Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung

Reporter-Gen-Assay

Molekulare Zellbiologie von Immunzellen

Blockpraktikum SS 2008

Referenten: Felix Eppler, Sibylle Molt

10.07.08

Einleitung

• Phosphorylierung der der Tyrosinreste der ITAMs durch Src-Kinasen

• Rekrutierung der Syk-Kinase ZAP-70

• Aktivierung von ZAP-70 durch Tyrosin-Phosphorylierung von Lck und Fyn

Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

Zap70

• Tyrosinkinase Phosphoryliert die Adapterproteine SLP-76 und LAT (linker of T cell activation)

• Aktivierung der PL Cγ und Ras-Proteine• Ausgelöste Signalkaskade aktiviert die

Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB binden an die jeweiligen Erkennungssequenzen im IL-2 Promotor Induktion der Synthese des IL-2

• IL-2 fördert die Proliferation und Differenzierung der T-Zelle

Cytohesin-1

• Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) für kleine ADP-Ribosylierungsfaktoren

• Überwiegend in Zellen des hämatopoetischen System exprimiert

• Wurde als spezifischer Interaktionspartner der β2-Untereinheit (CD18) des Integrins LFA-1 identifiziert (Kolanus et al.)

Ziel des Versuchs

• Untersuchung des Einflusses von Zap70 und Cytohesin-1 auf den IL-2 Reporter und damit auf die T-Zellaktivierung

• Ist Cytohesin-1 an Signalkaskaden der T-Zellaktivierung beteiligt?

• Mutanten – Zap70K- inaktive Mutante (dominant negativ)– Zap70Y292F funktionserhöhende Mutante

Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

• Dominant-negative Cytohesin-1 Sec-7 Mutante (Cytohesin-1 E157K) in Jurkat E6 T-Zellen unterbindet nicht nur den GDP/GTP-Austausch an ARF1, sondern auch die LFA-1-vermittelte Adhäsion an ICAM-1

Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

IL-2 Reporter-Gen Assay

• Hinter der Promotor-Region wurde das IL-2 Gen durch eine Luciferase cDNA ersetzt Luciferaseexpression wird dadurch u.a. von den Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB kontrolliert

Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

Luciferase Assay System

• Luciferase spaltet das Substrat Luciferin in Anwesenheit von ATP zu Oxyluciferin

• Die emittierten Photonen können mit Hilfe eines Luminometers detektiert werden

Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

Versuchsdurchführung

• Elektroporation der LT-Zellen mit Marker (GFP), Reporter (IL2) und Test-DNA (Vektorkontrolle, Cytohesin1 wt, Cytohesin1 E157K, Zap70K-, ZAP70Y292F)

• Stimulation der Zellen für 6 Stunden mit Okt3 (α CD3ε) und PMA (Phorbolester)

• Überprüfung der Transfektionseffizienz Bestimmung der GFP-Expression der einzelnen Transfektionen im FACS

• Messung der Luciferase Aktivität (Luminometer) und Proteinkonzentration (mittels BCA)

• Excel Auswertung

Ergebnisse

Als Beispiel: Transfektionseffizienz von Cytohesin-1 E157K ermittelt durch FACS-Analyse (27,66%)

ErgebnisseTransfektionseffizienz Proteinkonzentration

(mg/ml)Luciferase Aktivität

Vektorkontrolle 26,6% Stim (1): 0,739

Stim (2): 0,803

Us (1): 0,756

Us (2): 0,67

Stim (1): 210213

Stim (2): 205821

Us (1): 979

Us (2): 1173

ZAP70 K- 19,9% Stim (1): 0,671

Stim (2): 0,87

Us (1): 0,692

Us (2): 0,823

Stim (1): 4553

Stim (2): 4442

Us (1): 516

Us (2): 691

ZAP70 Y292F 20,27% Stim (1): 0,633

Stim (2): 0,686

Us (1): 0,616

Us (2): 0,655

Stim (1): 44713

Stim (2): 51351

Us (1): 823

Us (2): 808

Cytohesin-1 wt 11,7% Stim (1): 0,857

Stim (2): 0,976

Us (1): 0,963

Us (2): 0,846

Stim (1): 59143

Stim (2): 53592

Us (1): 262

Us (2): 309

Cytohesin-1 E157K 27,66% Stim (1): 0,48

Stim (2): 0,88

Us (1): 0,634

Us (2): 0,783

Stim (1): 92826

Stim (2): 115140

Us (1): 1712

Us (2): 1770

Ergebnisse

Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten aus 2 Experimenten

Diskussion

• Vektorkontrolle stimuliert: IL2-Promotor wird sehr effizient aktiviertVektor hat keinen Einfluss auf T-Zellaktivierung

• ZAP70 K- stimuliert:

IL2-Promotor wird kaum aktiviert

ZAP70 hat eine wichtige Funktion im Rahmen der T-Zellaktivierung

Diskussion

• ZAP70 Y292F stimuliert:schwache Aktivierung des IL2-PromotorsMutante scheint negative Einwirkung auf die T-

Zellaktivierung zu habenEine erhöhte Aktivierung des IL2-Promotors

wäre zu erwarten gewesen (Zeitlmann et al., 1998)

Müsste mit einem neuen Ansatz nochmals durchgeführt werden

Diskussion• Cytohesin-1 E157K stimuliert:sehr schwache Aktivierung des IL2-PromotorsDominant negative Mutante scheint negativen

Einfluss auf T-Zellaktivierung zu haben

• Cytohesin-1 wt stimuliert:sehr effiziente Aktivierung des IL2-Promotorsleichte Steigerung gegenüber der

VektorkontrolleCytohesin-1 scheint eine Rolle in der T-

Zellaktivierung zu spielen