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Seminar HPLC
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Dr. R. Vasold
Analytik - Abteilung
Institut für Organische Chemie
Prof. B. König
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Kapitel I Theoretischer Teil
I.1 EinleitungI.2 ZielsetzungI.3 Die stationäre PhaseI.4 Die mobile PhaseI.5 Die PumpeI.6 Die InjektionseinheitI.7 Der DetektorI.8 Die SoftwareI.9 Die Methode des ISTDI.10 Aufgaben (Skript)
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d Kapitel I Theoretischer Teil
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dI.1 EinleitungI Theoretischer Teil
H igh
( = Hochleistungs/Druck-Flüssig-Chromatographie)
P erformance-PressureL iquidC hromatography
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Die einzelnen Komponenten eines HPLC-Systems kennen
Wichtige chromatographische Kenngrößen bestimmen können
Die Trennleistung einer Trennungbeurteilen können
Nach diesem Praktikum soll man u.a.:
Eine quantitative Bestimmung einer Komponente mit der Methode des Internen Standards durchführen können
I Theoretischer TeilI.2 Zielsetzung
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dI.2.1 Komponenten eines HPLC SystemsI Theoretischer Teil
Abb. 1: Komponenten eines HPLC-Systems (komplett)
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dI.2.1 Der HPLC-Arbeitsplatz
Abb. 2: Moderner HPLC-Arbeitsplatz
I Theoretischer Teil
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dI.3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer Teil
Abb. 3: Komponenten eines HPLC-Systems (Säule)
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dI.3 Die Stationäre Phase
Abb. 4: Darstellung einer HPLC-Säulegefüllt mit stationärer Phase
Stationäre Phase
End-Kartusche
I Theoretischer Teil
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Abb. 5: Darstellung des Säulenmaterials(Einzelpartikel)
Partikel (sphärisch)
3µm -10µm
I.3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer Teil
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I Theoretischer TeilI.3.1 Chromatographiearten (Auswahl)
untersch. Löslichkeit Verteilungs-Chromatographieflüssig / flüssig
untersch. Adsorptions-verhalten
Adsorptions-Chromatographieflüssig / fest
NP / RP-HPLC
untersch. elektrostatischeWW
Ionenaustausch-Chromatographie
unterschdl. Größe od.Gestalt
Gel-ChromatographieSEC, GPC
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dI.3.2 Polarität der Stationäre PhaseI Theoretischer Teil
Normal-Phase-Chomatographie: NP
Stationäre Phase polar
Mobile Phase unpolar
Reversed-Phase-Chomatographie: RP
Stationäre Phase unpolar
Mobile Phase polar
Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in:
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dI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
Abb. 6: Material mit polaren Silanol- (SiOH)-Endguppen
I Theoretischer Teil
Nor
mal
-Pha
se
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Abb. 7: Material mit C18-Endcapping
RP-
Phas
e
I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Abb. 8: Material mit C8-Endcapping
RP-
Phas
e
I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Abb. 9: Material mit C4-Endcapping
RP-
Phas
e
I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Abb. 10: Material mit CH3-Endcapping
RP-
Phas
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I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Abb. 11: Material mit Phenyl-Endcapping
RP-
Phas
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I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Abb. 12: Material mit Aminopropyl-Endcapping
I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Abb. 13: Material mit SO3- - Endcapping
I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Abb. 14: Material mit C3H6N(CH3)3+ -
Endcapping
I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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Im Praktikumsversuch wird folgende Säule eingesetzt:
Hersteller: Fa. PhenomenexDimensionen: 150 mm x 4.6 mm (ID)Material: 3 µmstationäre Phase: C18
I Theoretischer TeilI.3.3 Beispiele stationärer Phasen
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dI.4 Die mobile PhaseI Theoretischer Teil
Abb. 15: Komponenten eines HPLC-Systems (Eluenten)
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dI.4.1 Die Polarität der mobilen PhaseI Theoretischer Teil
Normal-Phase-Chomatographie: NP
Stationäre Phase polar
Mobile Phase unpolar
Reversed-Phase-Chomatographie: RP
Stationäre Phase unpolar
Mobile Phase polar
Adsorptions-Chromatographie teilt sich auf in:
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dI.4.2 Die Eluotrope Reihe für
= Empirische Anordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft (Polarität E0) bezogen auf Al2O3 bzw. SiO2 alsStationäre Phase
Für die Normalphasen-(NP)-Chomatographie gilt:
THF Acetonitril Methanol Wasser
E0 = 0,45 E0 = 0,65 E0 = 0,95 E0 > 1
I Theoretischer Teil
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Für die Reversed-Phase-(RP)-Chomatographie gilt:
Wasser Methanol Acetonitril THF
E0 = 0,45E0 = 0,65E0 = 0,95E0 > 1
I Theoretischer TeilI.4.2 Die Eluotrope Reihe
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dI.4.3 Die isokratische-Elution
Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sichwährend der chromatographischen Trennung nicht:
Abb. 16: Solventverlauf bei isokratischer Elution
I Theoretischer Teil
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dI.4.4 Die Gradienten-Elution
Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sichwährend der chromatographischen Trennung:
I Theoretischer Teil
Abb. 17: Solventverlauf bei Gradienten Elution
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dI.5 Die PumpeI Theoretischer Teil
Abb. 18: Komponenten eines HPLC-Systems (Pumpe,Detektor, Injektionseinheit)
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dI.5 Die Pumpe
Abb. 19: Kolbenpumpe
Einlaßventil
Auslaßventil
Kolben
I Theoretischer Teil
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dI.5 Die Pumpe
Abb. 20: Einkolben-Pumpe
Kolben
Auslaßventil
Einlaßventil
I Theoretischer Teil
Kolbenantrieb
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dI.5 Die Pumpe
Abb. 21: Diaphragma-Pumpe
Hydraulik-Flüssigkeit
MembranKolben
I Theoretischer Teil
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dI.6 Die Injektionseinheit
Probengläschen
Injektionsnadel
Ventil
Abb. 22: Funktionsweise Autosampler
I Theoretischer Teil
Proben-Schleife
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dI.7 Der Detektor
Abb. 23: Variabler Wellenlängendetektor (VWD) Jeweils nur eine Wellenlänge einstellbar
Spalt
Deuteriumlampe
Gitter
Flußzelle
I Theoretischer Teil
I.7.1 Der VWD-Detektor
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Abb. 24: Der Photodiodenarray-Detektor
Deuteriumlampe
Gitter
Spalt Photodioden
Flußzelle
I Theoretischer TeilI.7.2 Der Diodenarray-Detektor
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dI.7.2.1 Der ISO-PlotI Theoretischer Teil
Abb. 25: Isoplot einer chromatographischen TrennungZeit [min]
Wel
lenl
änge
[nm
]Absorption0 mAU 100 mAU
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I Theoretischer Teil
Abb. 26: 3-D-Plot einer chromatographischen Trennung
I.7.2.2 Der 3D-Plot
Wellenlänge [nm]
Zeit [min]
Abs
orpt
ion
[mA
U]
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dI.7.3 Der MS-Detektor
Quadrupol IonenfalleIonenquelle
HPLC
Abb. 27: Vereinfachte Darstellung eines HPLC-MS-Detektors
I Theoretischer Teil
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dI.7.3.1 Funktionsweise des LC-MS-DetektorsI Theoretischer Teil
Abb. 28: Funktionsweise eines HPLC-MS-Detektors
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dI.8 SoftwareI Theoretischer Teil
Abb. 29: Software ChemStation A.10.01 [1635]
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dI.9 Die Methode des Internen Standards
Masseder Komponente iResponsefaktor
der Komponente i
Fläche derKomponente i
I Theoretischer Teil
imf iia = • (1)
Die Fläche eines Peaks ist mit der eingespritzten Stoffmenge bzw. der Masse mi des Stoffes proportional:
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dI.9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer Teil
Aber chromatographische Läufe sind nie100% identisch.
Es kann zu „ganz normalen“ Schwankungenzwischen den Läufen kommen, wie:
Geringe Unterschiede im Injektionsvolumen(Luftblasen, manuelle Injektion).
Veränderungen des Säulenmaterials im Laufe des Meßbetriebes.
Veränderungen der Umgebungstemperaturetc.
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dI.9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer Teil
Wie können diese Fehlerquelleneliminiert werden ?
Zugabe eines Tracers zur Stammlösung( führt zur → Kalibrierlösung)
Zugabe des gleichen Tracers (gleiche Konzentration, gleiches Volumen) zu den Realproben (führt zu → Probenlösungen).
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dI.4.1 Die Methode des Internen Standards
K = Kalibrierlösung
I Theoretischer Teil
fi = i
ima
Beliebige Substanz
(2)
Tracer Substanz
fTr = Tr
Trma
Tr = Tracer
(3)
iKF = i
Tr
ff
= Ki
KTr
KTr
Ki
amam⋅
⋅
Kalibrierfaktor der Komponente i
(4)
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dI.4.1 Die Methode des Internen Standards
Auflösen nach Masse der Komponente i
I Theoretischer Teil
x = Probenlösung
i
Tr
ff
= xi
xTr
xTr
xi
amam⋅
⋅(5)
mxi = ⋅ ⋅mTr (6)
i
Tr
ff i
xTra
axKFi
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Kapitel II Experimenteller Teil
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Kapitel II: Experimenteller Teil
II.1 Einleitung
II.2.1 Vorbereitung der LösungenII.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen
(siehe Praktikumsskript)
II.2 Versuchsdurchführung
II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrierlösung)(siehe Praktikumsskript)
II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen(siehe Praktikumsskript)
II.2.2 Durchführung der HPLC-AnalysenII.3 Aufgaben (Skript)
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Coffein
II Experimenteller Teil
N
NN
N
O
O
CH3
CH3
CH3
II.1 Einleitung
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 30: Die Pumpen-Programmierung
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 31: Die Programmierung des Injektionsvolumens
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 32: Die Detektorprogrammierung (DAD)
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 33: Die Programmierung des Säulenthermostaten
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 34: Die Einstellung der Integrationsparameter
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 35: Die Programmierung des Autosamplers
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 36: Das Starten der Probensequence
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 37: Der Menüpunkt: Data-Analysis
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 38: Das Erstellen der Kalibriertabelle
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-Analyse
Abb. 39: Das Erstellen des Quantitativen Reports
II Experimenteller Teil
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dI.4.1 Durchführung der HPLC-AnalyseII Experimenteller Teil
Abb. 40: Praktikumslabor Raum 32.1.06
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