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BiotechnologieProdukte mit lebenden Organismen
oder Teilen davon herstellen
Enge Definition♦ Industrielle Produktion in Bioreaktoren - Mikroorganismen, Zellkulturen ♦ Enzymtechnik und Biokatalyse - Enzyme
Breitere Definition♦ Spezifisch modifizierte Pflanzen und Tiere als Produzenten (Transgene Organismen)♦ Direkte medizinische Applikationen (z.B. Gentherapie) ♦ Bio-Nanostrukturen
Molekulare BiotechnologieEngineering von Biosystemen
Zell-EngineeringStoffwechsel-Engineering
Protein-Engineering
BioprozesstechnikEngineering von Produktionsverfahren
ProzessentwicklungReaktionstechnik
Aufarbeitungstechnik
BIOTECHNOLOGIE
Integrierte Vernetzung
Natur
Breite Biodiversität
1. Schritt zur Etablierung eines Biotechnologischen ProzessesSuche nach geeigneten Organismen in der Biodiversität der Natur
Beispiel:
Isolierung eines Antibiotikaproduzenten
2. Schritt zur Etablierung eines Biotechnologischen Prozesses
Entwicklung des biologischen Systems
Aus der Natur isolierte Stämme sind zwar fähig, gewünschtes Produkt herzustellen
aber meist sind viele Parameter nicht zufriedenstellend
z.B.:WachstumsverhaltenProduktbildungVerwertung von NährstoffenBildung von NebenprduktenGenerelle Prozesseigenschaften
Physiologische Bedingungen Genetische Optimierung
Substrate(Futter z.B. Zucker)
Gene
Produkt(z.B. Penicillin)
Enzyme
S CBA D
G
F
Zelle - Funktion
E1
E7
E5
E2 E3
E6
E8
E4
P
MetaboliteProteine
E
Umwelt
Zellbauteile
Zellbau-teile+/-
+/-
Wachstum von Mikroorganismen Produktion der Biomasse
Biomasse Produkt Biomasse biokatalytische Kapazität
Produktbildung
Für den Bioprozess wichtige Phasen im Biosystem
Metabolische FähigkeitenGenexpression
Wachstum von Mikroorganismen
Wachstum von Mikroorganismen
Exponentielles Wachstum Substrat-limitiertes Wachstum
Wachstum von Mikroorganismen
Monod
X = Biomasse N = Zellzahlµ = spez. Wachstums-
rate
dNdt = µ N
dX dt = µ X
dX dt = µX
1*
Zuwachs - Absterben
α = spez. Absterberate
Wachstum –Temperaturabhängigkeit
dX dt = µ X α X-
ln µ
1/ T
µ = A . e RT
Ea
α = A‘ . e RT
Ea‘
Absterben Wachstum
F V = D [h-1]
F = ZuflussrateV = Reaktorvolumen
dX dt = µ X – D.X
steady state
dX dt = µ X – D.X = 0
µ = D
Kontinuierliche Kultur - Chemostat
Produktbildung
Wachstumsassoziiert
dPdt =
µ X
YP/S
Nicht assoziiert
Wachstum von Mikroorganismen
Experimentelle Bestimmung
Zellzahl (nur einzellige Organismen)Thoma Zählkammer (mikroskopisch)Cell CounterCFU (colony forming units)
Biomasse (direkte Verfahren)ZTM (Zelltrockenmasse) ZFM (Zellfeuchtmasse)Frischvolumen (Zentrifugation)
Probleme: Feststoffe in Medium
Biomasse (indirekte Verfahren)Optische Dichte (Trübungsmessung)Stoffwechselparameter (z.B. dO2/dt, dCO2/dt, dpH/dt etc.)Zellinhaltstoffe (z.B. DNA, RNA, ATP, N-Gehalt, Proteingehalt etc.)
Probleme: Abhängigkeit von physiolg. Zustand der Biomasse
Substrate
Zentrale MetaboliteZellbestandteileGrundbausteinePolymere
EnergieATP
O2H2 hν
Kat
abol
ism
us
Anabolismus
NADH2
Stoffwechsel
Nährstoffansprüche
HauptelementeC-QuelleKohlenhydrateorg. SäurenKohlenwasserstoffeCO2
N-QuelleAmmoniumNitratorg. N-Verb.N2
Nebenelemente
O-QuelleO2SO4NO3
P-QuellePO4org. P-Verb.
S-QuelleSO4org. S-Verb.Me-Sulfide
Spurenelemente Wuchsstoffe/VitamineCa, Mg, Na, K, .... Mn, Fe, Ni, Co, Mo, Se....
MilieuansprüchepH Temperatur Sauerstoff Ionenstärke (osmot.)Druck
psychrophilmesophilthermopil
aerobanaerob
Definierte MedienMinimalmedien
Komplexe Medien
Sterilität – steriles Arbeiten
Sterilität: KeimfreiheitNur gewünschte Organismen im System vorhandenabsolute Sterilitätkeimarme BedingungenBedingungen die bestimmte Organismen bevorzugen/ausgrenzen
Methoden: Abtöten von Organismen in einem SystemAbschluss von Systemen gegen Eindringen und EntweichenMethoden zum sterilen Transfer von Organismen
von einem System in ein anderes
Verfahren: Hitze (feucht, trocken)chemisch (Flüssigkeiten, Gase)Filtration (Absolutfilter, Tiefenfilter)Strahlung (UV, Gamma, Mikrowellen)
Sterilisation
Hitze Chemisch Mechanisch - FiltrationStrahlung
Chemische Methoden zurVerhinderung von Zellwachstum
Systeme zum Züchten von Mikroorganismen
Wachstum auf Oberfächen Stammhaltung
AgarkulturenSchrägagarPetrischale
Wachstum auf TrägermaterialienTropfkörper
Wachstum in Submerskulturen
Schüttelkulturen - RollerkulturenMikrotiterplattenEprouvetten Erlenmayer Kolben
Gerührte KulturenFermentoren
Deep Well Mikrotiterplatten
Quelle: A.Glieder
Schüttelkolben
Steriles Arbeiten
Steriles Arbeiten
Petrischale
Genetische Grundlagen
5‘ – PO4
3‘ – OH 5‘ – PO4
3‘ – OH
DNA Stränge liegen im Doppelstrang inantiparalleler Orientierung vor
Lineare DNA – Zirkuläre DNA
Zirkuläre DNA
Bakterielle Chromosomen PlasmideViren - PhagenMitochondriale DNA
lineare DNA
Eukaryontische Chromosomen Spezielle PlasmideViren - Phagen
Supercoiling – Unterwindung von DNA
Plasmide
Extrachromosomale Elemente
Replikation, Maintenance
Transfer
Gene für spez.Funktionen
Transposition,Integration
Isolierung von Plasmid DNA
Plasmid _DNA Isolierung
Lyse der Zellen – schonendDenaturieren der DNARenaturieren in Gegenwart hoher IonenstärkenChromosomale DNA zusammen mit Proteinen abtrennen (ZEntrifugationReinigung der Plasmid-DNA durch Chromatographie
Agarose-Gelelektrophorese von DNA
Transkription
Translation
DNA
mRNA
Protein
Protein A Protein CProtein B
RibosomeBinding Site(Shine Dalgarno)
P Promoter
R Regulatory Region (e.g. Operator)
start startstartstop stop stop
P RR Gen A Gen B Gen C
initiation termination
Genexpression (in Prokaryonten)
Prokaryoten: Transkription und Translation laufen simultan
lac -Operon
lac -Operon
Negative Kontrolle durch Lac-Repressor
Induktor:LaktoseIPTG
Positive Kontrolle durchcAMP-CRP
pMS470d85366 bp
bla
tac Promoter
d8lacI
AvaI (18)
BamHI (23)
EcoRI (2)
HindIII (1454)
Sma I (20)
XmaI (18)
BglI (2648)
XbaI (29)
Sac I (12)
Sph I (1452)
NdeI (69)
ApaLI (2094)ApaLI (3340)
ApaLI (4656)
ApaLI (5134)
Platzhalterfragment
E.coli Expressionsvektor
Regulatorprotein
Selektionsmarke
Transkription - Termination
oriVReplication
Shine - Dalgarno SequenzTranslation Initiation
Esterase Gen (EP6)Bg_estA
Promoter
Shine - Dalgarno SequenzTranslation Initiation
Transkription - Termination
RepressorLacI
Replication Selection
GTG - Geltung (§2)
• Gentechnische Anlagen• Arbeiten mit GVO• Freisetzung von GVO• Inverkehrbringen und Kennzeichnung von Erzeugnissen• Genanalyse, Gentherapie am Menschen• gilt nicht für
in vitro Befruchtungungerichtete MutageneseZellfusion (wie z.B. Hybridomherstellung)Arzneimittel
GTG – Einstufung
Sicherheitseinstufung von Arbeiten mit GVO:
S1: kein oder vernachläßigbares RisikoS2: geringes RiskoS3: mäßiges RiskoS4: hohes Risiko
Kriterien :
WirtVektorInsertrekombinater Organismus
Sicherheitsmaßnahmen
Biologische SicherheitsmaßnahmenOrganisatorische / Technische Sicherheitsmaßnahmen
GTG – Maßstab
• kleiner Maßstab:- S1 bis 600 Liter- S2 bis 100 Liter- S3 und S4 bis 10 Liter
• großer Maßstab: - alles, was nicht kleiner Maßstab ist