Prüfverfahren-SOP: Phytoplankton-Untersuchungen in ... · Prüfverfahren-SOP: Phytoplankton-Untersuchungen in Oberflächengewässern der Küste (qualitativ und quantitativ) Diese

QUALITÄTSSICHERUNGSSTELLE DES BUND/LÄNDER-MESSPROGRAMMS NORD- UND OSTSEE AM UMWELTBUNDESAMT

Weitergabe an Dritte oder Vervielfältigung ohne Genehmigung der Qualitätssicherungsstelle des BLMP am Umweltbundesamt ist unzulässig.

Muster-Standardarbeitsanweisung für Laboratorien

des Bund/Länder-Messprogramms

Prüfverfahren-SOP: Phytoplankton-Untersuchungen in

Oberflächengewässern der Küste (qualitativ und quantitativ)

Diese Muster-Standardarbeitsanweisung wurde von der Qualitätssicherungsstelle des BLMP in Zusammenarbeit mit der UAG QS Phytoplankton erarbeitet und am

10.12.2008

durch Beschluss der AG Qualitätssicherung verabschiedet.

Die ARGE BLMP hat diese Muster-Standardarbeitsanweisung durch Beschluss am

26.01.2009

als verbindliche Arbeitsgrundlage für das Bund/Länder-Messprogramm Nord- und Ostsee angenommen.

QUALITÄTSSICHERUNGSSTELLE DES BUND/LÄNDER-MESSPROGRAMMS NORD- UND OSTSEE AM UMWELTBUNDESAMT

Diese Standardarbeitsanweisung ist gültig für die am Bund/Länder-Messprogramm Nord- und Ostsee beteiligten und registrierten Laboratorien einschließlich der Qualitätssicherungsstelle des BLMP am Umweltbundesamt, Fachgebiet II 2.5, Standort Berlin.

Anmerkung:

Standard-Arbeitsanweisungen (SOPs) beschreiben die Durchführung bestimmter, immer wiederkehrender Laboruntersuchungen oder sonstige Tätigkeiten, die in der Regel im Qualitätsmanagementhandbuch und/oder den Verfahrensanweisungen nicht näher beschrieben sind. Sie müssen so geschrieben sein, dass sie es einem Mitarbeiter vergleichbarer Qualifikation ermöglichen, das beschriebene Untersuchungsverfahren ohne weitere Hilfe fehlerfrei durchzuführen. Informative Anmerkungen und Beispiele sind, wie hier, grün markiert. Diese Abschnitte sind in der endgültigen Fassung zu löschen.

Abschnitte die auf ihre Gültigkeit zu prüfen und an die Verhältnisse des BLMP-Laboratoriums anzupassen sind, wurden - wie hier beispielhaft - gelb markiert.

Abschnitte in denen in jedem Fall eine laborspezifische Eintragung vorzunehmen ist, wurden – wie hier beispielhaft – rot markiert.

Verfahrensanweisung P-SOP-BLMP-PP_v01.doc

BUND/LÄNDER-MESSPRO-GRAMM NORD- UND OSTSEE

QUALITÄTS-SICHERUNGS-STELLE des BLMP am

Version: 01 Seite: 3 von 69

Gültig ab: <Datum>

Phytoplankton-Untersuchungen in Oberflächengewässern der

Küste (qualitativ und quantitativ) Anlagen: 10

Erstellt Geprüft Freigegeben

Name:

Datum:

Unterschrift:

Prüfverfahren-SOP

SOP-Nr.: P-SOP-BLMP-PP_v01

Phytoplankton-Untersuchungen in Oberflächengewässern der Küste

(qualitativ und quantitativ)

Diese Standardarbeitsanweisung ersetzt die Fassung vom: keine

Arbeitsexemplar Nr.: für QMB Arbeitsplatz

Informationsexemplar (unterliegt nicht dem Änderungsdienst)





Gültig ab: <Datum>



1 Zweck des Verfahrens .............................................................................................6 2 Anwendungsbereich des Verfahrens .....................................................................6 3 Begriffe/Abkürzungen..............................................................................................6 4 Grundlage des Verfahrens ......................................................................................7 5 Bezug zu gültigen Normen ......................................................................................7 6 Geräte ........................................................................................................................8 6.1 Optische Geräte........................................................................................................8 6.1.1 Umkehrmikroskop....................................................................................................8 6.1.2 Aufrechtes Mikroskop..............................................................................................9 6.1.3 Stereomikroskop ......................................................................................................9 6.1.4 Zubehör .....................................................................................................................9 6.1.5 Wartung, Reinigung und Reparatur der optischen Geräte.................................10 6.2 Sonstige Geräte......................................................................................................10 7 Chemikalien ............................................................................................................11 8 Durchführung .........................................................................................................12 8.1 Probenhandhabung, Probenvorbereitung ...........................................................12 8.1.1 Schöpfproben .........................................................................................................13 8.1.2 Netzproben..............................................................................................................16 8.1.3 Lebendproben ........................................................................................................16 8.2 Artbestimmung und Ermittlung der Abundanz ...................................................17 8.2.1 Vorbereitung der Zählkammern (Sedimentation: UTERMÖHL-Technik)...........17 8.2.2 Vereinbarungen für die quantitative Auswertung ...............................................21 8.2.3 Vereinbarungen für die qualitative Auswertung..................................................23 8.2.4 Berechnung der Abundanz....................................................................................23 8.2.5 Planktonzählung mit dem Epifluorezenzmikroskop ...........................................24 8.2.6 Planktonzählung mit dem Stereomikroskop........................................................26 8.2.7 Auswertung von Kieselalgenpräparaten für die Bewertung nach EG-WRRL...27 8.3 Bestimmung des Biovolumens.............................................................................28 8.3.1 Messprinzip.............................................................................................................28 8.3.2 Kalibrierung des Okularmikrometers ...................................................................28 8.3.3 Ermittlung des taxonspezifischen Biovolumens.................................................29 8.3.4 Berechnung des Gesamtbiovolumens.................................................................29 8.3.5 Berechnung des Kohlenstoffgehaltes..................................................................30





Gültig ab: <Datum>



8.4 Angabe und Aufbewahrung der Ergebnisse........................................................31 9 Entsorgung..............................................................................................................32 10 Qualitätssicherung .................................................................................................32 10.1 Verfahrenskenndaten .............................................................................................33 10.2 Rückstellproben......................................................................................................33 10.3 Vergleichsmessungen............................................................................................34 10.4 Spannweitenkontrollkarten....................................................................................34 10.5 Fotodokumentation ................................................................................................35 10.6 Besonderheiten und mögliche Störungen ...........................................................36 11 Mitgeltende Unterlagen ..........................................................................................36 12 Literatur ...................................................................................................................37 13 Liste der Änderungen (optional, eventuell als Anlage).......................................38 14 Anlagen....................................................................................................................38 Anlage 1 Mikroskop-spezifische Daten – Beispiele ............................................................40 Anlage 2 Codes zur Beschreibung der Wind- und Wetterverhältnisse .............................43 Anlage 3 Probenahmeprotokoll – Beispiel ...........................................................................45 Anlage 4 Zählprotokoll, Planktonzählung mittels Stereomikroskop – Beispiel................46 Anlage 5 Ergebnisprotokoll – Beispiel .................................................................................47 Anlage 6 Vermessungsprotokoll – Beispiel .........................................................................48 Anlage 7 Geometrische Körper und Volumenformeln ........................................................49 Anlage 8 Liste der zu verwendenden Bestimmungsliteratur..............................................56 Anlage 9 Hinweise zur Präparation von Diatomeen ............................................................62 Anlage 10 Formblatt zur Erfassung von SOP-Änderungen..................................................69





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1 Zweck des Verfahrens

Zweck des Verfahrens ist die qualitative und quantitative Untersuchung des Phytoplankton-bestandes in Oberflächengewässern der Küste.

2 Anwendungsbereich des Verfahrens

Das Verfahren wird angewendet zur Bestimmung der qualitativen Zusammensetzung des Phytoplanktons (Artenspektrum) und zur Erfassung der Häufigkeiten einzelner Arten oder systematischer Gruppen des Gesamtbestandes an Phytoplankton (Abundanz und Biovolumen) in Oberflächengewässern der Küste.

Phytoplankton im Sinne dieser Untersuchungsvorschrift umfasst die Gemeinschaft sich vorwiegend photoautotroph ernährender Cyanobacteria und Algen, die frei schwebend im Wasser leben. Picoplankter werden nach einer gesonderten Methode erfasst. Frei treibende Matten von Cyanobacteria werden mit dieser Methode nicht erfasst.

3 Begriffe/Abkürzungen

BLMP Bund/Länder-Messprogramm Nord- und Ostsee

BLMP-Laboratorium am Bund/Länder-Messprogramm Nord- und Ostsee beteiligtes Laboratorium

HELCOM Helsinki–Kommission, Kommission zur Durchführung des Helsinki Übereinkommens über den Schutz der Meeresumwelt des Ostseegebietes

NS Normschliff

OSPAR Oslo/Paris–Kommission (auch OSPARCOM), Übereinkommen zum Schutz der Meeresumwelt des Nordostatlantiks

PP Phytoplankton

Picoplankton Algentaxa, die 0,2 – 2 µm groß sind. Kolonien, die aus solchen Zellen bestehen, aber insgesamt größer sind, gehören nicht zum Picoplankton.





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Planktonkammer Zählkammer in der das Phytoplankton sedimentiert und anschließend mikroskopisch ausgezählt wird (Röhrenkammern, kombinierte Platten-kammern)

Spannweitenkontrollkarte Kontrollkarte, die zur Kontrolle der Präzision eines Analyseverfahrens unter wirklichkeitsnahen Bedingungen dient; Kontrollwert ist die relative Spannweite Rrel

Taxon eine als systematisch/taxonomische Einheit erkannte Gruppe von Lebe-wesen (Mehrzahl: Taxa), die auf Grund von fehlenden oder nicht erkennbaren artspezifischen Merkmalen nicht der fachlichen Definition einer Art entsprechen müssen. Deshalb dürfen die Ergebnisse solcher "Taxa" nicht wie Populationen behandelt werden, z. B. hinsichtlich von Ansprüchen gegenüber Umweltfaktoren

4 Grundlage des Verfahrens

Die Phytoplankton-Untersuchungen in Oberflächengewässern beruhen auf der taxonomischen Bestimmung der Algentaxa (Artenspektrum), der mikroskopischen Zählung und der Ermittlung des Biovolumens des Phytoplanktons in sedimentierten Wasserproben mit Hilfe von Umkehr-mikroskopen (Utermöhl-Technik), Aufrechten Mikroskopen und Stereomikroskopen.

5 Bezug zu gültigen Normen

ISO 8036 (2006-05): Optik und Photonik - Mikroskope - Immersionsflüssigkeiten für die Lichtmikroskopie

DIN EN 15204 (2006-12): Wasserbeschaffenheit - Anleitung für die Zählung von Phytoplankton mittels der Umkehrmikroskopie (Utermöhl-Technik); Deutsche Fassung EN 15204: 2006

DIN EN 14996 (2006-08): Wasserbeschaffenheit - Anleitung zur Qualitätssicherung biologischer und ökologischer Untersuchungsverfahren in der aquatischen Umwelt; Deutsche Fassung EN 14996: 2006





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DIN EN ISO 5667-3 (2004-05): Wasserbeschaffenheit – Probenahme – Teil 3: Anleitung zur Konservierung und Handhabung von Wasserproben (ISO 5667-3: 2003); Deutsche Fassung EN ISO 5667-3: 2003

ISO 5667-9 (1992-10): Wasserbeschaffenheit – Probenahme – Teil 9: Hinweise zur Probenahme von Meerwasser

Anmerkung: Diese Auflistung ist ggf. durch weitere Normen zu ergänzen, die sich auf das beschriebene Verfahren beziehen, z. B. die Norm zum Biovolumen, die in der Bearbeitungsphase ist.

6 Geräte

6.1 Optische Geräte

6.1.1 Umkehrmikroskop

- Umkehrstativ

- Objektive: 5 x oder 6,3 x für sehr große Zellen; 10 x; 16 x oder 20 x oder 25 x für die Routinezählung; 40 x für die Überprüfung schwer sichtbarer Merkmale

- Ölimmersions-Objektive: 100 x Oil

- Okulare: 10 x – 20 x

- Zählstreifenokular oder Okular mit Netzgitter

- Phasenkontrasteinrichtung

- Differentieller Interferenzkontrast (DIC)

- Fluoreszenzeinrichtung

- Mikrophotographische Einrichtung/Mikroskopkamera

Anmerkung: Die obige Auflistung beschreibt die Mindestausstattung, die das Labor vorhalten muss.





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6.1.2 Aufrechtes Mikroskop

- Objektive: 5 x oder 6,3 x für sehr große Zellen; 10 x; 16 x oder 20 x oder 25 x für Routinezählungen; 40 x bei kleinen Organismen

- 100 x Ölimmersions-Objektive: für die Überprüfung schwer sichtbarer Merkmale

- Zählstreifenokular oder Okular mit Netzgitter

- Phasenkontrasteinrichtung

- Differentieller Interferenzkontrast (DIC)

- Epifluoreszenzeinrichtung (minddestens mit breiter Grünanregung)

- Mikrophotographische Einrichtung/Mikroskopkamera

6.1.3 Stereomikroskop

- Varioobjektive 7,5 x bis 64 x

- Wasserimmersionsobjektiv 50 x (seewasserfest)

6.1.4 Zubehör

- Okularmikrometer

- Objektmikrometer

- Planktonkammern nach Utermöhl:

Röhrenkammern (kalibrierte Plexiglasröhren mit abschraubbarem, verchromten Messingfuß mit 5 ml, 10 ml oder 25 ml Inhalt) kombinierte Plattenkammern (bestehend aus einer Plattenkammer mit 2,973 ml Inhalt und einem Set von Röhrenkammern mit 10 ml, 50 ml oder 100 ml Gesamtinhalt)

- Kammern nach Kolkwitz für aufrechte Mikroskope und Proben sehr hoher Zelldichte (mehr als ca. 5 Mio Zellen/l) (bestehend aus Objektträger, auf den ein Plexiglasring mit 21 mm Durchmesser und 3 mm Höhe geklebt ist, Gesamtvolumen: 1 ml, Abdeckung )

- Zählkammer nach Bogorov

- Objektträger

- Deckscheiben für Röhren –und Plattenkammern





Gültig ab: <Datum>



- Zählgerät/Zählsoftware

Anmerkung: Die obige Auflistung beschreibt die Mindestausstattung, die das Labor vorhalten muss.

6.1.5 Wartung, Reinigung und Reparatur der optischen Geräte

Die eingesetzten optischen Geräte sind in der Weise zu warten und zu reinigen, dass ein störungsfreier Betriebsablauf gewährleistet werden kann. Grundlage bilden die Bedienungs-anleitungen der Hersteller.

Wartungsverträge wurden nicht abgeschlossen.

Die Reinigung der Objektive erfolgt auf Empfehlung des zuständigen technischen Services entsprechend den Herstellerangaben.

Alle anderen Teile werden mit antistatischen Reinigungstüchern für optische Geräte gesäubert.

Reparaturen werden soweit erforderlich, durch den technischen Service der Herstellerfirma ausgeführt.

Die Wartung der Geräte erfolgt in der Regel im Abstand von 2 - 3 Jahren.

Die Protokolle bzw. Berichte zu Wartungen und Reparaturen werden im “Messgerätebuch” am Arbeitsplatz deponiert.

6.2 Sonstige Geräte

- Arbeitsplatz-PC

- Bildanalyse-Software

- Drucker

- waagerechte Ablagefläche zur Sedimentation

- Messzylinder, Nennvolumen 50, 100 ml mit NS zum Ansetzen von Verdünnungen

Anmerkung: Keine Pipetten verwenden!

- 250 ml-Glasflaschen, klar (Probenflaschen)

- 150 ml-Glasflaschen, klar (Rückstellproben)





Gültig ab: <Datum>



- 50 ml-Glasflaschen, klar (Netzproben)

Anmerkung: Für sehr dichte Proben (mehr als 5 Mio Zellen/l) genügen auch kleinere Flaschen (20 - 50 ml).

- 1 l-PE-Weithalsflaschen (Lebendproben)

- Planktonnetze (10/25/55 µm)

- Probenahmegerät/Schöpfer

Anmerkung: Genaue Gerätebezeichnung des/der Probenahmegeräte ergänzen!

- Kühlschrank/Kühlraum

- Eppendorfzentrifuge

- Eppendorfgefäße

- Ultraschallgerät <Bezeichnung>

- Heizplatte

- Bechergläser

- Mikromanipulator

- 60 µm Sieb

- antistatische Reinigungstücher

7 Chemikalien

Alle eingesetzten Chemikalien entsprechen, wenn nicht anders angegeben, dem Reinheitsgrad p. A.

- Aqua dest./Reinstwasser

- 20 %ige gepufferte Formaldehyd-Lösung: 500 ml 35 - 40 %ige wässrige Formaldehyd-Lösung, (Formalin, HCHO) wird mit 500 ml deionisiertem H2O verdünnt und mit 100 g Hexamethylentetramin versetzt, so dass man eine 20 %ige neutrale bis schwach alkalische Formaldehyd-Lösung erhält (anstelle von Hexamethylentetramin kann auch Borax verwendet werden)





Gültig ab: <Datum>



Anmerkung: Käufliche Formaldehydlösung enthält bis zu 15 % Methanol – welches die Haltbarkeit sehr stark beeinträchtigt!

- Borax (Natriumtetraborat, Na2B4O7 • 10 H2O)

- 25 %ige wässrige Glutaraldehyd-Lösung für cyanobacteriareiche Picoplanktonproben (HCO(CH2)3CHO)

Anmerkung: Die käuflich erwerbbare Glutaraldehyd-Lösung sollte in 20 ml-Portionen eingefroren aufbewahrt werden.

- Saure Lugolsche Lösung: Aqua dest. 100 g Kaliumiodid (KI) 50 g Iod, sublimiert (I2) 100 ml Eisessig (konz. CH3COOH)

100 g Kaliumiodid in 1000 ml Aqua dest. lösen, 50 g Iod zugeben, bis zur Lösung schütteln und 100 g Eisessig zugeben. Die Lösung in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur aufbewahren (Haltbarkeit: 1 Jahr).

- Ethanol (zur Entfettung der Kammern)

- Immersionsöl nach ISO 8036

- Einbettungsmittel: Naphrax (Lösemittel Toluol, Brechungsindex n. D. 1,69)

- Toluol

- 30 %iges Wasserstoffperoxid (H2O2)

- konz. Salzsäure (HCl)

- Phosphatpuffer: 2 g Na2HPO4 • 2 H2O und 0,2 g KH2PO4 in 100 ml H2O, pH 7,5

8 Durchführung

8.1 Probenhandhabung, Probenvorbereitung

Für die Phytoplanktonanalyse wird grundsätzlich eine Schöpfprobe untersucht. Netz- und Lebendproben können im Bedarfsfall zusätzliche Informationen liefern.





Gültig ab: <Datum>



Es sind die allgemeinen Forderungen an die Probenahme zu beachten (siehe SOP <Bezeichnung>). Für jede Probenahme wird eine Person (Fahrtleiter) festgelegt, die den Einsatz vorbereitet, die Arbeiten koordiniert und für das Einhalten der Arbeitsanweisungen verantwortlich ist.

Vor jeder Probenahme sind alle Einsatzgeräte zu überprüfen. Bei längeren Einsätzen ist ge-eigneter Ersatz mitzuführen. Zur Beschreibung der Probenahmeverhältnisse sind die Codes zur Beschreibung der Wind- und Wetterverhältnisse zu verwenden (siehe Anlage 2).

8.1.1 Schöpfproben

Probenahme

Die Probenahme erfolgt grundsätzlich mit einem Wasserschöpfer (z. B. Ruttner-, Friedinger- oder Van-Dorn-Fallschöpfer, Limnos-Schöpfer, Hydrobios-Rosettenschöpfer).

Anmerkung: Sollte davon abgewichen werden, ist der Nachweis zu erbringen, dass die eingesetzte Probenahmetechnik vergleichbare Ergebnisse liefert.

Für die Hubschrauber-Probenahme sind Oberflächenmischproben zu entnehmen, da eine gezielte Tiefenprobenahme nicht möglich ist. Mit dem Hubschrauber werden Oberflächen-proben aus ca. 1 m Wassertiefe entnommen. Der Hubschrauber schwebt nach Aufsuchen der Position mehrere Meter über der Probennahmestelle. Ein 5 l-Wasserschöpfer wird herabge-lassen und zügig auf 1 m Wassertiefe abgesenkt. Durch die relativ kleine Öffnung füllt sich der Wasserschöpfer relativ langsam. Ist der Wasserschöpfer gefüllt, wird er wieder nach oben in den Hubschrauber gezogen, wo umgehend die Abfüllung der Planktonproben und die Messung der vor-Ort-Parameter erfolgt.

Für die Durchführung der Probenahme ist die für das Untersuchungsprogramm verbindlich vorgeschriebene Strategie zu verwenden. Das gilt insbesondere bei der Teilnahme an nationalen und internationalen Überwachungsprogrammen bzw. bei der geplanten Weitergabe von Daten an derartige Programme, da hierbei für die Aussagekraft der Werte vergleichbare Probenahmen und Zählungen vorausgesetzt werden müssen.

Entsprechend der Tiefe und des Schichtungsverhaltens des zu untersuchenden Gewässers ist eine ausreichende Anzahl von Tiefenstufen zu beproben. Als optimale Probenahmemethode wird die Mischprobenahme mit einem integrierenden bzw. summierenden Schöpfer empfohlen. In vollständig durchmischten flachen Gewässern kann auf die Erfassung von Tiefenstufen





Gültig ab: <Datum>



verzichtet werden und stattdessen eine Oberflächenprobe (0 – 1 m) und ggf. eine Tiefenprobe (1 m über Grund) analysiert werden. Da allerdings auch in Küstengewässern regelmäßig eine Schichtung auftreten kann (insbesondere Haloklinen, im Sommer Thermoklinen), ist diese im Vorfeld zu bestimmen, um die Probenahmestrategie den aktuellen Bedingungen anzupassen. Die einfachste Bestimmung stellt dabei ein Vertikalprofil der Temperatur dar. Zusätzlich können andere Parameter genutzt werden. Bei erkennbarer Schichtung sollte minimal jede Schicht einmal beprobt werden.

Neben der Beprobung von festen Tiefenhorizonten ist eine zusätzliche Beprobung des saisonal unterschiedlich lokalisierten Chlorophyll a-Maximums (Bestimmung über Fluoreszenzsonde möglich) zu empfehlen.

Für die mikroskopische Phytoplanktonanalyse können die Proben verschiedener Tiefenstufen zu Mischproben vereinigt werden.

Die Probenahme zur Analytik der Nährstoffe und der Chlorophyll a-Konzentration erfolgt aus der gleichen Schöpfprobe bzw. aus Unterproben der einzelnen Tiefenhorizonte bzw. aus den Mischungsansätzen.

Festlegung der Tiefenhorizonte:

Sind die Tiefenhorizonte nicht durch das Untersuchungsprogramm standardisiert (z. B. HELCOM, OSPAR), sind bei Gewässertiefen von mehr als 10 m die von der HELCOM empfohlenen Tiefenhorizonte zu verwenden (1 m, 2,5 m, 5 m, 7,5 m, 10 m bzw. 1 m, 5 m, 10 m, 15 m und 20 m). In potentiell geschichteten Gewässern unter 10 m Wassertiefe sind mindestens zwei Tiefenstufen festzulegen.

Herstellen einer Mischprobe:

Die entnommenen Proben aus den einzelnen Tiefenstufen werden in einem Gefäß (Kanister, Eimer) gesammelt. Zuvor muss das Gesamtvolumen aller Proben (Volumen Chlorophyllbe-stimmung, Lebendprobe, Nährstoffprobe, Phytoplankton-Lugol-Probe, Diatomeenpräparations-probe usw.), die als Mischproben über diesen Tiefenbereich abgefüllt werden sollen, errechnet werden. Die gleiche Menge Probenwasser sollte als Reserve und Spülwasser berücksichtigt werden. Aus der Summe wird die benötigte Wasserprobenmenge je Tiefenstufe bestimmt. Dabei ist aus jeder Tiefenstufe das gleiche Volumen zu berücksichtigen. Die Art und Weise der Mischung ist im Protokoll festzuhalten.





Gültig ab: <Datum>



Das Sammelgefäß sollte möglichst im Schatten stehen oder abgedeckt werden. Durch vorsichtiges Schwenken (Empfehlung: mindestens 2 Minuten) wird die Mischprobe in dem Gefäß homogenisiert, um eine gleichmäßige Verteilung der Algensuspension zu gewährleisten. Die Proben werden anschließend mit einem Messbecher in die einzelnen beschrifteten Probengefäße gefüllt. Es empfiehlt sich, das „Restwasser“ für unvorhergesehene Störfälle in das Labor zu transportieren.

Anmerkung: Hier sind für Routineuntersuchungen (Monitoring) die Tiefenstufentabelle je Mess-station aufzuführen. Außerdem sollte hier jedes Labor festschreiben, wie und wann die Erfassung der Schichtung erfolgt und welche alternativen Schritte der Probennehmer vor Ort veranlassen muss (Oberflächenprobe/Tiefenprofil).

Fixierung:

Die als Probengefäße für die Schöpfproben eingesetzten verschließbaren klaren 250 ml-Glasflaschen werden bereits vor der Probenahme mit Saurer Lugolscher Lösung (1 ml/100 ml) versetzt, um lokale Über- oder Unterkonzentrationen des Fixiermittels zu verhindern (die Probe muss eine kognakartige Färbung annehmen).

Die Flaschen werden nicht vollständig mit dem Probengut gefüllt (80 %), um bei der Bearbeitung im Labor die Möglichkeit der Durchmischung der Probe zu gewährleisten.

Es ist darauf zu achten, dass es beim Füllen der Flaschen nicht zum Überlaufen und damit zum Verlust des Fixiermittels kommt.

Das Fixiermittel dient außerdem dazu, die Algen schwerer zu machen, da sich das Jod in die Zellen einlagert und die Sedimentation in den UTERMÖHL-Kammern erleichtert.

Sollen Fluoreszenzuntersuchungen durchgeführt werden, sind Unterproben mit gepuffertem Formaldehyd (Endkonzentration: 1 %) zu fixieren. Diese Unterproben müssen innerhalb ca. 1 Woche analysiert werden (Dinoflagellaten: innerhalb max. 1 d). Optional kann Glutaraldehyd (1 % Endkonzentration) verwendet werden, wenn die Probe nicht innerhalb einer Woche aufgearbeitet werden kann.

Lagerung

Die entnommenen Proben sind kühl (unter 20 °C, aber frostsicher) und dunkel aufzubewahren. Die Proben sind baldmöglichst zu verarbeiten. Im Protokoll ist die Lagerzeit anzugeben.





Gültig ab: <Datum>



Die Lagerzeit lugolfixierter Proben darf bis zur Zählung 12 Monate nicht überschreiten. Die Proben müssen in dieser Zeit vierteljährlich auf Entfärbung kontrolliert werden. Gegebenenfalls ist nachzufixieren.

Rückstellproben, die länger aufbewahrt werden sollen, werden nach der Zählung zusätzlich mit 20 %iger gepufferter Formaldehyd–Lösung fixiert (4 % Endkonzentration).

8.1.2 Netzproben

In Verantwortung des Prüfleiters wird zusätzlich zu den Schöpfproben an festgelegten Stationen ein Netzfang über eine Wassersäule von 0 – 20 m durchgeführt. Die Netzproben dienen der Vervollständigung des Gesamtartenspektrums und der Bestimmung schwieriger Arten.

Für die Fänge wird ein Phytoplanktonnetz (Maschenweite 10 bzw. 25 bis max. 55 µm) eingesetzt. Als Probengefäße für die Netzproben werden 50 ml-Klarglasflaschen genutzt.

Die Netzfänge werden mit gepuffertem Formaldehyd (Endkonzentration: 4 %) fixiert.

Die fixierten Proben sind kühl (unter 20 °C) und dunkel zu lagern.

Um Verschleppungseffekte zu vermeiden, ist die gründliche Reinigung der Netze sehr wichtig und erfolgt nach Gebrauch umgehend mit warmem bis heißem Leitungswasser. Dem Spülwasser kann ein Reinigungsmittel (z. B. Geschirrspülmittel) zugesetzt werden. Das Netz wird einige Zeit darin gelagert und in Abständen gut von innen und von außen durchgespült. Danach muss das Netz mit fließendem Leitungswasser nochmals sehr gründlich ausgewaschen werden. Anschließend frei hängend zum Trocknen aufbewahren. In der Sonne getrocknete Planktonnetze werden mit der Zeit brüchig, unausgewaschene Netze verkrusten. Feucht in Plastikbeutel eingewickelte Netze und Schnüre schimmeln.

8.1.3 Lebendproben

Da sich einige Phytoplanktontaxa durch die Fixierung deutlich verändern und/oder große Arten in der fixierten Probe zu gering vertreten sind, wird vor der Fixierung bestimmten, durch den Prüfleiter festgelegten Proben Lebendmaterial entnommen. Das Lebendmaterial kann im Kühlschrank bis zu 24 h gelagert werden und wird in einem geeigneten mikroskopischen Verfahren (z. B. Stereomikroskopie, Tauchverfahren) auf veränderliche Arten untersucht.

Zur Erfassung der großen Noctiluca-Zellen und Phaeocystis-Kolonien dient eine Schöpfprobe gemäß den Anforderungen aus Abschnitt 8.1.1. Die Probenahme erfolgt jeweils bei Tidenhoch- und Tidenniedrigwasser (maximale Abweichung: ± 30 min) mit einem 10 l-Schöpfeimer





Gültig ab: <Datum>



(Oberflächenwasser). Aus diesen 10 Litern wird noch vor Ort eine Teilprobe (Lebendprobe) von 1 Liter in eine PE-Weithalsflasche abgefüllt. Je nach Dichte der zu zählenden Organismen wird im Labor ein Volumen von 50 bis 1000 ml durch Sieben über 60 µm-Gaze konzentriert und anschließend mit dem Stereomikroskop im Dunkelfeld ausgezählt. (siehe Abschnitt 8.2.6). In diesem Ansatz werden zusätzlich die Zellzahlen großer Kieselalgen wie Odontella sinensis und Coscinodiscus wailesii, C. concinnus und C. granii ermittelt.

Prüfung auf große und seltene Taxa mittels Tauchimmersionsverfahren:

Die mit dem Tauchimmersionsverfahren zu untersuchenden Phytoplanktonproben werden mit 20 µm- und 80 µm-Planktonnetzen (nach Apstein der Fa. Hydrobios) entnommen. Dazu werden die Netze bei sehr reduzierter Fahrtgeschwindigkeit etwa 5 Minuten geschleppt. Die jeweilige Planktonprobe wird in 250 ml-Glasflaschen gefüllt. Falls die Ausbeute sehr gering ist (nur eine leicht braune Färbung des Konzentrats) wird das Netz ein zweites Mal geschleppt.

Im Labor wird eine Unterprobe der jeweiligen 20 µm- und 80 µm-Probe unter dem Binokular auf große und seltene Taxa hin durchgesehen und die Häufigkeitsverteilung der Taxa ermittelt.

Je eine zweite Unterprobe von etwa 10 ml wird in eine Petrischale überführt. Darin lässt man die Organismen ca. eine halbe Stunde absetzen. Die Probe soll nicht zu dicht sein, da sich die Algen sonst überlagern. Mit dem Wasserimmersionsobjektiv (50 x) wird die Probe entlang regelmäßiger Transekte (von links nach rechts bzw. von oben nach unten) durchgesehen. Falls ein Taxon durch seine Lage nicht richtig identifiziert werden kann, wird es durch leichtes Schütteln in die richtige Lage gebracht. Die Algen werden soweit möglich bis zum Art-Niveau bestimmt. Diese Untersuchung wird sowohl in der 20 µm-Probe als auch in der 80 µm-Probe durchgeführt. Einzelheiten, wie Befall mit Parasiten, Sexualstadien, Dauersporen, häufige oder massenhaft auftretende Taxa, werden notiert.

8.2 Artbestimmung und Ermittlung der Abundanz

8.2.1 Vorbereitung der Zählkammern (Sedimentation: UTERMÖHL-Technik)

Die Temperatur der lugolfixierten Schöpfproben ist etwa 24 h vor dem Ansatz an die Raum-temperatur anzugleichen.

Anschließend wird die Probe vorsichtig über Kopf rotiert, um die Plankter in der Flüssigkeit gleichmäßig zu verteilen.





Gültig ab: <Datum>



Eine Teilmenge der zu untersuchenden Phytoplanktonprobe wird direkt aus der Probenflasche (nicht pipettieren!) in eine entsprechend der zu erwartenden Phytoplanktondichte ausgewählte Sedimentationskammer überführt. Zur Anwendung kommen in der Regel Volumina von 3, 5, 10, 25 und 50 ml. Sehr dichte Proben, z. B. aus inneren Küstengewässern, müssen ggf. mit Wasser verdünnt werden.

Die Sedimentationskammer wird nach dem Füllen mit einer Verschlussplatte unter Vermeidung von Luftblasen abgedeckt. Die Verschlussplatte ist behutsam, waagerecht und ohne Verschiebungen der Sedimentationskammer aufzulegen, um Verwirbelungen in der Probe zu vermeiden. Die Bildung eines Luftraumes am oberen Ende der Röhrenkammer ist zu vermeiden.

Die verschlossene Sedimentationskammer wird vorsichtig auf einen mittels einer Libelle waagerecht eingestellten Tisch verbracht und dort erschütterungsfrei, temperaturkonstant unter Vermeidung direkter Sonneneinstrahlung gelagert.

Folgende Sedimentationszeiten sind einzuhalten:

3 ml: > 8 h

5 ml: > 8 h

10 ml: > 8 h

25 ml: > 12 h

50 ml: > 24 h

100 ml: > 48 h

Nach der Sedimentationszeit wird der Aufsatz von der Plattenkammer getrennt, indem mit einer Deckscheibe der Röhrenkammeraufsatz vorsichtig so abgeschoben wird, dass die Deckscheibe anschließend blasenfrei auf der Plattenkammer liegt. Um das Abschieben und das blasenfreie Verschließen zu erleichtern, wird vorher etwas Aqua dest./Reinstwasser zwischen Plattenkammer und Röhrenkammeraufsatz gespritzt.

Für eine quantitative Sedimentation kleiner Nanoplankter (< 5 µm Durchmesser) darf die Röhrenhöhe die 5-fache Länge des Kammerdurchmessers nicht übersteigen.

Der Rest der Proben wird weiter aufbewahrt, falls ein erneutes Ansetzen der Proben notwendig wird.





Gültig ab: <Datum>



Die Sedimentationskammern sind nach Beendigung der Zählung sofort mit Leitungswasser und einer weichen Bürste zu reinigen, um ein Antrocknen von Organismen am Rand zu vermeiden. Die Sedimentationskammern werden mit einem geeigneten Reinigungsmittel (z. B. Geschirr-spülmittel) gesäubert. Alle Teile der Kammer werden abschließend mit Aqua dest./Reinstwasser gespült und an der Luft getrocknet. Bei hartnäckigen Verschmutzungen sind die Bodengläser zu wechseln.





Gültig ab: <Datum>



Durchführung der Zählung

Die Zählung muss innerhalb von 4 Tagen stattfinden (einschließlich Sedimentationszeit). Ist das in Ausnahmefällen nicht möglich, sind die verschlossenen Plattenkammern in feuchtigkeits-gesättigter Luft zu lagern. Dazu ist die Kammer mit einem feuchten sauberen Tuch vorsichtig abzudecken. Sedimentierte Proben, die nicht innerhalb von 4 Tagen gezählt werden und nicht abgedeckt wurden, sind zu verwerfen.

Vor Beginn der Zählung ist bei geringer Vergrößerung zu prüfen, ob die Verteilung der sedimentierten Algen auf dem Kammerboden gleichmäßig ist; falls das nicht der Fall ist, muss die Probe neu angesetzt werden. Ebenso sind die angesetzten Proben zu verwerfen, in denen sich größere Luftbläschen gebildet haben.

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt mindestens bei zwei verschiedenen Vergrößerungen: kleine Taxa bei hoher Vergrößerung (200 x /400 x), große bei kleinerer Vergrößerung (100 x /200 x).

Das Auszählen der Phytoplanktontaxa erfolgt mit Hilfe einer Zählstreifeneinrichtung (z. B. Zählstreifenokular oder Netzgitter) und eines Zählgerätes. Beim Einblick in das Okular mit Netzgitter erkennt man 2 parallele Begrenzungslinien im Gesichtsfeld. Diese Linien bilden den Zählstreifen.

Zur Vermeidung eines zu großen Zählaufwandes für häufig bis massenhaft vorkommende Taxa wird ein kleinerer Sedimentationsaufsatz verwendet, die Probe verdünnt oder eine entsprechend kleinere Fläche ausgezählt.

Die Verdünnung sollte unter Verwendung eines verschließbaren graduierten Messzylinders mit einem relativ großen Volumen z. B. 100 ml (siehe 6.2) erfolgen. Bei Seewasserproben ist für die Verdünnung filtriertes (Porenweite: 0,45 µm), isotonisches, möglichst entgastes Seewasser (ggf. künstliches) zu verwenden.

Gezählt werden alle Individuen eines Taxons, die sich zwischen den, den Zählstreifen bildenden, beiden parallelen Linien befinden und zwar dann, wenn das zu erfassende Taxon beim Verschieben des Objekttisches die zu dem Zählstreifen senkrecht verlaufende Linie im Zählstreifenokular/des Netzgitters überschreitet. In diesem Moment wird die Taste des Zählgerätes betätigt. Dabei ist darauf zu achten, dass die Richtung dieser Begrenzungslinien genau mit der Vorschubrichtung des Kreuztisches übereinstimmt.





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Erstellung einer Zählliste

Vor Beginn jeder Zählung wird die Probe zunächst auf den vorhandenen Artenbestand durchgesehen. Die Erhebung des Artenspektrums ist ein wesentlicher Bestandteil des Untersuchungsprogramms. Das Artenspektrum der Probe wird tabellarisch aufgeführt und dient als Basis für das Ergebnisprotokoll. Die Ergebnisse der taxonomischen Arbeit werden im Ergebnisprotokoll (siehe Anlage 5) dokumentiert.

Anhand der Auflistung der vorgefundenen Taxa wird in Abhängigkeit vom Untersuchungs-programm durch den Bearbeiter festgelegt, welche Phytoplanktontaxa gezählt und gemessen werden.

8.2.2 Vereinbarungen für die quantitative Auswertung

Die Zählstrategie soll sowohl kleinzellige als auch großzellige Taxa sicher erfassen.

Eckpunkte der Zählstrategie sind:

− Das zu untersuchende Kammervolumen richtet sich nach der Menge der sedimentierenden Partikel und nach dem Untersuchungsprogramm/ -ziel.

− Es sind mindestens 50 Individuen jedes dominanten, biomasserelevanten Taxons zu zählen. Idealerweise ist eine Gesamtzahl von mindestens 500 Individuen pro angesetzte Zählkammer zu erreichen. Es gibt folgende alternative Zählstrategien:

• Auszählen von nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Feldern (Gesichtsfelder): Diese müssen jedoch mehr oder weniger gleichmäßig über den Kammerboden verteilt sein. Die Anzahl muss aus statistischen Gründen mindestens 20 betragen und insgesamt genügend Zellen der dominierenden Arten enthalten (100 oder 400 ergeben nach Poissonverteilung einen Vertrauensbereich von ± 20 % bzw. 10 %.

• Auszählen von Ausschnitten (z. B. Zählstreifen, halbe Kammern): Die mit dem Zählokular überstrichene Fläche muss so groß sein, dass sie für die Grundfläche der Zählkammer repräsentativ ist.

• Auszählen des gesamten Kammerbodens: Bei geringen Dichten des Phytoplanktons oder für das Auszählen großer Arten, deren Verteilung in der Kammer möglicherweise nicht dem Zufall entspricht, ist der gesamte Kammerboden auszuzählen.

− Die Zählung von Taxa mit einem weiten Größenspektrum erfolgt entweder nach festge-legten Größenklassen (z. B. HELCOM) oder durch Ermittlung der Gesamtzellzahl des





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Taxons unter Bestimmung der aktuellen mittleren Zellgröße (siehe Biovolumenbestimmung Abschnitt 8.3).

− Bei Planktern, die zwar die Begrenzungslinie des Zählstreifens berühren, sich aber teilweise außerhalb des Zählstreifens befinden, werden auf der einen Seite des Zählstreifens konsequent alle Organismen, die die Begrenzungslinie berühren, mitgezählt, unabhängig davon, ob der größere Teil des jeweiligen Individuums innerhalb oder außerhalb des Zählstreifens liegt. Beim zweiten Markierungsstrich werden nur die Organismen mitgezählt, die innerhalb des Zählstreifens liegen und den Markierungsstrich nicht berühren.

− Bei einzeln lebenden Formen (z. B. Flagellaten), aber auch bei nur in lockeren Kolonieverbänden lebenden Taxa (z. B. Diatoma elongatum) werden Individuen bzw. Zellen gezählt und diese Bezeichnung der Zähleinheit ins Protokoll übernommen.

− Bei fadenbildenden Formen, deren Einzelzellen gut erkennbar sind, werden Einzelzellen gezählt. Bei fadenförmigen Organismen, bei denen die Zellgrenzen nicht ohne weiteres zu erkennen sind (z. B. fädige Cyanobacteria), kann man auch Zähleinheiten festlegen, die zum Abstand der Markierungsstriche des Zählstreifens in Beziehung gesetzt werden können. So werden z. B. Fadenlängen in Einheiten von 100 µm erfasst. Zur Berechnung werden die Einzellängen der Trichome (Fadenstücke) aufsummiert.

− Coenobien sind als eine Einheit und nicht als Einzelzellen auszuzählen. So wird, falls nur ein Teil des Coenobiums innerhalb des Zählfeldes liegt, das gesamte Coenobium in die Zählung aufgenommen.

− Bei Microcystis sp. und anderen Taxa, die Kolonien mit sehr vielen Zellen (> 100 pro Kolonie) bilden und deren Zellzahl deshalb nicht direkt ermittelt werden kann, werden durch Fokussieren repräsentative Teilkolonien von bis zu 100 Zellen gezählt und je nach Größe der Gesamtkolonie die Anzahl der Zellen abgeschätzt. Zur Erleichterung der Zellzählung kann in einer Teilprobe durch Ultraschall-Behandlung der Zerfall der Kolonien gefördert werden. Dabei ist darauf zu achten, dass die zu zählenden Zellen nicht geschädigt werden. Die Teilprobe wird mit dem Ultraschallgerät <Bezeichnung> zweimal 15 min bei 40 °C mit 35 kHz bei 100 % behandelt.

Achtung: empfindliche Arten können bei der Ultraschallbehandlung zerstört werden, deshalb immer nur eine Teilprobe oder eine separate zusätzliche Probe





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behandeln. Durch anschließendes leichtes Schütteln der Probe wird nochmals homogenisiert.

Bestehen solche Kolonien aus sehr kleinen Zellen (< 2 µm), die mit den zur Zählung verwendeten Vergrößerungen nicht ausgezählt oder abgeschätzt werden können, müssen durchschnittliche Zellzahlen je Kolonie (10 - 30 Kolonien) unter 1000facher Vergrößerung mit Kontrastverfahren oder epifluoreszenzmikroskopisch ermittelt werden. Diese Zellzahl je Kolonie wird mit der Koloniezahl multipliziert. Eine Anwendung von Literaturdaten ist ebenfalls möglich.

8.2.3 Vereinbarungen für die qualitative Auswertung

Für die korrekte Bezeichnung der Taxa ist die im Rahmen des BLMP abgestimmte Artenliste in ihrer jeweiligen aktuellen Fassung zugrunde zu legen.

Die Artbestimmung der Diatomeen erfolgt anhand von Schalenpräparaten, da Diatomeen in der Sedimentationskammer nicht sicher bestimmt werden können. Bei Bedarf wird deshalb dieses Verfahren für die Erstellung vollständiger Artenlisten herangezogen und für die spätere Ermittlung der Arten in einem Diatomeenschalenpräparat als relativer Anteil an einer Größen-klasse bestimmt und anschließend dem Zählergebnis der gleichen Größenklasse proportional zugeordnet, um das Biovolumen einzelner Taxa insgesamt zu erfassen. Dafür sind mindestens 200 Diatomeenschalen zu erfassen.

8.2.4 Berechnung der Abundanz

Die Abundanz ist in Individuen/l anzugeben:

Anmerkung: Jedes Labor gibt hier die Umrechnung für die im Labor verwendeten definierten Teilvolumina an.

Die Anzahl der gezählten Einheiten/Liter bzw. Einheiten/dm3 Seewasserprobe (Abundanz) ergibt sich durch Multiplikation der Anzahl tatsächlich gezählter Einheiten mit dem Koeffizienten C, der nach folgender Formel berechnet wird:

VaA

VaNAdmC

∗∗

=∗∗

∗=−

21

3 10001000][





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A: Querschnittsfläche des oberen Zylinders der Sedimentationskammer; gewöhnlich A ≈ 500 mm2 bei Ø = 25 mm

a1: Fläche eines einzelnen Feldes oder Zählstreifens (Breite in µm * genau 10 mm Länge)

a2: gesamte ausgezählte Fläche (a1 * N)

N: Anzahl der gezählten Felder oder Zählstreifen

V: Volumen (cm3) der sedimentierten (Teil-)Probe

Der Koeffizient C ist demnach abhängig vom Volumen der Sedimentationskammer, von der Streifenbreite sowie von der gewählten Vergrößerung.

Das Endergebnis der Zählprozedur enthält ein Artenspektrum mit Angabe der Zellzahl bzw. Zähleinheit/Liter für jedes gezählte Taxon.

8.2.5 Planktonzählung mit dem Epifluoreszenzmikroskop

Die Abundanz sehr kleiner Zellen, z. B. des Picoplanktonkolonien, muss für einige Gewässer durchgeführt werden, weil deren Anteil an der Biomasse > 10 % sein kann. Das trifft auf die inneren Küstengewässer der südlichen Ostseeküste, viele weitere Ästuare und andere flache hoch eutrophe Seen zu. Für Kolonien aus sehr kleinen hyalinen Zellen ist die Epifluoreszenz-mikroskopie ebenfalls ein geeignetes Mittel, die durchschnittliche Zellzahl je Kolonie zu be-stimmen. Einige Algenfamilien, insbesondere die Dinophyceen und Chryophyceen, weisen keine Pigmentierung auf, so dass sie von ihrer Funktion her nicht zum Phytoplankton gehören. Diese An- oder Abwesenheit einer Pigmentation ist in lugolfixierten Proben jedoch oft schwer feststellbar, kann aber epifluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden.

Da es sich bei den Untersuchungsobjekten vor allem um kleine und abundante Zellen handelt, genügen kleine Probenvolumina von 20 – 100 ml zur Aufbewahrung. Die Zellen können entweder unfixiert (< 1 d Aufbewahrung im Kühlschrank), mit gepuffertem Formaldehyd fixiert (Endkonzentration: 1 – 2 % Formaldehyd, Aufbewahrung im Dunkeln < 7 d) oder mit Glutar-aldehyd fixiert (Endkonzentration: 1 – 2 %, Aufbewahrung im Dunkeln einige Monate) analysiert werden.

Zur Überprüfung der Pigmentation und bei Kolonien mit wenigen Zellen wird die Probe auf-konzentriert (1 ml Probe in einem Eppendorf-Gefäß bei 5000 U/min in einer Eppendorf-zentrifuge für 5 – 10 min zentrifugieren). Ein Tropfen der aufkonzentrierten Probe wird auf einen Objektträger gegeben, mit einem Deckglas abgedeckt und bei 1000 x Vergrößerung (Öl-





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immersion) untersucht. Alternativ kann die Probe in einer Sedimentierkammer aufkonzentriert werden und mit einem entsprechend ausgestatteten inversen Mikroskop analysiert werden. Für die Untersuchung soll die Vergrößerung mindestens 600x sein und mit einem Öl- oder Wasser-immersionsobjektiv erfolgen, da andernfalls schwache Chlorophyll a-Fluoreszenzen übersehen werden können.

Für quantitative Bestimmungen, wie dem Auszählen des Picoplanktons, kleiner Nanoplankter oder sehr großer Kolonien, eignet sich neben der Sedimentation in Kammern und einem inversen Mikroskop auch die Filtration eines definierten Volumens (0,5 – 10 ml) auf geschwärzten Kernspurmembranen (z. B. Isopore von Sigma-Aldrich, Porengröße 0,2 µm, 25 mm Durchmesser). Dieser Filter wird mit Immersionsöl auf einem Objektträger fixiert, mit weiterem Öl und einem Deckglas abgedeckt und bei 1000 x Vergrößerung (Ölimmersion) aus-gezählt.

Für alle Algenfamilien eignet sich eine breite Grünanregung. Da jeder Hersteller eine völlig andere Nomenklatur der Filterblöckchen anwendet, muss an Hand der Filterkenndatenblätter diejenige Ausstattung gewählt werden, deren Emssionsseite möglichst breitbandig ist, um die Lichtausbeute zu maximieren. Der Teilerspiegel kann eine Wellenlänge von 570 - 590 nm je nach Hersteller haben. Die Pigmente der meisten Algenfamilien sind außerdem auch mit einer breiten Blauanregung sichtbar, da sowohl Chlorophyll a als auch akzessorische Pigmente zur Fluoreszenz beitragen. Nur Cyanobakterien lassen sich so nicht sichtbar machen, da das Chlorophyll a bei ihnen eine sogenannte Blauanregungslücke aufweist und keine passenden akzessorischen Pigmente vorhanden sind.

Die Quantifizierung der Zellen auf den Filtern oder dem Kammerboden erfolgt mittels eines Okularnetzes bekannter Größe. Es werden mindestens 20 gleichmäßig über den Durchmesser der Kammer oder des Filters verteilte Gitternetzflächen oder ggf. eine bestimmte Anzahl von Teilflächen im Netz ausgezählt. Es sind insgesamt mindestens 100 Zellen im Okularnetz zu zählen. Anschließend wird auf die Gesamtfläche des Filters bzw. das darauf filtrierte Volumen hochgerechnet:

Abundanz [ml] NetzanzahlNetzflächeVFilterFFixFgezZ

∗∗∗∗

=

gezZ: insgesamt gezählte Zellen

FixF: Fixierungsmittelfaktor (z. B. 1 ml Fixierungsmittel auf 20 ml Probe ergibt einen Faktor von 1,05)





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FilterF: benetzbare Filterfläche (bei einem Durchmesser von 21 mm ergibt sich eine Fläche von 346,4 mm2)

V: filtriertes Volumen [ml]

Netzfläche: eines Okularnetzes mit 100 Kästchen (bei 1000facher Vergrößerung einem Tubusfaktor von 1,0 und 10 x Okularen ergibt sich eine Fläche von 0,01 mm2 bzw. 10.000 µm2)

Netzanzahl: mind. 20

8.2.6 Planktonzählung mit dem Stereomikroskop

Dieses Verfahren wird zur Abschätzung der Phytoplanktonentwicklung in tidebeeinflussten Küstengewässern (Wattenmeer) eingesetzt.

Ausgangsmaterial ist die 1 l-Teilprobe (Lebendprobe) aus einer 10 l-Schöpfprobe (siehe Abschnitt 8.1.3)

Im Labor wird mit Hilfe eines Standzylinders eine Probenmenge zwischen 100 und 1000 ml abgemessen. Das Volumen richtet sich nach der optisch erkennbaren Planktondichte; das anschließende Einengen des gewählten Volumens auf ca. 15 – 20 ml soll eine übersichtliche Bearbeitung im Zählrahmen nicht beeinträchtigen.

Das abgemessene Volumen wird vorsichtig über ein 60 µm-Sieb (Siebgröße abhängig vom Untersuchungsziel) filtriert. Der Siebrückstand wird dann mittels einer mit sterilfiltriertem Seewasser gefüllten Spritzflasche in eine 30 ml-Kristallisierschale gespült.

Von dort aus wird die Lebendprobe in eine Bogorov-Zählkammer überführt; bei Bedarf werden noch vorhandene Reste aus der Kristallisierschale mit wenig filtriertem Seewasser nachgespült.

Die Probe wird unter einem Stereomikroskop der Firma <Name> mit Vergrößerungen zwischen 7,5 x und 64 x (Varioobjektiv) entlang des mäanderförmigen Zählstreifens abgesucht, wobei wegen der Schichtdicke ein Durchfokussieren notwendig ist. Hierbei werden die größeren Planktonarten (ab ca. 50 µm) bestimmt und gezählt und bei Phaeocystis globosa bzw. P. pouchetii die Koloniegröße gemessen.

Die Ergebnisse sowie der Gesamteindruck der Probe werden im Zählprotokoll festgehalten.

Im Bedarfsfall werden einige Arten zur genaueren Bestimmung mit einer Pasteurpipette ent-nommen.

Danach kann die Probe verworfen werden; die Geräte werden mit Leitungswasser gereinigt.





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8.2.7 Auswertung von Kieselalgenpräparaten für die Bewertung nach EG-WRRL

Diese Methode wird vorwiegend im limnischen Bereich eingesetzt.

Diatomeen können in der Sedimentationskammer nicht sicher bestimmt werden. Deshalb wird der Anteil der Arten in einem Diatomeenschalenpräparat als relativer Anteil an einer Größenklasse bestimmt und anschließend dem Zählergebnis der gleichen Größenklasse proportional zugeordnet.

Als Ausgangsmaterial dient 0,5 bis 1 l Schöpfprobe aus dem gleichen Schöpfer aus dem auch die lugolfixierte Probe für die quantitative Utermöhl-Analyse gewonnen wurde. Die Präparation erfolgt je nach Aufgabenstellung entsprechend der in der Anlage 9 beschriebenen Vorgehens-weise.

Für das Bewertungsverfahren des Phytoplanktons der Fließgewässer werden nur die solitären zentrischen Diatomeen (Centrales) ausgezählt. Die Auswertung von 200 Schalen (einschließlich leere Schalen) ist nur dann erforderlich, wenn die solitären Centrales-Arten (ohne Aulacoseira, Melosira) nach der Auswertung der lugolfixierten Probe einen prozentualen Anteil von mehr als 15 % (+ 5 %) ausmachen. Beträgt der prozentuale Anteil < 15 % werden die Centrales-Arten als Sammelgruppe in Größenklassen gemeldet.

Die Auswertung erfolgt an einem Lichtmikroskop bei 400 x bis 1000 x Vergrößerung unter Einsatz des Phasenkontrastverfahrens oder DIC (Differenzieller Interferenzkontrast). Um die Zuordnung der im Präparat ermittelten relativen Artzusammensetzung zu Zellzahl und Bio-volumen zu ermöglichen, erfolgt die Auszählung der solitären zentrischen Diatomeen in den gleichen Größenklassen wie die quantitative Auszählung dieser Gruppe in den Plankton-kammern nach Utermöhl am Umkehrmikroskop. Zur Ermittlung des Biovolumens wird das Zähl-ergebnis nach Utermöhl mit einem Standardzellvolumen je Größenklasse multipliziert und aus der Summe aller Größenklassen erhält man das Biovolumen der solitären Centrales.

Da Schalen der Centrales mit < 5 µm Durchmesser nur sehr schwach verkieselt sind und damit Bestimmungsmerkmale fehlen, wird die Größenklasse „zentrische solitäre Diatomeen < 5 µm“ nicht nach Arten aufgeschlüsselt.

Nachdem die relative Artenzusammensetzung in den Schalenpräparaten ermittelt ist, wird das Ergebnis der taxonomischen Zusammensetzung auf die quantitativen Ergebnisse der Utermöhl-Zählung aus den gleichen Größenklassen übertragen. Im Endprotokoll werden die Größen-klassen durch die Artbiovolumina ersetzt.





Gültig ab: <Datum>



Anmerkung: Die aktuelle Vorschrift für das Seenbewertungsverfahren nach WRRL kann folgender Literaturquelle entnommen werden (Kapitel 2.6): Nixdorf, B.; Hoehn, E.; Riedmüller, U.; Mischke, U.; Schönfelder, I. & M. Bahnwart (2008): Anforderungen an Probenahme und Analyse der Phytoplanktonbiozönosen in Seen zur ökologischen Bewertung gemäß der EU-WRRL. In: Mischke, U. & B. Nixdorf (Hrsg.), Gewässerreport (Nr. 10), BTUC-AR 2/2008, ISBN 978-3-940471-06-2, Eigenverlag BTU Cottbus, 147-184.

8.3 Bestimmung des Biovolumens

8.3.1 Messprinzip

Um zunächst das spezifische Biovolumen in µm³ der ausgezählten Taxa zu bestimmen, werden diese näherungsweise als möglichst einfache geometrische Körper betrachtet (siehe Anlage 7). Falls erforderlich, wird die dritte (nicht sichtbare) Dimension mit Proportionalitätsfaktoren zur Länge oder Breite geschätzt, so dass nur höchstens zwei Dimensionen gemessen werden müssen. Die Messung der zur Volumenberechnung notwendigen Dimensionen (Länge L, Breite B, Höhe H und Durchmesser D,) erfolgt mit einem Okularmikrometer, indem die zu messende Achse mit der Skala des Okulars zur Deckung gebracht wird.

Es ist der in der BLMP-Artenliste vorgegebene geometrische Körper zugrunde zu legen.

8.3.2 Kalibrierung des Okularmikrometers

Vor seiner Verwendung muss das Okularmikrometer mit Hilfe eines Objektmikrometers kalibriert werden. Bei Verwendung einer Bildanalysesoftware sind die Angaben des Software-Herstellers zu beachten.

Die Skala des Okularmikrometer ist in 100 gleiche Teile unterteilt, deren Wertigkeit je nach Objektiv-Vergrößerung unterschiedlich ist. Aus den Skalenwerten ergeben sich für jede Vergrößerung Umrechnungsfaktoren, die jeweils für die eingesetzten Mikroskope zu ermitteln sind.

Bestimmung der Umrechnungsfaktoren:

Die Skala des Objektmikrometers ist 1 mm lang und in 100 gleiche Teile eingeteilt. Der Abstand der Teilstriche beträgt 10 µm. Indem die Skala des Okularmikrometers mit der Skala des Objektmikrometers zur Deckung gebracht wird, kann der Skalenwert (S) = Umrechnungsfaktor des Okularmikrometers für jede Objektivvergrößerung bestimmt werden:





Gültig ab: <Datum>



S [µm] = ometerOkularmikr

ometerObjektmikr

eSkalenteiln]µm[10eSkalenteiln ∗

8.3.3 Ermittlung des taxonspezifischen Biovolumens

Die Längs- und Querdimensionen des Organismus werden als Anzahl der Striche der Skala des Messokulars abgelesen, durch Multiplikation mit dem für die jeweilige Vergrößerung ermittelten Umrechnungsfaktor in µm umgerechnet und in die entsprechende Volumenformel eingesetzt.

Auf dieser Basis werden die spezifischen Biovolumina mit Hilfe der Laborsoftware <Bezeichnung der Software> ermittelt. Das entsprechende Handbuch liegt am Arbeitsplatz vor.

Für die einzelnen Größenklassen mit festen Dimensionsgrenzen sowie für die wenig größen-variablen Taxa ist es erlaubt, Standardbiovolumina für das artspezifische Zellvolumen zu ver-wenden, die aus eigenen Vermessungen oder aus der Literatur entnommen sind. Wurden die größenvariablen Taxa nicht in Größenklassen ausgezählt, ist immer die Ermittlung des mittleren taxonspezifischen Zellvolumens durch die Vermessung erforderlich.Dabei werden in Abhängigkeit von Größenschwankungen die Dimensionsachsen von mindestens 20 Einzel-individuen des gleichen Taxons vermessen. Dieser Standardwert kann auch für weitere Termine verwendet werden. Eine Überprüfung der verwendeten Standardzellvolumina (d. h. Er-gänzung von neuen Messungen und damit eine neue Mittelwertberechnung) ist immer dann erforderlich, wenn ein Taxon über 50 % des Gesamtbiovolumens bildet sowie bei allen größen-variablen Taxa. Bei sehr größenvariablen Taxa sind bis zu 50 Individuen zu vermessen. Zudem gelten oben genannte Vereinbarungen zur Zählung der Organismen auch für die Vermessung.

Ein subjektives Auswählen einzelner Zellen oder Individuen ist zu vermeiden. Daher sind z. B. bei Einzelzellen immer die ersten 20 Organismen eines Taxons zu vermessen. Bei Coenobien, Kolonien und Zellfäden sind möglichst viele Zellverbände zu berücksichtigen.

Ein Protokoll für die Vermessung ist der SOP als Anlage 6 beigefügt.

8.3.4 Berechnung des Gesamtbiovolumens

Die Berechnung des Gesamtbiovolumens pro Taxon erfolgt durch Multiplikation der Anzahl der betreffenden Individuen des Taxons/l (siehe Abschnitt 8.2) mit dem taxonspezifischen Biovolumen (µm³), das zuvor (siehe Abschnitt 8.3.3) ermittelt bzw. durch spezielle Listen vorgegeben wurde (z. B. HELCOM).





Gültig ab: <Datum>



Diese Biovolumenberechnung ist für jedes einzelne Taxon durchzuführen. Das Ergebnis wird in mm³ l-1 angegeben.

Die Biovolumenberechnung erfolgt mit Hilfe der Laborsoftware <Bezeichnung der Software>

Das für jede Probe zu ermittelnde Gesamtbiovolumen [mm³ l-1] ergibt sich aus der Summe der für jedes Taxon separat ermittelten Biovolumina und wird in [mm³ l-1] angegeben.

Es steht als wichtiges Endergebnis auf dem Ergebnisprotokoll (Anlage 5).

8.3.5 Berechnung des Kohlenstoffgehaltes

Der Kohlenstoffgehalt des Phytoplanktons wird nach Menden-Deuer and Lessard (2000) berechnet. Dieses Verfahren erfordert keine gesonderte Berechnung des Plasmavolumens und berücksichtigt die Abnahme des spezifischen Kohlenstoffgehalts mit der Zellgröße. Auf Grund der Größenabhängigkeit ist der Kohlenstoffgehalt für jedes Taxon und Größenklasse separat zu berechnen.

Die Berechnung des Kohlenstoffgehalts (C) der einzelnen Zelle erfolgt mit folgender Formel:

CZelle [pg] = 0,216 ∗ BiovolumenZelle [µm3] 0,939

Bei Kieselalgen erfolgt die Berechnung des Kohlenstoffgehalts der einzelnen Zelle mit folgender Formel:

CZelle [pg] = 0,288 ∗ BiovolumenZelle [µm3] 0,811

Wenn Zellaggregate gezählt werden, muss die Berechnung auf Grund der Größenabhängigkeit auf die Einzelzelle zurückgeführt werden. Dabei ist zwischen der Zählung von Kolonien (z. B. 100 Zellen von Microcystis) und Filamenten (z. B. 100 µm-Stücke von Nodularia) zu differenzieren. Bei Filamenten muss die Zell-Länge bekannt sein.

Die Berechnung des Kohlenstoffgehalts pro Zähleinheit erfolgt bei mehrzelligen Kolonien mit folgender Formel (gilt nicht für Diatomeen!):

CZähleinheit [pg] = 0,939

Zellzahl][µm BiovolumenZellzahl0,216

tZähleinhei

3tZähleinhei

tZähleinhei ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∗∗

Die Berechnung des Kohlenstoffgehalts pro Zähleinheit erfolgt bei Filamenten mit folgender Formel:





Gültig ab: <Datum>



CZähleinheit [pg] = 0,939

Länge]µm[Länge][µm Biovolumen

Länge0,216

tZähleinhei

eEinzelzell3

tZähleinhei

eEinzelzell

tZähleinheiLänge⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ∗∗∗

Unter Berücksichtigung der Abundanz wird der Kohlenstoffgehalt pro Taxon wie folgt berechnet:

CTaxon [µg l-1] = C [pg Zelle-1] ∗ AbundanzTaxon [Zellzahl l-1] / 1.000.000

bzw. bei mehrzelligen Kolonien und Filamenten

CTaxon [µg l-1] = C [pg Zähleinheit-1] ∗ AbundanzTaxon [Zähleinheit l-1] / 1.000.000

8.4 Angabe und Aufbewahrung der Ergebnisse

Das Ergebnisprotokoll (Anlage 5) für die untersuchte Seewasserprobe (Schöpf- oder Netzprobe) enthält folgende Angaben:

- Probennummer,

- Bezeichnung der Probenahmestation,

- Datum der Probenahme,

- Zähldatum/Bearbeitungsdatum

- Name des Bearbeiters (Probenehmer)

- Kammervolumen,

- Artenspektrum,

- Abundanzen [Individuen l-1],

- individuenspezifisches Biovolumen (in µm3 ohne Nachkommastelle),

- Biovolumen [mm3 l-1] für jedes gezählte Taxon (mit maximal 3 Nachkommastellen),

- Gesamtbiovolumen [mm³ l-1] für die Probe (mit maximal 3 Nachkommastellen),

- Zusammenfassung der gezählten Taxa zu bestimmten taxonomischen Phytoplanktongruppen mit den entsprechenden Biovolumen [mm³ l-1] und Individuenzahlen [Individuen ml-1]

- C-Gehalt [pg Taxon-1]





Gültig ab: <Datum>



Die Ergebnisprotokolle (Anlage 5) und die ausgedruckten Messprotokolle (Anlage 3, 4 und 6) werden geordnet nach den untersuchten Küstengewässern 5 Jahre archiviert.

Anmerkung: Die Aufbewahrungszeit von 5 Jahren ist eine Mindestanforderung; längere Aufbe-wahrungszeiten sind möglich.

9 Entsorgung

Lugolfixierte Schöpfproben:

Die fixierten Schöpfproben werden ins kommunale Abwassernetz entsorgt.

Formalin- und Glutaraldehydfixierte Proben:

Die fixierten Proben werden nach der Analyse in einem verschließbaren und als solchen gekennzeichneten Abfallbehälter aufgefangen, der bei Bedarf durch die Firma <Firmenbezeichnung> entsorgt wird.

Unfixierte Lebendproben:

Die unfixierten Lebendproben werden ins kommunale Abwassernetz entsorgt.

10 Qualitätssicherung

Grundsätzlich:

- Schulung und Einweisung der Bearbeiter

- Sicherstellung der personellen Kontinuität

- Verwendung geeigneter und hochwertiger Materialien und Geräte (z. B. optisches Gerät)

Probenahme:

- Regelmäßige Wartung der Ausrüstung

- Gegenseitige Überprüfung der Arbeitsabläufe (Audit)

Probenbearbeitung:

- Regelmäßige gegenseitige Überprüfung der Restproben durch unterschiedliche Bearbeiter





Gültig ab: <Datum>



- Teilnahme an Ringversuchen

Anmerkung: Siehe hierzu auch Kapitel 10.3!

Taxonomie:

- Interne Standardisierung (taxonomische Bezeichnung, taxonomische Ebene, Zähl-genauigkeit, verwendete Bestimmungsliteratur)

- Interne gegenseitige Überprüfung der Bestimmung insbesondere in Zweifelsfällen oder beim ersten Auftreten einer Art

- Bei „Problemtaxa“ Überprüfung einer Bestimmung durch Kollegen anderer Institutionen bzw. durch einen auf diese Phytoplanktongruppe spezialisierten Taxonomen

- Regelmäßige Recherche nach neuer relevanter Literatur

- Teilnahme an Taxonomie-Workshops

- Teilnahme an Ringversuchen

- Einrichtung und Pflege einer internen Fotodokumentation

10.1 Verfahrenskenndaten

Bei 100 gezählten Individuen liegt der obere und untere 95 %-Vertrauensbereich bei ca. 20 %.

10.2 Rückstellproben

Rückstellproben für qualitative Beweissicherungen sind zwingend erforderlich. Diese Proben sind mit gepuffertem Formaldehyd zu fixieren (siehe Abschnitt 8.1).

Rückstellproben sind mindestens 3 Jahre aufzubewahren.

Anmerkung: Jedes Labor muss entsprechende Kriterien für die Auswahl der Rückstellproben festlegen und in diesem Abschnitt erläutern. Die Aufbewahrungszeit für Rückstellproben von 3 Jahren ist eine Mindestanforderung; längere Aufbe-wahrungszeiten sind möglich.





Gültig ab: <Datum>



10.3 Vergleichsmessungen

Es werden regelmäßig Mehrfachzählungen (ein Ansatz wird von verschiedenen Bearbeitern gezählt) vorgenommen und die Ergebnisse in Spannweitenkontrollkarten festgehalten.

Alternativ können auch Mehrfachansätze (aus einer Probe werden zwei Unterproben zum Sedimentieren angesetzt) verwendet werden, in denen die Arten zu bestimmen und zu zählen sind. Die Ergebnisse werden ebenfalls in Kontrollkarten festgehalten.

Das Labor nimmt regelmäßig an den von der Qualitätssicherungsstelle oder anderen internationalen Organisationen angebotenen Ringversuchen teil.

Die Ergebnisse der Teilnahme werden mittels Teilnahmebescheinigung und Ergebnisberichten dokumentiert und in einer Laborbesprechung ausgewertet.

Die entsprechenden Unterlagen, einschließlich der Ergebnisse, befinden sich beim QM-Beauftragten des Labors.

Anmerkung: Jedes Labor muss Festlegungen für die Durchführung von Vergleichsmessungen treffen und in diesem Abschnitt erläutern.

10.4 Spannweitenkontrollkarten

Die Analysenqualität wird durch das Führen von Qualitätskontrollkarten überwacht. Zur Qualitätskontrolle von quantitativen Phytoplanktonuntersuchungen ist die Spannweitenkontroll-karte geeignet. Sie dient zur Kontrolle der Präzision eines Verfahrens. Es werden sowohl Matrixeinflüsse als auch Schwankungen in der Verfahrensstabilität erfasst. Als Spannweite R wird hierbei die Differenz zwischen dem größten und dem kleinsten Einzelergebnis bei Mehrfachanalyse einer Probe bezeichnet. Dabei ist es ausreichend, die einfachste Form der Spannweitenkontrollkarte einzusetzen, nämlich die mit nur einer Doppelbestimmung.

Als Kontrollwert wird die prozentuale relative Spannweite Rrel herangezogen.

Als Kontrollproben werden reale Proben aus der Routineanalytik verwendet. Dabei soll mindestens jede 10. zu bearbeitende Probe als Kontrollprobe deklariert werden. Die Auswahl der Kontrollprobe erfolgt vor der Analyse nach dem Zufallsprinzip. Es sollte bei der Auswahl der Probe jedoch darauf geachtet werden, dass sowohl die Konzentration als auch die Probenmatrix das gesamte Spektrum der routinemäßig untersuchten Proben abdecken.

Der Kontrollwert Rrel wird mit Hilfe von Kontrollkriterien, den Kontrollgrenzen, bewertet.





Gültig ab: <Datum>



Die Spannweitenkontrollkarte kann entweder mit statistisch ermittelten Kenngrößen (obere Warn- und Kontrollgrenze), resultierend aus einer Vorperiode, oder mit einem vorgegebenen Qualitätsziel (z. B. maximal zulässige relative Spannweite als obere Ausschlussgrenze) geführt werden.

Anmerkung: Die Kontrollkriterien können auch vom Auftraggeber vorgegeben werden.

Eine Kontrollperiode umfasst in der Regel 30 Kontrollanalysen. Die Kontrollwerte Rrel werden vor der Freigabe der Analysenergebnisse arbeitstäglich in die Spannweitenkontrollkarte eingetragen und auf Außerkontrollsituationen hin überprüft. Zeigt die Kontrollkarte eine Außerkontrollsituation für das zu überwachende Analysenverfahren an, muss eine umfassende Ursachenanalyse erfolgen. Ist die Fehlerquelle erkannt und beseitigt, wird der letzte Kontrollwert erneut erarbeitet und geprüft.

Die zur Ursachenklärung durchgeführten Maßnahmen müssen dokumentiert werden.

Analysenergebnisse von Proben dürfen nur dann freigegeben werden, wenn keine Außerkontrollsituation mehr vorliegt.

Der Kontrollwert Rrel basiert auf der Berechnung des Gesamtbiovolumens (mm3/l).

Die Erarbeitung der Kontrollwerte soll an mindestens einer der am häufigsten und einer der am wenigsten vertretenen Arten erfolgen.

Der Kontrollwert Rrel wird durch einen Untersucher erarbeitet, der eine Teilprobe (Zählkammer) aus der gleichen Probe nach oben genannten Kriterien analysiert (Wiederholpräzision).

Anmerkung: Zu Einsatz, Erstellung, Führung und Auswertung einer Spannweitenkarte ist das Vorgehen, wie es in den „Strategien für die Wasseranalytik: Verfahrens-entwicklung, Validierung und Qualitätssicherung in der Routine“ insbesondere unter Punkt 5 und 6 (DEV Bd.1) bzw. im AQS-Merkblatt (A-2) beschrieben wird, anzuwenden.

10.5 Fotodokumentation

In bestimmten Fällen ist es sinnvoll, das Probenmaterial an Hand von Fotos zu dokumentieren und entsprechend zu archivieren.

Bei der Fotodokumentation ist darauf zu achten, dass bestimmungsrelevante Merkmale deutlich erkennbar sind. Nach Möglichkeit sollten die kompletten Organismen bzw. bestimmungs-relevante Merkmale vollständig auf den Fotos zu sehen sein. Bildunterschriften sind mindestens





Gültig ab: <Datum>



mit Gattungs- und Artbezeichnung oder, falls nicht möglich, der nächst höheren Bezeichnung zu versehen. Wichtige Bestimmungsmerkmale sind, wenn möglich, zu markieren. Es ist unbedingt eine genaue Größenangabe zu machen bzw. ein Größenmaßstab zu verwenden.

10.6 Besonderheiten und mögliche Störungen

Methodische Fehler:

- Unzulänglichkeiten in der Probenahmetechnik

- Entmischung der Proben bei der Lagerung

- Erschütterungen während der Sedimentationszeit

- Nicht waagerechte Aufstellung der Sedimentierkammer

- Luftblasen in der Plattenkammer

- Einrichtungen an den Organismen, die das Sedimentieren erschweren (Gasvakuolen, Schwebefortsätze)

- Unregelmäßigkeiten in der Sedimentverteilung auf dem Kammerboden

- Fehlbestimmungen

Zufällige Fehler - statistische Zählfehler:

Diese werden durch Faktoren verursacht, die nicht beeinflussbar sind, bedingt durch den Stichprobencharakter der Untersuchungen.

Ungleichverteilung des Phytoplanktons im Gewässer:

Zur statistischen Bewertung der Ergebnisse, insbesondere zur Abschätzung der methodischen und zufälligen Fehler s. Literatur in 5 (ATT-Technische Informationen).

11 Mitgeltende Unterlagen

Liste gültiger Standardarbeitsanweisungen (SOPs)

BLMP-Artenliste Phytoplankton in ihrer jeweiligen aktuellen Fassung

Anmerkung: Auflistung der zusätzlichen Unterlagen, die für die Ausführung des Verfahrens relevant sind (z. B. gesetzliche Regelungen, Normen und Vorschriften, Spezifikationen, Verträge, andere Verfahrensabläufe und Arbeitsanweisungen





Gültig ab: <Datum>



usw.). Bei Bedarf ergänzen.

12 Literatur

- Arbeitsgemeinschaft Trinkwassertalsperren e.V. (1999): Erfassung und Bewertung von Phytoplanktonorganismen. ATT Technische Informationen Nr.7 Oldenbourg-Verlag, ISBN 3-486-26369-2.

- HELCOM, Baltic Marine Environment Protection Commission (2004): Checklist of Baltic Sea Phytoplankton Species. Baltic Sea Environment Proceedings No. 95.

- AQS-Merkblatt (2004): zu den Rahmenempfehlungen der Länderarbeitsgemeinschaft Wasser (LAWA) für die Qualitätssicherung bei Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchungen Kontrollkarten (A-2), AQS 13. Lfg. IV/06.

- Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser Abwasser- und Schlammuntersuchung (2000): Strategien für die Wasseranalytik: Verfahrensentwicklung, Validierung und Qualitätssicherung in der Routine, Bd.1, Wiley-VCH, Beuth Verlag, 48. Lieferung.

- Manual for Marine Monitoring in the COMBINE Programme of HELCOM Annex C-6 Phytoplankton species composition, abundance and biomass http://www.helcom.fi/groups/monas/CombineManual/AnnexesC/en_GB/annexes/.

- Menden-Deuer, S.; Lessard, E. J. (2000): Carbon to volume relationsships for dinoflagellates, diatoms and other protist plankton. Limnol. Oceanogr. 45: 569-579.

- Mischke, U.; Behrendt, H. (2007): Handbuch zum Bewertungsverfahren von Fließgewässern mittels Phytoplankton zur Umsetzung der EU-WRRL in Deutschland Weißensee Verlag Ökologie, ISBN 978-3-89998-105-6

- Mischke, U.; Nixdorf, B.(Hrsg.) (2008): Bewertung von Seen mittels Phytoplankton zur Umsetzung der EU-WRRL, BTUC-AR 2/2008, ISBN 978-3-940471-06-2





Gültig ab: <Datum>



- Olenina, I., Hajdu, S., Andersson, A.,Edler, L., Wasmund, N., Busch, S., Göbel, J., Gromisz, S., Huseby, S., Huttunen, M., Jaanus, A., Kokkonen, P., Ledaine, I., Niemkiewicz, E. (2006): Biovolumes and size-classes of phytoplankton in the Baltic Sea. Baltic Sea Environment Proceedings No.106, 144pp. Paper: http://www.helcom.fi/stc/files/Publications/Proceedings/bsep106.pdf Biovolume Table: http://www.helcom.fi/stc/files/Publications/Proceedings/bsep106ANNEX1Biovolumes_web.xls

- Utermöhl, H. (1958): Zur Vervollkommnung der quantitativen Phytoplankton-Methodik. Mitt. internat. Verein. Limnol. 9, pp. 1 – 38.

Bestimmungsliteratur: siehe Anlage 8

13 Liste der Änderungen (optional, eventuell als Anlage)

Anmerkung: Ergeben sich notwendige inhaltliche Änderungen ist die SOP zeitnah zu überarbeiten. Die Liste der Änderungen kann dann dazu dienen, laufende Änderungen am Verfahren bis zum Abschluss der Überarbeitung zu protokollieren. Dazu werden die Änderungen, die im Zeitraum bis zum Inkrafttreten der überarbeiteten SOP erfolgen, handschriftlich eingetragen. Diese Änderungen werden dann von dem fachlich zuständigen Bearbeiter oder der Laborleitung abgezeichnet. Wird die Liste der Änderungen zu lang, können Einträge, die älter als drei Jahre sind, entfernt werden. Dies soll mit einem Hinweis auf die Vorgängerversion (z. B. „Die vorige Version enthält weitere Änderungen“) dokumentiert werden. Das Führen einer Liste ist nicht unbedingt erforderlich aber zweckmäßig, da bei der Überarbeitung der SOP relevante Änderungen in dieser Liste verbleiben können und somit die historische Entwicklung eines Verfahrens dokumentiert wird. Es ist in Ausnahmefällen auch möglich, Änderungen direkt handschriftlich im Arbeitsexemplar vorzunehmen. Diese sind dann mit Datum und Unterschrift des fachlich zuständigen Bearbeiters oder der Laborleitung abzuzeichnen.

14 Anlagen

Anlage 1: Mikroskop-spezifische Daten – Beispiele





Gültig ab: <Datum>



Anlage 2: Codes zur Beschreibung der Wind- und Wetterverhältnisse

Anlage 3: Probenahmeprotokoll – Beispiel

Anlage 4: Zählprotokoll - Planktonzählung mittels Stereomikroskop – Beispiel

Anlage 5: Ergebnisprotokoll – Beispiel

Anlage 6: Protokoll für die Vermessung – Beispiel

Anlage 7: Geometrische Körper und Volumenformeln

Anlage 8: Liste der zu verwendenden Bestimmungsliteratur

Anlage 9: Hinweise zur Präparation von Diatomeen

Anlage 10: Formblatt zur Erfassung von SOP-Änderungen





Gültig ab: <Datum>


Küste (qualitativ und quantitativ) Anlage 1 von 10

Anlage 1 Mikroskop-spezifische Daten – Beispiele

Mikroskop - AXIOVERT S 100 Streifenbreite in µm: Objektiv: 20 40 100

(Netz) 1 Streifenbreite: 500 250 100 ½ Streifenbreite: 250 125 50

Kammer Objektiv Netzkasten Anz.d.Kästen/ml

10 ml 20 ½ 1

400 200

500 mm² = 10 ml 50 mm² = 1 ml 40 ½

1 1.000

800

100 ½ 1

10.000 5.000

50 ml 20 ½ 1

80 40

500 mm² = 50 ml 10 mm² = 1 ml 40 ½

1 320 160

100 ½ 1

2.000 1.000

100 ml 20 ½ 1

40 20

500 mm² = 100 ml 5 mm² = 1 ml 40 ½

1 160

80

100 ½ 1

1.000 500

Messfaktor: 100-Vergrößerung = 1,0 40-Vergrößerung = 2,5 20-Vergrößerung = 5,0 10-Vergrößerung = 10,0 5-Vergrößerung = 20,0





Gültig ab: <Datum>







Gültig ab: <Datum>







Gültig ab: <Datum>



Anlage 2 Codes zur Beschreibung der Wind- und Wetterverhältnisse

ICES-Wettercode

Bei Küstengewässern wird zur Beschreibung der Wettersituation eine Ziffer nach dem ICES-Wettercode wie folgt verwendet:

Ziffer des ICES-Wettercode Beschreibung

0 klar

1 teilweise bewölkt

2 geschlossene Wolkendecke

3 Sand- und Schneesturm

4 Nebel, starker Dunst

5 Sprühregen

6 Regen

7 Schnee, Schneeregen

8 Schauer

9 keine Beobachtung

Seegang

Bei Küstengewässern wird Seegang nach der nautischen Skala mit Ziffern zwischen 0 und 9 angegeben, die jeweils einem Bereich der Wellenhöhe in Metern entsprechen:

Ziffer der nautischen Skala Beschreibung Wellenhöhe [m]

0 glatt 0

1 sehr ruhig 0 - 0,3

2 ruhig 0,3 - 0,8

3 leicht bewegt 0,8 - 1,5

4 mäßig bewegt 1,5 - 2,5

5 ziemlich grob 2,5 - 4,0

6 grob 4,0 - 6,0

7 hoch 6,0 - 10,0

8 sehr hoch 10,0 - 12,0

9 äußerst schwer > 12





Gültig ab: <Datum>



Wind

Bei den Küstengewässern wird die Windrichtung jeweils in Winkelgrad und die Windge-schwindigkeit in Metern pro Sekunde (m/s) angegeben:

Ziffer der Beaufort-Skala Beschreibung Windgeschwindigkeit [m/s]

0 still < 0,3

1 sehr leicht 0,3 – 1,5

2 leicht 1,6 – 3,3

3 schwach 3,4 – 5,4

4 mäßig 5,5 – 7,9

5 frisch 8,0 – 10,7

6 stark 10,8 – 13,8

7 steif 13,9 – 17,1

8 stürmisch 17,2 – 20,7

9 Sturm 20,8 – 24,4

10 schwerer Sturm 24,5 – 28,4

11 orkanartiger Sturm 28,5 – 32,6

12 Orkan > 32,6





Gültig ab: <Datum>



Anlage 3 Probenahmeprotokoll – Beispiel Gewässer: …………………………………Probenahmestelle: ...…………………........

Datum: …………………………………Probenehmer: ...…………………........

Proben-Nr.: …………………………………Probeneingangs-Nr.: .…………………….…..

Parameter Einheit Messwert Bemerkungen N

Position E

OB: Oberfläche GN: Grundnähe

Anfang UTC

Ende Anfang

Uhrzeit MESZ

[UTC+2] Ende

Wassertiefe laut Echolot [m]

ICES-Wettercode

Wolken [%]

Luftdruck [mbar]

Wellenhöhe [m]

Eisbedeckung [%]

Luft-Temperatur [°C]

Windstärke [m/s]

Windrichtung [°]

Um

gebu

ngsb

edin

gung

en

Sichttiefe [cm]

OB Wassertemperatur [°C]

GN

OB Leitfähigkeit (bei 25°C) [mS/cm]

GN

OB pH-Wert

GN

OB Salzgehalt [PSU]

GN

OB Sauerstoffgehalt [mg/l]

GN

OB Sauerstoffsättigung [%]

GN

OB Trübung [FTU]

GN

Sond

enda

ten

Chlorophyll a [mg/m³] OB





Gültig ab: <Datum>



Anlage 4 Zählprotokoll, Planktonzählung mittels Stereomikroskop – Beispiel

Station: Datum:

Tiedehochwasser: Tideniedrigwasser:

Bearbeiter: eingeengte Wassermenge: l

Noctiluca scintillans [Zellen/l]: l-1

Phaeocystis globosa [Kolonien/l] : l-1

Phaeocystis-Größenklassen (Kolonien): Koloniegröße Anzahl

0 – 50 µm 50 – 300 µm

300 – 600 µm 600 – 1000 µm

1000 – 2000 µm > 2000 µm

Odontella sinensis [Zellen/l]: l-1

Coscinodiscus wailesii [Zellen/l]: l-1

Coscinodiscus concinus [Zellen/l]: l-1

Coscinodiscus granii [Zellen/l]: l-1

weiteres großes Phyto- und Zooplankton:

Taxon Vorkommen1 Taxon Vorkommen1 Actinoptychus sp. Tunicaten-Larven Odontella aurita Echinodermen-Larven Odontella regia Polychaeten-Larven Chaetoceros sp. Veliger-Larven Thalassiosira levanderi Muschel-Larven Thalassionema nitzschioides Copepoden Thalassiosira rotula Thalassiosira sp. Melosira moniliformis Neocalyptrella robusta Ceratium sp.

(1sehr selten: +/- selten: + häufig: ++ sehr häufig: +++):





Gültig ab: <Datum>



Anlage 5 Ergebnisprotokoll – Beispiel

Gewässer: Probenahme Datum: Bearbeiter: Uhrzeit: Bearbeitungsdatum: Station: Nummer: Kammervolumen:

Taxon Foto

Sedimenta-tions-volumen [ml]

Zähl-fläche [cm2]

Anzahl Ind./Zählfläche

Koeffi-zient

Ver-größe-rung

Abundanz [Ind./l]

spezif. Artvol. [µm3]

Bio-volumen [mm3/l]

Gesamtabundanz [Ind./l]: …………………………… Gesamtbiovolumen [mm3/l]: ……………………………





Gültig ab: <Datum>


Küste (qualitativ und quantitativ) Anlagen: 6 von 10

Anlage 6 Vermessungsprotokoll – Beispiel

1. 11. 21.

2. 12. 22.

3. 13. 23.

4. 14. 24.

5. 15. 25.

6. 16. 26.

7. 17. 27.

8. 18. 28.

9. 19. 29.

10. 20. 30.

31. 41. 51.

32. 42. 52.

33. 43. 53.

34. 44. 54.

35. 45. 55.

36. 46. 56.

37. 47. 57.

38. 48. 58.

39. 49. 59.

40. 50. 60.

Geräte-Faktor Ind./ml Anzahl der Messungen Achsen

Organismenart:

Gewässer: Datum:

Vol.-Formel





Gültig ab: <Datum>



Anlage 7 Geometrische Körper und Volumenformeln

Geometrischer

Körper Abbildung Volumenformel

Kugel

d

V = 1/6 * π * d3

Halbkugel

d

V = 1/12 * π * d3

Rotations-ellipsoid

d

h

V = 1/6 * π * d2 * h

Triaxial-ellipsoid

h d1

d2

V = 1/6 * π * d1 * d2 * h

Kreiszylinder

d h

V = 1/4 * π * d2 * h





Gültig ab: <Datum>



Geometrischer Körper Abbildung Volumenformel

Kreiszylinder mit Halbkugel

V = 1/4 * π * d2 * (h -1/2 d+ 1/3 d)

Kreiszylinder mit zwei Halbkugeln

V = 1/4 * π * d2 * (h - d + 2/3 d)

Kreiszylinder mit Kreiskegel

V = 1/4 * π * d2 * h1 + 1/12 π * d2 h2

Kreiszylinder mit zwei Kreiskegeln

V = 1/4 * π * d2 * (h1 + 2/3 h2)

Elliptischer Zylinder

V = 1/4 * π * d1 * d2 * h ba

h





Gültig ab: <Datum>




Halb elliptischer Zylinder

V = 1/4 * π * d1 * d2 * h

Sickle shaped cylinder (synonyms: Sickle shaped prism)

V = 1/4 * π *h * (d1 * d2 - d3 * d4)

Mono-raphidioid shape

a d

b

V = d2/8 * (2b – d + a) * (1/6 * π2 + )

Quader

h

wl

V = l * w * h

Triangular prism (synonyms: Prism on triangle base, Half Parallel-epiped)

V = 1/2 * a * b * h

Rhomboid prism (synonyms: Prism on parallelogram base)

h

d1

d2

V = 1/2 * d1 * d2 * h

d1: large distance, d2: small distance





Gültig ab: <Datum>




Pyramiden-stumpf

V = 1/2 * h * w * (l1 + l2)

Kreiskegel

d

h

V = 1/12 * π * d2 * h

Halbkreiskegel

V = 1/24 * π * d2 * h

Half cone + cut flattened ellipsoid

d2 h2 d1

h1

V =(1/24 * π * d12 * h1) + (1/6 * d1 *

d2 * h2)

D1: large diameter d2: small diameter h1: 0.3 * total height of cell h2: 0.7 * total height of cell

Doppelkegel

d

h

V = 1/12 * π * d2 * h

d/2

h





Gültig ab: <Datum>




Kreiskegel mit Halbkugel

d

h

V = 1/12 * π * d2 * (h + d/2)

Kreiskegel-stumpf

d2

d1

h

V = 1/12 * π * h * (d1

2 + d22 +d1 * d2)

Tetraeder

V = 1/12 * √2 * b3

Trident (synonyms: Goniochloris shape)

V = 1/6 * π * b3 + 1/16 * π * b2 * l

b

l

b

l l

b

h





Gültig ab: <Datum>




Staurastrum- Form

V = 2/3 * hm * (1/4 * √3 * (l2mi + l2b) + √(3/16 * l2mi * l2b)) + 1/2 * π * d2

s * lst

Ceratium-Form

V = (π/12 * f1 * (h22 + h2 * g1 + g1

2) + π/6 * l * b * h1) + π /12 * (g2

2 * f2 + g3

2 * f3 + g42 * f4)

Cymbelloid

V = 2/3 * π * b² * a * β/360

sin β/2 = c / (2 * b)

b

h1 b

gg4

gg

f4 f3

f

h2

f1

l

h

lmi

lb

d

lst





Gültig ab: <Datum>




Gompho-nemoid

V = b * c * ((π * e/4) + ((f – e)/3))





Gültig ab: <Datum>



Anlage 8 Liste der zu verwendenden Bestimmungsliteratur

1. Erforderliche Literatur

- Anagnostidis, K. & Komárek, J. (1988): Modern approach to the classification system of cyanophytes. 3 – Oscillatoriales. – Archiv für Hydrobiologie, Supplement 80 (Algological Studies, 50-53): 327 – 472.

- Balech, E. (1995): The genus Alexandrium Halim (Dinoflagellatae), Sherkin Island Marine Station

- Berard-Therriault, L. ; Poulin, M. & Bosse, l. (1999): Guide d` identification du phytoplankton marin de l`estuaire du golfe du Saint-Laurent. – Publication special canadienne des sciences halieutiques et aquatiques

- Chrétienne-Dinet, M.-J.; Billard, C.; Sournia, A. (1990): Atlas du phytoplancton marin, Vol. III: Chlorarachniophycées, chlorophycées, chrysophycées, cryptophycées, euglénophycées, eustigmatophycées, prasinophycées, prymnésiophycées, rhodophycées et tribophycées. Centre National de la Recherche Scientifique, Paris.

- Dodge, J. D. (1982): Marine Dinoflagellates of the British Isles. Her Majesty's Stationery Office by Hobbs the Printers of Southampton, London.

- Drebes, G. (1974): Marines Phytoplankton. Georg Thieme Verlag, Stuttgart.

- Hasle, G & Fryxell, G. (1976): The genus Thalassiosira: Some species with a linearareola array. - Nova Hedwigia, Beiheft 45

- Horner, R. A. (2002): A taxonomic guide to some common marine phytoplankton. Biopress Ltd.

- Hustedt F. (1930-1966): Die Kieselalgen Deutschlands, Österreichs und der Schweiz. – Reprints: Koeltz Scientific Books (USA) Teil 1: 1930,


UND/LÄNDER-MESSPRO-GRAMM NORD- UND OSTSEE



Gültig ab: <Datum>



Teil 2: 1959, Teil 3: 1966

- Jensen, K. & Moestrup, O. (1998): The genus Chaetoceros (Bacillariophyceae) in inner Danish coastal waters. – Opera Botanica 133

- Larink, O. & Westheide, W. (2006): Coastal Plankton. - Verlag Dr. Friedrich Pfeil, München

- Linne von Berg, K.-H. & Melkonian, M. (2004): Der Kosmos-Algenführer. – Franckh-Kosmos ,Verlags GmbH & Co. KG, Stuttgart

- Pankow, H. (1976): Algenflora der Ostsee, II. Plankton. Gustav Fischer Verlag, Jena.

- Pankow, H. (1990): Ostsee-Algenflora. Gustav Fischer Verlag, Jena.

- Pascher, A: Die Süßwasserflora von Mitteleuropa, G.-Fischer-Verlag, Stuttgart Band 1: Chrysophyceae und Haptophyceae Band 2/1;2/2; 2/3: Bacillariophyceae Band 3: Xanthophyceae 1 Band 4: Xanthophyceae 2 Band 6: Dinophyceae Band 9: Chlorophyta 1.Teil: Phytomonadina Band 10: Chlorophyta 2. Teil: Tetrasporales, Chlorococcales, Gloeodendrales Band 12: Cyanophyceae. – Gustav Fischer Verlag Band 16: Chlorophyta 8. Teil: Conjugatophyceae Band 19/1: Cyanoprocaryota. Chroococcales Band 19/2: Cyanoprocaryota. Oscillatoriales Band 20: Schizomycetes: Bakterien

- Kolkwitz, R.(Ed.): Dr. Rabenhorsts Kryptogamenflora. Band 10: Silicoflagellatae/Coccolithineae Band 14: Cyanophyceae





Gültig ab: <Datum>



- Ricard, M. (1987): Atlas du phytoplancton marin, Vol. II: Diatomophycées. Centre National de la Recherche Scientifique, Paris.

- Rines, J.E.B. & Hargraves, P.E. (1988): The Chaetoceros Ehrenberg (Bacillariophyceae) Flora of Narragansett Bay, Rhode Island, USA. – Bibliotheca phylogica, Band 79

- Snoeijs, P. (1993): Intercalibration and distribution of diatom species in the Baltic Sea. Volume 1 - The Baltic marine biologists. Publication No. 16a

- Snoeijs, P. (1994): Intercalibration and distribution of diatom species in the Baltic Sea. Volume 2 - The Baltic marine biologists. Publication No. 16b

- Snoeijs, P. (1995): Intercalibration and distribution of diatom species in the Baltic Sea. Volume 3 - The Baltic marine biologists. Publication No. 16c

- Snoeijs, P. (1996): Intercalibration and distribution of diatom species in the Baltic Sea. Volume 4 - The Baltic marine biologists. Publication No. 16d

- Snoeijs, P. (1998): Intercalibration and distribution of diatom species in the Baltic Sea. Volume 5 - The Baltic marine biologists. Publication No. 16e

- Sournia, A. (1986) : Atlas du phytoplancton marin, Vol. I: Introduction, Cyanophycées, Dictyochophycées, Dinophycées et Raphidophycées. Centre National de la Recherche Scientifique, Paris.

- Streble, H. & Krauter, D. (2002): das Leben im Wassertropfen. - – Franckh-Kosmos Verlags GmbH & Co. KG, Stuttgart

- Sundström, B. G. (1986): The marine diatom genus Rhizosolenia. Lund University, Dep. of Systematic Botany, Lund.

- Thomsen, H. A., ed.(1992): Plankton I de indre dankse farvande Havforskning fra Miljostyreksen, Nr. 11, Miljoministeriet Miljostyrelsen. Copenhagen.





Gültig ab: <Datum>



- Throndsen, J.; Hasle & Tangen 2007): Phytoplankton of Norwegian coastal waters. - Almater Forlag AS

- Tikkanen, T. & Willen, T. (1992): Växtplanktonflora. - Naturvardsverket, Solna

- Tomas, C. R. (1993): Marine Phytoplankton. A guide to naked flagellates and coccolithoporids. Academic Press Inc., London.

- Tomas, C. R. (1996): Identifying Marine Diatoms and Dinoflagellates. Academic Press Inc., London.

- Tomas, C. R.; Hasle, G. (1997): Identifying Marine Phytoplankton – Academic Press Inc. Harcourt Brace & Company





Gültig ab: <Datum>



2. Empfehlenswerte weiterführende Literatur

- Brandt, K. u. Apstein, C. (Hrsg.1916): Nordisches Plankton - Botanischer Teil, 1916, Neudruck: A.ASHER & CO, Amsterdam 1964

- Cupp, E. E. (1977): Marine Plankton Diatoms of the west coast of North America. Otto Koeltz Science Publishers, Königstein.

- Cleve-Euler, A. (1968): Die Diatomeen von Schweden. J. Cramer Verlag, New York.

- Gams, H. (1969): Kleine Kryptogamenflora, Bd. 1a: Makroskopische Süßwasser- und Luftalgen, G.-Fischer-Verlag, Jena.

- HELCOM-PEG-Handouts (1994): HELCOM Phytoplankton identification course, Poland.

- HELCOM-PEG-Handouts (1999): HELCOM Phytoplankton training course, Abisko.

- Huber-Pestalozzi: Die Binnengewässer Bd. XVI, Das Phytoplankton des Süßwassers Schweizerbart, Stuttgart Teil 1: Blaualgen, Bakterien, Pilze Teil 2/2: Diatomeae Teil 3/2: Cryptophyceae, Chloromonadophyceae, Dinophyceae Teil 4: Euglenophyceae Teil 5: Chlorophyceae – Volvocales Teil 6: Chlorophyceae – Tetrasporales Teil 7/1: Chlorophyceae – Chlorococcales

- Kenkyukai, A. (1982): Synopsis of Red-Tide Organisms. Fisheries Agency, Japanese Government

- Komarek, J. (1999): Überblick der planktischen Blaualgen (Cyanobacteria) im Einzugsgebiet der Elbe. Internat. Kommission zum Schutz der Elbe





Gültig ab: <Datum>



- Larsen, J. & Nguyen, N. L. (2004): Potentially toxic microalgae of Vietnamese waters – Opera Botanica 140

- Throndsen, J. (1983): Ultra & Nanoplankton Flagellates from coastal waters of southern Honshu and Kyushu, Japan

- UNESCO (1995): Manual on harmful marine microalgae





Gültig ab: <Datum>



Anlage 9 Hinweise zur Präparation von Diatomeen

Nur selten ist die Bestimmung von Diatomeen an lebendem oder mit Lugolscher Lösung fixiertem Material bis zur Art möglich. Zur Bestimmung müssen feinste Strukturen des Kieselpanzers analysiert werden und das ist in der Regel nur an Material möglich, das von allen organischen Bestandteilen gereinigt und in speziellen Kunstharzen mit einem hohen Brechungsindex eingebettet ist (Dauerpräparate). Die Auswahl der Reinigungsmethode richtet sich dabei auch nach dem Untersuchungsziel. Oft befinden sich wichtige Merkmale auf der Innenseite der Schalen und können dann nur im Rasterelektronenmikroskop erkannt werden. In diesen Fällen ist eine Trennung der beiden Schalen zur Identifizierung notwendig.

1 Anreicherung des Probenmaterials

Das zu präparierende Material muss angereichert und von jeglichem Fixierungsmittel frei sein.

Bei Verwendung von Schöpfproben sind die Proben auf kleine Mengen einzuengen durch:

− Konzentration des Materials durch Membranfiltration (Porenweiten < 3 µm), wobei die mit Material besetzten Filter lufttrocken zeitlich unbegrenzt aufbewahrt werden können

oder

− Zentrifugation bis zu 5 min bei ca. 1000 - 1300 U/min

2 Reinigung

2.1 Reinigung durch Glühen

Methode der Wahl, wenn der Erhalt der Zellverbände und Zellkolonien (Kettenbildungen zentrischer und pennater Diatomeen) notwendig ist und die Algen ungeteilt in Epi- und Hypotheka untersucht werden müssen, in der Regel bei qualitativen und quantitativen Bestimmungen mittels Lichtmikroskop. Ist nur für wenig verunreinigtes Material geeignet.

Das angereicherte Material (z. B. als Abrieb vom angefeuchteten Filter mit einem kleinen Pinsel oder mit einem Glasstab aus dem Zentrifugenglas) aufnehmen und die Diatomeensuspension auf ein Deckgläschen geben und gut verteilen (der Tropfen läuft auseinander, wenn das Deckglas fettfrei ist).





Gültig ab: <Datum>



Glühen im Muffelofen:

ca. 2 h bei 400 °C, bei kleinen und zarten Formen kann diese Zeit auf ca. 10 min reduziert werden

oder

Glühen über schwacher Flamme (Spiritusflamme oder Bunsenbrenner):

Das Deckglas wird mit dem Material nach oben auf ein dünnes Blech aus Edelstahl gelegt und das Blech über der Flamme vorsichtig bis zur Rotglut erhitzt.

Das Material auf dem Deckglas wird erst schwarz, der Glühvorgang ist abgeschlossen, wenn das Diatomeenmaterial eine reinweiße Farbe angenommen hat.

Störende Ascherückstände des organischen Begleitmaterials können entfernt werden, indem man die geglühten und erkalteten Deckgläschen an einer Ecke mit der Pinzette greift und kurz einige Male in Aqua dest. Taucht. Da die Diatomeenschalen nach dem Glühen mit dem Glas versintert sind, führt diese Behandlung nicht zum Materialverlust. Bei kalkreichen Proben kann man dem ersten Waschwasser einige Tropfen Salzsäure (HCl) zugeben und anschließend mehrfach mit Aqua dest. waschen.

2.2 Reinigung durch Wasserstoffperoxid (H2O2)

Diese Methode ist nicht ganz so wirkungsvoll wie die unter 2.3 beschriebenen Reinigungs-methoden mit Säuren, aber dafür schonender und für wenig verunreinigte Planktonproben geeignet.

Bei diesen Arbeiten sind Gummihandschuhe und Schutzbrille zu tragen und die Arbeiten müssen unter einem Abzug durchgeführt werden.

Schonende Variante:

− Fixierte Proben mindestens dreimal mit Aqua dest. waschen

− Bei Zentrifugation den Überstand im Zentrifugenröhrchen vorsichtig soweit wie möglich abgießen und Bodensatz (bzw. den Membranfilter nach Filtration) mit Wasserstoffperoxid (30 - 35 %) auffüllen (bis 1 cm unter dem oberen Rand)

− Über Nacht (24 h) bei 60 °C im Wärmeschrank stehen lassen, die Suspension muss klar werden





Gültig ab: <Datum>



− Zentrifugieren und anschließend überstehendes Wasserstoffperoxid vorsichtig abgießen

− Bodensatz mindestens dreimal mit Aqua dest. waschen

− Über dem Bodensatz stehendes Wasser vorsichtig mit Pipette absaugen

oder

Reinigung durch Kochen mit Wasserstoffperoxid (Schnellmethode):

− Das konzentrierte, möglichst wasserfreie Material oder der Membranfilter mit dem angereicherten Plankton wird mit Wasserstoffperoxid (30 - 35 %) versetzt, erhitzt und ca. 1 bis 10 min gekocht.

Achtung: wegen der Gefahr des explosiven Zerfalls muss darauf geachtet werden, dass das Wasserstoffperoxid nicht vollständig verkocht!

Die Länge des Kochvorgangs bis zum Sprengen der Schalen (Frusteln) hängt vom Probenmaterial ab. Sehr zarte, schwach verkieselte Formen (z. B. kleine Cyclotella-Arten) benötigen nur ca. 1 min, größere Formen müssen bis 10 min gekocht werden. Richtwert: ca. 3 min.

− Anschließend wird tropfenweise 30%ige Salzsäure (HCl) zugegeben (Vorsicht!), um Kalk zu entfernen.

− Danach die Probe mit Aqua dest. stark verdünnen und anschließend wieder anreichern, entweder durch Zentrifugation oder auf einem neuen Membranfilter (Porenweite ca. 1 µm). Gründlich mit Aqua dest. waschen.

2.3 Reinigung mit Säuren und Oxidationsmitteln

Diese Methode wird eingesetzt, wenn die Schalen (Valven) der Zellen von einander getrennt werden sollen. Außerdem können störende anorganische Beimengungen (z. B. Kalk) entfernt werden. Dieses Verfahren ist besonders für sehr stark mit organischem Material verunreinigte Proben geeignet. Es kommen starke Säuren zusammen mit einem Oxidationsmittel wie Kaliumnitrat zum Einsatz.

Bei diesen Arbeiten sind Gummihandschuhe und Schutzbrille zu tragen und die Arbeiten müssen unter einem Abzug durchgeführt werden.

Reinigung durch Kochen mit konzentrierter Schwefelsäure:





Gültig ab: <Datum>



− Das überstehende Wasser über der sedimentierten Diatomeensuspension in einem kleinen Becherglas möglichst vollständig entfernen

− Anschließend mit 0,5 bis 1 cm technisch reiner konz. Schwefelsäure überdecken

− 20 min kochen (mit Siedestäbchen und abgedeckt mit einem Uhrgläschen)

− Dann eine Spatelspitze Kaliumnitrat in die heiße Säure geben, es tritt eine augenblickliche Entfärbung ein und die Diatomeen bilden nach dem Abkühlen und Sedimentieren einen reinweißen Bodensatz

− Säure gründlich mit Aqua dest. auswaschen

oder

„Kaltes Reinigungsverfahren“

− Bei diesem Verfahren werden die Diatomeen nur durch die Zugabe konzentrierter Schwefelsäure zu der in Aqua dest. vorliegenden Diatomeensuspension erhitzt, nicht aber gekocht

− Die Diatomeensuspension wird wie bei der Kochmethode mit konz. Schwefelsäure überdeckt und durch vorsichtiges Schwenken gut durchmischt

− Die Bechergläser auf eine Heizplatte (100 °C) stellen und konz. Kaliumpermanganatlösung zugeben, nach 5 min überprüfen und bei denjenigen Proben, bei denen eine Entfärbung eingetreten ist, erneut Kaliumpermanganatlösung zugeben. Das wird so oft wiederholt bis bei keiner Probe mehr eine Entfärbung eintritt

− Anschließend etwas konz. Oxalsäurelösung zugeben (Entfärbung der roten oder braunen Kaliumpermanganatlösung), die Oxidation ist quantitativ abgeschlossen

− Säure gründlich mit Aqua dest. auswaschen

Achtung: Bei dieser harten Methode kann es zur Zerstörung von Feinstrukturen oder sehr zarter Schalen kommen, die besonders im Rasterelektronenmikroskop (REM) sichtbar werden.





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2.4 Reinigung mit Enzymen

Die Reinigung mit Hilfe von Enzymen ist vor allem für Untersuchungen mit dem REM oder dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) gedacht, wenn jede Beeinträchtigung der Kiesel-schalen vermieden werden soll. Die aus Polysacchariden bestehende organische Hüllmembran bleibt erhalten, so dass die natürliche Lage der Schalenelemente und Ketten erhalten bleibt.

− Waschen des Diatomeenmaterials in Aqua dest.

− Entfernung der Fette mit Aceton und mit durch Wasserzusatz verflüssigtem Phenol

− Erneutes Waschen mit Aqua dest. und 24stündige Behandlung mit einer phosphatge-pufferten 2%igen Pankreatinlösung bei 40 °C

− Anschließend wieder mit Aqua dest. spülen

− Sollen alle organische Bestandteile beseitigt werden, muss die Diatomeensuspension nach der Enzymbehandlung noch in eine gesättigte wässrige Chloralhydratlösung (1:2 verdünnt) oder Eau de Javelle überführt werden

− Anschließend wieder mit Aqua dest. spülen

3 Herstellung von Dauerpräparaten

Alle Objektträger und Deckgläschen, die zur Einbettung der Kieselalgen verwendet werden, müssen völlig fettfrei sein (in Alkohol legen, spülen und trockenen oder bei starker Verschmutzung in einem Gemisch von 50 % Wasser und 50 % Wasserstoffperoxid kochen, spülen und trocknen). Als Einbettungsmittel kann z. B. Naphrax (Lösemittel Toluol, Brechungs-index n.D. 1,69) verwendet werden.

− Deckgläschen (max. Stärke 0,17 mm) mit einem Tropfen des angereicherten Materials beschicken, so breit wie möglich verteilen (der Tropfen läuft auseinander, wenn das Deckglas fettfrei ist) und den Tropfen auf dem Deckgläschen über Nacht eintrocknen lassen

Achtung: Nach dem Auftropfen dürfen die Deckgläschen bis zum Eintrocknen nicht mehr bewegt werden, weil es sonst zur Klumpenbildung kommen kann!

− Zur besseren Haftung der Diatomeen auf dem Deckgläschen wird dieses mit der Schicht-seite nach oben auf einem Objektträger ca. 15 min auf eine Heizplatte gelegt oder für kurze





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Zeit über einen kleinen Bunsenbrenner gehalten (Versintern der Kieselalgen mit der Glasoberfläche)

− Auf einen beschrifteten Objektträger 1 Tropfen Naphrax (oder ein anderes Einbettungsmittel geben) und das Deckgläschen mit der Beschichtung nach unten blasenfrei auf den Tropfen auflegen

− Auf einer Heizplatte (Temperatur 200 °C) oder über einer kleinen Spiritusflamme erwärmen bis das Naphrax ca. 3 sec. lang Blasen wirft (Verdunstung des Lösemittels)

− Sobald das Lösemittel verdampft ist (geht sehr schnell!) den Objektträger aus der Flamme oder von der Heizplatte nehmen. Während der anschließenden schnellen Abkühlung auf einem Blech gegebenenfalls das Deckglas mit einem Bleistift noch etwas andrücken bzw. ausrichten.

4 Herstellung von REM-Präparaten

Soll das gereinigte Material im REM untersucht werden, erfolgt die Aufbringung der Proben auf die Deckgläser wie bereits beschrieben. Die Deckgläser werden mit Leitkohle oder Leitsilber auf spezielle REM-Objektträger montiert, mit Metallen (in der Regel Gold) besputtert und anschließend im REM untersucht.

Ungereinigte, lugolfixierte Schöpfproben werden auf Nucleoporefiltern (0,45 µm) angereichert. Nach Lufttrocknung bei Raumtemperatur wird der Filter mit doppelseitigem Klebeband auf dem REM-Objektträger fixiert und an zwei Randstellen mit Leitkohle oder –silber direkt mit dem Träger verbunden. Nach dem vollständigen Verdampfen der Lösemittel aus dem Leitmaterial werden die Filter mit Gold besputtert (nach Klee & Steinberg, 1987).

5 Lichtmikroskopische Untersuchung

− Hellfeld, Phasenkontrast und Differentialkontrast sind geeignete Beleuchtungsverfahren, im Hellfeld ist die Kontrastierung mit Schieflicht sehr zweckmäßig

− Verwendung eines Immersionsobjektives (100 x) mit hoher numerischer Apertur (1,2 – 1,4)

− Bei quantitativen Untersuchungen muss berücksichtigt werden, dass Reinigung und Präparation einen Materialschwund verursachen (sehr kleine, zarte oder schwach verkieselte Formen werden überproportional stärker reduziert als größere).





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6 weiterführende Hinweise

- Kalbe, L. (1973): Kieselalgen in Binnengewässern. A. Ziemsen Verlag, Wittenberg Lutherstadt.

- Krammer, K. & H. Lange-Bertalot (1986, 1997): Bacillariophyceae, 1. Teil: Naviculaceae. – In: Ettl, H.; Gerloff, J.; Heynig, H. & D. Mollenhauer (Hrsg.): Süßwasserflora von Mitteleuropa 2/1, XVI, 876 Seiten. G. Fischer, Stuttgart.





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Anlage 10 Formblatt zur Erfassung von SOP-Änderungen

Veränderungen zur SOP-Nr.: Version: 01

lfd. Nr. Veränderung

(unter Angabe des Gliederungspunktes und des betreffenden Absatzes)

gültig ab: (Datum)

Unterschrift (Leitung/QMB)

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