Serumenzyme

Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation

Enzyme - Eigenschaften

• Die Bestimmung von Enzymaktivitäten in Serum, Plasma oder Harn hat für die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen vorrangigen Stellenwert eingenommen.

• Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering, wenn man sie in Konzentrationen angibt – z.B. ALAT (GPT) 100 µg/ Liter (Gesamteiweiß 60-80 g/l)

• Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B. Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren – kommen in höheren Konzentrationen vor.

• Enzyme gelangen meistens durch die Zellumsatz ins Blut.

Enzyme - Eigenschaften

• Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut – z.B. Thrombin, Plasmin, Cholinesterase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Abfall der Aktivität im Blut.

• Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drüsen – z.B. Pankreasamylase, -lipase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.

• Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle – z.B. LDH, GOT, GPT, CK - zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.

Enzyme - Eigenschaften

• Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut sezeniert wird – z.B. CHE -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut sinkt.

• Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber nicht ins Blut abgegeben wird – z.B. CK -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut steigt.

Enzyme - Eigenschaften

• Einige Enzyme kommen als Isoenzyme vor – das heißt, dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor – z.B. Lactatdehydrogenase oder LDH, die als Tetramer in 5 verschiedenen Isoformen vorkommt.

• Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das Herkunftsorgan herauszubekommen.

• LDH-1 kommt überwiegend im Herzmuskel und Erythrozyten, LDH-5 dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor.

• Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2 (LDH-3), HM3 (LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz; M=Muskel)

Serumenzyme – Diagnostisches Nützen

• Das Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgänge im Körper widerspiegeln. Nicht nur die Geschwindigkeit des An- oder Absteigens eines Enzyms, sondern das Verhältnis von Enzymen zueinander, gibt zusätzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer Therapie.

• Es gibt verschiedene Komponente der Enzymkinetik, die separat betrachtet werden müssen, um ein diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren.

Enzyme – Messung der Aktivität

• Die Internationale Union für Biochemie (IUB) hat schon 1961 Empfehlungen für die optimierte Bestimmung von Enzymaktivitäten erarbeitet.

• Die Bedingungen für diese optimierten Methoden sind:• Optimaler pH-Wert• Definierte Temperatur d.h. 37 °C • Optimale Substratkonzentration• Optimale Coenzymkonzentration• Optimale Konzentration an Aktivatoren

Enzyme – Messung der Aktivität

• Enzymaktivität wird in Einheiten/l (U/l) angegeben.• 1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivität,

die pro Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1 µmol Substrat katalysiert. (Dies wird für Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen).

• Die Messtemperatur ist 37 °C (definierte und validierte Referenzbereiche sind oft nur für 25 °C vorhanden!)

Enzyme - Nomenklatur

• Die Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im „Enzyme Nomenclature“ [1972] sowie dem „Enzyme Handbook“ und seinen „Supplements“ (Springer-Verlag).

• Die EC-Nummer hat 4 Komponente:• Stelle 1 definiert die Funktion – z.B. 1 = Oxidoreduktasen• Stelle 2 definiert die Donorgruppe – z.B. 1 = CH-OH• Stelle 3 definiert die Akzeptorgruppe – z.B. 1 = NAD(P)• Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe.• Beispiel: EC 1.1.1.71 = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder

Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase• Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)

Enzyme - Nomenklatur

• Die Hauptgruppen von Enzymen sind:• 1.x.x.x – Oxidoreduktasen (z.B. GLDH: EC 1.4.1.3,

LDH: EC 1.1.1.27)• 2.x.x.x – Transferasen (z.B. Gamma-GT: EC 2.3.2.2,

ASAT/GOT: EC 2.6.1.1, ALAT/GPT: EC 2.6.1.2)• 3.x.x.x – Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase:

EC 3.1.3.1, α-Amylase: EC 3.2.1.1, Lipase EC 3.1.1.3)• 4.x.x.x – Lyasen (z.B. Adenylatcyclase: EC 4.6.1.1)• 5.x.x.x – Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat

Isomerase: EC 5.3.1.9)• 6.x.x.x – Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoff-

carboxylase: EC 6.3.4.6)

Enzyme – Messung der Aktivität

• In klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles automatisch geregelt. Die Temperierung der Messzelle findet automatisch statt. Das Gleiche gilt für das Pipettieren der Reagenzien, eventuelle Verdünnungen und Umrechnung der Ergebnisse.

• Es gibt verschiedene Messmöglichkeiten: kontinuierliche Verfahren (Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt Messung) oder Endpunktverfahren.

• Die Konzentration der zumessenden Substanz in der Probe errechnet sich nach der Gleichung:

• c = (ΔE / [ µmol * d])

• c = Konzentration der Substanz• ΔE = Extinktionsdifferenz zwischen Analysen- und

Leerwert bzw. Extinktionsdifferenz durch Verbrauch oder Bildung von NAD(P)H

• d = Schichtdicke der Kuvette in cm µmol = spezifischer mikromolare Extinktionskoeffizient

Enzyme – Berechnung der AktivitätBerechnung des molaren

Extinktionskoeffizienten -

Enzyme – Berechnung der Aktivität

• Die Enzymaktivität entspricht der Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt während der Messzeit (t). Meist wird bei einer Enzymaktivitäts-bestimmung aus mehreren Messungen das durchschnittliche ΔΕ/Minute ermittelt. Von diesen Beobachtungen haben wir:

• Volumenaktivität = Δc / t = ΔE / (t* µmol *d) µmol/min * ml Messlösung

• Δc = Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt

• t = Messzeit in Minuten

Enzyme – Berechnung der Aktivität

• Ein Substratumsatz von 1 µmol/min = 1U. Analog zur Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das Volumen der Messlösung und das Probenvolumen zu berücksichtigen.

• Volumenaktivität = ΔE * V/ (t* µmol *d * v) U/ml• V = Volumen der Messlösung• v = Volumen, das in dem Test eingesetzten Probe• Da man Ergebnisse meistens in U/l angibt, muss man

mal mit dem Faktor 1000 multiplizieren.• Wird verdünntes Material eingesetzt, muss dies auch

berücksichtigt werden.

Serumenzyme - Herkunft

• Sekretionsenzyme – Cholinesterasen• Reaktion: Acylcholin + H2O Cholin + R.COOH• Es gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre

Acetyl(thio)cholinesterase (AChE) (2 Typen bekannt) und die Pseudocholinesterasen (CHE) (Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere Acylcholine sowie Thiocholine spalten.

• Die Bestimmung von AChE hat – im Gegensatz zur CHE– so gut wie keine klinische Bedeutung. Die CHE biologische Halbwertzeit im Serum beträgt ca. 10 Tage.

Cholinesterase – diagnostisches Nutzen

• Aktivitätsänderungen bei der Cholinesterase:• Erhöhung bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches

Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frühform der alkoholischen Leberschädigung), funktionelle Hyperbilirubinämie, Hypertriglyceridämie, Adipositas, Diabetes mellitus.

• Erniedrigung bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin, Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6 Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikämie, Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva, Malignome, Anämien)

Weitere Serumenzyme – Beispiele und diagnostische Anwendung in der Gerinnung

• Andere Enzyme mit Aktivität im Plasma sind die, die mit der Blutgerinnung zu tun haben. Hierzu gehören u.a. Urokinase, Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) und Thrombin sowie die überwiegende Zahl der Gerinnungsfaktoren, die je in einer inaktiven Form vorliegen, die während des Gerinnungsprozesses stufenweise aktiviert werden.

• Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern ihre biologische Aktivität im Form von „globalen“ Tests, wie der Quick-Wert [auch Thromboplastinzeit, TPZ oder Prothrombinzeit genannt]. Hier werden eine Verminderung der Faktoren II, V, VII, X sowie Vitamin-K und Fibrinogen erfasst. Der Quick-Wert wird u.a. zur Kontrolle einer Cumarin-Derivat Antikoagulantientherapie angewendet. Die Werte werden normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben (Normal: 70-130%).

Serumenzyme – als Globalteste in der Gerinnung

• Andere Globalteste (mit ähnlichen Abkürzungen!) sind:• Partielle Thromboplastinzeit [PTT] und aktivierte

partielle Thromboplastinzeit [aPTT] – Prüft die Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I). Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMW-Kininogen durch den Zusatz von Oberflächenaktivatoren, wie Kaolin.

• Plasma Thrombinzeit [PTZ] – Die PTZ wird eingesetzt, um ein Fibrinogenmangel zu prüfen.

Enzyme – Messung der AktivitätKinetisch-Optischer Test - IFCC Methode

• Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Serum.• Reaktion: Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

• Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das Entstehen des Coenzyms NADH bei 339 nm im Spektralphotometer.

• Als Substrat dient Lactat.• Im Prinzip kann man die Reaktion in die

entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im Überschuss haben und einen anderen pH-Wert einstellen.

• NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form• NADH – NAD reduzierte Form

Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit

Indikatorreaktion

• Die Bestimmung des ASAT (GOT) im Serum• ASAT – Aspartat-Amino-Transferase• GOT – Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

• Reaktion: Enzym ASAT/GOT• L-Aspartat + α-Oxoglutarat L-Glutamat + Oxalacetat• Indikatorreaktion: Enzym/Malatdehydrogenase• Oxalacetat + NADH + H+ Malat – NAD+

• Messprinzip – Abnahme der Extinktion bei 334 nm (Oxydation des NADH)

Enzyme – Messung der AktivitätZusammengesetzter optischer Test mit Hilfs-

und Indikatorreaktion

• Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum:

• Reaktion: Enzym Creatinkinase• Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP• Hilfsreaktion: Enzym Hexokinase• ATP + D-Glucose ADP + D-Glucose-6-Phosphat• Indikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenase• G-6-P + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

• Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm (Reduktion des NADP zu NADPH)

IFCC Methode – Creatin Kinase

• Messbedingungen für die CK• Temperatur: 37,0 °C ± 0,1 °C• Wellenlänge: 339 nm ± 1 nm• Bandbreite: 2 nm• Lichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm ± 0,01 mm• Inkubationszeit: 180 s• Verzögerungszeit: 120 s• Messinterval: 120 s• Anzahl der Messpunkte: mindestens 6

Enzyme – Messung der AktivitätVerfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren

Lichtes

• Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum:

• Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP) pNP + PO4• pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10• Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH

9,8 unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm)• Kontinuierliche (kinetische) Messung• Als Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 benötigt• EDTA- bzw. Citratplasma können, wegen ihrer

komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden.

Enzyme - Diagnostik

• GPT / ALAT• Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt• GPT ist überwiegend im Zytoplasma der

Leberparenchymzellen zu finden.• Wichtigster Leberzellnekroseparameter• in kleinen Mengen auch in der Niere, Herz- und

Skelettmuskulatur • Störungen – Stark lipämische Seren können nicht

analysiert werden.• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <41; f: <31 U/l

Enzyme - Diagnostik

• GOT / ASAT• Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt• GOT ist überwiegend in der Leber sowie im Herz- und

Skelettmuskulatur zu finden • in kleinen Mengen auch im Gehirn• Wichtiger Leberzellnekroseparameter, in Verbindung

mit der GPT Hinweis auf die Schwere der Leberzellschädigung.

• Erhöhte Werte: akuter und chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Fettleber, aber auch Herzinfarkt und

Muskeldystrophie. • Störungen – Stark lipämische Seren können nicht

analysiert werden.• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <38; f: <32 U/l

Enzyme - Diagnostik

• Laktatdehydrogenase - LDH • LDH kommt in allen Geweben vor, wobei sich die höchste

Aktivität in Skelettmuskulatur, Herzmuskel, Niere, Gehirn und Leber findet

• Aufgrund der fehlenden Organspezifität eignet sich die Gesamt-LDH allein nur wenig als diagnostischer Parameter.

• LDH-1 als „Spätindikator“ für einen Herzinfarkt• LDH erhöht bei: hämolytische Anämien, Lungenembolie

Skelettmuskelerkrankungen • Leber und Gallenwegserkrankungen (LDH-5): akute Hepatitis,

akute Parenchymzellschädigung durch Intoxicationen• Störungen – Hämolytische Seren können nicht analysiert

werden. • IFCC Referenzmethode (37 °C) - m: <225; f: <215 U/l

Enzyme - Diagnostik

• Glutamatdehydrogenase - GLDH • Wird zur Leber-Diagnostik eingesetzt, da GLDH

ausschließlich intramitochondrial in Leber vorkommt. • Ein starker Anstieg der GLDH weist immer auf eine

schwere Leberschädigung hin, insbesondere der zentroazinären Abschnitte, z.B. bei akuter Stauungsleber.

• Reaktion:• α-Oxoglutarat + NADH + NH4 L-Glutamat + NAD+ + H2O• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <6,4; f: <3,8 U/l

Enzyme - Diagnostik

• Gamma-Glutamyltransferase – γGT • γGT findet sich in der Leber überwiegend in den

kanalikulären Segmenten der Hepatozytenmembran und in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege.

• γGT ist ein Leberzellnekrose- und Cholestaseparameter

• Reaktion:• γ-Glutamyl-p-Nitroanilid (farblos) + Glycylglycin γ-

Glutamyl-Glycylglycid + p-Nitroanilin (gelb) (405 nm)• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <49; f: <32 U/l

Enzyme - Diagnostik

• Alkalische Phosphatase - AP• Cholestaseparameter und Knochenerkrankungen mit

erhöhter Osteoblastenaktivität • Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP. Die

Aktivität im Normalserum ist hauptsächlich auf das Leber- und Knochenisoenzym zurückzuführen.

• Störungen – nur Serum bzw. Heparinplasma, nicht Citrat und EDTA verwenden.

• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <270; f: <240 U/l. Kinder in Wachstumsalter haben höhere Werte (Knochenbau)

Enzyme - Diagnostik • Bei Cholestase steigen AP und -GT im Serum an.• erhöhte gesamt AP kommt auch bei andere

Erkrankungen vor: Osteopathie mit erhöhter Osteoblastenaktivität, Nierenerkrankungen, Rachitis, Schwangerschaft (letztes Trimenon), maligne Tumoren.

-GT Erhöhungen im Serum sind bei etwa 95% aller Fälle durch eine hepatobiliären Erkrankung zustande gekommen.

-GT ist ein guter Marker für Alkoholabusus• Mäßig erhöhte -GT kommt bei einer chronisch aktiven

Hepatitis, primär biliäre Zirrhose und chronische Pankreatitis vor.

Bedeutung von Quotientenbildung

• De-Ritis Quotient = GOT/GPT - akute Virushepatitis: < 0,7 unkompliziert, >0,7 nekrotisierend - chronische Hepatitis, Leberzirrhose: ca.1 - nicht hepatisch (Trauma/Herzinfarkt): >1

• Quotient (GOT+GPT)/GLDH gilt als Maßstab für den Schweregrad der Hepatozytenschädigung.

- < 20 bei schwerer Schädigung - 20 – 50 bei mäßiger Schädigung

Bedeutung von Quotientenbildung

• Beispiele von Quotienten bei einer Hepatitis-A• Typischer ikterischer Verlauf / cholestatischer Verlauf

Wochen 1 3 5 7

AST/ALT25 °C37 °C

0,54 / 0,490,54 / 0,49

0,28 / 0,280,28 / 0,28

0,31 / 0,360,31 / 0,36

0,65 / 0,310,66 / 0,31

(AST +ALT)/GLDH

116 / 93174 / 140

107 / 109160 / 164

49 / 20074 / 300

38 / 8857 / 132

Enzyme - Diagnostik

• Creatinkinase - CK • CK kommt in hoher Aktivität in der Skelettmuskulatur, im

Herzmuskel und im Gehirn• 3 Isoenzyme: CK-MB (Myokardtyp), CK-MM (Muskeltyp)

und CK-BB (Gehirntyp)• Skelettmuskelerkrankungen: Rhabdomyolyse, Myositis,

progressive Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma (inkl. i.m. Injektionen)

• Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt (Diagnostik und Verlaufskontrolle), Kontrolle einer Thrombolysetherapie, Myokarditis

• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <170; f: <145 U/l

Enzyme - Diagnostik beim Herzinfarkt

• CK-MB erreicht im Myokard ihre höchste Konzentration • Obwohl CK-MB nicht vollständig kardiospezifisch ist, wird

sie in Verbindung mit der Gesamt-CK neben den kardialen Troponinen weiterhin als biochemischer Marker für den akuten Herzinfarkt eingesetzt.

• Cardiac-Troponin-T - Methode der Wahl, da standardisiert

• Cardiac-Troponin-I • Troponin-C ist nicht spezifisch genug für die

Herzinfarktdiagnostik.• CK,CK-MB und Troponin T steigen 2-6 h nach einem

Infarkt.• Myoglobin nach 1-2 h; GOT nach 4-6 h; LDH-1 (HBDH)

nach 6-12 h;

Serumenzyme – Referenzbereiche für gesunde Erwachsene – 37 °C

-GT – M: < 50 U/l; F: < 32 U/L (IFCC)• AP – M: 40-120 U/l; F: 30-90 U/L• GPT – M: < 40 U/L; F: < 33 U/L (IFCC mit P-5-P)• GOT – M: < 43 U/L; F: < 36 U/L (IFCC mit P-5-P)• CK – M: 24-207 U/L; F: 24-170 U/L (IFCC)• CK-MB – M: < 18 U/L; F: < 18 U/L• GLDH – M: < 6,7 U/L; F: < 4,8 U/L• LDH – M: 135-225 U/L; F: 135-215 U/L (IFCC)• LDH-1 (HBDH) – M: < 171 U/L; F: < 202 U/L

• (Wood et al.: Clin Lab 2004; 50: 455-75)