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S•N •A •K •E
S•N •A •K •ESupraleitendes Nanoskop für angewandte
kernphysikalische Experimente
Mikroskopisch genaue Zellbestrahlung an S.N.A.K.E.
V. Hable, A. Hauptner, G. Dollinger,R. Krücken, P. Reichart
Physik-Department E12, Technische Universität München
A.A. FriedlStrahlenbiologisches Institut, LMU-München
G.A. DrexlerInstitut für Molekulare Strahlenbiologie, GSF
T. Cremer, S. DietzelDepartment Biologie II, LMU-München
S•N •A •K •E
Gliederung
• Allgemeines Ziel• Versuchsaufbau und -ablauf• Biologische Experimente
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
Ziel
S•N •A •K •E
Anforderungen
• Um Größenordnungen variierbarer Schaden
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
Einzelstrangbrüche (SSB) Doppelstrangbrüche (DSB)
Die beiden wichtigsten DNA-Schäden
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
55 MeV 12C
296 keV/µm17 DSB
S•N •A •K •E
Anforderungen
Breites Ionenspektrum (H, He, … , Au) am Münchner Tandembeschleuniger
• Um Größenordnungen variierbarer Schaden
• Auf Submikrometer fokussierte Einzelionen
Einzelionenpräparation am Rasterionenmikroskop SNAKE
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
Einzelionenpräparation
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
Testbestrahlung eines KernspurdetektorsErzielte Auflösung
S•N •A •K •E
S•N •A •K •E
Zellbehälter
S•N •A •K •E
Bestrahlungseinrichtung
S•N •A •K •E
Muster in Zellen
Blau: DAPI-gefärbte Zellkerne
Grün: FITC-gefärbtes Rad51, das nach Bestrahlung mit 100MeV 16O zu den induzierten DSBs wandert
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DNA-Reparatur durch homologe Rekombination
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Rad51
Nach Trennung :
DNA-Reparatur durch homologe Rekombination
S•N •A •K •ES•N •A •K •E
• Inkubationszeit, in der Reparaturmechanismen anlaufen
• Fixierung der Zellen und Zugabe primärer und angefärbter sekundärer Antikörper
• DAPI-Gegenfärbung der DNA
• Mikroskopie
Aufbereitung der bestrahlten Proben
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Fluoreszenzmikroskopie
S•N •A •K •E
3D-MikroskopieTiefenschärfe deutlich unter 1µm Der Zellkern kann in seiner Tiefe nicht mit einem Bild erfasst werden Aufnahme von Stacks in z-Richtung möglich
γ-H2AX
–H2AX: Histon, um das die DNA gewickelt ist
–Phosphoriliert bei DSB
–Evtl. Signalfunktion
–Erscheint praktisch sofort nach Ionenbeschuss, daher sehr gut als Kontrolle geeignet
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Dekonvolution
• Unschärfe aus „out of focus“-Ebenen
• Das sichtbare Bild eines Objektes ist das Objekt gefaltet mit der PSF
• Verbesserung der Bildqualität durch Dekonvolution (= rechnerbasierte Entfaltung) oder konfokale Mikroskopie
Fokusebene unterhalb des Punktes
Ebene des Punktes
PSF des Mikroskops
Bild des Punktes
z
S•N •A •K •E
Dekonvolution
S•N •A •K •E
Konfokale Laserscanningmikroskopie
S•N •A •K •E
Konfokale Laserscanningmikroskopie
Auffällig: Spuren am Rand des Kerns am ausgeprägtesten
„Echte“ Biologie?
S•N •A •K •E
sch14_3 und sch20_3(Volker)
blau = DAPIrot = H2AXgrün = 53BP1
1 h nach Bestrahlung
6 h nach Bestrahlung
24 h nach Bestrahlung
Rückgang durch abgeschlosseneReparatur?oderVereinigung von Foci zu Groß-Komplexen?oderDurchgang durch Mitose?
Zeitliche Dynamik der Foci
Suche nach Korrelation zwischen chaotischen Mustern und Zellzyklus in der letzten StrahlzeitVersuch einer quantitativen Auswertung
S•N •A •K •E
p53BP1 und Mdc1
• p53BP1– Erscheint sehr früh (< ½ Std. nach Bestrahlung)– Leitet wahrscheinlich Reparaturprozesse ein ohne selbst
daran beteiligt zu sein
• Mdc1– Wie p53BP1 sehr früh und wahrscheinlich nicht aktiv an der
Reparatur beteiligt– Leitet evtl. einen alternativen Reparaturweg ein
S•N •A •K •E
Zuerst: waagrechte Linien
Untersuchung von Konkurrenzprozessen mittels Kreuzbestrahlungen
Nach einer Zeit T: senkrechte Linien
S•N •A •K •E
Kreuzbestrahlungen (T=0)
-H2AX-foci(Cy3)
53BP1-foci(FITC)
DAPI DAPI
Vorbestrahlung ca. 10Gy, also ca. 350 DSB
S•N •A •K •E
Kreuzbestrahlung (T=1,5h)
-H2AX-foci(Cy3)
53BP1-foci(FITC)
DAPI DAPI
Fixierung jeweils nach ½ Std. Inkubationszeit
S•N •A •K •E
Mögliche Ursachen
• Zellen tot bzw. so weit geschädigt, dass kein weiterer Reparaturversuch erfolgt
• Das in der Zelle vorhandene BP1 ist an den Reparaturpunkten der 1. Bestrahlung gebunden
neue Strahlzeit mit Variation der Zeiten T, der Inkubationszeit und der Dosis der Erstbestrahlung sowie zusätzlicher Beobachtung von Mdc1
S•N •A •K •E
Kreuzbestrahlungen April/Mai
• Leider Probleme mit den Antikörpern, insb. Mdc1• Bei längeren Zwischenzeiten T (>2h) keine
Konkurrenz beobachtbar Effekt kann nicht auf Absterben der Zelle beruhen
• Bei längerer Inkubationszeit (>1h) keine Konkurrenz beobachtet
S•N •A •K •E
Kreuzbestrahlungen April/Mai
γ-H2AX (Cy3)p53BP1 (Cy5)
(T=“0“h, Inkubation 1h)
S•N •A •K •E
Kreuzbestrahlungen April/Mai
(T=“0“h, Inkubation 1h, Niederdosisvorbestrahlung ca. 1,5Gy)
γ-H2AX(Cy3)p53BP1(Cy5)
S•N •A •K •E
Kreuzbestrahlungen April/Mai
Vermutung: Prozesse spielen sich auf kürzerer Zeitskala ab als angenommen
Langfristiges Ziel: Lebendzellbeobachtung direkt am Bestrahlungsplatz
S•N •A •K •E
Kreuzbestrahlungen April/Mai
(T=“0“h, Inkubation 1h)
DAPIγ-H2AX (Cy3)p53BP1 (Cy5)Mdc1 (Alexa488)
alternativer Reparaturweg von Mdc1 konnte nicht verifiziert werden
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Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns
S•N •A •K •E
Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns
• Problem: Zellen danach schwer bis gar nicht zu finden
• Lösung: Bedruckte Zellfolie– Aluminisierte Mylarfolie wird belichtet und geätzt– Zweistellige Koordinaten im Abstand 300µm
S•N •A •K •E
Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns
S•N •A •K •E
Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns
DAPI mit Fokus auf Folie
DAPI mit Fokus auf Zellebene
p53BP1(Cy3)Merge
S•N •A •K •E
Zusammenfassung und Ausblick
• Versuchsaufbau steht und liefert erste Ergebnisse• Methoden zu sinnvoller quantitativer Auswertung
müssen gefunden werden• Untersuchung der Konkurrenzprozesse noch nicht
abgeschlossen• Mit perfektionierter Zielbestrahlung einzelner Kerne
und Lebendzellmikroskopie existieren zwei Langzeitziele, die eine Vorreiterstellung in der Untersuchen der Dynamik von Reparaturvorgängen ausbauen würden
