Embed Size (px)
Citation preview
Morfologische taxonomie en DNA barcoding van een
geselecteerde groep nachtvlinders uit Afrika
Johan De Gruyter
Universiteit Antwerpen, Faculteit Wetenschappen,
Departement Evolutionaire Ecologie (EVECO)
Promotor: Dr. Luc De Bruyn
Copromotor: Dr. Kurt Jordaens
2012-2013
Masterproef ingediend tot het bekomen van de graad van Master in de Biologie,
afstudeerrichting Evolutie en Gedrag.
Abstract:
This study aimed to evaluate, and to compare, different methods to identify African species of
the superfamily Noctuoidea, the most speciose and cosmopolitan lineage of all Lepidoptera.
There were three major aims: (1) can external morphological characteristics be used to
identify species, (2) how useful are genitalia to identify species and (3) is the barcode
fragment of the mitochondrial cytochrome oxidase c subunit I (COI) useful to identify
species? In addition, the applicability of two molecular databases (BOLD and GenBank) was
assessed. Specimens from a wide range of species were caught in Tanzania (Morogoro, Ruaha
National Park, Udzungwa National Park, and Saadani National Park). It was found that
external morphology is very useful to identify specimen up to the subfamily and the genus
level, but often less reliable at the species level. Genital morphology enables only to identify
males. In addition, both external and internal morphology might be unreliable to identify
species that are sexually dimorphic. Interspecific COI sequence divergence was sometimes
too low to allow unambiguous identification of several species. We therefore suggest that
both external and internal morphology, and COI barcoding, should be combined to provide a
successful identification at the species level for African Noctuoidea. The molecular databases
proved to be useful for the identification of well-known pest species, but contain many
potentially incorrectly identified noctuoids.
2
Samenvatting:
Deze studie richt zich tot de evaluatie en vergelijking van verschillende methodes waarmee
Afrikaanse soorten behorende tot de Noctuoidea geïdentificeerd kunnen worden.
Nachtvlinders van de superfamilie van de Noctuoidea vormen de soortenrijkste en meest
kosmopolitisch voorkomende groepen van alle Lepidoptera. Hiervoor werden drie doelen
opgesteld: (1) kunnen externe morfologische kenmerken gebruikt worden om soorten te
identificeren, (2) hoe bruikbaar zijn de genitaliën om soorten te identificeren en (3) is het
barcoding fragment van het mitochondriale gen cytochroom oxidase c subunit I (COI)
bruikbaar om soorten te identificeren? Daarnaast werd ook de toepasbaarheid van twee
moleculaire databanken (BOLD en GenBank) getest. Specimen van een breed scala aan
soorten werden gevangen in Tanzania (Morogoro, Ruaha National Park, Udzungwa National
Park, Saadani National Park). Er werd gevonden dat de externe morfologie zeer goed
bruikbaar is om specimen te determineren tot op het subfamilie- en genusniveau, maar vaak
minder betrouwbaar is op het soortniveau. De genitaalmorfologie laat enkel toe om
mannelijke exemplaren te identificeren. Daarnaast blijken zowel externe als interne
morfologie onbetrouwbaar bij soorten die seksueel dimorfisme vertonen. Interspecifieke COI
divergentie was soms te laag voor een eenduidige identificatie van verschillende soorten. Er
wordt daarom voorgesteld dat externe en interne morfologie, en COI barcoding gecombineerd
moeten worden om een succesvolle determinatie mogelijk te maken op het soortniveau voor
Afrikaanse Noctuoidea. De moleculaire databanken bleken nuttig te zijn voor de identificatie
van gekende pestsoorten, maar bevatten mogelijk veel incorrect geïdentificeerde noctuoiden.
Inhoudstabel:
3
Abstract:......................................................................................................................................2Samenvatting:.............................................................................................................................3Inhoudstabel:...............................................................................................................................41. Inleiding:.................................................................................................................................8
1.1 Algemene introductie en morfologische taxonomie:........................................................81.2 DNA barcoding:................................................................................................................9
1.2.1 COI barcoding binnen de Lepidoptera:....................................................................101.3 Genetische databanken:..................................................................................................11
1.3.1 Barcode of Life System (BOLD).............................................................................111.3.2 GenBank..................................................................................................................11
1.4 Noctuoidea:.....................................................................................................................121.5 Doelstellingen.................................................................................................................13
2. Materiaal en methoden:.........................................................................................................132.1 Locaties:..........................................................................................................................13
2.1.1 Eastern Miombo Woodlands....................................................................................142.1.2 Central Zambezian Miombo Woodland...................................................................142.1.3 Eastern Arc Forests..................................................................................................142.1.4 East African Mangroves..........................................................................................152.1.5 Northern Zanzibar-Inhambane Coastal Forest Mosaic............................................15
2.2 Vangstmethoden:............................................................................................................162.2.1 Open lichtval:...........................................................................................................162.2.2 Gesloten lichtval......................................................................................................172.2.3 Met de hand..............................................................................................................17
2.3 Prepareermethoden:........................................................................................................182.3.1 Uiterlijke preparatie:................................................................................................182.3.2 Genitaalpreparatie:...................................................................................................192.4 Morfologische identificatie:........................................................................................212.4.1 Bepaling van de superfamilie en familie:................................................................212.4.2 Verdere determinatie:...............................................................................................22
2.5 Genetische analyse:.........................................................................................................222.6 Data evaluatie:................................................................................................................23
2.6.1 BOLD:......................................................................................................................232.6.2 GenBank:.................................................................................................................242.6.3 Fylogenetische analyse:...........................................................................................24
3 Resultaten:..............................................................................................................................243.1 Morfologische determinatie:...........................................................................................25
3.1.1 Externe morfologie voldoende:................................................................................253.1.2 Externe morfologie onvoldoende:............................................................................263.1.2 Interne morfologie onvoldoende:.............................................................................27
3.2 Genetische analyse:.........................................................................................................293.2.1 Sequentiebepaling:...................................................................................................293.2.2 Correcte match in BOLD:........................................................................................303.2.3 Geen correcte match BOLD:...................................................................................313.2.4 Determinatie met GenBank:....................................................................................343.2.6 Fylogenetische analyse:...........................................................................................35
3.3 Samenvatting van de resultaten:.....................................................................................363.3.1 Identificatie met externe morfologie:.......................................................................363.3.2 Genetische analyse:..................................................................................................37
4. Discussie en conclusies:........................................................................................................414.1 Morfologische identificatie:............................................................................................41
4
4.2 Genetische analyse:.........................................................................................................414.2.1 COI barcoding accuraatheid....................................................................................414.2.2 Plaatsen van onbekende soorten met COI barcoding..............................................424.2.3 Gebruik van fylogenetische bomen en afstanden:...................................................43
4.3 Correctheid van de genetische databanken.....................................................................434.4 Conclusies:......................................................................................................................44
Dankwoord................................................................................................................................44Referenties:...............................................................................................................................45
Geraadpleegde websites:.......................................................................................................45Geraadpleegde artikels:.........................................................................................................45Publicaties gebruikt voor de identificaties:...........................................................................51
5
1. Inleiding:
1.1 Algemene introductie en morfologische taxonomie:
Taxonomie, de wetenschap van het classificeren en benoemen van soorten, kan beschouwd
worden als een fundamentele basis van de biologische wetenschappen. Nochtans is er
ondanks 250 jaar van taxonomische studie naar schatting slechts 10% van de biota op Aarde
beschreven (Wilson 2000). Hiervoor zijn drie grote oorzaken: het verlies van de wereldwijde
biodiversiteit, het afnemende aantal taxonomen en de complexiteit van de biologische
diversiteit. Het wereldwijde verlies aan biodiversiteit is een topic waar de laatste 20 jaar meer
aandacht aan besteed word (bijv. de Conventie van Biologische Diversiteit (2005), 2010 werd
het jaar van de biodiversiteit, de recente Nagoya Biodiversiteit Top, en het nieuwe Europese
biodiversiteitsplan voor 2020; van Kooten et al. 2001; Fay 2010). Gegeven de trend van het
verlies aan biodiversiteit en het hogere besef hiervan is er een drang ontstaan voor het
bewaren van de huidige globale biodiversiteit. De succesvolle beperking van het verlies aan
biodiversiteit is echter een voortdurende uitdaging door twee factoren: allereerst is er een
gebrek aan kennis van de globale (en vaak ook regionale) diversiteit. Ten tweede is de
snelheid waarmee de biodiversiteit afneemt grotendeels onbekend. In deze context is de
algemene consensus dat de taxonomie een belangrijke functie inneemt door de catalogisering
en het begrijpen van de biodiversiteit (Savage 1995). Dit wordt dan weer bemoeilijkt door de
beperkingen van de traditionele morfologische taxonomische technieken. Deze zijn vaak zeer
arbeidsintensief en vereisen een hoge graad van specialisatie. De taxonomische expertise is
echter vaak zeer dun verspreid over de fylogenetische groepen (Scotland et al. 2003) en een
enkele taxonoom kan naar schatting maximum 0,01% van de miljoenen soorten identificeren
(Erwin 1982, May 1990, Hammond 1992, Stork 1993, Hawksworth & Kalin-Arroyo 1995).
Als een gevolg hiervan is het vaak zeer tijdrovend en soms zelfs onmogelijk om alle specimen
van een sample uit een biologisch divers gebied tot op soort te brengen. Dit is een direct
resultaat van vier grote problemen die morfologische taxonomische technieken tegenkomen.
Allereerst kan de fenotypische plasticiteit van veel soorten tot incorrecte identificaties leiden,
ten tweede kan de morfologische identificatie geen fenotypische verschillen onderscheiden bij
cryptische soorten, die veel voorkomen in verschillende groepen (Knowlton 1993; Jarman &
Elliott 2000). Ten derde zijn morfologische sleutelkenmerken vaak enkel effectief op een
enkel stadium of geslacht, wat de identificatie van individuen kan voorkomen en ten vierde en
laatste zijn de sleutelkenmerken vaak zo specifiek dat een zeer hoog niveau van expertise
6
vereist is wat ook tot incorrecte determinaties kan leiden (Hebert et al. 2003, Mitchell 2008).
De afhankelijkheid van taxonomie van morfologische determinaties plaatst dus een potentiële
limitering op de diagnose van de biologische diversiteit en doet de vraag rijzen naar een
snellere en gestandaardiseerde methode om organismen te identificeren.
1.2 DNA barcoding:
De ontwikkeling van microgenomische identificatiesystemen, welke toelaten om een
organisme te determineren via de analyse van een klein segment van het genoom, bieden een
mogelijke oplossing voor de problemen van morfologische identificaties. Het idee achter deze
identificatiesystemen is dat een korte, gestandaardiseerde sequentie van een deel van het
genoom gebruikt kan worden als een unieke identificatie voor een soort, als het ware
fungerend als een genetische “barcode” die in elke cel aanwezig is (Floyd et al. 2002, Hebert
et al. 2003). De fundamentele assumptie hiervan is dat de genetische variatie van de barcode
binnen een soort steeds kleiner is dan die tussen soorten. Hebert et al. (2003) definieerden het
barcode gebied als 648 basenparen vanaf het 5’-einde van het mitochondriale DNA gen
cytochroom c oxidase subunit 1 (COI). Sinds het ontstaan van het concept van barcoding is er
veel kritiek en weerstand tegenover deze technieken (Meyer & Paulay 2005, Wheeler 2005,
Hickerson et al. 2006). Afgezien van de meer theoretische limitaties geassocieerd met
barcoding worden de volgende kritieken gegeven: (I) barcoding kan niet accuraat specimen
identificeren, of nieuwe soorten ontdekken en (II) barcoding kan niet voldoen aan de
“rijkheid” van traditionele morfologische taxonomie. Met de “rijkheid” van traditionele
taxonomie wordt de kennis van de totale morfologie van de bestudeerde groepen bedoeld.
Packer et al. (2009) onderzocht of barcoding kon voldoen aan de accuraatheid en “rijkheid”
van de traditionele methoden en vond dat barcoding vaak betere resultaten geeft dan
morfologische methoden en dat barcoding nuttiger is voor het onderscheid in cryptische
soortgroepen. Deze resultaten werden nog vaak herhaald bij verschillende diergroepen en veel
taxonomen zien barcoding nu als een nuttige toevoeging en gereedschap voor de identificatie
en ontdekking van nieuwe soorten (Tautz et al. 2003, Schindel & Miller 2005). Recente
reviews (Vogler & Monaghan 2007; Waugh 2007) suggereren zelfs dat het fundamentele doel
van DNA barcoding, namelijk het verschaffen van snelle, accurate en consistente soort
identificaties, zelfs voor onbeschreven soorten (Blaxter et al. 2005), al bereikt is voor het
overgrote merendeel (>95%) van de onderzochte soorten.
7
1.2.1 COI barcoding binnen de Lepidoptera:
COI barcoding is binnen de Lepidoptera reeds veelvuldig getest. Het werk waarin het gebruik
van COI barcoding het eerst wordt voorgesteld voor de identificatie van soorten maakt
gebruik van een dataset bestaande uit Lepidoptera (Hebert et al. 2003). In deze dataset werden
drie COI profielen opgesteld: een voor de zeven dominante phyla, een voor acht van de
grootste ordes binnen de Insecta (de 4 grootste ordes Coleoptera, Hymenoptera, Lepidoptera
en Diptera werden geselecteerd met dan nog random 4 andere ordes zijnde Blattaria,
Ephemeroptera, Orthoptera en Plecoptera), en de laatste van 200 Lepidoptera soorten. Dit
profiel dient dan om de “onbekende” taxa te plaatsen binnen phylum, orde en uiteindelijk
soort. De 200 Lepidoptera soorten waren verdeeld over Geometridae, Sphingidae, Arctiidae
(nu Erebidae), Noctuidae en Notodontidae. 55 Testsoorten uit verscheidene groepen werden
gebruikt om de plaatsing binnen phyla te testen, 50 insectsoorten werden gebruikt om de
plaatsing op ordeniveau testen en 150 Lepidoptera soorten werden op soortniveau getest.
Hebert et al. vond dat de plaatsing van de taxa zeer nauwkeurig was met 96,4% correct
geplaatst in het phylum, 100% van de test taxa van zowel het orde- als soortniveau werden
correct geplaatst. Gelijkaardige resultaten werden door andere auteurs (Janzen et al. 2005,
Hajibabaei et al 2006, Burns et al 2008) herhaald in verscheidene groepen van de
Lepidoptera: o.a. bij de Hesperiidae (Brower 2006, Brower 2010), de Tortricidae (Brown et
al. 2011, Segerer et al. 2011), de Gracilariidae (Davis & De Prins 2011), de Geometridae
(DeWaard et al. 2011, Hausmann et al. 2011), de Saturniidae (Decaëns & Rougerie 2008), de
Sphingidae (Vaglia et al. 2008) en de Noctuoidea (Ball et al. 2006, Nagy et al. 2010, Nagoshi
et al. 2010, Joomun et al. 2012, Sutrisno 2012)
1.3 Genetische databanken:
1.3.1 Barcode of Life System (BOLD)
Het Barcode of Life Data System (BOLD) is een databank voor brio-informatica gericht op
het verzamelen, opslaan, analyse en publiceren van DNA barcodes. Het einddoel van de
databank is om over de volgende 20 jaar een volledige barcode bibliotheek te hebben van al
het eukaryoot leven. Door moleculaire, morfologische en distributionele data te bundelen
poogt de databank een traditionele kloof in brio-informatica te overbruggen. Onderzoek naar
groepen met gekende taxonomie wordt gebruikt om de mechanismen van de divergentie in
COI sequenties te achterhalen, welke dan weer kunnen helpen in de ontwikkeling van
algoritmes die kunnen gebruikt worden in minder bekende taxa. (Hebert et al . 2003; Smith et
8
al. 2005, 2006; Barber & Boyce 2006). BOLD is opgericht in mei 2004 en is vrij toegankelijk
voor iedereen, hoewel veel data nog niet publiekelijk vrijgegeven is. Ondertussen werken er
meer dan 120 organisaties van 45 landen mee aan BOLD en de databank bezit momenteel
meer dan 1 900 000 sequenties.
1.3.2 GenBank
De GenBank sequentiedatabank is een geannoteerde collectie van alle publiekelijk
toegankelijke nucleotide sequenties en hun proteïnetranslaties. Deze databank is ontstaan uit
het National Center for Biotechnology Information (NCBI) als een onderdeel van een
internationale samenwerking van het Europees Moleculair Biologisch laboratorium (EMBL),
databibliotheken van het Europees Brio-informatica instituut (EBI) en de DNA databank van
Japan (DDBJ). GenBank en zijn collaborateurs ontvangen sequenties geproduceerd in
laboratoria en bijgevolg heeft GenBank sinds de ontwikkeling een exponentiële groei gekend.
Ten tijde van laatste update in april 2011 bevatte GenBank meer dan 126 miljoen sequenties.
De data in GenBank komt zowel van individuele laboratoria als van grootschalige
sequentiecentra (Olson et al 1989).
1.4 Noctuoidea:
De superfamilie van de Noctuoidea is met ongeveer 70 000 beschreven soorten de
omvangrijkste superfamilie binnen de Lepidoptera (Kitching & Rawlins 1998). Adulten en
larven vertonen een vaak overweldigende diversiteit in grootte, kleur, gedrag en ecologie. De
monofylie van de Noctuoidea is gebaseerd op een enkel apomorf extern morfologisch
kenmerk: De aanwezigheid van een metathoracaal tympanum (figuur 1) (Miller 1991) met
geassocieerde abdominale kenmerken (Kitching & Rawlins 1998) Deze monofylie is
meermaals bevestigd en geaccepteerd (Nielsen 1989; Miller 1991; Kitching & Rawlins 1998;
Mitchell et al. 2006).
9
Figuur 1: links: locatie van het metathoracaal tympanum bij de Noctuoidea. Rechts: Close-up van het
metathoracaal tympanum (rode pijl) met geassocieerde tympanale kap op het eerste abdominale segment
(blauwe pijl). Afgebeeld specimen: Hypotacha isthmigera (Erebidae, Erebinae).
(Deze superfamilie heeft wereldwijd een enorme economische impact door vraat aan
landbouwgewassen. Bijgevolg zijn de voornaamste studies om soorten deze diverse familie te
identificeren gedaan rond de zogenaamde “pestsoorten”. Een beperkt aantal van deze studies
maakt gebruik van COI barcoding om te testen of individuen uit nauw verwante soorten
hiermee onderscheiden kunnen worden: Joomun et al. (2012) en Sutrisno (2012)
onderzochten of COI barcoding gebruikt kan worden bij soorten van het genus Mythimna
(Noctuidae, Hadeninae). Beide studies vonden dan COI barcoding in het genus Mythimna
zeer positieve resultaten gaf. Dewaard et al. (2010) onderzochten het gebruik van COI
barcoding bij Lymantria (Erebidae, Lymantriinae) en konden met behulp van COI barcoding
een sequentiebibliotheek construeren die een 100% succesrate had bij het identificeren van
soorten behorende tot Lymantria. Ball et al. (2006) kwamen tot dezelfde conclusie voor de
subfamilie van de Lymantriinae. Nagy et al. (2010) hebben getest of barcoding gebruikt kon
worden om oudere, gedroogde afrotropische specimen uit de subfamilie van de Lymantriinae
uit musea nog gebruikt kunnen worden en of barcoding dan nog tussen soorten kan
discrimineren. Zij kwamen tot de conclusie dat zelfs deze specimen nog gebruikt kunnen
worden en dat COI barcoding een nuttig hulpmiddel is voor de afrotropische
vertegenwoordigers van de Lymantriinae. Als laatste heeft Nagoshi et al. (2010) nog het
gebruik van COI getest in Spodoptera (Noctuidae, Amphypirinae). Meer bepaald werd getest
of COI Barcoding kon discrimineren tussen Spodoptera litura en S. littoralis, twee nauw
10
verwante en morfologisch zeer gelijkende soorten die beide wereldwijd een grote impact
hebben door de vraat aan landbouwgewassen. Er werd gevonden dat COI barcoding
consistent specimen in de juiste soort kon plaatsen. Dit kan zijn toepassingen hebben om de
larvale stadia van deze vlinders te identificeren zodat een effectievere bestrijding ontwikkeld
kan worden.
1.5 Doelstellingen
Deze studie richt zich op het onderzoeken of barcoding kan aangewend worden om soorten
van de Oost-Afrikaanse Noctuoidea te identificeren. Van deze vlinders wordt de externe en
interne morfologie gekarakteriseerd en de sequentiegegevens van de DNA-barcoding regio
van het mitochondriale cytochroom oxidase c I gen (COI) worden bepaald. Met deze
gegevens kan dan onderzocht worden hoe COI barcoding zich verhoudt ten opzichte van
morfologische determinatietechnieken. Additioneel wordt getest of de internationale
moleculaire databanken BOLD en GenBank aangewend kunnen worden om tot een snellere
en eenvoudigere determinatie te komen van Oost-Afrikaanse Noctuoidea.
2. Materiaal en methoden:
2.1 Locaties:
Als praktisch onderdeel van de opleiding Biologie aan de Universiteit van Antwerpen, wordt
elke twee jaar een tropische stage ingepland in Tanzania. Tijdens de stage van 2010 werden er
op vijf locaties nachtvlinders verzameld tussen 3-23 juli, met name in Morogoro en in de
nationale parken Ruaha (Ngajira campsite), Udzungwa (Mwanihana forest reserve) en
Saadani (campsite 27 en Zaraninge forest) (figuur 2). In Morogoro werd een week lang
gevangen en in de nationale parken twee dagen per locatie. Deze vijf locaties liggen binnen
aparte terrestrische ecoregio’s (Burgess et al. 2004):
2.1.1 Eastern Miombo Woodlands: deze ecoregio bestaat voornamelijk uit
tropisch en subtropische graslanden, savanne, struikgewas en bossen en is beperkt tot de
laaggelegen gebieden. De ondergrond is uitgeloogd en arm aan nutriënten, organisch
materiaal en licht zuur. Het klimaat is seizoenaal tropisch, met een unimodaal regenpatroon
waarbij het overgrote merendeel van de jaarlijkse regen valt tijdens de warmste maanden
november tot maart. Het gebied is bijna volledig vorstvrij. De stad Morogoro valt binnen deze
ecoregio en doet voornamelijk dienst als een centrum voor agricultuur, wat zich uit in een
sterk achteruitgaan van natuurlijke biotopen. Velden met maïs, bananen, sisal en andere
11
gewassen liggen verspreid in de regio terwijl de residentiële gebieden meer centraal liggen.
De vangstplaats was gelegen op in een ruderaal open grasland met aanpalende akkers
(voornamelijk maïs).
2.1.2 Central Zambezian Miombo Woodland: Ook deze regio bestaat
voornamelijk uit tropisch en subtropisch grasland, savanne, struikgewas en bossen, maar komt
enkel voor op het hoger gelegen Centraal-Afrikaans plateau. De ondergrond is uitgeloogd en
arm aan nutriënten, bevat relatief weinig organisch materiaal en is licht zuur. Het gebied kent
een unimodale regenval met de hoogste concentratie aan regen tijdens de warme maanden
november tot april. Door de hogere ligging kan er vorst optreden tijdens de droge koudere
maanden. Het Ruaha National Park is met 20226 km2 een van de grootste nationale parken in
Tanzania. Het park is een deel van een groter systeem (50000 km²) dat bestaat uit vier game
reserves en twee beschermde gebieden rond het nationale park. Er werd gevangen in de buurt
van de kampplaats naast de Great Ruaha River op een open zandplek met bomen behorend tot
het genus Brachystegia in de buurt.
2.1.3 Eastern Arc Forests: Deze ecoregio bestaat uit tropisch en subtropisch
vochtige breedbladige bossen. De Eastern Arc Forests vormen een onderbroken keten van
beboste bergen van Zuidoost-Kenia tot Oost-Tanzania, welke een gemiddelde maximale
hoogte hebben van 2200-2500m. De bodem is relatief arm maar rijker aan voedingsstoffen
dan in het dalbodems. Deze gebieden hebben jaarlijks een hogere regenval door de hoogte,
hoewel er bewijs is voor een afname in jaarlijkse neerslag. Door de hoge ligging treedt er
regelmatig vorst. Doordat het klimaat op de bergen stabiel is gebleven voor miljoenen jaren is
er een hoge soortenrijkdom en zijn er veel endemen. Udzungwa National Park is ongeveer
1990 km2 groot en bestaat bijna volledig uit tropisch woud. Rondom het park is er veel
menselijke activiteit met veel landbouw. Het Mwanihana Forest Reserve bevindt zich aan de
rand van Udzungwa National Park en hierin bevond zich het vangstgebied. De specimen
werden gevangen op een meer open plek in het regenwoud met menselijke activiteit op
minder dan 1km afstand.
2.1.4 East African Mangroves: De mangroven van Oost-Afrika kunnen ruwweg
opgedeeld worden in twee types: meestal kleine mangroven langs de open kust en meer
uitgestrekte mangroven langs de estuaria van grote rivieren. Hoewel de mangroven van Oost-
Afrika kleiner zijn dan die van West-Afrika, is de algemene biodiversiteit groter. Saadani
National Park is het enige wildnatuurreservaat in Tanzania dat aan de kust ligt. Het is met
slechts 1100 km2 een van de kleinere nationale parken van Tanzania maar herbergt een grote
12
diversiteit aan biotopen. Er werd gevangen in een kustsavanne met hoog gras en Acacia
zanzibarica als dominante boomsoort, met verspreide kleine mangroves langs de kustlijn.
2.1.5 Northern Zanzibar-Inhambane Coastal Forest Mosaic: Deze ecoregio
bestaat ook uit Tropisch en subtropisch vochtig breedbladig woud. De bodem is complex,
maar meestal niet erg vruchtbaar. Deze gebieden kennen een tropisch klimaat met een hoge
vochtigheid. De meeste regen komt voor tijdens twee regenseizoenen, maar losstaande
regenbuien komen vaker voor dan in de andere ecoregio’s. Dit klimaat is waarschijnlijk
stabiel gebleven voor verscheidene miljoenen jaren. Dit heeft dan weer gezorgd voor een
hoge diversiteit en endemisme. In deze ecoregio werden enkel poppen en rupsen verzameld in
Zaraninge Forest.
Figuur 2: Kaart van Tanzania met de verschillende vangstplaatsen aangeduid. (www.abouttanzania.com)
2.2 Vangstmethoden:
Er werden drie verschillende vangstmethoden toegepast:
2.2.1 Open lichtval:
Met deze methode werd er gevangen door een lamp langs elke kant van een opgehangen wit
laken te plaatsen. De gebruikte lampen voor deze methode waren een hogedruk
kwikdamplamp van 125Watt, een menglichtlamp van 140Watt en een terrariumlamp voor
13
reptielen van 16Watt. Deze lampen hebben een hoog stralingspercentage van UV-A
(golflengte tussen 315 en 400 nm) en UV-B (golflengte tussen 280 en 315 nm) straling, wat
voor een hoge aantrekkingskracht zorgt (Hosagoudar & Manjunatha, 2011; Carlson et al.,
1968; Van Langevelde et al., 2011). De vlinders, aangetrokken door het licht, landen op het
laken waar ze gemakkelijk verzameld kunnen worden (figuur 3). Op deze manier werd met
drie personen alle aangetrokken vlinders verzameld van zonsondergang (rond zes uur) tot
middernacht. Deze methode werd enkel in Morogoro toegepast.
2.2.2 Gesloten lichtval
Omdat het vangen met het laken beperkt is tot middernacht en dit in de nationale parken niet
toegelaten was, werd er ook gebruikt gemaakt van een lichtval om specimen te vangen. Deze
val was van het “skinner” model (figuur 3). Deze val bestond uit een houten doos waar het
licht boven werd geplaatst. Onder de lichtbron werden 2 doorzichtige platen van plexiglas
geplaatst in een schuine hoek. De openingsspleet tussen de 2 platen was 5cm om alle vlinders
erdoor te laten. Voor deze vangstmethode werd enkel gebruik gemaakt van de 125Watt
hogedruk kwikdamplamp omdat deze lamp de grootste aantrekking heeft. De aangetrokken
vlinders komen via de platen in de houten doos terecht waar ze zich onder eikartons kunnen
verstoppen tot ze de volgende dag verzameld worden. Deze methode werd de laatste 2 dagen
in Morogoro gebruikt en in alle nationale parken.
2.2.3 Met de hand
Als laatste werden er nog specimen verzameld door in de schemering de vegetatie af te
zoeken met een vlindernet en door rupsen en poppen te zoeken op de waardplanten. De
rupsen werden dan samen met een deel van de waardplant geïncubeerd tot de vlinder
ontpopte. Deze methode werd enkel in Morogoro toegepast.
14
Figuur 3: Links: verzamelen van nachtvlinders aan het laken. Rechts: Nachtvlinderval van het skinner type.
2.3 Prepareermethoden:
2.3.1 Uiterlijke preparatie:
De gevangen vlinders werden verdoofd met ethylacetaat en overnacht ingevroren. De
eerstvolgende dag werden de vlinders opgespeld (figuur 4), waarbij de vleugels reeds zo veel
mogelijk gespreid werden om de latere preparatie gemakkelijker te maken. In de nationale
parken was er geen mogelijkheid om de vlinders in te vriezen en daarom werden de vlinders
gedood door ze in de zon te leggen, waarna ze opgespeld werden. De verdere preparatie
gebeurde in België.
Figuur 4: Opspelden van de vlinders met initiële spreiding van de vleugels.
15
Vooraleer de vlinders verder werden uitgeprepareerd, werd er van elk exemplaar 1 a 2 poten
verwijderd en ondergebracht in absolute (99,9%) ethanol (C2H6O) voor de latere moleculaire
extractie. Elk specimen kreeg hierbij een unieke identificatiecode toegewezen bestaande uit 2
letters gevolgd door 8 cijfers. Hierna werden de vlinders opgeweekt door ze 24 tot 48 uur in
een met water verzadigde atmosfeer te brengen. Ter voorkoming van schimmelvorming
werden steeds enkele kristallen thymol (C10H13OH) toegevoegd (Kordali et al., 2008; Sokovic
et al., 2009). Voor een succesvolle determinatie is het noodzakelijk dat alle vlinders mooi
open worden geprepareerd zodat alle kenmerken goed zichtbaar zijn. Dit wordt verwezenlijkt
door ze op spanplankjes uit te spreiden en opnieuw 24 tot 48 uur te laten drogen. Eens de
vlinders in de juiste positie stonden werd een etiket toegevoegd met de exacte vindplaats,
datum en collector, en een etiket met de unieke identificatiecode. Hierna werd van elk
exemplaar een foto gemaakt om de originele habitus vast te leggen.
2.3.2 Genitaalpreparatie:
Voor het uitprepareren van de genitalia werd de methode grotendeels gevolgd zoals
beschreven in de entomobrochure van Phegea (De Prins, 2007), en in “The preparation of
Lepidoptera genitalia with special reference to the Microlepidoptera” (Robinson, 1976). De
volgende procedure werd gevolgd:
I. Macereren van het abdomen gedurende 12-24 uur:
Van elk exemplaar werd het abdomen verwijderd door het zachtjes op en neer te
bewegen met een pincet tot het afbreekt. Vervolgens werd het abdomen vijf seconden in
ethanol gelegd om dan overgebracht te worden in 10% Kaliumhydroxide (KOH) voor
12-24 uur afhankelijk van de grootte van het specimen. Het is zeer belangrijk om bij elk
abdomen een etiket te houden elke verwarring uit te sluiten. Dit etiket werd dan ook bij
elke volgende stap meegenomen.
II. Uitprepareren van de genitaliën
Na de maceratie werd het abdomen gespoeld in gedestilleerd water om de KOH te
verwijderen. Het abdomen werd dan overgeplaatst in een horlogeglas met water. Door
met een fijn penseel (marterhaar grootte 000) dwars over de tergieten en sternieten te
borstelen werden de meeste schubben en zacht weefsel verwijderd. Het abdomen werd
dan opengemaakt door met twee genitaalpincetten de pleurieten aan de linkerzijde (in de
standaard anatomische positie) open te trekken tot aan het laatste abdominale segment.
Bij mannelijke exemplaren werd het laatste abdominaal segment mee open gemaakt
waarna de genitaliën verwijderd werden. Bij vrouwtjes werd het laatste abdominaal
16
segment intact gelaten en samen met de genitaliën verwijderd. Hierna werden het
abdomen en genitaliën overgebracht in een horlogeglas met 25% ethanol voor een
verdere reiniging. Hierbij werden de overige schubben en haren verwijderd van zowel
het abdomen als de genitaliën (uitgezonderd de structuren die belangrijk waren voor de
identificatie) met een fijner penseel (marterhaar grootte 0000). Bij mannetjes werd ook
de aedagus van de rest van de genitaliën gescheiden en werden de vesica uitgestulpt.
Indien aanwezig werden ook de coremata uitgestrekt (figuur 5 en 6).
III. Kleuring
Omdat sommige chitinestructuren te fijn zijn om duidelijk te onderscheiden, werden de
meeste preparaten gekleurd. Het abdomen en genitaliën van de vrouwelijke exemplaren
werden gedurende 6-8 seconden ondergedompeld in een 1% chlorazol black E
(C34H25N9Na2O7S2) oplossing in 70% ethanol en erna gespoeld in 70% ethanol. De
mannelijke genitaliën werden 5-10 minuten ondergedompeld in een 2% eosine Y
(C20H8Br4O5) oplossing en erna gespoeld met water.
IV. Ontwatering
Om latere afbraak van de preparaten te vermijden, moet het water uit de structuren
verwijderd worden. Na de reiniging en de kleuring werden de preparaten in een
oplossing van 70% alcohol gelegd gedurende 15 minuten. Vervolgens werden de
preparaten overgebracht in absolute ethanol voor minstens 60 minuten afhankelijk van
de grootte van het preparaat. Omdat de chitinestructuren al verharden in hoge
concentraties ethanol, moeten de genitaliën reeds in de juiste houding gebracht worden
voor de insluiting.
V. Insluiting
Als insluitingmiddel werd voor euparal gekozen omdat deze stof een hoge tolerantie
heeft voor watersporen in het preparaat waardoor preparaten direct uit ethanol
overgebracht kunnen worden en omdat deze stof ook een relatief lage brekingsindex van
1,478-1,535 heeft waardoor fijnere structuren duidelijk te zien zijn in het preparaat
(Gilson G, 1906; Hebb RG, 1907). Euparal bestaat uit een mengsel van sandarac hars,
paraldehyde (C6H12O3), eucalyptol (C10H18O), fenylsalicylaat (C13H10O3) en kamfer
(C10H16O). Het voorwerpglas en het dekglaasje werden met een 95% ethanol oplossing
gereinigd. Op het voorwerpglas werden enkele druppels euparal uitgespreid. De
genitalia en bijhorend abdomen werden nog even in eucalyptol (het oplosmiddel van
euparal) gelegd voor een beter contrast waarna het overgebracht werd op het
voorwerpglas. Het preparaat werd dan in de gewenste houding gebracht waarin alle
17
structuren duidelijk zichtbaar zijn. Het dekglaasje werd dan nog bevochtigd met
eucalyptol waarna het op het preparaat gelegd werd. Voor grote preparaten werd een
voorwerpglas met een centrale holte gebruikt. Op het voorwerpglas werd het
identificatienummer van het specimen in kwestie genoteerd. De preparaten werden dan
gedurende 48 uur bij een temperatuur van 45°C gedroogd om de euparal uit te laten
harden. Indien er lucht onder het dekglas kwam door het inkrimpen bij het drogen werd
dit bijgevuld met euparal. Hierna werd van elk preparaat een foto genomen waarbij elke
foto als naam de identificatiecode kreeg.
Figuur 5: Algemene structuren van de mannelijke genitalia bij Lepidoptera. Links: langszij bekeken, rechts:
ventraal bekeken. (De Prins W. 1981)
Figuur 6 Links: algemene structuren van de vrouwelijke genitalia bij Lepidoptera (ventraal bekeken). Rechts:
mannelijke genitalia van Amerila bubo (Walker) met coremata op de valven (langszij bekeken) (De Prins W.
1981, Häuser, C.L. & Boppré, M. 1997)
18
2.4 Morfologische identificatie:
2.4.1 Bepaling van de superfamilie en familie:
Zoals in de inleiding vermeld is de aanwezigheid van een metathoracaal tympanum (figuur 1)
een goed herkenningspunt van de Noctuoidea (Miller 1953, Kitching & Rawlings, 1999). In
de Noctuoidea worden momenteel zes families erkend (Zahiri et al. 2010, 2012a,b). Voor
deze studie werd gebruik gemaakt van de fylogenie voorgesteld door Zahiri et al (2012a) (ook
weergegeven op www.afromoths.net). De verschillende families waartoe de specimen
behoren werden bepaald met de volgende publicaties: Voor de Notodontidae werd gebruik
gemaakt van de publicaties van Miller (1953), Kitching & Rawlings (1999) en Lafontaine &
Fibiger (2006). Voor de Nolidae werden de publicaties van Holloway (1998), Kitching &
Rawlings (1999), Holloway (2003), Lafontaine & Fibiger (2006) en Zahiri et al. (2012 (b))
gebruikt. Om de familie van de Euteliidae te determineren werd gebruik gemaakt van de
publicaties van Holloway (1987), Kitching & Rawlings (1999) en Zahiri et al. (2010). Om de
families Erebidae en Noctuidae te identificeren werden de publicaties van Fibiger &
Lafontaine (2005) en Zahiri et al. (2012 (a)) gebruikt.
2.4.2 Verdere determinatie:
De specimen werden vervolgens tot op soort gebracht met behulp van recente publicaties (zie
referentielijst), hulp van dr. Albert Legrain (Société d’Entomologie Africaine), dr. Leif Aarvik
(University of Oslo, Natural History Museum) en dr. Ugo Dall’Asta (Koninklijk Museum
voor Centraal Afrika) en via de raadpleging van de collecties van het Koninklijk Museum
Voor Midden-Afrika in Tervuren, de Zoologische Staatssammlung onder begeleiding van dr.
Axel Hausmann en het Brits Natuurhistorisch Museum in Londen onder begeleiding van dr.
Martin Honey. Er werd gepoogd de vlinders met behulp van externe morfologie eenduidig te
determineren, waarna de aanwezige genitaalpreparaten vergeleken werden met de eigen
preparaten. Indien mogelijk werden de specimen steeds vergeleken met typespecimen om
incorrecte identificaties te vermijden.
2.5 Genetische analyse:
Vooraleer de vlinders verder werden uitgeprepareerd, werd er van elk exemplaar 1 of 2 poten
verwijderd en bewaard in absolute (99,9%) ethanol voor de moleculaire analyse. Totaal
genomisch DNA werd geëxtraheerd uit één poot met behulp van een Nucleospin Tissue Kit
en volgens het bijgeleverde protocol (Macherey-Nagel). Een langere incubatieperiode
19
(overnacht bij 56°C) werd gebruikt om een volledige lyse te garanderen. Een gedeelte van de
subunit 1 van het mitochondriale cytochroom oxidase c gen werd geamplificeerd met de
primers Lep-HybLCO (5’-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-ATT-CAA-CCA-ATC-ATA-
AAG-ATT-TGG-3’) en Lep-HybHCO (5’-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACT-AAA-CTT-
CTG-GAT-GTC-CAA-AAA-ATC-A-3’). (WahlBerg & Wheat, 2008; Nagy et al., 2010).
PCR’s (Polymerase Chain Reaction) werden uitgevoerd in een 30 µl eindvolume bestaande
uit 1x PCR buffer, 2mM MgCl2, 0,2 mM dNTP’s, 0,8 µM forward en reverse primer, 0,02
units/µl platinum Taq polymerase en 2µl DNA extract. Het volgende PCR profiel werd
gebruikt: een initiële denaturatie bij 90°C voor 4 minuten, gevolgd door 40 cycli van 60s bij
94°C, 60s bij 46°C en 60s bij 72°C en een finale stap van 10 minuten bij 72°C. Het PCR
product werd vervolgens geëvalueerd op een voorgemaakte 1,2% agarosegel (Invitrogen) en
gefotografeerd (figuren bijgevoegd in appendix). Het PCR product werd gezuiverd op een
NucleoFast PCR plaat (Macherey-Nagel). Het gezuiverde PCR product werd gesequeneerd in
beide richtingen met een ABI 3130xl DNA sequencer (Life Technologies) gebruikmakende
van de BigDye Terminator v1.1 Sequencing Kit (Life Technologies).
2.6 Data evaluatie:
De bekomen sequenties werden gecheckt en gealigneerd gebruikmakend van de SeqScape
v2.7 (Life Technologies) software. Hierna werden de bekomen sequenties opgezocht voor een
match in de verschillende genetische databanken en deze match werd vergeleken met het
resultaat van de morfologische determinaties (zowel externe als interne morfologie). Indien
een hit op een databank hetzelfde resultaat gaf als de interne morfologie dan werd deze als
een positieve match beschouwd. Er werd ook een fylogenetische analyse gedaan om de
interspecifieke relaties tussen de specimen te onderzoeken.
2.6.1 BOLD:
De gevonden sequenties werden opgezocht gebruikmakend van het identificatiesysteem op de
website. BOLD maakt gebruik van een hidden markov model (HMM) om de ingevoerde
sequentie te vergelijken met een globale sequentie van de databank. Hierna wordt een lineaire
zoektocht door de referentiedatabank gedaan om te zoeken naar een mogelijke match. Indien
de divergentie met de gevonden sequentie minder dan 1% bedraagt wordt het gevonden
resultaat door BOLD als een soortspecifieke match beschouwd. Indien de divergentie groter is
dan 1% maar kleiner dan 3% dan wordt de sequentie aan de hand van de data in een genus
geplaatst (Ratnasingham & Hebert, 2007). BOLD construeert daarnaast ook steeds een
20
neighbour joining tree, gebaseerd op kimura 2-parameter afstanden (Kimura, 1980), met de
interne en de opgezochte sequenties. Deze boom werd steeds geraadpleegd en aan de hand
ervan kon het best scorende specimen op de databank geselecteerd worden, waarna de BIN
pagina van dit specimen bekeken werd voor additionele informatie over de vangstplaats en
identificatie. Om de betrouwbaarheid van de databank en deze grenswaarden te testen werd
gekeken naar hoeveel soorten er correct gedetermineerd worden met een grenswaarde van 1%
en 3% sequentiedivergentie. Hetzelfde werd herhaald voor de correcte plaatsing in een genus
alleen werden hierbij 3% en 5% sequentiedivergentie getest. BOLD construeert daarnaast ook
steeds een neighbour joining tree met de interne en de opgezochte welke steeds geraadpleegd
werd. Aan de hand van deze boom kon het best scorende specimen op de databank
geselecteerd worden, waarna de BIN pagina van dit specimen bekeken werd voor additionele
informatie over de vangstplaats en identificatie.
2.6.2 GenBank:
In GenBank werden de sequenties ook opgezocht, maar GenBank maakt voor het opzoeken
van sequenties gebruik van een Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Voor het
opzoeken van de sequenties van de specimen werd gekozen voor een nucleotide megaBLAST
(voor sterk gelijkende sequenties). Zoals BOLD construeert GenBank ook steeds een
fylogenetische boom (neighbour joining met K2P afstanden). Er werd gezocht in de volledige
nucleotide databank van GenBank. In GenBank werd dezelfde werkwijze toegepast als in
BOLD: de betrouwbaarheid van de databank werd getest door te kijken naar hoeveel soorten
er correct gedetermineerd worden met een grenswaarde van 1% en 3% sequentiedivergentie.
Hetzelfde werd ook hier herhaald voor de correcte plaatsing in een genus met 3% en 5%
sequentiedivergentie.
2.6.3 Fylogenetische analyse:
Een beperkte fylogenetische analyse werd uitgevoerd om de intra- en interspecifieke
sequentiedivergentie bloot te leggen. Hiervoor werd gebruikgemaakt van MEGA 5.10
(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (Tamura et al. 2011). Een neighbour joining tree
gebaseerd op een Kimura 2-parameter model (K2P) (Kimura, 1980) werd geconstrueerd van
de sequenties. Een nonparametrische bootstrap van 1000 werd uitgevoerd om de
betrouwbaarheid van de takken weer te geven.
21
3 Resultaten:Er werden in totaal 617 vlinders gevangen over de vangstperiode van 20 dagen. Hiervan
werden er 311 in Morogoro, 43 in Ruaha National Park, 152 in Udzungwa National Park en
112 in Saadani National Park verzameld. Van deze 617 vlinders werden 209 gedetermineerd
als Noctuoidea. Er konden 126 specimen met zekerheid tot op soortniveau gedetermineerd
worden, behorend tot 65 soorten. Dit is 60,29% van het totaal aantal specimen. De Erebidae is
met 137 gevangen specimen en 40 gedetermineerde soorten veruit de grootste familie en de
Euteliidae de kleinste met slechts 2 specimen die beide tot dezelfde soort behoren.
Door een gebrek aan referentiemateriaal konden 55 specimen niet geverifieerd worden op
soortniveau en van zes specimen kon het genus niet achterhaald worden. 16 specimen konden
niet in een subfamilie geplaatst worden en zes specimen konden niet aan een familie
toegewezen worden door de afwezigheid van de nodige determinatiekenmerken. Een
soortenlijst met alle gegevens over soort, geslacht, barcoding en vindplaats van de specimen is
bijgevoegd in de appendix, evenals de foto’s van de specimen en preparaten.
3.1 Morfologische determinatie:
3.1.1 Externe morfologie voldoende:
Gebruikmakend van externe morfologische kenmerken kon aan 95 specimen een soortnaam
gegeven worden die correct bleek wanneer deze vergeleken werd met de interne morfologie.
Deze specimen behoorden tot 50 soorten (tabel 1). Dit komt overeen met 75,39% van de
geïdentificeerde specimen en 76,92% van het aantal gedetermineerde soorten. Deze soorten
bezitten minstens één uniek extern morfologisch kenmerk, meestal een tekening of structuur
op de vleugels, dat toelaat om ze enkel hierop te determineren (figuur 7).
Figuur 7: Chalciope delta is een voorbeeld van een soort waarbij de uiterlijke morfologie, met de duidelijke
witte driehoek op de vleugels, toelaat een betrouwbare identificatie te maken.
22
Tabel 1: De soorten die gedetermineerd kunnen worden met externe morfologie.
Familie Subfamilie Soort AantalErebidae Anobinae Anoba atriplaga 1Erebidae Anobinae Anoba hamifera 1Erebidae Anobinae Plecoptera tripalis 1Erebidae Arctiinae Afrasura ichorina 3Erebidae Arctiinae Amerila bubo 2Erebidae Arctiinae Amerila phaedra 1Erebidae Arctiinae Amerila vitrea 3Erebidae Arctiinae Apisa canescens 1Erebidae Arctiinae Argina amanda 1Erebidae Arctiinae Argina astrea 1Erebidae Arctiinae Creatonotos leucanioides 1Erebidae Boletobiinae Acontia imitatrix 1Erebidae Boletobiinae Acontia transfigurata 1Erebidae Boletobiinae Eublemma anachoresis 1Erebidae Boletobiinae Eublemma apicata 14Erebidae Boletobiinae Eublemma apimacula 1Erebidae Boletobiinae Eublemma baccalix 7Erebidae Boletobiinae Eublemma seminivea 2Erebidae Boletobiinae Phytometra subflavalis 5Erebidae Calpinae Gesonia obeditalis 2Erebidae Calpinae Gnamptogyia diagonalis 1Erebidae Calpinae Lacera alope 1Erebidae Calpinae Oraesia emarginata 1Erebidae Erebinae Achaea oedipodina 1Erebidae Erebinae Chalciope delta 1Erebidae Erebinae Cyligramma fluctuosa 1Erebidae Erebinae Egybolis vaillantina 1Erebidae Erebinae Hypopyra capensis 1Erebidae Erebinae Lyncestis dargei 1Erebidae Erebinae Rhynchina revolutalis 1Erebidae Erebinae Tachosa asperum 2Erebidae Hermiininae Nodaria nodosalis 2Erebidae Hypeninae Hypena laceratalis 1Erebidae Hypeninae Hypena varialis 1Erebidae Hypenodinae Luceria oculalis 2Eutelliidae Eutelliinae Marathyssa cuneata 2Noctuidae Amphipyrinae Callopistria maillardi 1Noctuidae Amphipyrinae Parca tristictica 1Noctuidae Amphipyrinae Spodoptera cilium 3Noctuidae Hadeninae Leucania punctulata 1Noctuidae Hadeninae Mythimna hamata 7Noctuidae Hadeninae Mythimna viettei 1Noctuidae Heliothinae Adisura bella 1Noctuidae Heliothinae Adisura callima 1Nolidae Bleninae Garella nilotica 3Nolidae Chloephorinae Gyrtothripa pusilla 1Nolidae Chloephorinae Maurilia arcuata 1Nolidae Chloephorinae Odontestis striata 1Nolidae Nolinae Nolidia pumilalis 2Notodontidae Notodontinae Scalmicauda bicolorata 1
23
3.1.2 Externe morfologie onvoldoende:Voor 33 specimen waren externe kenmerken niet voldoende om een onderscheid te kunnen
maken en tot een identificatie op soortniveau te komen (tabel 2). Deze specimen waren
verspreid over 19 soorten waarvan 6 niet tot soortspecifieke identificatie gebracht konden
worden door een gebrek aan genitaalpreparaten in de geraadpleegde collecties en publicaties.
De reden dat er geen soortspecifieke identificatie kan gemaakt worden was te wijten aan één
van de volgende oorzaken:
De externe habitus van verschillende soorten binnen het genus is hetzelfde of zeer
sterk gelijkend (figuur 8).
De soort vertoond een extreme variatie in uiterlijk en de gevonden vorm is nog niet
beschreven als behorende tot dezelfde soort
Er is sprake van seksueel dimorfisme waardoor de mannetjes en vrouwtjes van
dezelfde soort niet met elkaar in verband kunnen worden met enkel externe
kenmerken.
In het geval van een hoge variatie of zeer gelijkende soorten bieden genitaalpreparaten
meestal een uitkomst. Om te achterhalen of twee specimen behoren tot een soort met sexueel
dimorfisme zijn kweekexperimenten de enige betrouwbare uitkomst.
3.1.2 Interne morfologie onvoldoende:
In een aantal gevallen was de interne morfologie niet voldoende om soorten te identificeren.
Meestal was dit te wijten aan het gebrek aan definiërende kenmerken, wat vaker bij vrouwtjes
voorkwam dan bij mannetjes vanwege de delicatere structuur van de vrouwelijke genitaliën.
Dit kwam voor bij drie vrouwelijke specimen van twee genera: Euproctis sp. (Erebidae,
Lymantriinae), en Maurilia sp. (Nolidae, Chloerophorinae); en bij drie mannelijke specimen
van Nola Socotrensis (Nolidae, Nolinae). Deze laatste kon enkel geïdentificeerd worden
dankzij de combinatie van geografische verspreiding van de soort, morfologie en barcoding.
24
Tabel 2: specimen waarbij de soort niet bepaald kan worden met enkel de externe morfologie.
Familie Subfamilie Externe morfologische determinatieInterne morfologische determinatie
Aantal
Erebidae Arctiinae Amerila leucophylla/A. phaedra/A. orientis Amerila orientis 3Erebidae Boletobiinae Eublemma biparva/E. miniparva Eublemma miniparva 1Erebidae Boletobiinae Eublemma exigua/E. parva Eublemma exigua 4Erebidae Boletobiinae Mimasura albiceris/M. impunctata/M. innotata / 1Erebidae Calpinae Antiophlebia bourgognei/A. bracteata/A. griveaudi / 1Erebidae Calpinae Melanephia brunneiventris/M. nigrescens/M. trista / 1Erebidae Erebinae Audea sp. / 1Erebidae Erebinae Ericeia congregata/E. inangulata Ericeia congregata 2Erebidae Erebinae Hypotacha isthmigera/H. raffaldi / 1Erebidae Erebinae Trigonodes exportata/T. hyppasia Trigonodes exportata 1Erebidae Hypeninae Hypena masurialis/H. obacerralis / 1Noctuidae Amphipyrinae Condica sp. Condica capensis 2Noctuidae Amphipyrinae Condica sp. Condica pauperata 1Noctuidae Amphipyrinae Spodoptera littoralis/S. litura Spodoptera littoralis 2
NolidaeChloephorinae Neaxestis mesogonia /N. rhoda Neaxestis mesogonia 1
Nolidae Eariadinae Earias biplaga/E. insulana Earias biplaga 1Nolidae Eariadinae Earias insulana/E. biplaga Earias insulana 4Nolidae Nolinae Meganola bispermutata/M. monofascia/M. praefica/M. subpraefica Meganola monofascia 1Nolidae Nolinae Nola afrotaeniata/N. taeniata Nola afrotaeniata 1Nolidae Nolinae Nola harouni/N. musculalis/M. socotrensis Nola socotrensis 3Nolidae Nolinae Nola poliophasma/N. triangulalis Nola poliophasma 5
25
Figuur 8: Links Spodoptera Littoralis en rechts Spodoptera litura. Twee soorten die vrijwel niet te onderscheiden zijn van elkaar gebaseerd op de uiterlijke kenmerken.
26
3.2 Genetische analyse:
3.2.1 Sequentiebepaling:Van 205 specimen kon de sequentie van het barcoding gedeelte van COI succesvol bepaald
worden. Dit komt overeen met een 98,01% succes rate. Bij 1 exemplaar konden 2
stikstofbasen niet bepaald worden, maar dit had geen grote invloed op de gevonden match in
de databanken gezien het specimen nog steeds correct geplaatst werd (33A5 AB42846620
Acontia transfigurata; 0,46% sequentiedivergentie in BOLD; geen match in GenBank).
Er trad ook een contaminatie op bij een van de specimen (34C4 AB42846576 Eublemma
apicata). Deze werd gecontamineerd door een exemplaar behorende tot Phytometra
subflavalis (figuur 9-10).
Figuur 9: De plaatsing van het gecontamineerde sample in de fylogenetische boom. Het gecontamineerde
sample is met de rode stip aangeduid.
Figuur 10: Het duidelijke verschil tussen het specimen met de contaminatie (links) en de soort waarmee het
sample gecontamineerd werd (rechts).
27
3.2.2 Correcte match in BOLD:
Met BOLD werden 74 specimen correct gedetermineerd aan de hand van COI. Deze
specimen waren verspreid over 36 soorten (tabel 3). Een specimen werd als correct
gedetermineerd beschouwd als het de soort weergegeven door BOLD met de laagste
sequentiedivergentie overeenkwam met de soort bekomen door de inwendige morfologie.
Tabel 3: correct geïdentificeerde soorten door BOLD met de sequentiedivergenties per soort. De specimen waar de sequentiedivergentie groter is dan 1% staan in het vet gedrukt.
Familie Subfamilie Gevonden soort % SequentiedivergentieAantal
Erebidae Anobinae Anoba atriplaga 0,15 1Erebidae Arctiinae Amerila bubo 0-0,15 2Erebidae Arctiinae Apisa canescens 2,75 1Erebidae Arctiinae Argina amanda 0 1Erebidae Arctiinae Argina astrea 0,15 1Erebidae Arctiinae Creatonotos leucanioides 1,25 1Erebidae Boletobiinae Acontia imitatrix 0 1Erebidae Boletobiinae Acontia transfigurata 0,46 1Erebidae Boletobiinae Eublemma anachoresis 0 1Erebidae Boletobiinae Eublemma apicata 0,46-0,61 14Erebidae Boletobiinae Eublemma baccalix 0-0,61 7Erebidae Boletobiinae Eublemma exigua 0,16-0,32 4Erebidae Boletobiinae Eublemma seminivea 0-0,17 2Erebidae Boletobiinae Phytometra subflavalis 0 5Erebidae Calpinae Gesonia obeditalis 3,67-3,82 2Erebidae Calpinae Lacera alope 1,38 1Erebidae Erebinae Chalciope delta 0,31 1Erebidae Erebinae Cyligramma fluctuosa 0 1Erebidae Erebinae Egybolis vaillantina 0,31 1Erebidae Erebinae Hypopyra capensis 0 1Erebidae Erebinae Rhynchina revolutalis 0,31 1Erebidae Hermiininae Nodaria nodosalis 1,07 2Erebidae Hypeninae Hypena laceratalis 0 1Erebidae Hypeninae Hypena varialis 0,32 1Erebidae Hypenodinae Luceria oculalis 2,91-3,69 2Eutelliidae Eutelliinae Marathyssa cuneata 0-0,15 2Noctuidae Amphipyrinae Callopistria maillardi 0 1Noctuidae Amphipyrinae Condica capensis 0 2Noctuidae Amphipyrinae Spodoptera cilium 0 3Noctuidae Amphipyrinae Spodoptera littoralis 0 2Noctuidae Heliothinae Adisura callima 0,77 1Nolidae Bleninae Garella nilotica 0 3Nolidae Chloephorinae Gyrtothripa pusilla 4,44 1Nolidae Chloephorinae Maurilia arcuata 3,36 1Nolidae Eariadinae Earias insulana 0-0,15 4Nolidae Nolinae Nola afrotaeniata 0,15 1
28
In deze tabel zien we duidelijk dat er meerdere gevallen zijn waar de sequentiedivergentie
groter is dan 1% (in het vet aangeduid in de tabel). De grootste divergentie vinden we bij
Gyrtothripa pusilla. Deze soort heeft normaal een verspreiding die beperkt is tot het Indo-
Australische gebied. Moore vermeld bij de beschrijving van de soort dat er een Afrikaanse
zustersoort is die nagenoeg identiek is (Holloway 2003). De sequenties op BOLD van
Gyrtothripa pusilla zijn allemaal afkomstig uit de Indo-Australische regio, wat de grote
divergentie kan verklaren. Een vergelijkbaar geval zien we bij Oraesia emarginata. De
analyse op BOLD gaf als beste match O. provocans met 2,6% sequentiedissimilariteit. O.
provocans is echter een zustersoort van O. emarginata die gemakkelijk met morfologische
kenmerken van O. emarginata onderscheiden kan worden. De hoogste match van O.
emarginata zelf bedroeg 3,36% sequentiedissimilariteit. O. emarginata is echter recent in 2
subsoorten opgedeeld waarbij 1 subsoort een Oost-Afrikaanse verspreiding heeft en de andere
een Aziatisch-Australische verspreiding. Vergelijkbaar met G. pusilla zijn alle sequenties op
BOLD afkomstig van Australische O. emarginata wat het verschil in sequenties kan
verklaren.
De overige hoge sequentiedivergenties zouden kunnen wijzen op de aanwezigheid van
cryptische soortcomplexen. Soorten die goede kandidaten zijn voor cryptische soorten zijn
Gesonia obeditalis en Maurilia arcuata. Deze soorten vertonen veel variatie in de externe
morfologie en hebben een redelijk hoge sequentiedivergentie (3,67-3,82% voor G. obeditalis
en 3,36% voor M. arcuata). Vooral de vrouwelijke specimen van deze genera vertonen
weinig tot geen determinerende kenmerken in de genitalia, waardoor ze moeilijk te
onderscheiden zijn.
Een aantal soorten die morfologisch moeilijker geïdentificeerd konden worden vertonen wel
een zeer specifieke match in COI barcoding, waardoor ze met grotere zekerheid
gedetermineerd konden worden (Eublemma exigua, Condica capensis, Spodoptera littoralis,
Earas insulana en Nola afrotaeniata).
3.2.3 Geen correcte match BOLD:31 Specimen verspreid over 19 soorten konden niet eenduidig met BOLD gedetermineerd
worden. Dit was te wijten aan een van de volgende oorzaken:
BOLD gaf mogelijk een verkeerde soort als match.
Er waren meerdere soorten met een match met minder dan 1% sequentiedivergentie
(figuur 11).
29
Het specimen in kwestie kon door gebrek aan referentiemateriaal morfologisch niet tot
op soort gebracht worden vanwege de sterke externe morfologische gelijkenis tussen
meerdere soorten uit het genus. BOLD bezat slechts informatie over één van de
soorten uit het genus waardoor het onmogelijk was om de andere soorten uit te sluiten.
Er stond een foutieve of onbestaande benaming op BOLD.
Verder bevatte BOLD nog veel synoniemen en verouderde benamingen wat de identificatie
kon bemoeilijken.
Een voorbeeld waarbij er verschillende soorten worden gegeven binnen de 1%
sequentiedivergentie vinden we bij Trigonodes exportata. Deze soort is met de externe
morfologie niet te onderscheiden van Trigonodes hyppasia (figuur 11), maar wel met de
genitaalpreparaten. Beide soorten leven geografisch gescheiden van elkaar daar T. exportata
enkel in de afrotropen voorkomt en T. hyppasia een voornamelijk Aziatisch-Australische
verspreiding heeft. De match van beide soorten binnen de 1% sequentiedivergentie suggereert
dat deze soorten niet onderscheiden kunnen worden met barcoding. Wanneer de neighbour
joining tree, door BOLD geconstrueerd, wordt gecheckt (figuur 12) zien we dat er drie
sequenties behorend tot T. exportata en 59 sequenties behorend to T. hyppasia in de
bibliotheek van BOLD aanwezig zijn, en dat slechts drie specimen van T. hyppasia bij T.
exportata worden geplaatst. Het verschil tussen de sequenties van T. exportata en de rest van
de sequenties van T. hyppasia is wel groter dan 1% (3,03%-3,33). Van deze 3 specimen werd
ook de vangstplaats opgezocht en deze bleken uit Tanzania, Oman en de Kaapverdische
Eilanden te komen. Er is dus een reële kans dat deze drie sequenties toebehoren aan T.
exportata en dus door de persoon die de sequenties ingebracht heeft verkeerd geïdentificeerd
waren. Dezelfde situatie doet zich voor bij Earias biplaga waarbij waarschijnlijk een
specimen behorend tot E. insulana foutief gedetermineerd werd.
Een ander voorbeeld van foutieve benamingen vinden we bij Nolidia pumilalis, welke door
BOLD als Nola tanzania weergegeven word. Nola tanzania is een onbestaande soort, en er
bleken vijf morfologisch zeer verschillende specimen onder deze naam in de databank
opgeslagen. Wanneer de neighbour joining tree geraadpleegd werd bleek slechts 1 sequentie
van deze specimen bij de opgezochte sequentie gegroepeerd. Door de BIN pagina van dit
specimen te raadplegen kon de identificatiecode van de vlinder achterhaald worden waarna dit
specimen in de Zoologische Staatssammlung München gedetermineerd kon worden als
Nolidia pumilalis.
30
Tabel 4: Onbevestigde en incorrecte matches op BOLD. De foutieve of onbestaande benamingen zijn aangeduid met een *
Families SubfamilieMorfologische identificatie BOLD
% sequentiedivergentie Aantal
Erebidae Arctiinae Amerila vitrea Amerila vitrea/A. bauri 0-0,31 3Erebidae Calpinae Melanephia sp. Melanephia trista 0,15 1Erebidae Calpinae Antiophlebia sp. Antiophlebia bracteata 0,31 1Erebidae Erebinae Audea sp. Audea nigrior 0 1Erebidae Erebinae Hypotacha sp. Hypotacha raffaldi 0,46 1Erebidae Erebinae Ericeia congregata Ericeia inangulata 0 2Erebidae Erebinae Tachosa asperum Tachosa aspera* 0 2Erebidae Erebinae Achaea oedipodina Achaea catella 0,61 1Erebidae Erebinae Trigonodes exportata Trigonodes exportata/T. hyppasia 0 1Erebidae Hermiininae Pogonia sp. Pogonia umbrifera 0,92 2Erebidae Hypeninae Hypena sp. Hypena masurialis 0 1Erebidae Scoliopteryginae Anomis sp. Anomis lyona 0,98 1Noctuidae Heliothinae Adisura bella Adisura bella/A. parva 0,46 1Nolidae Bleninae Bryophilopsis sp. Bryophilopsis curvifera 0,32-0,64 2Nolidae Eariadinae Earias biplaga Earias biplaga/E. insulana 0 1Nolidae Nolinae Nola poliophasma Nola poliophasma/N. adelpha 0-0,31 4Nolidae Nolinae Nola socotrensis Nola vansoni*/N. musculalis 0-0,31 3Nolidae Nolinae Nolidia pumilalis Nola tanzania* 0,31 2Nolidae Nolinae Meganola monofascia Nola bispermutata* 0 1
Figuur 11: Trigonodes exportata (links) en Trigonodes hyppasia (rechts) met de respectievelijke genitaalpreparaten.
31
Figuur 12: neighbour joining tree geconstrueerd via BOLD. De opgezochte sequentie is in het rood
weergegeven. Een deel van de T. hyppasia op de boom werd weggelaten om de grootte te beperken (stippellijn).
3.2.4 Determinatie met GenBank:
Via GenBank konden 16 specimen verspreid over 10 soorten correct gedetermineerd worden
(tabel 5). Ook hier werd een match als correct beschouwd wanneer de weergegeven soort met
de laagste sequentiedivergentie overeenkwam met de soort gevonden via de inwendige
morfologie.
Tabel 5: correct geïdentificeerde soorten door GenBank met de sequentiedivergentie en aantal
specimen per soort weergegeven.
FamilieSubfamilie Gevonden soort
% sequentiedivergentie
Aantal
Erebidae Arctiinae Creatonotos leucanioides 1 1Erebidae Boletobiinae Eublemma anachoresis 1 1Erebidae Calpinae Oraesia emarginata 5 1Erebidae Erebinae Hypopyra capensis 6 1Erebidae Hypeninae Hypena laceratalis 1Noctuidae
Amphipyrinae Condica capensis 0 2
Noctuidae
Amphipyrinae Spodoptera cilium 0-1 3
Noctuidae
Amphipyrinae Spodoptera littoralis 0 2
Noctuidae Heliothinae Adisura bella 1 1Nolidae Bleninae Garella nilotica 2 3
32
In GenBank zijn de sequentiedivergenties gemiddeld hoger dan in BOLD, maar er werden
geen verkeerde identificaties gevonden. Vergelijkbaar als in BOLD zien we bij Oraesia
emarginata een relatief hoge sequentiedivergentie. De grote sequentiedivergentie van
Hypopyra capensis is echter zeer verschillend met BOLD. Dit kan een indicatie zijn dat
Hypopyra capensis in feite een cryptische soort is.
3.2.6 Fylogenetische analyse:
De geconstrueerde neighbour joining tree is zeer goed bruikbaar om soorten op te sporen die
een grote variatie hebben in de externe morfologie en voor soorten die sexueel dimorfisme
vertonen. Het is ook bruikbaar om mogelijke synoniemen en misidentificaties op te sporen en
te kijken waar barcoding mogelijk niet werkt. Een voorbeeld hiervan vinden we bij Amerila
phaedra en A. orientis. In de fylogenetische boom zien we dat deze twee soorten bij elkaar
worden gezet en dat ze weinig tot niet verschillen in hun COI barcode (figuur 13).
Figuur 13: de fylogenetische tak waar Amerila phaedra en A. orientis bij elkaar worden gezet. De getallen bij de
knopen duiden de betrouwbaarheid van de plaatsing aan.
Uit de gebruikte publicaties voor de identificaties weten we dat A. orientis wordt gezien als
een synoniem van A. phaedra. De beschrijving van de genitaliën voor de vrouwtjes van A.
phaedra strookt echter niet met de gemaakte preparaten. De beschrijving spreekt van een grote
bursa copulatrix en een corpus bursae met een brede appendix. In de gemaakte preparaten
wordt echter een grote bursa copulatrix waargenomen met verscheidene rijen spinose signa,
een ventrale gesclerotiseerde driehoek en grote spinose driehoek. De corpus bursae heeft ook
een redelijk grote appendix (figuur 14). In het Brits Natuurhistorisch Museum kon de
33
identiteit van A. orientis bevestigd worden door de gemaakte preparaten te vergelijken met de
holotypes van A. orientis. Dit zou erop wijzen dat A. phaedra en A. orientis niet kunnen
onderscheiden worden door COI barcoding en dat A. orientis een volwaardige soort is.
Figuur 14: Genitaalpreparaten van de twee gevangen Amerila orientis.
3.3 Samenvatting van de resultaten:
3.3.1 Identificatie met externe morfologie:
Per familie zien we dat de Erebidae het hoogste percentage halen voor de externe
morfologische identificatie gezien er 68 van de 78 specimen en 35 van de 40 soorten hiermee
gedetermineerd kunnen worden. Dit stelt 87,18% van de specimen en 87,5% van de soorten
van de gedetermineerde Erebidae voor. De Nolidae hebben de laagste percentages met
54,17% van de specimen en 58,33% van de soorten determineerbaar gebruikmakend van
enkel de externe morfologie. Van de Euteliidae werden er slechts 2 specimen gevangen die tot
1 soort behoren, welke gemakkelijk morfologisch herkenbaar is. Er werden 4 vlinders van de
Notodontidae gevangen, maar slechts 1 hiervan kon succesvol gedetermineerd worden en ook
deze soort was morfologisch eenvoudig herkenbaar. Deze resultaten zijn samengevat in Tabel
6.
34
Tabel 6: Aantal gevangen en gedetermineerde specimen en soorten in totaal en voor de verschillende families
Aantal
specime
n
Aantal
gedetermineerd
e specimen
Aantal
gedetermineerd
e soorten
Specimen
morfologisch
(extern)
determineerbaa
r
Soorten
morfologisch
(extern)
determineerbaa
r
Totaal: 209 126 65 95 52
Erebidae 137 78 40 68 35
Euteliidae 2 2 1 2 1
Noctuidae 27 21 11 16 8
Nolidae 33 24 12 13 7
Notodontida
e
4 1 1 1 1
3.3.2 Genetische analyse:
BOLD (soortniveau):
Er werden 44 hits gevonden waarbij de sequentiedivergentie minder was dan 1%. We zien
echter dat slechts 28 van deze hits een correcte determinatie is wanneer deze vergeleken
worden met de interne morfologische determinatie. Dit komt overeen met 63,63% van de hits.
Dit is te wijten aan een aantal gevallen waar er meerdere soorten waren die binnen de 1%
sequentiedivergentie vielen en BOLD dus geen definitieve determinatie kon bieden of waar
de gevonden soort niet de correcte was. Er werden echter 36 juiste soortmatches gevonden
met BOLD. Hiervan valt dus 77,78% binnen de 1% sequentiedivergentie. Indien we de
grenswaarde van 1% divergentie optrekken naar 3% valt 88,89% van de juiste soortmatches
hierbinnen. BOLD was dus in staat om 43,08% van het totale aantal geïdentificeerde soorten
te bevestigen met een match waar de sequentiedivergentie kleiner is dan 1%. Binnen de
families is het opvallend dat vooral binnen de Nolidae er weinig soorten met BOLD met
zekerheid gedetermineerd konden worden (slechts 25% van het aantal gedetermineerde
soorten en 15,79% van het totale aantal soorten Nolidae), en dat geen enkele van de
Notodontidae soorten een match gaf.
35
GenBank (soortniveau):
In GenBank werden slechts zes hits gevonden waarbij de sequentiedivergentie kleiner was
dan 1%. Alle zes gevonden soorten waren ook de correcte determinatie wanneer vergeleken
met de determinatie van de interne morfologie. In totaal werden er 10 correcte soortmatches
gevonden in GenBank. 60% hiervan valt dus binnen de 1% sequentiedivergentie en 80%
binnen 3% sequentiedivergentie. In totaal kon GenBank slechts 10,71% van de
gedetermineerde soorten identificeren. Het is opvallend dat alle hits met minder dan 1%
divergentie in GenBank zich voordoen in de Erebidae en de Noctuidae.
De resultaten van zowel BOLD als GenBank op soortniveau zijn weergegeven in tabel 7.
BOLD (genusniveau):
Er werden 54 hits gevonden waar de sequentiedivergentie kleiner is dan 3%. 51 van deze hits
corresponderen met een correct gedetermineerd genus. Dit stelt 94,44% van de gevonden
matches voor. Er werden in totaal wel 83 correcte hits gevonden op BOLD. Hiervan valt dus
61,45% binnen de grenswaarde van 3% sequentiedivergentie. Indien deze grenswaarde
opgetrokken werd tot 5% sequentiedissimilariteit vinden we 60 genera die correct gevonden
worden, wat overeenkomt met 72,29% van het aantal correct geïdentificeerde genera door
BOLD. Opnieuw zien we binnen de families dat de Notodontidae door BOLD niet gevonden
worden en dat de Nolidae een laag aantal correcte identificaties heeft door BOLD.
GenBank (genusniveau):
Met GenBank werden er slechts 11 hits gevonden met een sequentiedivergentie kleiner dan
3%. Zes van deze hits corresponderen met een correct geïdentificeerd genus. In totaal werden
er wel 41 correcte matches gevonden op GenBank, waarvan 14,63% binnen de grenswaarde
van 3% sequentiedivergentie valt. Binnen de grenswaarde van 5% sequentiedissimilariteit
konden 10 correcte hits gevonden worden, wat overeenstemt met 24,39%. Opvallend is de
zeer lage aantallen van genera binnen de Erebidae die onder de 3% en 5%
sequentiedivergentie vallen, terwijl er toch 36 genera correct gevonden werden. Ook
opvallend is dat er op genusniveau 7 genera van de Nolidae wel correct geplaatst konden
worden met GenBank, maar met een hogere sequentiedivergentie dan de 3% en 5%
grenswaarden. De genera binnen de Euteliidae en de Notodontidae konden dan weer opnieuw
niet correct geïdentificeerd worden.
De resultaten van BOLD en GenBank voor de identificatie op genusniveau zijn weergegeven
in tabel 8.
36
37
Tabel 7: resultaat van de genetische analyse van BOLD en GenBank op soortniveau.
Soorten met match sequentiedivergentie < 1%
Soorten met match sequentiedivergentie < 3%
Aantal juiste soort matches
Aantal hits met sequentiedivergentie < 1%
Aantal gedetermineerde soorten
BOLDTotaal: 28 32 36 44 65Erebidae 19 23 25 27 40Euteliidae 1 1 1 1 1Noctuidae 5 5 5 7 11Nolidae 3 3 5 9 12Notodontidae 0 0 0 0 1GenBankTotaal: 6 8 10 6 65Erebidae 2 3 5 2 40Euteliidae 0 0 0 0 1Noctuidae 4 4 4 4 11Nolidae 0 1 1 0 12Notodontidae 0 0 0 0 1
38
Tabel 8: resultaat van de genetische analyse van BOLD en GenBank op genusniveau.
Genus met match sequentiedivergentie < 3%
Genus met match sequentiedivergentie < 5%
Aantal juiste genus matches
Aantal hitst met sequentiedivergentie < 3%
Aantal gedetermineerde soorten
BOLDTotaal: 51 60 83 54 65Erebidae 40 44 60 35 40Euteliidae 1 1 1 1 1Noctuidae 5 6 9 7 11Nolidae 5 9 13 10 12Notodontidae 0 0 0 0 1GenBankTotaal: 6 10 41 11 65Erebidae 2 6 26 5 40Euteliidae 0 0 0 0 1Noctuidae 4 4 8 5 11Nolidae 0 0 7 1 12Notodontidae 0 0 0 0 1
39
4. Discussie en conclusies:
4.1 Morfologische identificatie:
Uit de resultaten blijkt dat ongeveer driekwart van de vlinders tot op soortniveau
gedetermineerd kan worden met enkel de externe morfologische kenmerken. Deze vlinders
hadden vaak een opvallende tekening of structuur die toeliet om ze te identificeren. De
externe morfologische kenmerken zijn betrouwbaar om de subfamilie en het genus te bepalen,
maar binnen een enkel genus komen er te vaak identiek uitziende soorten voor om enkel met
externe morfologie identificaties op soortniveau succesvol toe te passen.
De meeste vlinders kunnen met behulp van genitaal kenmerken gedetermineerd worden. Dit
vereist echter een zeer grondige kennis van de kenmerken die gebruikt worden bij de
determinaties. Het is hierbij noodzakelijk dat voor de determinaties steeds het typespecimen
van de soort worden gebruikt om incorrecte determinaties te vermijden (Winston 1999). Het
is tevens ook een zeer tijdrovende taak aangezien er collecties en vakliteratuur geraadpleegd
moeten worden die meestal niet gecentraliseerd zijn. Door de onafhankelijkheid van deze
verschillende onderzoekscentra ontstaan vaak synoniemen door het apart beschrijven van
dezelfde soort (Martin Honey, mondelinge communicatie, Hacker et al. 2010). Bij seksueel
dimorfe soorten worden de mannetjes en vrouwtjes vaak apart beschreven en/of bij een
verkeerde soort geplaatst doordat de link tussen de individuen niet gelegd kan worden tot er
kweekexperimenten uitgevoerd worden (Häuser & Boppré, 1997).
4.2 Genetische analyse:
4.2.1 COI barcoding accuraatheid
Een van de grote kritieken die tegenover COI barcoding wordt gesteld is de accuraatheid
waarmee soorten geïdentificeerd kunnen worden. De meeste studies op Lepidoptera waar
gebruik werd gemaakt van COI barcoding rapporteren dat minder dan 5% van de onderzochte
soorten niet van elkaar onderscheiden kunnen worden op soortniveau (Hebert et al. 2003,
Janzen et al. 2005, Ball et al. 2006, Hajibabaei et al 2006, Burns et al 2008, Nagy et al. 2010,
Nagoshi et al. 2010, Joomun et al. 2012, Sutrisno 2012). Dit is in sterk contrast met de
gevonden resultaten van deze studie. Slechts 63,63% van de gevonden hits in BOLD met een
sequentiediversiteit van minder dan 1% werden aan de correcte soort toegewezen wanneer
gecontroleerd werd met morfologische identificatie. In GenBank werden weliswaar minder
40
sequenties met een sequentiedivergentie van minder dan 1% gevonden, maar elk van deze hits
was wel correct. Hier moet bij opgemerkt worden dat deze soorten allemaal zogenaamde
“pestsoorten” zijn waar dus relatief meer onderzoek naar wordt gedaan wegens de
economische belangen (Shelley & Armstrong 2006, Nagoshi et al. 2010, Joomun et al. 2012).
Er zijn ook een aantal gevallen gevonden waar de soort morfologisch gedetermineerd werd en
wel teruggevonden werd met de genetische databank, maar met hogere sequentiediversiteit
dan verwacht (groter dan 1%). Hiervoor wordt de onder andere geografische scheiding als een
mogelijke verklaring gegeven. Bergsten et al. (2012) onderzochten de effecten van
geografische schaal op COI barcoding bij Europese waterkevers en vond een significant
verband tussen de afstand en isolatie en de variatie binnen het COI gen. Dittrich et al. (2006)
kwamen tot dezelfde conclusie bij Diptera. Lukhtanov et al (2009) vonden in hun studie dan
weer dat de toename van geografische schaal geen invloed had op het identificatiesucces van
Centraal-Aziatische vlinders. Er is duidelijk nog meer onderzoek nodig naar deze mogelijke
interactie.
4.2.2 Plaatsen van onbekende soorten met COI barcoding
Volgens mijn resultaten zijn zowel BOLD als GenBank niet in staat meer dan de helft van de
gedetermineerde soorten correct te identificeren tot op soortniveau gezien slechts 43,08% van
het totale aantal gedetermineerde soorten teruggevonden werd op BOLD en slechts 10,71%
op GenBank. Doordat in de groep ingevoerde specimen soorten aanwezig waren die nog niet
in de genetische databanken opgenomen waren, is er dus in feite getest of COI bruikbaar is
om onbekende soorten correct bij de meest verwante groep te plaatsen. Dit is één van de
andere grote kritieken waarmee COI barcoding geconfronteerd wordt (Meyer & Paulay 2005,
Wheeler 2005, Hickerson et al. 2006). Wilson et al. (2011) testten de mogelijkheid van COI
barcoding om onbekende sequenties in de correcte groep te plaatsen bij de familie van de
Sphingidae op het niveau van genus, tribus en subfamilie. De Sphingidae is één van de
weinige families waarvan het merendeel van de soorten reeds beschreven en gesequeneerd is.
Zij vertrokken van de volledige sequentiedatabank van de Sphingidae en simuleerden
vervolgens sequentiebibliotheken die 10-100% compleet waren. Als testgroep gebruikten
Wilson et al. een groep van 118 soorten die vertegenwoordigers hebben in elke tribus en
subfamilie. Hun conclusie was dat, indien er sequenties van het juiste genus aanwezig waren
in de databank, de opgezochte sequentie steeds bij het juiste genus werd geplaatst. Indien er
geen sequenties van het juiste genus aanwezig waren in de databank, dan werd de opgezochte
41
sequentie nog steeds in de juiste tribus of familie geplaatst. Deze resultaten zijn deels
teruggevonden in deze studie. Indien de juiste soort niet aanwezig is in de databank maar wel
andere soorten uit hetzelfde genus, werd vaak wel een correcte match op genusniveau
gevonden. Vertrekkende van deze genusmatch kan een meer gerichte zoektocht ondernomen
worden in de collecties en publicaties voor een morfologische determinatie.
4.2.3 Gebruik van fylogenetische bomen en afstanden:
Fylogenetische bomen en afstanden worden vaak gebruikt om interspecifieke relaties te testen
(Velzen et al. 2012). Doordat COI een snelmuterend gen is komt er ook variatie voor binnen
soorten (Roe & Sperling 2007). Een manier om deze variatie te incorporeren in de analyse is
via fylogenetische afstanden. Een van de meest gebruikte modellen voor de fylogenetische
afstanden tussen soorten te testen is het Kimura 2-parameter model (Kimura 1980). Dit model
berekent de fylogenetische afstand tussen sequenties, rekening houdend met het feit dat de
kans dat een pyrimidine naar een purine muteert niet gelijk is aan de snelheid waarmee een
pyrimidine in een ander pyrimidine muteert. Dit model wordt vaak geïncorporeerd in een
neighbour joining tree en uitgevoerd met een bootstrap van 1000. Op deze manier kan worden
weergegeven hoe consistent specimen bij elkaar worden gezet op de fylogenetische boom.
Hierdoor kan bepaald worden of 2 specimen tot dezelfde soortgroep worden behoren. In onze
resultaten kon de fylogenetische boom gebruikt worden om een aantal sexueel dimorfe
vlinders van het tegengestelde geslacht te groeperen, wat de determinatie verder hielp gezien
er een specifiekere groep onderzocht kon worden.
4.3 Correctheid van de genetische databanken
In de analyse werd ook duidelijk dat de databanken regelmatig verouderde of mogelijk zelfs
foute data hebben. Mede dankzij deze data is het percentage van succesvolle identificaties met
de databanken lager dan in de meeste andere studies waar de auteurs zelf een
referentiedatabank construeren en deze vervolgens testen met specimen uit verschillende
soorten. Een voorbeeld van een studie waar de foute identificatie een grote invloed had op de
resultaten is bij de studie van Ramsuran (2004) en Nilsson et al (2006). Ramsuran vond dat
een exemplaar van de Katoenbollen Korenworm (Anthonomus grandis) op GenBank een 30%
verschil in COI barcode sequentie heeft ten opzichte van andere Korenwormen (accession
number AY266628, Scataglini et al. 2006.) maar dat dit specimen wel een 100% match heeft
met twee sprinkhanensequenties (Dichroplus elongatus AY014345 and AF260551). Toch
wordt dit niet aangepast door GenBank tenzij de originele auteur deze corrigeert. Dit
42
voorbeeld en de gevonden resultaten van deze studie illustreren de noodzaak voor een
striktere controle op de gegevensdatabanken op BOLD en GenBank.
4.4 Conclusies:
Zowel morfologische als genetische identificatiemethoden waren op zichzelf niet altijd
afdoende voor een zekere identificatie op soortniveau. De morfologische methoden zijn zeer
arbeidsintensief en vereisen een hoge graad van specialisatie. Toch kunnen deze methoden
niet altijd effectief toegepast worden door beschadiging van specimen of door cryptische
soorten. De ontwikkeling van moleculaire identificatietechnieken zoals COI barcoding
kunnen hier een uitkomst bieden.
Gezien de immense diversiteit van de Noctuoidea en de variabiliteit van evolutionaire
snelheden tussen genen en taxa (Roe & Sperling, 2007) is het zeer onwaarschijnlijk dat een
simpel systeem gebaseerd op een enkel gen in staat is om universeel soorten te identificeren.
Het is daarom opmerkelijk dat COI tot nu toe zo bruikbaar is gebleken, volgens veel
publicaties, voor de identificatie van Noctuoidea, en per extensie, Lepidoptera (Hebert et al.
2003, Janzen et al. 2005, Ball et al. 2006, Hajibabaei et al 2006, Burns et al 2008, Nagy et al.
2010, Nagoshi et al. 2010, Joomun et al. 2012, Sutrisno 2012). Hoewel deze resultaten niet
teruggevonden werden in deze studie, doet dit niet af aan het potentieel van COI barcoding
om op zijn minst een richtlijn te vormen voor de identificatie. Deze resultaten werden wel
teruggevonden in de mogelijkheid van COI barcoding om een onbekende sequentie in het
juiste genus te plaatsen. Indien soortspecifieke identificaties mislukken, biedt COI barcoding
dus nog relatief betrouwbare informatie over de soortgroep of het genus waartoe het specimen
behoort. In deze gevallen kan de integratie van morfologische kenmerken of een ander gen
een uitkomst bieden om specimen met redelijke zekerheid te identificeren.
43
Dankwoord
Ik wil graag dr. Albert Legrain, dr. Axel Hausmann, dr. Jurate De Prins, dr. Leif Aarvik, dr.
Martin Honey, dr. Reza Zahiri en dr. Ugo Dall’Asta bedanken voor hun hulp bij de
determinatie van de specimen, het verschaffen van de nodige vakliteratuur en voor de toegang
te verschaffen tot de collecties. Ik wil ook Evelyne Elst en Danielle Willemans bedanken voor
de hulp bij het bezoeken van de buitenlandse collecties en de morele steun. Tevens wil ik
Alexander Meire en Jeffrey Jacobs bedanken voor hun hulp bij het verzamelen en opprikken
van de vlinders. Als laatste wil ik dr. Kurt Jordaens en dr. Luc De Bruyn bedanken voor de
begeleiding en het mogelijk maken van dit project.
Referenties:
Geraadpleegde websites:http://www.barcodinglife.com/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
http://www.afromoths.net/
http://www.africanmoths.com/
Geraadpleegde artikels:
Ball, S.L. & Armstrong, K.F. (2006) DNA barcodes for insect pest identification: a test case with tussock moths (Lepidoptera: Lymantriidae). Canadian Journal of Forest Research 36: 337–350
Barber, P., Boyce, S.L. (2006) Estimating diversity of Indo-Pacific coral reef stomatopods through DNA barcoding of stomatopod larvae. Proceedings of the Royal Society B-Biological Science 273:2053–2061
Blaxter, M., Mann, J., Chapman, T., Thomas, F., Whitton, C., Floyd, R., Abebe, E. (2005) Defining operational taxonomic units using DNA barcode data. Philosophical Transaction of the Royal Society London B Biological Science 360: 1935-1943
Burgess, N., Hales, D.J., Underwood, E., Dinerstein, E., Olson, D., Itoua, I., Schipper, J., Ricketts, T. & Newman, K. (2004) Terrestrial Ecoregions of Africa and Madagascar A conservation assessment. Island Press, Washington
Burns, J.M., Janzen, D.H., Hajibabaei, M., Hallwachs, W., Hebert, P.D.N. (2008) DNA barcodes and cryptic species of skipper butterflies in the genus Perichares in Area de Conservacion Guanacaste, Costa Rica. Proceedings of the National Academy of Science USA 105: 6350-6355.
44
Brower, A.V.Z. (2006) Problems with DNA barcodes for species delimitation: ‘ten species’ of Astraptes fulgerator reassessed (Lepidoptera: Hesperiidae). Systematics and Biodiversity 4: 127–132
Brower, A.V.Z. (2010) Alleviating the taxonomic impediment of DNA barcoding and setting bad precedent: names for ten species of Astraptes fulgerator (Lepidoptera: Hesperiidae: Eudaminae) with DNA–based diagnoses. Systematics and Biodiversity 8: 485–491
Brown, J.W., Segura, R., Santiago-Jiménez, Q., Rota, J. & Heard, T.A. (2011). Tortricid moths reared from the invasive weed Mexican Palo Verde, Parkinsonia aculeata, with comments on their host specificity, biology, geographic distribution, and systematics. Journal of insect science 11: 1-17
Carlson, S.D., Smith, J.S. & Stanley, J.M. (1968) Moth visual potentials in response to middle UV-radiation. Experientia 24: 289
Davis, D.R. & De Prins, J. (2011) Systematics and biology of the new genus Macrosaccus with descriptions of two new species (Lepidoptera, Gracillariidae). ZooKeys 82: 29-82
Decaëns, T. & Rougerie, R. (2008) Descriptions of two new species of Hemileucinae (Lepidoptera: Saturniidae) from the region of Muzo in Colombia - evidence from morphology and DNA barcodes. Zootaxa 1944: 34-52
De Prins, W. (1981) Genitalia van Lepidoptera prepareren en afbeelden. Entomobrochure 1, tweede editie.
DeWaard, J.R., Hebert, P.D.N. & Humble, L.M. (2011) A Comprehensive DNA Barcode Library for the Looper Moths (Lepidoptera: Geometridae) of British Columbia, Canada. PLoS ONE 6(3): 1-6
DeWaard, J.R., Mitchell, A., Keena, M.A., Gopurenko, D., Boykin, L.M., Armstrong, K.F., Pogue, M.G., Lima, J., Floyd, R., Hanner, R.H. and Humble, L.M. (2010).Towards a global barcode library for Lymantria (Lepidoptera: Lymantriinae) tussock moths of biosecurity concern. PLoS ONE 5: 1-10
Dittrich, G., Conlong, D.E. & Mitchell, A. (2006) Genetic diversity of Sturmiopsis parasitica (Curran) (Diptera: Tachinidae). Annales de la Société entomologique de France 42, 325–329
Erwin T.L. (1982) Tropical forests: their richness in Coleoptera and other arthropod species. Coleopt Bull 36: 74-75
Fay, M.F. (2010) Marking the end of the international year of biodiversity. Botanical Journal of the Linnaeus Society 164(4):337–341
Fibiger, M. & Lafontaine, J.D., (2005) A review of the higher classification of the Noctuoidea (Lepidoptera) with special reference to the Holarctic fauna. Esperiana 11: 7–92
Floyd R., Abebe E., Papert A. & Blaxter, M. (2002) Molecular barcodes for soil nematode identification. Molecular Ecology 11, 839–850
45
Gilson, G. (1906) Un nouveau médium solifiable pour le montage des préparations microscopiques. La Cellule, 23: 425-432
Hajibabaei, M., Janzen, D.H., Burns, J.M., Hallwachs, W., Hebert, P.D.N. (2006) DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proceedings of the Natural Academy Science USA 103: 968-971.
Hammond, P. (1992) Species inventory. In Global biodiversity: status of the earth’s living resources (ed. B. Groombridge), pp. 17–39. London: Chapman & Hall.
Hawksworth, D. L. & Kalin-Arroyo, M. T. (1995) Magnitude and distribution of biodiversity. In Global biodiversity assessment, Cambridge University Press: 107–191
Hausmann, A., Haszprunar, G. & Hebert P.D.N. (2011) DNA Barcoding the Geometrid Fauna of Bavaria (Lepidoptera): Successes, Surprises, and Questions. PLoS ONE 6(2): 1
Hebb, R.G., ed. (1907) A summary of current researches relating to zoology and botany (principally invertebrate and cryptogamia). Journal of the Royal Microscopical Society: 501
Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., DeWaard J.R. (2003) Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Science 270:313–321
Hickerson M.J., Meyer C.P., Moritz C. (2006) DNA barcoding will often fail to discover new animal species over broad parameter space. Systematic Biology, 55: 729–739
Holloway, J. D. (1985) The moths of Borneo (part 14): Family Noctuidae: subfamilies Euteliinae, Stictopterinae, Plusiinae, Pantheinae. Malayan Nature Journal 38: 157–317
Holloway, J. D. (1998). The classification of the Sarrothripinae, Chloephorinae, Camptolominae and Nolinae as the Nolidae (Lepidoptera: Noctuoidea). Quadrifina 1: 247–276
Hosagoudar, S.R. & Manjunatha, H.B. (2011). Picosecond UV laser induced morphological, biochemical and biological changes in Bombyx mori. Iranian journal of radiation research 9: 127-137
Janzen, D.H., Hajibabaei, M., Burns, J.M., Hallwachs, W., Remigio, E. & Hebert, P.D.N. (2005) Wedding biodiversity inventory of a large and complex Lepidoptera fauna with DNA barcoding. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 360: 1835–1845
Jarman, S. N. & Elliott, N. G. (2000) DNA evidence for morphological and cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, ‘living fossils’ from the Triassic. J. Evol. Biol. 13: 624–633.
Joomun, N., Ganeshan, S., & Dookum-Saumtally, A. (2012) Identification of three armyworm species (Lepidopter: Noctuidae) using DNA barcodes and restrictive enzyme digestion. International Sugar Journal 114: 344-349
46
Kimura, M. (1980). A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16:111-120
Kitching, I.J. & Rawlins, J.E. (1999) Lepidoptera, moths and butterflies. 1. Evolution, systematics and biogeography. Handbook of Zoology 4(35) Berlin
Knowlton, N. 1993 Sibling species in the sea. Annual Review of Ecololgy Systematics 24: 189–216.
Kordali, S., Cakir, A., Ozer, H., Cakmakci, R., Kesdek, M. & Mete, E. (2008). Antifungal, phytotoxic and insecticidal properties of essential oil isolated from Turkish Origanum acutidens and its three components, carvacrol, thymol and p-cymene. Bioresource Technology 99(18): 8788-8795
Lafontaine, J.D. & Fibiger, M. (2006) Revised higher classification of the Noctuoidea (Lepidoptera). Canadian Entomologist 138: 610–635
Lukhtanov, V. A., Sourakov, A., Zakharov, E. V. & Hebert, P. D. N. (2009) DNA barcoding Central Asian butterflies: increasing geographical dimension does not significantly reduce the success of species identification. Molecular Ecology Resources 9(5): 1302-
May R.M. (1990) How many species? Phil Trans R Soc Lond B 330: 293-304
Meyer C.P. & Paulay G. (2005). DNA barcoding: error rates based on comprehensive sampling. PLoS Biology 3: 422
Miller, J.S. (1991) Cladistics and classification of the Notodontidae (Lepidoptera, Noctuoidea) based on larval and adult morphology. Bulletin of the American Natural History Museum 204: 1-230
Mitchell, A., Mitter, C. & Regier, J. C. (2006) Systematics and evolution of the cutworm moths (Lepidoptera: Noctuidae): evidence from two protein-coding nuclear genes. Systematic Entomology, 31, 21–46
Mitchell A. (2008) DNA barcoding demystified. Austrian Journal of Entomology 47:169–173
Nilsson, R.H., Ryberg, M., Kristiansson, E. Abarenkov, K., Larsson K.H. & kõljalg, U. (2006) Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases: a fungal perspective. PLoS ONE 1: e59.
Ramsuran, V. (2004) A test of DNA barcoding as a species diagnostic in insects. Unpublished Honours Thesis. School of Molecular and Cellular Biosciences, University of KwaZulu-Natal, South Africa
Rodney N. Nagoshi, N.R., Brambila, J. & Meagher, L.R. (2010) Use of DNA barcodes to identify invasive armyworm Spodoptera species in Florida. Journal of insect science 11: 154
47
Nagy, Z.T., Breman, F.C. & Dall’asta, U. (2010) DNA barcoding of museum specimen of Lymantriidae preserved in the Royal Museum for Central Africa. Entomologica romanica 15: 11-16
Nielsen, E.S., Edwards, E.D. & Rangsi, T.V. (1996). Checklist of the Lepidoptera ofAustralia. CSIRO, Australia.
Olson, M., Hood. L., Cantor, C. & Botstein, D. (1989) A common language for physical mapping of the human genome. Science 245(4925):1434–1435
Packer, L., Gibbs, J., Sheffield, C., Hanner, R. (2009) DNA barcoding and the mediocrity of morphology. Molecular Ecology Resources 9:42-50
Ratnasingham, S. & Hebert P.D.N. (2007). BARCODING BOLD: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes
Robinson, G.S. (1976) The preparation of slides of Lepidoptera genitalia with special reference to the Microlepidoptera. Entomologist’s gazette 27: 127-132
Roe, A.D. & Sperling, F.A.H. (2007) Patterns of evolution of mitochondrial cytochrome c oxidase I and II DNA and implications for DNA barcoding. Molecular phylogenetics and evolution 44: 325-345
Savage J.M. (1995) Systematics and the biodiversity crisis. BioScience 45: 673-679
Scataglini, M.A., Lanteri, A.A. & Confalonieri, V.A. (2006). Diversity of boll weevil populations in South America: a phylogeographic approach. Genetica 126: 353–368.
Schindel, D.E., Miller, S.E. (2005) DNA barcoding a useful tool for taxonomists. Nature, 435: 17.
Scotland, R., Hughes, C., Bailey, D. & Wortley, A. (2003) The Big Machine and the much-maligned taxonomist. Systematics and Biodiversity 1: 139–143
Segerer, A.H., Haslberger, A. & Grünewald, T. (2011) Occurrence of Olethreutes subtilana (Falkovitsh, 1959) in Central Europe uncovered by DNA barcoding (Tortricidae: Olethreutinae). Nota Lepidopterologica 33: 209-218
Smith, M.A., Fisher, B.L., Hebert, P.D.N. (2005) DNA barcoding for effective biodiversity assessment of a hyperdiverse arthropod group: the ants of Madagascar. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360:1825–1834
Smith, M.A., Woodley, N.E., Janzen, D.H., Hallwachs, W., Hebert, P.D.N. (2006) DNA barcodes reveal cryptic host specificity within the presumed polyphagous members of a genus of parasitoid flies (Diptera: Tachinidae). Proc Natl Acad Sci USA 103:3657–3662
Soković, M.D., Vukojević, J., Marin, P.D., Brkić, D.D., Vajs, V. & van Griensven, L.J. (2009) Chemical Composition of Essential Oils of Thymus and Mentha Species and Their Antifungal Activities. Molecules 14(1): 238-249
48
Stork, N.E. (1993) How many species are there? Biodivers Conserv 2: 215-232.
Sutrisno, H. (2012) Molecular Phylogeny of Indonesian Armyworm Mythimna Guenée (Lepidoptera: Noctuidae: Hadeninae) Based on COI Gene Sequences. Hayati journal of biosciences. 19: 65-72
Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., & Kumar, S. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739
Tautz, D., Arctander, P., Minelli, A., Thomas, R.H., Vogler, A.P. (2003) A plea for DNA taxonomy. Trends in Ecology & Evolution, 18: 70–74
Vaglia, T., Haxaire, J., Kitching, I. J., Meusnier, I. & Rougerie, R. (2008) Morphology and DNA barcoding reveal three cryptic species within the Xylophanes neoptolemus and loelia species-groups (Lepidoptera: Sphingidae). Zootaxa 1923: 18-36
Van Kooten, G.C., Blute, E.H., Sinclair, A.R.E. (eds) (2001) Conserving nature’s diversity. Ashgate, Hampshire
Van Langevelde, F., Ettema, J.A., Donners, M., De Vries, M.F.W. & Groenendijk, D. (2011) Effect of spectral composition of artificial light on the attraction of moths. Biological Conservation 144: 2274–2281
Velzen, R.V., Weitschek, E., Felici, G. & Bakker, F.T. (2012) DNA barcoding of recently diverged species: relative performance of matching methods. Plos One 7(1): e30490
Vogler, A.P. & Monaghan, M.T. (2007) Recent advances in DNA taxonomy. Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research 45: 1–10
Wahlberg, N. & Wheat, C.W. (2008) Genomic outposts serve the phylogenomic pioneers: designing novel nuclear markers for genomic DNA extractions of Lepidoptera. Systematic Biology 57: 231-242
Waugh, J. (2007) DNA barcoding in animal species: progress, potential and pitfalls. Bioessays 29: 188–197
Wilson, J., Rougerie, R., Schonfeld, J., Janzen, D., Hallwachs, W., Hajibabaei, M., Kitching, I., Haxaire, J. and Hebert, P. (2011) When species matches are unavailable are DNA barcodes correctly assigned to higher taxa? An assessment using sphingid moths. BMC Ecology 11: 18
Winston, J.E. (1999) Describing Species: Practical Taxonomic Procedure for Biologists. Columbia University Press, New York
Wilson, E.O. (2000) A global map of biodiversity. Science 289: 2279
Wheeler Q.D. (2005) Losing the plot: DNA ‘barcodes’ and taxonomy. Cladistics, 21: 405–407
49
Zahiri, R., Lafontaine, D., Holloway, J.D., Kitching, I.J., Schmidt, B.C., Kaila, L. & Wahlberg, N. (2012 b) Major lineages of Nolidae (Lepidoptera, Noctuoidea) elucidated by molecular phylogenetics. Cladistics 1: 1–23
Zahiri, R., Holloway, J.D., Kitching, I.J., Lafontaine, D., Mutanen, M., Wahlberg, N. (2012 a) Molecular phylogenetics of Erebidae (Lepidoptera, Noctuoidea). Systematic Entomology 37: 102–124
Zahiri, R., Kitching, I.J., Lafontaine, J.D., Mutanen, M., Kaila, L., Holloway, J.D. & Wahlberg, N. (2010) A new molecular phylogeny offers hope for a stable family-level classification of the Noctuoidea (Lepidoptera). Zoologica Scripta 40: 158–173
Zahiri, R., Lafontaine, J. D., Holloway, J. D., Kitching, I. J., Schmidt, B. C., Kaila, L. and Wahlberg, N. (2012) Major lineages of Nolidae (Lepidoptera, Noctuoidea) elucidated by molecular phylogenetics. Cladistics. doi: 10.1111/cla.12001
Publicaties gebruikt voor de identificaties:Bart, M.A. (1902) The moths of South Africa (pt. II). Annals of The South African Museum 2: 255-446
Behounek, G., Hacker, H. & Speidel, W. (2010) Revision of the genus Oraesia Guenée, 1852 (Old World) and related genera (Lepidoptera, Noctuoidea, Noctuidae, Calpinae). Esperiana memoir 5: 243-293
Bethune-Baker, G.T. (1911) Descriptions of new species of Lepidoptera from tropical Africa. Annals and Magazine of Natural History 8: 506-542
Brown, E.S. & Dewhurst, C.F. (1975) The genus Spodoptera in Africa and the Near East. Bulletin of Entomological Research 65: 221-262.
Butler, A.G. (1879) Illustrations of typical specimen of Lepidoptera Heterocera in the collection of the british museum. Annals of the British Museum 3: 1-152
De Freina, J.J. (2010) Über das Artenspektrum der Gattung Creatonotos Hübner, 1816 auf der Arabischen Halbinsel mit einer Revision der afrotropischen Creatonotos leucanioides
Holland, 1893-Artengruppe (Lepidoptera: Arctiidae, Spilosominae) Esperiana 15: 423-432
Derra G. & Schreier H.P. (1990) Beitrag zur Noctuidae - Fauna der Türkei (Lepidoptera). Esperiana 1: 393-402
Dubatolov, V.V. & Zolotuhin, V.V. (2011) Does Eilema Hübner, [1819] (Lepidoptera, Arctiidae, Lithosiinae) present one or several genera? EUROASIAN ENTOMOLOGICAL JOURNAL 10(3): 367–379 + 380 + VII
Durante, A. (2009) Revision of the Afrotropical species of Asura Walker, 1845 (Lepidoptera, Arctiidae, Lithosiinae), with the description of a new genus. Zootaxa 2280: 27-52
50
Ebert, G. & Hacker, H. (2002) Beitrag zur Fauna der Noctuidae des Iran: Verzeichnis der Bestände im Staatlichen Museum für Naturkunde Karlsruhe, taxonomische Bemerkungen und Beschreibung neuer Taxa (Noctuidae, Lepidoptera). Esperiana 9: 237-409
Fibiger, M. (1990) Noctuidae Europaeae, Volume 1: Noctuinae I. Apollo Books, Londen
Fibiger, M. (1993) Noctuidae Europaeae, Volume 2: Noctuinae II. Apollo Books, Londen
Fibiger, M. (1997) Noctuidae Europaeae, Volume 3: Noctuinae III. Apollo Books, Londen
Fibiger, M. & Hacker, H. (2002) The Eublemma HÜBNER, [1821] species of Yemen, with description of ten new species (Lepidoptera, Noctuidae, Eublemminae) (Part 1). Esperiana 9: 481-510
Fibiger, M. & Hacker, H. (2004) The Eublemma HÜBNER, [1821] species of Yemen, with description of six new species (Lepidoptera, Noctuidae, Eublemminae) (Part 2). Esperiana 10: 692-720
Fibiger, M. & Hacker, H. (2007) Noctuidae Europaeae, Volume 9: Amphipyrinae, Condicinae, Eriopinae, Xyleninae: Caradrinini. Entomological press, Londen
Fibiger, M. & Lafontaine, J.D. (2005) A review of the higher classification of the Noctuoidea (Lepidoptera) with special reference to the Holarctic fauna. Esperiana 11: 1-205
Fibiger, M., Ronkay, L., Steiner, A. & Zilli, A. (2009) Noctuidae Europaeae, Volume 11: Pantheinae - Bryophilinae Acronyctinae, Bryophilinae. Entomological press, Londen.
Fibiger, M., Ronkay, L., Yela, J.L. & Zilli, A. (2010) Noctuidae Europaeae, Volume 12: Rivulinae – Microoctuinae. Apollo books, Londen
Goater, B. (1994) The genus Earias Hübner (1825) (Lepidoptera, Noctuidae) in Britain and Europe. Entomologists record 106: 233-239
Goodger, D.E. & Watson, A. (1995) The Afrotropical Tiger-Moths. An illustrated catalogue, with generic diagnoses and species distribution, of the Afrotropical Arctiinae (Lepidoptera: Arctiidae). Apollo books, Londen
Hacker, H. (1999) Description of new Noctuoidea (Lepidoptera) species from the Arab Republic of Yemen and list of palearctic relicts of the high Asir mountain chain (2500-3700m) with notes on some Arabian taxa. Esperiana 7: 321-342
Hacker, H. (2001) Fauna of the Nolidae and Noctuidae of the Levante with descriptions and taxonomic notes (Lepidoptera, Noctuoidea) Appendix: Revision of the genus Clytie Hübner, 1823. Esperiana 8: 7-398
Hacker, H., Aulombard, F., Bischof, A., Bittermann, J., Fibiger, M. & Schreier, H.P (2001) Lepidoptera of Yemen Arab Republic, collected during three expeditions in 1996, 1998 and 2000. Esperiana 8: 597-632
51
Hacker, H. & Fibiger, M. (2001) Description of new Noctuoidea (Lepidoptera) species from the Arabian Peninsula and with other taxonomic notes. Esperiana 8: 585-596
Hacker, H. & Fibiger, M. (2006) Updated list of Micronoctuidae, Noctuidae (s.l.), and Hyblaeidae species of Yemen, collected during three expeditions in 1996, 1998 and 2000, with comments and descriptions of species. Esperiana 12: 75-166
Hacker, H., Legrain, A. & Fibiger., M. (2008) Revision of the genus Acontia (OCHSENHEIMER, 1816) and the tribus Acontiini GUENÉE, 1841 (Old World) (Lepidoptera: Noctuidae: Acontiinae). Esperiana 14: 1-545
Hacker, H. & Saldaitis, A. (2010) Noctuidae of the Socotra Archipelago (Yemen) with notes on the fauna of the southern Arabian Peninsula (Lepidoptera, Noctuoidea). Esperiana memoir 5: 172-242
Hacker, H. & Schmitz, W. (1996) Fauna und Biogeographie der Noctuidae des makaronesischen Archipels (Lepidoptera). Esperiana 4: 167-221
Hacker, H., Schreier, H.P. & Aistleitner, E. (2010) Noctuidae of Cape Verde Islands (Lepidoptera, Noctuoidea). Esperiana memoir 5: 7-96
Hacker, H., Schreier, H.P. & Goater, B. (2012) Revision of the tribe Nolini of Africa and the Western Palaearctic Region (Lepidoptera, Noctuoidea, Noctuidae, Nolinae). Esperiana 17: 1-614
Hampson, G.F. (1910) Zoological collections from northern Rhodesia and adjacent territories: Lepidoptera: Phalaenae. Proceedings of The Zoological Society of London 1910: 388-510
Hampson, G.F. (1912) Catalogue of the Noctuidae in the collection of the british museum. Annals of the british museum volume XI: 1-756
Hampson, G.F. & Bart, M.A. (1905) The moths of south Africa (volume III). Annals of the South African Museum III: 389-438
Häuser, C.L. & Boppré, M. (1997) A revision of the Afrotropical taxa of genus Amerila Walker (Lepidoptera: Arctiidae). Systematic Entomology 22: 1-44
Hausmann, A. & Hacker, H. (2010) Noctuidae collected by Karlheinz Politzar in Bogué, Mauritania (Lepidoptera, Noctuoidea). Esperiana memoir 5: 97-168
Holloway, J.D. (1989) The moths of Borneo: Family Noctuidae, trifine subfamilies: Noctuinae, Heliothinae, Hadeninae, Acronictinae, Amphipyrinae, Agaristinae. Malayan Nature Journal 42: 57-226.
Holloway, J.D. (2003) The moths of Borneo: Part 18: Nolidae. Malaysian Nature Society, Kuala Lumpur
Karisch, T. & Dall'Asta, U. (2010) ‘New species and subspecies of Cyana Walker, 1854 (Lepidoptera, Arctiidae, Lithosiinae) from the collection of the Musée royal de l’Afrique centrale ’. Journal of Afrotropical Zoology 6: 117-127.
52
Kiriakoff, S. G. (1962) Notodontidae africains nouveaux (Lepidoptera). Annalen van het Koninklijk museum voor Midden-Afrika, Tervuren.
Kühne, L., (2007) Beschreibung neuer Flechtenbärenarten aus Afrika nebst taxonomischen Anmerkungen (Arctiidae: Lithosiinae). Esperiana memoir 3: 353-394
Kühne, L. (2010) Taxonomische Ergebnisse der Bearbeitung der Nachtfalterfauna des südlichen Afrikas (Lepidoptera, Noctuoidea). Esperiana memoir 5: 433-456
László, G.M., Ronkay, G. & Witt, T.J. (2010) Contribution to the Nolinae (Lepidoptera, Noctuidae) fauna of North Thailand. Esperiana 15: 7-126
Lehmann, L., Hacker, H., Kallies, A., Kljutschko, Z. & Petersen, M. (1998) Noctuoidea (Lepidoptera) aus Zentralasien. Esperiana 6: 472-532
Malicky, H. (1992) Faunistische Meldungen von Lepidopteren aus Griechenland und Zypern Esperiana 3: 391-408
Mey, W. (1998) Contribution to the Noctuidae (Lepidoptera) fauna of Tibet and the adjacent regions (I.) (Lepidoptera). Esperiana 6: 67-184
Nagy, Z., Dall'Asta, U. & Breman, F. (2009) ‘DNA barcoding of museum specimen of Lymantriidae preserved in the Royal Museum for Central Africa’. Rokosy, L. (ed), Entomologica romanica 15: 11-16
Nupponen K. & Fibiger, M. (2006) Additions and corrections to the list of Bombyces, Sphinges and Noctuidae of the Southern Ural Mountains. Part I. (Lepidoptera: Lasiocampidae, Lemoniidae, Sphingidae, Notodontidae, Noctuidae, Pantheidae, Lymantriidae, Nolidae, Arctiidae). Esperiana 12: 176-196
Pinhey, E.C.G. (1975) Moths of southern Africa. Descriptions and colour illustrations of 1183 species. Tafelberg, Cape town
Rungs, C.H. (1955) Contribution a l’étude de Leucania auct. De Madagascar (Lepid. Phalaenidae Hadeninae). Memoires de l’institut scientific de Madagascar Serie E, Tome VI: 6-108
Tams W. H. T. & Bowden J. (1953). A Revision of the African Species of Sesamia Guenée and related Genera (Agrotidae-Lepidoptera). Bulletin of Entomological Research, 43: 645-678
Venette, R.C., Davis, E.E., Zaspel, J., Heisler, H. & Larson, M. (2003) Mini Risk Assessment Egyptian cotton leafworm, Spodoptera littoralis Boisduval [Lepidoptera: Noctuidae]. Department of Entomology, University of Minnesota.
Walsh, J.B. & Lafontaine, J.D. (2010) A review of the subfamily Anobinae with the description of a new species of Baniana Walker from North and Central America (Lepidoptera, Erebidae, Anobinae). Zookeys 39: 3-11
53
