Staphylococcus aureus-Isolate aus dem … · 2017-02-19 · Fokus der Untersuchung ... asp23 als sigB-abhängiges Transkript und sae sowie das Transkriptionsprofil der Virulenzgene

Aus dem Universitätsklinikum Münster

Institut für Medizinische Mikrobiologie

- Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Georg Peters -

Transkriptionsprofil wichtiger Regulatoren und Virulenzgene klinischer

Staphylococcus aureus-Isolate aus dem Respirationstrakt von

Mukoviszidose-Patienten

INAUGURAL – DISSERTATION

zur

Erlangung des doctor medicinae

der Medizinischen Fakultät

der

Westfälischen Wilhelms-Universität Münster

vorgelegt von

Ulrich, Katharina Maria Elisabeth

aus Münster

2013

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der

Westfälischen Wilhelms-Universität Münster

Dekan: Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h.c. Wilhelm Schmitz

1. Berichterstatterin: Prof. Dr. med. Barbara Kahl

2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Alexander Mellmann

Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2013

Aus dem Universitätsklinikum Münster

Institut für Medizinische Mikrobiologie

Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Georg Peters

Referentin: Prof. Dr. med. Barbara Kahl

Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. Alexander Mellmann

Zusammenfassung


Staphylococcus aureus-Isolate aus dem Respirationstrakt von Mukoviszidose-Patienten

Ulrich, Katharina

In der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression von 16 klinischen S. aureus-Isolaten aus dem

Respirationstrakt von Mukovizidose-Patienten untersucht. Die verwendeten Isolate stammten aus einer

multizentrischen prospektiven Observationsstudie von Mukoviszidose-Patienten. Fokus der Untersuchung

war das Transkriptionsprofil der Regulatoren agr, in Form von RNA III, asp23 als sigB-abhängiges

Transkript und sae sowie das Transkriptionsprofil der Virulenzgene hla und spa. Zum Vergleich wurden

neben den Isolaten Laborstämme (SH 1000, RN 6390, 8325-4) und Mutanten (agr-, sar-, agr-/sar-, sigB-)

mitgeführt. Die phänotypische Analyse der Stämme erfolgte nach Anzucht auf Columbia-Blut- und

Schaedler-Agar, wobei letztgenannter Unterschiede im Phänotyp, wie den Hämolysegrad und die

Pigmentierung, noch besser erfasste. Die Isolate wurden je nach Ausmaß der Hämolyse in drei Gruppen

zusammengefasst. Da die RNA-Isolierung von Agarplatten nicht üblich ist, wurde die RNA der Stämme

zusätzlich noch aus BHI-Flüssigkulturen isoliert. Ziel war es, die relative Genexpression der Regulatoren

und Virulenzgene mittels der RT-PCR zu bestimmen, um mögliche Rückschlüsse auf den Phänotyp

ziehen zu können. Arbeiten, die eine Korrelation zwischen Phänotyp und erwarteter Genexpression

herstellten, gab es bisher nicht.

Ergebnis der Untersuchung ist die große Variation der Genexpression zwischen den klinischen Isolaten

untereinander aber auch im Vergleich zu den Mutanten und Laborstämmen. Der Phänotyp von 8325-4

entwickelte eine maximale Hämolyse und exprimierte wie erwartet hla in hohem Maße. Diese Hypothese

ließ sich bei den klinischen Isolaten nicht belegen. Stark hämolysierende Phänotypen (S 568 I) wiesen

teilweise auch eine geringere Hämolyse auf Schaedler-Agar auf. Allerdings folgte einer erfolgreichen

Transkription von sae die ebenfalls erfolgreiche Expression von hla bei Isolaten der Gruppe III.

Interessanterweise stellten sich zwei klinische Isolate (S 348 I, S 179 I) offenbar als spa-Mutanten heraus.

Bei zwei weiteren klinischen Stämmen (S 1368 II und III) könnte es sich um natürliche agr-Mutanten

handeln, da die RNA III-Expression auf den Agarplatten sehr gering war. Diese Erkenntnisse dienen als

Anstoß für weitere Untersuchungen, die sich mit den Mutationen in klinischen S. aureus-Isolaten aus

Mukoviszidose-Patienten befassen könnten.

Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2013

Eidesstattliche Erklärung

Ich gebe die eidesstattliche Erklärung ab, dass ich meine Dissertation über das


Staphylococcus aureus-Isolate aus dem Respirationstrakt von

Mukoviszidose-Patienten

Im Institut für Medizinische Mikrobiologie des

Universitätsklinikums Münster

Unter Anleitung von

Frau Prof. Dr. med. Barbara Kahl

1. selbstständig angefertigt,

2. weder in der gegenwärtigen, noch in der anderen Fassung als Dissertation,

Semesterarbeit, Prüfungsarbeit oder zur Erlangung eines akademischen Grades

vorgelegt,

3. nur unter der Benutzung der im Literaturverzeichnis angegebenen Arbeiten angefertigt

und sonst kein anderes gedrucktes oder ungedrucktes Material verwendet,

4. keine unerlaubte fremde Hilfe in Anspruch genommen habe.

Hamburg, den 05.05.2013

Katharina Ulrich

1 Inhalt

6

1 Inhalt

1 Inhalt ..........................................................................................................................6

2 Einleitung und Fragestellung .....................................................................................8

2.1 Staphylococcus aureus ........................................................................................8

2.2 Zystische Fibrose ................................................................................................9

2.3 Genexpression bei Bakterien ............................................................................11

2.4 Expression der Virulenzgene und Virulenzfaktoren von S. aureus ..................11

2.4.1 Der agr-Regulator......................................................................................13

2.4.2 Der sar-Regulator ......................................................................................14

2.4.3 Der sae-Regulator ......................................................................................15

2.4.4 Der sigB-Regulator ....................................................................................15

2.4.5 Die Hämolysine .........................................................................................16

2.4.6 Das Protein A.............................................................................................16

2.5 Bestimmung der Genexpression mittels Real-Time-PCR ................................17

2.6 Fragestellung und Ziel dieser Arbeit.................................................................19

3 Material und Methoden ...........................................................................................20

3.1 Materialien ........................................................................................................20

3.1.1 Bakterielle Stämme....................................................................................20

3.1.2 Chemikalien ...............................................................................................21

3.1.3 Geräte.........................................................................................................23

3.1.4 Software .....................................................................................................23

3.2 Methoden ..........................................................................................................23

3.2.1 Bakterienanzucht auf Columbia-Blut- und Schaedler-Agar ......................23

3.2.2 Bakterienanzucht in Flüssigkulturen zur Ermittlung des

Wachstumsverlaufes ................................................................................................24

1 Inhalt

7

3.2.3 RNA–Isolierung.........................................................................................25

3.2.4 Bestimmung von Konzentration und Reinheit der RNA ...........................26

3.2.5 cDNA-Transkription..................................................................................26

3.2.6 Real Time-Polymerasekettenreaktion........................................................27

4 Ergebnisse................................................................................................................30

4.1 Wachstumsverhalten auf Columbia-Blut- und Schaedler-Agar........................30

4.1.1 Häufigkeitsverteilung der Merkmale der klinischen Isolate ......................31

4.1.2 Das phänotypische Erscheinungsbild der Kolonien auf Columbia-Blut-

und Schaedler-Agar .................................................................................................33

4.2 Der Wachstumsverlauf in den Flüssigkultur .....................................................35

4.3 Die Ergebnisse der Real Time-PCR..................................................................37

4.3.1 Das Transkriptionsprofil der Laborstämme und Mutanten .......................37

4.3.2 Das Transkriptionsprofil der klinischen Isolate .........................................52

5 Diskussion ...............................................................................................................78

6 Literaturverzeichnis .................................................................................................85

7 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................91

8 Tabellenverzeichnis .................................................................................................93

9 Abkürzungen ...........................................................................................................94

10 Anhang.....................................................................................................................95

11 Lebenslauf ...............................................................................................................96

2 Einleitung und Fragestellung

8


2.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) gehört zur Familie der Staphylokokken (griech.

staphylos = Traube). Staphylokokken sind grampositive, fakultativ anaerobe,

Katalase-positive, typischerweise in der Gramfärbung in Haufen gelagerte, ca. 0,5-

1,7µm große Bakterien, die unbeweglich und nicht sporenbildend sind. Sie sind relativ

hitzestabil und können noch nach längerer Zeit aus getrocknetem Material kultiviert

werden.

Die Abgrenzung zu anderen Koagulase-negativen Staphylokokken (CoNS) geschieht

bei S. aureus durch die Produktion des Enzyms Koagulase, das Fibrinogen in Fibrin

umwandelt. Beim Wachstum auf Blut-Agar neigt S. aureus zur Bildung von weißlich

bis goldgelben, ß-hämolysierenden Kolonien. Daher stammt auch der Name S. aureus

(lat. aureus =golden).

S. aureus, ein opportunistischer Erreger, kolonisiert 20-50% der gesunden

Normalbevölkerung dauerhaft oder vorübergehend. Am häufigsten sind die vorderen

Nasenvorhöfe und der Perinealbereich besiedelt. Höher ist die Kolonisationshäufigkeit

bei chronisch Kranken, wie insulinpflichtigen Diabetikern und Hämodialyse-Patienten.

Zu einer hohen Morbidität und Mortalität führen vor allem die nosokomialen

Infektionen (38), aber auch bei Gesunden kann eine S. aureus-Infektion schwere

Verläufe aufweisen.

S. aureus kann oberflächliche Hautinfektionen wie Abszesse oder Impetigo

verursachen. Eine Infektion mit S. aureus kann aber auch zu schweren invasiven

Infektionen wie Arthritis, Osteomyelitis, Endokarditis oder Sepsis führen (38). Ein

erhöhtes Risiko haben vor allem hospitalisierte Patienten nach invasiven Eingriffen, wie

nach Anlage intravenöser Katheter oder chirurgischen Operationen, bei denen die

nosokomialen Infektionen mit S. aureus eine wichtige Rolle spielen. Ein großes

Problem bei der Behandlung von S. aureus-Infektionen ist das Auftreten von

Methicillin-resistenten S. aureus Stämmen (MRSA), bei denen inzwischen schon


9

Resistenzen gegen das Reserveantibiotikum Vancomycin aufgetreten sind (25).

Zunehmend treten so genannte „community-acquired“ MRSA-Infektionen auf, an denen

vor allem gesunde Menschen erkranken, die nicht in einer medizinischen Einrichtung

behandelt worden sind (59).

S. aureus exprimiert eine Vielzahl an Virulenzfaktoren, die z.T. dazu führen, dass der

Erreger der Immunabwehr des Menschen entgeht und die zur Zerstörung des Gewebes

führen. Die Virulenzfaktoren werden eingeteilt in die Gruppe der Oberflächenproteine

und in die der extrazellulären Proteine. Wichtige Virulenzfaktoren, die in der Zellwand

verankert sind, sind das Protein A, das Fibronektin-bindende Protein und der Clumping-

Faktor A. Viele S. aureus-Stämme produzieren zudem eine Polysaccharidkapsel (48).

Ein Virulenzfaktor, der zunehmend bei CA-MRSA-Infektionen an Bedeutung gewinnt,

ist das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), das mit schweren Hautinfektionen und

nekrotisierenden Pneumonien assoziiert ist. So wurden auch schon PVL-positive

MRSA-Stämme aus der Lunge von CF-Patienten isoliert (16). Zu den extrazellulären

Proteinen gehört eine große Gruppe von Exotoxinen, wie die zu den Superantigenen

(SAgs) gehörenden Enterotoxine, SEs, SEIs und Toxic-Shock-Syndrome-Toxin-1

(TSST-1), die Exfoliativtoxine A und B und die Zytolysine, wie das PVL und die

Hämolysine.

Typischerweise werden die verschiedenen Virulenzfaktoren von S. aureus in

bestimmten Phasen des Wachstumszyklus exprimiert. So werden die

Oberflächenproteine in der exponentiellen Phase und die sezernierten Proteine vor allem

in der postexponentiellen und stationären Phase produziert (55).

2.2 Zystische Fibrose

Die zystische Fibrose (cystic fibrosis, CF, Synonym: Mukoviszidose) ist eine autosomal

rezessiv vererbbare Stoffwechselerkrankung. Es liegt eine Mutation eines Gens auf

Chromosom 7 vor, das für den „cystic fibrosis transmembrane conductance regulator“

(CFTR) kodiert. Die häufigste Mutation (ca. 70%) beruht auf einer Deletion von drei

Basenpaaren, die zum Fehlen von Phenylalanin (F) an Position 508 (∆ F508) im

CF-Genprodukt führt (13). Die Prävalenz liegt in den westlichen Ländern bei 1 von


10

3000 Lebendgeburten. Über 50% der Patienten mit CF sind homozygot für die Mutation

∆ F508 (13), wobei die Schwere der Erkrankung stark variieren kann.

Typischerweise kommt es durch eine epitheliale Dysfunktion mit erhöhter

Natriumabsorption und verminderter Chloridsekretion zur Funktionsstörung der

exokrinen Drüsen. Ursächlich dafür ist das Fehlen der cAMP-aktivierten Chloridionen-

Transportfunktion des CFTR-Proteins (15). Außerdem scheint CFTR als Inhibitor der

epithelialen Natriumkanäle zu wirken. Das CFTR-Protein kommt in der apikalen

Epithelmembran verschiedener Organe vor und führt dort bei gestörter Funktion zu

einer erhöhten Viskosität der Sekrete.

Charakterisiert wird die zystische Fibrose klinisch durch verzögertes Wachstum,

Steatorrhoe, Infektionen und Pankreasinsuffizienz.

Die Infektionen in der Lunge werden durch die hohe Viskosität des Bronchialsekrets,

welches durch die erhöhte Natriumchloridkonzentration bedingt ist, begünstigt. Die

gestörte mukoziliäre Clearance verhindert, dass der Schleim abgehustet werden kann

und somit ein idealer Nährboden für bakterielle Keime entsteht. Folgen sind

rezidivierende Bronchitiden aufgrund der chronischen Inflammation und

Bronchiektasen, die zu Atelektasen führen. Typischerweise werden im Sputum von

CF-Patienten S. aureus, Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia sowie

gelegentlich Escherichia coli und Klebsiellen nachgewiesen. S. aureus und

Haemophilus influenzae sind die Keime, die meist schon im frühen Kindesalter im

Sputum nachgewiesen werden, wenn in der Lunge noch keine ausgeprägte strukturelle

Schädigung vorliegt (51). Bei Jugendlichen und Erwachsenen ist P. aeruginosa der

führende Keim im bronchopulmonalen System. S. aureus ist in der Lage für Monate bis

Jahre in der Lunge der CF-Patienten trotz adäquater antibiotischer Therapie zu

persistieren (31). Ein Mechanismus, um sich an die Langzeittherapie mit Antibiotika zu

adaptieren, ist das Auftreten von „small colony variants“ (SCV), die noch resistenter

gegen die gängigen bei CF eingesetzten Antibiotika sind als der normale Phänotyp von

S. aureus (33).

Die chronische Beteiligung der Lunge führt zu weiteren Komplikationen, wie

Pneumothorax, Hämoptysen und im fortgeschrittenen Stadium zur respiratorischen

Insuffizienz und chronischem Cor pulmonale (15). Die Patienten fallen meist im frühen

Kindesalter mit chronischer Rhinosinusitis und Nasenpolypen auf.


11

Die wesentlichen Säulen der Therapie sind die Förderung der Sekret-Clearance durch

gezielte Physiotherapie, die Gabe von rekombinanter humaner DNAase und die

rechtzeitige prolongierte antibiotische Therapie bei akut entzündlichen Schüben. Zur

Aufrechterhaltung einer regelrechten Verdauung werden Pankreasenzyme substituiert.

Wichtige Punkte in der antibiotischen Therapie im Zusammenhang von CF und

S. aureus sind die primäre Prophylaxe, die Eradikation und die Behandlung von

pulmonalen Exazerbationen.

Durch eine Verbesserung der therapeutischen Möglichkeiten in den letzten Jahren

beträgt die Lebenserwartung heute bei diesen Patienten mehr als 30 Jahre (13).

2.3 Genexpression bei Bakterien

Gene liegen nicht verstreut auf der DNA, sondern sind meistens zu mehreren als

regulierte Einheit zusammengefasst. Diese Einheiten werden als Operon bezeichnet.

Das zentrale Element der Signaltransduktion bei Bakterien bezieht sich auf ein

Zwei-Komponenten-System. Dieses besteht gewöhnlich aus zwei Proteinen, die in

einem einzelnen Operon kodiert werden. Bei einem der beiden Proteine handelt es sich

um den transmembrane sensor und bei dem anderen um den Transkriptionsfaktor oder

auch response regulator (52).

Alle Bakterien exprimieren ihre genetische Information in einem bestimmten Muster

abhängig von der Wachstumsphase, relativ wenige sogar durchgehend während des

gesamten Zellwachstums (konstitutiv).

2.4 Expression der Virulenzgene und Virulenzfaktoren von

S. aureus

Eine Reihe verschiedener regulatorischer Gene sind für die Expression der

Virulenzfaktoren von S. aureus verantwortlich.

Die Produktion der Virulenzfaktoren wird eng in Bezug auf die Zelldichte,

Umgebungseinflüsse und zur Verfügung stehender Energie kontrolliert und findet nur

bei entsprechendem Bedarf statt (45). Die Expression der Virulenzfaktoren bei

S. aureus ist abhängig von der jeweiligen Wachstumsphase. Bei der Kultivierung eines


12

S. aureus Stammes im nährstoffreichen Flüssigmedium lässt sich das

Wachstumsverhalten anhand einer logarithmisch aufgetragenen Kurve beschreiben. Es

ergibt sich eine Unterteilung in drei Phasen: lag-, log- bzw. exponentielle, post

exponentielle und die stationäre Phase. In der exponentiellen Phase werden die

Oberflächenproteine synthetisiert, in der postexponentiellen vor allem die Toxine und

Exoproteine.

Abb. 1: Wachstumskurve des Laborstammes SH 1000 in BHI

Zu den unterschiedlichen Virulenzfaktoren gehören im Allgemeinen die

Oberflächenproteine und die sezernierten Proteine. Ihre Produktion wird insbesondere

über das agr-System reguliert, wobei die Oberflächenproteine durch agr inhibiert und

die sezernierten Proteine aktiviert werden (44). Zu den sezernierten Proteinen gehören

die Enterotoxine, Hämolysine (α, β, γ, δ), Hyaluronidase, Exfoliativtoxine (A und B),

das Fibrinolysin, Leukozidin und das „toxic shock syndrome toxin“. Zu den

Oberflächenproteinen gehören u.a. das Protein A, an das sich die Immunglobuline mit

ihrem Fc-Fragment binden. Zu den extrazellulären Proteinen gehören u.a. das Panton-

Valentine-Leukozidin und das γ-Hämolysin, welche leukozytolytische Aktivität

aufweisen.

WK von SH 1000

0

5

10

15

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Stunde

OD

578 n

m

30.09.2009

06.10.2009

09.10.2009


13

2.4.1 Der agr-Regulator

agr (accessory gene regulator) ist ~3kb groß und besteht aus verschiedenen

Transkriptionseinheiten, die von den Promotoren P2 und P3 gesteuert werden (45). Es

handelt sich um einen zentralen Transkriptionsregulator von S. aureus, der die

Expression von Genen, die für Virulenz-assoziierte Proteine kodieren, kontrolliert. agr

wurde erstmals von Recsei et al. 1986 als globaler Regulator von S. aureus beschrieben

und nimmt eine Schlüsselfunktion in der Kontrolle der Expression von Exoproteinen ein

(54).

Das Regulator-Gen agr repräsentiert ein „quorum-sensing-System“, welches über die

bakterielle Dichte von S. aureus reguliert wird. Dabei werden sogenannte

autoinduzierende Peptide (AIP) sezerniert, die in Abhängigkeit von der bakteriellen

Populationsdichte zur Aktivierung des Regulators führen. Es werden vier verschiedene

agr-Gruppen I-IV synthetisiert. Die AIPs induzieren die Aktivierung des

Zwei-Komponenten-System von S. aureus derselben agr-Gruppe, während die AIPs

einer anderen agr-Gruppe den Regulator inhibieren. Das agr-Operon besteht aus den

beiden Promotoren P2 und P3, die für die Produktion der Transskriptionseinheiten RNA

II und RNA III verantwortlich sind (45). Das P3-Transkript RNA II besteht aus dem

Operon agrA, -B, -C und -D, die alle für die Aktivierung des Promotors P2 und die

folgende RNA III Transkription benötigt werden. RNA III ist das agr-Effektormolekül,

das im Wesentlichen für die Kontrolle der Synthese von Oberflächenproteinen und

extrazellulären Proteinen verantwortlich ist (44).

Die einzelnen vier agr-Gruppen werden mit verschiedenen S. aureus-bedingten

Krankheiten assoziiert. So wird die agr-Gruppe III mit dem „toxic-shock-Syndrom“ in

Verbindung gebracht (41) und die Gruppe IV korreliert mit dem „staphylococcal-

scaled-Skin-Syndrom“ (29). Bei den aus CF-Patienten isolierten S. aureus-Isolaten

konnte keine Korrelation zu einer bestimmten agr-Gruppe gefunden werden (32).

Bei RNA III handelt es sich um den agr-Effektor, der für das δ-Hämolysin Gen kodiert

und für die agr-vermittelte Regulation verantwortlich ist (44). Es agiert wechselseitig,

indem es die Transkription der meisten extrazellulären Proteine aktiviert und im

Gegenzug viele Oberflächenproteine inhibiert. So werden hla und spa von RNA III

reguliert, indem RNA III mit dem hla Transkript interagiert und dessen Translation

erleichtert (40). Die Unterdrückung von spa geschieht nicht nur auf


14

Transkriptionsebene, sondern auch auf der RNA III-vermittelten Ebene der Translation

und ebenso durch den Abbau der spa-mRNA mit Hilfe der RNase III (27).

Der agr-Lokus spielt eine wichtige Rolle bei der Virulenz von S. aureus im Tiermodell

und daher wird schlussfolgernd vermutet, dass er ebenso eine Rolle bei humanen

Infektionen spielt. Obwohl die meisten klinischen S. aureus-Isolate, die bei humanen

Infektionen isoliert werden, agr+ sind, gibt es mehrere Berichte über die Isolation von

agr-defekten Mutanten aus Materialen infizierter Patienten. Es ist bekannt, dass der

agr-Lokus in vitro sehr labil ist.

Traber et al. beschäftigten sich mit Mutationen im agr-Lokus von klinischen S. aureus-

Isolaten und kamen zu der Erkenntnis, dass die Mutationen im Verlauf der Infektion

zustande gekommen waren (57).

Eine Studie von Goerke et al. kam zu dem Schluss, dass die Aktivität von agr bei einer

Infektion mit S. aureus bei der zystischen Fibrose keine wesentliche Relevanz hat. Sie

konnten zeigten, dass RNA III in den klinischen S. aureus-Isolaten nur gering

exprimiert wurde, was für ein inaktives agr in vivo sprach (21).

2.4.2 Der sar-Regulator

Bei sar (staphylococcal accessory regulator) handelt es sich um einen

Regulationslokus, der das agr-Operon in dessen Funktion beeinflusst. Es ist aus drei

verschiedenen sich überlappenden Transkripten sarA, -B und -C aufgebaut, die ihren

Ursprung in den Promotoren P1, P2 und P3 nehmen. Die Arbeitsgruppe um Manna

analysierte 1998 die Expression dieser Promotoren, um die Aktivierung des sar-Lokus

zu untersuchen. Die maximale Expression wurde bei einer Verbindung der P2-P3-P1-

Promoteren beobachtet. Desweiteren wurde mit der Untersuchung der Expression bei

einer sigB-Mutante gezeigt, dass P3 sigB abhängig ist (39). So kann sigB die Expression

von sarA steigern während es gleichzeitig die Expression von agr reduziert (3). Die

Expression der drei Transkripte variiert während des Wachstumszyklus, mit einem

Maximum der Expression von sarA und -B in der frühen exponentiellen Phase und von

sarC in der späten stationären Phase (2). sarA selbst ist in der Lage seine Produktion zu

unterdrücken, indem es die Transkription von P1 und P3 limitiert (12).


15

Darüber hinaus ist sar notwendig für die agr-abhängige Regulation von RNA III (7).

Ebenso hat sar einen Einfluss auf die Transkription der Exoproteine α- und β-

Hämolysin (8).

2.4.3 Der sae-Regulator

Der Lokus staphylococcal accessory gene (sae) besteht aus einem Zwei-Komponenten-

Signaltransduktionssystem, das für die Gene saeR (response regulator), saeS (Histidin

Proteinkinase), saeQ (Membranprotein) und saeP (Lipoprotein) kodiert und das eine

Schlüsselfunktion in der Genregulation der Exoproteine aufweist. Es beeinflusst deren

Produktion während der Wachstumsphase und agiert auf der Transkriptionsebene.

Gesteigert wird die Expression von α- und β-Hämolysinen (hla, hlb), DNase und

Koagulase (coa). In einigen Fällen scheint es sich synergistisch zu agr zu verhalten. Es

findet aber keine Beeinflussung der Regulationsgene agr, sarA und σB statt, wobei diese

Gene allerdings im Gegenzug die Transkription von sae beeinflussen (46). sae wird vor

allem in der postexponentiellen Phase transkribiert (19).

2.4.4 Der sigB-Regulator

Das Operon für den alternativen Stress-Sigma-Faktor B (sigB) besteht aus vier Genen,

rsbU, rsbV, rsbW und sigB, dem ein σA-ähnlicher Promotor vorausgeht und das eine

innere σB-ähnliche Promotorsequenz enthält (63). Der alternative Sigma Faktor σB spielt

eine wichtige Rolle in der Regulation der Exoproteine und verhält sich generell

antagonistisch zu agr und kontrolliert zumindest teilweise die Transkription des

globalen Regulatorgens sar (14). Eine Inaktivierung des σB-Gens scheint im Vergleich

zum Wildtyp (RsbU-) zu einer gesteigerten Expression von sae zu führen (46).

Die Arbeitsgruppe um Gertz identifizierte 1999 das Alkalische-Schock-Protein asp23,

dessen Gen vom alternativen Stress-Sigma Faktor σB transkribiert wird und damit einzig

und allein von sigB abhängig ist. Dadurch wird asp23 zu einem idealen Marker, um die

Aktivität von sigB zu messen (18).

Phänotypisch zeigt eine ∆σB-Mutante eine verminderte Pigmentierung, eine

beschleunigte Sedimentierung und eine höhere Sensitivität gegenüber Katalase in der

stationären Phase (36).


16

2.4.5 Die Hämolysine

Bekannt sind vier Membran schädigende Hämolysine, die von jedem Stamm exprimiert

werden können. Dazu gehören das α-, β-, γ- und das δ-Hämolysin bzw. -Toxin. Sie sind

zytotoxisch und begünstigen die Invasion des Erregers ins Gewebe.

Das hla-Gen kodiert für das α-Hämolysin und ist eines der am besten untersuchten

Virulenzfaktoren von S. aureus. Es wird in seiner Expression von den drei Loki agr,

sarA und sae reguliert. Eine Mutation im sae Gen führt zu einer erheblich verminderten

Expression von hla in vivo und in vitro während Mutationen in agr und sarA dagegen

keine Konsequenz auf die hla-Expression in vivo aufwiesen (20).

Das α-Toxin bildet Poren in der Zellmembran der Zielzellen, vor allem der

Erythrozyten, und führt dort zur osmotischen Lyse. Weiterhin stimuliert das α-Toxin die

Apoptose von Lymphozyten (30). Viele Studien zeigen, dass α-Toxin die S. aureus-

Infektion begünstigt und besonders bei durch S. aureus-induzierten Pneumonien ein

wichtiger Virulenzfaktor ist (53). Denn eine hla-Mutante war im Mausmodell weniger

virulent als der α-Toxin produzierende Elternstamm (62).

Das β-Hämolysin ist ebenfalls ein zytolytisches Toxin, welches in seiner Funktion wie

eine Sphingomyelinase agiert (60). Aarestrup et al. fanden 1999 heraus, dass nur 11%

von humanen Nasenabstrichen Gesunder und 13% von septischen Isolaten β-Hämolysin

positiv waren; allerdings waren Isolate von Rindern mit Mastitis zu 72% positiv. Bei

Versuchen in vitro wurde deutlich, dass das β-Hämolysin antagonistisch zum α-Toxin

reagiert, indem das β-Hämolysin an der Membran der Erythrozyten bindet und damit

die Fähigkeit des α-Toxins an dieser zu binden und zu multimerisieren inhibiert. Die

Wirkung von β-Hämolysin auf Blut-Agar wird als „hot-cold-lysis“ bezeichnet, da sich

die Hämolyse der Erythrozyten nach Inkubation unter Kälte deutlich klarer darstellt als

unter normalen Bedingungen bei 37°C (28).

2.4.6 Das Protein A

Das „staphylococcal“ Protein A (spa) ist ein wichtiger Virulenzfaktor, der ebenfalls

über agr reguliert wird. Er soll besonders bei S. aureus-induzierten Pneumonien als

inflammatorischer Faktor eine Rolle spielen (22). Bei SpA handelt es sich um ein in der

Zellwand von S. aureus verankertes Oberflächenprotein, das in über 90% der S. aureus-


17

Stämme vorkommt (61). Es gehört zur Gruppe der MSCRAMM (microbial surface

components recognizing adhesive matrix molecules) (56). SpA bindet an die FC-Region

des IgG und verhindert dadurch die Antikörper-vermittelte Opsonierung und

beeinträchtigt so die Phagozytose (17). Ebenso bindet es den von-Willebrand-Faktor,

ein Serum-Glykoprotein, das die Plättchenaggregation induziert, und an TNFR1, einen

Rezeptor des Tumor-Nekrose-Faktors α (22). In früheren Studien konnte gezeigt

werden, dass SpA als Virulenzfaktor in Mausmodellen mit septischer Arthritis oder

Pneumonien eine wichtige Rolle spielt (49). Außerdem wurden in PVL-positiven CA-

MRSA-Isolaten eine verstärkte Produktion von SpA beobachtet (37).

Im Gegensatz zu den Exoproteinen wird spa kontinuierlich bis zur stationären Phase im

Wachstumszyklus transkribiert. Man geht davon aus, dass agr und sar die spa-

Produktion auf Transkriptionsebene regulieren, indem sie dessen Synthese unterdrücken

(10). Somit führt eine Inaktivierung von agr zu einem Anstieg des spa-Transkripts.

Sobald es aber zur Induktion des Effektorgens RNA III kommt, wird die Synthese von

spa eingestellt (58).

2.5 Bestimmung der Genexpression mittels Real-Time-PCR

Das Verfahren der quantitativen Real-Time PCR wurde erstmals 1992 von Higuchi et

al. beschrieben. Die Zugabe von Ethidiumbromid in den Reaktionsansatz ermöglichte

die simultane Amplifikation der doppelsträngigen DNA-Sequenzen und die Detektion

des Produkts durch den Anstieg der Fluoreszenz (24).

Zur Normalisierung der experimentellen Fehler ist es notwendig, die Transkription der

untersuchten Gene zur Transkription interner Referenzgene ins Verhältnis zu setzen.

Diese Gene werden als Haushalts-Gene bezeichnet, da sie im Metabolismus der

Bakterien konstitutiv und nicht-reguliert exprimiert werden und nicht durch äußere

Einflüsse, Zelltyp oder Zellstadium beeinflusst werden. So werden zur Normalisierung

sowohl ein als auch mehrere Haushalts-Gene verwendet, wobei die Verwendung

mehrerer Haushalts-Gene zu exakteren Ergebnissen in der RT-PCR führt, besonders

dann, wenn kleinere Änderungen in der Expression festgestellt werden sollen (47).

Die RT-PCR beruht auf dem Prinzip der konventionellen PCR. Der Unterschied

zwischen beiden Methoden besteht darin, dass bei der qRT-PCR die Messung des


18

Amplifikats quantitativ in Echtzeit erfolgt. Die Quantifizierung erfolgt mit Hilfe von

Fluoreszenz-Messungen am Ende eines jeden PCR-Zyklus. Eine Möglichkeit, die

Fluoreszenz zu messen, ist der Gebrauch von interkalierenden Farbstoffen, wie das

SYBR Green I, das sich in die doppelsträngige DNA einlagert. Die Menge der

gemessenen Fluoreszenz erhöht sich exponentiell mit jedem weiteren PCR-Zyklus und

wird als relatives Maß für die amplifizierte Menge des Genfragmentes verwendet. Der

Vorteil des SYBR Green I besteht darin, dass es hitzestabil, selektiv für dsDNA und

hoch sensitiv ist (64).

Mit der RT-PCR gelingt es, die Transkription der interessierenden Gene zu messen.

Dazu muss zur Bestimmung der Genexpression in einem ersten Schritt die RNA der

Bakterien extrahiert werden. Als nächstes werden für die Amplifikation der cDNA zwei

Oligonukelotid-Primer benötigt, die die cDNA an beiden Enden flankieren. Dann wird

die cDNA durch reverse Transkription aus der ursprünglichen RNA synthetisiert. Die

eigentliche Reaktion der RT-PCR besteht aus Denaturation, Annealing und Elongation

(Abb. 2) und wird durch die Veränderung der Temperatur eingeleitet.

Abb. 2: RT-PCR Zyklus aus (34)

Zu Beginn des Zyklus wird eine hohe Temperatur von üblicherweise 95°C benötigt, um

die beiden Stränge der cDNA auf zu trennen. Die Höhe der Schmelztemperatur und die

Dauer des Schmelzvorganges sind abhängig von der Länge und der Sequenz des zu


19

amplifizierenden DNA-Abschnittes. Damit sich die Primer an die DNA anlagern

können, wird die Temperatur gesenkt. Die Höhe dieser Temperatur hängt von den

Primern ab. Am Ende des Zyklus wird die Temperatur auf 72°C gesetzt. Das ist das

Optimum für die Amplifikation des DNA-Abschnittes (34).

Um die PCR-Produkte in Echtzeit messen zu können, lagert sich der

Fluoreszenzfarbstoff während der Amplifikation in die amplifizierte doppelsträngige

DNA ein. Zu Beginn der Reaktion ist das Fluoreszenzsignal schwach und reflektiert

dementsprechend nur eine kleine Menge an PCR-Produkt. Mit der Akkumulation des

Produktes kommt es im Verlauf zu einem exponentiellen Anstieg des Signals. Zum

Ende hin pendelt sich dies durch Sättigung auf dem Höhepunkt ein. Im Verlauf

überschreitet das Signal eine Schwelle, deren Schnittpunkt als Ct-Wert bezeichnet wird.

Der Ct-Wert gibt an, wie viele Zyklen benötigt werden, um diese Schwelle zu

überschreiten.

2.6 Fragestellung und Ziel dieser Arbeit

Die vorliegende Arbeit baut auf eine über zwei Jahre laufende multizentrische Studie

auf, in der aus 17 Mukoviszidose-Zentren Untersuchungsmaterial von 195 Patienten

mikrobiologisch untersucht wird und die S. aureus-Isolate besonders charakterisiert

werden, um durch Untersuchung verschiedener patienten- und pathogen-spezifischer

Parameter eine Unterscheidung zwischen S. aureus-Kolonisation und -Infektion treffen

zu können. Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um Nasen-, Rachenabstriche

und Sputum. Vierteljährlich werden die Materialien von den Mukoviszidose-Patienten

eingesandt und aus ihnen die S. aureus-Stämme isoliert.

In dieser Arbeit wurden S. aureus-Isolate, die auf Columbia-Blut- und Schaedler-Agar

ein bestimmtes Wachstumsmuster zeigten, hinsichtlich ihrer Genexpression mittels

Real-Time PCR untersucht. Dabei wurde der Frage nachgegangen, ob sich ein

Zusammenhang zwischen dem Wachstum der S. aureus-Isolate in Bezug auf

Hämolyseverhalten und Pigmentierung auf Columbia-Blut-Agar, bebrütet bei 37ºC, und

Schädler-Agar, bebrütet bei 37ºC unter 5% CO2, und dem Transkriptionsprofil dieser

Isolate ein Bezug auf die Aktivität der Regulatoren agr, sigB und sae und der

abhängigen Virulenzgene hla und spa herstellen lässt.

3 Material und Methoden

20


3.1 Materialien

3.1.1 Bakterielle Stämme

Die klinischen S. aureus-Isolate, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden,

stammen aus einer multizentrischen prospektiven Observationsstudie von

Mukoviszidose-Patienten. Die Studie ist auf www.clinicaltrials.gov unter der

Kennzeichnung NCT00669760 abrufbar.

Es wurden 23 S. aureus-Stämme hinsichtlich ihres phänotypischen Erscheinungsbildes

auf Columbia-Blut- und Schaedler-Agar und ihrer Genexpression hin untersucht. Bei

den 23 Stämmen handelt es sich dabei um drei Wildtyp-Laborstämme (Tabelle 1), vier

isogene Deletions-Mutanten (Tabelle 2) und 16 klinische Isolate (Tabelle 3).

Tabelle 1: Laborstämme

Stamm Beschreibung Referenz

SH 1000 8325-4 rsbU+ (26)

RN 6390 genetischer Hintergrund dem von 8325-4 sehr

ähnlich; natürliche 11bp Deletion im rsbU Gen (42,50)

8325-4 Wildtyp, Standard Laborstamm (43,26)

Tabelle 2: Mutanten

Stamm Beschreibung Referenz

RN 6911

(RN 6390 ∆agr)

von RN 6390 abstammend, in dem der agr Lokus durch das tetM-Gen ersetzt wurde

(44)

ALC 136

(RN 6390 ∆sar)

isogenetische Mutante von RN6390 mit einer

sarA::ermC Mutation

(10)

ALC 135

(RN 6390 ∆agr/sar)

RN6390 mit agr::tetM und sar::Tn917LTV1 Insertion

(9)

ALC 1001

(RN 6390 ∆sigB)

sigB-Mutante von RN6390 abstammend (11)


21

Tabelle 3: klinische Isolate

Stamm Referenz

S 179 I aktuelle Studie

S 198 II „

S 348 I „

S 385 IV „

S 376 I „

S 501 II „

S 516 I „

S 568 I „

S 592 II „

S 605 I „

S 66 I „

S 1344 „

S 1365 I „

S 1365 II „

S 1368 II „

S 1368 III „

3.1.2 Chemikalien

- BBL™ Columbia-Blut-Agar BD, USA

Pro Liter: pankreatisch abgebautes Casein 10g

peptisch abgebautes Fleisch 5g

Hefeextrakt 5g

pankreatisch abgebautes Herzmuskelgewebe 3g

Maisstärke 1g

Natriumchlorid 5g

Agar 13,5g

5% steriles, defibriniertes Blut

- Schaedler-Agar BD, USA

Pro Liter: pankreatisch abgebautes Casein 8,2g

peptisch abgebautes Tiergewebe 2,5g

papainisch abgebautes Sojamehl 1g

Glucose 5,8g

Hefeextrakt 5g

Natriumchlorid 1,7g


22

Dikaliumphosphat 0,8g

L-Cystin 0,4g

Hämin 0,01g

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 3g

Agar 13,5g

- Bacto™ Tryptische-Soja-Bouillon BD, USA

Pro Liter: pankreatisch abgebautes Casein 17g

papainisch abgebautes Soja 3g

Dextrose 2,5g

Natriumchlorid 5g

Dikaliumphosphat 2,5g

- Brain-Heart-Infusion (Hirn-Herz-Bouillon) Merck, Darmstadt

Pro Liter: Nährsubstrat (Hirn-, Herzextrakt u. Peptone) 27,5g

D(+)-Glucose 2,0g

Natriumchlorid 5,0g

di-Natriumhydrogenphosphat 2,5g

- LiChrosolv® Wasser für die Chromatographie Merck, Darmstadt

- RNA Protect ® Qiagen, Hilden

- FastRNA® Pro Blue Kit MP Biomedicals, Eschwege

RNApro™ Solution

DEPC-H2O

Lysing B Matrix

- Quantitect® Reverse Transcription Kit Qiagen, Hilden

gDNA Wipeout Buffer, 7x

Quantiscript® Reverse Transcriptase

Quantiscript RT Buffer, 5x

RT Primer Mix

RNase-Free Water

- iCycler iQ™ PCR Plates, 96 well Bio-Rad, USA

- iQTM SYBR green Supermix Bio-Rad, USA

- qPCR EvaGreen® Mastermix (5x concentrated) Segenetic, Borken

+ Fluorescein 100x concentrated Segenetic, Borken


23

3.1.3 Geräte

- Fast Prep FP120 Cell Disrupter Qbiogene, Frankreich

- Megafuge 1.OR Heraeus Instruments, Osterode

- Eppendorf Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg

- Photometer Ultrospec 1100pro AmershamBiosciences, USA

- Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg

- Biophotometer 6131 Eppendorf, Hamburg

- iQ™5 Multicolor Real-Time PCR Detection System Bio-Rad, USA

- iCycler Bio-Rad, USA

3.1.4 Software

Bio-Rad iQ™5 Optical System Software, Version 2.1 Bio-Rad, USA

3.2 Methoden

3.2.1 Bakterienanzucht auf Columbia-Blut- und Schaedler-Agar

Der Columbia-Blut- und Schaedler-Agar wurden im 3-Ösen-Ausstrich mit S. aureus

beimpft und über Nacht im Brutschrank bei 37°C bebrütet, wobei der Columbia-Blut-

Agar unter aeroben Bedingungen und der Schaedler-Agar unter 5%igem CO2 bebrütet

wurde.

Am darauffolgenden Tag wurde die Beschreibung des Phänotyps der S. aureus-

Kolonien auf Blut- und Schaedler-Agar mit Hilfe eines standardisierten

Beurteilungsbogens (Anhang) durchgeführt, der für die CF-Studie entwickelt wurde.

Beurteilt wurden Hämolysegrad, β-Toxin, Pigmentierung und Größe der Kolonien,

Wachstum und Konsistenz. Der Hämolysegrad wurde eingeteilt in die Stufen 0 bis 4,

wobei „Null“ keine Hämolyse und „vier“ maximale Hämolyse bedeutete. Bei der

Pigmentierung wurde zwischen weiß, grau und gelb unterschieden. Die Größe der

Kolonien wurde von winzig über klein bis hin zu groß beschrieben. Beim Wachstum

gab es die Unterteilung in normal, klein und winzig. Die Konsistenz der Kolonien war

trocken, feucht oder schleimig.


24

Zur phänotypischen Charakterisierung wird normalerweise Blut-Agar verwendet. Das

zusätzliche Bebrüten der Stämme auf Schaedler-Agar wurde genutzt, da auf Schaedler-

Agar die Eigenschaften wie Hämolyseverhalten, Pigmentierung und Größe der

Kolonien häufig noch besser zur Ausprägung kommen.

3.2.2 Bakterienanzucht in Flüssigkulturen zur Ermittlung des

Wachstumsverlaufes

Für die Übernachtkultur (ÜNK) wurde in ein Reagenzröhrchen mit 5 ml BHI eine

Bakterienkolonie von einer Blutagarplatte eingeimpft. Die ÜNK wurde anschließend im

Schüttelwasserbad bei 37°C mit 160 rpm (revolutions per minute) für ca. 16 Std über

Nacht bebrütet. Anschließend wurde die Hauptkultur in einem 500 ml Schikanekolben

mit 50 ml BHI aus der ÜNK mit einer Start-OD578nm von 0,1 beimpft.

Im Schüttelinkubator fand die Anzucht bei 37°C und 160 rpm statt. Es wurde stündlich

die optische Dichte OD578nm mit dem Photometer bis zum Erreichen der stationären

Phase gemessen, wobei der Messbereich der OD578nm zwischen 0,05-0,3 liegen sollte.

Bei einer OD578nm > 0,3 wurde die Probe mit BHI 1:10 bzw. 1:100 verdünnt und erneut

gemessen. Somit wurde der Verlauf der Wachstumskurve mit früher exponentieller,

später exponentieller und stationärer Phase ermittelt (Abb. 3).

Abb. 3: Bestimmung des Wachstumskurvenverlaufes (WK) zu drei unterschiedlichen

Zeiten des klinischen Isolates S 605 I

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8

OD

57

8 n

m

Zeit (h)

1. WK

2. WK

3. WK


25

3.2.3 RNA–Isolierung

Die RNA-Isolierung der S. aureus-Stämme erfolgte nach Anzucht dieser auf Blut- bzw.

Schaedler-Agar und in dem Flüssigmedium Brain-Heart-Infusion (BHI) mit Hilfe des

FastRNA® Pro Blue Kit von qBiogene.

3.2.3.1 RNA-Isolierung von Columbia-Blut- und Schaedler-Agar

Es wurde 500 µl RNA Protect in einem 2 ml biopur Eppendorf Zentrifugenröhrchen

vorgelegt, anschließend der gesamte erste Ausstrich von der Agarplatte zugegeben und

beides gründlich homogenisiert. Dann wurde die Probe für fünf Minuten bei 5000 g bei

Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Nach diesem

Arbeitsschritt konnte das Pellet auch bei -20°C für einige Zeit eingefroren werden.

Die nächsten Arbeitsschritte durften nur mit speziellen Pipetten, gestopften

Pipettenspitzen, Handschuhen und unter dem Abzug durchgeführt werden, um jegliche

Verunreinigung durch Kontamination oder Partikel aus der Luft zu vermeiden.

Im nächsten Schritt wurde das Pellet in 1 ml RNApro™ Solution durch gründliches

Durchmischen im Vortex resuspendiert und in die Lysing B Matrix überführt. Diese

wurde in das Homogenisationssystem FastPrep® gesetzt und für 40 s bei einer

Aufschlussintensität von 6 gerüttelt, um die bakteriellen Zellen zu lysieren.

Anschließend wurde die Probe bei 12000 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Der

Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Zentrifugenröhrchen überführt, für 5 min bei

Raumtemperatur inkubiert und anschließend 300 µl Chloroform hinzugefügt und 10 s

im Vortex durchmischt. Nach weiteren 5 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur

wurde wieder bei 12000 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Die oberste RNA-enthaltende

Phase wurde, ohne die Interphase zu zerstören, abpipettiert und in ein neues

Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Hinzufügen von 500 µl absolutem Ethanol und

fünfmaligem Invertieren folgte eine mindestens 30 minütige Lagerung bei -20°C.

Anschließend wurde die Probe erneut bei 12000 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert und

der Überstand verworfen. Das weiße Pellet am Rand des Zentrifugenröhrchens, welches

die aufgereinigte RNA enthält, wurde mit 500 µl kaltem 75%igen Ethanol, hergestellt

mit DEPC-H2O, gewaschen und der Ethanol verworfen. Nach fünfminütigen Trocknen


26

bei Raumtemperatur wurde das Pellet in 100 µl DEPC-H2O resuspendiert. Eine

Lagerung der Probe war bei -80°C für längere Zeit möglich.

3.2.3.2 RNA-Isolierung aus der BHI-Flüssigkultur

Für die Isolierung der RNA aus der Flüssigkultur wurde der gleiche Ansatz des BHI-

Mediums verwendet wie zur Ermittlung des Wachstumsverlaufes.

An den zuvor ermittelten Zeitpunkten für die frühe exponentielle, späte exponentielle

und stationäre Phase wurden Proben entnommen. Zum Zeitpunkt der frühen

exponentiellen Phase wurden 2 ml, zu den beiden anderen Zeitpunkten je 500 µl Kultur

abpipettiert. Die Proben wurden im Zentrifugenröhrchen zu gleichen Teilen mit RNA

Protect versetzt und anschließend im Vortex gründlich durchmischt. Sie wurden zum

Inkubieren 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend bei 4000 rpm

für 10 min bei 20°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet bei -

20°C zur Lagerung eingefroren oder es wurde die RNA-Isolierung (s.o.) direkt

angeschlossen.

3.2.4 Bestimmung von Konzentration und Reinheit der RNA

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration wurde die RNA im Verhältnis 1:100 mit

HPLC-H2O und für die Bestimmung der Reinheit ebenfalls im Verhältnis 1:100 mit 10

mM Tris HCL versetzt. Gemessen wurde nach Eichen der Leerprobe mit dem

Eppendorf Photometer. Der Quotient aus A260nm/A280nm gab einen Hinweis auf die

Reinheit der RNA. Er lag idealerweise zwischen einer OD von 1,8 und 2,0, da ein Wert

unter 1,8 für eine Verunreinigung der Probe sprach und ein Wert von 2 eine optimale

Aufreinigung widerspiegelte.

3.2.5 cDNA-Transkription

Zur Transkription der RNA in cDNA wurde das QuantiTect® Reverse Transcription Kit

von der Firma Qiagen verwendet.

Sämtliche Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Das RNA-Template wurde auf

Eis aufgetaut, ebenso die Reagenzien gDNA Wipeout Buffer, Quantiscript Reverse


27

Transcriptase, Quantiscript RT Buffer und der RT Primer Mix. Das RNAse-freie

Wasser wurde bei Raumtemperatur aufgetaut. Folgender Reaktionsansatz wurde zur

Elimination der genomischen DNA verwendet:

2 µl gDNA Wipeout Buffer 7x sowie eine nach Konzentrationsbestimmung berechnete

Menge RNA wurden in ein 1,5 ml biopur Zentrifugenröhrchen gegeben und zuletzt

wurde RNAse freies Wasser auf einen Gesamtansatz von 24 µl ergänzt. Die Probe

wurde 2 min bei 42°C inkubiert. Danach wurde der Reverse-Transkriptions-Mastermix

zur Probe hinzugefügt, bestehend aus 2 µl Quantiscript Reverse Transkriptase, 8 µl

Quantiscript RT Buffer 5x und 2 µl RT Primer Mix. Es folgte ein weiterer

Inkubationsschritt für 15 min bei 42°C und direkt anschließend für 3 min bei 95°C, um

die reverse Transkriptase zu inaktivieren. Die erhaltene cDNA wurde bei -20°C

gelagert.

3.2.6 Real Time-Polymerasekettenreaktion

Die quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) wurde in der vorliegenden Arbeit

verwendet, um das Transkriptionsprofil mehrerer wichtiger regulatorischer Gene von

S. aureus zu quantifizieren und mit dem phänotypischen Erscheinungsbild auf

Columbia-Blut- und Schädler-Agar in Verbindung zu bringen. Dazu wurden aus Agar-

und Flüssigkulturen RNA-Isolierungen vorgenommen, die anschließend in

komplementäre DNA umgeschrieben wurden. Mit der cDNA wurde dann die RT-PCR

durchgeführt.

Die Real-Time-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) leitet sich von der ursprünglichen

PCR ab, bei der DNA-Abschnitte mit Hilfe von Primern amplifiziert werden. Der

Unterschied in der RT-PCR liegt darin, dass bei der Amplifikation der DNA-Abschnitte

ein Fluoreszenzfarbstoff in die DNA interkaliert, der proportional zur PCR

Produktmenge ist(34). Damit lässt sich in Echtzeit das PCR-Produkt ermitteln. Die

Zyklen, die benötigt werden, um das Produkt zu erhalten, gestatten einen Rückschluss

auf die in der Probe vorhandene Menge der DNA.

Zur Normalisierung der RNA-Expression der Regulator-Gene dienen sogenannte

Haushalts-Gene oder auch Referenz-Gene genannt. Bei ihnen handelt es sich um Gene,

die konstitutiv und nicht reguliert exprimiert werden, deren Transkription somit


28

unabhängig vom Zellstadium, Zelltyp und äußeren Einflüssen ist. Als Referenzgen

wurde gyrB eingesetzt (21).

Tabelle 4: Sequenzen der Referenzgene

Oligonukleotid

Forward

Reverse

aro E 5‘- CTA TCC ACT TGC CAT CTT TTA T - 3‘

5’- ATG GCT TTA ATA TCA CAA TCC C - 3’

gmk 5’- AAG GTG CAA AGC AAG TTA GAA - 3’

5’ - CTT TAC GCG CTT CGT TAA TAC - 3’

gyr B 5’ - TGG TTC AAT GGA TGG AGA TGG - 3’

5’ - CAT ACG AGC CTT ATT CAC TTG G - 3’

Tabelle 5: Sequenzen der in dieser Arbeit untersuchten Gene

Oligonukleotid

Forward

Reverse

Referenz

hla 5‘ - TTT CAC CAG ACT TCG CTA CAG - 3‘

5’ - CCA ATT TGT TGA AGT CCA ATG - 3’

(5)

sae 5‘ - CAA TTT ACG CCT TAA CTT TA - 3‘

5’ - TAG TCA TAT CCC CAA ACT T - 3’

diese Arbeit

rna III 5‘ - TGA ATT TGT TCA CTG TGT CG - 3‘

5‘ - AGG AAG GAG TGA TTT CAA TG - 3‘

(5)

asp23 5‘ - CAA GAA CAA AAT CAA GAG CCT CAA T - 3‘

5‘ - CTT CAC GTG CAG TAC CA - 3‘

(6)

spa 5‘ - GCA ACG TAA CGG CTT CAT TC - 3‘

5’ - CTT TCG GTG CTT GAG ATT CG - 3’

diese Arbeit

Der Reaktionsansatz setzte sich aus folgenden Reagenzien zusammen:

11 µl HPLC-H2O

12,5 µl SYBR Green Supermix

1 µl Primer Mix (enthielt forward und reverse)

0,5 µl cDNA

entsprachen insgesamt 25 µl Gesamtreaktionsansatz

Es wurde ein Mastermix mit H2O, SYBR Green und Primer-Mix vorgelegt und

anschließend die cDNA hinzugefügt.


29

Folgendes Temperaturprofil wurde für die Amplifikation der cDNA verwendet:

Initiale Denaturierung: 1 min bei 95°C

Annealing: 35x 0:10 min bei 95°C

0:30 min bei 56°C

0:30 min bei 72°C

Elongation: 81x Anstieg der Temperatur von initial 55°C in 0,5°C

Schritten alle 0:10 min bis auf 95°C

Die relative Expression der Transkripte wurde als Anstieg (n-Fold) in Bezug zu den

Werten der Haushalts-Gene ausgedrückt(6).

4 Ergebnisse

30

4 Ergebnisse

4.1 Wachstumsverhalten auf Columbia-Blut- und Schaedler-Agar

Zunächst wurden die S. aureus-Kolonien phänotypisch charakterisiert. Bestimmt

wurden die Pigmentierung, die Größe, das Hämolyseverhalten, der Nachweis von β-

Toxin sowie die Konsistenz der Kolonien. Bei der Pigmentierung wurden weiße, gelbe

und graue Kolonien unterschieden. Die Einteilung der Hämolyse reichte von 0 (keine

Hämolyse) bis 4 (maximale Hämolyse). Die Konsistenz wurde definiert von trocken

über feucht bis hin zu schleimig. Bei der Größe galt es winzige, kleine oder große

Kolonien zu beschreiben.

Wie in Kapitel 3.2.1 beschrieben, wurden die Isolate auf Columbia-Blut- und

Schaedler-Agar überimpft und über Nacht bei 37°C bebrütet, wobei der Schaedler-Agar

unter 5%igem CO2 inkubiert wurde. Ausschlaggebend für die Bebrütung auf Schaedler-

Agar war, dass einige Merkmale der Kolonien, wie die Pigmentierung oder auch die

Hämolyse durch α-Toxin und β-Toxin, deutlich stärker ausgeprägt waren als auf Blut-

Agar. Einen Einfluss auf das veränderte Wachstum der Kolonien auf Schaedler-Agar

wird auch die Bebrütung unter 5%igem CO2 gehabt haben; im Gegensatz zur Bebrütung

des Blut-Agars unter Raumluft.

Typischerweise wird S. aureus zur Analyse der Transkriptionsprofile in Flüssigkulturen

angezüchtet. Über die Untersuchung von S. aureus von Kulturplatten ist bisher wenig

bekannt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit zum einen das Transkriptionsprofil

sämtlicher Stämme zusätzlich mit dem Flüssigmedium BHI ermittelt und zum anderen

zur Korrelation wichtige Laborstämme (SH 1000; RN 6390; 8325-4) sowie deren

Regulator-Mutanten (agr-; sar-; agr-/sar-; sigB-) untersucht.

4 Ergebnisse

31

4.1.1 Häufigkeitsverteilung der Merkmale der klinischen Isolate

Die isolierten S. aureus Stämme aus dem Respirationstrakt der CF-Patienten zeigten auf

Blut-Agar in Hinblick auf die Farbe der Kolonien eine andere Häufigkeitsverteilung als

auf Schaedler-Agar. Zum Zeitpunkt der Berechnung der Häufigkeit befanden sich 740

klinische Isolate in der Studie.

Abb. 4 Häufigkeitsverteilung der Pigmentierung der Kolonien auf Blut- und Schaedleragar

Auf Blut-Agar traten weiße Kolonien mit 52% etwas häufiger auf als gelbe Kolonien

(46%). Auf Schaedler-Agar war das Verhältnis zugunsten der gelben Kolonien deutlich

verschoben. Diese traten in 72% der Fälle auf, im Gegensatz zu den weißen Kolonien

mit einem Anteil von nur 24 %. Graue Kolonien traten auf beiden Nährböden nur zu

einem sehr geringen Prozentsatz auf.

Abb. 5 Häufigkeitsverteilung der Hämolysestufe der Kolonien auf Blut- und Schaedler-Agar

gelbe Kolonien

42% weiße

Kolonien 52%

graue Kolonien

6%

Columbia-Blut-Agar

gelbe Kolonien

72%

weiße Kolonien

24%

graue Kolonien

4%

Schaedler-Agar

keine Hämolyse

31%

Hämolyse 1

25%

Hämolyse 2

25%

Hämolyse 3

14%

Hämolyse 4

5%

Columbia-Blut-Agar keine

Hämolyse 5% Hämolyse

1 14%

Hämolyse 2

20%

Hämolyse 3

23%

Hämolyse 4

38%

Schaedler-Agar

4 Ergebnisse

32

Die Verteilung der Hämolyse zeigte auf Blut- und Schaedler-Agar große Unterschiede

(Abb. 5). Auf Blut-Agar hatten die Kolonien ohne Hämolyse den größten Anteil mit

31%. Dagegen waren diese auf Schaedler-Agar nur mit 5% vertreten. Den größten

Anteil hatten auf Schaedler-Agar diejenigen mit der Hämolysestufe 4 mit 38%. Den

zweitgrößten Anteil mit 23% hatten hier die Kolonien mit Hämolysestufe 3. Auf

Blutagar trat Hämolysestufe 1 und 2 mit jeweils 25% auf.

Abb. 6 Häufigkeitsverteilung der β-Toxin-Expression der klinischen Isolate

Auf beiden Medien, Blut- und Schaedler-Agar, lag der Anteil der Kolonien, die kein β-

Toxin produzierten bei knapp über 90%.

kein β-Toxin 92%

β-Toxin exprimiert

8%

Columbia-Blut-Agar

kein β-Toxin 91%

β-Toxin exprimiert

9%

Schaedler-Agar

4 Ergebnisse

33

4.1.2 Das phänotypische Erscheinungsbild der Kolonien auf Columbia-Blut-

und Schaedler-Agar

Tabelle 6: Die Phänotypen der Laborstämme

Colu

mb

ia-B

lut-

Agar

Stamm SH 1000 RN 6390 8325-4

Hämolyse 3 3 4

β-Toxin nein ja nein

Pigmentierung gelb weiß weiß

Größe groß groß groß

Wachstum normal normal normal

Konsistenz feucht feucht feucht

Sch

aed

ler-

Agar

Hämolyse 4 4 4

β-Toxin ja ja nein

Pigmentierung gelb weiß weiß

Größe groß groß groß

Wachstum normal normal normal

Konsistenz feucht feucht feucht

Tabelle 7: Die Phänotypen der Mutanten

Colu

mb

ia-B

lut-

Agar Stamm agr- sar- agr-/sar- sigB-

Hämolyse 0 2 0 2

β-Toxin nein nein nein ja

Pigmentierung weiß weiß weiß weiß

Größe klein klein klein klein

Wachstum normal normal normal normal

Konsistenz feucht feucht feucht feucht

Sch

aed

ler-A

gar

Hämolyse 0 4 0 4

β-Toxin nein nein nein ja

Pigmentierung weiß weiß weiß weiß

Größe klein groß klein klein

Wachstum normal normal normal normal

Konsistenz feucht feucht feucht feucht

4 Ergebnisse

34

Die klinischen Stämme sind aus Nasen- und Rachenabstrichen sowie Sputumproben der

CF-Patienten isoliert worden. Die klinischen Isolate wurden in drei Gruppen unterteilt.

Die Gruppe I enthielt Stämme, die auf Blut-Agar keine Hämolyse vorwiesen. Die

Gruppe II bestand aus Isolaten die auf Blut-Agar eine geringe bis mittlere Hämolyse

aufwiesen und auf Schaedler-Agar ebenfalls stark hämolysierten. In der Gruppe III

wurden Isolate zusammengefasst, die sowohl auf Blut-Agar als auch auf Schaedler-

Agar eine starke Hämolysezone ausbildeten.

Tabelle 8: Die Phänotypen der Gruppe I

Colu

mb

ia-B

lut-

Agar Stamm S 198 II S 348 I S 385 IV S 1368 II S 1368 III

Hämolyse 0 0 0 0 0

β-Toxin nein nein nein nein nein

Pigmentierung gelb gelb weiß gelb gelb

Größe groß groß groß groß groß

Wachstum normal normal normal normal normal

Konsistenz feucht feucht feucht feucht feucht

Sch

aed

ler-A

gar

Hämolyse 0 1 2 3 3


Pigmentierung gelb gelb gelb gelb weiß




Tabelle 9: Die Phänotypen der Gruppe II

Colu

mb

ia-B

lut-

Agar Stamm S 66 I S 179 I S 516 I S 592 II S 376 I S 501 II

Hämolyse 1 1 2 2 3 3

β-Toxin nein nein nein nein nein nein

Pigmentierung gelb weiß gelb weiß gelb weiß

Größe groß groß groß groß groß groß

Wachstum normal normal normal normal normal normal

Konsistenz feucht feucht feucht feucht feucht feucht

4 Ergebnisse

35

Sch

aed

ler-A

gar

Hämolyse 2 4 3 4 4 4

β-Toxin ja nein nein nein nein ja

Pigmentierung gelb gelb gelb gelb gelb gelb

Größe groß groß groß groß groß groß

Wachstum normal normal normal normal normal normal

Konsistenz feucht feucht feucht feucht feucht feucht

Tabelle 10: Die Phänotypen der Gruppe III

Colu

mb

ia-B

lut-

Agar Stamm S 1365 I S 1365 II S 605 I S 1344 S 568 I

Hämolyse 4 4 4 4 4


Pigmentierung weiß weiß weiß weiß gelb




Sch

aed

ler-A

gar

Hämolyse 4 4 4 4 4

β-Toxin nein nein ja nein nein

Pigmentierung weiß gelb gelb weiß gelb




4.2 Der Wachstumsverlauf in den Flüssigkultur

Alle Stämme wurden dreimal im Flüssigmedium BHI (Brain Heart Infusion) unter

kontinuierlichem Schütteln bei 160 rpm angezüchtet, um den Wachstumsverlauf zu

ermitteln (Abb. 8). Für die Analyse der Genexpression wurden drei Zeitpunkte

bestimmt: die frühe exponentielle, die späte exponentielle und die stationäre Phase.

Zu Beginn der Versuchsreihe wurde das Nährmedium TSB verwendet. Dies führte bei

den Bakterien zu einem sehr verzögerten Anstieg beim Wachs tum in der exponentiellen

Phase, so dass das Erreichen der stationären Phase schwer zu ermitteln war. Zum

4 Ergebnisse

36

Vergleich wurden die gleichen Stämme im Flüssigmedium BHI angezüchtet und

zeigten dort einen fast idealen exponentiell logarithmischen Wachstumsverlauf, in dem

die stationäre Phase meist nach acht bis neun Stunden erreicht war (Abb. 7).

Abb. 7: Vergleich des Wachstumsverlaufs des klinischen Isolates S 605 I in BHI- und TSB-

Flüssigmedium

Abb. 8: Ermittlung des Wachstumsverlaufs zu drei verschiedenen Zeitpunkten (WK)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

OD

57

8 n

m

Zeit (h)

S 605I in TSB

S 605I in BHI

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8

OD

57

8n

m

Zeit (h)

S 605 I

1. WK

2.WK

3.WK

4 Ergebnisse

37

4.3 Die Ergebnisse der Real Time-PCR

Die RNA von den Kolonien der Blut- und Schaedler-Agarplatten und aus den

Flüssigkulturen mit folgender cDNA-Transkription wurde in drei unabhängigen Läufen

extrahiert. Die RT-PCR wurde mit jeder Probe doppelt durchgeführt. Zur Analyse der

Ergebnisse konnten daher von jeder Probe sechs Werte herangezogen werden, um den

Mittelwert und die Standardabweichung bestimmen zu können.

Es wurden die Transkription der Regulatoren agr, sae und sigB untersucht, sowie die

der Virulenzgene hla und spa. Für die Bestimmung der agr-Transkription wurde RNA

III und für die von sigB das sigB-abhängige Transkript asp23 untersucht. Als

Referenzgene wurden aroE, gmk und gyrB verwendet.

4.3.1 Das Transkriptionsprofil der Laborstämme und Mutanten

Um das Transkriptionsprofil der klinischen S. aureus-Isolate besser beurteilen und in

Bezug zur Regulation bekannter Laborstämme setzen zu können, wurden die drei

Laborstämme 8325-4, RN 6390 und SH 1000 sowie definierte Regulator-Mutanten

mitgeführt und hinsichtlich ihres Transkriptionsprofils beim Wachstum sowohl auf

Blut- und Schaedler-Agar als auch in der Flüssigkultur mit BHI untersucht.

4 Ergebnisse

38

4.3.1.1 Die Genexpression von 8325-4

Abb. 9: Genexpression des Laborstamms 8325-4 in der Flüssigkultur

Abb. 10: Genexpression des Laborstamms 8325-4 auf den Agarkulturen

8325-4, ein Standardlaborstamm, der eine sigB-Mutation aufweist, exprimierte in der

Flüssigkultur BHI die untersuchten Regulatoren und Virulenzgene wachstumsphasen-

abhängig unterschiedlich stark (Abb. 9). Vor allem in der späten exponentiellen und der

stationären Phase steigerte sich die Expression stark im Verhältnis zur frühen

0,02

1,42

0,65 0,63

1,34 1,07

0,07

1,04

1,30

0,08

1,26 1,30

0,45

1,34

1,02

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n

Wachstumsphasen der BHI-Flüssigkultur

8325-4

0,05

1,21

0,002 0,02

1,73 2,04

1,60

0,86

0,04 0,23

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

hla sae rna III asp23 spa hla sae rna III asp23 spa

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n

Blut-Agar Schaedler-Agar

8325-4

4 Ergebnisse

39

exponentiellen Phase. Der Regulator sae wurde zu allen drei Zeitpunkten erfolgreich

exprimiert, wobei die stärkste Transkription wie erwartet in der späten exponentiellen

Phase zu verzeichnen war. Das von sigB kontrollierte asp23 wurde trotz der sigB-

Defizienz insbesondere in der exponentiellen und stationären Phase erfolgreich

transkribiert. RNA III steigerte seine Expression von der frühen exponentiellen bis zur

stationären Phase stetig. Das Virulenzgen hla machte wie erwartet von der frühen zur

späten exponentiellen Phase einen großen Sprung hinsichtlich der relativen Menge der

Genexpression. In dieser Phase wurde das Maximum der Transkription erreicht.

Unerwartet und anders als in der beschriebenen Literatur war der Abfall des hla-

Transkripts in der stationären Phase. Das könnte möglicherweise auf das von uns

benutzte BHI-Medium zurück zu führen sein. Ähnlich sah es bei spa aus, wo auch die

maximale Expression des Gens in der späten exponentiellen Phase stattfand.

Auf Blut- und Schaedler-Agar entwickelte 8325-4 ein Hämolyseverhalten der Stufe 4,

bildete weiß pigmentierte große Kolonien, zeigte ein normales Wachstum und eine

feuchte Konsistenz (Abb. 10). Es wurde kein β-Toxin produziert. Im Vergleich zur

Flüssigkultur war die relative Menge der Genexpression beim Regulator sae sowohl auf

Blut- als auch auf Schaedler-Agar annähernd gleich hoch. Interessant war die fast nicht

vorhandene Transkription von RNA III auf Blut-Agar, wobei es auf Schaedler-Agar

auch wie oben erwähnt in der Flüssigkultur erfolgreich exprimiert wurde. Die

Transkription von asp23 fiel im Gegensatz zur Flüssigkultur auf Blut- und Schaedler-

Agar deutlich geringer aus. Das Virulenzgen hla zeigte eine stark erhöhte Expression

des Gens auf Schaedler-Agar im Vergleich zur Transkription auf Blut-Agar. Wie auch

in der Flüssigkultur wurde spa auf beiden Agarplatten erfolgreich exprimiert. Allerdings

war die Transkription auf Blut-Agar höher als auf Schaedler-Agar.

4 Ergebnisse

40

4.3.1.2 Die Genexpression von RN 6390

Abb. 11: Genexpression des Laborstamms RN 6390 in der Flüssigkultur

Abb. 12: Genexpression des Laborstamms RN6390 auf den Agarkulturen

RN 6390, ein Laborstamm, der einen ähnlichen genetischen Hintergrund hat wie der

Laborstamm 8325-4, weist ebenso wie der Stamm 8325-4 eine sigB-Mutation auf. Dies

führte zu der typischen weißen Farbe der Kolonien beim Wachstum auf Agar. In der

BHI-Flüssigkultur wurden alle fünf untersuchten Regulatoren und Virulenzgene

0,01

1,82

1,21

0,24

1,52

1,40

0,14

0,94

1,35

0,01 0,03 0,04

0,34

1,17 1,35

0

0,5

1

1,5

2

2,5

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


RN 6390

0,06

0,95

0,10 0,02

0,42

0,88

1,04

0,77

0,06

0,60

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


RN 6390

4 Ergebnisse

41

erfolgreich exprimiert (Abb. 11). Der Regulator sae transkribierte die größte Menge an

RNA in der späten exponentiellen Phase. Da eine Mutation im sigB-Gen vorliegt,

konnte die Transkription von asp23 in allen drei Phasen kaum nachgewiesen werden.

Das Effektorgen RNA III steigerte seine Expression von der frühen exponentiellen bis

zur stationären Phase, in der es sein Maximum erreichte. Wie auch schon vom

Laborstamm 8325-4 wurde hla in der späten exponentiellen Phase am stärksten

exprimiert. Das Virulenzgen spa wies die höchste Transkription in der stationären Phase

auf.

Auf Blut- und Schaedler-Agar zeigte RN 6390 ein starkes Hämolyseverhalten (Stufe 3),

die Kolonien waren weiß pigmentiert, groß, hatten ein normales Wachstum und eine

feuchte Konsistenz. Auf Blut- und Schädler-Agar wurde das β-Toxin exprimiert. Alle

fünf Gene wurden auf beiden Agarmedien transkribiert (Abb. 12). Der Regulator sae

zeigte sowohl auf Blut- als auch auf Schaedler-Agar eine ungefähr gleich hohe

Genexpression wie zum Zeitpunkt der stationären Phase in der Flüssigkultur.

Interessanterweise wurde asp23 auf beiden Agarmedien genauso gering exprimiert wie

in der Flüssigkultur. RNA III wurde auf Schaedler-Agar stärker exprimiert als auf Blut-

Agar. Ebenso sah es bei den Virulenzgenen hla und spa aus, bei denen die

Transkription auf Schaedler-Agar stärker ausfiel.

4 Ergebnisse

42

4.3.1.3 Die Genexpression von SH 1000

Abb. 13: Genexpression des Laborstamms SH 1000 in der Flüssigkultur

Abb. 14: Genexpression des Laborstamms SH 1000 auf den Agarkulturen

SH 1000, abstammend vom Laborstamm 8325-4 mit einer Komplementierung der

Deletion im sigB-Gen (rsbU+), zeigte ein ähnliches Transkriptionsverhalten in den drei

Wachstumsphasen (Abb. 13) der einzelnen Regulatoren sae, RNAIII und asp23 und des

Virulenzgens spa. Die Transkription in der Flüssigkultur war in der frühen

exponentiellen Phase gering und steigert sich bis zum Erreichen der stationären Phase.

Wie zu erwarten, erhöhte sich die Expression von asp23 von der späten exponentiellen

0,01 0,83

0,28 0,30 0,82 0,93

0,16

1,60

3,65

0,06 0,49

6,82

0,94

1,69 2,16

0

1

2

3

4

5

6

7

8

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


SH 1000

0,03

0,45

0,12

0,31 0,37

0,14

1,26

1,16

1,26

0,28

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


SH 1000

4 Ergebnisse

43

zur stationären Phase sehr stark, da es sich bei SH1000 um eine komplementierte sigB-

Mutation handelt und folglich war die Transkription von asp23 entsprechend hoch. Der

sae-Regulator zeigte keine großen Schwankungen zwischen den drei

Wachstumsphasen. Zwar war die Expression in der frühen exponentiellen Phase am

geringsten, bis zur stationären Phase kam es jedoch nur zu einem geringen Anstieg in

der Transkriptionsmenge. Bei RNA III, dem Effektorgen von agr, war die Expression in

der frühen exponentiellen Phase am niedrigsten und erreichte ihr Maximum in der

stationären Phase. Die erfolgreiche Expression von RNA III unterstrich auch die

positive Transkription des Virulenzgens hla, da dessen Expression durch RNA III

aktiviert wurde. hla erreichte sein Maximum in der späten exponentiellen Phase und

wurde als einziges Transkript in der stationären Phase in geringerer Menge produziert.

Obwohl spa, das für das Oberflächenprotein Protein A kodiert, normalerweise durch

RNA III supprimiert wird, zeigte sich die maximale Transkription der spa-RNA in der

stationären Phase.

Die Hämolyse von SH 1000 erreichte auf Schaedler-Agar Stufe 4 und war somit stärker

als auf Blut-Agar. Die Pigmentierung war auf beiden Agarplatten goldgelb, die

Kolonien wuchsen groß und hatten eine feuchte Konsistenz. Auf Schaedler-Agar konnte

jedoch im Gegensatz zum Blut-Agar die Hämolyse durch das β-Toxin beobachtet

werden. Abb. 14 zeigt das Transkriptionsprofil von SH 1000 nach Isolierung der RNA

von Blut- und Schaedler-Agar. Auf den ersten Blick fiel auf, dass alle untersuchten

Gene auf Schaedler-Agar stärker exprimiert wurden. Der Genregulator sae wurde auf

Schaedler-Agar stärker exprimiert als auf Blut-Agar und in der Flüssigkultur. RNA III

wies auf Schaedler-Agar eine höhere Expression als auf Blut-Agar auf. Die erfolgreiche

sigB-Transkription spiegelte sich ebenso auf den beiden Agarplatten wie in der

Flüssigkultur wieder, da asp23 auf Blut- und Schaedler-Agar erfolgreich exprimiert

wurde. Das Virulenzgen hla zeigte auf Blut- und Schaedler-Agar eine verminderte

Transkription als in der Flüssigkultur. Das spa-Transkript fand sich auf Blut- und

Schaedler-Agar in annähernd gleicher Menge.

4 Ergebnisse

44

4.3.1.4 Die Genexpression der ∆agr-Mutante RN 6911

Abb. 15: Genexpression der ∆agr-Mutante in der Flüssigkultur

Abb. 16: Genexpression der ∆agr-Mutante auf den Agarkulturen

Bei der ∆agr-Mutante RN 6911, abstammend von RN 6390, ist der agr-Lokus deletiert

und durch das tetM-Gen ersetzt, was dazu führte, dass das Effektorgen RNA III nicht

transkribiert wurde. Bekannt ist, dass die Oberflächenproteine in ihrer Expression als

0,03 0,68 0,53

1,76 1,71 1,03

0,00 0,00 0,00 0,08

2,05 2,12

0,31

4,26

0,63

-1

0

1

2

3

4

5

6

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n

Wachstumsphasen der BHI-Flüssigkeitskultur

∆agr-Mutante

1,60 2,06

0,00

1,48

2,60

0,18 0,39

0,00

0,67

1,36

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


∆agr-Mutante

4 Ergebnisse

45

Folge der agr-Mutation gesteigert und die der Exoproteine reduziert werden.

Desweiteren besteht eine reduzierte Virulenz der Mutante. Alle übrigen vier

untersuchten Gene wurden in allen Wachstumsphasen der Flüssigkultur erfolgreich

exprimiert (Abb. 15). Bei sae wurde erwartet, dass dessen Transkription in einer ∆agr-

Mutante erniedrigt ist. Hier wurde es in der frühen exponentiellen Phase am stärksten

transkribiert mit sinkender Tendenz bis zur stationären Phase. asp23, das die Aktivität

des sigB-Gens widerspiegelt, steigerte seine Transkriptionsmenge kontinuierlich bis

zum Erreichen der stationären Phase. Dafür zeigten hla und spa als agr-abhängige Gene

die stärkste Transkription in der späten exponentiellen Phase und wurden nur gering in

der frühen exponentiellen und stationären Phase exprimiert.

Die ∆agr-Mutante RN 6911 entwickelte sowohl auf Blut- als auch auf Schädler-Agar

keine Hämolyse, kein β-Toxin, hatte kleine weiß pigmentierte Kolonien, ein normales

Wachstum und eine feuchte Konsistenz. Auch beim Wachstum auf Agar wurde RNA III

aufgrund der Mutation im agr-Lokus wie erwartet nicht exprimiert (Abb. 16). Auffällig

war hier, dass die Transkription der vier erfolgreich exprimierten Gene auf Blut-Agar

stärker war als auf Schaedler-Agar. sae erreichte auf Blut-Agar eine ähnlich hohe

Expression wie in der frühen exponentiellen Phase in der Flüssigkultur, wohingegen die

Transkription auf Schaedler-Agar im Vergleich erheblich niedriger war. Das in der

Flüssigkultur ebenfalls erfolgreich exprimierte asp23 zeigte eine erfolgreiche

Expression auf den Agarplatten, wobei die Transkription auf Blut-Agar ungefähr

doppelt so stark war wie auf Schaedler-Agar. Auch die agr-abhängigen Virulenzgene

hla und spa wurden auf Blut-Agar stärker exprimiert als auf Schaedler-Agar.

4 Ergebnisse

46

4.3.1.5 Die Genexpression der ∆sar-Mutante ALC 136

Abb. 17: Genexpression der ∆sar-Mutante in der Flüssigkultur

Abb. 18: Genexpression der ∆sar-Mutante auf den Agarkulturen

Der globale Regulator sar kontrolliert die Produktion der Oberflächen- und

extrazellulären Proteine. Bei der ∆sar-Mutante ALC 136 ist das sar-Gen ausgeschaltet,

das normalerweise die Expression von Virulenzgenen wie auch hla und spa beeinflusst,

0,04

1,67

1,12 1,24

1,49

1,09

0,05

1,13 1,31

0,11

0,56

0,92 0,82

1,60

0,32

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


∆sar-Mutante

2,30

1,01 1,20

1,18

1,72

1,35

0,29

1,63

2,17

0,24

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


∆sar-Mutante

4 Ergebnisse

47

allerdings nur indirekt. Es handelt sich um eine isogenetische Mutante von RN 6390 mit

einer sarA::ermC Mutation. Daher wurden im folgenden Transkriptionsprofil alle fünf

untersuchten Gene in den einzelnen Wachstumsphasen erfolgreich exprimiert (Abb. 17).

asp23 steigerte die Menge der relativen Genexpression stetig bis zum Erreichen der

stationären Phase, in der es sein Maximum erreichte. Dagegen wurde der Regulator sae

in der späten exponentiellen Phase am stärksten transkribiert, ebenso auch spa und hla.

Der Regulator agr, dessen Transkriptionsmenge durch die Expression des Effektorgens

RNA III gemessen wurde, erreichte das Maximum der relativen Genexpression erst mit

dem Eintreten in die stationäre Phase. Der Sprung bezüglich der Transkriptionsmenge

zwischen der frühen exponentiellen und der späten exponentiellen Phase war sehr hoch.

Die ∆sar-Mutante erreichte auf Blut-Agar Hämolysestufe 2 und auf Schaedler-Agar

Hämolysestufe 4. Sie bildete kein β-Toxin, die Kolonien waren klein und weiß

pigmentiert. Das Wachstum war normal und die Kolonien hatten eine feuchte

Konsistenz. Die untersuchten fünf Gene wurden alle wie in der Flüssigkultur erfolgreich

transkribiert (Abb. 18). Bei sae fiel auf, dass der Regulator auf Blut-Agar deutlich

stärker exprimiert wurde als auf Schaedler-Agar. RNA III zeigte wie auch schon in der

Flüssigkultur eine positive Transkription, die auf Schaedler-Agar etwa gleich stark

ausgeprägt war wie auf Blut-Agar. Dagegen war asp23 das einzige Virulenzgen,

welches auf Schaedler-Agar eine höhere Expression als auf Blut-Agar aufwies.

Interessanterweise wurden die beiden agr-abhängigen Virulenzgene hla und spa auf

Blut-Agar stärker transkribiert.

4 Ergebnisse

48

4.3.1.6 Die Genexpression der ∆agr/sar-Doppelmutante ALC 135

Abb. 19: Genexpression der ∆agr-/sar-Mutante in der Flüssigkultur

Abb. 20: Genexpression der ∆agr-/sar-Mutante auf den Agarkulturen

Die ∆agr/sar-Doppelmutante ALC 135 exprimierte die untersuchten Gene nach einem

ähnlichen Muster, wie die ∆agr-Mutante (Abb. 19). Hier handelt es sich um eine

Mutante von RN 6390 mit agr::tetM und sar::Tn917LTV1 Insertion. RNA III wurde

daher auch in der Doppelmutante nicht transkribiert. sae zeigte das gleiche

0,04

2,83

0,67 0,87 0,75 0,17 0,00 0,00 0,00

0,28

4,64

1,38

0,16

4,21

0,20

0

1

2

3

4

5

6

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


∆agr-/sar-Mutante

0,71 0,76

0,00

1,03 0,95

0,28 0,20

0,00

0,90 1,06

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


∆agr-/sar-Mutante

4 Ergebnisse

49

Transkriptionsmuster wie in der agr-Mutante. Bei asp23 sah das Transkriptionsprofil in

den drei Wachstumsphasen im Gegensatz zur agr-Mutante anders aus. Hier erreichte

asp23 sein Maximum schon in der späten exponentiellen Phase. Da sar die Expression

von anderen Virulenzgenen nur indirekt beeinflusst, wurden diese auch in der

Doppelmutante erfolgreich exprimiert. Die Expression von hla und spa war in der

späten exponentiellen Phase am stärksten.

Auch der Phänotyp der Kolonien auf den Blut- und Schaedler-Agar ähnelte dem der

agr-Mutante sehr. Sie wies ebenfalls auf beiden Agarplatten keine Hämolyse auf, kein

β-Toxin und entwickelte kleine weiße Kolonien mit normalem Wachstum und feuchter

Konsistenz. Ebenso ließ sich ein ähnliches Transkriptionsmuster zur agr-Mutante

feststellen (Abb. 20). RNA III wurde nicht exprimiert, die Expression des Regulators

sae war auf Blut-Agar erheblich stärker als auf Schaedler-Agar und asp23 zeigte hier

ein ebenso erfolgreiches Transkriptionsmuster, was schon in der Flüssigkultur zu

erkennen war. Die Höhe der Expression war auf den beiden Agar-Platten ungefähr

gleich stark. Auch die Transkription von hla ähnelte dem der agr-Mutante, da deren

Expression von hla auf Blut-Agar wesentlich höher ausfiel. Dagegen steigerte spa in der

Doppelmutante auf Schaedler-Agar seine Expression nicht mehr.

4 Ergebnisse

50

4.3.1.7 Die Genexpression der ∆sigB-Mutante ALC 1001

Abb. 21: Genexpression der ∆sigB-Mutante in der Flüssigkultur

Abb. 22: Genexpression der ∆sigB-Mutante auf den Agarkulturen

Bei der ∆sigB-Mutante ALC 1001, abstammend von dem Laborstamm RN 6390, war

bekannt, dass durch die Inaktivierung von sigB die Expression des sae-Regulators

gesteigert wird. So wurde sae auch hier zu allen drei Zeitpunkten in der Flüssigkultur

0,02

4,44

3,40

0,94

1,37

3,29

0,02

4,64

2,99

0,05 0,51

0,83

0,05 0,06 0,12

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


∆sigB-Mutante

0,84 1,04 0,90

0,05 0,02

3,34 3,34 2,57

0,06 0,01

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


∆sigB-Mutante

4 Ergebnisse

51

erfolgreich exprimiert (Abb. 21). Es fand eine kontinuierliche Steigerung von der frühen

exponentiellen bis zur stationären Phase statt. Interessanterweise wurde asp23 trotz der

sigB-Defizienz wenn auch nur gering transkribiert. RNA III hatte das Maximum schon

in der späten exponentiellen Phase erreicht. spa wurde im Gegensatz zu den anderen

Mutanten in der sigB-Mutante nur ganz gering transkribiert und es war ein kaum

merklicher Unterschied zwischen den einzelnen Wachstumsphasen erkennbar. Es

bestand somit ein Unterschied zu RN 6390, bei dem spa erfolgreich in allen drei

Wachstumsphasen mit Maximum in der stationären Phase exprimiert wurde. Wie

erwartet wurde das Virulenzgen hla erfolgreich exprimiert und hatte sein Maximum in

der Transkription während der späten exponentiellen Phase. Es bestätigte sich außerdem

die höhere Expression von hla in der sigB-Mutante im Vergleich zu RN 6390.

Weiterhin hat die sigB-Mutation einen Einfluss auf die Transkripte von spa, die in den

Flüssigkeiten und auf Blut- und Schaedler-Agar zu erkennen ist.

Auf Blut- und Schaedler-Agar ähnelte der Phänotyp der sigB-Mutante sehr dem von

RN 6390. Die Mutante entwickelte auf Blut-Agar eine geringere Hämolyse als auf

Schaedler-Agar, bildete aber auf beiden ein β-Toxin. Die Kolonien waren klein, weiß

pigmentiert und wuchsen normal mit feuchter Konsistenz. Der Virulenzregulator sae

wies auf Schaedler-Agar ein stärkeres Transkriptionsprofil als auf Blut-Agar auf (Abb.

22). Ebenso verhielt es sich mit dem Effektorgen RNA III. asp23 wurde auf beiden

Agarplatten gering exprimiert. spa wurde wie schon in der Flüssigkultur sowohl auf

Blut- als auch auf Schaedler-Agar wenig exprimiert. hla wurde in dieser Mutante auf

beiden Agar-Medien erfolgreich exprimiert, jedoch wesentlich stärker auf Schaedler-

Agar.

4 Ergebnisse

52

4.3.2 Das Transkriptionsprofil der klinischen Isolate

In der vorliegenden Arbeit wurden 16 klinische S. aureus-Isolate aus dem

Respirationstrakt von Mukoviszidose-Patienten ausgewählt, um zu untersuchen, ob

abhängig vom phänotypischen Erscheinungsbild auf Blut- und Schaedler-Agar,

Rückschlüsse auf das Transkriptionsverhalten der Isolate zu ziehen sind.

Die RNA-Isolierung von den Agarplatten erfolgte nach Inkubation der Stämme über 16-

24h bei 37°C. Der Blut-Agar wurde aerob und der Schaedler-Agar unter 5%igem CO2

bebrütet. Durch die Verwendung von Columbia-Blut- und Schaedler-Agar ist eine

bessere Charakterisierung und Vergleich der einzelnen Phänotypen von klinischen

S. aureus-Isolaten untereinander möglich. Zumeist ist das Hämolyseverhalten auf

Schaedler-Agar noch stärker ausgeprägt als auf Blut-Agar. Auch das Pigment der

Kolonien ist häufig unterschiedlich. So haben die Kolonien auf Schaedler-Agar häufig

eine gelblichere Pigmentierung als diejenigen auf Blut-Agar.

Desweiteren wurde ein Teil der klinischen S. aureus-Isolate in dem Flüssigmedium BHI

bebrütet und deren Wachstumsverlauf ermittelt. So konnten die Zeitpunkte des

Erreichens der frühen exponentiellen, der späten exponentiellen und der stationären

Phase ermittelt werden. Anschließend wurde nach erfolgter RNA-Isolierung das

Transkriptionsprofil der Gene mittels RT-PCR bestimmt. Es wurden die S. aureus-

Regulatoren agr, sigB und sae sowie die Virulenzgene hla und spa untersucht.

Bekannt ist, dass die verschiedenen Virulenzfaktoren von S. aureus in bestimmten

Phasen des Wachstumszyklus mehr oder weniger stark exprimiert werden. So werden

die Oberflächenproteine vor allem in der exponentiellen Phase und die Exoproteine und

-toxine eher in der postexponentiellen und stationären Phase transkribiert. Das in dieser

Arbeit untersuchte Virulenzgen spa gehört zur Gruppe der Oberflächenproteine, somit

wurde eine stärkere Expression in der exponentiellen Phase erwartet, während hla zur

Gruppe der sezernierten Proteine gehört, sodass eine stärkere Expression in der

stationären Phase erwartet wurde.

Die klinischen Isolate wurden zu drei Gruppen zusammengefasst, wobei die Einordnung

entsprechend der Ausprägung der Hämolyse erfolgte.

4 Ergebnisse

53

Die Gruppe I der klinischen Isolate, die auf Blut-Agar keine Hämolyse entwickelten,

zeigten in der Flüssigkultur ein sehr unterschiedliches Verhalten in der Transkription

der einzelnen Gene in den verschiedenen Phasen des Wachstumsverlaufes.

Die fünf S. aureus-Isolate S 198 II, S 348 I, S 385 IV, S 1368 II und S 1368 III

entwickelten auf Blut-Agar keine Hämolyse, auf Schaedler-Agar zeigten sie eine

Hämolysezone von Stufe 0 bis 3. Abb. 23 zeigt S 1368 II ohne Hämolyse auf Blut-Agar

und Hämolysestufe 3 auf Schaedler-Agar.

Abb. 23: Isolat S 1368 II mit Hämolyse 0 auf Blut-Agar (li) und mit Hämolyse 3 auf Schaedler-Agar

(re)

Die Pigmentierung der Kolonien war bei drei Isolaten auf Blut- und Schaedler-Agar

gelb, bei einem Isolat auf Blut-Agar weiß und auf Schaedler-Agar gelb und das fünfte

Isolat entwickelte ein gelbes Pigment auf Blut-Agar und ein weißes auf Schaedler-Agar

(Tabelle 8, s.S. 34).

4 Ergebnisse

54

Abb. 24: Genexpression von S 198 II in der Flüssigkultur

Abb. 25: Genexpression von S 198 II auf den Agarkulturen

Bei S 198 II wurden die fünf untersuchten Gene in allen drei Wachstumsphasen

erfolgreich exprimiert (Abb. 24). hla, sae, asp23 und spa wurden hier in der

postexponentiellen Phase am stärksten exprimiert. Nur bei RNA III steigerte sich die

Expression bis hin zur stationären Phase, was ebenso bei den drei untersuchten

Laborstämmen (SH 1000, RN 6350, 8325-4) zu beobachten war.

Auffällig war die geringe Expression aller untersuchten Gene auf Blut-Agar bis auf spa,

das ein sehr hohes Transkript aufwies und sich auf Schaedler-Agar noch steigerte (Abb.

25). Weiterhin wies auch asp23 eine deutlichere Steigerung der Expression auf

Schaedler-Agar auf. RNA III vervierfachte seine relative Expressionsmenge auf

0,17

2,93

1,49

0,60

1,36

0,93

0,25

1,03 1,45

1,03

2,52

1,45

0,64

3,19

1,85

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 re

lati

ve G

en

exp

ress

ion


S 198 II

0,76 0,74 0,49 0,76

5,40

1,01 2,09 2,09

5,29

9,45

0

2

4

6

8

10

12

14

16


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 198 II

4 Ergebnisse

55

Schaedler-Agar und sae steigerte sich um zwei Drittel. Nur hla zeigte auf beiden

Agarmedien ein annähernd gleich hohes Transkript.

Abb. 26: Genexpression von S 348 I in der Flüssigkultur

Abb. 27: Genexpression von S 348 I auf den Agarkulturen

S 348 I zeigte trotz ähnlichem Phänotyp zu S 198 II ein nicht vergleichbares

Transkriptionsverhalten in der Flüssigkultur. Interessanterweise lag bei keinem der fünf

Gene das Maximum in der postexponentiellen Phase (Abb. 26). Nur bei asp23 kam es

zu einem stetigen Anstieg bei der Expressionsmenge bis hin zur stationäre Phase. sae

dagegen hatte sein Expressionsmaximum bereits in der frühen exponentiellen Phase,

was so nur bei der Doppelmutante agr-/sar- zu beobachten war. Trotz der niedrigen

0,08 0,13 0,09

1,43

0,81 0,76

0,18 0,19 0,24 0,12 0,16

0,45

0,01 0,01 0,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8

1 1,2 1,4 1,6 1,8

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 348 I

1,07 0,71

0,03

1,27

0,01 0,18

3,29

0,29

2,30

0,05

-1

0

1

2

3

4

5


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 348 I

4 Ergebnisse

56

RNA III-Expression tendierte die Expression von spa in allen drei Phasen gegen Null,

so dass es sich möglicherweise um eine spa-Mutante handeln könnte.

Auf Blut- und Schaedler-Agar fiel bei sae, RNA III und asp23 eine stärkere Expression

auf Schaedler-Agar auf (Abb. 27). Bei hla dagegen war die Expression auf Schaedler-

Agar deutlich geringer als auf Blut-Agar. spa wurde wie schon in der Flüssigkultur fast

nicht exprimiert.

Abb. 28: Genexpression von S 385 IV in der Flüssigkultur

Abb. 29: Genexpression von S 385 IV auf den Agarkulturen

0,09 0,49

1,03 0,89

4,04

1,54

0,01

5,28

3,00

0,65 0,70 0,41 0,87

3,17

0,72

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 385 IV

1,32

0,92

1,31

0,46

1,32

0,30

0,47

0,02

0,47

0,76

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 385 IV

4 Ergebnisse

57

Bei S 385 IV wurden sowohl in der Flüssigkultur als auch auf dem Agarmedium

sämtliche Gene und Regulatoren erfolgreich transkribiert (Abb. 28 u. Abb. 29). In der

Flüssigkultur erreichte wie erwartet hla in der stationären Phase und spa in der

postexponentiellen Phase sein Maximum. Auch sae und RNA III wurden in der

postexponentiellen Phase am stärksten exprimiert. Dagegen war das Transkript von

asp23 in allen drei Phasen etwa gleich gering ausgeprägt.

Auf Blut-Agar fiel bei fast allen Genen und Regulatoren eine deutlich stärkere

Expression auf als auf Schaedler-Agar. Nur asp23 wurde auf beiden Medien gleich

stark exprimiert. Ein ähnliches Transkriptionsmuster sah man bei der agr-Mutante von

RN6390. Jedoch wurde in dem klinischen Isolat S 385 IV RNA III auf Blut-Agar in

hohem Maße exprimiert.


Abb. 31: Genexpression von S 1368 III auf den Agarkulturen

0,27

0,96

0,14

0,89 0,97

0,22

1,60

0,37

2,23 2,15

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 1368 II

1,54

1,14

0,18

1,39 1,44

0,15

1,00

0,11

1,00 1,00

0

0,5

1

1,5

2

2,5


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 1368 III

4 Ergebnisse

58

Ergänzt wurde diese Gruppe um die Stämme S 1368 II und S 1368 III, die aus

derselben klinischen Probe eines Patienten isoliert wurden. Auffallend war hier, dass

beide Isolate auf Blut-Agar gelbe Kolonien entwickelten, S 1368 III im Gegensatz zu S

1368 II allerdings auf Schaedler-Agar weiße Kolonien produzierte. Es wurden alle Gene

und Regulatoren erfolgreich exprimiert. Es fiel aber auf, dass sich auf Schaedler-Agar

bei S 1368 III eine schwächere Expression aller Gene im Vergleich zur Transkription

auf Blut-Agar zeigte.

Zusammenfassend lässt sich für die Gruppe I sagen, dass sich die Transkriptionsprofile

der untersuchten Regulatoren und Virulenzgene im Vergleich der Stämme miteinander

sehr unterschiedlich darstellten. Der globale Regulator sae wurde bei allen fünf Isolaten

erfolgreich exprimiert. Es bestand ein Unterschied in der Höhe der Expression zwischen

Blut- und Schaedler-Agar, wobei die Transkription auf Schaedler-Agar bei drei Isolaten

(S 198 II, S 348 I, S 1368 II) stärker war. Auch das Effektorgen RNAIII transkribierte

auf Schaedler-Agar eine größere Menge RNA bei diesen drei Isolaten. Der sigB-

abhängigen Virulenzfaktor asp23 wurde bei den Isolaten, die auf beiden Agarplatten

gelbe Kolonien produzierten, auf Schaedler-Agar in höherem Maße exprimiert.

Interessant war, dass die Expression von asp23 bei S 1368 III, das auf Blut-Agar gelbe

und auf Schaedler-Agar weiße Kolonien entwickelte, entsprechend auch auf Blut-Agar

eine stärkere Transkription aufwies. Der Virulenzfaktor hla wurde bei allen 3 Isolaten

auf Blut-Agar im Gegensatz zu Schaedler-Agar deutlich stärker exprimiert. Auch die

Transkription des agr-abhängigen Faktors spa zeigte gewisse Unterschiede auf. So war

die spa-Transkription von S 1368 II wie schon bei asp23 auf Blut-Agar höher. Bei S

198 II und S 1368 II war die Expression auf Schaedler-Agar stärker. Die anderen beiden

Isolate exprimierten spa auf Blut-Agar in stärkerem Maße, wobei die im Vergleich zu

den anderen Isolaten sehr geringe Expression von spa bei S 348 I auffiel.

Es lässt sich bei allen Isolaten kein Zusammenhang zwischen den Transkripten von hla

und dem Grad der Hämolyse auf Blut- und Schaedler-Agar darstellen. Obwohl alle

Isolate auf Blut-Agar ohne Hämolyse wuchsen, konnte bei allen Isolaten eine

Expression für hla auf Blut-Agar aufgezeigt werden.

Beim Isolat S 198 II fiel eine sehr starke Expression von spa, sowohl auf Blut- als auch

auf Schaedler-Agar auf. Ebenfalls wies asp23 eine sehr hohe Transkription auf. Bei S

4 Ergebnisse

59

348 I handelte es sich möglicherweise um eine RNA-Mutation mit kombinierter spa-

Mutation. Bei S 385 IV fiel eine ungewöhnliche Regulation auf, da die Transkripte auf

Blut- höher als auf Schaedler-Agar waren. Weiterhin zeigte sich ein starkes sae-

Transkript in BHI. Bei den Isolaten S 1368 II und III könnte es sich um natürliche agr-

Mutanten handeln, da die Expression von RNA III sowohl auf Blut- als auch auf

Schaedler-Agar sehr gering war.

Zu der Gruppe II gehörten die klinischen Isolate S 66 I, S 179 I, S 516 I, S 592 II, S

376 I und S 501 II, die auf Blut- und Schaedler-Agar eine mäßige bis starke

Hämolysezone entwickelten.

Abb. 32: Isolat S 516 I mit Hämolysestufe 2 auf Blut-Agar (li) und Hämolysestufe 3 auf Schaedler-

Agar (re)

Die Pigmentierung von 3 Isolaten war auf Blut- und Schaedler-Agar gelb (S 66 I, S 516

I, S 376 I) und bei den übrigen drei jeweils auf Blut-Agar weiß und auf Schaedler-Agar

gelb (S 179 I, S 592 II, S 501 II) (Tabelle 9, s.S. 34).

4 Ergebnisse

60



S 66 I transkribierte sowohl im Flüssigmedium BHI als auch auf den Agar-Nährböden

die Gene und Regulatoren erfolgreich (Abb. 33 u. Abb. 34). hla wurde in der

Flüssigkultur in der stationären Phase am stärksten exprimiert, was bei keiner der

untersuchten Mutanten und Laborstämme der Fall gewesen war. RNA III steigerte seine

Expression bis hin zur stationären Phase, wie es auch bei den Laborstämmen gezeigt

werden konnte. Unerwartet sah man bei spa ein Transkriptionsverhalten mit der

höchsten Transkriptionsmenge in der frühen exponentiellen Phase, dass weder bei den

Mutanten noch bei den Laborstämmen zu beobachten war. Dagegen fiel auf, dass spa

0,01

0,69

1,57 1,54

2,28

1,36

0,01

1,46

1,68

0,37 0,51

1,16

0,87 0,71 0,57

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 66 I

0,96 1,06 0,04

1,15 0,01

3,51 3,13

11,91

17,78

0,001 0

5

10

15

20

25


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 66 I

4 Ergebnisse

61

auf Blut- und Schaedleragar kein relevantes Transkript exprimierte. sae erreichte sein

Maximum in der späten exponentiellen Phase und asp23 erst in der stationären Phase,

wie es schon bei der ∆sar-Mutante zu beobachten war. hla und sae wurden dafür im

Vergleich zur Expression auf Blut-Agar auf Schaedler-Agar doppelt so stark und RNA

III und asp23 sogar mehr als 10fach so stark exprimiert.



S 179 I transkribierte hla, sae, RNA III und asp23 erfolgreich. Wie schon bei S 348 I

aus Gruppe I konnte spa weder beim Wachstum des Stammes in der Flüssigkultur noch

in den Kolonien nachgewiesen werden. hla und sae erreichen ihr Maximum in der

stationären Phase, während RNA III und asp23 ihr Maximum bereits in der

0,03 0,73

1,83

0,20

1,37 1,79

0,04

2,47 1,83

0,34

4,91

1,69

0,02 0,03 0,00

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 179 I

2,52

0,43 1,55

3,71

0,01

2,87

0,87

3,93

6,20

0,002

-2

0

2

4

6

8

10

12


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 179 I

4 Ergebnisse

62

postexponentiellen Phase erreichten. Auf Blut- und Schaedler-Agar wurde hla gleich

stark transkribiert. Bei sae, RNAIII und asp23 steigerte sich die Expression auf

Schaedler-Agar auf das Doppelte.



In der BHI-Flüssigkultur werden alle Gene und Regulatoren von S 516 I erfolgreich

exprimiert (Abb. 37). sae und spa erreichten ihr Maximum bereits in der frühen

exponentiellen Phase. Dies war bei keiner der Mutanten oder Laborstämme zu

beobachten. Wie schon bei den Laborstämmen wurde RNA III in der postexponentiellen

Phase am stärksten transkribiert. asp23 zeigte die höchste Transkriptionsrate in der

stationären Phase, hla dagegen bereits in der postexponentiellen Phase. Obwohl spa von

0,01

1,02 0,71

2,00

0,53 0,57

0,03 0,38 0,47

0,10 0,27

3,03 2,79

0,38 0,61

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 516 I

0,94 1,11 1,07 1,05

0,02

0,97

1,18

0,80 0,94

0,00 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 516 I

4 Ergebnisse

63

S 516 I beim Wachstum in der Flüssigkultur exprimiert wurde, konnte es auf Blut- und

Schaedler-Agar nicht nachgewiesen werden (Abb. 38). Die übrigen Gene und

Regulatoren (hla, sae, asp23) wurden auf beiden Agar-Medien etwa gleich stark

produziert, wobei RNA III auf Schaedler-Agar etwas geringer exprimiert worden war.



Auffällig war bei S 592 II, dass hla im Flüssigmedium nicht exprimiert worden war,

wohingegen es erfolgreich auf dem festen Nährmedium exprimiert wurde (Abb. 39 u.

Abb. 40); auf Schaedler-Agar etwa doppelt so stark wie auf Blut-Agar. spa wurde wie

0,00 0,02 0,04

1,00 0,72

2,14

0,02 0,05 0,34

0,18

1,60

3,36

0,81

5,65

1,05

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 592 II

0,27

2,08

2,60

1,05

0,30

0,76

3,16

1,09

0,62

0,17

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 592 II

4 Ergebnisse

64

erwartet in der postexponentiellen Phase am stärksten exprimiert. sae, RNA III und

asp23 erreichten ihr Maximum erst in der stationären Phase. Es fiel auf, dass neben hla

nur noch sae auf Schaedler-Agar stärker transkribiert wurde. RNA III, asp23 und spa

zeigten jedoch bei diesem Stamm eine stärkere Expression auf Blut-Agar.



S 376 I transkribierte im Flüssigmedium sämtliche fünf Gene und Regulatoren

erfolgreich (Abb. 41). Sowohl hla, sae als auch RNA III erreichten ihr Maximum in der

postexponentiellen Phase. Dagegen steigerte asp23 sein Maximum bis zur stationären

Phase. spa exprimierte in der frühen exponentiellen Phase am stärksten. Bei sae und

asp23 war zwischen Blut-Agar und Schaedler-Agar kein Unterschied in der Höhe der

0,09

4,96

1,83

0,74 1,06 0,78 0,50

3,85

2,69

0,51

1,46

3,14

5,11 4,79

2,05

0

1

2

3

4

5

6

7

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 376 I

3,83

0,73 0,47

1,12

0,00

1,98

0,74

1,66 0,96

0,01 0

1

2

3

4

5

6


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 376 I

4 Ergebnisse

65

Expression erkennbar. hla wurde auf Blut-Agar stärker und RNA III schwächer

exprimiert. spa ließ sich im Gegensatz zur Anzucht in der Flüssigkultur auf Blut- und

Schaedler-Agar nicht nachweisen (Abb. 42).



Der Stamm S 501 II zeigte eine erfolgreiche Expression der untersuchten Gene und

Regulatoren im Flüssigmedium BHI (Abb. 43). Die größte Menge an hla-RNA wurde

in der stationären Phase transkribiert. Bei sae, RNA III, asp23 und spa war das

Maximum bereits in der postexponentiellen Phase erreicht.

Auf Schaedler-Agar wurde hla fast 10fach so stark transkribiert wie auf Blut-Agar

0,00 0,38 0,82

0,50 0,81

0,70 0,02 1,18 0,94

0,50

5,52

1,80 1,27

9,57

0,27

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 501 II

0,23

2,49

0,71

1,91

0,21

2,08

0,60

2,08 1,69

0,03

0

1

2

3

4

5


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 501 II

4 Ergebnisse

66

Abb. 44). Eine höhere Transkription auf Blut-Agar ließ sich bei sae, asp23 und spa

nachweisen. Dagegen war die Expression von RNA III auf Schaedler-Agar am

stärksten.

In der Gruppe II wurden in der Flüssigkultur von fast allen Stämmen die untersuchten

Regulatoren und Virulenzgene exprimiert. Es fiel auf, dass hla des Stamms S 592 II in

BHI kein relevantes Transkript bildete, jedoch war hla auf Blut- und Schaedler-Agar

nachweisbar. Bei dem Isolat S 179 I scheint es sich möglicherweise um eine spa-

Mutante zu handeln, da in keinem der Medien ein spa-Transkript nachgewiesen wurde.

Auch in den Kolonien, die auf Blut- und Schaedler-Agar wuchsen, konnte bei drei

Stämmen (S 66 I, S 516 I, S 376 I) kein relevantes spa-Transkript nachgewiesen

werden. Allerdings gelang eine erfolgreiche Expression in den Flüssigkulturen dieser

Isolate, so dass bei der Untersuchung der Kolonien möglicherweise die spa-RNA

bereits schon abgebaut worden war. Die übrigen vier Gene bzw. Regulatoren dieser drei

Isolate wurden dafür auf beiden Agarmedien erfolgreich exprimiert. S 66 I zeigte im

Vergleich zu den anderen fünf Isolaten das schwächste Hämolyseverhalten (Blut-Agar

Stufe 1, Schaedler-Agar Stufe 2). Dafür waren hier die Unterschiede in der relativen

Expressionsmenge von Blut- zu Schaedler-Agar am größten (Abb. 34). Bei den

Stämmen, die auf beiden Kulturplatten einen hohen Hämolysegrad erreichten, wie S

376 I und S 501 II, zeigte sich eine Steigerung des Transkripts auf Schaedler-Agar nur

beim Regulator RNA III. hla wurde sogar auf Schaedler-Agar weniger stark exprimiert

und bei sae und asp23 waren keine relevanten Veränderungen in der Expressionsmenge

nachweisbar (Abb. 42).

4 Ergebnisse

67

Der Gruppe III wurden aufgrund ihrer phänotypischen Gemeinsamkeit die Isolate S

605 I, S 568 I, S 1344, S 1365 I und S 1365 II zugeordnet, da sie sowohl auf Blut- als

auch auf Schaedler-Agar die stärkste Hämolyse entwickelten.

Abb. 45: Isolat S 1365 I mit Hämolysestufe 4 auf Blut -(li) und Schaedler-Agar (re)

Zwei Isolate (S 1365 I, S 1344) wiesen sowohl auf Blut- als auch auf Schaedler-Agar

eine weiße Pigmentierung auf. S 568 I war auf beiden Agarplatten gelb pigmentiert und

die restlichen zwei Isolate (S 1365 II, S 605 I) zeigten eher eine weiße Pigmentierung

auf Blut-Agar und ein gelbes Pigment auf Schaedler-Agar (Tabelle 10, s.S. 35).

4 Ergebnisse

68



S 605 I transkribierte die untersuchten Gene und Regulatoren beim Wachstum im

Flüssigmedium erfolgreich (Abb. 46). Sowohl hla, RNA III als auch asp23 hatten das

Maximum der Transkription in der postexponentiellen Phase erreicht. Bei sae steigerte

sich die Expression hin bis zur stationäre Phase und bei spa war das Maximum bereits

in der frühen exponentiellen Phase erreicht.

Beim Wachstum der Kolonien auf Blut- und Schaedler-Agar fiel wie schon bei einigen

zuvor beschriebenen Stämmen eine äußerst geringe Expression von spa auf. hla und

RNA III wurden auf Schaedler-Agar mindestens doppelt so stark transkribiert (Abb.

47). Dagegen sah man bei sae und asp23 eine geringere Expression auf Schaedler-Agar

im Vergleich zu Blut-Agar.

0,01

1,72

1,24

0,11

0,85 1,21

0,13

2,51

1,27

0,11

1,57

1,13 1,09

0,80

0,30

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 605 I

0,34

1,55

0,09

1,70

0,01

1,42

0,81

0,28

1,48

0,003

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 605 I

4 Ergebnisse

69



S 568 I exprimierte in der Flüssigkultur die untersuchten Gene und Regulatoren

erfolgreich. Hier fiel auf, dass hla sein Maximum bereits in der postexponentiellen

Phase erlangte und in der stationären Phase gleich viel RNA-Transkript produzierte

(Abb. 48). Bei sae und spa zeigte sich die höchste Expression bereits in der frühen

exponentiellen Phase. RNA III und asp23 dagegen steigerten ihre Expression bis hin zur

stationären Phase.

Trotz der hohen Hämolysestufe wurde hla auf Schaedler-Agar in geringerem Maße

exprimiert als auf Blut-Agar. Eine höhere Transkriptionsmenge auf Schaedler-Agar sah

man bei diesem Stamm nur bei RNA III (Abb. 49). sae und asp23 produzierten etwa

0,01

0,96 0,93 1,10 1,01 0,59

0,21

1,01 1,15

0,15 0,11

1,04

2,82

0,69 0,86

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 re

lati

ve G

en

exp

ress

ion


S 568 I

1,35

0,96

0,41

0,93

0,01

0,58

1,09

0,77

1,05

0,005 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 568 I

4 Ergebnisse

70

eine gleiche Menge an RNA-Transkript auf beiden Agar-Medien. spa wurde weder auf

Blut- noch auf Schaedler-Agar erfolgreich exprimiert, trotz der Expression im

Flüssigmedium BHI.

Abb. 50: Genexpression von S 1344 auf den Agarkulturen

Ergänzend wurde S 1344 untersucht, allerdings nur auf Blut- und Schaedler-Agar, da

dieses Isolat, wie nur selten beobachtet, auf beiden Agar-Medien weiße Kolonien

ausbildete. hla steigerte seine Expression auf Schaedler-Agar noch um mehr als das

doppelte. Bei sae war die Transkription gleich hoch ausgefallen. Die Expression von

asp23 verdoppelte sich fast auf Schaedler-Agar. RNA III zeigte in beiden Agarmedien

eine erfolgreiche Transkription, wobei diejenige auf Schaedler-Agar noch stärker

ausgeprägt war. Die Expression von spa war dagegen auf beiden Agar-Medien fast

nicht nachweisbar.

1,33

2,49

6,62

0,83 0,05

4,17

2,18

8,54

1,50

0,01 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 1344

4 Ergebnisse

71



Die beiden Stämme S 1365 I und II wurden hinsichtlich ihres Transkriptionsverhaltens

nur auf Blut- und Schaedler-Agar untersucht, da sie zwar aus derselben klinischen

Probe eines Patienten isoliert wurden, jedoch auf Blut- und Schaedler-Agar einen

unterschiedlichen Phänotyp ausbildeten. S 1365 I bildete auf beiden Medien weiße

Kolonien aus und S 1365 II die häufigere Variante: auf Blut-Agar weiße Kolonien und

auf Schaedler-Agar gelbe Kolonien. Bei beiden Stämmen zeigte sich eine mehr als

zehnfach so ausgeprägte Transkription von hla auf Schaedler-Agar. Auch bei RNA III

sah man eine deutliche Steigerung in der Expressionsrate auf Schaedler-Agar. Dagegen

wurde bei sae kein relevanter Unterschied in der Menge der Transkription

nachgewiesen. Bei S 1365 I war die Expression auf Schaedler-Agar etwas stärker,

0,94 1,69

0,61 0,20 0,86

11,35

2,24

11,35

0,05 0,22 0

2

4

6

8

10

12

14


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n


S 1365 I

0,25

1,75

0,77 0,58 0,28

4,24

1,63

4,42

0,63 0,06

0

1

2

3

4

5

6

7


rela

tive

Ge

ne

xpre

ssio

n

Blut-Agar Schaedler -Agar

S 1365 II

4 Ergebnisse

72

jedoch sah man bei S 1365 II keinen großen Unterschied. spa zeigte bei beiden

Stämmen eine relevante Reduktion in der Transkriptionsmenge.

Die Gruppe III fasst diejenigen Isolate zusammen, die auf Blut- und Schaedler-Agar

die größte Hämolysezone (Stufe 4) entwickelten. Wie schon in der Gruppe II, fiel bei

zwei Isolaten (S 605 I und S 568 I) auf, dass ein spa-Transkript in den Kolonien auf den

Agarmedien nicht nachgewiesen werden konnte, trotz einer erfolgreichen Expression

von spa in der Flüssigkultur. Der Regulator RNA III wurde in allen fünf Stämmen in

den Kolonien auf Schaedler-Agar stärker exprimiert als auf Blut-Agar. Bei S 1365 I war

die Transkription um mehr als das 10fache gesteigert. asp23 zeigte nur bei S 1344 einen

relevanten Unterschied, in dem es seine Expression auf Schaedler-Agar fast

verdoppelte. Die übrigen Isolate wiesen keinen relevanten Unterschied in ihrer

Transkriptionsmenge von asp23 im Agarmedium auf. S 568 I entwickelte als einziges

Isolat der Gruppe auf beiden Agarmedien gelbe Kolonien. Die Expression von hla war

auch nur bei diesem Isolat auf Blut-Agar stärker als auf Schaedler-Agar. Alle anderen

Isolate wiesen auf Blut-Agar eine geringere Expression von hla auf und produzierten

auf Blut-Agar weiße Kolonien. Außerdem ließ sich die Verbindung zwischen sae und

hla darstellen. Es ist bekannt, dass sae die Expression der α- und β-Hämolysine steigert.

Dies spiegelt sich auch in den Ergebnissen dieser Gruppe wieder. Einer erfolgreichen

Transkription von sae folgte die ebenfalls erfolgreiche Expression von hla im

entsprechenden Medium.

4 Ergebnisse

73

4.3.2.1 Die relative Expression der klinischen Isolate bei dem Wachstum auf

Blut- und Schaedler-Agar im Vergleich

Es wurde die relative Expression der mRNA beim Wachstum der Isolate auf Blut- und

Schädler-Agar untersucht.

Die Expression des Virulenzgens hla, welches vom agr Lokus reguliert wird und für

das α-Toxin kodiert, zeigte bei den 16 klinischen S. aureus-Isolaten z. T. Unterschiede

in der relativen Transkriptionsmenge. 7 Isolate hatten auf Schaedler-Agar eine stärkere

Transkription als auf Blut-Agar, 5 Isolate eine geringere Expression auf Schaedler-

Agar. Bei den restlichen 4 Isolaten konnte keine Änderung in der Expression dargestellt

werden.

Das Virulenzgen spa, dass ebenfalls vom agr-Lokus reguliert wird, kodiert für das

Protein A. 3 Isolate zeigten auf Blut-Agar eine geringere Transkription als auf

Schaedler-Agar und bei 12 Isolaten verhielt es sich umgekehrt. Bei einem Isolat konnte

keine veränderte Transkription festgestellt werden.

Auffällig war, dass RNA III als Effektorgen von agr bei 12 Isolaten auf Schaedler-Agar

stärker exprimiert wurde als auf Blut-Agar. Bei 3 Isolaten verhielt es sich umgekehrt.

Ein Stamm zeigte eine gleich starke Expression auf beiden Agarmedien.

asp23 kodiert für das Alkalische-Schock-Protein und steht unter der Kontrolle des

alternativen Stress-Sigma-Faktors σB. 6 Isolate exprimierten asp23 auf Schaedler-Agar

stärker als auf Blut-Agar. Eine höhere Transkription auf Blut-Agar zeigte sich dagegen

bei 5 Isolaten. In weiteren 5 Isolaten konnte keine vermehrte Expression nachgewiesen

werden.

Der Genlokus sae, bestehend aus den zwei Komponenten saeR und saeS, kodiert für

viele Exoproteine. Mit 7 Isolaten war bei fast der Hälfte der Isolate die Transkription

auf Schaedler-Agar höher als auf Blut-Agar. 4 Isolate wiesen eine höhere Expression

auf Blut-Agar auf. Die übrigen 5 Isolate zeigten keinen relevanten Unterschied in der

Expression im Vergleich von Blut- auf Schaedler-Agar.

4 Ergebnisse

74

4.3.2.2 Zusammenfassung der Ergebnisse von Blut- und Schaedler-Agar

Isolat Hämolyse

B/Sch

Pigment

B/Sch

β-Toxin

B/Sch

hla sae RNAIII asp23 spa

RN 6390 3/4 w/w j/j 10 0 10 2 0

8325-4 4/4 w/w n/n 10 0 10 2 0

SH 1000 3/4 g/g n/j 10 2 10 2 0

agr- 0/0 w/w n/n - - ne - -

sar- 2/4 w/w n/n - - 0 2 -

agr-/sar- 0/0 w/w n/n - - ne 0 0

sigB- 2/4 w/w j/j 2 2 2 0 0

Isolat Hämolyse

B/Sch

Pigment

B/Sch

β-Toxin

B/Sch

hla sae RNAIII asp23 spa

S 198 II 0/0 g/g n/n 0 2 2 2-10 2

S 348 I 0/1 g/g n/n - 2 10 2 0

S 385 IV 0/2 w/g n/n - - - 0 -

S 1368 II 0/3 g/g n/n 0 0-2 2 10 2

S 1368 III 0/3 g/w n/n - 0 0 - -

S 66 I 1/2 g/g n/n 2 2 10 10 -

S 179 I 1/4 w/g n/n 0 2 2 2 -

S 516 I 2/3 g/g n/n 0 0 - 0 0

S 592 II 2/3 w/g n/n 2 0-2 - - -

S 376 I 3/4 g/g n/n - 0 2 0 0

S 501 II 3/4 w/g n/n 10 - 2 - -

S 1365 I 4/4 w/w n/n 10 0-2 10 - -

S 1365 II 4/4 w/g n/n 10 0 2 0 -

S 605 I 4/4 w/g n/n 2 - 2 - -

S 1344 4/4 w/w n/n 2 - 0-2 2 -

S 568 I 4/4 g/g n/n - 0 2 0 -

Tabelle 11: Legende: w: weiß, g: gelb. n: nein, j: ja. 2: Änderung mindest. doppelt so hoch; 10:

Änderung fast 10fach so hoch; - : geringere Transkription; 0: keine Änderung; ne: nicht exprimiert

4 Ergebnisse

75

Tabelle 11 gibt eine vergleichende Übersicht über die Expression der einzelnen

Virulenzgene und Regulatoren auf Blut- und Schaedler-Agar. „2“ bedeutet, dass die

relative Menge des jeweiligen Transkripts auf Schaedler-Agar mindestens doppelt so

hoch war als auf Blut-Agar. Die „10“ steht für ein fast 10fach so hohes Transkript auf

Schaedler-Agar. Das Minus besagt, dass die Expression auf Schaedler-Agar geringer

war als auf Blut-Agar. Ergänzend dazu sind das Ausmaß der Hämolyse auf Blut- und

Schaedler-Agar, die Ausbildung von β-Toxin sowie die Pigmentierung aller Stämme

mit aufgelistet.

4.3.2.3 Die Veränderung des Hämolyse-Verhaltens verglichen mit der

Veränderung der Transkription von RNAIII auf Blut- und Schaedler-

Agar

Da RNA III hla positiv reguliert und hla für die Hämolyse verantwortlich ist, wird

davon ausgegangen, dass bei einer gesteigerten Expression von RNAIII auch das

Hämolyseverhalten auf Blutagar stärker ausgeprägt sein sollte.

Die Einteilung der Hämolyse fand nach einem vorgefertigten Beschreibungsbogen

(Anhang) statt und wurde mit 0 (keine Hämolyse) bis 4 (maximale Hämolyse)

beschrieben. Dabei kam es vor, dass der Unterschied in der Hämolyse im Vergleich der

Kolonien von Blut- und Schaedler-Agar nur eine oder auch mehrere Stufen betrug.

Möglich war auch eine sehr starke Hämolysezone auf Schaedler-Agar und gar keine

oder nur geringste Hämolyse auf Blut-Agar.

Abb. 53: S 179 I mit Hämolysegrad 1 auf Blut-Agar (li) und Hämolysegrad 4 auf Schaedler-Agar

(re)

4 Ergebnisse

76

Bei 12 Isolaten zeigte sich eine Steigerung der RNA III-Transkription auf Schaedler-

Agar. Dies trat bei 3 von 5 Isolaten ohne Hämolyse auf Blut-Agar, bei 4 von 6 Isolaten

mit geringer bis mäßiger Hämolyse auf Blut-Agar und bei 5 von 5 Isolaten mit starker

Hämolyse auf Blut-Agar auf.

4.3.2.4 Die Unterschiede in der Pigmentierung der Kolonien auf Blut- und

Schaedler-Agar verglichen mit der jeweiligen asp23-Expression

In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass ein Zusammenhang zwischen

der phänotypischen Pigmentierung und der Expression des Stress-Sigma-Faktors σB

besteht. Ein Produkt des σB-Faktors, das eine Aussage über die Aktivität von σB erlaubt,

ist das asp23. Wenn das σB-Gen in einem S. aureus Stamm nicht transkribiert wird, sind

die Kolonien des Phänotyps weiß. Bei vorhandener Transkription des σB-Gens können

die Kolonien eine gelb-goldene Färbung annehmen. Es stellt sich somit die Frage, ob

sich bei einer Veränderung der Pigmentierung der Kolonien von Blut- nach Schaedler-

Agar auch die Expression des σB, gemessen durch asp23, entsprechend verändert.

Zum Vergleich wurde von einer ∆sigB-Mutante das Transkriptionsprofil des

Wachstums auf Blut- und Schaedler-Agar ermittelt. Die Kolonien hatten eine weiße

Farbe, was auf eine verminderte sigB-Transkription schließen lässt. In der RT-PCR war

das Transkript asp23 sowohl von Blut- als auch von Schaedler-Agar nahezu Null.

Bei den klinischen Isolaten zeigte sich häufig eine Pigmentierung von weißen Kolonien

auf Blut- und gelben Kolonien auf Schaedler-Agar. Dies Verhalten trat bei 6 der 16

untersuchten klinischen Isolate auf. Von diesen wies lediglich 1 Isolat (S179 I) auf

Schaedler-Agar die vermutete höhere Expression von asp23 auf. 4 Isolate zeigten ein

annähernd gleich hohes Transkript auf beiden Agarmedien. Ein Transkript (S 592 II)

zeigte sogar auf Blutagar die höhere Expression von asp23.

Ebenfalls häufig zu beobachten war das Auftreten von Isolaten mit Kolonien einer gelb-

goldenen Farbe. So wuchsen 7 von 16 Isolaten mit gelbem Pigment auf beiden

Agarmedien. Auch hier war eine Differenz zwischen der relativen Menge von asp23 auf

Blut- und Schaedler-Agar zu beobachten. 4 Isolate zeigten eine doppelt bis zehnfach

erhöhte Expression von asp23 auf Schaedler-Agar. 3 Isolate exprimierten asp23 auf

beiden Agarmedien gleich stark.

4 Ergebnisse

77

Seltener ist das Auftreten von weißen Kolonien sowohl auf Blut- als auch auf

Schaedler-Agar, was nur bei 2 der untersuchten klinischen Isolate der Fall war. Beide

Isolate transkribierten auf beiden Agarmedien eine geringe Menge an asp23.

5 Diskussion

78

5 Diskussion

Die zystische Fibrose ist in der westlichen Bevölkerung die häufigste autosomal-

rezessiv vererbbare Stoffwechselerkrankung, die durch eine Mutation im CFTR-Gen

zustande kommt. Einer der wichtigsten therapeutischen Ansätze ist die Behandlung

rezidivierender bronchopulmonaler Infekte, die leider auch heute noch einen

lebenslimitierenden Faktor bei CF-Patienten darstellen. Einer der bedeutsamsten

Erreger dieser Infektionen ist S. aureus. Die Identifizierung der Erreger findet in erster

Linie in der mikrobiologischen Diagnostik durch die Kultivierung des Erregermaterials

aus Nasen-, Rachenabstrichen oder Sputum statt. Üblicherweise wird Selektivagar

verwendet, der andere Erreger im Wachstum inhibiert, und das Wachstum von S. aureus

fördert. Für die Identifizierung von S. aureus wird gewöhnlich Columbia-Blut-Agar und

Mannitol-Salz-Agar verwendet.

Zur phänotypischen Analyse der S. aureus Isolate aus dem Respirationstrakt von CF-

Patienten wurden die klinischen Proben auf verschiedene Agarplatten ausgestrichen und

das Wachstum der Kolonien nach Bebrütung über Nacht charakterisiert. Üblich ist dabei

die Verwendung von Columbia-Blut-Agar. In der CF-Studie, die die Grundlage für die

vorliegende Arbeit bildete, wurden die S. aureus-Isolate zusätzlich auf Schaedler-Agar

ausgestrichen und unter 5% CO2 bebrütet. Denn es wurde beobachtet, dass Unterschiede

im Phänotyp der einzelnen Isolate meist auf Schaedler-Agar noch besser zu erfassen

sind, da sich die Pigmentierung der Kolonien und das Hämolyseverhalten noch besser

ausprägen. Bei Schaedler-Agar handelt es sich um einen nicht-selektiven Nährboden,

der üblicherweise zur Kultivierung von anaeroben Bakterien eingesetzt wird.

In der vorliegenden Arbeit wurden ausgewählte klinische Isolate aus der CF-Studie und

ausgewählte Laborstämme und Mutanten auf Blut- und Schaedler-Agar bebrütet, deren

Phänotyp beschrieben und anschließend eine RNA-Isolierung für die Untersuchung der

Transkription vorgenommen. Ziel war es, das Transkriptionsprofil verschiedener

Virulenzgene und -regulatoren dieser Stämme auf Blut- und Schaedler-Agar mit dem

Verfahren der RT-PCR vergleichen zu können. Es sollte die Frage beantwortet werden,

ob es möglich sei, vom phänotypischen Erscheinungsbild der Kolonien auf

Agarmedien, Columbia-Blut- und Schaedler-Agar, auf das Transkriptionsprofil

5 Diskussion

79

wichtiger Virulenzregulatoren und -gene von S. aureus schließen zu können. Es wurden

die globalen Regulatoren sae, agr durch die Ermittlung von RNAIII und sigB durch die

Bestimmung von asp23, sowie die Virulenzgene hla und spa untersucht. Da es nicht

üblich ist, RNA-Isolierung von Agarplatten durchzuführen, wurden die untersuchten

Stämme zusätzlich noch in einer BHI-Flüssigkultur angezüchtet und aus diesen zu

verschiedenen Zeitpunkten des Wachstumsverlaufes RNA-Isolierungen durchgeführt.

Zu drei voneinander unabhängigen Zeitpunkten wurden die Wachstumsphasen eines

jeden Stammes ermittelt: frühe exponentielle, späte exponentielle und stationäre Phase.

BHI wurde als Flüssigmedium gewählt, da sich hier nach ca. 8 Stunden der typische

exponentielle Wachstumsverlauf entwickelte. Zum Vergleich wurde zu Beginn auch das

Flüssigmedium TSB verwendet, in dem sich allerdings kein klarer exponentieller

Wachstumsverlauf abzeichnete, so dass die einzelnen Wachstumsphasen nicht eindeutig

abzugrenzen waren. Daher wurde TSB als Flüssigmedium wieder verworfen.

Jeder S. aureus-Stamm wurde dreimal auf Blut- und Schaedler-Agar bzw. in der

Flüssigkultur angezüchtet, um zu drei unabhängigen Zeitpunkten die RNA isolieren zu

können. Von jedem RNA-Isolat wurde eine Doppelbestimmung in der RT-PCR

durchgeführt.

Unterschiede im genetischen Hintergrund der einzelnen S. aureus-Stämme können zu

einem völlig unterschiedlichen Transkriptionsprofil bei der Genexpression führen. Die

klinischen Isolate befanden sich längere Zeit (Einschlusskriterium war eine Persistenz

von mindestens sechs Monaten) im Respirationstrakt der CF-Patienten. Bei

rezidivierenden Infektionen mit entsprechender klinischer Symptomatik aufgrund der

Abwehrschwäche ist es notwendig, diese Patienten wiederholt mit Antibiotika zu

behandeln. Die Erreger entwickeln zunehmend Resistenzen und Veränderungen im

Erbgut, um der Immunantwort des Wirts und der Wirkung der Antibiotika zu entgehen.

So kommt es zu einer veränderten Transkription der Regulatoren und Virulenzgene von

S. aureus. Longitudinalstudien haben bereits gezeigt, dass Stämme, die denselben

genetischen Hintergrund haben, wiederholt aus dem Respirationstrakt von CF-Patienten

isoliert wurden und somit chronische Infektionen durch einen einzel nen Stamm

verursacht werden können (4). Vor allem bei chronischen Infektionen ist S. aureus

einem starken Selektionsdruck unterworfen, der durch die Therapie mit Antibiotika,

durch die Immunantwort des Wirts aber auch durch Co-Infektionen mit anderen

5 Diskussion

80

Mikroorganismen verursacht wird (23). So lässt sich möglicherweise die durchaus sehr

unterschiedliche Expression der in dieser Arbeit untersuchten Gene erklären, auch wenn

diese Isolate ein ähnliches phänotypisches Erscheinungsbild aufwiesen. In dieser Arbeit

wurden Isolate in Gruppen zusammengefasst, die aus dem Respirationstrakt von

verschiedenen Patienten isoliert worden waren. Hier haben sich vermutlich sehr

unterschiedliche adaptive Vorgänge abgespielt, die somit auch zu einer unterschiedlich

starken Expression der Virulenzgene und Regulatoren führen konnten. Ein interessanter

Aspekt für weitere Untersuchungen wäre es, die Expression der Virulenzgene von

Isolaten eines einzelnen Patienten zu vergleichen, um die Hypothese zu prüfen, ob die

Isolate möglicherweise einen ähnlichen genetischen Hintergrund vorzuweisen haben.

Zu unterschiedlichen Ergebnissen führen auch minimale Unterschiede in den

Wachstumsbedingungen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Expression der

Virulenzgene und -regulatoren beim Wachstum auf festem Medium wie Blut- und

Schaedler-Agar und in dem Flüssigmedium BHI sehr unterschiedlich sind. Bei allen

klinischen Isolaten unterschied sich das Transkriptionsprofil zwischen Flüssigmedium,

Blut-Agar und Schaedler-Agar. So wurde auch asp23 des Laborstamms 8325-4 zwar in

der Flüssigkultur in allen drei Wachstumsphasen erfolgreich exprimiert, dagegen konnte

dafür asp23 auf den Agarplatten nicht suffizient nachgewiesen werden. Allerdings

zeigte sich bei RN6390, da dieser Stamm eine sigB-Mutation aufweist, wie erwartet,

eine nicht erfolgreiche Expression von asp23 in allen drei Medien. Zum Vergleich war

jedoch bei den vier Mutanten ∆agr, ∆sar, ∆agr/sar und ∆sigB eine ähnlich erfolgreiche

Expression zwischen dem festem Agar-Medium und dem Flüssigmedium zu erkennen.

Bei den klinischen Isolaten fiel vor allem bei den Isolaten aus der Gruppe II mit S 66 I,

S 516 I und S 376 I und aus der Gruppe III mit S 605 I und S 568 I auf, dass diese zwar

spa in der Flüssigkultur erfolgreich exprimierten, dass ein spa-Transkript allerdings auf

den Agarmedien nicht erfolgreich nachzuweisen war. Möglicherweise spielte hier die

Dauer der Inkubationszeit eine Rolle, so dass die längere Inkubation von 24 h bei den

Agarplatten zu einer Instabilität der RNA von spa geführt haben könnte.

Wichtig war es, die Transkription der Regulatoren und Gene zusätzlich in der

Flüssigkultur zu untersuchen, da hier die einzelnen Wachstumsphasen (prä-,

postexponentielle und stationäre Phase) genau ermittelt werden konnten. Auf den

Agarmedien wurden dagegen nur die Produkte der Gene und Regulatoren

5 Diskussion

81

nachgewiesen, die nach 24 Stunden Inkubation noch stabil waren. Mögliche instabile

Produkte, die zu diesem Zeitpunkt schon abgebaut wurden, konnten so nicht mehr

erfasst werden. Dass die Regulatoren und Virulenzgene jedoch erfolgreich exprimiert

wurden, ließ sich somit durch die zusätzliche Anzucht der Isolate in den Flüssigkulturen

bestätigen.

Viele Untersuchungen zur Genregulation und Expression von Virulenzfaktoren basieren

auf Studien mit bekannten S. aureus-Laborstämmen, wie dem Stamm 8325-4.

Durch die Wahl von BHI als Flüssigmedium zeigten die Laborstämme teilweise schon

ein unterschiedliches Verhalten als bisher in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel lag

das Maximum der Expression von hla bei 8325-4 in der späten exponentiellen Phase.

Auch zeigte dieser Stamm eine Expression von sigB, die eigentlich nicht vorhanden sein

sollte, da es sich um eine Deletion in RsbU handelt. RN 6390 zeigte ebenfalls ein frühes

Maximum von hla in der späten exponentiellen Phase. Hingegen weißt dieser Stamm

tatsächlich die sigB-Deletion auf, was auch durch die vorliegenden Ergebnisse bestätigt

werden konnte.

Ein wichtiges Ergebnis dieser Untersuchung ist, dass eine große Variation in der

Genexpression der klinischen S. aureus-Stämme untereinander, aber auch im Vergleich

zu den Laborstämmen und Mutanten herrscht.

Desweiteren ist die initial phänotypische Charakterisierung der Kolonien auf den Agar-

Platten in gewisser Weise der subjektiven Betrachtungsweise des einzelnen

Untersuchers unterworfen. So können Kolonien, die nicht eindeutig in ihrer Farbe zu

beschreiben sind, von einem Untersucher anders interpretiert werden als von einem

anderen. Dadurch ist es z. B. schwer, definitiv zwischen weißen und gelben Kolonien zu

trennen. Die in dieser Arbeit erfolgte Zusammenfassung der klinischen Isolate in

Gruppen nach dem Hämolyseverhalten konnte auf diesem Hintergrund auch nicht rein

objektiv erfolgen. Es ergab sich daher in der Gruppe II mit Isolaten mit gering bis

mäßiger Hämolyse auf Blut-Agar die ungenaueste Einteilung. Hierdurch lassen sich

möglicherweise die wenigen Gemeinsamkeiten im Transkriptionsverhalten erklären.

Nur bei spa zeigte sich bei vier von sechs Isolaten eine geringere Expression des

Transkripts auf Schaedler-Agar. Alle anderen vier Virulenzgene und -regulatoren waren

bei den einzelnen Isolaten dieser Gruppe nicht miteinander zu korrelieren. Ein weiterer

Ansatz wäre somit, die Isolate zum einen von mehreren unabhängigen Untersuchern

5 Diskussion

82

hinsichtlich der Pigmentierung der Kolonien beurteilen zu lassen. Zum anderen wäre für

weitere Folgearbeiten eine strikte Trennung zwischen Isolaten mit und ohne

Hämolysezone sinnvoller. Dadurch wäre eine ungenaue Beurteilung der phänotypischen

Beschreibung der Kolonien vermeidbar.

Eine weitere wichtige Hypothese der Untersuchung war es, festzustellen, ob eine

Korrelation zwischen dem Hämolyseverhalten und der Expression von hla darzustellen

ist. Hierzu können vor allem die Ergebnisse der Gruppe III herangezogen werden, da in

dieser Gruppe das Hämolyseverhalten am stärksten ausgeprägt war. Sowohl auf Blut-

als auch auf Schaedler-Agar wurde die Stufe 4 des Hämolysegrads erreicht. Unsere

Vermutung ließ sich jedoch nicht belegen. Ein Isolat (S 568 I) wies sogar eine

reduzierte Expression von hla auf Schaedler-Agar auf, was nicht vermutet worden war.

Interessanterweise konnte bei dem Laborstamm 8325-4, der auf beiden Agarmedien die

maximale Hämolyse erreichte, eine sehr hohe Expression von hla dokumentiert werden.

Dieses Ergebnis lässt sich eventuell damit begründen, dass die klinischen Isolate durch

adaptive Vorgänge im Wirt Veränderungen auf RNA-Ebene durchgemacht haben, die

dadurch zu nicht vergleichbaren Ergebnissen mit den Laborstämmen führen.

Interessanterweise stellten sich bei der Untersuchung 2 klinische Isolate (S 348 I, S 179

I) offenbar als spa-Mutanten heraus. Keines der beiden Isolate exprimierte spa in den

einzelnen Wachstumsphasen der Flüssigkultur suffizient. Auch auf Blut- und Schaedler-

Agar wurde spa nicht transkribiert. Im Rahmen der Studie konnte in einer anderen

Untersuchung der spa-Typ bei beiden Isolaten ermittelt werden. Für S 179 I war dies

t015, für S348 I t2845. Damit kann die Mutation zwar nicht im dem Bereich der Primer-

Bindungsstelle für die spa-Typisierung, aber möglicherweise an anderer Stelle im Gen,

erfolgt sein. In einer früheren Arbeit (1) konnte bereits 2009 gezeigt werden, dass

klinische S. aureus-Stämme, bei denen eine spa-Typisierung nicht gelingt, häufig spa-

Mutanten sind. Bei der Sequenzierung zeigten sich vor allem Deletionen in den IgG-

bindenden Domainen. Allerdings konnte auch nachgewiesen werden, dass Stämme mit

Deletionen in mehreren Abschnitten in der RT-PCR sehr hohe Transkriptionen von spa

aufwiesen. Dies ist in der Weise interessant, da spa als wichtiger Virulenzfaktor gilt,

und somit spa-Mutanten in S.aureus-Isolaten nachgewiesen werden, die zu Infektionen

bei CF-Patienten geführt haben. Andererseits muss gerade bei diesen im Allgemeinen

abwehrgeschwächten Patienten, der Stamm gar nicht so virulent sein, um klinisch

5 Diskussion

83

relevante Infektionen zu verursachen. Es wäre somit ein weiterer interessanter Ansatz,

die klinischen Isolate aus dem Respirationstrakt von CF-Patienten hinsichtlich

möglicher Mutationen in den Virulenzgenen zu untersuchen. Bei den Isolaten der

Gruppe I, ausgenommen die spa-Mutante S 348 I, fielen relativ hohe spa-Transkripte

im Vergleich zu den anderen Gruppen auf.

Bei zwei klinischen Isolaten (S 1368 II und III), die zum gleichen Zeitpunkt aus dem

Respirationstrakt desselben Patienten isoliert worden waren, fiel eine ganz geringe

Expression von RNA III auf. Hierbei könnte es sich um natürliche agr-Mutanten

handeln. Ein interessantes Ergebnis, so dass man in weiteren Untersuchungen der Frage

nachgehen könnte, was ursächlich für die Mutation gewesen ist.

Die Transkription von asp23 wird durch den Regulator sigB beeinflusst (35). Da bei

einer hohen Aktivität von sigB auf eine verstärkte Pigmentierung der Kolonien

geschlossen werden kann, kann dies indirekt über asp23 hergeleitet werden. Somit

bildete die sigB-Mutante in dieser Untersuchung auch nur weiße Kolonien. Eine

Transkription von asp23 fand erwartungsgemäß nicht statt. Bei den klinischen Isolaten

fand sich bei allen Isolaten, die auf beiden Agarmedien gelbe Kolonien entwickelten,

eine erfolgreiche Expression von asp23. Allerdings wies auch der Stamm S 1344, der

nur weiße Kolonien bildete, eine erfolgreiche Expression von asp23 auf.

Interessanterweise zeigte sich jedoch bei den klinischen Isolaten S 1365 I und II ein sehr

ähnliches Bild in der relativen Menge der Genexpression, obwohl diese in ihrer

Pigmentierung unterschiedlich waren. Denn S 1365 I zeigte auf Schaedler-Agar die

seltene weiße Pigmentierung, die nur zu 24 % in der Studie beobachtet worden war.

Passend dazu wurde asp23, als sigB-abhängiges Transkript, nicht erfolgreich

exprimiert. Dafür zeigte S 1365 II die mit 72 % häufigeren gelben Kolonien auf

Schaedler-Agar und wie erwartet, eine Expression von asp23.

Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lässt sich ableiten, dass es nicht oder nur bedingt

möglich ist, von der phänotypischen Erscheinung der klinischen Isolate auf das

Transkriptionsprofil wichtiger Regulatoren und Virulenzgene von S. aureus zu

schließen. Da bisher keine Untersuchungen zum Transskriptionsprofil der Erreger auf

Agarplatten vorlagen, war ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit, dass es möglich ist,

RNA der Bakterien von Agarplatten nachzuweisen, dass es Unterschiede zum

Transskriptionsverhalten der Erreger auf den verschiedenen Agarplatten (Blut- und

5 Diskussion

84

Schaedler-Agar) unter den verschiedenen Kultivierungsbedingungen (normale

Bedingungen und CO2) gibt und dass sich das Transskriptionsverhalten auf Agarplatten

zu dem in Flüssigkulturen unterscheidet. Interessant waren auch die Ergebnisse des

Transskriptionsverhaltens wichtiger Laborstämme und deren Mutanten, mit denen die

klinischen Stämme verglichen wurden. Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit

durch Auswahl der klinischen Isolate einige interessante klinische Mutanten gefunden

(spa-Mutanten, agr-Mutanten).

Die Arbeit dient somit als Anstoß für weitere Experimente und Fragestellungen: Wie

unterscheidet sich das Transkriptionsverhalten von Isolaten eines einzelnen Patienten?

Treten hier möglicherweise ähnliche Mutationen auf? Inwieweit und wie häufig treten

Mutationen in den Genen von diesen klinischen Stämmen auf, die die adaptiven

Vorgänge der S. aureus-Stämme im Wirt erklären könnten? Treten diese Mutationen

erst bei chronischer Infektion mit langer Persistenz im Wirt oder möglicherweise auch

schon nach kurzer Zeit bei akuten Infektexazerbationen auf?

6 Literaturverzeichnis

85


(1) Baum C, Haslinger-Loffler B, Westh H, Boye K, Peters G, Neumann C, et al. (2009) Non-spa-typeable clinical Staphylococcus aureus strains are naturally occurring protein

A mutants. J.Clin.Microbiol. 47 (11): 3624-3629.

(2) Bayer M, Heinrichs J, Cheung A (1996) The molecular architecture of the sar locus

in Staphylococcus aureus. J.Bacteriol. 178 (15): 4563-4570.

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7 Abbildungsverzeichnis

91


Abb. 1: Wachstumskurve des Laborstammes SH 1000 in BHI ......................................12

Abb. 2: RT-PCR Zyklus aus (34) ....................................................................................18

Abb. 3: Bestimmung des Wachstumskurvenverlaufes (WK) zu drei unterschiedlichen

Zeiten des klinischen Isolates S 605 I .............................................................................24

Abb. 4 Häufigkeitsverteilung der Pigmentierung der Kolonien auf Blut- und

Schaedleragar...................................................................................................................31

Abb. 5 Häufigkeitsverteilung der Hämolysestufe der Kolonien auf Blut- und Schaedler-

Agar .................................................................................................................................31

Abb. 6 Häufigkeitsverteilung der β-Toxin-Expression der klinischen Isolate ................32

Abb. 7: Vergleich des Wachstumsverlaufs des klinischen Isolates S 605 I in BHI- und

TSB- Flüssigmedium .......................................................................................................36

Abb. 8: Ermittlung des Wachstumsverlaufs zu drei verschiedenen Zeitpunkten (WK)..36

Abb. 9: Genexpression des Laborstamms 8325-4 in der Flüssigkultur ...........................38

Abb. 10: Genexpression des Laborstamms 8325-4 auf den Agarkulturen ......................38

Abb. 11: Genexpression des Laborstamms RN 6390 in der Flüssigkultur .....................40

Abb. 12: Genexpression des Laborstamms RN6390 auf den Agarkulturen....................40

Abb. 13: Genexpression des Laborstamms SH 1000 in der Flüssigkultur ......................42

Abb. 14: Genexpression des Laborstamms SH 1000 auf den Agarkulturen ...................42

Abb. 15: Genexpression der ∆agr-Mutante in der Flüssigkultur ....................................44

Abb. 16: Genexpression der ∆agr-Mutante auf den Agarkulturen .................................44

Abb. 17: Genexpression der ∆sar-Mutante in der Flüssigkultur .....................................46

Abb. 18: Genexpression der ∆sar-Mutante auf den Agarkulturen ..................................46

Abb. 19: Genexpression der ∆agr-/sar-Mutante in der Flüssigkultur .............................48

Abb. 20: Genexpression der ∆agr-/sar-Mutante auf den Agarkulturen ..........................48

Abb. 21: Genexpression der ∆sigB-Mutante in der Flüssigkultur ...................................50

Abb. 22: Genexpression der ∆sigB-Mutante auf den Agarkulturen ................................50

Abb. 23: Isolat S 1368 II mit Hämolyse 0 auf Blut-Agar (li) und mit Hämolyse 3 auf

Schaedler-Agar (re) .........................................................................................................53

Abb. 24: Genexpression von S 198 II in der Flüssigkultur .............................................54

Abb. 25: Genexpression von S 198 II auf den Agarkulturen ..........................................54

Abb. 26: Genexpression von S 348 I in der Flüssigkultur ...............................................55


92

Abb. 27: Genexpression von S 348 I auf den Agarkulturen............................................55

Abb. 28: Genexpression von S 385 IV in der Flüssigkultur ............................................56

Abb. 29: Genexpression von S 385 IV auf den Agarkulturen .........................................56

Abb. 30: Genexpression von S 1368 II auf den Agarkulturen ........................................57

Abb. 31: Genexpression von S 1368 III auf den Agarkulturen .......................................57

Abb. 32: Isolat S 516 I mit Hämolysestufe 2 auf Blut-Agar (li) und Hämolysestufe 3 auf


Abb. 33: Genexpression von S 66 I in der Flüssigkultur .................................................60

Abb. 34: Genexpression von S 66 I auf den Agarkulturen..............................................60











Abb. 45: Isolat S 1365 I mit Hämolysestufe 4 auf Blut -(li) und Schaedler-Agar (re) ...67





Abb. 50: Genexpression von S 1344 auf den Agarkulturen ............................................70

Abb. 51: Genexpression von S 1365 I auf den Agarkulturen ..........................................71

Abb. 52: Genexpression von S 1365 II auf den Agarkulturen ........................................71

Abb. 53: S 179 I mit Hämolysegrad 1 auf Blut-Agar (li) und Hämolysegrad 4 auf


8 Tabellenverzeichnis

93

8 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Laborstämme ..................................................................................................20

Tabelle 2: Mutanten .........................................................................................................20

Tabelle 3: klinische Isolate ..............................................................................................21

Tabelle 4: Sequenzen der Referenzgene ..........................................................................28

Tabelle 5: Sequenzen der in dieser Arbeit untersuchten Gene ........................................28

Tabelle 6: Die Phänotypen der Laborstämme .................................................................33

Tabelle 7: Die Phänotypen der Mutanten ........................................................................33

Tabelle 8: Die Phänotypen der Gruppe I .........................................................................34

Tabelle 9: Die Phänotypen der Gruppe II........................................................................34

Tabelle 10: Die Phänotypen der Gruppe III ....................................................................35

Tabelle 11: Legende: w: weiß, g: gelb. n: nein, j: ja. 2: Änderung mindest. doppelt so

hoch; 10: Änderung fast 10fach so hoch; - : geringere Transkription; 0: keine Änderung;

ne: nicht exprimiert..........................................................................................................74

9 Abkürzungen

94

9 Abkürzungen

BHI Brain heart infusion

cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat

CF Cystische Fibrose

cDNA complementary deoxyribonucleic acid

dsDNA Doppelstrang DNA

EL early log phase

g Vielfaches der Erdbeschleunigung

kb Kilobase

li links

LL late log phase

OD optische Dichte

PCR Polymerase Ketten Reaktion

re rechts

rpm rounds per minute

RT-PCR Real-Time PCR

s Sekunde

SP stationary phase

TSB Tryptic soy broth

WK Wachstumskurve

10 Anhang

95

10 Anhang

Beurteilungsbogen der Studie NCT00669760 zur phänotypischen Beschreibung der

Isolate:

11 Lebenslauf

96

11 Lebenslauf

11 Lebenslauf

97

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Staphylococcus aureus-Isolate aus dem … · 2017-02-19 · Fokus der Untersuchung ... asp23 als sigB-abhängiges Transkript und sae sowie das Transkriptionsprofil der Virulenzgene