Biochem. Physiol. Pflanzen 181, 411--420 (1986) VEB Gustav Fischer Verlag Jena

Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehungen fUr die Hemmung des autotroph en Wachstums

synchroner Chlorella vulgaris-Kulturen durch monosubstituierte Nitrobenzene

CLAUS-RUDIGER KRAMER, LUTZ TRUMPER und LOTHAR BERGER Sektion Biologie/Chemie der Padagogischen Hochschule "Wolfgang Ratke" Kothen, DDR

Quantitative Structure-Activity Relations for the Inhibition of the Autotrophic Growth of Synchronous Chlorella vulgaris Cultures

by Monosubstituted Nitrobenzenes

Key Term Index: monosubstituted nitrobenzenes, growth inhibition, quantitative structure­activity relations; ChIarella vulgaris

Summary

A selected series of 32 monosubstituted nitrobenzenes, which were from commercial sources or synthesized by known methods, was tested for algicidic activity against autotrophic Chiarella vulgaris suspensions.

Isoactive inhibitory values pCso]) were determined from dosageeffectivness relations and used as activity parameters for structure-activity correlations.

Simple and multiple regression equations are reported, discussed and compared with analogous QSAR of earlier tested series. Two separate functions have been found for meta-, para-, and ortho­derivatives.

Einleitung

Wirkstoffe, welche auf einer aromatischen Grundstruktur basieren, sind in vielen Fallen durch das Vorhandensein von einer oder mehreren Nitrogruppierungen als Ringsubstituent gekennzeichnet.

Einfache Nitrobenzene von praktischer Relevanz sind z. B. nitrierte Phenole (DINO­SEB, DNOC, BROMOXYNIL), N-substituierte Nitroaniline (TRIFLURANIL) sowie Chlor­nitrobenzene (1,2,4-Trichlor-3,5-dinitro-benzen). Herbizide, Fungizide und Insektizide sind in dieser Wirkstoffgruppe zu finden.

Quantitative biologische Aktivitatsparameter fUr Nitrobenzene sind in der Literatur nur vereinzelt zu finden.

Fur eine groJ3e Anzahl verschieden substituierter Aromaten, die diverse Nitrobenzene enthalten, sind minimale Hemmkonzentrationen fUr die Zellvermehrung der Blaualge Microcystis angegeben (BRINGMANN 1975).

1) Abbreviations: pCso = -lg{ED50}, see Table 1; QSAR, quantitative structure-activity rela­tion(s)

412 C.-R. KRAMER et al.

Von gegenwartig besonderem Interesse sind Arbeiten, die uber das Studium einzelner Verbindungen hinaus mit der systematischen U ntersuchung des Substituenteneinflusses auf biologische Aktivitatsparameter innerhalb kongenerer Serien von Wirkstoffen und der mathematischen Fixierung der erhaltenen Daten in quantitative Struktur-Wirkungs­Beziehungen (QSWB) einen wesentIichen Beitrag zur Kenntnis allgemeiner Zusammen­hange zwischen chemischer Struktur und biologischer Aktivitat leisten.

Quantitative Struktur-Wirkungs-Analysen mit Nitrobenzen als Leitverbindung sind nicht bekannt.

In bezug auf sUbstituentenabhangige Wirkquantitaten wurde deshalb versucht, eine QSW A fur die autotrophe Wachstumshemmung von Chlorella vulgaris durch mono­substituierte Nitrobenzene durchzufUhren.

Ausgehend Von der Gesamtheit der experimentellen Befunde werden statistisch signifikante Beziehungen zwischen Aktivitats- und Strukturparametern vorgeschlagen.

Material und Methoden

Gelestele Substanzen

Die fUr die experimentellen Untersuchungen verwendeten monosubstituierten Nitrobenzene (Tabelle 1) waren kommerziell verfiigbar oder wurden nach bekannten Verfahren (Nitrierung, Dia­zotierung, Williamson-Synthese u. a.) synthetisiert. Identitatspriifungen erfolgten durch Schmelz­punktbestimmung, Ermittlung des Brechungsindizes und Analysen der IR-Spektren. Vor der Testung wurden aIle Substanzen nochmals durch Umkristallisation bzw. Vakuumdestillation gereinigt.

Biologische Testung

Die quantitative Charakterisierung der algiziden Wirksamkeit monosubstituierter Nitrobenzene erfolgte unter Anwendung eines standardisierten Chlorella-Testes nach BOHM et al. (1971), welcher auf der komplexen Wachstums- und Entwicklungsbeeinflussung der einzelligen Griinalge Chlorella vulgaris BEIJERINCK 1890 var. vulgaris FOTT et NOVAKOVA 1969 Stamm BOHM/BoRNs 1972/1 (As der Algensammlung der PH Kothen) basiert.

Anzucht und Entwicklungssynchronisation des Testorganismus erfolgte in einem modifizierten Nahrmedium nach KUHL und LORENZEN (1964) mit einer von BOHM (1973b) entwickelten, weit­gehend automatisierten Apparatur.

Das Prinzip des g{,wahlten autotrophen Wachstumstests (BiiHM 1973 a) besteht in der 6stiindigen parallelen Konfrontation synchroner Chlorella-Fliissigkeitskulturen konstanter Zelldichte ( ....... 7,5 X lOS Autosporen/ml) mit Konzentrationsreihen des jeweiligen Wirkstoffs. Dabei garantiert ein Licht­Karussell-Thermostat (BORNS 1974) fiir 30 Kultivierungsplatze (Reagenzglaser 30/200 mm) identi­sche, artspezifisch optimale Wachstumsbedingungen (36,5 °C, 10 1 Luft mit 2 Vol.-% C02/h, 28 W 1m2).

Die resultierende biologische Wirkung W in Form prozentualer Wachstumshemmung ist iiber wahlweise Extinktionsmessungen bei 680 oder 750 nm entsprechend

EK-Ew W=100·--­

EK-Eo (1)

zu berechnen, wobei Eo die standardisierte Anfangsextinktion, Ew und EK die Extinktionen wirk­stoffbehandelter bzw. parallel belichteter Kontrollsuspensionen nach 6 h Testdauer darstellen. Aus der Dosisabhiingigkeit der relativen prozentualen Wachstumshemmung sind die als Aktivitats. parameter definierten negativen dekadischen Logarithmen der molaren Effektorkonzentrationen, welche eine 50 %ige Hemmung des autotrophen Algenwachstums bewirken (pc50), durch graphische Interpolation gemaB Abb. 1 zuganglich.

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.......

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414 C.-R. KRAMER et al.

Tabelle 1. Aktivitiitspl!rameter (pcso) substituierter Nitrobenzene der allgemeinen Struktur

R-C6H4-N02

sowie ausgewiihUe hydrophobe (n) und elektronische (a) Substituentenkonstanten

Nr. R pCSOI ) pCS0

2 ) nB3) nNo24) as) ap +5)

1. H 3,31 3,28 0,0 0,0 0,0 0,0 2. 4-CHO 4,98 4,95 -0,65 -0,50 0,42 0,42 3. 4-Br 4,10 4,03 0,86 0,77 0,23 0,15 4. 4-Cl 3,96 3,94 0,71 0,65 0,23 0,11 5. 4-CH2CN 3,88 3,79 -0,57 -0,24 0,01 0,12 6. 4-NH2 3,01 3,00 -1,23 -0,49 -0,66 -1,30 7. 4-0CH3 3,70 3,67 -0,02 0,33 -0,27 -0,78 8. 4-0C2HS 3,62 3,61 0,38 0,62 -0,24 -0,756)

9. 4-0H 4,28 4,30 -0,67 -0,13 -0,37 -0,92 10. 4-0C4 H9 4,34 4,31 1,55 1,58 -0,32 -0,836 )

1I. 4-CN 4,37 4,40 -0,57 -0,56 0,66 0,66 12. 4-N02 4,30 4,15 -0,28 -0,39 0,78 0,78 13. 4-NHNH2 5,18 4,91 -0,88 -0,21 -0,55 -1,106) 14. 3-CHO 4,04 4,02 -0,65 -0,49 0,35 15. 3-COCH3 4,08 3,92 -0,55 -0,43 0,38 16. 3-N02 5,35 4,95 -0,28 -0,50 0,71 17. 3-CN 4,83 4,75 -0,57 -0,62 0,56 18. 3-Br 4,40 4,30 0,86 0,78 0,39 19. 3-CI 4,30 4,22 0,71 0,67 0,37 20. 3-0CaH7 4,08 4,12 1,05 1,21 0,10 21. 3-0H 3,70 3,73 -0,67 -0,30 0,12 22. 3-0Ha 3,42 3,39 0,56 0,94 -0,07 23. 3-NH2 3,14 3,10 -1,23 -0,53 -0,16 24. 3-00Ha 3,74 3,64 -0,02 0,26 0,12 25. 2-0H 4,40 4,22 -0,67 -0,137) -0,377) 26. 2-CHa 3,03 2,98 0,56 0,737) -0,177) 27. 2-0HO 4,41 4,28 -0,65 -0,507) 0,427) 28. 2-NH2 3,18 3,15 -1,23 -0,437) -0,667) 29. 2-N02 4,96 4,88 -0,28 -0,397) 0,787) 30. 2-CI 3,46 3,43 0,71 0,657) 0,237) 3I. 2-Br 3,56 3,55 0,86 0,777) 0,237) 32. 2-CN 5,27 5,20 -0,57 -0,567) 0,667)

1) pCso = -lg{EDso}, [ED5oJ = mol. 1-1; aus Dosis-Wirkungs-Beziehungen gemaB Abb.1 er-mittelte negative dekadische Logarithmen der molaren Effektorkonzentrationen, welche eine 50 %ige Hemmung des autotrophen Wachstums synchroner Chlorella vulgaris-Suspension en be-wirken; Werte basieren auf Extinktionsmessungen bei 680 nm

2) vgl. 1); Werte basieren auf Extinktionsmessungen bei 750 nm

a) aus Verteilungsdaten (lg P) substituierter Benzene im System n-OctanolfWasser abgeleitete hydro-phobe Substituentenparameter nach HANSCR et al. (1973)

4) Hydrophobizitatsparameter der Nitrobenzen-Standardserie; Berechnung der Daten nach FRANKE (1980)

5) a = elektronische Substituentenkonstanten nach HAMMETT (McDANIEL et al. 1958; HANSCR et al. 1973) ap + nach EXNER (1972)

Struktur-Wirkungs-Beziehungen monosubstituierter Nitrobenzene 415

6) geschatzte Werte in Relation zu R = 4-0CH3

7) Nutzung der jeweiligen para-Werte zur Quantifizierung des elektronischen bzw. hydrophoben Einflusses nicht tabellierter ortho-Substituenten

Ergebnisse und Diskussion

Monosubstituierte Nitrobenzene hemmen in praktisch relevanten Konzentrationen das autotrophe Wachs tum synchroner Chlorella vulgaris-Suspensionen. Die gezeigte Hemmaktivitat steht in funktioneller Beziehung zur applizierten molaren Wirkstoff­konzentration (Abb. 1). Aus den entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven lassen sich die negativen Logarithmen der isoaktiven Konzentrationen, welche eine 50 %ige Hemmung induzieren (pc50), durch Interpolation in einfacher Weise extrapolieren (Tabelle 1).

Die isoaktiven Konzentrationen der monosubstituierten Nitrobenzene weisen pra­gnante Unterschiedeauf. Variationenkonnen im Bereich von 9,7 x 10-4 bis4,5 x 10- 6mol/1 beobachtet werden, wodurch eine deutlich hohere Aktivitat gegenuber den von uns (TRUMPER 1984) untersuchten Phenolen angezeigt wird. Erhaltene Aktivitatsdifferenzen zeigen deutliche Substituentenabhiingigkeit.

Ermittelte Hemmdaten (Tabelle 1), die auf zeitgleich gemessenen Extinktionen bei 680 und 750 nm basieren, weisen auf keine signifikanten Unterschiede hin, weshalb nicht auf eine primare Beeinflussung der Pigmententwicklung geschlossen werden kann. Aus diesen Grunden wurden fUr die Berechnung der Korrelationsbeziehungen nur die bei 680 nm aufgenommenen Primardaten genutzt.

Auftragungen der Logarithmen der isoaktiven Konzentrationen als Funktion der ~N02-Werte gemaB FRANKE (1980) oder der (j-Konstanten (McDANIEL and BROWN 1958, HANSCR et al. 1973) fUr den Stichprobenumfang meta- und para-substituierter Derivate weiscn auf keine einfachen lincarcn Abhiingigkeiten hin (Abb. 2 und 3). Ortho-substituierte Verbindungen wurden in dies en Abbildungen zunachst nicht mit erfaBt, da Substituentenkonstanten hierfiir nur auBerst luckenhaft zur Verfugung stehen.

Einfach lineare und multiple Regressionsanalysen mit n- und (j-Parametern wurden deshalb zunachst fUr jede Substitutionsmoglichkeit getrennt vorgenommen. Die er­haltenen Korrelationsbeziehungen gemaB Gleichung (2) sind in Tabelle 2 zusammcn­gestellt.

(2)

Aus der Dbersicht der statistischen Daten (Tabelle 2) ist ersichtlich, daB lediglirh in 3 Fallen (Gl. 2.7, 2.8, 2.12) signifikante Beziehungen erhalten wurden.

Fur die meta-substituierten Verbindungen und die unsubstituierte Stammverbin­dung ist eine eindeutige Abhangigkeit der biologischen Aktivitat von elektronischcn Eigenschaften, die sich durch HAMMETT'sche (j-Konstanten beschreibcn lassen, zu erkennen (Gl. 2.7).

Wenn elektronische Wechselwirkungen fUr meta- und ortho-substituierte Derivate (Gl. 2.8, 2.12) bestimmende GroBen darstellen, so ist es chemisch-physikalisch sehr

416 C.-R. KRAMER et al.

Tabelle 2. Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehungen gemii[J Gleichung (2) zur Beschreibung der Substituentenabhiingigkeit der algiziden Aktivitiit substituierter Nitrobenzene gegenuber autotroph kulti: vierten Ohlorella vUlgaris-Suspensionen

Gl.-Nr. Substitu- Xl Xa bl ba bo n2) r2) S2) tionl)

2.1 p )'l;B -0,03 4,14 12 -0,043 0,614 2.2 P )'l;NOa -0,13 4,16 12 -0,141 0,607 2.3 P (J 0,36 4,15 12 0,289 0,587 2.4 P )'l;NOa (J -0,07 0,34 4,15 12 0,298 0,617 2.5 m )'l;B 0,12 4,04 12 0,135 0,662 2.6 m )'l;N02 -0,15 4,05 12 -0,157 0,660 2.7 m (J 2,33 3,48 12 0,957 0,192 2.8 m )'l;NOa (J 0,15 2,44 3,44 12 0,967 0,169 2.9 0 )'l;B -0,43 3,97 8 -0,393 0,835 2.10 0 )'l;NOa -0,97 4,05 8 -0,685 0,661 2.11 0 (J 1,16 3,87 8 0,693 0,654 2.12 0 )'l;NOa (J -0,82 0,99 3,91 8 0,898 0,398

1) P = para-, m = meta- bzw. 0 = ortho-Kernsubstitution 2) n = Stichprobenumfang, r = Korrelationskoeffizient

s = Standardabweichung der Regressionsfunktion (Wurzel aus der Reststreuung urn die empiri-sche Regressionsgeradej-ebene)

unwahrscheinlich, da13 diese aus der para-Position bedeutungslos sind. Es wurde deshalb versucht, die Differenzen zwischen den experimentellen pcso-Werten und denen, die nach Gleichung (2.8) zu erhalten sind, durch einen zweiten elektronisch determinierten Term zu erkHiren. Die O"p+-Konstanten (EXNER 1972), die Resonanzwechselwirkungen aromatischer Systeme zu charakterisieren vermogen, lieferten hierfur brauchbare Resultate.

n: 12 r: -0,837

Llpc50 = -1,27 O"p + + 0,334

s: 0,639

(3)

Ein weit effizienterer Zusammenhang ist zu erhalten, wenn einige Substituenten un­beachtet bleiben. Gleichung (4) ist das Ergebnis einer Korrelationsanalyse, die 4-Nitro­anilin, 4-Nitro-phenylhydrazin und 4-Nitro-benzaldehyd nicht berucksichtigt.

n:9 r: -0,940

LI pc50 = -1,28 O"p + + 0.176

s: 0,329

(4)

Offen bleibt allerdings die theoretische Interpretation der extremen Abweichungen genannter Derivate.

Interessant ist au13erdem, da13 die Dipolmomente f-l der para-Verbindungen ebenfalls zur Charakterisierung der pc50- Betrage geeignet sind.

11: 12 r: 0,920

LI pc50 = 0,48 f-l - 1,11

s: 0,454

(5)

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418 C.-R. KRAMER et al.

5,0

1 4-Br

4,0 o • &3-COCH3

4C1 3-CHO

- 0,5 o 0,5 1,0

Abb.3. Beziehung zwischen den Aktivitiitsparametern (peso) der autotrophen Wachstumshemmung von Chlorella vulgaris durch 3- und 4-substituierte Nitrobenzene und eleklronischen Substiluentenkonstanten (J'

(HANseR et al. 1973). Daten und Symbole entsprechend Tabelle 1. Eingetragene Regressionsgerade gilt fiir meta-Derivate (Gl. 2.7).

n:9 r: 0,941

Ll pc50 = 0,45# - 1,09

s: 0,329

(6)

Aus den Gleichungen (2.8) und (4) kann eine QSWB formuliert werden, die eine mogliche Variante zur Beschreibung der biologischen Aktivitat 3- und 4-substituierter Nitro­benzene darstellt.

pCso = 2,44 IY - 1,28 IYp + + 0,15 Jl:N02 + 0,18 X + 3,44

n: 21 r: 0,896 s: 0,230

4-Substitution: X = 1 3-Substitution: X = °

(7)

Struktur-Wirkungs-Beziehungen monosubstituierter Nitrobenzene 419

Fur para-substituierte Verbindungen ware Gleichung (7) als eine spezifische Form der Yukawa-Tsuno-Gleichung zu interpretieren, in welcher dem Kopplungseffekt eine spezifische Wichtung zukommt. Eine quantitative Struktur-Wirkungs-Analyse mit 4-substituierten 1-Nitro-3-amino-benzenen gelangt zu einem ahnlichen Resultat (HANSOH 1970), wobei der a+-Term gleichfalls einen negativen Anstieg aufweist. Die Ausbildung partieller Ladungen durch Resonanzstabilisierung durfte fUr die Bedeutung des Dipolmoments in Gleichung (5) und (6) verantwortlich sein.

Abschliel3end sollen die ortho-substituierten Verbindungen betrachtet werden. Die Inkonstanz des relativen Gewichts induktiver und mesomerer Effekte innerhalb einer Reaktionsserie wird von CHARTON (1969 a, b) als Grund fUr das Versagen der einfachen Hammett-Gleichung diskutiert. Derartige Verhaltnisse sollen bei ortho-substituierten Aromaten vorherrschen (ortho-Effekt). CHARTON'S ortho-Ansatz basiert auf der Sepa­ration von induktiven und mesomeren Anteilen. Bei der Interpretation von Gleichung (2.12) mul3 berucksichtigt werden, dal3 verwendete Substituentenkonstanten (nNo2' a) para-Werte sind.

Unter Berucksichtigung dieser Fakten und Einkalkulierung eventuell auftretender Kreuzprodukte zwischen den Strukturparametern wurden fUr 2-substituierte Derivate weitere Hypothesen gepriift. Die besten erhaltenen QSWB kiinnen durch folgende Glei­chungen (8) und (9) approximiert werden:

pc50 = 0,74 ap + 1,17 ar - 0,11 nB -1,65 nB . ar + 3,43 (8)

n: 8 r: 0,957 s: 0,263

pc50 = 2,32 1'5- + 0,37 ffi - 0,14nB -1,83 i5nB + 3.26 (9)

n:8 r: 0,978 s: 0,188

Gleichung (8) entspricht dem ortho-Ansatz nach CHARTON (ar, gemal3 PALM 1971), wahrend die Gleichung (9) die Separation von induktivem- und Resonanzeffekt mit den 1'5-- und ffi-Konstanten (HANSOH et al.1973) vorgenommen wurden. Die Kreuzterme kiinnen als elektronische Korrekturen der verwendeten nB-Konstanten (HANSOH et al. 1973) verstanden werden.

Einen hydrophoben Term mit negativem Anstieg, der relativ selten auf tritt, wurde ebenfalls am Beispiel der Hemmung von L-Alaninaminopeptidase durch ortho-substi­tuierte Piperidinoacetanilide gefunden (BARTH und HAGEMANN 1975).

Die berechneten quantitativen Struktur-Wirkungs-Beziehungen (Gl. 7,8,9) gestatten bei genugender statistischer Absicherung die Beurteilung der algiziden Aktivitat be­liebig disubstituierter Nitrobenzene uber den Umfang der untersuchten Stichprobe hinaus.

Dber den Wirkmechanismus ktinnen keine Aussagen getroffen werden, was auch nicht Ziel der Untersuchungen war.

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28 a

420 C.-R. KRAMER et aI., Struktur-Wirkungs-Beziehungen monosubstituierter Nitrobenzene

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Eingegangen am 20. Dezember 1985; angenommen am 24. Januar 1986

Anschrift der Verfasser: Prof. Dr. C.-R. KRAMER, Padagogische Hochschule "Wolfgang Ratke" Kothen, Sektion Biolog'ie/Chemie, LohmannstraBe 23, DDR - 4370 Kothen.