Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 1 af 34

Indholdsfortegnelse

side

1. Forkortelser

2. Forord

3. Abstract

4. Resumé

5. Indledning

6. Teori

6.1 Glycoproteiner

6.1.1 Fastfase peptid syntese

6.1.2 Native Chemical Ligation

6.1.3 O-bundne glycoproteiner

6.1.4 N-bundne glycoproteiner

6.2 Anomer effekt

6.3 -effekt

2

3

4

4

5

7

8

9

11

13

15

16

7. Resultater og diskussion

7.1 Oxidation af amid med methyl(trifluoromethyl)dioxiran

7.2 Oxidation af amid med 2,2-dimethyldioxiran

7.3 Syntese af oxaziridin med mCPBA

7.4 Syntese af oxaziridin med mmpp

7.5 Hydrolyse af oxaziridin

7.6 Substitution af acetyl på C1 med azid

8. Konklusion

9. Experimental

9.1 General synthetic methodologies

9.2 Apparatus

9.3 Synthesis

10. Referencer

Bilag 1 - Struktur af udvalgte monosaccharider, aminosyrer og

beskyttelsesgrupper

Bilag 2 - Tabel over diverse eksakte masser

Bilag 3 - NMR Spektre

16

18

22

24

25

26

27

28

28

28

33

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 2 af 34

1. Forkortelser

Ac acetyl

Ac2O eddikesyre anhydrid

Asn asparagin

Asp aspartat, asparagin syre

Boc tert-butoxycarbonyl

C celsius

Cosy Correlated spectroscopy

Cys cystein

d dublet

dd dobbelt dublet

DCM dichlormethan

DMF N,N-dimethylformamid

ER endoplasmatisk reticulum

EtOH ethanol

Et2O diethylether

EtOAc ethylacetat

eq ækvivalent

Fmoc Fluorene-methoxy-carbonyl

Fuc fucose

Gal galactose

GalNAc N-acetylgalactosamin

Glc glucose

GlcNAc N-Acetylglucosamin

h time(r)

Hz hertz

J koblingskonstant målt i Hz

M molær

m multiplet

Man mannose

mCPBA 3-chloroperoxybenzoesyre

MeCN acetonitril

MeOH methanol

min minut(ter)

Mmpp magnesium monoperoxyphthalat

hexahydrate

MS massespektroskopi

NCL native chemical ligation

NMR nuclear magnetic resonance,

kernemagnetisk resonans

rt. room temperature, stuetemperatur

ppm parts per million

s singlet

Ser serin

Sia sialic acid, sialin syre

SPPS solid phase peptide synthesis, fast

fase peptid syntese

SAL sugar-assisted ligation

TBAHS tetrabutylammonium

hydrogensulfat (C4H9)4N+HSO4

-

TFA trifluoroacetic acid,

trifluoreddikesyre

THF tetrahydrofuran

Thr threonin

TLC thin layer chromatography,

tyndtlagskromatografi

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 3 af 34

2. Forord

Denne opgave er produktet af det eksperimentelle arbejde i forbindelse med min bachelor opgave og

er udført i gruppe 103, afdeling for Bioorganisk Kemi, på Kemisk Institut ved Århus Universitet.

Projektet er udført under vejledning og supervision af adjunkt Henrik Helligsø Jensen. Projektet

svarer til 10 ECTS points.

I forbindelse med projektet vil jeg gerne takke alle personer tilhørende gruppe 103 på Århus

Universitet, som har været behjælpelige undervejs i processen.

En stor tak rettes specielt til min vejleder Henrik Helligsø Jensen, som har ydet stor hjælp til såvel

praktiske som teoretiske problemstillinger, samt til Ph.D.-studerende Helena S. Christensen og Ph.D.-

studerende Anne Mette Frey, der har læst korrektur på opgaven.

Århus d. 1. august 2007

Helle Christensen

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 4 af 34

3. Abstract

Sugars being attached to proteins have been shown to play a key role in a wide range of biological

processes. Since nature produce glycoproteins as mixtures, the study of these processes is

problematical. The solution to this problem might be to chemically produce well-defined glycan

structures and attach them to proteins, and subsequently to test these products in the relevant

biological processes. A few methods already exist to ligate sugar and protein together, but so far no

method for the synthesis of the naturally occurring amide functionality between the sugar fragment

and the protein in aqueous solution has been described in the literature.

This project seeks to develop a novel method for ligating sugars to peptides in aqueous solution and

thereby synthesize the native -glycosyl amide bond.

The key to this project is to synthesize N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amine, and investigate its

reaction with thioesters in aqueous solution. Inspired by the process referred to as native chemical

ligation, it is believed that an initial attack of the N-OH function onto the thioester carbonyl, followed

by O-N exchange, will result in a stable amide bond.

Unfortunately it was problematically to introduce the acquired hydroxylamide function in the sugar,

and therefore it was not possible to continue the study and test if the amid bond could form.

4. Resumé

Sukre bundet til proteiner har vist sig at spille en vigtig rolle i et væld af biologiske processer. Da

naturen fremstiller glycoproteiner som blandinger, er studiet af disse processer problematisk. En

løsning til dette problem kunne være at kemisk fremstille veldefinerede glycan strukturer og fastsætte

dem til proteiner, og efterfølgende teste disse produkter i de relevante biologiske sammenhænge. Det

eksisterer allerede få metoder til at danne en binding mellem sukker og protein, men indtil nu er ingen

metode til syntese af den naturligt forekommende amidbinding mellem sukker og protein i vandig

opløsning blevet beskrevet i litteraturen.

Formålet med dette projekt er at finde en god måde, hvormed sukre kan bindes til peptider i vandig

opløsning og danne den naturlige -glycosyl amid binding.

Nøglen til dette projekt er at syntetisere N-acetyl-N-hydroxyl glucosyl amin og undersøge dens

reaktion med thioestre i vandig opløsning. Inspireret af processen kaldet native chemical ligation,

kunne det tænkes at N-OH først vil angribe thioester carbonylen, og der derefter vil ske en O-N-

cyklisering, hvorved den naturlige amidbinding dannes.

Desværre var det problematisk at introducere den ønskede hydroxylamid funktionalitet på sukkeret,

og derfor var det ikke muligt at teste om den ønskede amidbinding kunne dannes.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 5 af 34

5. Indledning

Formålet med dette projekt er at finde en god metode til at danne en -N-glycosyl binding mellem et

sukkermolekyle og et peptid i vandige omgivelser, hvori peptidet er stabilt og opløseligt. Nøglen til

denne problemstilling er først at syntetisere N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amin 1 og efterfølgende

undersøge dets reaktion med en thioester i vandig opløsning.

Forventningen er, at et nukleofilt angreb af N-OH (der på grund af -effekten er en meget god

nukleofil) ind på thioester-carbonylen vil resultere i et intermediat, der efterfølgende kan undergå O-

N udskiftning og slutteligt danne en stabil amidbinding, som skitseret i figur 1. Dette er inspireret af

processen kaldet ”Native Chemical Ligation” for proteiner.

ONH2

OH

HOHO

N OHO HN

NH

O

RS

OO

ONH2

OH

HOHO

N

OHN

NH

O

O O

O

O HN

OH

HOHO

N

OHN

NH

O

OO

OH

reduktionO H

N

OH

HOHO

NH

OHN

NH

O

OO

1

Figur 1. Projekt ide.

For at syntetisere 1 anvendes som udgangsstof sukre med D-Glucosamin konfiguration, da N-acetyl-

glucosamin (GlcNAc) naturligt er det saccharid, der er bundet til sidekæden på asparagin (Asn).

Strategien for at fremstille 1 er at forsøge at introducere en N-acetyl-N-hydroxyl-amin gruppe på C2

positionen ud fra angivne måder i litteraturen, hvor lignende forbindelser syntetiseres.

De frie hydroxygrupper på sukkeret skal først beskyttes som acetyl-estre, da estre ikke er særligt

nukleofile og meget mindre polære end hydroxygrupper. På denne måde undgår man uønskede

sidereaktioner, og stoffet gøres mere hydrofobt. Ud over introduktion af N-acetyl-hydroxyl-amid

funktionaliteten på C2 positionen, skal der på C1 positionen sidde en amin. Da aminer er meget

reaktive, kan der i stedet placeres et azid på C1 positionen i den ønskede -position, der efter

afbeskyttelse af hydroxygrupperne, kan reduceres til den ønskede amin 1. Dette er skitseret i figur 2.

O

OH

HOHO

NH2OH

O

OAc

AcOAcO

NH2OAc

beskyttelse af friehydroxygrupper O

OAc

AcOAcO

NOAc

O OH

indtroduktion afN-acetyl-N-hydroxylamid gruppe på C2

O

OAc

AcOAcO

NO OAc

N3

Indtroduktion afazid på C1

O

OH

HOHO

NO OH

NH2

reduktion afazid til aminO

OH

HOHO

NO OH

N3

afbeskyttehydroxygrupper

1

Acetylering

O

OAc

AcOAcO

N OAc

O OAc2 3

Figur 2. Strategi.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 6 af 34

Planen er derfor at syntetisere 2 ud fra angivne måder i litteraturen, hvor lignende forbindelser

syntetiseres, og derefter afbeskytte 2 med en katalytisk mængde natriummethoxid i methanol og

derved danne 3, der kan reduceres til aminen 1 ved hjælp af triphenylphosphin, kaldet Staudinger

reduktion1. Dette er vist i figur 3.

Raju et al.2 angiver en metode, hvorved azider selektivt kan reduceres til aminen ved hjælp af

triphenylphosphin, uden at hydroxy-amid gruppen samtidig reduceres.

ON3

OAc

AcOAcO

N OAcO

cat. MeONa

MeOH ON3

OH

HOHO

N OHO

ONH2

OH

HOHO

N OHO

P SO3NaNaO3S

SO3Na

2 3 1

THF, H2O

Figur 3. Afbeskyttelse og reduktion af azid.

Reduktionen af azidet til aminen skal finde sted, samtidig med at der i opløsningen er en thioester

tilstede, som den netop dannede og meget reaktive amin kan reagere videre med, som vist i Figur 1.

Et delmål i projektet er at undersøge, om der kan ske en O-N-cykliseringen, hvor der sker en acyl

overførsel fra N-OAc til aminen på C1. Det vil sige om reaktionen fra 4 til 5 kan finde sted, som vist i

figur 4.

ON3

OAc

AcOAcO

N OAcO

PPh3

Staudinger reduktion

O

NH2

OAc

AcOAcO

AcNO

O

NH

OAc

AcOAcO

NAc

HO

O

O

reduktion

Protonskift

2

Zn/H+

4 5

ONH

OAc

AcOAcO

NH

O

O

6

Figur 4. Delmål. Kan O-N-cykliseringen finde sted.

Den endelige N-O reduktion af hydroxylamidet 5 til amidet 6 kan ifølge Canne et al.3 udføres med

zink-støv i surt miljø.

Denne reduktions metode skulle også kunne anvendes til reduktionen af 1 efter amidbindingen

mellem sukker og peptid er dannet, som vist i figur 1.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 7 af 34

6. Teori

6.1 Glycoproteiner

Proteiner, hvortil der er bundet et oligosaccharid til en eller flere aminosyresidekæder, kaldes

glycoproteiner og siges at være glycosylerede. Som oftest består oligosaccharider af kæder på 3 til 10

sukre.

Glycosylering af proteiner er den hyppigst forekommende co-translationelle og post-translationelle

modifikation af proteiner. Mere end halvdelen af menneskets proteiner er glycosylerede.4

Glycosylering af aminosyresidekæderne medfører, at der findes mange flere forskellige proteiner i

mennesket, end det antal af proteiner, som generne koder for.

I glycoproteiner er oligosaccharidet kovalent bundet til enten amid nitrogen atomet i sidekæden af

Asn, hvilket kaldes N-glycosylering, eller til oxygenatomet i serin (Ser) eller threonin (Thr) og kaldes

O-glycosylering. N-glycosylering er en co-translationel modifikation, der sker samtidig med

translationen fra mRNA til protein. N-glycosyleringen begynder i endoplasmatisk reticulum (ER) og

fortsætter i Golgi-komplekset, mens O-glycosylering er en post-translationel modifikation og

udelukkende finder sted i Golgi komplekset.5

Sukkermolekyler på overfladen af proteiner kan have mange forskellige roller. De kan assistere

proteinets foldning, forbedre proteinets stabilitet, øge opløseligheden af proteinet, indgå i signal

transduktion, medvirke i intercellulære processer og beskytte peptid-backbone fra

proteinnedbrydende enzymer kaldet peptidaser. De fleste membranproteiner og proteiner der

udskilles fra cellen er glycosylerede. Glycoproteiner er vigtige for immunsystemet (antistoffer og

antigener er glycosylerede proteiner). Andre eksempler på vigtige glycoproteiner er forskellige

hormoner som f.eks. Follikel stimulerende hormon, Thyroid stimulerende hormon og EPO

(Erythropoietin).

I modsætning til biosyntesen af proteiner og nukleinsyrer, er samlingen af oligosaccharider ikke

kontrolleret af en bestemt skabelon. Derfor findes glycoproteinerne som heterogene blandinger,

kaldet glycoformer. Disse glycoformer har det samme peptid-backbone, men kan være glycosylerede

forskellige steder eller have forskellige sukre bundet. Hver af disse glycoformer har forskellige

egenskaber6.

Da glycoproteiner spiller så stor en rolle inden for mange vigtige biologiske processer, er studiet af

disse interessant for at fastslå og forstå deres rolle. Et problem i studiet af glycoproteiner er, som

tidligere nævnt, at biosyntetiske glycoproteiner fremstilles og eksisterer som disse glycoformer. Det

er derfor et problem at have rigeligt tilgængeligt homogent materiale at studere. En løsning på dette

problem er at syntetisere homogene glycoproteiner kunstigt ved hjælp af kemisk syntese.7

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 8 af 34

6.1.1 Fastfase peptid syntese

Peptider kan syntetiseres ved gentagne gange at koble carboxylgruppen på en C-terminal aminosyre

med aminogruppen på en N-terminal aminosyre. Peptid syntesen i opløsning (væske-

fase syntese), men det er nemmere at anvende fastfase peptid syntese (SPPS). En af fordelene ved

SPPS er, at peptid kæden bygges, mens kædens C-terminal er kovalent bundet til en fast fase (kaldet

resin). Dette gør, at det er let at oprense mellem syntesetrinnene, da peptidkæden sidder fast, mens

overskydende reaktanter i væskefasen, samt biprodukter, kan skylles væk. Dette kan gøres

automatisk. På grund af, at der tilsættes overskud af aminosyrer for at opnå højt udbytte i hvert

syntesetrin, er polymerisering af aminosyrer et almindeligt problem i synteser, hvor aminosyrerne

ikke er beskyttede. Derfor beskyttes aminosyrerne. Der findes mange beskyttelsesgrupper, men de to,

der almindeligvis anvendes i SPPS, er tert-butoxycarbonyl (Boc) og fluorene-methoxy-carbonyl

(Fmoc).

Det grundlæggende princip bag SPPS er en gentaget cyklus af kobling og afbeskyttelse af

aminosyrerne. Den frie N-terminale amin på fastfase peptidet kobles til en enkelt N-beskyttet

aminosyre, hvorefter denne aminosyre afbeskyttes under frigivelse af en ny N-terminal amin, der er

klar til at reagere videre med en ny aminosyre, som vist på figur 5. Til sidst kan peptidkæden frigives

fra den faste fase. De mest anvendte resiner idaga kræver trifloureddikesyre (TFA) til kløvningen.

b

R

ONH

O

X

afbeskyttelse,neutralisering

R

OH2N

O-X

R'

OHNH

O

XR

ONH

OR'

HN

O

X

gentagX: beskyttelsesgruppeR, R': aminosyresidekæde

Figur 5. Grundlæggende princip bag SPPS.9

Af de to beskyttelses grupper foretrækkes Fmoc frem for Boc i SPPS til syntese af glycopeptider. For

at fjerne en Boc gruppe kræves sure betingelser, normalt THF, hvilket ikke er kompatibelt med

tilstedeværelsen af syrefølsomme glycosidbindinger. Dette undgås i den trinvise afbeskyttelse af den

base-labile Fmoc beskyttelses gruppe, hvor der normalt anvendes 20% piperidine i N,N-dimethyl-

formamid (DMF). Hydroxygrupperne på saccharidet er oftest beskyttet som acetyl eller benzoyl

estere, der kan fjernes ved behandling med natriummethoxid eller hydrazin, efter at peptidet er blevet

kløvet fra den faste fase.8

Problemet med SPPS er, at fragmenter, der består at mere end 40-50 aminosyrer, er svære at

syntetisere, da det kræver meget højt udbytte i hvert trin, for at få den korrekte aminosyre sekvens i

det endelige peptid.9 En løsning til dette problem er at anvende native chemical ligation (NCL).

a Wang eller Rink

b Den oprindelige Merrifield resin kræver HF.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 9 af 34

6.1.2 Native Chemical Ligation

NCL involverer den selektive kobling af to peptid-fragmenter. Det ene fragment skal have en N-

terminal cystein (Cys) rest, mens det andet fragment skal have en C-terminal thioester funktionalitet.

De to komponenter kombineres og danner selektivt en nativ peptidbinding i vandig opløsning uden

beskyttelsesgrupper. Processen er udviklet af Stephen Kent med flere i The Scripps Research Institute

i 199410

. Mekanismen er vist på figur 6.

[Peptid-1] SR

OH2N

HN

HS

O

[Peptid-2]

[Peptid-1]

H2N

HN

S

O

[Peptid-2]

[Peptid-1] NH

HN

HS

O

[Peptid-2]

O

O

Figur 6. Princippet i Nativ Chemical Ligation.

10

Peptid 1, der har en thioester på carbonylgruppen, bliver angrebet af det nukleofile svovlatom på

Cys-sidekæden i peptid 2. Der sker herved en trans-thioesterifisering. Den dannede thioester undergår

derefter hurtigt en intramolekylær omlejring (S-N-cyklisering), der er favorabel, fordi det involverer

en 5-leddet ring, for til sidst at danne den native peptidbinding.10

Det er vigtigt at sikre, at sidekæden i Cys ikke oxideres og danner en disulfid-linked peptiddimer

inden NCL, da peptid-2-dimeren så er ureaktiv i NCL. Et overskud af thiol svarende til thioester

leavinggruppen kan tilsættes, for at Cys-resten er i den reducerede form. Derudover kan reagenser

som guadinium chlorid anvendes for at øge reaktionshastigheden, da proteinet foldes ud og gør de

reaktive grupper tilgængelige.10

Da NCL bruger thioestere, og disse er ustabile over for base (piperidine anvendes i Fmoc SPPS) men

ikke syre, har Boc-metoden været succesfuld til fremstillingen af Peptid-1 fragmenter i de tilfælde,

hvor der ikke er syre følsomme glycosidbindinger tilstede. For fremstilling af peptid-2 fragmentet

med en N-terminal Cys-rest kan Fmoc metoden anvendes. For at fremstille en både syre og base labil

C-terminal glycopeptid thioester kan almindelig Boc- og Fmoc-metoder ikke anvendes.

En løsning på dette problem er at anvende Fmoc-baseret SPPS på en sulfonamid ”safety-catch” linker

resin.8 Peptidkæden dannes med Fmoc-beskyttede aminosyrer, på nær på den sidste aminosyre, der

kobles på den voksende peptidkæde som en Boc-beskyttet aminosyre.

Efterfølgende behandling med iodoacetonitril medfører alkylering af sulfonamid funktionen, og efter

nukleofil addition af en thiol, frigives den ønskede thioester med syre labil N-terminal-Boc

beskyttelse, samt syrelabile sidekæde beskyttelsesgrupper. Disse kan fjernes med TFA, hvori

thioesteren er stabil. Se figur 7.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 10 af 34

H2NS

OO

R'

OHNH

O

Fmoc R'

NH

O

FmocHN

S

OO Piperidine/DMF

FmocNHCHRCO2H n

R'

NH

O

(oligopeptide)HN

S

OO

FmocHN

1) piperidine/DMF2) BocNHCHRCO2H

R'

NH

O

(oligopeptide)'HN

S

OO

BocHN

I CNbase

HI

R'

NH

O

(oligopeptide)'N

S

OO

BocHN

CN

R'' SH

NH

S

OO

NC

R'

NH

O

(oligopeptide)'BocHN SR''

TFAR'

NH

O

(oligopeptide)'H2N SR''

Figur 7. Princippet i anvendelse af Fmoc-baseret SPPS på en sulfonamid ”safety-catch” linker resin.

6

Bruges denne strategi, skal man kun bruge relativt fortyndet TFA een gang til fjernelse af Boc og

beskyttelsesgrupper på sidekæderne. Disse forhold kan glycosid bindingerne godt klare, hvorfor

denne metode kan anvendes til syntese af glypeptider vha. NCL.9 Havde man i stedet anvendt Boc-

strategien på alle aminosyrerne, skulle TFA anvendes i hvert eneste N-terminale afbeskyttelsestrin,

og dette ville være meget hårdere for de syrelabile glycosidbindinger.

Fordelen ved NCL er, at fragmenter, dannet ved SPPS, kan kobles, og man kan derved syntetisere

længere peptider, end det er mulige at danne alene vha. SPPS. Begrænsningen ved metoden er, at Cys

skal være en del af proteinet og være placeret et godt sted (ideelt set for hver 30-40 aminosyrer i

protein sekvensen), hvilket sjældent er tilfældet, da Cys er den anden mindst forekommende

aminosyre af ud af de 20 naturlige aminosyrer.11

I mange tilfælde er det derfor nødvendigt at introducere en Cys-mutation i peptid-sekvensen hvilket

kan føre til dannelsen af forkerte disulfidbroer ved proteinfoldningen. En alternativ løsning på

problemet er at anvende såkaldte ”ligation auxilliaries”, hjælpemolekyler.12 I denne strategi anvendes

en thiol-hjælpegruppe, der er fastsat til det syntetiske peptids N-terminal, hvorved der dannes en

sekundær amin, og formidler trans-thioesterificationen og den intramolekylære S-N acyl overførsel

på lignende måde som Cys. Dette er vist i figur 8.

SR

O

Aux

HN

SH

R

O O

Aux

S

NH

R

O

O

Aux

N

R

O

O

NH

R

O-Aux-SH

SH

Figur 8. Princippet i NCL ved anvendelse af hjælpegrupper.

12

Når den native peptidbinding er dannet, kan hjælpegruppen fjernes med eksempelvis TFA, hvorefter

den umodificerede peptidkæde er dannet. En ulempe ved disse hjælpemolekyler er, at de kun er

anvendelige på syntetiske peptider, samt at sterisk hindring medfører et krav til udførelsen af

koblingen om, at mindst en af de to terminale aminosyrer, der indgår i reaktionen, er glycin.12

Eksempler på hjælpemolekyler ses i figur 9:

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 11 af 34

HN PeptidSH

MeO

OMe

OMe A

HS

O

HN Peptid

B

MeO OMe

HS

NH

Peptid

C

Figur 9. Forskellige hjælpemolekyler. A: 2-mercaptobenzyl, B: ethanthiol, C 1-aryl-2-mercaptoethyl.12

En nyere strategi til syntese af glycopeptider er ”sugar-assisisted ligation”13

(SAL), der angiver endnu

en løsning til problemet i NCL med mangel på en N-terminal Cys-rest. I SAL er thiolgruppen placeret

på et sukkermolekyle, der er bundet til aminosyrens sidekæde, i stedet for at sidde direkte på selve

aminosyresidekæden. Denne metode kan anvendes for -O og N-linked glycopeptider.11

Fordelen ved denne metode er, at man i stedet for at placere et hjælpemolekyle på N-terminalen af

peptidet, der senere skal fjernes, fordelagtigt anvender et sukkermolekyle, der allerede er bundet til en

aminosyre. Modificering af en acetamido gruppe på C2 positionen med en sulfhydryl-gruppe gør

sukkermolekylet i stand til at medvirke i trans-thioesterificationen med en peptid thioester. Dette sker

via et 14- (O-bundet glycopeptid) eller 15-leddet (N-bundet glycopeptid) ring-intermediat.

Mekanismen er vist i figur 10.

Peptide 2 SR

O

H2NNH

Peptide 1

R

O

O

X

OHO

HN

O

HSPeptide 2

O

H2N NH

Peptide 1

R

O

O

X

OHO

HN

O

S

Peptide 2

O

HN

NH

Peptide 1

R

O

O

X

OHO

HN

O

HS

Figur 10. Sugar assisted ligation. X: O, NHO.

11

For de tidligere nævnte hjælpegrupper, er den N-terminale nukleofil sekundær, hvorimod der i SAL

anvendes en primær amin. Dette medfører et mindre sterisk hindret transitionstate, og gør, at denne

metode har en bredere tolerance overfor valget af de terminale aminosyrer. Efter koblingen af de to

peptidfragmenter kan thiol-delen fjernes ved hydrogenolyse for at gendanne den umodificerede

sukker, eller den modificerede sukker kan ved hjælp af en glycosyl transferase oligomeriseres.11

6.1.3 O-bundne glycoproteiner

I pattedyr og andre eukaryoter er den mest almindelige form for O-glycosylering mucin-typen, hvor

N-acetylgalactosamin (GalNAc) er -O-bundet til -hydroxyl gruppen af enten en Ser eller Thr rest i

proteinet. Muciner er glycoproteiner, der findes på celle overflader eller udskilles fra cellen, og har

mange tætte klynger af sådanne O-bundne GalNAc enheder. De fremstilles blandt andet af epitel

celler, der er specialiserede i slim produktion.14

Ikke alle O-glycosylerede GalNAc glycoproteiner er

muciner, da nogen kun indeholder få O-bundne GalNAc saccharider. Disse siges at være mucin-

lignende. Andre typer af O-glycosylering forekommer, blandt andet -O-N-GlcNAc, der findes som

en modifikation af Ser- og Thr-rester i cytosol- og kerneproteiner.

-O-GalNAc-Ser/Thr strukturen danner et biosyntetisk grundlag for otte forskellige kerne saccharid-

strukturer resulterende fra glycosylering på C3 og/eller C6 hydroxygruppen på GalNAc. Disse

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 12 af 34

kernestrukturer kan forlænges med andre monosaccharider så som sialin syre (Sia), fucose (Fuc)

og/eller gentagne enheder af galactose (Gal) og GlcNAc. Sammen med andre modifikationer, så som

sulfonering, giver disse forlængelser ophav til meget komplekse oligomere saccharid-strukturer, der

kan indeholde vigtige genkendelses elementer involverede i celle-celle genkendelse, der har stor

betydning for immunsystemet.

Syntese af mucin-type glycopeptider kan ske ved at indsætte en beskyttet O-glycosyl aminosyre i et

polypeptid via SPPS. Et problem, i syntesen af komplekse O-glycosyl aminosyrer, er at opnå den

ønskede -selektivitet, når sukker-Ser/Thr bindingen dannes. 7

Den mest almindelige metode til syntese af disse glycopeptider er først at danne den ønskede -O-

Ser/Thr binding, og derefter forlænge GalNAc kernen med yderligere sukre. Ved anvendelse af 2-

azidogalactose halo- og thioglycoside donorer, som vist i figur 11, sikres en høj selektivitet i

glycosylerings-reaktionen8, hvorved de ønskede -O-GalNAc-Ser/Thr byggesten i SPPS kan dannes.

Omdannelse af 2-azidogruppen til en N-acetamidogruppe giver den Fmoc beskyttede -O-GalNAc-

Ser/Thr aminosyre.7

O

OAcAcO

AcON3

X

FmocHN CO2Bn

RHO

glycosylering O

OAcAcO

AcON3

FmocHN CO2Bn

RO

O

OAcAcO

AcOAcHN

FmocHN CO2Bn

RO

X=Br, Cl, SEt Figur 11. Syntese af -O-GalNAc-Ser/Thr byggesten til SPPS for syntese af O-bundne glycopeptider,

Thr:R=Me, Ser; R=H. 7

Forlængelsen af monosaccharidet GalNAc efter den ønskede -O-Ser/Thr binding er dannet, kan ske

ved at beskytte hydroxygrupperne på GalNAc med ortogonale beskyttelsesgrupper på C3, C4 og C6

hydroxygrupperne, hvilket tillader trinvis addition af forgrenede sukre.

Fremstillingen af O-bundne glycopeptider kan også ske ved hjælp af enzymer som glycosyl-

transferaser og glycosidaser. Herved får man selektiv addition af saccharidenhederne, og desuden

opnår man den fordel, at man undgår brugen af beskyttelsesgrupper.

De almindelige metoder nævnt til at danne kemisk fremstillede homologe glycoproteiner kræver et

strengt vandfrit miljø, og anvendelse af polypeptider med beskyttede sidekæder, for at danne den

native glycosid binding.15

Som en løsning på dette er der blevet udviklet flere metoder, kaldet ”chemoselective ligation”15

, hvor

der i vandige omgivelser, og under moderate temperaturer, kan dannes stabile bindinger under

forhold, der ikke er skadelige for de resterende dele af molekylet. Dette sker ved at introducere ikke-

native elektrofile og nukleofile funktionelle grupper på peptidet og monosaccharidet, der

efterfølgende kan reagere og danne en binding, der er analog til en glycosid-binding. Bertozzi et al.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 13 af 34

har for eksempel dannet en oxim-binding mellem et ikke-naturligt keton funktionaliseret peptid og en

-aminooxy GalNAc i stedet for en almindelig glycosid ether-binding. Dette er vist på figur 12. 16

O

OHHO

HOAcHN O

Peptide 2

O

H3C

NH

O

Peptide 1

NH2

O

OHHO

HO

AcHN O

Peptide 2

N

H3C

NH

O

Peptide 1

Figur 12. Syntese af en oxim-binding mellem et keton-funktionaliseret peptid og en -aminooxy GalNAc.

16

6.1.4 N-bundne glycoproteiner

N-glycosylering af proteiner sker biologisk set ved, at oligosaccharidet bindes til Asn ved hjælp af en

oligosaccharyl transferase. Dette kan kun ske, hvis Asn er del af en Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr

sekvens, hvor X kan være en hvilken som helst aminosyre, bortset fra prolin. Det vil sige, at

potentielle glycosylerings-sites kan opdages ud fra aminosyresekvensen.17

Oligosaccharidet samles, mens det er bundet til dolichol-phosphat, der sidder i ER membranen.

Derefter overføres oligosaccharidet til amid sidekæden af Asn inde i lumen i ER fra dolichol-

phosphat glycosyldonoren ved hjælp af den membran bundne oligosaccharyl transferase.7 Det fuldt

translaterede glycoprotein bliver derefter trimmet, processeret og yderligere glycosyleret i ER og

Golgi komplekset.

Alle N-bundne oligosaccharider har en fælles pentasaccharid kerne bestående af en Man3GlcNAc2(-

N)-Asn struktur. Lige som med O-bundne saccharider kan yderligere sukre, som for eksempel Gal,

GalNAc, GlcNAc, Fuc og Sia, samt sulfonering, bindes til denne kerne for at øge variationen af

oligosaccharid mønstret i glycoproteinerne.

Funktionerne af N-bundne glycosyleringer er mange. De kan opdeles i to typer: intra- og

extracellulære funktioner. Intracellulært er funktionen af N-bundne glycaner blandt andet at sikre, at

proteinet foldes korrekt. Ekstracellulært kan N-bundne glycaner virke som ligander for

kulhydratreceptorer og som strukturelle elementer, idet den store og fleksible N-bundne glycan kan

øge proteinets stabilitet ved at mindske den konformationelle fleksibilitet af proteinet, uden at den

samlede entropi af systemet mindskes.18

Kemisk syntese af N-bundne glycopeptider kan ske på lignende måde som for O-bundne

glycopeptider, hvor en glycosyl aminosyre bindes til den voksende polypeptidkæde via Fmoc-kemi

SPPS. I dette tilfælde kan hele oligosaccharidet syntetiseres først, og efterfølgende danne -glycosid

bindingen til peptidet.

Glycosyl--N-Asn byggestenen fremstilles almindeligvis ved at koble en reaktiv glycosylamin med

en aktiveret ester af aspartat (Asp)19, som vist på figur 10.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 14 af 34

O

OP

ROPO

NHAc

NH2

P=beskyttelsesgruppeR=H, oligosaccharidR'=aktiveret ester

+

OP

OR'O

NHP

OO

OP

ROPO

NHAc

HN

OP

O

NHP

O

Figur 13. Generel syntese af N-bundne glycosyl aminosyrer vha. kobling af en glycosylamin til aktiveret Asp.

20

Glycosyl aminen kan fremstilles ved reduktion af et glycosylazid under milde betingelser.19

Den nævnte metode til syntese af N-bundne glycopeptider ved hjælp af SPPS anvendes kun til

syntese af små peptidfragmenter. Enzymatiske metoder kan også anvendes, men de er svære at bruge

ved produktion på stor skala. Generelt er syntese af glycopeptider kompliceret på grund af, at

glycosidbindingen mellem (oligo)saccharidet og peptidet er følsom over for kemisk og enzymatisk

hydrolyse.

Som med O-bundne glycopeptider kan metoden ””chemoselective ligation” 21 anvendes til syntese af

større og mere komplekse glycopeptider, hvor ikke-native glycosyl bindinger syntetiseres.

Syntese af unaturlige aminosyrer med sidekæden bundet til et glycosid, via en ikke-nativ glycosid

binding, kan danne glycopeptider, der er stabile over for kemisk og enzymatisk nedbrydning. Disse

glycopeptider kan have potentiel metabolisk aktivitet, som for eksempel inhibitorisk aktivitet mod

glycosidaser.23

Bertozzi et al.21

har for eksempel vha. ”chemoselective ligation” syntetiseret en glycopeptid-analog

ved først at introducere et ikke naturligt ketopeptid vha. SPPS i den voksende peptidkæde, og

efterfølgende reagere denne med et modificeret glycopeptid, for at danne en thiosemicarbazid binding

mellem sukker og protein. Dette er skitseret på figur 14.

O

OH

ROHO

NHAc

NH2

1) Cl2CS0.3 M NaHCO3

2) NH2NH2

.H2O

O

OH

ROHO

NHAc

HN

S

HN

NH2

Peptid 2

O

NH

O

Peptid 1

Peptide 2

N

NH

O

Peptide 1

O

OH

ROHO

NHAc

HN

S

HN

Figur 14. Syntese af glycoprotein med ikke-nativ peptidbinding.

22

Et andet eksempel på dette er syntese af triazol bundne glycopeptider. Kuijpers et al. 23 har ladet et

azid-fuktionaliseret glycosid reagere med en acetylen funktionaliseret aminosyre. Det triazol-bundne

glycopeptid dannes med et godt udbytte for mange forskellige saccharider. Triazol-bindingen er

ifølge Kuijpers stabil under sure og basiske betingelser. Reaktionen er skitseret i figur 15.

O

OAc

AcOAcO

NHAc

N3

NH

CO2MeBoc

Cu(OAc)2, Na-ascorbatH2O, tert-BuOH

O

OAc

AcOAcO

NHAc

NH

CO2MeBoc

NN

N

88%

Figur 15. Cu(II)-katalyseret [3+2] cycloaddition af azid funktionaliseret glucosamine og alkyn-aminosyrer.

23

Som før nævnt, er der indtil videre i litteraturen ikke angivet nogen effektiv måde, hvorpå den native

-glycosyl-amid binding kan dannes i vandige omgivelser vha. kemisk syntese.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 15 af 34

6.2 Anomer effekten24,25

For sukkerkemi er anomer effekten vigtig, da den kan bruges til at styre stereokemien på C1, det

anomeriske carbon atom. Stabiliteten af en bestemt konformer kan almindeligvis bestemmes ud fra

steriske faktorer. For en pyranose ring vil man forvente at -isomeren, med den anomeriske

substituent i den ækvatoriale position, ville være mere stabil end -isomeren, hvor substituenten er i

de mere sterisk hindrede aksiale omgivelser. Det kan imidlertid observeres, at elektronegative

substituenter på C1 i en pyranose ring foretrækker at have en aksial frem for en ækvatorial

orientering. Denne tendens kaldes anomer effekten.

En forklaring på anomer effekten er, at når en elektronegativ substituent (X) er i den aksiale position

på det anomeriske center, vil oxygenatomet i ringen have et af dets lonepair elektroner

O

OH

HOHO

HO X

O

OH

HOHO

HO X Figur 16. Resonansformer.

antiperiplanart til C-X bindingen. Dette lonepair kan

deltage i en stabiliserende to elektron interaktion, som kan

repræsenteres som to resonansformer (figur 16). I orbital

termer vil dette sige, at oxygenets lonepair elektroner kan doneres ind i den antibindende orbital

(LUMO) af C-X bindingen, som vist på figur 17. Den overordnede effekt af denne interaktion er

elektron delokalisering, og derfor er den stabiliserende. Den partielle overførsel af elektron densitet

Figur 17.

fra et heteroatom til en antibindende sigma orbital øges ved tilstedeværelsen af en

elektronegativ substituent. Dette forklarer, hvorfor det kun er elektronegative

substituenter, der medfører denne effekt. Hvis den anomeriske substituent

derimod er i en ækvatorial position, er det ikke muligt for oxygenatomet i ringen

at orientere et lonepair antiperiplanart til C-X bindingen og derfor kan elektroniske stabiliserende

interaktioner ikke finde sted.

6.3 -effekten26

Som vist på Figur 1, side 5, forventes det, at hydroxygruppen på hydroxylamidet 1, ved reaktion med

en thioester, vil være den første til at angribe thioesteren, efterfulgt af en acyloverførsel fra O til N.

Dette skyldes, at hydroxylaminen er en meget god nukleofil. Når to nukleofile atomer er bundet

kovalent til hinanden, øges nukleofiliciteten betydeligt. Dette kaldes -effekten. effekten gør for

eksempel at et oxygenatom i H2O2 er mere nukleofilt end H2O, og amingrupperne i hydrazin,

NH2NH2, og HONR2 er mere nukleofile end hhv. NH3 og HNR2. Der er to mulige forklaringer på

denne effekt. Den ene forklaring er, at lonepair elektroner placeret lige ved siden af en nukleofil

destabiliserer grundtilstanden, og hermed gøres nukleofilen mere reaktiv. En anden forklaring er, at

den induktive tiltrækning af den negative ladning af det naboelektronegative atom medfører dårligere

solvatisering af nukleofilen, der derfor er mere reaktiv i opløsningen.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 16 af 34

7. Resultater og diskussion

7.1 Oxidation af amid vha. methyl(trifluoromethyl)dioxiran

Den første ide til hvordan 1 kunne syntetiseres, er inspireret af en artikel af Detomaso et al.,27

der

beskriver, hvordan N-Boc beskyttede aminosyre metyl estere kan oxideres ved hjælp af

methyl(trifluoromethyl)dioxiran 7 i dichlormethan (DCM) ved -20 til 0 oC med et udbytte på 57-82%.

Amidfunktionaliteten i N- acetyl D-glucosamin 8 minder om carbamat funktionaliteten i N-Boc, så

derfor kunne man forestille sig, at denne metode kunne anvendes til oxidation af 8.

O (CH2)n

OCF3

OO

CH2Cl2N

CH

H

R

OCH3

O

O (CH2)n

O

NCH

OH

R

OCH3

O7

Figur 18. Oidation af carbamat ifølge Detomaso et al.27

For at syntetisere 1 ud fra 8 skal N-H oxideres til N-OH, og der skal udskiftes en hydroxygruppe på

det anomeriske carbon med en amin i -position. I stedet for at placere en reaktiv amin på C1, kan der

i stedet placeres et ureaktivt azid, der senere kan reduceres til aminen, som vist i figur 3, side 6.

Inden der placeres et azid på C1, skal de frie hydroxygrupper acetyleres.

Stereokemien på det anomeriske carbonatom kan kontrolleres, når en nabo carbonylgruppe kan

deltage i reaktionsmekanismen. Ved reaktion af 8 med acetylchlorid, vist i skema 1, reagerer alle 4

hydroxygrupper først via en acyltransfer mekanisme28

og beskyttes som estre, samtidig med der

dannes HCl. Esteren på C1 kan derefter protoneres og efterfølgende dissociere via en SN1

mekanisme. Den derved dannede carbocation kan stabiliseres ved hjælp lonepairet på oxygenatomet i

ringen vha. resonans og af carbonyl oxygenatomet fra acetylgruppen på naboatomet, der kan

stabilisere den dannede glycosylcation ved cyklisering.

Den cykliske oxonium ion kan åbnes med et SN2 angreb af en nukleofil chloridion, hvilket medfører

inversion af konfigurationen på C1. Chloratomet vil derfor sidde ækvatorialt, men da en

elektronegativ substituent på det anomeriske carbon er mest stabil i den aksiale position, vil det

udskiftes via endnu en SN2 reaktion med en anden chloridion i opløsningen, og ligevægten vil være

forskudt mod -anomeren 9. Se skema 1.29

.

O

OH

HOHO

NH

O

OHCl

O

O

OH

HOHO

NH

O

O

O

-HCl

Cl

O

3 x O

OAc

AcOAcO

NH

O

O

O

-3xHCl

H Cl

O

OAc

AcOAcO

NH

O

O

OH

O

OAc

AcOAcO

NHO

O

OH-

O

OAc

AcOAcO

NH O

O

OAc

AcOAcO

HNO

Cl O

OAc

AcOAcO

NH

O

ClCl

O

OAc

AcOAcO

NH

OCl

SN2

8

SN1

SN29

Skema 1. Mekanisme for udskiftning af anomer-OH med Cl.

29

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 17 af 34

Det dannede glycosyl chlorid 9 reagerer hurtigt med gode nukleofiler. Ved tilsætning af natrium azid

kan chloratomet derfor udskiftes med azid ved en SN2- mekanisme, som vist på skema 2. Der igen

sker inversion på det anomeriske carbon, og azidet sidder nu i den ønskede -konfiguration.

O

OAc

AcOAcO

NH

OCl

N3 O

OAc

AcOAcO

HN

O

N3

Cl-9 10

Skema 2. udskiftning af -chlor med azid i -position.

Efterfølgende reduktion af glycosyl azidet 10 vil danne den ønskede amin på C1, men inden

reduktion og afbeskyttelse, skal N-H oxideres til N-OH.

Syntesen af 10 fra 8 blev udført efter en metode foreslået af Macmillian et al.30

og forløb uden de

store besværligheder og med et godt udbytte, som ses i skema 3.

O

OH

HOHO

NH

O

OH

O

OAc

AcOAcO

HNCl

O

4 eq Cl

O

DCM, rt

O

OAc

AcOAcO

HN

O

N3

NaN3

TBAHS

DCM, NaHCO3, rt

78%86%8 9 10

Skema 3. Overordnet reaktionsskema for syntese af 10.

30

N-acetyl-D-glucosamin 8 og acetyl chlorid blev blandet og omrørt 3 dage ved stuetemperatur (rt.), så

ligevægten havde god tid til at indfinde sig. Reaktionsblandingen blev oparbejdet og oprenset for at

adskille - og-anomerene. Produktet blev karakteriseret vha. NMR. Udbyttet af -anomeren var på

78%.

Glycosyl chloridet 9 blev opløst i DCM og tetrabutylammonium hydrogensulfat (TBAHS) blev tilsat

sammen med mættet vandigt NaHCO3 og natrium azid. Opløsningen blev omrørt voldsomt i 2 timer

ved rt. indtil TLC viste reaktionen var færdig.

Reaktionsblandingen bestod af et to-fasesystem (vandig og organisk) hvor TBAHS rolle var at være

”phase transfer agent”, mens den voldsomme omrøring øgede kontakten mellem de to faser. Glycosyl

chloridet opløses i den organiske fase, mens den nukleofile azidion befinder sig i vandfasen. TBAHS

øger reaktionshastigheden for reaktionen ved, at den cationiske ammonium-gruppe parres med azid-

anionen, og letter dens overførsel til det organiske solvent, hvor den er meget reaktiv. TBAHS

bevæger sig på den måde mellem de to lag og ekstraherer anioner til det organiske lag.31

Efter oparbejdning og oprensning viste NMR, at det ønskede produkt 10 var dannet. Ideen var nu at

10 skulle oxideres vha. 7 for at danne den ønskede hydroxylamin efter metoden anvendt af Detomaso

et al.27

Bols et al.32

beskriver at 7 kan dannes ud fra ud fra 1,1,1-trifluoriacetone 11 og oxon.c

c Oxon består af 2KHSO5 KHSO4 K2SO4. Det reaktive stof i oxonblandingen er KHSO5.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 18 af 34

Som vist i skema 4, kan det nukleofile oxygenatom på peroxysyren KHSO5 angribe carbonylgruppen

i 11, hvorefter et protonskift gør, at KHSO4 bliver en god leavinggruppe og kan smides ud ved en SN2

lignende mekanisme. Herved dannes 7.

CF3

O OS

OK

O O

O

H

CF3

OS

OK

O O

O

H

O

CF3

OS

OK

O O

OO

CF3

O O

HOS

OK

O OProtonskift

H

117

Skema 4

33. Mekanisme for oxidation af 11 til 7 vha. KHSO5.

Det forventes, at 7 kan reagere videre med amidnitrogenet på 10, som vist i skema 5. Nitrogen atomet

kan lave et nukleofilt SN2-lignende angreb på det ene oxygenatom i 7, hvorved bindingen mellem de

to oxygenatomer brydes. Der dannes et tetraederisk intermediat, og efter et protonskift bliver

hydroxylgruppen en god leavinggruppe. Carbonylgruppen i 11 gendannes, samtidig med at amid-

nitrogenatomet i 10 bliver oxideret til hydroxylamidet 12.

CF3

CF3

O ON

O

R

H CF3N

O R

HO

Protonskift

N

O

R

OH

O

CF3N

O R

O

O

H O

7 tetraederisk intermediat 11

Skema 5. Generel mekanisme for oxidation af amid til hydroxylamid vha. 7.

Glycosyl azidet 10 blev opløst i acetonitril (MeCN) og vand i en kolbe med tøris-acetone kondenser

og nedkølet til 0 oC på isbad. 11 og NaHCO3 blev tilsat efterfulgt af oxon. Rollen af NaHCO3 i

opløsningen er at sørge for det dannede KHSO4 i skema 4 er neutralt, og ikke findes i opløsningen

som KSO4-.

Reaktionsblandingen blev herefter omrørt ved rt., mens reaktionen blev fulgt med TLC. Efter 1 døgn

var der ikke tegn på, at nogen reaktion var sket, så reaktionsblandingen blev oparbejdet, og en 1H-

NMR prøve viste, at NMR spektret var identisk med spektret for 11, der er vedlagt som bilag. Vigtigt

var det, at der stadig kunne observeres en dublet ved 5.58 ppm med Jd=9.2 Hz, der stammer fra N-H.

O

OAc

AcOAcO

HN

O

N3CF3

OO

CH3CN, H2O

NaHCO3, 0 oC

O

OAc

AcOAcO

N

O

N3

OH

0%10 12

Skema 6. Overordnet reaktionsskema.

Der blev ikke brugt mere tid på denne fremgangsmåde. I stedet blev en anden fremgangsmåde

forsøgt.

7.2 Oxidation af amin med 2.2-dimethyldioxiran

Den næste plan for at syntetisere 1 er inspireret af en artikel af Wittman et al.34

, der angiver en

metode til oxidation af en amin til en hydroxylamin ved hjælp af 2,2-dimethyldioxiran 13 uden videre

oxidation til nitro-gruppen.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 19 af 34

Wittman et al. har blandt andet oxideret -methyl glycosidet af 3,4,6-triacetylglucosamin 14, vist i

figur 19, med et godt udbytte.

O

OAc

AcOAcO

H2N

OCH3 O

OAc

AcOAcO

N

OCH3

OHH

O O

acetone, -45 oC til rt76%

13

14

Figur 19. oxidation udført af Wittman et al.

34

Ifølge Wittman et al. opløses 14 i acetone ved -45 oC, hvorefter 13 tilsættes. Reaktions-blandingen

varmer derefter op til rt. Udbyttet for reaktionen angives til 76%. I forsøg på at syntetisere 1 ud fra

denne procedure, bruges som udgangsstof D-glucosamin hydrochlorid 15.

Strategien er først at beskytte hydroxygrupperne på 15 som acetyler, hvorefter aminen på C2 skal

oxideres til hydroxylaminen vha. 13 og efterfølgende acetyleres. Til sidst skal det anomeriske carbon

modificeres til et azid i -position. Efter afbeskyttelse af hydroxygrupperne, kan azidet reduceres til

NH2-gruppen, hvorved 1 er fremstillet.

Acetyleringen af 15 blev udført som beskrevet af Myszka et al.35

NH2-gruppen blev først beskyttet

med p-anisaldehyd, hvorefter de frie hydroxygrupper blev acetyleret med eddikesyre anhydrid

(Ac2O) i pyridin. Fjernelsen af p-methoxybenzylidene gruppen skete med HCl i acetone.

Reaktionerne forløb uden besværligheder og med godt udbytte som vist i skema 7.

O

OH

HOHO

NH2OH

HCl

O

OH

HOHO

NOH

O

O

O

NaOH

O

O O

N71%

15

16

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

86%

O

OAc

AcOAcO

NH2

OAc

92%

O5M HCl

OO

HCl

17

18

Skema 7. Overordnet reaktion for syntese af 1,3,4,6-tetra-O-acetyl--glucosamine hydrochloride 18.

Skema 8 viser mekanismen for imindannelsen mellem aldehydet og aminen 15. Beskyttelse af en

NH2-gruppe som en imin er langsom reaktion uden syrekatalyse, fordi OH-gruppen er en dårlig

leavinggruppe og derfor svær at smide ud fra det tetraederiske intermediat. Vand til stede i

opløsningen, dannet ved reaktion mellem HCl og NaOH, protonerer OH-gruppen, så den bliver en

bedre leavinggruppe. Efterfølgende kan den dannede hydroxid-ion deprotonerer den dannede imin,

hvorved vand gendannes.

O

OH

HOHO

NH2OH

O

O

protonskift O

OH

HOHO

NH OH

HO

O

HO

H

O

OH

HOHO

NH OH

H2O

O

H2O15

-H2O

O

OH

HOHO

NOH

O

H

HO

O

OH

HOHO

NOH

O

H2O

16

Skema 8. Mekanismen for beskyttelse af amin på 15 med p-anisaldehyd (imin-dannelse).

36

Iminer er normalt ikke særligt stabile og vil hurtigt hydrolyseres hurtigt tilbage til en primær amin og

et aldehyd, men da carbon fra dobbeltbindingen i dette tilfælde bærer en aromatisk substituent, er

iminen stabil. Dette skyldes, at amin dobbeltbindingen er i konjugation med den aromatiske ring.37

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 20 af 34

Iminen kan dog nemt hydrolyseres tilbage til den primære amin og aldehydet ved tilsætning af vandig

syre, hvilket udnyttes senere til afbeskyttelse af aminen.

Acetylering af hydroxygrupperne er vist i skema 9 og foregår ved, at pyridin, der er en svag base og

mere nukleofil end alkoholerne, angriber Ac2O og danner et meget elektrofilt intermediat pga. den

positive ladning. Dette intermediat reagerer derefter med alkoholerne og danner esterfunktionaliteten.

O

O O

N

O

O O

N

O

O

N

O

O

OH

HOHO

N

O

N

O

OH

O

OH

HOHO

N

O

OHO

OH

HOHO

N

O

OH

O

N

mutarotation

HN1616

O

OH

HOHO

N

O

O

O

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

17

Skema 9. Mekanisme for acetylering af hydroxygrupper

38.

Pyridin øger reaktionens hastighed ved at virke som nukleofil. Da pKa af pyridin er 5.23 og pKa af

acetat er 4.75, vil pyridin forbruges i reaktionen, når den deprotonerer den dannede ester, da det er

den stærkeste base. Da pyridin tilsættes som solvent, dvs. i stort overskud, er det dog ikke noget

problem, at den forbruges.

Det er kun -formen af 16, der acetyleres, da -isomeren er sterisk hindret på grund af den store

gruppe på C2. og -isomererne er i ligevægt, da hemiacetalen kan åbnes og lave mutarotation.

Ligevægten mellem og -isomererne drives mod -formen, da denne forbruges i reaktionen.d

Iminen kan efterfølgende hydrolyseres til aminen ved hjælp af syre, som vist i skema 10. Herved

dannes 18, der nu er klar til at blive oxideret.

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

H Cl

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

H

HO

H

O

OAc

AcOAcO

NH2

O

OAc

OH

Protonskift

Cl17

O

OAc

AcOAcO

NH2

OAc O

O H

Cl

O

OAc

AcOAcO

NH2

OAc

HClO

O

+

18

Skema 10. Mekanisme for hydrolyse af imin.

Efter inspiration af Wittman et al. er planen nu at aminen i 18 skal oxideres til hydroxylaminen 19

vha. 13, som vist i skema 11 på næste side. Wittman et al. opløser aminen i acetone og tilsætter

derefter 13.

Ifølge Murray et al.39

kan 13 dannes i en opløsning af vand, acetone, NaHCO3 og oxon.

Strategien er derfor at danne 13 direkte i reaktionsblandingen hvor den skal bruges. NaHCO3 opløser

HCl-saltet 18 og, som tidligere, neutraliserer KSO4- dannet i reaktionen.

d ifølge Le Châteliers princip

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 21 af 34

O

OAc

AcOAcO

NH2

OAc

O O O O

O

OAc

AcOAcO

HN

OAc

OH

KHSO5

18 19

13

Skema 11. Overordnet reaktionsskema for oxidation af amin 18 med 2,2-dimethyldioxiran 13.

18 blev opslemmet i vand, acetone (104 eq), MeCN og NaHCO3 i en rundbundet kolbe med en

tøris/acetone kondenser (-78 oC) og blev nedkølet på isbad til 0

oC. Der blev først forsøgt med

MeCN-tøris-bad på -40 oC, men så frøs hele reaktionsblandingen til is.

Oxon blev tilsat ad flere gange (i alt 2 eq) og reaktionen blev fulgt med TLC. Efter 1 time var alt

udgangsstof omdannet. Efter oparbejdning af reaktionsblandingen kunne produktet identificeres som

en nitron 20, vist i skema 12, vha. NMR og MS.

Reaktionen blev afprøvet igen på samme måde. Denne gang dog på mindre skala og med mindre

acetone (10 eq). I stedet for acetone blev som solvent tilsat mere MeCN samt MeOH, for at sænke

reaktionsblandingens solidificeringspunkt.

Reaktionsblandingen blev nedkølet til -40 oC i et MeCN/CO2 is bad. Oxon (2 eq) blev tilført af flere

gange, og reaktionen blev fulgt med TLC. Det tog nu længere tid, før der kunne observeres en

reaktion på TLC, men dette kan skyldes, det var sværere at fremkalde og aflæse TLC-pladerne på

grund af, der var tilsat MeOH. Inden TLC pladerne kunne fremkaldes, skulle de først varmes svagt på

varmeovnen, da der ellers kun var en stor lang plet at se på TCL pladen. Efter 6 timer blev reaktionen

oparbejdet. NMR og MS viste der igen var dannet en nitron, samt at ikke alt udgangsstof havde

reageret.

Dannelsen af en nitron tyder på, at det ønskede 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-N-hydroxy--D-glucosyl amin

19 er dannet i reaktionene, men da hydroxylaminen er meget nukleofil på grund af -effekten, kan

den reagere videre med overskydende acetone i opløsningen og danne en nitron 20, vist i skema 13.

O

OAc

AcOAcO

HN

OAc

OH

O

O

OAc

AcOAcO

HN

OAc

HO O

Protonskift

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

HO OH2

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

OOH H

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

O

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

HO HO HO

H

H2O

H2O

19

20A

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

O20B

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

O

Skema 12. mekanisme for dannelsen af nitron.

Det er bemærkelsesværdigt, at Wittman et al. kun får dannet en hydroxylamin og ikke en nitron, da

de også bruger acetone som solvent i deres oxidation.

e Mekanismen for oxidation af acetone til 13, er den samme som vist i skema 4, side 18, og oxidationen af 18 til 19

forløber på samme måde som vist i skema 5, side 18.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 22 af 34

For begge reaktioner kunne i lavtopløseligt MS observeres en moltop ved m/z=426.1 som svarer til

den eksakte masse af nitronen 20 (403.1) plus massen af natrium (23.0). Den eksakte masse af den

ønskede hydroxylamin 19 er m/z=386.1 (363.1+Na) og kunne ikke opserveres i nogen af spektrerne

for de to reaktioner. I reaktionen, hvor der kun var tilsat et lille overskud af acetone var der en top ved

370.1 som passer med den eksakte masse af udgangsstoffet 18 plus natrium.

Der blev ikke brugt tid på at oprense reaktionsblandingerne, da de ikke indeholdt det ønskede

produkt. De optagne 1H-NMR spektre er derfor vanskelige at tilordne, da der i det ene tilfælde er

både produkt og udgangsstof i spektret, samt at der tilsyneladende er hindret rotation omkring C-N

bindingen, hvilket giver ophav til at visse hydrogenatomer giver forskellige signaler. I begge spektre

bemærkes 4 s ved 1.54, 1.50, 1.32 og 1.30 ppm, der to og to har samme intensitet. Forholdet mellem

dem er 2:3, og de må hver svare til 3 hydrogen-atomer fra CH3-grupperne på nitronen 20, men er fra

hver sin konformation A og B, vist i skema 12. Ved hjælp af 1H-COSY er signalerne dog tilordnet,

men det kan ikke umiddelbart afgøres hvilke signaler, det hører til hhv. A og B konformationen.

Spektret for 1H-NMR af det første forsøg, med overskud af acetone, er vedlagt som bilag.

7.3 Syntese af oxaziridin med mCPBA

En anden måde at danne en hydroxylamin på er at oxidere en primær amin ved først at danne en imin,

oxidere denne til en oxaziridin og efterfølgende hydrolysere denne.

Ito et al.40

anvender denne fremgangsmåde til at oxidere en primær amin til en hydroxylamin. Først

reagerer aminen med p-anisaldehyd og danner iminen, hvorefter denne oxideres med 3-

chloroperoxybenzoesyre (mCPBA) i 1,2-dichlorethan til en oxaziridin. Hydroxylaminen kan i følge

Ito et al. dannes ved hydrolyse af oxaziridinen vha. hydroxylamin hydrochlorid, NH2OH i HCl.

Tidligere i projektet blev 17 syntetiseret. For at danne 1 er planen at oxidere 17 til en oxaziridin, og

efterfølgende hydrolysere denne til hydroxylaminen 19, der efter acetylering af frie hydroxygrupper,

skal modificeres, så der sidder et azid på C1 i -position, der kan reduceres til en amin.

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc= N

R

R'

OO

HO

Cl=

OO

HO

R''

HH

17

NR

R' HO

O

H O

R''

NR

HR'

O

OH

O

R''

H-ClN

R

HR'

O

HN

R

HR'

O

H

NH2OH

NR

HR'

O

H

NHR

HR'

ON

Protonskift

H OH

-HH

NOH

H

H

O

N

OH

O

OAc

AcOAcO

NH

OAc

HO

+

19

1721

21

Skema 13. mekanisme for dannelse af oxaziridin og efterfølgende hydrolyse.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 23 af 34

Som det ses på skema 13, sker dannelsen af oxaziridinen i et enkelt conserted trin. Den nukleofile

dobbeltbinding på 17 angriber det ene elektrofile oxygenatom på mCPBA, samtidig med at de to

elektroner fra O-H bindingen angriber dobbeltbindingen. Hydrogen atomet fra O-H bindingen

overføres til oxygenatomet i carbonylen på mCPBA, der efter reaktionen bliver omdannet til en 3-

chlorobenzosyre.

Den dannede oxaziridin 21 kan derefter protoneres på N, hvorved den treleddede ring åbnes og

danner en carbokation, der kan stabiliseres ved hjælp af et lonepair på oxygenatomet. Hydroxyl-

aminen kan angribe denne oxonium ion og alt i alt dannes den ønskede hydroxylamin 19 samt 4-

methoxybenzaldehyd oxim 21, som ses på skema 13.

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAcmCPBA

Na2CO3

ClCH2CH2Cl

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

O

10-14%

1722

Skema 14. Overordnet reaktionsskema for syntesen af oxaziridin 22.

Den ønskede oxidation, som ses på skema 14, blev udført to gange som beskrevet af Ito et al., og

begge gange var udbyttet meget dårligt. 17 blev opløst i dichlorethan og omrørt på isbad. Na2CO3

(1.4 eq) og mCPBA (1.1 eq) blev tilsat, hvorefter reaktionsblandingen blev omrørt 1 time på isbad, og

derefter natten over ved rt. TLC viste, at der var dannet et stof, der var mindre polært end

udgangsstoffet, og som derfor løb længere på TLC, samt at der var dannet stof, der stort set ikke løb

meget anderledes end udgangsstoffet. Reaktionen blev oparbejdet ved at tilsætte vand og ekstrahere

med DCM, hvorefter den organiske fase blev vasket med en mættet vandig opløsning af NaCl og

tørret med MgSO4. Produktet blev oprenset ved hjælp af søjlechromatografi i 1:2 ethylacetat

(EtOAc):pentan. Der blev opsamlet 3 fraktioner.

1H-NMR og MS viste, at produktet var oprenset dårligt, da udgangsstof 17 og produkt 22 var

copolært i det valgte solventsystem, og derfor adskilles dårligt på søjlen. Ud over 17 og 22 viste MS

og 1H-NMR, at der var dannet p-anisaldehyd. Dette kan skyldes, at der ikke har været nok base

tilstede i reaktionsblandingen, så iminen 17 er blevet hydrolyseret til 18 (af 3-chlorobenzoesyre) efter

samme mekanisme som vist i skema 10, side 20. Underligt nok ses 18 ikke i hverken MS eller 1H-

NMR. Dette skyldes måske, at 18 er meget mere hydrofil end 17 og 22 og derfor ikke er blevet

ekstraheret med over i den organiske fase ved oparbejdningen.

Udbyttet af oxaziridinen var på 10%, mens kun 4% af udgangsstoffet var opsamlet. Resten af stoffet

må være gået tabt undervejs i reaktionen, muligvis er det blevet i vandfasen under oparbejdningen.

Forsøget blev udført igen. Denne gang blev reaktionsblandingen omrørt 2 timer på isbad, og henstod i

alt 2 dage ved rt. Der blev tilsat i alt 4,7 eq Na2CO3 og 3,6 eq mCPBA. Reaktionen oparbejdes som

tidligere i beskrevet men denne gang uden at tilsætte vand. I stedet tilsættes DCM efterfulgt af mættet

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 24 af 34

vandigt NaHCO3. Til oprensningen blev der denne gang som eluent anvendt 1:10 EtOAc:DCM. Der

bemærkes en interessant ting ved skift af eluent i forhold til det forrige forsøg.

Skitse af TLC-plader

u c p

1:2 ethyl acetate pentan

u c p

1:10 ethylacetat :DCM

Når der anvendes 1:2 EtOAc:pentan løber

oxaziridinen længere end produktet, mens det er

omvendt, når der som eluent anvendes 1:10

EtOAc:DCM. Der opsamles ligesom i det forrige

forsøg 3 fraktioner. 17 og 22 er denne gang bedre

adskilt i den valgte solventsystem.

Produktet karakteriseres på samme måde som i det tidligere forsøg ud fra MS og NMR. Udbyttet for

denne reaktion er 14%, og kun 12% af udgangsstoffet er opsamlet. Denne fremgangsmåde er ikke

særligt effektiv til syntese af den ønskede oxaziridin, og der går meget stof til spilde undervejs.

Måske er det anvendte mCPBA ikke særligt godt, da det ikke er helt nyt, og muligvis er meget

mCPBA omdannet til den korresponderende syre. Oxaziridinen forsøges i stedet at blive fremstillet

ud fra en anden metode.

7.4 Syntese af oxaziridin med mmpp

Gould et al. 41

fremstiller en imin ud fra en primær amin og p-anisaldehyd og oxiderer derefter

iminen til den tilsvarende oxaziridin vha. magnesium monoperoxyphthalate hexahydrate (mmpp).

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

H

O

O

O

O

OH

2

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

H

Mg2+

O

38%

2217

Skema 15. Overordnet reaktionsskema for syntese af oxaziridin vha. mmpp.

Mekanismen for oxidationen er som vist på skema 14.

Denne fremgangsmåde forsøges først på lille skala (0.200g sukker) med bedre udbytte end i de to

forrige forsøg med mCPBA. Iminen opløses i diethylether (Et2O) og absolut ethanol (EtOH) og

omrøres ved 0oC, hvorefter mmpp tilsættes og omrøres 2½ time. TLC viser at der stadig er

udgangsstof tilbage, så der tilsættes ekstra mmpp (i alt 2,4 eq), hvorefter blandingen omrøres ved rt

natten over. Efter oparbejdning og oprensning viser MS og NMR at oxaziridinen er dannet med et

udbytte på 38%. Denne fremgangsmåde forsøges igen på større skala (5.00g) med et udbytte af

oxaziridinen på 28%.

Vandfasen fra oparbejdningen gemmes (den er ugennemsigtig og gullig), da den måske indeholder

noget af udgangsstoffet, der er blevet hydrolyseret til 18, eller noget af den dannede oxaziridin, der er

hydrolyseret til hydroxylaminen 19, og derfor er for polær til at blive trukket med over i den

organiske fase ved ekstraktionen. Vandfasen inddampes med toluene, hvorefter Ac2O og pyridin

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 25 af 34

tilsættes og omrøres 2 timer, for at acetylere frie hydroxygrupper og gøre stoffet mere upolært.

Reaktionsblandingen oparbejdes og oprenses, men MS og NMR viser at de oprensede stoffer ikke er

nogen af de forventede stoffer (17, 18, 22 eller 23) hvorefter der ikke gøres mere ud af dette.

7.5 Hydrolyse af oxaziridin

Den dannede oxaziridin 22 skal nu hydrolyseres til 19. Som tidligere nævnt kan hydrolysen af

oxaziridinen udføres med NH2OH i HCl ifølge Ito et al.40

Mekanismen for hydrolysen er tidligere

angivet i skema 13, side 22.

Oxaziridinen opløses i MeOH, hvorefter NH2OH i HCl tilsættes og reaktionsblandingen omrøres ved

rt. i 1 døgn. Reaktionsblandingen inddampes, hvorefter der tilsættes Ac2O og pyridin for at acetylere

hydroxylaminen 19 og frie OH-grupper. Den dannede N-OH på 19 er som sagt en god nukleofil, og

kan tage en acetyl fra andre sukre i opløsningen på C1,3,4 og 6-positionen.

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

O

NH2OH HCl

MeOH O

OAc

AcOAcO

NAc

OAc

AcO

O

O O

N

1)

2)

N

OH

+

O

22

0%23

O

OAc

AcOAcO

NH

OAc

HO19

N

OAc

+

O21

Skema 16. hydrolyse af oxaziridin vha. NH2OH∙HCl.

Reaktionsblandingen oparbejdes og oprenses vha. søjlekromatografi. Der opsamles 3 forskellige

fraktioner. 1H-MNR og MS viser at der er dannet 21 (m/z=216,0 inkl. Na). I de to andre fraktioner er

der en moltop ved hhv. m/z=413.2 og m/z=398.0, der ikke passer med den forventede masse af det

ønskede produkt 23 på m/z=470.1 (m/z=447.1+Na). Massen af produktet, hvis det havde tabt en

acetyl eller to passer heller ikke med de observerede masser. Der blev ikke brugt tid på at

karakterisere de dannede produkter yderligere.

I stedet blev hydrolysen forsøgt udført med 5M HCl i tetrahydrofuran (THF).

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

O

HCl

THF O

OAc

AcOAcO

NAc

OAc

AcOO

O O

N

1)

2)

O

+

O

19%22 23

Skema 17. syre-hydrolyse af oxaziridin 22.

Mekanismen for hydrolysen forløber på samme måde som med NH2OH i HCl, og ses i skema 18. Der

dannes dog et aldehyd (p-anisaldehyd) i stedet for en oxim.

NR

HR'

O

H-Cl NR

HR'

O

H NR

HR'

O

H NR

HR'

O

H

HO

H

NHR

HR'

OO

Protonskift

H H

R' H

O

R NHOH

-H

H2O

Skema 18. Mekanisme for hydrolyse af oxaziridin vha. syre.

Reaktionen blev først udført på lille skala (0.08g). MS viste en masse på m/z=341.1, der ikke passer

med massen af 23. I 1H-NMR ses der ikke aromatisk signaler, så 22 må være blevet hydrolyseret,

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 26 af 34

men på grund af tidsmæssige årsager, blev der ikke brugt tid på at karakterisere produktet yderligere.

Muligvis har udbyttet af reaktionen været så lavt, at det ønskede produkt var svært at oprense

ordentligt. I stedet blev reaktionen gentaget på større skala (0.74g), Denne gang viser MS en moltop

ved m/z= 470.1, hvilket passer fint med det ønskede produkt 23 (m/z=447.1+Na).

Der blev optaget 1H-NMR af produktet, men der er sket en fejl, så spektret ikke er blevet gemt på

computeren, og derfor er det ikke muligt at karakteriserer produktet vha. NMR, da alt stoffet blev

brugt i den næste reaktion. Ved højtopløseligt MS har stoffet m/z=470.1268 (litteratur: 470.1274), så

det passer meget godt med, at der er 23 der er blevet dannet. Udbyttet var på 19%.

7.6 Substitution af acetyl på C1 med azid

For få syntetiseret 1 mangler acetylen på C1 på 23 at blive udskiftet med et azid, der kan reduceres til

en amin. For at gøre dette reageres 23 med HBr efter en metode foreslået af Rye et al.42

. Først dannes

-isomeren på grund af nabogruppe effekten, men på grund af effekten er brom mere stabil i

position og udskiftes af en anden bromidion i opløsningen, så -isomeren dannes. Mekanismen er

som vist på skema 1, side 16.

O

OAc

AcOAcO

NAc

OAc

AcO

HBr, CH3COOH

DCM

O

OAc

AcOAcO

AcN BrAcO23

24

NaN3

TBAHS

DCM, NaHCO3, rt

O

OAc

AcOAcO

AcN

N3

AcO25 0%

Skema 19. Overordnet reaktionsskema for syntese af glycosyl azid 25.

23 opløses i tørt DCM og omrøres på isbad under nitrogen atmosfære. HBr i eddikesyre (33%)

tilsættes. Reaktionen får lov til at varme op til rt., mens reaktionen følges med TLC. Der tilsættes

løbende ekstra HBr (i alt 12 eq). Da TLC viser at alt udgangsstof er omdannet, oparbejdes reaktionen

hurtigt, da bromforbindelsen er ustabil, hvorefter produktet med det samme reageres videre med

natrium azid, efter proceduren tidligere anvendt30

(NaN3, TBAHS, NaHCO3). Efter 1 døgn

oparbejdes reaktionsblandingen og oprenses ved hjælp af søjlechromatografi.

MS viser, at det dannede produkt ikke er det ønskede glycosyl azid. Da glycosylbromidet er meget

ustabilt, kan det hydrolysere og danne –OH på C1, der kan efterfølgende kan acetyleres, ved at tage

en acetyl fra nitrogen, som vist i skema 20. Denne forbindelse 26 ses på MS (m/z=428.2 inkl. Na).

O

OAc

AcOAcO

AcN BrAcO

24

O

OAc

AcOAcO

AcN OAcH

O HO

OAc

AcOAcO

AcN

O

OH

O

O

OAc

AcOAcO

AcN

HO

OAc

26

Skema 20. hydrolyse af glycosyl bromid og efterfølgende acetyl-overførsel.

Da der ikke var mere tid til at udføre flere forsøg stoppes projektet her, selvom projektets formål ikke

er nået og N-acetyl-N-hydroxy glucosylamin 1 ikke er blevet syntetiseret.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 27 af 34

8. Konklusion

For at kunne undersøge om den naturlige glycosyl amid binding mellem N-acetyl-N-hydroxy

glucosyl aminen og en thioester i vandige omgivelser kan dannes, skal den ønskede hydroxylamin

først syntetiseres.

Dette blev forsøgt på flere forskellige måder, men de i litteraturen fundne metoder var ikke alle lige

anvendelige til introduktion af hydroxyl gruppen på nitrogen atomet.

Først blev metoden angivet Detomaso et al. afprøvet til oxidation af amidfunktionaliteten på 10 ved

hjælp af methyl(trifluoromethyl)dioxiran, men der skete ingen reaktion. Dernæst blev metoden

angivet af Wittman et al. afprøvet, hvor 2,2-dimethyldioxiran i acetone skulle kunne oxidere en amin

til en hydroxylamin. I dette tilfælde blev der i stedet dannet en nitron.

En anden metode til syntese af en hydroxylamin, er først at danne en imin, og efterfølgende oxidere

denne med en peroxysyre til den tilsvarende oxaziridin, hvorefter denne kan hydrolyseres til

hydroxylaminen.

Syntesen af oxaziridinen blev først forsøgt ved at oxidere en imin med mCPBA, men med dårligt

udbytte. Tilsyneladende er den anvendte peroxysyre i mCPBA omdannet til syre, der hydrolysere den

dannede imin tilbage til aminen og aldehydet. Efterfølgende blev metoden afprøvet ved at anvende

mmpp til oxidationen og med bedre udbytte.

Den dannede oxaziridin blev forsøgt hydrolyseret med NH2OH i HCl, som beskrevet af Ito et al. men

denne fremgangsmåde gav ikke den ønskede hydroxylamin. I stedet lykkedes det at hydrolysere

oxaziridinen ved hjælp af HCl i THF, hvorefter den dannede hydroxylamin blev acetyleret. Uheldige

omstændigheder medførte, at karakteriseringen af den acetylerede hydroxylamin begrænsedes til MS.

For at danne den ønskede N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amin skulle den fremstillede hydroxylamin

modificeres, så der sad en amin i -positionen på C1. Dette forsøgtes udført ved først at reagere

glycosidet med HBr, men den dannede bromforbindelse var så ustabil, at den hydrolyserede,

hvorefter den blev acetyleret ved reaktion med en acetyl fra nitrogenatomet på C2.

Da der ikke var mere hydroxylamin tilbage, blev projektet stoppet her, da der ikke var mere tid til at

lave flere forsøg.

Det havde været meget interessant at afprøve om amidbindingen kunne være blevet dannet, men det

var desværre ikke muligt, da det ikke lykkedes at syntetiseret N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amin.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 28 af 34

9. Experimental

9.1 General synthetic methodologies

All bought chemicals were used without any purification. Organic solvents were concentrated under

vacuum with temperature at 40 °C. Reactions were followed with TLC. The TLC’s were developed

by supplying CeMol-developer (cerium (IV) sulphate (0,2%) and ammonium molybdat (5%) in 10 %

sulphuric acid) or potassium permanganate (KMNO4 0,5% in 1 M NaOH) and applying heat until

visible spots appeared. Columns for flash columns chromatography were packed with silica gel 60

(230-400 mesh) as the stationary phase and distilled solvents as eluents.

9.2 Apparatus

1H and

13C NMR experiments were carried out at a Varian Germini 400 spectrometer.

1H NMR was

carried out at 400 MHz and 13

C NMR at 100 MHz. MS experiments were carried out as electrospray

experiments on a Micromass LC-TOF spectrometer.

9.3 Synthesis

O

OAc

AcOAcO

HNCl

O9 Synthesis of 2-Acetamido-2-Deoxy-3,4,6-Tri-O-Acetyl--D-Glucopyranosyl Chloride30 (9)

N-Acetyl D-glucosamine 8 (5.00 g, 22.6 mmol) was added to stirring acetyl chloride (10.0 mL) and

the resulting suspension was stirred magnetically under nitrogen atmosphere for 3 days at rt. DCM

(40 mL) was then added and the resulting solution was poured into ice (40,0 g) and water (10,0 mL)

with stirring. The organic layer was immediately separated and run into saturated aqueous NaHCO3

(40.0 mL) and ice with stirring, the neutralisation being completed in a separating funnel. The organic

layer was then separated and dried with MgSO4. The organic layer was then filtered with suction and

the residue washed thoroughly with DCM. The resulting solution was concentrated under vacuum.

The crude product was purified by flash chromatography over silica (eluent gradually changed from

1:2 EtOAc:pentane =>EtOAc) to afford the product (6.445 g, yield 78 %, the -anomer) as a white-

yellow crystalline solid.

Anomer: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 1.98 (3H, s, CH3CO), 2.04 (6H, s, 2xCH3CO), 2.09 (3H,

s, CH3CO), 4.30-4.10 (3H, m, H-6a, H-6b, H-5), 4.53 (1H, ddd, JH2-H1=3.6 Hz, JH2-NH=8.8 Hz, JH2-

H3=12.4 Hz, H-2), 5.20 (1H, dd, JH4-H3=9.6 Hz, JH4-H5=12.0 Hz, H-4), 5.31 (1H, dd, JH3-H4=9.6 Hz,

JH3-H2=10.8 Hz, H-3), 5.83 (1H, d, JNH-H2=8.8 Hz, N-H), 6.18 (1H, d, JH1-H2=4.0 Hz, H-1).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): =20.8, 20.9 (2C), 23.3, 53.7, 61.4, 67.2, 70.4, 71.1, 93.9, 169.3,

170.3, 170.8, 171.7.

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 29 af 34

O

OAc

AcOAcO

HN

O

N3

10

Synthesis of 2-Acetamido-2-Deoxy-3,4,6-Tri-O-Acetyl--D-Glucopyranosyl Azide30 (10)

To a solution of the glycosyl chloride 9 (6.372 g, 17.4 mmol) in DCM (65.0 mL), TBAHS (5.962 g,

17.5 mmol) and saturated aqueous NaHCO3 (65.0 mL) was added followed by sodium azide (3.406 g,

52.1 mmol). The resulting biphasic solution was stirred vigorously at rt. for 2 h. The solution was

poured into a separation funnel and extracted with EtOAc (3x100 mL), the organic layer was

separated and washed with saturated aqueous NaHCO3 (2x60 mL), water (2x60mL) and brine

(1x60mL). The organic phase was then dried over Na2SO4 and the solvent removed under vacuum.

The crude was purified flash chromatography over silica (eluent: 1:2 pentane:EtOAc) to afford the

product (5.598 g, 86%).

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 1.98 (3H, s, CH3CO), 2.03 (3H, s, CH3CO), 2.04 (3H, s, CH3CO),

2.10 (3H, s, CH3CO), 3.78 (1H, ddd, JH5-H6a=2.4Hz, JH5-H6b=4.8Hz, JH5-H4=10Hz, H5), 3.91 (1H, dt,

JH2-H3=10.8Hz, JH2-H1=9,2Hz, H-2), 4.14 (1H, dd, JH6a-H5=2.4Hz, JH6a-H6b=12.4 Hz, H-6a), 4.27 (1H,

dd, JH6b-H5=4.8 Hz, JH6b-H6a=12.8 Hz, H-6b), 4.75 (1H, d, JH1-H2=9.2Hz, H-1), 5.10 (1H, t, Jt=10.0 Hz,

H-4), 5.24 (1H, t, Jt=10.0 Hz, H-3 ), 5.56 (1H, d, Jd=8.8 Hz, N-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.7, 20.8, 20.9, 23.3, 54.2, 62.1, 68.5, 72.4, 74.0, 88.5, 169.5, 170.9

(2C), 171.0.

O

OH

HOHO

NOH

O16

Synthesis of 2-deoxy-2-(p-methoxybenzylidene(amino))-D-glucopyranose35 (16)

To a solution of D-glucosamine hydrochloride 15 (12.5 g, 58.0 mmol) in a freshly prepared aqueous

solution of 1 M NaOH (60.0 mL) under stirring was added p-anisaldehyde (8.5 mL, 70.0 mmol).

After a short time crystallisation began. Then the mixture was refrigerated and after 2 days the

precipitated product was filtered off and washed with cold water, followed by a mixture of 1:1

EtOH:Et2O. The resulting product was dried in an excicator for 1 day, and used without any

characterisation. (Yield: 12,686 g, 71 %)

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 30 af 34

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

17

Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-(p-methoxybenzylidene(amino))--D-

glucopyranose35 (17)

Sugar 16 (12.686g, 42.6 mmol) was added sequentially to a cooled (ice-water) mixture of pyridine

(67.5 mL) and Ac2O (37.5 mL). The mixture was stirred in ice-bath for 1 h and at rt. for 3 days. The

yellow solution was poured into 250 mL of ice-water. The precipitated white product was filtered and

washed with cold water. The crystals were added toluene, which was removed under vacuum. (Yield:

17.076 g, 86%)

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): .87 (3H, s, CH3CO), 2.00 (3H, s, CH3CO), 2.02 (3H, s, CH3CO),

2.08 (3H, s, CH3CO), 3.43 (1H, m, H-2), 3.83 (3H, s, OCH3), 3.96 (1H, ddd, JH5-H6b=2.0 Hz, JH5-

H6a=4.4 Hz, JH5-H4=10.0 Hz, H-5), 4.12 (1H, dd, JH6b-H5=2.0 Hz, JH6b-H6a=12.4 Hz, H-6b), 4.36 (1H,

dd, JH6a-H5=4.4Hz, JH6a-H6b=12.4 Hz, H-6a), 5.13 (1H, t, Jt=9.6 Hz, H-4), 5.41 (1H, t, Jt=9.6 Hz, H-3 ),

5.93 (1H, d, JH1-H2=8.0 Hz, H1), 6.90 (2H, d, Jd=8.8 Hz, Ar-H), 7.64 (2H, d, Jd=8.4 Hz, Ar-H), 8.14

(1H, s, N=CH).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.7, 20.9, 21.0 (2C), 55.6, 62.1, 68.3, 73.0, 73.2, 73.5, 93.4, 114.3

(2C), 128.5, 130.5 (2C), 162. 5, 164.5, 169.0, 170.0, 170.1, 170.9

O

OAc

AcOAcO

NH2

OAc

HCl18

Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-glucosamine hydrochloride35 (18)

Sugar 17 (16.968g, 36.5 mmol) was dissolved in warm acetone (150 mL) and then HCl (5 M, 7.5 mL)

was added with immediate formation of a precipitate (blue colour appeared). The mixture was cooled

in ice-bath, and after addition of Et2O (150 mL) it was stirred for 2 h and refrigerated for 3 days. The

precipitated product was filtered, washed with Et2O and dried on vacuum to give a white powder.

(Yield: 12.852 g, 92%)

1H-NMR (400 MHz, CD3OD): (6H,s, 2xCH3CO), 2.09 (3H,s, CH3CO), 2.18 (3H,s, CH3CO),

3.64 (1H,dd, JH2-H1=8.8Hz, JH2-H3=10.4Hz, H2), 4.02 (1H, ddd, JH5-H6b=2.4Hz, JH5-H6a=4.8Hz, JH5-

H4=10.0, H-5), 4.12 (1H, dd, JH6b-H5=2.0 Hz, JH6b-H6a=12.4 Hz, H-6b), 4.30 (1H,dd, JH6a-H5=4.8 Hz,

JH6a-H6b=12.8 Hz, H-6a), 5.09 (1H, dd, JH4-H3=9.2Hz, JH4-H5=10.0, H-4), 5.35 (1H, dd, JH3-H4=9.4Hz,

JH3-H2=10.4Hz, H-3), 5.86 (1H, d, JH1-H2=8.8Hz, H-1).

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 31 af 34

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.2, 20.3 (2C), 20.4, 52.5, 61.6, 68.2, 71.0, 72.3, 90.5, 171.4, 172.8,

173.2, 173.7

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

O20A

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

O20B

Synthesis of 1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-deoxy-N-(propan-2-ylidene)--D-glucopyranose-2- amine

oxide34,39 (Nitrone) (20A+20B)

A 100 mL three-necked round bottom flask fitted with a dry ice/acetone condenser, containing a

mixture of 18 (0.5034 g, 1.31 mmol, 1 eq), water (5.0 mL), acetone (10.0 mL, 104 eq), MeCN (5.0

mL), NaHCO3 (0.8850g, 10.54 mmol) and a magnetic stirring bar was cooled to 0 oC in an ice bath.

Oxone (1.602 g, 2.61 mmol, 2 eq) was added sequentially, and the mixture was stirred for ~1 h. DCM

and water was added, and the organic layer was separated in a separating funnel, dried with MgSO4

and concentrated under vacuum. 1H-NMR and MS identify the product as a nitrone.

MS: m/z=426.2 (nitrone+Na).

1H-NMR (400 MHz, CD3OD): s, N=C-CH3), 1.32 (1.8H, s, N=C-CH’3), 1.50 (1.2H, s,

N=C-CH’3), 1.54 (1.8H, s, N=C-CH3), 1.96-2.18 (12 H, 4xs, 4xCH3CO), 2.82 (0.4H, dd, Jd=8.0,

Jd=10.0, H2), 2.89 (0.6H, dd, Jd=8.4, Jd=9.6 , H2’), 3.88 (1H, ddd, Jd=2.4, Jd=4.8, Jd=10.2, H5), 4.02-

4.08 (1H, m, H6a), 4.28 (1H, dt, Jt=4.4, Jd=12.4, H6b), 5.08-5.02 (1 H, m, H4), 5.42 (0.4H, t, Jt=9.6,

H3), 5.53 (0.6H, t, Jt=9.6, H3’), 5.78 (0.6H, d, Jd=8.4, H1’), 5.97 (0.4H, d, Jd=8.0, H1).

O

OAc

AcOAcO

N

O

OAc

O

22

Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-((4-methoxyphenyl)-1,2-oxaziridine)--D-

glucopyranose with mCPBA40 (22)

Na2CO3 (0.177 g, 1.67 mmol, 1.4 eq) and 3-chloroperoxybenzoic acid (mCPBA, content ca. 57%,

0.384 g, 1.27 mmol, 1.2 eq) were added to a stirred solution of 17 (0.506g, 1.09 mmol) in 1,2-

dichlorethane (25mL) at 0 oC and then the reaction mixture was stirred at the same temperature for 1h

and at rt over night. After adding water (30 mL) and extracting the mixture with DCM, the combined

organic layer was washed with brine, dried over MgSO4 and concentrated under reduced pressure.

The crude was purified by flash chromatography over silica (eluent 1:10 EtOAt:DCM) to give the

required oxaziridine 22. (Yield: 0.052g, 10%)

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 32 af 34

1H-NMR (400 MHz, CD3OD): s, CH3CO), 2.06 (3H, s, CH3CO), 2.07 (3H, s, CH3CO),

2.15 (3H, s, CH3CO), 2.55 (1H. m, H2), 3.74 (3H, s, OCH3), 3.81 (1H, ddd, Jd=2.4, Jd=4.8, Jd=10.0,

H5), 4.04 (1H, dd, Jd=2.4, Jd=12.4, H6a), 4.25 (1H, dd, Jd=4.8, Jd=12.4, H6b), 4.51 (1H, s, N-C-H),

5.06 (0.33H, t, Jt=9.6, H4), 5.10 (0.67H, Jt=9.6, H4’), 5.42 (0.33H, t, Jt=9.2, H3), 5.64 (0.67H, t,

Jt=9.6, H3’), 5.79 (0.67H, d, Jd=8.8, H1’), 6.05 (0.33, d. Jd=8.4, H1), 6.86 (1H, d, Jd=8.4, Ar-H), 7.25

(1H, d, Jd=8.4, Ar-H).

13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.7, 20.8, 20.9, 21.0, 55.5, 61.7, 67.7, 71.4, 73.1, 73.2, 79.1, 91.2,

114.3 (2C), 125.5, 129.2 (2C), 161.6, 168.3, 169.8, 170.2, 170.7. MS m/z=504,2 (481,2+Na)

Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-((4-methoxyphenyl)-1,2-oxaziridine)--D-

glucopyranose with mmpp41 (22)

17 (0.203g, 0.44 mmol), dry Et2O (15 mL) and EtOH (99.9%, 8 mL) were stirred at ice bath under

nitrogen atmosphere. Monoperoxyphathalic acid magnesium salt (0.259g, 1.05 mmol, 2.4 eq) was

added and the resulting mixture was stirred for 2.5 h at 0 oC. mmpp was added once more (0.260 g,

0.526 mmol, 1.2 eq) and the mixture was stirred at rt overnight. After adding DCM and saturated

aqueous NaHCO3, the organic layer was separated and washed saturated aqueous NaCl. The organic

phase was then dried over Na2SO4 and the solvent removed under vacuum. The crude was purified by

flash chromatography over silica (eluent 1:10 EtOAc DCM) to give the oxaziridine 22 (0.080 g, Yield

38% )

O

OAc

AcOAcO

NAc

OAc

AcO23 Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-(N-acetoxyacetamido)--D-glucopyranose (23)

Oxaziridin 22 (0.742 g, 1.54 mmol) was dissolved in THF( 20 mL). HCl (5 M, 1,5 mL, 5 eq) was

added sequentially over 2 h while the reaction was followed by TLC (eluent 1:5 EtOAc:pentan). The

mixture was stirred magnetically for 2 days at rt. The resulting mixture was concentrated under

reduced pressure. Water (40 mL) and Et2O (40 mL) was added. The water phase was separated and

extracted with Et2O. The water phase was then added toluene and concentrated under reduced

pressure. Pyridine (15.0 mL) and Ac2O (15.0 mL) was added and the resulting mixture was stirred in

ice-bath for 1 h and at rt. for 2 days. The reaction was poured into an ice-water mixture and extracted

twice with EtOAc. The combined organic phases were washed with 0.1 M HCl, saturated NaHCO3,

brine, dried over MgSO4 and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash

chromatography over silica (eluent 1:1 EtOAc: pentane). (Product 0.129 g, Yield 19%). MS

m/z=470,1268 (literature: 447.1377+Na). Rf(23)=0.29. (1:2 pentane:EtOAc)

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 33 af 34

10. Referencer

1 http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/staudinger-reaction.shtm

2 Raju, B; Mortell, K; Anandan, S; O’Dowd, H; Gao, H; Gomez, M; Hackbarth, C, Wu, C; Wang, W; Yuan, Z,

White, R; Trias, J, Patel, D.V; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 2413-2418

3 Canne, L.E; Bark, S.J; Kent, S.B.H; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5891-5896

4 Yang, Y; Ficht, S; Brik, A; Wong, C; J. Am. Soc., 2007, Published on web 05/25/2007

5 Berg, J. M; Tymoczko, J. L: Stryer, L; Biochemisty; W.H.Freeman and Company, 5. edition, side 307

6 Davis, B.G.; Fairbanks, A.J., Carbohydrate Chemistry; Oxford chemistry primers, side 81-83

7 Pratt, M.R; Bertozzi, C. R; Chem. Soc. Rev, 2005, 34, 58-68

8 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 597-598)

9 Jensen, H. H; Lecture Notes on Peptide Synthesis, Bioorganic Chemistry, 2007

10 Dawson, P.E; Muir, T.W; Clark-Lewis, I; Kent, S.B.H; Science, 1994, 5186, 776-779

11 Brik, A; Wong, C; Chem. Eur. J.; 2007, 13, 5670-5675

12 Macmillan, D; Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 7668-7672

13 Yang, Y; Ficht, S; Brik, A; Wong, C; J. Am. Soc., 2007, 129, 7690-7701

14 Marcaurelle, L.M; Bertozzi, C.R; Glycobiology, 2002, 12, 69R-77R

15 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 605)

16 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 606)

17 Berg, J. M; Tymoczko, J. L: Stryer, L; Biochemisty; W.H.Freeman and Company, 5. edition, side 306-307

18 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 614)

19 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 618)

20 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 620)

21 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 621)

22 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 623)

23 Kuijpers, B.H.M; Groothuys, S; Keereweer, B.R; Quaedflieg, P.L.M; Blaauw, R.H; Delft, F.L.V; Rutjes, F.P.J.T;

Org.Lett., 2004, 6, 3123-3126

24 Boons, G; Hale, K.J; Organic Synthsis with carbohydrates, 2000, Sheffield Academic Press, s.10-14

25 Davis, B.G.; Fairbanks, A.J., Carbohydrate Chemistry; Oxford chemistry primers, side 15

26 Anslyn, E.V., Dougherth, D.A.; Modern Physical Organic Chemistry; University Science Books: 2006; s. 640

27 Detomaso, A; Curci, R; Tetrahedron Letters; 2001, 42, 755-758

28 Anslyn, E.V., Dougherth, D.A.; Modern Physical Organic Chemistry; University Science Books: 2006; s. 600

29 Davis, B.G.; Fairbanks, A.J., Carbohydrate Chemistry; Oxford chemistry primers, side 10, 14, 32-33

30 Macmillian, D; Daines, A.M; Bayrhuber, M; Flitsch, S.L; Org.Lett., 2002, 4, 1467-1470

31 Anslyn, E.V., Dougherth, D.A.; Modern Physical Organic Chemistry; University Science Books: 2006; s. 507

32 Bols, M; Hazell, R.G; Thomsen, I.B; Chem. Eur. J., 1997, 3, 940-947

33 Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 992

34 Wittman, D.M; Halcomb, R.L; Danishefsky, S.J; J. Org. Chem., 1990, 55, 1981-1983

35 Myszka, H; Bednarczyk, D; Najdar, M; Kaca, W; Carbohydrate Research, 2003, 338, 133-141

36 Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 349

37 Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 350

Bachelorprojekt forår 2007

Århus Universitet

Helle Christensen

Årskort: 20041209

Side 34 af 34

38

Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 282

39 Murray, R.W; Jeyaraman, R; J. Org. Chem, 1985, 50, 2847-2853

40 Ito, M; Okui, H; Nakagawa, H; Mio, S; Kinoshita, A; Obayashi, T; Miura, T; Nagai, J; Yokoi, S; Ichinose, R;

Tanaka, K; Kodama, S; Iwasaki, T; Miyaka, T; Takashio, M; Iwabuchi, J; Bioorg. Med. Chem, 2003, 11, 761-768

41 Gould, S.J; Shyhchen, J; J.Am.Chem.Soc, 1992, 114, 10166-10172

42 Rye, C.S; Withers, S.G; J.AM.Chem.Soc., 2002, 124, 9756-9767