Reaktive Träuger mit Maleinimidgruppen zur Enzymimmobilisierung

Die Angewandte Makromolekulare Chemie 91 (1980) I79 - 201 (Nr. 1422)

Fritz-Haber-Institut der Max-Planck-Gesellschaft, Faradayweg 4 - 6, D-1000 Berlin 33

Reaktive Trager mit Maleinimidgruppen zur Enzymimmobilisierung

Georg Manecke und Herman-Josef Middeke

(Eingegangen am 1 1. Februar 1980)

ZUSAMMENFASSUNG: Es wurden hochpolymere Triiger rnit Maleinimidgruppen dargestellt und deren Bin-

dungsverhalten filr Cystein und thiolgruppenhaltige Enzyme in Abhangigkeit von verschiedenen Parametern wie Enzymkonzentration, Temperatur, pH-Wert, Reak- tionszeit und Harnstoffkonzentration untersucht. In Trypsin und a-Chymotrypsin, die keine SH-Gruppen aufweisen, wurden Thiolgruppen durch Thiolierung rnit N-Acetyl-D,L-homocysteinthiolacton eingefiihrt. Die am Polymeren gebundene Enzymmenge und die Aktivittit der Immobilisate wurden bestimmt.

SUMMARY: Maleinimide-groups containing macromolecular supports were pr .pared. The

concentration, temperature, pH, reaction time and urea-concentration dependent reactions with thiols and thiol containing enzymes were studied. Trypsin and a-chymotrypsin, exhibiting no free thiol groups, were polythiolated by means of N-acetyl-D,L-homocysteinethiolacton. The amounts of bound enzyme and the enzymatic activities of the immobilisates were determined.

Einleitung

Es ist seit langern bekannt, daf3 Maleinirnidderivate, insbesondere aber das N-Ethylmaleinirnid, rnit Thiolen schnell und quantitativ zu reagieren ver- rn6gen I - b. Speziell das N-Ethylrnaleinimid und das N-(CDirnethylamino- 3,5-dinitrophenyl) rnaleinirnid werden zur Bestimmung von Thiolgruppen in biologischem Material verwendet'. Obwohl unspezifische Reaktionen von Maleinimiden rnit Arninogruppen beschrieben sind *, lassen sich diese durch die Wahl niedriger pH-Werte bei der Reaktion rnit SH-Gruppen eliminieren. Eine polymer gebundene Maleinimidgruppe sollte daher in der Lage sein, Verbindungen, die SH-Gruppen aufweisen, selektiv zu binden.

179

G . Manecke und H.-J. Middeke

Darstellung und Eigenschaf ten der reaktiven TrUger

Als polymere Grundverbindungen wurden von uns Poly(aminostyro1) und Poly(vinylalkoho1) verwendet.

Poly(aminostyro1) ist in der Lage, sowohl mit Maleinsiiureanhydrid 5, als auch rnit N-Methylolmaleinimid zu reagieren. Mit Maleinsiiureanhydrid bil- det sich dabei ein Amid, das unter Wasserabspaltung in das Poly(ma1ein- imidostyrol) (1) ilbergeht:

Dazu wurde kiiufliches Poly(aminostyrol), das 5,8 mmol Aminogruppen je Gramm Polymeres (durch Perchlorsiiuretitration ermittelt) enthielt, mit dem 2,5-fachen seines Gewichtes an Maleinsaureanhydrid umgesetzt. Fur dieses Polymere konnte als Modellsubstanz das N-(4-Ethylphenyl)maleinimid aus Maleinsaureanhydrid und 4-Ethylanilin gewonnen werden. Die Infrarot- spektren des Polymeren und der Modellverbindung waren identisch.

Zur Umsetzung des Poly(aminostyro1)s rnit N-Methylolmaleinimid wurde es in trockenem Dioxan suspendiert, die Suspension rnit dem 2,5-fachen des Harzgewichts an N-Methylolmaleinimid versetzt und das bei der Reaktion gebildete Wasser rnit Dioxan azeotrop abdestilliert. Der so gewonnene Tra- ger (2) wurde anschlieflend mit Dioxan extrahiert und im Vakuum bei 50°C getrock net.

2

Auch fur dieses Polymere wurde durch analoge Reaktion von CEthylanilin rnit N-Methylolmaleinimid eine Modellsubstanz dargestellt, die das gleiche

180

Reaktive TrUger zur Enzymimmobilisierung

C H N Reakt ive Gruppen*

(0700) ((TJO) (%o) (mmol. g- I )

Infrarotspektrum zeigte wie das Polymere. In Tab. 1 sind die auf Poly(ami- nostyro1)-Basis erhaltenen Polymeren zusammengefdt. Es ist aus Tab. 1 zu ersehen, d d die urspriinglich im Harz vorhandenen Aminogruppen ( 5 3

Quellung in Wasser (YO)

Aus der Gewichtszunahme bei der Reaktion mit Maleinssureanhydrid bzw. N-Methylolmaleinimid berechnet.

mmol - g- I ) zu 82% (Triger 1) bzw. zu 61 To (Triger 2) reagiert haben. Die aus dem Poly(aminostyro1) dargestellten maleinimidhaltigen Polymeren zeigten in Wasser keine meBbare Quellung.

Um quetlbare maleinimidhaltige Polymere zu erhalten, wurde Poly(viny1- alkohol) verschieden hoch mit Terephthalaldehyd vernetzt und das so entstandene wasserunldsliche Polymere mit 3-Maleinimidobenzaldehyd (3) oder Maleinimidoacetaldehyddimethylacetal (4) umgesetzt. Dazu wurde Poly- (vinylalkohol) in waBriger Lasung in Gegenwart von Salzsaure mit 1 mol-To, 2 mol-Yo oder 5 mol-Yo Terephthalaldehyd nach der Methode von Kuhn und Balmer l o vernetzt (5a - 5c).

3-Maleinimidobenzaldehyd (3) wurde aus 2-(3-Aminophenyl)-l,3-dioxolan I ' und Maleinsiureanhydrid gewonnen. Das Dioxolan wurde anschlie- Bend hydrolytisch zum Aldehyd gespalten und danach der RingschluB zum Imid (3) mit Essigsiureanhydrid vollzogen. Wird die Schutzgruppe spiter abspalten, erhilt man schwerer isolierbare Produkte.

181

G. Manecke und H.-J. Middeke

Maleinimidoacetaldehyd-dimethylacetal (4) konnte aus Maleinsiure- anhydrid und Aminoacetaldehyddimethylacetal in gleicher Weise gewonnen werden:

CH30 \

/ CH,O

CH-CH

0

4

Die Maleinimidderivate wurden im Verhiltnis OH-Gruppen zum Aldehyd bzw. Acetal von 2 : 1 rnit den verschieden vernetzten Poly(vinylalkoholen) (5a - 5c) umgesetzt. Dazu wurde das vernetzte Polymere mit Wasser vorgequollen, rnit konzentrierter SalzsPure versetzt und unter Ruhren bei 45 bis 50 "C rnit den entsprechenden Mengen der Maleinimidderivate umgesetzt. Nach 60 h wurden die entstandenen reaktiven Polymeren abgesaugt und rnit Wasser extrahiert, rnit Aceton entquollen und an der Luft getrocknet. An- schlieRend wurden sie auf Korngr6Den zwischen 0,l und 0,2 mm ausgesiebt. Der rnit Maleinimidoacetaldehyddimethylacetal umgesetzte Poly(viny1alko- hol) stellt die Triger 6a, 6b und 6c dar und der rnit 3-Maleinimidobenz- aldehyd umgesetzte Poly(vinylalkoho1) die Triger 6d und 6c:

4 60, b, c

\

/

5 b . c t OHC

6d, e

0

3

Die Quellung der mit verschiedenen Mengen Terephthalaldehyd vernetzten Poly(vinylalkoho1)-Derivate ist aus Tab. 2 zu erkennen. Sie nimmt, wie erwartet, mit steigendem Vernetzergehalt ab.

182


Polymeres

Tab. 2. Quellung des mit Terephtalaldehyd vernetzten Poly(vinylalkoho1)s.

Vernetzerzusatz Quellung in Wasser (mol-Vo je mol OH) (Vo)

Trlger

5a 5b 5 C

Vernetzer- Gebundenes N-Gehalt Quellung Menge der zusatz Maleinimid- in Wasser eingefohrten

derivat Maleinimid-

(mol- To) (VO) (mmol . g - I) gruppen*

1 2 5

940 720 160

Tab. 3. Charakterisierung der rnaleinimidhaltigen Polymeren auf der Basis von vernetztem Poly(vinylalkoho1).

6 a 1 Maleinimido- 1,92 420 1,4 acetaldehyddimethylacetal (4)

6 b 2

6c 5

Maleinimido- 1,62 100 acetaldehyd- dimeth ylacetal (4)

Maleinimido- 2,50 acetaldehyddimethylacetal (4)

35

6d 2 3-Maleinimido- 1,79 80 1,3 benzaldehyd (3)

6 e 5 3-Maleinimido- 2,tO 35 1,s benzaldehy d (3)

* Berechnet aus dem N-Gehalt der Polymeren.

183


Tab. 3 charakterisiert die vernetzten Poly(vinylalkoho1)-Drivate nach deren Umsatz mit den Maleinimidverbindungen. Es ist ein deutlicher Ruck- gang der Quellbarkeit nach der Umsetzung festzustellen.

Bei den wenig vernetzten Polymeren ist die Entfernung des restlichen Was- sers offensichtlich nicht vollsandig erfolgt; daher erscheint der Stickstoff- gehalt dieser Harze niedriger als der Gehalt bei den zu 5 mol-Yo vernetzten Polymeren. Die Werte fiir die Anzahl der eingefuhrten Maleinimidgruppen sind deshalb bei den schwach vernetzten Polymeren nur von geringer Genauigkeit.

Um den Gehalt an reaktiven Maleinimidgruppen variieren zu konnen, wurden fur die Reaktion des mit 5 mol-Yo Terephthalaldehyd vernetzten Poly(vinylalkoho1)s rnit Maleinimidoacetaldehyd-dimethylacetal (4) verschieden lange Zeiten gewiihlt. Abb. 1 zeigt die Abhlngigkeit der Menge der eingefiihrten Maleinimidgruppen von der Reaktionszeit, berechnet aus dem Stickstoffgehalt der erhaltenen Harze.

P p - I 2,o

0 10 20 30 40 50 60 Reaktionsdauer in h

Abb. 1 . Zeitabhingigkeit des Umsatzes von Malein- imidoacetaldehyddi- methylacetal (4) mit dem zu 5 mol-To mit Terephthalaldehyd vernetzten Poly(viny1- alkohol) (5c). Um- satzbedingungen: 2 g ausgesiebtes Polyme- res wurden in 100 cm3 Wasser und 2 cm3 konz. Salzsiure bei 45 - 50°C mit 4 g (21,6 mmol) Malein- imidoacetaldehyd- dimethylacetal (4) umgesetzt.

Die Reaktion rnit dem Polymeren ist auch nach 60 h noch nicht beendet. Aus der aufgefuhrten ZeitabhBngigkeit des Umsatzes ergibt sich die MOg- lichkeit, die Konzentration an reaktiven Gruppen am Triiger durch die Dauer der Reaktion zu steuern.

Wlhrend die Anzahl der in die Polymeren eingefiihrten reaktiven Grup- pen beim Poly(vinylalkoho1) aus dem Stickstoffgehalt der erhaltenen Harze

184

Reaktive Trager zur Enzyrnimrnobilkierung

ermittelt werden konnte, wurde beim Poly(aminostyro1) die Gewichts- zunahme des Polymeren nach der Reaktion mit Maleinstiureanhydrid oder N-Methylolmaleinimid zur Bestimmung der Anzahl der ins Polymere eingefiihrten Gruppen herangezogen. Die Menge der am TrBger vorhandenen reaktiven Gruppen lieR sich aber auch durch dessen Reaktion mit Thiolen be- stimmen. Wahrend die Reaktionen der niedermolekularen Maleinimidderi- vate rnit Thiolen schnell verlaufen und bisweilen in wenigen Minuten vollstandig sind, benotigen die polymeren Maleinimidderivate erheblich langere Zeit zur Reaktion. Abb. 2 zeigt die von den Tragern (1) und (6e) aufgenommene Cysteinmenge in Abhangigkeit von der Zeitdauer der Reaktion. Dazu wurde das jeweilige Polymere mit einer Cysteinlosung versetzt und rnit Puf- fer auf pH 7,O gehalten. Die nach der Reaktion in der Losung verbliebene Cysteinmenge wurde rnit 5,5 ‘-Dithiobis(2-nitrobenzoesaure) (DTNB) bestimmt 1 2 .

Abb. 2 Zeitliche AbhBngig- keit der Cysteinauf- nahme der Trtiger 1 I

und 6e. TrSLger I: A & 99,36 mg, Trager 6e: 1,5 -

m C al ul u

0 110,58 mg. - Cysteinltisung: w

1,70 g (14 mmol) Cystein in 500 cm3 2 Wasser, davon je- C

Umsatz entnommen 2

.-

>. 1,o-

D weils 20 cm3 zum

0,05 M Phosphat- E 0.0 I I I I I

5 0.5 -

m und mit 5 cm3 - puffer (pH 7,O) ge- 0 1 2 3 4 5 mischt. SH-Bestim- Reaktionsdauer in h mung rnit DTNB nach Ellman’*.

WBhrend der Trager 6 e nach etwa 4 h vollstandig rnit dem Cystein aus- reagiert hatte und genau die Menge aufgenommen wurde, die dem aus der Stickstoffanalyse ermittelten Maleinimidgehalt entspricht, reagierte der nicht quellbare Trager 1 deutlich langsamer. Hier lieRen sich nach 5 h erst etwa ein Drittel der vorhandenen Maleinimidgruppen mit Cystein umsetzen.

Da die Nucleophilie der Thiolgruppen vom pH-Wert der Umgebung bestimmt wird6S8, sollte auch die Reaktionsgeschwindigkeit der reaktiven Poly-

185


meren vom pH-Wert beim Umsatz mit Thiolen abhangig sein. Es wurde deshalb die Reaktion von Cystein mit dem Trtiger 6 e bei konstanter Reaktions- dauer bei verschiedenen pH-Werten untersucht. In Abb. 3 ist die Cysteinauf- nahme von Trager 6 e nach jeweils 30 min in Abhtingigkeit vom pH-Wert dargestellt. Der Trtiger zeigte in diesem pH-Bereich eine konstante Quellung.

L 0 [7) :?

0.7 -

.: 0.6-

G 0.5-

- c m

m

0 D 2 OP-

g 02- 5 0,3- n

Abb. 3. Abhlngigkeit der Cysteinaufnahme durch Trlger 6e vom pH-Wen. Etwa 100 mg Harz wurden in je 5 cm3 Titrisol-Puffer verschiedener pH- Werte (Merck) 30 min mit 20 cm3 einer 14 mM Cysteinlosung reagieren gelassen. Zurilckgebliebenes Cystein wurde nach Ellman I Z bestimmt.

I I I I I I I l I 1 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 12

PH

Beim pH 7 3 lag ein deutliches Aufnahmemaximum: Zwar steigt zu hbhe- ren pH-Werten hin die Nucleophilie der SH-Gruppe des Cysteins, gleichzei- tig findet aber ab pH 7 eine Aminolyse oder Hydrolyse des Imidringes statt, so da8 oberhalb pH 8 weniger Cystein gebunden wird5-6*8e13. Ebenso konnte beobachtet werden, da13 sich das Polymere oberhalb pH 7 zu verfarben be- gann und bei pH 1 1 tiefrot vorlag 1 4 .

Thiolierung der Proteine

Zur Bindung an die maleinimidhaltigen Polymeren wurden Trypsin und a-Chymotrypsin gewahlt, da deren Struktur und Reaktionsweise gut bekannt sind und sie in gro13er Reinheit erhtiltlich sind. Allerdings enthalten sie keine freien nativen SH-Gruppen, so da13 sie vor den Immobilisierungsreak- tionen thioliert werden milssen j6 . Die Thiolierungsreaktion wurde nach

186

Reaktive Trilger zur Enzymimmobilisiemng

einer abgewandelten bekannten Vorschrift von Reiner und Siebeneick mit N-Acetyl-D,L-homocysteinthiolacton ausgefiihrt 17. 1 8 . Das Protein wurde nach der Thiolierungsreaktion durch eine asymmetrische Membran (Aus- schlu8grenze 10000 g - mol- I ) ultrafiltriert und so von den niedermolekularen Beimengungen des Thiolierungsgemisches befreit. Dabei ging etwa 20% des Proteins verloren. In dem thiolierten Produkt liel3en sich im Mittel drei Thiolgruppen je Enzymmolekiil mit DTNB nachweisen. Wahrend natives und thioliertes Trypsin etwa die gleiche Aktivitit bei der Spaltung von Nu-Benzoyl-L-argininethylester-hydrochlorid (BAEE) aufwiesen, sank die Aktivitat des thiolierten a-Chymotrypsins bei der Spaltung von N-Acetyl-L- tyrosinethylester (ATEE) auf etwa 80% der Aktivitat des nativen Enzyms ab. Das ultrafiltrierte thiolierte Enzym wurde im AnschluR lyophilisiert. Die Eigenschaften der thiolierten Enzyme schwankten stark von Thiolierung zu Thiolierung. Im pH-Profil der Aktivitaten der thiolierten Enzyme erschien jeweils ein zweites Optimum der Aktivitat. Die Abb. 4 und 5 zeigen die pH- Profile der Aktivitaten von thioliertem und nativem Trypsin und a-Chymo- trypsin. Die Aktivitiiten wurden pH-statisch gemessen. Dabei wurden die pH-Werte mit Trishydroxymethylaminomethan (TRIS) und Salzsaure eingestellt.

Immobilisierung von TIypsin und a-Chymotrypsin

Bei den Bindungsversuchen der thiolierten Enzyme an die auf der Basis von Poly(aminostyro1) hergestellten Trager 1 und 2 zeigte es sich, da8 diese Trager auch nach langen Reaktionszeiten nicht in der Lage waren, thioliertes Trypsin oder a-Chymotrypsin zu binden.

Die hydrophilen TrPger 6 a bis 6e wurden zunlchst rnit thioliertem a-Chymotrypsin bei identischen Reaktionsbedingungen umgesetzt. Je etwa 50 mg Trager wurden vier Stunden bei pH 6 und 4°C mit 5 cm3 einer 1 ,5proz. Ldsung des thiolierten a-Chymotrypsins gerilhrt. Anschlieoend wurde die Uberstehende Reaktionsldsung durch eine Fritte abgepumpt und das Harz mit 1 M NaC1-Losung gewaschen. Aus dem Proteingehalt in den vereinigten Ldsungen (250 cm3) wurde die vom Harz aufgenommene Enzym- menge bestimmt.

Die besser quellbaren Trager binden entsprechend mehr Protein. Die stlr- ker vernetzten Harze mit geringerer Quellbarkeit zeigen eine hdhere relative Aktivitat, die sicheriich darauf zuriickzufuhren ist, da8 hier die Immobilisie- rung vor allem in den besser zuganglichen Schichten der Harzkdrner erfolgt

187


50 - 7 0 E

c = 40- 4d

w 0

30- z a

20-

Abb. 4. Aktivitltsprofil von nativem (A) und thioliertem ( 0 ) Trypsin. Mes- sung: pH-statisch iiber den Ver- brauch von 0,05 M NaOH bei 25 "C. Substratlbsung: 20 ml 0,0105 M BAEE-Losung wurden vor der Messung mit 1 ml einer Lbsung aus 0,21 M TRIS . HCI und 2,i M NaCl gemischt. Die Eigenhydrolyse des BAEE wlhrend der Messung wurde berlicksichtigt. Enzymmenge: Je- weils etwa 80 pg.

I I I , I , I

Abb. 5. Aktivittitsprofil von nativem (A) und thioliertem ( 0 ) a-Chymotrypsin. Mes- sung: pH-statisch iiber den Verbrauch von 0,l M NaOH bei 20°C. Substrat- Ibsung: 10 ml 0,022 M ATEE-Lbsung (5proz. in Ethanol) und 1 ml 0,22 M TRIS - HCI, 2.2 M NaCl wurden vor der Messung gemischt. Die Eigenhydro- lyse des ATEE wurde be- riicksichtigt.

ist. Die Flhigkeit des Trlgers 6a, grok Mengen des thiolierten Enzyms zu binden, sowie die hohe relative Aktivitlt seines Immobilisats ist auf die sehr hohe Quellbarkeit des Trlgers zuriickzufiihren. Da die Trager 6a und 6 b we-

188

Reaktive Trdger zur Enzymimrnobilisierung

Trager

Tab. 4. Die von den Tragern 6a bis 6e aufgenommene Menge thiolierten a-Chymo- trypsins und die Aktivititt sowie relative Aktivitlt der Immobilisate.

Aufgenommene Aktivitat des Relative Proteinmengea Immobilisats Aktivitat (meeg- ' ) (pmol - g- I - min- I ) 1%)

6a 21 1,4 1432,O 3,7 6b 109,4 488,3 2,6 6c 79,3 5353 5,6

6e 13.8 603 3 s

a Bestimmt nach der modifizierten Methode nach Fohn-Ciocalteau 1 9 .

pH-statisch bei pH 8 3 rnit 1 1 cm3 0,02 M ATEE, 0,02 M TRIS * HCI, 0,2 M NaCl bei 25°C. Bezogen auf die Aktivitat des thiolierten a-Chymotrypsins bei pH 8 3 , das im jeweiligen Ansatz zur Reaktion kam.

6d 30,O 191,4 2,9

gen ihrer hohen Quellbarkeit mechanisch weniger stabil waren und die Tra- ger 6 d und 6 e im Vergleich sehr vie1 weniger thioliertes Enzym binden konnten, wurden eingehendere Untersuchungen mit den thiolierten Enzymen nur mit Trager 6c vorgenommen.

Bei allen Immobilisierungsreaktionen war das AusmaR der Thiolierung der Enzyme fur das Ergebnis entscheidend. Da fur die verschiedenen Unter- suchungen nicht nur eine Thiolierungscharge zur Verfiigung stand, fielen auch die einzelnen Immobilisierungsreaktionen unterschiedlich aus. Generell wurde die Beobachtung gemacht, daR rnit steigendem SH-Gehalt die Bin- dung ans Polymere zunirnmt, aber die relative Aktivitiit des erhaltenen Im- mobilisats bezogen auf die Aktivitat des thiolierten Proteins abnimmt. Tab. 5 zeigt das Immobilisierungsergebnis bei der Reaktion von thioliertem Tryp- sin mit dem Trager 6c.

Die pH-Abhangigkeit der Aktivitat wurde fur die an den Trager 6c gebundenen Enzyme untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abb. 6 und 7 dargestellt.

Die immobilisierten Enzyme zeigten eine ahnliche AbhLngigkeit der Akti- vitat vom pH-Wert wie die nativen Enzyme. Sie zeigten kein zweites Opti- mum der Aktivitat wie die thiolierten Enzyme. Mit steigendem pH-Wert steigt die Aktivitat des gebundenen Trypsins nicht so stark an, wie die des

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Mittlerer Thiolgehalta (mol . mol Protein- I )

Aufgenommene Aktivitlt Relative Proteinmengeb des ImmobilisatsC Aktivitiit (mg * g- I ) (pmol. g- I * min- I ) (070)

1,52 59 0,77 34 0.5 1 19 0,20 19

1 02 77 83

172

4 s 6.5

12,3 29,4

~ ~~ ~

Immobilisationsbedingungen: 50 mg TrBger 6 c in 15 cm3 0.05 M Phosphatpuffer (pH 8,0), 0,33 in Trypsin bei 4°C iiber 24 h.

a Bestimmt rnit DTNB nach Ellman'2. Bestimmt nach der modifizierten Methode nach Folin-Ciocalteau 19.

pH-statisch bei pH 8,5 mit 21 cm3 0,Ol M BAEE, 0,02 M TRIS * HCI, 0,20 M NaCl bei 25°C. Bezogen auf die Aktivitlt des thiolierten Trypsins, das jeweils zur Reaktion kam.

Abb. 6. pH-Profil der Aktivitat von an TrBger 6 c immo- bilisiertem Tryp- sin. Aktivitlts- c

2 300 messung: pH- 5 statisch mit 21

cm3 0,010 M E E

BAEE, 0,020 M - 200 3

0,200 M NaCl .- bei 25°C. Menge 5 100 des eingesetzten .-

f

0 - 0

0,

C

TRlS * HCI,

c .- > c Immobilisats:

54,OS mg (18 mg Trypsin/g TrB- ger). Die Eigen- hydrolyse des BAEE wurde be- riicksichtigt.

7 a 9 10 11 PH

190

Reaklive Trliger zur Enzymimmobilisienmg

3 siertem - a-Chymot rypsin. Aktivitatsmessung: E pH-statisch rnit I

1 1 cm3 0,020 M ATEE, 0,020 M TRIS * HCI,

.? 200- 0,200 M NaCl bei 25 "C. Menge des s a eingesetzten Immo- bilisats: 12,44 mg

.- B o 600- E 0, 3 400- c

:0

.- c

L .-

l ' l ~ l ~ l ~ l

freien Trypsins. Das Aktivitatsprofil des gebundenen a-Chymotrypsins ist um eine halbe pH-Einheit zu hdheren pH-Werten verschoben.

Fiir die Optimierung der Imrnobilisierungsreaktion von thioliertern a-Chymotrypsin an Triger 6c wurden die Reaktionsbedingungen variiert. Es konnten dabei allerdings nicht alle Untersuchungen mit derselben Charge des thiolierten Enzyms durchgefilhrt werden.

Zunachst wurde die Abhangigkeit der gebundenen a-Chyrnotrypsinmenge und die Aktivittit des dabei erhaltenen Immobilisats von der bei der Immobi- lisierungsreaktion angewendeten Enzymkonzentration untersucht. Abb. 8 zeigt, dal3 die gebundene Enzymmenge mit steigender Enzymkonzentration ansteigt. Die Aktivitat des erhaltenen Immobilisats durchliuft ein Maxi- mum. Der Abfall der Aktivitat bei htiherer Enzymkonzentration ist sicher- lich auf die Selbstverdauung des Enzyms zuriickzufiihren, die bei pH 8,O und 20 "C sehr hoch ist und mit steigender Konzentration des Enzyms zunimmt.

Weiterhin wurde die Temperaturabhangigkeit der Immobilisierungsreak- tion untersucht. Es ist aus Abb. 9 zu ersehen, dal3 mit steigender Temperatur wie erwartet auch die gebundene Menge EiweiR ansteigt. Die Aktivitat des Immobilisats fallt jedoch mit hdherer Temperatur stark ab. Fur eine hohe Aktivitatsausbeute bei der Immobilisierungsreaktion ist also auch in diesem Fall eine niedrigere Temperatur unerlaialich.

191


1 2 3 r, Konzentration in %

Abb. 8. Die Abhingigkeit des an Trager 6 c gebundenen a-Chymotrypsins von der Enzymkonzentration beim Umsatz. Reaktionsbedingungen: 60 mg Trtiiger in 1,5 cm3 mit Britton-Robinson-Puffer (pH 8,O; 0,4 M Borat, 0,4 M Acetat, 0,4 M Phosphat) gepufferter Enzymldsung bei 20°C in 4 h.

5 10 15 20 25 Temperatur in ' C

Abb. 9. Menge und Aktivittit von gebundenem a-Chymotrypsin an Trtiger 6c in Abhgngigkeit von der Temperatur bei der Immobilisierungsreaktion. 60 mg Trlger in 1,5 cm3 mit Bntton-Robinson-Puffer (pH 8,O; 0.4 M Borat, 0,4 M Acetat, 0,4 M Phosphat) gepufferter 2,6proz. Enzymldsung in 4 h.

192

Reaktive Trdger zur Eniymimmobilisierung

Es wurde ebenfalls die zeitliche Abhangigkeit der Immobilisierungsreak- tion untersucht; dabei wurde auch der EinfluB der Selbstverdauung des Enzyms erkennbar werden. In Abb. 10 sind die Ergebnisse dieser Untersu- chung zusammengefafit. Die gebundene EiweiBmenge steigt nach 4 h Reak- tionszeit nur noch wenig. Die Aktivitat des Immobilisats ist schon nach 3 h

1 2 3 4 5 Reaktionsdauer in h

Abb. 10. Menge und Aktivitslt von gebundenem a-Chymotrypsin an Trtiger 6 c in Abhangigkeit von der Umsatzdauer. 60 mg Trslger in 1,5 cm3 mit Britton- Robinson-Puffer (pH 8,O; 0,4 M Borat, 0.4 M Acetat. 0,4 M Phosphat) gepufferter 2,4proz. Enzymhung bei 4 "C.

maximal; mit zunehmender Reaktionszeit nimmt sie ab, weil hier wahr- scheinlich eine Inaktivierung durch Selbstverdauung erfolgt. Da die Reak- tion von Maleinimidderivaten mit Thiolen stark von deren Nucleophilie und somit vom pH-Wert der Reaktionsmischung abhlngt s,8, sollte auch die Im- mobilisierungsreaktion pH-abhangig verlaufen. So sollten oberhalb pH 7 auch Amino- und Imidazolgruppen des Enzyms an die Doppelbindung des Maleinimids addiert werden. In Abb. 11 ist die pH-AbhPngigkeit der Immo- bilisierungsreaktion aufgefiihrt. Die vom Harz aufgenommene Enzymmenge steigt mit dem pH-Wert an, wahrend die Aktivitat des resultierenden Immo- bilisats ebenso stark fallt, was zum einen auf eine mit steigendem pH-Wert zunehmende Selbstverdauung, zum anderen auf eine sterische Hinderung durch mehrfache Bindung ans Polymere zuruckgefiihrt werden ktinnte.

Es sollte die Immobilisierung auch in Gegenwart von Harnstoff durchge- fuhrt werden, wobei dieser eine Entfaltung des Enzymmolekuls infolge der

193


t ISI 70- * :0

\ 060-

:: 50- C ._

%

40-

r" 30- Y rr 20- n E 10- E

0

.-

Abb. 12. Menge und Aktivitlt von gebundenem a-Chymotrypsin an Trlger 6c in Abhlngigkeit von der Harnstoffkonzentration beim Umsatz. 50 mg Trl- ger in 2,6 cm3 mit Britton-Robinson-Puffer (pH 6,O; 0,4 M Borat. 0.4 M Acetat, 0,4 M Phosphat) gepufferter 1,9proz. Enzymldsung in 4 h bei 4°C.

0 1 2 3 4 5

Hornstoffkonzentration in rnol.dm3

Menge und Aktivitlt von gebundenem a-Chymotrypsin an Trlger 6 c in Abhlngigkeit vom pH-Wert beim Umsatz. 60 mg TrSLger in 4,O cmmit Britton-Robinson-Puffer (0,4 M Borat, 0,4 M Acetat, 0,4 M Phosphat) gepufferter 1.7prOZ. Enzymldsung in 4 h bei 4°C.

Abb. 1 1 .

194

Reaktive Trdger zur Enzyrnimrnobilkierung

Sprengung von Wasserstoffbrucken herbeifiihrt. Das entfaltete Enzymmole- kul wiirde dann infolge der besseren Zuganglichkeit der reaktiven Gruppen in grO8eren Mengen gebunden werden. Es zeigte sich, dal3 mit hOherem Ge- halt an Harnstoff mehr a-Chymotrypsin gebunden wird, die Aktivittit dabei jedoch abnimmt.

Aus den bisher gemachten Untersuchungen konnte eine Optimierung der Immobilisierungsreaktion erfolgen. So konnten an den Trager 6c 145,3 mg a-Chymotrypsin je Gramm TrHger gebunden werden aus einer 1,3pr02. L& sung des Enzyms bei pH 6,O und 4 "C in vierstundiger Reaktion. Die Aktivi- ttit des erhaltenen Immobilisats betrug 2345 pmol - g- I * min - ' bei einer rela- tiven Aktivitiit, bezogen auf die Aktivitat des thiolierten a-Chymotrypsins, von 8,9%.

Experimenteller Teil

Herkun f t der Materialien

a-Chymotrypsin EC 3.4.21.1 (Boehringer, Mannheim), Trypsin EC 3.4.21.4 (Merck, Art. 24579), NU-Benzoyl-L-argininethylester-hydrochlorid (BAEE, Merck), N-Acetyl-L-tyrosinethylester (ATEE, Merck), N-Acetyl-D,L-homocysteinthiolacton (AHTL, Ega, Steinheim). Poly(vinylalkoho1) (Schuchardt, Molgewicht 72 OOO, Hydrolysegrad 97,5 - 99,5%), Polyaminostyrol (Norsk Hydro). N-Methylolmalein- imid wurde nach Tawney, Snyder et al. * O s Z 1 dargestellt.

Die Elementaranalysen wurden mit einem Perkin-Elmer Analyser 240 durchgefilhrt. Die Absorptionsmessungen erfolgten mit einem Beckman DB-Spektral- photometer.

1 . Darstellung von 3-Maleinimidobenzaldehyd (3)

1 . 1 (Z)-4-0xo-4-[3-(1,3-dioxolan-2-yl)phenylamino]-2-butencarbonsilure

Eine Lbsung von 20 g (0,12 mol) 2-(3-Aminophenyl)-l,3-dioxolan, welches nach Hibbert und Sturrock I ' dargestellt wurde, in 60 cm3 Diethylether wurde langsam und unter Kiihlen zu einer LOsung von 12 g (0,12 mol) Maleinslureanhydrid in 100 cm3 Diethylether unter starkem Rilhren getropft. Das ausgefallene gelbe Amid wurde abgesaugt, mit Diethylether gewaschen und aus Ethylacetat umkristallisiert.

C I3H 1 ,NO5 ( 2 6 3 3 ) Ber. C 59,31 H 4.98 N 5,32 Gef. C 59,47 H 5,05 N 5,49

Ausb.: 30 g, Schmp.: 146°C.

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1.2 (Z)-4-0xo-4-(3-aminobenzaldehyd)-2-butencarbo~dure

25 g (95 mmol) (2)-4-OxO-4-[3-( 1,3-dioxolan-2-yl)phenylamin0]-2-butencarbon- slure wurden in 120 cm3 Wasser suspendiert und die Suspension schnell erwumt. Bei 95 "C ging das Dioxolan schnell in Ldsung; nach kurzer Zeit fie1 ein weiDer Nieder- schlag aus, welcher abgesaugt und mit vie1 Wasser gewaschen wurde. Das Produkt wurde bei 50°C i. Vak. getrocknet.

C, , H,NO, (2 1 9,20) Ber. C 60,27 H 4.14 N 6,39 Gef. C 60,36 H 4,16 N 6,66

Ausb.: 19 g, Schmp. 173°C.

1.3 3-Maleinimidobenzaldehyd (3)

In ein Gemisch aus 50 cm3 (0.5 mol) Essigslureanhydrid, 0,03 cm3 DMF und 0,5 g Natriumacetat wurden 1 5 ,O g (68 mmol) (Z)-4-0~0-4-(3-aminobenzaIdehyd)-2-buten- carbonsiiure gegeben und die Mischung unter Riihren auf 80°C erhitzt. Nach 30 min bei dieser Temperatur wurde auf Raumtemperatur gekiihlt und das nichtumgesetzte Essigslureanhydrid mit Wasser hydrolysiert. Das abgeschiedene Maleinimidderivat wurde abgesaugt, aus Wasser umkristallisiert und i. Vak. getrocknet.

Ausb.: 8,5 g , Schmp.: 95°C.

C, ,H,NO3 (201.18) Ber. C 65,67 H 3.51 N 6,% Gef. C 65,68 H 3,46 N 6,32

2. Darstellung von Maleinimidoacetaldehyddimethylacetal(4)

2.1 (Z)4-0x0-4-(1, I -dimethoxyethyl-2-amino)2-butencarbonsdure

4.87 g (46,3 mmol) Aminoacetaldehyddimethylacetal wurden in 20 cm3 Diethyl- ether gelBst und langsam unter Kiihlung und starkem Rilhren zu einer LOsung von 434 g (46.3 mmol) Maleinsilureanhydrid in 60 cm3 Diethylether getropft. Das ausge- schiedene Amid wurde nach 1 h abgesaugt, n i t Ether gewaschen, aus Toluol umkristallisiert und i. Vak. getrocknet.

Ausb.: 9,22 g, Schmp.: 1 1 1 "C.

CsHISN05 (203,20) Ber. C 47,29 H 6,45 N 6.89 Gef. C 47,W H 6.55 N 6,61

2.2 Maleinimidoacetaldehyddimethylacetal(4)

8,O g (39,4 mmol) der (Z)-4-Oxo-4-( 1,l -dimethoxyethyl-2-amino)-2-butencarbon- slure wurden in 10 cm3 (0,l mol) Essigslureanhydrid mit 0.5 g Natriumacetat fur 15

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min auf 65 "C erhitzt. Nach dem Abkilhlen wurde die LBsung filtriert, das Essigsaure- anhydrid am Rotationsverdampfer abgezogen und der Riickstand bei 1 mbar und 91 "C destilliert. Das Produkt kondensierte als farbloses 01. Ausb.: 5,3 g, ng: 1,4715.

C,H, ,NO4 ( 1 85,I8) Ber. C 51,89 H 5 9 N 736 Gef. C 51,41 H 6,20 N 7,42

3 . Darstellung von Poly(ma1einimidostyrol) (1 )

Kommerziell erhlltliches Poly(aminostyro1) wurde auf KorngrbRen zwischen 0,l und 0,2 mm ausgesiebt, mit Methanol gewaschen und mit einer Lbsung von Zinn(I1)-chlorid in konzentrierter Salzsaure behandelt, bis aus dem Polymeren kein Schwefelwasserstoff mehr entwjch. Das Harz wurde anschlieaend rnit Wasser gewaschen und mit l0proz. Natronlauge 1 h geschiittelt. Dann wurde rnit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen, das Wasser durch Methanol ersetzt und nach dem Absaugen des Methanols i. Vak. bei 50°C getrocknet. AnschlieRend wurde das Harz nochmals auf KorngrbRen zwischen 0,l und 0,2 mm ausgesiebt.

Etwa 0,s g des so vorbereiteten Polymeren wurde in einen verschlieabaren Kolben eingewogen und mit einer Lbsung von 2 bis 5 g (20 bis 50 mmol) Maleinslureanhydrid in Diethylether oder trockenem Dioxan unter Feuchtigkeitsausschlufi 1 bis 6 h geschiittelt. Danach wurde das Polymere abgesaugt und mit dem betreffenden LBsungs- mittel gewaschen. Das Polymer wurde nach dem Trocknen gewogen, in das Reak- tionsgefl8 zurilckgegeben und rnit 20 cm3 Essigsaureanhydrid auf 80°C erhitzt. Nach 30 min wurde abgesaugt, rnit Methanol gewaschen und i. Vak. bei 50°C getrocknet.

4. Darstellung von Poly(aminomethylmaleinimidostyrol) (2)

0,5 g des wie oben beschrieben gereinigten Poly(aminostyro1)s und 1 ,O bis 1,5 g (2,9 bis 11.8 mmol) N-Methylolmaleinimid in etwa 100 cm3 Dioxan wurden 1 bis 5 h am RllckfluB unter FeuchtigkeitsausschluR erhitzt. Dabei wurden zur azeotropen Entfer- nung des gebildeten Wassers etwa 50 cm3 des LBsungsmittels abdestilliert. Nach dem Abkiihlen wurde das Polymere mit dem LBsungsmittel gewaschen und i. Vak. bei 50°C getrocknet.

5 . Darstellung von N-(4-Ethylphenyl)rnaleinimid

5.1 N-(4-Ethylphenyl)maleinamid

4,90 g (50 mmol) Maleinslureanhydrid wurden in 50 cm3 Diethylether gelbst. Dazu wurde 6,06 g (50 mmol) frisch ilber Kaliumhydroxid destilliertes CEthylanilin in 30 cm3 Diethylether unter Rilhrung und Kiihlung getropft. Nach der Zugabe wurde noch

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30 min geriihrt und das entstandene gelbe Kristallpulver abgesaugt und mit Ether gewaschen.

Ausb.: 10,83 g, Schmp.: 185°C unter Zersetzung.

5.2 N-(4-Ethylphenyl)maleinimid

10,O g (45,6 mmol) N-(4-Ethylphenyl)maleinamid und 1 ,O g Natriumacetat wurden in 45 cm3 (0.44 mol) Essigssureanhydrid suspendiert und die Suspension unter Riih- ren auf 95 "C erhitzt. Nach 20 rnin bei dieser Temperatur wurde abgektihlt und iiber Nacht mit 200 cm3 Wasser hydrolysiert. Die abgeschiedene Substanz wurde aus Etha- nol umkristallisiert.

Ausb.: 6,5 g, Schmp.: 67°C.

C 1 2 H l , N 0 2 (201,23) Ber. C 71,63 H 5.51 N 6,% Gef. C 7136 H 5,61 N 7,11

6 . Darstellung von N-(4-Ethylphenyl)aminomethylmaleinimid

5,0 g (39,3 mmol) N-Methylolmaleinimid und 5,O g (41,3 mmol) CEthylanilin wurden in 100 cm3 Dioxan geltlst. Die LCIsung wurde am Riickflun erhitzt und aus dem RiickfluB innerhalb von 3 h 50 cm3 Dioxan ausgekreist. Danach wurde das restliche Dioxan am Rotationsverdampfer abgezogen und die zuriickbleibende Masse aus Wasser/Aceton umkristallisiert und i. Vak. getrocknet.

C,3H,,N202 (230,27) Ber. C 67,81 H 6,13 N 12,16 Gef. C 68,53 H 6,13 N 12.04

Ausb.: 4,6 g, Schmp.: 84°C.

I. Darstellung von vernetztem Poly(vinylalkohol)la (5 a - 5c)

44 g Poly(vinylalkoho1) wurden in 1 dm3 Wasser eingestreut. Unter Riihren wurde erwlrmt, bis sich bei 65°C das Polymere im Wasser geltlst hatte, auf 1.8 dm3 mit Wasser von 70°C verdiinnt und so lange bei 70°C gehalten, bis die Ltlsung vtillig klar war. Bei derselben Temperatur wurde dann die berechnete Menge Terephthalaldehyd zugefugt und anschlienend die Ldsung auf Raumtemperatur gebracht. Zur Ldsung wurden nun 20 cm3 32proz. Salzslure gegeben und nach guter Durchmischung die Riihrung unterbrochen.

Als der gesamte Ansatz nach etwa 30 min erstarrt war, wurde das Gel mit einem Glasstab zerteilt und dann noch 48 h magnetisch geriihrt. Die Suspension des vernetzten Poly(vinylalkoho1)s wurde dann durch einen Faltenfilter filtriert und mit Wasser slurefrei gewaschen. Sie wurde sodann in etwas Wasser suspendiert, Methanol zuge- geben und die tiberstehende Losung nach 1 h abgesaugt. Dieser ProzeB wurde viermal

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Reaktive Triiger cur Enzymimmobilisierung

wiederholt. Das so entquollene Polymere wurde auf einer D 3-Glasfilternutsche abgesaugt und an der Luft vorgetrocknet. Das noch weiche Polymere wurde dann durch ein V2A-Sieb der Maschenweite 0,5 mm gedriickt und bei Raumtemperatur im Exsik- kator ilber Calciumchlorid getrocknet. Das harte trockene Polymere wurde in einer Culatti-Schlagmilhle (0,7 mm Siebeinsatz) gemahlen und auf KorngrBDen zwischen 0,i und 0,2 mm gesiebt.

8. Umsetzung des vernetzten Poly(viny1alkohol)s (6a - 6e)

1 bis 5 g des vernetzten Poly(vinylalkoho1)s wurden in 100 cm3 Wasser vorgequollen, mit 2 cm3 konz. Salzslure und 3-Maleinimidobenzaldehyd (3) oder Maleinimido- acetaldehyddimethylacetal (4) versetzt. Dabei wurde ein doppelter UberschuB der Maleinimidderivate bezogen auf die OH-Gruppen des Poly(viny1alkohol)s gewlhlt. Nach verschieden langen Reaktionszeiten wurden die Polymeren abgesaugt, mit Was- ser gewaschen und mit Aceton extrahiert. AnschlieBend wurde i. Vak. bei 50°C getrocknet und nochmals auf KorngrBBen zwischen 0, l und 0,2 mm ausgesiebt.

9. Messung des Quellverhaltens der Polymeren

In ein GefM, welches aus einem Glaszylinder mit unten angeschmolzenem, plan verschlossenem Bilrettenteil (Durchmesser der Burette 5 mm) bestand, wurden die Polymeren trocken eingefilllt, sodann das G e f a mit Wasser gefullt, bis die Luft aus dem GeflB und dem Polymeren verdrlngt war. Sobald keine Anderung des Polyme- renvolumens mehr zu beobachten war, wurde das Volumen des gequollenen Polyme- ren mit dem des trockenen Polymeren verglichen. Im Bereich von pH 2 bis 12 ergab sich keine Abhangigkeit der Quellung vom pH-Wert.

1 0. Messung der Cysteinaufnahme der maleinimidhaltigen Polymeren

Etwa 100 mg des betreffenden Polymeren wurden in 5 cm3 Puffer vorgequollen und mit 20 cm3 einer LBsung von Cystein (28 mM) versetzt. Aus der LBsung wurden Proben von 0,2 cm3 entnommen und mit DTNBI2 bei 412 nm der Cysteingehalt bestimmt.

1 1 . Thiolierung von Protein ''3 '

In einem G e f U mit Rilhrer und Stickstoffzuleitung wurden 20 cm3 (6,3 mM) Borat-Puffer, pH 10,s. auf 4°C gekilhlt. In die L6sung wurden 0,s g Imidazol und 1 ,O g N-Acetyl-D,L-homocysteinthiolacton eingetragen. Nachdem beide Substanzen

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in Ldsung gegangen waren, wurde das GeflB mit 1,00 g Trypsin bzw. 1,00 g a-Chymotrypsin beschickt. Nach 45 min wurden weitere 0,5 g des Thiolactons zuge- geben. Die Ldsung wurde nach 2 h rnit 1 M Salzslure vorsichtig auf pH 4,O gebracht und bei einem Druck von 9 bar durch eine asymmetrische Membran rnit der Aus- schluBgrenze loo00 g mol- ' (Berghof, BM 100) ultrafiltriert. wobei der Filtrations- verlust der Proteinldsung so lange durch Wasser ersetzt wurde, bis kein Thiol im Fil- trat mehr nachzuweisen war. AnschlieBend wurde das thiolierte Enzyrn lyophilisiert. Das trockene Enzympulver wurde auf seine Aktivitat und seinen SH-Gehalt untersucht 12.

12. Immobilisierungsreaktion

In ein kleines Zentrifugenglas wurden etwa 50 mg Trlger genau eingewogen, an- schlieBend das Glas temperiert und rnit Puffer und Enzymldsung beschickt. Nach der gew&lten Reaktionszeit wurde die Enzymldsung mit einer peristaltischen Pumpe uber eine kleine D2 Stielfritte in einen 250 cm3 MeRkolben gepumpt, das Polymere rnit einer 1 M NatriumchloridlOsung gut gewaschen und die Waschlbsung ebenfalls in den MeBkolben gepumpt, bis 250 cm3 erreicht waren. Aus dieser Ldsung wurde mit- tels einer Standardldsung des Enzyms nach der modifizierten Methode von Folin- Ciocalteau l y die vom Polymeren aufgenommene Eiweinrnenge bestimmt. Das Immo- bilisat wurde anschlieBend lyophilisiert.

13. Messung der enzymatischen AktivitUt

In ein auf 25 " C thermostatisiertes doppelwandiges G e f a mit Elektrodensystem zum Messen des pH-Wertes rnit Riihrer und Auslauf einer automatischen Bilrette wurden 20 cm3 einer 0,0105 M BAEE-Ldsung (im Falle des a-Chymotrypsins 10 cm3 einer 0,022 M ATEE-Ldsung) gegeben und 1 cm3 einer Ldsung, die 0,21 M an TRIS.HC1 und 2.10 M an NaCl war (im Falle des a-Chymotrypsins 0,22 M an TRIS - HCI und 2,20 M an NaCI). Nachdem der pH-Wert auf den gewilnschten Wert stabil eingestellt war, wurde die zu messende Probe zugefugt und ihre Aktivitlt bei konstantem pH-Wert uber den Verbrauch an 0,l M NaOH bestimmt.

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Reaktive Trdger zur Enzymimmobilisierung

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Documents

Reaktive Träuger mit Maleinimidgruppen zur Enzymimmobilisierung