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PROBENVORBEREITUNG UND UMGANG MIT BIOLOGISCHEN MATERIALIEN
Gewebehomogenisierung
Potter Elvehjem Homogenisator
Ultraschall‐homogeni‐sator
Blender Hochleistungs‐homogenisator
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Blutabnahme und ‐aufarbeitung • Für größere Mengen an Blut:
• Venipunktion
Blutabnahme und ‐aufarbeitung
• Für größere Mengen an Blut: • Venipunktion (einmalig) oder • Katheder (venflow)
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Blutabnahme und ‐aufarbeitung
• Für größere Mengen an Blut: • Venipunktion (einmalig) oder • Katheder (venflow)
• Für kleinere Mengen: • Kapillarblut (aus der Fingerspitze)
Probennahme: Blut ‐ Gerinnungshemmung
• Heparinplasma (Li‐Heparin) • EDTA‐Plasma (K2EDTA) • Zitrat‐Plasma (3.8% Zitronensäure)
• Serum mit/ohne Trenngel
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Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten
• Zentrifugation (bei relativ niedriger g‐Zahl) • Eventuell Waschen • Weitere Auftrennung (Differential(ultra)zentrifugation)
Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten
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Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine
• Differential(ultra)zentrifugation
Plasma
NaBr- Lösung
VLDL
LDL
HDL
(Ch)
Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine
• Differential(ultra)zentrifugation
• Trennung aufgrund der Dichte • (Chylomikronen, VLDL, LDL, HDL)
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Probenvorbereitung 1. Fettextraktion
2. Spurenelementanalytik
3. Festphasenextraktion (solid phase extraction, SPE) in Hinblick auf LC/MS Analysen
1. Fettextraktion
Soxhlet Fettextraktion
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1. Fettextraktion
Automatische Extraktionsgeräte: Einzelne Schritte (Extraktion, Spülen und Trocknen) lassen sich programmieren Vorteil: die tatsächliche Anzahl an erforderlichen Extraktionszyklen wird auf jeder Position durchlaufen ‐> reproduzierbare Extraktionsbedingungen
1. Fettextraktion
Probenvorbereitung für die Analyse von Fettsäuren
Fettextraktion
eventuell HPTLC der Membranphospholipide
Verseifung der Triglyceridester
Reveresterung der freien Fettsäuren zu Methylfettsäureestern
GC‐Analyse der Methylfettsäureester
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1. Fettextraktion
Rotationsverdampfer
1. Fettextraktion
Accelerated Solvent Extraction (ASE)
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1. Fettextraktion
Accelerated Solvent Extraction (ASE)
2. Spurenelementanalytik
Trockene Veraschung:
Proben werden in geeigneten Gefäßen (Porzellan, Platin) unter
Hitzezufuhr (500‐1000° C) verascht
Zur Bestimmung des Aschegehalts (Differenzwägung)
Zur Bestimmung von Mengenelementen (Na, K, Ca, Mg)
Ungeeignet für die Analyse von flüchtigen Spurenelementen (J, Se)
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2. Spurenelementanalytik
Trockene Veraschung:
Muffelofen
2. Spurenelementanalytik
Nasse Veraschung:
Proben werden unter Zugabe eines Oxidationsmittels verascht (in
der Regel eine Mischung aus H2O2 und HNO3)
Aufschluss erfolgt durch Erhitzung in der Mikrowelle oder unter Hochdruck
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2. Spurenelementanalytik
Nasse Veraschung:
Mikrowellen‐aufschlussgerät
2. Spurenelementanalytik
Nasse Veraschung:
Rotoren und Reaktionsgefäße für Mikrowellenaufschluß
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2. Spurenelementanalytik
Nasse Veraschung:
Hochdruck‐aufschlussgerät
2. Spurenelementanalytik Probennahme
Probennahme
L4
L1
L2
L3
L5
ca. 5 g Lungengewebe von jedem Lungenlappen (Alveolare Region) 5 g Gewebe von Leber und Niere -> tiefgekühlt: -30°C -> gefriergetrocknet -> Mikrowellenaufschluss
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Probenvorbereitung – menschliche Gewebe
0.5 g gefriergetrocknetes Gewebe
gespiked mit 196Pt, 108Pd + 4 mL HNO3 + 1 mL H2O2
Mikrowellenaufschluss 1 min/250W; 1min/0W; je 5 min
250W/400W/600W; 220°C Abrauchverfahren (offen)
Einengen auf 500 µL + 100 µL HF + 2 mL HCl (37%)
Isotopenverdünnungsanalyse (194Pt/196Pt; 195Pt/196Pt; 105Pd/108Pd; 106Pd/108Pd)
Mikrowellenaufschluss 1h, 400W, 220°C
Abrauchverfahren (offen) einengen auf 200 µL; + 2 mL aqua regia einengen auf 200 µL; + 1 mL HCl (37%)
einengen auf 200 µL; + H2O subb; 5 mL Endvolumen
Verdünnung vor dem Messen 1:4; ID‐ICP‐MS
nebulizer
spray chamber plasma torch
extraction lens
sampler cone
skimmer cone
electrostatic analyser
magnetic sector field
ion optics
detector (SEM)
Analytisches set up
Analytisches set‐up: USN 6000AT+ Element 1 Quantifizierung: IDMS (194Pt/196Pt, 195Pt/196Pt)
ICP‐SFMS
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Probenvorbereitung
Probenvorbereitung für spezielle chemische Anforderungen: PFA (Perfluoralkoxy; trade name: Teflon) • Hochreines Polymer (Herstellung erfolgt unter Ausschluss von Weichmachern und Füllstoffen) • sehr gute chemische Beständigkeit gegen fast alle Chemikalien • hohe thermische Stabilität von ‐270°C bis +250°C • extrem glatte Oberflächen herstellbar ‐> leicht zu reinigen ‐> keine memory Effekte • autoklavierbar und sterilisierbar
Probenvorbereitung
Säure Ausdämpf Apparatur: zur Reinigung und Vorbereitung von Probengefäßen in der Ultra‐Spurenanalytik Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen) Säurereinigung
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Probenvorbereitung
Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen)
How does it work? Vapor rises from the bath and condenses on the vessels; droplets carrying impurities and return to the acid bath.
Probenvorbereitung
Säurereinigung: subboiling Reinigung für Säuren (HNO3, HCl) oder H2O
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Probenvorbereitung – Urin
2 g Urin
Gespiked mit 108Pd + Standardaddition
+250µL HNO3, 1000µL H2O2, 500µL HCl, 1240 µL H2O
Abrauchverfahren (offen) einengen auf 200µL + 1 mL HCl (37%)
einengen auf 200 µL 2 g Probenvolumen
UV-Aufschluss
Isotopenverdünnungsanalyse (105Pd/108Pd; 106Pd/108Pd)
Welche Probenvorbereitung ist die richtige?
Manuell oder automatisch?
On‐line oder off‐line?
Verdünnen oder Aufkonzentrieren?
Probenvorbereitung bei der LC/MS Kopplung
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Warum Probenvorbereitung?
Minimierung der Matrixeffekte
Eliminierung von Störsubstanzen
Aufkonzentrieren des Analyten
Verdünnen des Analyten
Belastung des LC/MS Systems wird verringert (geringere Kosten in der Erhaltung)
Genauere Ergebnisse
Probenvorbereitung bei der LC/MS Kopplung
Manuelle oder automatisierte Probenvorbereitung ?
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Automatisierung • Probenvorbereitung: off‐line SPE, LLE Manuell oder automatisiert • Probenvorbereitung: on‐line SPE, mehrdimensionale SPE, Säulenschaltung
SPE is an extraction process
whereby an aqueous sample is filtered through a thin bed of
sorbent particles,
the analytes of interest are removed from the liquid matrix,
and concentrated onto the sorbent.
Once concentrated, the analytes are removed by an eluting
solvent.
Principles of SPE
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
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SPE Column
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
Comparison of LLE vs SPE Disk
LLE
Uses 200 ‐ 500 ml solvent
Shaking / continuous process
Forms emulsions
Little selectivity
Takes 1 ‐ 2 hours / sample
Uses 2 ‐ 20 ml solvent
Filtration process
No emulsions formed
Wide selectivity
(adsorbent)
Takes 10 ‐ 20 min. / sample
SPE disk
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
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What are the Benefits of SPE?
SPE uses less solvent than LLE
SPE is faster (at least 5 times)
High capacity
Total SPE costs are considerably less than LLE
High selectivity: broad choice of bonded phases and solvents
Automation much easier
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
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SPE Column accessories
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
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Silicagel‐Phases Reversed Phase
C18
Adsorption
Si‐OH
Normal Phase
NH2
CN C‐OH(OH)
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
Anion Exchange
N+
NH2
Cation Exchange
C6H5‐SO3H
COOH
SO3H
Biochromatography
WP PEI (NH2)
WP Butyl (C4)
WP CBX (COO)
Sephadex G‐25
Phases
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
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Interactions
Non polar: van der Waals ~20 KJ/mole
Polar: Dipole / Dipole ~ 40 KJ/mole
Hydrogen bond ~40 KJ/mole
Electrostatic: Ionic ~600 KJ/mole!
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
4 Steps in SPE
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
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Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: sample load
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: washing step
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
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Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: elution step
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
Online SPE‐LC
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3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE)
Online SPE‐LC
3. Festphasenextraktion (SPE)
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Proteinfällung
Vorteile:
hohe Wiederfindungsrate bei geeignetem Fällungsreagenz
universell einsetzbar
schnell durchführbar
geringe Fehlerquellen, da keine komplizierten Bauteile oder Schaltungen verwendet werden
Nachteile:
schwer automatisierbar
Ionische Matrix bleibt erhalten ‐> Belastung des LC/MS Systems
Verdünnen (Dilute and Shoot)
Vorteile:
Alle Komponenten bleiben für die Messung erhalten (Analyt und Matrix!)
geringer Aufwand für die Probenvorbereitung
leicht automatisierbar
kostengünstig
Nachteile:
Die Matrix muss chromatographisch abgetrennt werden
Belastung der analytischen Säule und des MS mit der Matrix
hohe Empfindlichkeit des MS erforderlich
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Festphasenextraktion
Vorteile:
leicht automatisierbar
direktes Einsetzen der Probe beim on‐line Betrieb
Abtrennung der Matrix
Nachteile:
schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten
hoher Zeitaufwand beim Einengen des Eluates
Kosten für die Kartuschen (Einmalkartuschen)
höherer Zeitaufwand für die Methodenentwicklung als bei der Proteinfällung
nicht universell einsetzbar
Flüssig‐Flüssig‐Extraktion (LLE)
Vorteile:
kostengünstiger als SPE
schnelleres Einengen des Eluates als bei der SPE
Matrix wird abgetrennt
Nachteile:
schlechter automatisierbar als SPE
schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten
nicht universell einsetzbar