�Analytik�

Riechen Krebszellen anders?

Claudia Brunner

Die Molekülzusammensetzung im Gasraum über in vitro kultivierten Zellen erlaubt es,

Lungenkrebs zellen und gesunde Lungenzellen voneinander zu unterscheiden.

� Es gibt Krankheiten, die man ein-deutig am Geruch des Patienten er-kennen kann:1) Der Atem eines schwer Zuckerkranken beispielsweise riecht nach Äpfeln, während ein deut-licher Körpergeruch nach Ammoniak auf eine Erkrankung der Leber hin-weist. Ärzte mit einer sehr feinen Nase berichten auch davon, dass Krebs oft von fauligen Gerüchen begleitet wird. Für eine Diagnose oder gar eine Früh-erkennung von Krebs sind diese Gerü-che aber zu schwach oder nicht cha-rakteristisch genug – zumindest nicht für den Menschen. Hunde dagegen mit ihrem ausgezeichneten Geruchs-sinn lassen sich darauf trainieren, ge-sunde Menschen von Krebspatienten an ihrer Atemluft zu unterscheiden.2) Ihre Trefferquote bei Lungenkrebs er-reicht 99 Prozent, und das sowohl bei richtig positiven wie bei richtig negati-ven Fällen. Bei Brustkrebs sind es bei richtig negativen 98 Prozent, bei rich-tig positiven immerhin noch 88 Pro-zent; dies entspricht fast der Treffer-quote bei der Mammographie.

Flüchtige Substanzen als Krebsmarker

� Krebszellen produzieren flüchti-ge Substanzen, die in der Atemluft nachweisbar sind. Das ist möglich, da ständig Stoffwechselmoleküle ins Blut gelangen und so in die Lunge transportiert werden. Dort findet ein Gasaustausch statt, bei dem ein Teil der volatilen Moleküle in die Atem-luft abgegeben wird. Die Art und Zu-sammensetzung der Substanzen, die Hunden eine solch präzise Unter-scheidung erlauben, sind weit-gehend unbekannt. Deshalb gleicht die Identifizierung dieser Substan-zen beim Menschen der Suche nach der Nadel im Heuhaufen. Zusätzlich macht der komplizierte menschliche Metabolismus Messungen unter exakt definierten Bedingungen fast unmöglich.3)

Um die Probleme bei der Repro-duzierbarkeit, die mit Messungen am Patienten einhergehen, zu ver-meiden, beschränkten wir uns in ei-ner Pilotstudie zunächst auf die Un-tersuchung in vitro kultivierter kan-zeröser Zellen, um grundlegende Er-kenntnisse zu sammeln und Kan-didaten für Krebsmarker zu finden.

Für diese Studie benutzten wir zwei Sorten von gesunden Zel- len (Retinale Pigmentepitelzellen hTERT-RPE1 (RPE), Bronchialepi-thelzellen BEAS 2B) und zwei Sor-ten Krebszellen (Lungenepithelzel-len A-549, Lungenkarzinomzellen EPLC 32M1). Allen vier Zelllinien ist gemeinsam, dass sie in einer mo-

nozellulären Schicht wachsen und so problemlos in Zellkulturflaschen angezüchtet werden können. Jede Zelllinie wurde in einem für die je-weilige Zellart optimierten Nähr-medium kultiviert, das während der Messung nicht entfernt werden konnte, damit die Zellen nicht aus-trocknen und sterben.

Aus der Zelle ins Massenspektrometer

� Die Zellen nehmen Stoffe aus dem Nährmedium auf und geben Stoffwechselprodukte darin ab. Bei einem Teil dieser Stoffe handelt es sich um volatile organische Kom-ponenten, kurz VOCs. Diese stehen im Gasraum über der Flüssigkeit mit denen in der Lösung im Gleichge-wicht (Abbildung 1). Mit einem Pro-tonen-Transfer-Reaktions-Massen-spektrometer (PTR-MS)4) kann die Zusammensetzung dieser VOCs im Gasraum über den Zellen analysiert werden. Dazu werden die VOCs über einen Teflonschlauch in das PTR-MS geleitet. In der Reaktions-kammer des Geräts werden VOCs dann chemisch ionisiert, indem ih-nen ein Hydroniumion ein Proton überträgt, so dass sich die Gesamt-masse des Moleküls um 1 u erhöht. Die so ionisierten Moleküle werden in einem elektrischen Feld beschleu-nigt und mit einem Quadrupol-Mas-senspektrometer analysiert.

Das PTR-MS bestimmt nur die ganzzahligen Atommassen der Mo-leküle. Deshalb ist es nicht möglich,

� QUERGELESEN

• Der Gasraum über Lungenkrebszellen enthält an-

dere Substanzen als der Gasraum über gesunden

Zellen des gleichen Zelltyps.

• Zellkulturflaschen mit Medium plus Zellen lassen

sich massenspektrometrisch eindeutig von Zell-

kulturflaschen mit reinem Medium unterschei-

den.

• Statistische Auswertemethoden machen die auf

den ersten Blick kaum erkennbaren Unterschiede

sichtbar.

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und dieses Molekül als Acetaldehyd identifiziert haben.6,7) Zudem fiel auf, dass die Moleküle der Massen 55 u, 69 u, 83 u und 97 u sowohl von gesunden als auch von Krebszel-len verbraucht, aber nie produziert wurden. Aldehyde neigen stark da-zu, bei der Protonierung ein Wasser-molekül abzuspalten, Ketone hin-gegen bleiben stabil. Daher ist diese Reihe mit hoher Wahrscheinlichkeit den Aldehyden Butanal, Pentanal, Hexanal und Heptanal zuzuordnen.

zwischen Medium plus Zellen und reinem Medium zu unterscheiden.

Ein Vergleich der so bestimmten zellspezifisch produzierten und ver-brauchten VOCs ergab weitere be-merkenswerte Ergebnisse: So wurde das Molekül der Masse 45 u nur von den beiden Krebszelllinien ver-braucht, jedoch nicht von den ge-sunden Zellen. Dies steht im Ein-klang mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, die einen ähnlichen Zusammenhang festgestellt haben

Abb. 1. Versuchsaufbau zur Messung der VOC-Konzentrationen im Gasraum von Zellkulturflaschen

(VOC: volatile organic compounds, PTR-MS: Protonen-Transfer-Reaktions-Massenspektrometer).

die genaue chemische Identität eines auf einer bestimmten Masse gemes-senen Stoffes zu bestimmen. Um die Massen eindeutig zuzuordnen, sind weitere Methoden erforderlich, zum beispiel Gaschromatographie. Klare Hinweise auf die Molekülzusam-mensetzung können aber auch die Isotopenverhältnisse zwischen ver-schiedenen Massen liefern.

Zelllinien unterscheiden

� Es stellte sich die Frage, ob wir mit der PTR-Massenspektrometrie verschiedene Zelllinien an der VOC-Zusammensetzung im Gasraum un-terscheiden können, um letztendlich zellspezifische VOC-Marker zu identifizieren. Da das Nährmedium während der Messungen unverzicht-bar war, war zuerst dessen Einfluss auf die VOC-Zusammensetzung im Gasraum der Zellkulturflaschen zu untersuchen. Dazu wurden die VOC-Konzentrationen in Flaschen mit Medium plus Zellen mit denen in Flaschen mit Medium ohne Zel-len verglichen.

Auf den ersten Blick ist der Un-terschied nicht sehr groß, wie das Beispiel der A-549-Zellen zeigt (Ab-bildung 2), da das Medium selbst die meisten VOCs erzeugt. Dennoch gibt es Massen, deren Zählrate in Anwesenheit von Zellen höher oder niedriger war als bei reinem Medi-um. Also werden gewisse Moleküle von den Zellen produziert, während andere aus dem Medium aufgenom-men und somit verbraucht werden.

Statistische Methoden: U-Test

� Eine statistische Analyse mit dem Mann-Whitney-Tests5), auch U-Test genannt, ermöglicht es, die Unter-schiede zwischen Medium plus Zel-len und reinem Nährmedium zu quantifizieren.

Bei jeder der vier untersuchten Zelllinien gab es Massen, deren Kon-zentrationen sich laut U-Test signifi-kant unterschieden (Tabelle S. 54). Dabei verbrauchten die Zellen deut-lich mehr VOCs, als sie produzierten. Mit allen signifikanten Massen zu-sammen war es möglich, eindeutig

Abb. 2. Repräsentatives Massenspektrum aus dem Gasraum einer Zellkulturflasche mit Nährmedium plus

A-549-Zellen (rot) im Vergleich zu reinem Nährmedium (grau).9)

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Analytik �Blickpunkt� 53

Statistische Methoden: Lineare Diskriminanzanalyse

� Die nächste Frage war, ob die ins-gesamt 42 identifizierten VOCs tat-sächlich zu einer Unterscheidung einzelner Zelllinien dienen können. Diese Frage wurde mit einer linearen Diskriminanzanalyse8) (LDA) unter-sucht (Abbildung 3). Die LDA ist ein multivariantes, statistisches Verfah-ren, um verschiedene Gruppen an-hand von mehreren Merkmalen von-einander zu trennen. Alle bis auf zwei zufällig ausgewählte Datensätze von jeder Zelllinie dienten dazu, Parame-ter für eine optimale Trennung der Gruppen zu bestimmen (Training). Mit den verbleibenden Datensätzen wurde anschließend die Zuverlässig-keit des Tests überprüft (Test).

Die einzelnen Zelllinien waren anhand des gemessenen VOC-Spek-trums eindeutig ohne Überlappun-gen voneinander zu unterscheiden

(Abbildung 3). Auch die Trennung von gesunden (untere Hälfte) und kanzerösen Zellen (obere Hälfte) war möglich, obwohl beide, BEAS2B und A-549, Lungenepithelzellen sind, also Zellen ähnlichen Typs. Die erfolgreiche Unterscheidung zwi-schen Lungenkrebszellen und ge-sunden Lungenzellen zeigt, dass die-se Methode eine krebsspezifische Differenzierung ermöglicht.9)

Ob sich dieser Effekt bei anderen Krebszellarten ebenso deutlich zei-gen lässt, müssen weitere Studien klären. Nachdem eine mögliche Zu-sammenstellung von Krebsmarkern gefunden wurde, könnte man dann auch beim Menschen gezielt nach diesem Muster suchen. Ein sich möglicherweise daraus ergebender Atemtest zur Früherkennung von Krebs für die klinische Praxis wäre für den Patienten besonders scho-nend. Zur Diagnose von Lungen-krebs beispielsweise dienen zur Zeit Computertomographie und Rönt-genaufnahmen des Thorax. Beide Methoden haben den Nachteil, den Patienten mit Strahlung zu belasten und trotzdem Lungentumore erst re-lativ spät sichtbar zu machen.

Claudia Brunner ist seit 2006 als Physikerin

am Helmholtz-Zentrum München beschäftigt,

wo diese Arbeit im Rahmen ihrer Diplom-

arbeit entstand. Gerade hat sie ihre Doktor-

arbeit über Computertomographie beendet.

Literatur

1) H. Hatt, R. Dee, „Das Maiglöckchen-Phä-

nomen: Alles über das Riechen und wie

es unser Leben bestimmt“, Piper Verlag,

München, 2010.

2) M. McCulloch, T. Jezierski, M. Broffman, A.

Hubbard, K. Turner, T. Janecki, Integrative

Cancer Therapies 2006, 5, 30–39.

3) B. Thekedar, W. Szymczak, V. Höllriegl, C.

Hoeschen, U. Oeh, J. Breath Res. 2009, 3,

doi:10.1088/1752–7155/3/2/027007.

4) A. Hansel, A. Jordan, R. Holzinger,

P. Prazeller, W. Vogel, W. Lindinger, Int. J.

of Mass Spectrom. Ion Processes 1995,

149–150, 609–619.

5) L. Sachs, „Angewandte Statistik“, Sprin-

ger, Berlin-Heidelberg-New York, 1999.

6) A. Sponring, W. Filipiak, T. Mikoviny et al.

Anticancer Res. 2009, 29, 419–426.

7) W. Filipiak, A. Sponring, T. Mikoviny et al.

Cancer Cell Int, 2008, 8, 17.

8) J. Bortz, „Statistik für Sozialwissen-

schaftler“, Springer Verlag, Berlin, Heidel-

berg, 1999.

9) C. Brunner, W. Szymczak, V. Höllriegl et al.,

Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397,

2315–2324.

Zelllinie Malignität Produzierte VOCs [u] Verbrauchte VOCs [u]

RPE gesund 29, 49, 73 69, 70, 81, 83, 84, 93, 97, 98

BEAS2B gesund 41 29, 46, 47, 48, 49, 57, 58, 62, 65, 69, 71, 73, 74, 79, 83, 85, 87, 89, 93, 94, 99

A-549 kanzerös 49, 73, 74 33, 41, 42, 45, 55, 57, 69, 70, 83, 84, 87, 97

EPLC2 kanzerös 41, 43, 44, 74, 75, 88 21, 31, 32, 33, 34, 42, 45, 46, 51, 57, 58, 59, 60, 69, 71, 77, 79, 85, 87, 91, 93, 94

Ergebnis des U-Tests zur Unterscheidung zwischen Medium plus Zellen und reinem Medium.

Abb. 3. Ergebnis der LDA, Trainingsdatensätze in Schwarz, Testdaten-

sätze in Rot;9) aufgetragen sind die Lineardiskriminanzkoeffizienten,

mit denen eine bestmögliche Trennung erreicht wird.

Kurz notiert

Massenspektrometrie für den Artenschutz

� Der Isotopen-Fingerabdruck von Elfenbeinproben soll helfen, deren geografischen Ursprung zu bestim-men: Das Internationale Zentrum für Elfenbeinforschung (Incentivs) an der Universität Mainz erstellt zu-sammen mit dem World Wide Fund for Nature (WWF) eine Referenz-datenbank für die Herkunft von El-fenbein. Mit Massenspektrometrie analysiert die Arbeitsgruppe um Dorrit Jacob die Isotopenverhältnis-se von Strontium, Kohlenstoff, Sau-erstoff und Stickstoff in den Proben. Anhand von etwa 500 Elfenbeinpro-ben eindeutig bekannter Herkunft will Incentivs eine Isotopen-Land-karte erstellen. Zollbeamte sollen mit dieser Karte feststellen können, woher konfisziertes Elfenbein stammt. Der Handel mit Elfenbein ist seit 1989 stark eingeschränkt. www.biomin.uni-mainz.de/englisch/

incentivs.html

Medizische Optik in Jena

� Ein Zentrum für medizinische Optik und Photonik gibt es seit No-vember 2010 an der Universität Jena. Die medizinische Fakultät trägt das Zentrum zusammen mit der physika-lisch-astronomischen und der che-misch-geowissenschaftlichen Fakul-tät.

Kathrin Wildemann

�Blickpunkt� Analytik 54

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