusammensetzen der sauberen, mit vergälltem Ethanol abgeriebenen Platten zur

Gelkammer.

2) Nach gründlichem Mischen der Trenngellösung (6) wird die Gelkammer bis 1 cm

unterhalb des Randes mit einer Pasteurpipette gefüllt und vorsichtig mit wasser-

gesättigtem Butanol überschichtet. Dadurch erhält man eine glatte Phasengrenze

zwischen Trenn- und Sammelgel.

3) Nach Beendigung der Polymerisation wird das Butanol mit einer Pasteurpipette

vorsichtig herausgesaugt und mit Wasser nachgespült. Die Sammelgellösung wird auf

das Trenngel aufgetragen und der Kamm vorsichtig in die Lösung eingeschoben.

4) Ist das Sammelgel polymerisiert, zieht man behutsam den Kamm heraus.

5) Die Gele werden mit den Glasplatten in die Elektrophoreseapparatur eingespannt und

diese mit Elektrophoresepuffer aufgefüllt.

6) Zur Elektrophorese werden 20 l der denaturierten Proben mit einer Mikropipette durch

den Elektrophoresepuffer hindurch in die Probentaschen eingebracht, ohne das

Sammelgel zu verletzen. Das Gel sollte insgesamt asymmetrisch beladen werden, da

sonst später keine Auswertung möglich ist.

7) Man setzt den Deckel auf und stellt eine konstante Spannung von 200V ein.

8) Nach erfolgter Elektrophorese und Abschalten der Spannungsquelle wird der

Elektrophoresepuffer dekantiert, und die Gelkammern werden ausgespannt. Das Gel

wird vorsichtig von den Platten abgelöst (nicht mit den Fingern anfassen!) und sofort in

Wasser eingetaucht.

19

9) Gefärbt wird das Gel mit PageBlue, einer Proteinfärbelösung von Fermentas nach

beiliegender Vorschrift. Zunächst wird das Gel in 100ml destilliertes Wasser gelegt und

1min bei höchster Leistung in der Mikrowelle erhitzt. Anschließend verbleibt das Gel für

5min auf dem Schüttler. Das Wasser wird entfernt und der Vorgang noch zwei weitere

Male wiederholt. Dieser erste Waschschritt dient zur Entfernung des SDS, da dieses

die Färbung stört. Anschließend wird das Gel mit genügend Färbelösung bedeckt und

erneut 30sec bei höchster Leistung in der Mikrowelle erhitzt und darauf hin 20min auf

dem Schüttler gefärbt. Danach wird die Färbelösung entfernt und das Gel mit

destilliertem Wasser von Farbresten befreit. Das Gel verbleibt über Nacht in

destilliertem Wasser auf dem Schüttler. Die Gele können so mehrere Tage gelagert

werden.

Aufgabe:

Bestimmung des Molekulargewichts der unbekannten Proteinproben.

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Enzymatische Bestimmung von ADP (Adenosindiphosphat)

Einleitung zu den photometrischen Bestimmungen

Wird eine Küvette, die mit einer absorbierenden Flüssigkeit oder Lösung gefüllt ist, von

Licht durchstrahlt, dann bewirkt die Absorption des Küvetteninhalts eine

Intensitätsabnahme des Lichtstrahls. Diese ist von der Wellenlänge des Lichts, der

Konzentration der absorbierenden Probe, der Länge des Lichtweges durch die

Messlösung sowie einer Stoffkonstanten (dem Extinktionskoeffizienten ) abhängig. Die

Wellenlängen, bei denen ein Maximum hat (die Absorptionsmaxima) sind für

absorbierende Atomgruppierungen (Chromophore) wie z. B. Nitrogruppen,

Doppelbindungen, Aromaten u. v. a. charakteristisch.

Die Konzentrationsbestimmung durch Messung der Absorption einer monochromatischen

Strahlung nach Durchgang durch die Messlösung bezeichnet man als Photometrie.

Grundlage für die photometrischen Konzentrationsbestimmungen ist das Lambert-

Beersche Gesetz, nach dem sich die Konzentration einer Lichtenergie absorbierenden

Verbindung in verdünnter Lösung berechnen lässt:

cE

d

c = Konzentration (mol/l)

= molarer Extinktionskoeffizient (l mol–1 cm–1)

d = Schichtdicke der Küvette (cm)

E = Extinktion

Die Ableitung des Lambert-Beerschen Gesetzes ist den Lehrbüchern zu entnehmen.

In der Regel ist die Skala eines lichtelektrischen Messgerätes linear und logarithmisch

unterteilt. Die lineare Teilung zeigt das Verhältnis der austretenden zur eingestrahlten

Lichtintensität an (Durchlässigkeit, Transmission T ), auf der logarithmischen Teilung wird

die Extinktion E (negativer Logarithmus der Durchlässigkeit) angezeigt.

21

Viele Substanzen, die farblos oder nur schwach gefärbt sind, können durch Zugabe eines

Reagenzes, mit dem sie unter Bildung stark gefärbter Produkte reagieren, bestimmt

werden. Dabei werden die Reaktionsbedingungen so standardisiert, dass die Menge der

zu bestimmenden Verbindung direkt proportional der gemessenen Extinktion ist.

c F E

c' = Gewichtsmenge der zu bestimmenden Verbindung im Standardtest

F = Proportionalitätsfaktor

Unter diesen Bedingungen wird eine Eichkurve mit bekannten Mengen der zu

bestimmenden Substanz aufgenommen und E gegen c' aufgetragen. Die Kurve sollte,

wenn von den gemessenen Extinktionswerten die Extinktion des Blindwertes (Extinktion

des Ansatzes ohne Analysensubstanz) subtrahiert wird, durch den Koordinatenursprung

gehen und eine Gerade ergeben, deren Steigung F entspricht.

Der ermittelte Proportionalitätsfaktor F dient zur Gehaltsbestimmung bei Lösungen

unbekannter Konzentration.

Aufgabe

In einer ADP-Lösung unbekannter Konzentration ist der Gehalt an ADP (Abb. 1) auf

enzymatischem Wege zu bestimmen.

O

O

ONa

P O

O

O

Na

Na

P O CH2

HO

O

OH

N

N

NH2

N

N

Abb. 1: ADP, Trinatriumsalz (MG 493,15)

Prinzip der enzymatischen Methode

Zur enzymatischen Bestimmung von ADP werden folgende Enzymreaktionen benutzt:

ADP + PEP PK

ATP + Pyruvat (1)

22

Pyruvat + NADH + H+ LDH

Lactat + NAD+ (2)

PEP = Phosphoenolpyruvat

PK = Pyruvatkinase

ATP = Adenosintriphosphat

NAD+ (NADH) = Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, oxidierte (bzw. reduzierte) Form

LDH = Lactatdehydrogenase

Durch Koppeln der Reaktion (1) mit der Indikatorreaktion (2), einem

Dehydrogenasesystem, kann ADP durch einen optischen Test gemessen werden. Da die

Gleichgewichte beider Reaktionen ganz auf der rechten Seite liegen, ist eine quantitative

Umsetzung von ADP in ATP und von Pyruvat in Lactat gewährleistet.

Reagenzien (M = mol/l)

0,1 M Tris-Puffer, mit HCl auf pH 7,5 eingestellt

PEP-Lösung in Wasser (2,5 mg / 0,4 ml)

NADH-Lösung in Wasser (4,5 mg / 0,6 ml)

0,5 M Magnesiumsulfat-Lösung

1 M KCl-Lösung

PK-Lösung in Puffer (ca. 0,1 mg / ml)

LDH-Lösung in Puffer (ca. 0,1 mg / ml)

Berechnung des Versuchsergebnisses

Aus den Reaktionsgleichungen (1) und (2) ist ersichtlich, dass pro mol umgesetztes ADP

1 mol NADH verbraucht wird. Die verbrauchte NADH-Menge kann aus der Extinktions-

änderung der Inkubationslösung berechnet werden:

340 = 6,3 · 103 l mol–1 cm–1

365 = 3,4 · 103 l mol–1 cm–1

Durchführung der Bestimmung

In eine Küvette (Schichtdicke 1 cm) werden nacheinander eingefüllt:

720 l Tris-Puffer

23

40 l MgSO4-Lösung

40 l 1 M KCl-Lösung

16 l PEP-Lösung

24 l NADH-Lösung

80 l der zu untersuchenden ADP-Lösung

40 l LDH-Lösung

Es wird gründlich gemischt und die Extinktion bei 365 nm oder 340 nm über 3 min

verfolgt. Wenn sie konstant bleibt, wird abgelesen, es werden 40 l der PK-Lösung

zugegeben, und es wird umgemischt. Ist die Extinktion erneut konstant, wird E365

bestimmt und daraus die ADP-Konzentration berechnet. Sollte die Menge zu groß oder

zu klein sein, um eine Extinktionsänderung von ca. 0,1 - 0,2 zu erreichen, dann sind die

Menge der ADP-Lösung und entsprechend die Puffermenge zu verändern; das Gesamt-

volumen des Ansatzes sollte dabei konstant bleiben. Es sollen mindestens drei Bestim-

mungen ausgeführt werden.

Tabelle zur Auswertung:

Ergebnis: ADP-Gehalt aufgrund der enzymatischen Bestimmung: ...................

ADP-Lsg [ml] E365 umgesetzte NADH-Menge

ADP-Menge im Ansatz

ADP-Konz. in der Lsg

24

Quantitative Proteinbestimmungsmethoden

Die quantitative Bestimmung von Proteinen gehört wohl zu den wichtigsten Methoden in

der allgemeinen Biochemie. In der Literatur ist eine Vielzahl verschiedener Bestimmungs-

verfahren beschrieben, die jedoch fast alle mit bestimmten Vor- und Nachteilen behaftet

sind.

Es soll hier dringend darauf hingewiesen werden, dass im Allgemeinen mit keinem der

Bestimmungsverfahren absolute Proteinwerte erhalten werden können. In den meisten

Fällen werden zur Bestimmung der unbekannten Proteinkonzentrationen andere, leicht

zugängliche Proteine (wie z. B. Rinderserumalbumin, BSA), als Standard verwendet. Die

über solche Methoden erhaltenen Proteinwerte sind also nur als relative Werte zu dem

jeweiligen Standardprotein zu verstehen.

Absolute Proteinbestimmung kann also nur dann durchgeführt werden, wenn zum einen

das zu untersuchende Protein als Standard verwendet werden kann (nach Lyophilisieren

und genauem Auswiegen kann eine Standardkurve ermittelt werden) oder zum anderen

bei bekanntem Extinktionskoeffizienten des untersuchten Proteins die UV-Absorption bei

einer definierten Wellenlänge bestimmt werden kann.

1. Proteinbestimmung mit BCA-Test

Einleitung

Der BCA-Test ist ein Proteinbestimmungs-Assay der Firma Uptima, der sich durch hohe

Empfindlichkeit und geringe Störanfälligkeit auszeichnet. Er ist kompatibel mit vielen

ionischen und nicht-ionischen Detergenzien. Der Test ist einfacher und schneller

durchzuführen als die Proteinbestimmungsmethode nach Lowry. Die Empfindlichkeit

erreicht 5 µg/ml im erweitertem Protokoll. Außerdem kann der Test in angepasster Form

in Microtiterplatten durchgeführt werden.

Bicinchoninsäure (2,2’-Bichinolin-4,4’-dicarbonsäure, bicinchoninic acid, BCA) ist ein Cu+-

Reagenz. Die Farbbildung wird auf die vier Aminosäuren Cystein, Cystin, Tryptophan und

Tyrosin zurückgeführt. In einer Biuret-Reaktion reduziert das Protein Cu2+ in alkalischem

Medium zu Cu+. Anschließend wird das Kupfer(I)-Ion von zwei Molekülen BCA

komplexiert.

25

Abbildung1: BCA-Reagenz

Abbildung 2: Mit BCA-Reagenz komplexiertes Cu+

Methode

Die verwendeten Lösungen enthalten:

Lösung A: - Natriumcarbonat

- Natriumbicarbonat

- BCA

- Natriumtartrat

- in 0,2 N NaOH

Lösung B: - 4%ige Kupfersulfat-Lösung

Lösung A und Lösung B sind kommerziell erhältlich.

26

Herstellung der Eichgeraden

Es wird eine BSA-Lösung der Konzentration c = 250 µg/ml unter Verwendung einer

Stammlösung (SL) der Konzentration c = 2 mg/ml hergestellt.

Eine Verdünnung von 100 µl SL (2 mg/ml) 200 µg BSA mit 700 µl Wasser ergibt eine

BSA-Lösung von c = 250 µg/ml. Diese Lösung wird zum Erstellen der Eichgerade

verwendet.

Herstellung des BCA-Reagenzes

BCA-Lösung A und BCA-Lösung B werden im Verhältnis 50:1 gemischt. Zum Beispiel

29,4 ml Lösung A und 0,6 ml Lösung B.

Das so angesetzte Reagenz kann nur einen Tag lang verwendet werden; immer so viel

Reagenz ansetzen, dass es auch für die zu bestimmenden Proben ausreicht.

Pipettierschema für die Eichgerade

Die Eichgerade sowie die Proben werden in Eppendorf-Tubes doppelt angesetzt.

Eppi-Nr. BSA-Lösung [µl] H2O [µl] BCA-Reagenz [µl] µg BSA/Probe

1 (Blank) 0 100 900 0

2 10 90 900 2,5

3 20 80 900 5

4 30 70 900 7,5

5 40 60 900 10

6 50 50 900 12,5

7 60 40 900 15

8 70 30 900 17,5

Am günstigsten legt man das Wasser vor und pipettiert anschliessend die BSA-Lösung

zu.

27

Pipettierschema für die zu bestimmende Proteinprobe

Eppi-Nr. Protein-Lsg. [µl] H2O [µl] BCA-Reagenz [µl]

1 (Blank) 0 100 900

2 20 80 900

3 40 60 900

4 60 40 900

Vermessung

Erst wenn alle Proben (d.h. Eichgerade und Proteinproben) bereit sind wird das BCA-

Reagenz zugegeben. Sofort danach erfolgt eine 30-minütige Inkubation im 60 °C warmen

Wasserbad. Danach werden die Proben auf Eis abgekühlt und sofort im UV/Vis-

Spektrometer bei einer Wellenlänge von 562 nm vermessen.

2. Konzentrationsbestimmung nach Bradford

Theorie

Die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford ist, ähnlich wie die Methode

nach Lowry, ein Verfahren, das auf einer Farbreaktion basiert. Die Nachweismethode

findet im stark sauren Medium statt, das Coomassie Brilliant Blue G-250, einen

Triarylmethanfarbstoff enthält. Durch Bindung des Farbstoffes an das Protein erfolgt ein

spezifischer Farbwechsel von einem Aborptionsmaximum von 465 nm zu 595 nm. Die

Intensität des Farbkomplexes ist direkt vom Proteingehalt abhängig.

Der Farbkomplex ist nach zwei Minuten gut sichtbar und für ca. eine Stunde stabil.

Diese Proteinbestimmungsmethode ist schnell durchführbar, gut zu reproduzieren und

sehr sensitiv. Sie wird durch Pufferchemikalien und reduzierende Stoffe kaum gestört,

versagt allerdings, wenn in der Proteinlösung Substanzen enthalten sind, die in stark

phosphorsauren Lösungen grobflockige Niederschläge bilden (z. B. Detergenzien wie

Desoxycholat o. ä.). Störungen des Testes werden auch durch Natriumdodecylsulfat

(SDS) und Triton X-100 verursacht.

Der Nachteil der Methode liegt, wie bei allen farb-chemischen Nachweismethoden darin,

dass die Proteinprobe wegen Denaturierung nicht mehr wiederverwendet werden kann.

28

Aufgabe

Ermittlung der Konzentration einer unbekannten Proteinlösung.

Reagenzien

Bradford-Reagenz

0,1 g Coomassie Brilliant Blue G-250 werden in 50 ml 50-%igem Ethanol (v/v) gelöst.

Dann werden 100 ml 85-%ige Phosphorsäure zugegeben und mit dest. Wasser auf

250 ml aufgefüllt.

Vor Gebrauch wird ein Volumen des Reagenz mit 4 Volumen dest. Wasser gemischt und

filtriert.

Modifizierung nach M. Holtzhauer (1988)

Albuminlösung als Standard für die Eichgerade

10 mg Rinderserumalbumin (BSA) werden in einem 10-ml-Messkolben eingewogen und

mit dest. Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Die Einwaage muss genau bekannt sein. Lösen

und Mischen durch vorsichtiges Drehen des Kolbens - nicht schütteln!

Durchführung

Erstellen der Eichgerade

Nach folgendem Schema wird der Albuminstandard (1 mg/ml) in einzelne Reagenzgläser

pipettiert.

2 × 0 l (Blank), 2 × 5 l, 2 × 7 l, 2 × 10 l, 2 × 12 l, 2 × 15 l (Dupletts)

Daraufhin werden in jedes Reagenzglas 1 ml Bradford-Reagenz hinzugefügt und auf

einem Whirlmix durchmischt.

Nach ca. 2 Minuten ist der Farbkomplex stabil. Dann erfolgt die Extinktionsmessung in

Kunststoffküvetten bei 595 nm. (Eppendorf-Photometer: 578 nm oder 623 nm)

Konzentrationsbestimmung der unbekannten Proteinlösung

2 × 3 l, 2 × 5 l, 2 × 7 l der Proteinlösung in einzelne Reagenzgläser pipettieren.

Proben mit jeweils 1 ml Bradford-Reagenz versetzen und analog zur Vorschrift der

Eichgeraden vermessen.

29

Falls die bestimmte Extinktion außerhalb des Bereiches der Eichgeraden liegt, muss die

Stammproteinlösung verdünnt eingesetzt werden.

Achtung: Bei dieser Proteinbestimmungsmethode sind die Eichgeraden nur bis zu einem

maximalen Proteingehalt von 15 g pro Probe proportional zur Proteinmenge, danach

knickt die Eichgerade ab.

Auswertung

Ermittelte Extinktionswerte für die verschiedenen BSA-Gehalte (g) in einem Diagramm

auftragen. Mittels linearer Regression kann daraufhin aus den gemessenen

Extinktionswerten der unbekannten Proteinlösung deren Konzentration bestimmt werden.

Literatur:

M. M. Bradford, (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254

Holtzhauer M. (1988) Biochemische Labormethoden, Arbeitsvorschriften und Tabellen,

Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 5-6

30

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

1. Einleitung ................................................................................................................. 30

2. Versuchsbeschreibung ............................................................................................ 35

3. Versuchsdurchführung ............................................................................................. 36

3.1 Reagenzien und Chemikalien ............................................................................. 36

3.2 Versuchsablauf ................................................................................................... 37

3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte .......................................................................... 38

4. Auswertung .............................................................................................................. 39

5. Literatur ................................................................................................................... 39

1. Einleitung

Die intakte Oberfläche des Körpers stellt eine wirksame Barriere gegenüber den meisten

Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Pilzen, Parasiten) dar. Um dennoch eingedrungene

Mikroben unschädlich zu machen, verfügen Wirbeltiere über ein Abwehrsystem aus

Molekülen und Zellen, das Immunsystem.

Alle Zellen des Immunsystems stammen von pluripotenten Stammzellen ab, die sich im

Laufe ihrer Entwicklung in zwei Zellinien, die myeloische und die lymphatische,

differenzieren. Die myeloische Reihe besteht zum gößten Teil aus Phagozyten, welche in

der Lage sind, Fremdorganismen zu endocytieren und zu verdauen. Die Zellen der

lymphatischen Reihe (Lymphocyten) differenzieren, je nach Umgebung (micro-

environment) in der sie heranreifen, in T- und B-Zellen. T-Zellen entwickeln sich dabei im

Thymus, während B-Zellen bei Säugetieren im Knochenmark (bone marrow) entstehen.

31

Neben der zellvermittelten Immunreaktion spielen auch lösliche Faktoren bei der

Immunantwort eine große Rolle (humorale Immunantwort). Den Hauptträger dieser

Abwehr bilden die Immunglobuline oder Antikörper. Diese werden - nach einem Kontakt

des lymphatischen Systems mit fremden immunogenen Molekülen - von Plasmazellen,

die sich aus B-Zellen entwickeln, gebildet. Moleküle, die im Organismus die Bildung

dieser Antikörper induzieren, nennt man Antigene.

Die Antikörper erkennen das infektiöse Agens spezifisch, das heißt, ein bestimmter

Antikörper erkennt nur sein zugehöriges Antigen. Die Bindung erfolgt dabei nicht an das

gesamte Antigen, sondern nur an eine bestimmte Stelle, die Antigendeterminante

(Epitop).

Die Grundstruktur aller Antikörper besteht aus je zwei identischen leichten und schweren

Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1).

32

Kohlenhydrat

Disulfidbrücke

schwere Kette450 Reste

leichte Kette

212 Reste

CH3CH2

CH1

VH

CL

VL

Türangel-(hinge)

Region

Antigen-

bindungs-stellen

Abb. 1: Grundstruktur eines Antikörpers (IgG)

Von der kleineren Polypeptidkette (light chain) mit einem Molekulargewicht von 25 000

existieren zwei Formen, die - und die -Form. Ihre Struktur gliedert sich in zwei globuläre

Regionen (Domänen), die in sich durch je eine Disulfidbrücke stabilisiert sind. Diejenige

Region, welche die Carboxylgruppe enthält, zeigt bei einem Vergleich der

Aminosäuresequenzen verschiedener Antikörper eine hohe Übereinstimmung und wird

daher als konstante Region (CL-Region, constant light chain) bezeichnet. Das

aminoterminale Ende besitzt eine große Sequenzvariabilität und wird daher variable

Region (VL-Region, variable light chain) genannt.

33

Die schwere Polypeptidkette (heavy chain) existiert in fünf Formen () mit einem

Molgewicht von 50.000-77.000. Jede dieser Formen ist mit einem Leichtkettentyp frei

kombinierbar, wodurch die fünf Immunglobulinklassen (IgA, IgD, IgE, IgG bzw. IgM)

entstehen. Variationen in der Schwerkettenstruktur innerhalb einer Klasse (z. B. 1, 2, 3

u. 4) führt zur Bildung von Subklassen (entsprechend: IgG1, IgG2, IgG3, bzw. IgG4).

Die Struktur der schweren Ketten ist denen der Leichtkette sehr ähnlich. Bedingt durch die

größere Molmasse besitzen sie jedoch neben der variablen Region (VH-Region, variable

heavy chain) drei konstante Domänen (CH1, CH2, CH3). Der Kohlenhydratanteil, den alle

Antikörper besitzen, ist an die CH2-Region gebunden.

Die pflanzliche Proteinase Papain spaltet Immunglobuline in der Region zwischen den

CH1- und CH2-Domänen, der sogenannten Türangelregion (hinge region), wodurch zwei

identische Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment entstehen (Abb. 2). Ein weiteres Enzym

für die Fragmentierung von Antikörpern ist Pepsin, welches zwei größere Fragmente

erzeugt, das F(ab')2-Fragment, das die über die Hinge-Region miteinander verbundenen

Fab-Regionen umfasst, und das pFc'- Fragment, welches den CH3-Domänen des

Antikörpermoleküls entspricht.

Mit diesen Fragmenten konnte gezeigt werden, dass die Antigen-Antikörper-Bindungsorte

in den variablen Bereichen (VL, VH) des Antikörpers liegen, während der Fc-Teil die

Bindung des Immunglobulins an verschiedene Zellen des Immunsystems, sowie

Komplementfaktoren vermittelt. Die hohe Beweglichkeit der Hinge-Region erlaubt eine

Änderung des Abstandes der Antigenbindungsorte, wodurch diese unabhängig

voneinander verfügbar sind.

34

F(ab’)2

Peptide mitniedriger

Molmasse

sekundäre

Spaltung

durch Papain

Papain

Pepsin

pFc’

333234

Fab

Fc’

Fc

433341224

Abb. 2: Enzymatische Spaltung von Immunglobulinen

35

2. Versuchsbeschreibung

Zur Bestimmung von Antikörpertitern gegen bestimmte Antigene existiert mittlerweile eine

Vielzahl von Methoden, wobei an dieser Stelle nur der RIA (radioimmunoassay) und der

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) genannt seien. Beide Assays sind sehr

einfach in der Durchführung, doch sehr sensitiv und zuverlässig, was zu deren weit

verbreiteter Anwendung geführt hat. Die Grundlage beider Methoden beruht auf der

Tatsache, dass bestimmte Kunststoffoberflächen (z. B. Polystyrol, Polypropylen,

Polycarbonat, Polyvinylchlorid) geringe Mengen der meisten Proteine fest binden können.

Pipettiert man in den Napf einer 96-Loch Mikrotiterplatte aus geeignetem Material eine

Antigenlösung, so wird ein Teil des Proteins adsorbiert (I in Abb. 3). Nicht gebundenes

Antigen wird durch Waschen der Platte entfernt.

I

II

III

Antigen

Abb. 3: Schematischer Aufbau des ELISA

Zur Sättigung nicht besetzter Bindungsstellen der Kunststoffoberfläche wird dann eine

konzentrierte Proteinlösung aufgetragen, die nicht zu Kreuzreaktionen im Test führen darf.

Häufig werden dazu Lösungen von Rinderserumalbumin (BSA) oder Gelatine verwendet.

36

In die so vorbehandelte Mikrotiterplatte wird dann die zu testende Lösung einpipettiert.

Falls in der Probe antigenspezifischer Antikörper vorhanden ist, bindet dieser an das an

die Festphase fixierte Antigen (II in Abb. 3). Alles nicht gebundene Material wird in einem

anschließenden Waschvorgang entfernt. Um den gebundenen Antikörper detektieren zu

können, wird die Platte dann mit einer Lösung von markiertem Anti-Antikörper behandelt

(III in Abb. 3).

Im Praktikumsversuch soll ein His-Tag markiertes Protein (Gelonin) aus

Expressionsversuchen immunologisch nachgewiesen werden. Es wird deshalb eine

monoclonale Anti-His-Tag Antikörperlösung verwendet. Die Markierung dieses zweiten

Antikörpers kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Beim RIA ist der

Sekundärantikörper radioaktiv markiert, beim ELISA ist er mit einem Enzym (E in Abb. 3)

gekoppelt.

Nach einem letzten Waschvorgang wird das gebundene Enzym-Anti-Maus-Ig-Konjugat

durch eine Farbreaktion nachgewiesen, bzw. beim RIA an die Festphase gebundene

Radioaktivität gemessen. Je nach Anwendung können verschiedene Enzyme zur

Markierung des Anti- Antikörpers verwendet werden. Häufig werden Peroxidase(POD)-

und alkalische Phosphatase(AP)-Konjugate benutzt.

3. Versuchsdurchführung

3.1 Reagenzien und Chemikalien

Testprotein (Antigen) Rekombinantes Gelonin mit His-Tag (20 µg/ml)

Gelonin aus Samen von Gelonium multiflorum (20 µg/ml)

Kontrollen

Negativkontrollen: 20 µg/ml Cytochrom C

Positivkontrolle: 20 µg/ml rekombinantes Gelonin

Primärantikörper Monoklonale, antigenspezifischer Antikörper:

Mouse Anti-His Antikörper

Verdünnung: 1:2000 mit PBS-Tween

Enzymkonjugat Alkalische Phosphatase markierte, polyklonale Antikörper gegen Maus-Immunglobuline:

Anti-mouse lgG Antikörper (AP)

Verdünnung: 1:1000 mit PBS-Tween

37

Coating-Puffer Lösung A: 100 ml 0,2 M Na2CO3 (2,12 g ad 100 ml)

Lösung B: 100 ml 0,2 M NaHCO3 (1,68 g ad 100 ml)

Gebrauchslösung : 8,5 ml Lösung A + 4 ml Lösung B

pH 10,6 (pH-Kontrolle)

ad 50 ml mit bidest. Wasser

Waschpuffer PBS-Tween Na2HPO4 0,92 g

NaH2PO4 * H2O 0,35 g

NaCl 8,18 g

pH 7,2

ad 1 l mit deionisiertem Wasser

100 ml zur Seite stellen (= PBS-Puffer)

zu den restlichen 900 ml:

Tween 20 0,45 ml

Blockierlösung 1% BSA in PBS

250 mg BSA in 25 ml PBS

Substratpuffer (AP) NaN3 0,2 g (0,02 %)

MgCl2 * 6 H2O 0,1 g

DEA (Diethanolamin) 97 ml

pH 9,8

ad 1 l bidest. Wasser

Substratlösung (AP) 15 mg p-Nitrophenylphosphat ad 15 ml Substratpuffer

3.2 Versuchsablauf

a) Das Antigen wird im Coating-Puffer auf eine Konzentration von 20 g/ml eingestellt. Je

Napf werden 100 µl dieser Lösung eingebracht. Die Bindung an die feste Phase erfolgt

über Nacht bei 4 °C.

b) Die Näpfe der Platte werden durch Ausschlagen geleert. Pro Napf werden 200 µl der

Blockierlösung eingefüllt. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 90 min.

c) 2-maliges Waschen mit jeweils 200 µl PBS-Tween-Puffer. Ausschlagen der Näpfe.

d) Je Napf werden 100 l Primärantikörperlösung eingebracht. Die Inkubation erfolgt bei

Raumtemperatur für 1 h (siehe „Aufteilung der Mikrotiterplatte“, Abschn. 3.3)

e) 3 × Waschen. Näpfe ausschlagen.

38

f) Das Enzymkonjugat wird auf eine geeignete Arbeitskonzentration gebracht, d. h. ca.

1000 × verdünnt (10 l Enzymkonjugatlsg. + 10 ml PBS-Tween) und 100 l pro Napf

eingebracht. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 h.

g) 4 × Waschen. Näpfe ausschlagen.

h) 100 l Substratlösung zugeben. Die Entwicklung erfolgt bei Raumtemperatur. Die

Platte wird nach 10 min mit Hilfe eines EIA-Readers bei 414 nm vermessen.

3.3 Bestückung der Mikrotiterplatte

a) Blank:

Für die Messung benötigt der EIA-Reader eine Spalte der Platte als Blank. In die Spalte 1

dürfen deshalb keine Proben eingebracht werden. Stattdessen wird PBS einpipettiert. Alle

anderen Schritte wie Blockieren, Konjugatzugabe usw. erfolgen wie beschrieben.

b) Negativkontrollen:

Um falsche positive Ergebnisse auszuschließen, müssen in jedem ELISA

Negativkontrollen durchgeführt werden. Zu diesem Zweck werden 2 Spalten der Platte

nicht mit Antigen beschichtet. Das weitere Vorgehen erfolgt wieder wie beschrieben. Als

weitere Negativkontrolle wird in einer antigenbeschichteten Spalte ein Antikörper, der

nicht mit dem Antigen reagiert, als Probe eingebracht.

Die Ursachen für falschpositive Ergebnisse können sein:

Unspezifische Adsorption des Enzymkonjugats an das Plastikmaterial,

Kreuzreaktionen des Enzymkonjugats,

c) Positivkontrollen:

Um sicherzustellen, dass der ELISA richtig durchgeführt wurde, sollte immer eine Spalte

der Platte mit einer Probe bestückt werden, von der bekannt ist, dass sie für das

verwendete Antigen spezifische Antikörper enthält. Diese Löcher müssen sich beim

Entwickeln auf jeden Fall färben.

39

4. Auswertung

Die Auswertung erfolgt zunächst optisch, indem man die Löcher notiert, die deutlich

stärker gefärbt sind als die Negativkontrollen. Die Messwerte des EIA-Readers werden

statistisch ausgewertet.

Dazu werden die Negativkontrollen gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Für

jede Probe wird ebenfalls der Mittelwert aus den Messwerten gebildet. Eine Probe ist

dann positiv, wenn dieser Mittelwert größer ist als die Summe aus dem Mittelwert der

Negativkontrollen und der zweifachen Standardabweichung.

5. Literatur

Harlow, E., Lane, D.,

Antibodies. A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988.

Kap. 14, Immunoassays, S. 553-612.

Goding, J. W.,

Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd ed.,

Academic Press, London, 1986.

Kap. 3.10, Screening Assays, S. 76-89.

Peters, J. H., Baumgarten, H., (Hrsg.),

Monoklonale Antikörper. Herstellung und Charakterisierung, 2. Auflage,

Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1990.

Kap. 10, Nachweis von monoklonalen Antikörpern, S. 317-458.

40

Gezielte Mutagenese

Gezielte Mutagenese ...................................................................................................... 40

1. Grundlagen .............................................................................................................. 41

1.1. Der Ort der Mutation und mutagene Oligonukleotide ......................................... 41

1.2. LacZ / -Galactosidase ...................................................................................... 41

2. DNA Isolierung nach der „QiaPrep“ Methode ........................................................... 45

2.1. Das QIAprep Prinzip .......................................................................................... 45

2.2. Alkalische Lyse von Bakterien ........................................................................... 45

2.3. DNA Adsorption an die QIAprep-Membran ........................................................ 46

2.4. Waschen und Elution der Plasmid DNA ............................................................. 46

2.5. DNA Ausbeute ................................................................................................... 46

3. Miniprep-Protokoll für den „QIAprep spin kit“ unter Verwendung einer Tischzentrifuge47

4. Ortsgerichtete Mutagenese ...................................................................................... 50

4.1. Einführung ......................................................................................................... 50

4.2. DNA-Polymerase ............................................................................................... 50

4.3. Verdau mittels DpnI Restriktionsendonuklease .................................................. 51

4.4. Primer-Design ................................................................................................... 51

4.5. Überblick ........................................................................................................... 52

4.6. Durchführung der PCR-Reaktion ....................................................................... 53

4.7. Durchführung der Restriktion ............................................................................. 53

5. Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................................... 54

5.1. Durchführung der Gelelektrophorese: ................................................................ 55

6. Transformation ......................................................................................................... 56

7. Vorbereiten der Agar-Platten für Blue-White-Screening ........................................... 57

41

1. Grundlagen

Bei der ortsspezifischen oder gezielten Mutagenese (im engl. site-directed mutagenesis)

wird mit Hilfe der rekombinanten Gentechnik eine gezielte Veränderung der DNA

ermöglicht. Es können damit gezielt einzelne Nukleinbasen eines Gens ausgetauscht

oder auch ganze Gene entfernt werden. Dieses Verfahren ist eine inzwischen weit

verbreitete Methode in der Molekularbiologie, welches von der Veränderung eines Gens

auf einem Plasmid bis hin zur Knockout-Maus reicht

1.1. Der Ort der Mutation und mutagene Oligonukleotide

Bevor eine zielgerichtete Mutation durchgeführt werden kann, müssen folgende

Voraussetzungen erfüllt sein:

Das interessierende Gen muss in einem geeigneten Vector (Bacteriophage oder

Plasmid) vorliegen.

Die Stelle, in welche die gewünscht Mutation in das Gen bzw. das Protein

eingeführt werden soll, muss bekannt sein.

Ebenso muss bekannt sein, welche Base entfernt und welche eingefügt werden

soll um das gewünschte Ergebnis zu erzielen.

1.2. LacZ / -Galactosidase

Das lacZ-Gen kodiert das Enzym -Galactosidase. Die -Galactosidase aus E. coli

hydrolysiert das Disaccharid Lactose in die beiden einfachen Zucker Galactose und

Glucose.

Eine weitere Anwendung von -Galactosidase ist das sogenannte blue-white-screening,

bei dem die farblose Verbindung 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-Dgalactopyranosid (XGAL)

als Substratanalogon verwendet wird. Hierbei wird XGAL von der -Galactosidase erkannt

und in Galactose und eine Indoxyl-Verbindung gespalten. Diese wird durch Luftoxidation

in den dunkelblauen Farbstoff 5-Brom-4-chlorindigo überführt (siehe Abbildung 1).

XGAL und -Galactosidase-Aktivität werden seit Jahren in der Molekular- und Mikrobiolo-

gie sehr effektiv für in vivo Screening eingesetzt. Bei der Kultivierung von E. coli mit einer

aktiven -Galactosidase auf XGAL-haltigen Festmedien nehmen die Kolonien die dunkel-

blaue Färbung durch den gebildeten Farbstoff an.

42

Die klassische Anwendung der Blau-Weiß-Selektion liegt in der Detektion von insertierter

(eingefügter) DNA in das lacZ-Gen. Eines der ursprünglichen Probleme bei Klonierungs-

arbeiten war, die wenigen „neuen“ Zellen zu finden, die das gewünschte Fremd-DNA-

Stück („insert“) enthalten und aus Tausenden oder Millionen nicht veränderten Zellen

sicher herauszupicken. Dieses Problem wurde von Joachim Messing (University of

California and Minnesota) gelöst. Messing konstruierte Vektoren (Plasmide und

Bacteriophagen), bei denen das interessierende fremde DNA-Fragment innerhalb des

normalen lacZ-Genabschnitts ein-kloniert werden konnte.

Erfolgt die Klonierung des Inserts erfolgreich in die -Galactosidase-kodierende Sequenz,

wird von der betroffenen Zelle keine intakte -Galactosidase mehr exprimiert. Diese

Zellen wachsen auf XGAL-haltigen Medien und bleiben weiß. Alle Zellen, die kein DNA-

Insert in ihrem lacZ-Gen tragen, färben sich aufgrund der -Galactosidase-Aktivität

dunkelblau. Das Problem, die „richtige“ Zelle (mit der klonierten DNA) zu finden wurde

somit trivial: Man pickt eine weiße Kolonie aus den blauen Kolonien heraus.

In unserem Experiment liegt ein defektes lacZ-Gen, einkloniert im Plasmid pWhitescript

(siehe Abbildung 4), vor. Dieses defekte Gen wird nun durch gezielte Mutagenese wieder

in ein aktives Gen zurückverwandelt. Die Mutation innerhalb des lacZ-Gens von

pWhitescript verursacht einen Austausch von C mit T innerhalb der Protein-kodierenden

Sequenz wodurch aus einem Glutamin-Codon (CAA) ein Stop-Codon (TAA) an der

Aminosäurenposition 9 der -Galactosidase entsteht. Diese Substitutionsmutation

verhindert, bedingt durch einen vorzeitigen Abbruch der Proteinsynthese, die Expression

des intakten Enzyms. Wird diese Mutation wieder revidiert, erhalten wir ein neues Plasmid

(pBluescriptIISK) mit aktiver -Galactosidase. Im lacZ-Gen vom pBluescriptIISK ist das T

also erfolgreich durch C ersetzt worden, wodurch wieder die Aminosäure Nummer 9

Glutamin exprimiert wird.

43

Abbildung 1: Nachweis von -Galactosidase-Aktivität (lacZ-Phänotypen zeigen

sich durch Farbreaktion)

Abbildung 2: Ein Beispiel für Blue-White-Screening von lacZ-Phänotypen auf

XGAL/IPTG-haltigen Platten

Dem durchzuführenden Experiment liegt also eine geringe Abwandlung der Methode des

Blue-White-Screenings zugrunde.

44

Kolonien eines geeigneten E. coli Stammes, welcher das Plasmid pWhitescript enthält,

sind auf XGAL-haltigen Platten farblos bis weiß. Das Ziel ist, aus dem veränderten Stop-

Codon (TAA), durch ortsspezifische Mutation wieder einen Codon für Glutamin (CAA)

herzustellen. Das bedeutet, dass eine einzige der rund 3000 Basen des Plasmids

ausgetauscht werden muss. Bei erfolgreich durchgeführter Mutation und anschließender

Transformation wird das inaktive lacZ--Gen und die damit verbundene inaktive -

Galactosidase wieder in ein aktives lacZ+-Gen und damit in eine aktive -Galactosidase

überführt. Diese Oligonukleotid-vermittelte Mutage-nese erzeugt aus den vorher

ungefärbten Kolonien wieder blaue Kolonien eines lacZ+-Stamms.

Zur Amplifikation steht ein synthetisches Oligonukleotid („QC primer1“) zur Verfügung.

Dieser Primer ist zur Plasmid-DNA-Sequenz in der Umgebung von Codon 9

komplementär (siehe Abbildung 3). Direkt im Codon 9 enthält der Primer eine

Fehlpaarung welche zur Mutation am Zielcodon (fett dargestellt in Abbildung 3) führt: TAA

wird durch CAA ersetzt und die ursprüngliche „Wildtyp“-Sequenz lacZ+ sowie die

Enzymaktivität werden wieder her-gestellt.

Abbildung 3: Mutation von pWhitescript Stop-Codon 9 (lacZ-) in Gln9 (lacZ+)

45

Abbildung 4: Plasmidkarte von pWhitescriptä

2. DNA Isolierung nach der „QiaPrep“ Methode

2.1. Das QIAprep Prinzip

Das QIAprep Minipreparationsverfahren besteht aus zwei grundlegenden Schritten:

Alkalische Lyse der Bakterien

Adsorption der DNA an die QIAprep Membran, Waschen und Elution der Plasmid-

DNA.

2.2. Alkalische Lyse von Bakterien

Das QIAprep-Verfahren verwendet eine modifizierte Methode der alkalischen Lyse von

Birn-boim und Doly. Hierbei werden zuerst die Bakterien unter alkalischen Bedingungen

lysiert. Das Lysat wird im darauf folgenden Schritt gleichzeitig neutralisiert und auf eine,

für die Reinigung an der QIAprep Silicagel-Membran notwendig hohe Salzkonzentration,

eingestellt.

46

2.3. DNA Adsorption an die QIAprep-Membran

QIAprep Säulchen verwenden ein spezielle Silicagel-Membran, welche:

unter hohen Salzkonzentrationen die selektive Adsorption

unter geringen Salzkonzentration die Desorption

der Plasmid-DNA ermöglichen.

Die Kombination des optimierten Puffersystem für die Lyse und dieser speziellen

Membran stellt sicher, dass nur Plasmid-DNA in den Säulchen absorbiert wird. RNA,

zelluläre Proteine und niedermolekulare Stoffwechselverbindungen hingegen binden nicht

an der Membran.

2.4. Waschen und Elution der Plasmid DNA

Salze werden effizient durch einen kurzen Waschschritt mit Puffer PE von der Membran

ent-fernt. Danach kann die hochreine Plasmid-DNA mit Puffer von der QIAprep-Säule

eluiert werden. Diese DNA kann dann in einer Vielzahl verschiedener Anwendungen

eingesetzt werden, wie z. B. Restriktionsverdau, PCR oder Sequenzierungsreaktionen.

2.5. DNA Ausbeute

Die Plasmid-Ausbeute variiert:

in Abhängigkeit mit der Anzahl der Plasmidmoleküle pro Zelle

mit der Größe des Plasmids

durch Zellwachstumsfaktoren

durch das Elutionsvolumen und der Elutionsdauer.

So können 1,5 ml Übernachtkultur können zwischen 5 und 15 mg Plasmid-DNA liefern.

47

3. Miniprep-Protokoll für den „QIAprep spin kit“ unter

Verwendung einer Tischzentrifuge

1. Animpfen einer Übernachtkultur von DH5a mit dem pWhitescript-Plasmid :

10 ml LBAmp-Medium (100 μl/ml Ampicillin) werden mit einer Einzelkolonie des DH5a

pWhitescript angeimpft (steril arbeiten!).

Die Kultur wird über Nacht bei 37°C mit 300 rpm in einem Rotationsschüttler inkubiert.

2. Bakterienernte durch Zentrifugation:

Es werden jeweils 2 ml der Kultur in ein Eppi überführt und die Zellen bei 13.000 rpm

für 30 Sekunden abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird in einem Gefäß

gesam-melt, später autoklaviert und verworfen.

3. Resuspendieren des Zellpellets:

Jedes Zellpellet wird in 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Es sollten anschließend keine

Zellklumpen mehr sichtbar sein.

4. Lyse des Zellpellets:

In jede der resuspendierten Zell-Lösungen wird nun 250 µl Puffer P2 zugegeben.

Die Flüssigkeiten durch vorsichtiges Invertieren der Eppis mischen. Nicht vortexen, da

dies zur Fragmentierung der genomischen DNA führt.

Die Lösung sollte viskos und leicht durchsichtig werden. Die Lyse darf nicht länger als

fünf Minuten stehen bleiben.

Anmerkung zur Lyse des Zellpellets:

Nach der Ernte und Resuspension weden die Bakterienzellen in NaOH / SDS (Buffer P2)

in der Gegenwart von RNase A lysiert. SDS solubilisiert die Phospholipide und Proteine

der Zellmembranen, was zur Auflösung der Zellwand führt. Das Cytosol wird

ausgeschüttet und die Alkalien denaturieren die Proteine wie auch chromosomale und

Plasmid-DNA. Bleiben die Plasmidmoleküle den alkalischen Bedingungen zu lange

ausgesetzt, wird die DNA irreversibel denaturiert. Diese denaturierte Form ist resistent

gegenüber Restriktionsverdau und läuft schneller im Agarosegel als die native Form.

48

Heftiges Schütteln oder Rühren des Lyse-Ansatzes muss vermieden werden, um zu

vermeiden, dass die chromosomale DNA in kleinere Fragmente zerbricht. Unter den

herrschenden Bedingungen könnten diese Fragmente nicht von der Plasmid-DNA

chemisch unterschieden werden. Die Fragmentierung würde also dazu führen, dass die

Plasmide mit anderen DNA-Bruchstücken verunreinigt werden.

5. Herstellung geeigneter Bedingungen zur Adsorption:

Jedem Ansatz werden 350 µl Puffer N3 zugegeben und das Eppi sofort vorsichtig

inver-tiert um die Lösungen zu durchmischen und um lokale Präzipitationen zu

vermeiden.

Die Lösung sollte eine zähflüssige Konsistenz annehmen.

Anmerkung zu den Adsorptionsbedingungen:

Das Lysat wird durch den Zusatz von Essigsäure neutralisiert und gleichzeitig wird eine

hohe Salzkonzentration erzeugt, die für die Adsorption an die Silicagel-Membran

notwendig ist.

Die hohe Salzkonzentration fällt denaturierte Proteine, Zelltrümmer, SDS und

chromosomale DNA aus, während die kleineren Plasmidmoleküle in Lösung bleiben. Es

ist sehr wichtig, dass die Lösungen gut durchmischt werden, um die Fällung zu

vervollständigen.

Die chromosomale DNA ist an die Zellwand gebunden und fällt als unlöslicher Komplex,

der aus Salzen, Detergenzien und Proteinen besteht, aus.

6. Zentrifugation:

Die Zentrifugation wird für 10 min. bei maximaler Geschwindigkeit durchgeführt um

die unlöslichen Bestandteile abzutrennen. Es sollte sich ein kompaktes, weißes

Pellet bilden. Die Plasmid-DNA bleibt im Überstand gelöst.

7. Adsorption der Plasmid-DNA an die Säulenmembran:

Für jede Probe eine QIAprep-Säule in ein 2-ml Sammelröhrchen setzen.

Den Überstand der Zentrifugation in eine QIAprep-Säule pipettieren.

Die Zentrifugation erfolgt für 30 Sekunden mit höchster Geschwindigkeit. Der Durch-

fluss wird verworfen.

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8. Waschen der gebundenen Plasmid-DNA:

Jeweils 75 µl Puffer PE in die QIAprep-Säule pipettieren und 1 min bei maximaler

Geschwindigkeit zentrifugieren.

Den Durchfluss verwerfen.

Die Säule erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugieren um Reste des

Waschpuffers vollständig zu entfernen.

9. Elution der Plasmid-DNA:

Die QIAprep-Säule in ein 1,5 ml Eppi setzten.

Zur Elution werden 50 µl Puffer auf die Mitte der QIAprep-Membran pipettiert. Nach

einer Minute Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird mittels Zentrifugation (1 min,

vmax) die Plasmid-DNA eluiert.

Die Säule wird verworfen.

10. Bestimmung der DNA-Konzentration im Eluat:

Die Konzentrationsbestimmung der Plasmid-Lösung (1:100 verdünnt) erfolgt bei

einer Extinktion von 260 nm im Photometer. Zum Messen wird eine Quarzküvette

verwendet.

Es werden 5 µl des Eluats mit 495 µl Wasser (bidest.) verdünnt um die

Konzentration zu bestimmen. Vor der eigentlichen Messung muss der Blank-Wert

bestimmt werden.

11. Berechnung der Konzentration:

Es wird die Konzentration der gewonnenen Plasmid-DNA bestimmt (1 OD260 = 50

μg

doppelsträngige DNA/ml). Den Verdünnungsfaktor berücksichtigen!

Die Konzentration der isolieren Plasmid-DNA wird auf 40 ng/µl eingestellt.

50

4. Ortsgerichtete Mutagenese

4.1. Einführung

Ortsspezifische Mutation ist eine wertvolle Technik zur Untersuchung von Struktur- und

Funktionsbeziehungen in Proteinen. Zur Durchführung einer solchen Mutation wird in der

Regel einzelsträngige DNA (ssDNA) als Template verwendet.

Mittels des QuikChange ortsgerichteter Mutagenese Kit™ von Stratagene wird die direkte

Einführung einer ortspezifischen Mutation in ein doppelsträngiges Plasmid ermöglicht.

Dies erspart die Umklonierung in Bakteriophagen und die Herstellung von ssDNA. Hinzu

kommt, dass dieses QuikChange-Verfahren keine speziellen Vektoren benötigt und auch

nicht an bestimme Restriktionsstellen geknüpft ist. Dieses schnelle Verfahren erzeugt die

gewünschten Mutanten in wenigen Schritten mit einer Effizienz von mehr als 80 %.

4.2. DNA-Polymerase

Das QuikChange-Verfahren kann verwendet werden:

um Punktmutationen zu erzeugen

um einzelne oder mehrere Aminosäuren auszutauschen, einzufügen oder zu

entfernen

um Restriktionsstellen einzufügen oder zu entfernen

Die Methode wird mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im Thermocycler unter

Verwen-dung einer DNA-Polymerase (Taq- oder Pfu-DNA-Polymerase) durchgeführt.

Die DNA-Polymerase repliziert beide Plasmidstränge mit hoher Geschwindigkeit unter

Ver-wendung der mutagenen Oligonukleotide als Primer (siehe Abbildung 3). Diese sind

zu beiden Strängen des Templats komplementär und werden während der Temperatur-

zyklen von der Polymerase an ihrem 3’-Ende verlängert. Dadurch entsteht, ausgehend

von den Primern, ein mutiertes Plasmid mit zwei gestaffelten Einzelstrangbrüchen am 5’-

Ende.

51

4.3. Verdau mittels DpnI Restriktionsendonuklease

Nach der Amplifikation wird das PCR-Produkt mit dem Restriktionsenzym DpnI behandelt

um restliche, unerwünschte Plasmid-DNA zu entfernen. Die DpnI Endonuklease (Zielse-

quenz: 5’-Gm6ATC-3’) schneidet nur methylierte DNA spezifisch. Somit kann das Enzym

zwischen der isolierten Plasmid-DNA und der in-vitro synthetisierten, mutagenen DNA

unterscheiden. In vivo hergestellte DNA, welche beispielsweise aus E. coli-Stämmen

isoliert wird, ist methyliert und wird deswegen von DpnI abgebaut.

Der doppelstrangbrüchige Vektor mit der gewünschten Mutation wird anschließend in

kompetente DH-Zellen transformiert.

4.4. Primer-Design

Mutagene Primer führen eine spezifische experimentelle Mutation ein. Die mutagenen

Oligo-nukleotide müssen individuell für die jeweils gewünschte Mutation entworfen

werden.

Folgende Überlegungen sollten dem Primer-Design zugrunde liegen:

1. Beide mutagenen Primer müssen die gewünschte Mutation enthalten und sich an die

Zielsequenzen auf den komplementären Strängen des Plasmids anlagern.

2. Die Primer sollten 25 bis 45 Basen lang sein und die Schmelztemperatur (Tm)

mindes-tens 78° C betragen.

Folgende Formel wird üblicherweise für die Berechnung der Tm verwendet:

Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 675/N - %mismatch

Wobei N die Primerlänge in Basenpaaren bedeutet.

3. Die gewünschte Mutation (Deletion oder Insertion) sollte in der Mitte der Primer

liegen,

flankiert von 10 bis 15 Basen der korrekten (komplementären) Sequenz auf beiden

Seiten.

4. Der GC-Gehalt der Primer sollte mindestens 40 % betragen und an beiden Enden

der Primer sollte mindestens eine G- oder C-Base lokalisiert sein.

52

4.5. Überblick

Die schwarzen Punkte kennzeichnen das Gen im Plasmid

mit der Zielsequenz für die Mutation.

Im ersten PCR-Schritt wird die Plasmid-DNA zu Einzel-

strängen denaturiert

Nach einer Absenkung der Temperatur erfolgt die Anlage-

rung (annealing) der mutagenen Oligonukleotide an die

komplementäre Stelle des Einzelstranges.

Im finalen PCR-Schritt verlängert (elongation) die DNA-

Polymerase die Primer und insertiert die Mutation in zirku-

läre Stränge mit Einzelstrangbrüchen.

Diese drei Schritte werden so oft wiederholt, bis genügend

PCR-Produkt vorhanden ist.

Die parentalen, nichtmutierte Template-DNA wird mittels

der Restriktionsendonuklease DpnI verdaut.

Nur der doppelstrangbrüchige Vektor mit der insertierten

Mutation liegt jetzt noch vor.

Dann erfolgt die Transformation der doppelstrangbrüchi-

gen dsDNA in kompetente DH5a-Zellen.

In den Zellen werden die Strangbrüche im mutierten

Plasmid repariert.

53

4.6. Durchführung der PCR-Reaktion

Folgende Reagenzien werden, der Reihenfolge entsprechend, auf Eis in ein PCR-

Reaktions-gefäß pipettiert:

32,50 µl Steriles Wasser

6,00 µl 10 x Puffer Y

1,00 µl MgCl2

2,50 µl pWhitescript ( = 100 ng)

2,00 µl Primer 1 ( = 10 nmol)

2,00 µl Primer 2 ( = 10 nmol)

2,00 µl dNTP-Mix (2,5 mM je Nukleotid)

2,00 µl Taq-Polymerase (ca. 2 U/µl)

50,00 µl Gesamtvolumen

Der Thermocycler nutzt folgendes Programm zur Amplifikation:

Segment Zyklen Temp. [°C] Dauer

1 1 95 3 min

95 30 sec

2 28 51 1 min

72 3 min

3 1 72 7 min

4 1 4 hold

4.7. Durchführung der Restriktion

Es werden 25 µl des amplifizierten PCR-Produktes in ein neues Reaktionsgefäß

überführt. Dann werden 2,0 µl der Restriktionsendonuklease DpnI zupipettiert und der

Reaktionsansatz bei 37 °C für eine Stunde im Thermocycler inkubiert.

54

5. Agarose-Gelelektrophorese

!

Ethidiumbromid (EtBr) ist sehr giftig, reizend, kanzerogen und mutagen!

Beim Umgang damit sind Schutzhandschuhe zu tragen! Alle Geräte, die mit der

Lösung in Berührung gekommen sind, müssen als kontaminiert betrachtet werden.

Der Umgang mit diesem Stoff ist nur an den speziell ausgewiesenen Arbeitsplätzen

erlaubt.

Die Elektrophorese mit einem Agarosegel als Trennmaterial ist eine Standardmethode,

die zur Trennung, Identifizierung und Reinigung von DNA-Molekülen dient. Die DNA wird

mittels dem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid im ultraviolettem Licht

sichtbar.

Die Wanderungsgeschwindigkeit der Nukleinsäuren im Gel hängt von deren Konformation

ab. Die überspiralisierte (supercoiled) Form wandert am schnellsten durch die Poren des

Gels. Dann folgt offene zirkulare DNA (Einzelstrangbruch) und letztendlich die lineare

DNA-Konformation (Doppelstrangbruch). Die Laufstrecke dieser Form steht in einem

direkten Verhältnis zu ihrer Länge in bp. Ebenfalls elektrophoretisch aufgetrennt wird ein

Marker mit definierten Bandengrößen. Durch einen Vergleich dieser Banden (hier: l-

Phagen-DNA mit Hind III verdaut) kann die Größe des Plasmids bestimmt werden.

Mittels Gelelektrophorese wird überprüft, ob die Amplifikation erfolgreich war. Hierzu wird

ein Teil des PCR-Produkts, Template-DNA als Vergleichsprobe sowie ein Marker auf das

Gel geladen.

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Abbildung 5: 0,9 % Agarosegel. (Bahn 1: l-Marker; Bahn 2: Template-DNA;

Bahnen 3+4: PCR-Produkt)

5.1. Durchführung der Gelelektrophorese:

Herstellung der Trenngellösung (0,9 %):

Folgende Zutaten werden in einem Erlenmeyerkolben vermischt:

1. 0,63 g Agarose einwiegen.

2. Mittels einer Messpipette 7 ml TBE-Puffer (10fach konzentriert) zugeben.

3. 63 ml Wasser auf der Waage zugeben.

Die Gellösung wird aufgekocht (Heizplatte oder Mikrowelle) bis die Agarose komplett

gelöst ist.

Gießen und Beladen des Gels:

1. Die offenen Seiten der Gelkammer werden sorgfältig mit Klebeband abgeklebt, wobei

auf korrekten Sitz (speziell an den Stegen) zu achten ist, um ein Auslaufen der Gel-

lösung zu verhindern.

56

2. Die Trenngellösung wird möglichst blasenfrei in die zuvor abgeklebte Kammer einge-

füllt und der Probenkamm in die Lösung gesteckt. Eventuell vorhandene Luftblasen

werden mittels einer Pipettenspitze vorsichtig an den Rand geführt.

3. Nachdem das Gel ausgehärtet ist (ca. 30 min.) wird es in die Elektrophoresekammer

gelegt. Die Apparatur wird bis knapp über den oberen Rand des Gels mit Laufpuffer

(1 x TBE) befüllt. Nun können die Proben in die Geltaschen eingebracht werden.

4. 20 μl des PCR-Produktes werden in ein 1,5 ml Eppendorf-Tube pipettiert, 4 μl Lade-

Puffer zugesetzt und kurz gemischt (Vortexer).

5. Um die an der Wand haftenden Tropfen am Boden des Tubes zu sammeln wird die

Probe wenige Sekunden zentrifugiert.

6. Die Proben (PCR-Produkt, Template-DNA, Marker) werden in jeweils eine Geltasche

pipettiert.

7. Die Kammer mit dem Deckel verschließen. Am Netzgerät eine konstante Spannung

von 100 V einstellen und die Elektrophorese starten.

8. Zwei Farbstoffe im Lade-Puffer zeigen die momentane Lauffront an. Nach ca. einer

Stunde kann die Elektrophorese gestoppt und das Gel im EtBr-Bad angefärbt

werden. Die Aufnahme erfolgt unter UV-Licht.

Durch einen Vergleich mit den Markerbanden wird die Längen der Plasmidfragmente be-

stimmt.

6. Transformation

Das PCR-Produkt wird mittels Temperaturschock in kompetente DH-Zellen transformiert.

Diese Zellen wurden durch Waschvorgänge mit verschiedenen Metallsalzlösungen so

modifi-ziert, dass sie durch einen Temperaturschock Plasmid-DNA ins Zellinnere

schleusen können. Trotz dieser chemischen Behandlung nimmt von etwa einer Million

Zellen nur eine einzige die fremde DNA auf.

Transformation der mutierten Plasmid-DNA:

1. Die kompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut. Ein Wasserbad auf 42 °C

vorgeheizt.

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2. Zu der Zellsuspension wird der komplette Rest des DpnI-verdauten PCR-Produktes

zugegeben und kurz auf dem Vortexer vermischt.

3. Die Zellen werden für 60 Minuten auf Eis inkubiert.

4. Der Hitzeschock der Zellen erfolgt durch die Inkubation für 3 Minuten bei 42 °C im

Wasserbad. Anschließend sofort wieder auf Eis stellen.

5. Die transformierten Zellen werden komplett in 1 ml Flüssigmedium pipettiert und für 1

Stunde bei 37 °C im Schüttler inkubiert.

7. Vorbereiten der Agar-Platten für Blue-White-Screening

Während der Transformation werden die Agarplatten für das Screening der

Transformanten vorbereitet. Nacheinander wird zuerst 40 μl IPTG-Lösung und dann 40 μl

XGAL-Lösung mit einem Trigalski-Spatel (bzw. einer gebogenen Pasteur-Pipette) auf LB-

Ampicillin-Platten ausgestrichen, bis die Flüssigkeit jeweils in das Medium eingezogen ist.

Nach vollendeter Inkubation werden von der Kultur 50, 100 und 200 µl mit einem

Trigalski-Spatel auf den vorbereiteten Agarplatten ausgestrichen.

Die Platten werden über Nacht bei 37° C in einem Brutschrank inkubiert, wobei die Petri-

schalen auf dem Deckel liegen (Beschriftung auf der Unterseite nicht vergessen).

Am nächsten Tag wird überprüft, ob und welche Kolonien gewachsen sind.