SCItOt~M~LLEI~, tIEPTNEI~ u. BELITZ: Stoffwechseluntersuchungen an Mikroorganismen. IV 539

Stoffwechseluntersuchungen an lebensmitteltechnologisch wichtigen Mikroorganismen

I V . Mittei lung

K o h l e n d i o x y d i m S to f fweehse l yon Penieillium eamemberti var. candidum

Von

J. SCHORM~)LLER, W. HEPTNER und H.-D. BEL1TZ

Mitteilung aus dem Institut ]iir Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechndogie der Technischen UniversitSt Berlin

Mi~ 1 Textabbildung

(Ein~egangen am 4. Mai 1961)

GITTERMAN 1 beobach te te 1952, dab COe ffir das op t imale W a c h s t u m yon Peni- cil l ium chrysogenum in versehiedenen Ni~hrmedien notwendig is t und in e inem syn- the t i schen IVIedium n u t dureh Oxalessigsiiure erse~zt werden kann. W u r d e n H y d r o l y - sate yon Pi lzmycel , das in Gegenwarfi yon ~CO~ bebr/i~et worden war, papierehro- ma tograph i sch ge t rennt , dann t r a t s ta rke Akt iv i t / i t bei Asparagins/ iure, Glu tamin- saure und Argin in auf.

I m Anschlug an frfihere Unte r suchungen unseres Arbei tskre ises fiber die CO~- F ix ie rung bei Mflchsi~urebakterien ~ einerseits, fiber den Stoffweehsel yon Penici l l ium camemberti a anderersei ts , in teressier te uns nun, ob aueh dieser ftir die Camember t - Kase re i wicht ige Pilz CO~ a u f n i m m t und in weIche Verb indungen dann das Kohlen- d i o x y d eingeh~. W i t haben deshalb Penic i lgum camemberti submers in e inem syn- the t i schen lV[edium sowie in Molke in Gegenwar~ yon Natt~aCOa gezfiehtet. Die N/~hr- medien und das Mycel wurden anschlieBend wie im folgenden beschr ieben f rakt io- n ier t und auf Akt iv i t / i t ungersuch~.

Experimenteller Teil

1. Radioalctives Material Das eingesetzte NaHI~C08 lag in Ampullen zu I mC/5,9 mg in 1,14 mt H~O vor. Der Inhalt

einer solchen Ampulle wurde mit 162,1 mgNatIC03 sowie 80 mg NaOH versetz~ und auf 100 ml aufgefiillt. Die spezifische Akt iv i~t dieser L5sung war 0,5 mC/mmol. Sie warde fiir die folgenden Versuche benutzt.

2. Waehstumsansiitze PeniciUium camemberti vat. candidum wurde nach der ~riiher beschriebenen ~ethode ~ in einer

Schfittelkultur submers geziichtet. Die erforderlichen Conidien wurden durch Schragagarkulturen erhalten.

Folgende N~hrmedien wurden verwendet: a) 10g GIucose, 5 g Ntt4NO3, 5g KH~POa, auBerclem 0,Sg MgSOa, 0,1 g FeSO~ und je

0,01 g ZnSOa, ~1C12, CaC12 in Form der handelsfiblichen Hydrate pro 11; b) Molke, aus Magermflch mitte]s Labferment und S~urewecker gewonnen ~; auf diesem Medium

ist das Wachstum optimal

1 GI~T]~A~, C. 0., u. S. G. K~mHT: J. Bact. 64, 223 (1952). 2 SC~O~MtiLL~, J., u. H.-D. BELI~Z: Diese Z. 110:425 (1959). - - B~LITZ, H.-D., u. J. Scion.

MffLLE~: Diese Z. 113, 449 (1960). SC~ORMi)LL]~R, J., u. tI. HUT~: I)iese Z. 107, '153 (1958). - - Se~O~Mi~LL]~R, J., u. W.

A~D~XSS: Diese Z. 109, 154 (1959). - - SC~OmU/JLLE~, J., u. It. MA]~L~: Diese Z. 110, 183 (1959). SC]ZO~LL~t~, J., u. H. HVT~: Zit. d. S., Anm. 3.

540 J. SCtIORM~LLEt¢, W. HEPTNEI¢ und H.-D. BELITZ:

Der p~-Wert wurde jeweils auf 6,5 eingestellt; ansfaUende Niederschl~ge wurden yon der hei$en LSsung abfiltriert. In 500 ml-Erlenmeyerkolben wurden je 100 ml N~hrl5sung mit Conidien- suspension beimpf~. Naeh Zugabe yon 10 ml Na~COa-L5sung, die zuvor gesondert sterilisiert worden war, wurden die Kulturen luftdicht verschlossen und ansehlieSend bei 26 ° C auf einer Rotationsschfittelmaschine 51/~ Tage gesehiittelt.

3. F r a k t i o n i e r u n g der K u l t u r e n

Der Verlauf der Auftrennung ist in tolgendem l~raktionierungsschem~ zusammengestellt (Abb. 1).

Fraktionierungss chema Submerskultur

- ~ ( ans~uern I homogenisieren, filtrieren I

N~hrmedium

Umsatz mit 2,4-Dinitro- phenylhydrazin Wasserd mpMesk

i o o oron I I o.o o uroo I fiber Kationenaust,auseher

Mycel

Extraktion mit Xther, Alkohol

i, Durchlau/

fiber Auionenaustauscher

+ + Durchtau] Eluat Eluat Extrakt

I Restst°ffe Ii Carbons~uren II Aminos~uren I ~ F e - - - ~ l Nucleins~uren I L Proteine

Abb. 1. ~Fraktionierungsschema /'St die Au#rennung yon Kuitu~en des Penicillium camembe~'ti vat. candidum

Ri~ckstand

Extraktion mit 5% iger TCE

E xtrakt R iicksta nd

Zur Bestimmung des 002 wurden die Erlenmeyerkolben mit den Kulturen nach Kiihlung au~ 0 ° C schnell mit einem Au~satz versehen, der einen Tropftrichter, sowie Gaseingangs- und G~sansgangsrohr trug. Nach dem Ans~uern mit 5 ml 10 n-H2SOt wurde unter Erw~rmung auf 30°C und l~iihren mit einem Magnetriihrer das COs durch Einleiten yon C02-freiem Stieks~off in einen Absorber iibergetrieben, der 25 ml n-N~OH enthielt.

• Anschliei~end wurde das lVlycel abgetrennt und in Wasser homogenisiert. Die Bestimmung der Ausbeute effolgte dureh Trocknen eines aliquoten Tefles des Homogenats bei 105 ° C bis zur Gewiehtskonstanz. Die weitere Fraktionierung yon ~ycel und N~hrboden erfolgte n~eh Vor- sohriften yon H]~])L]~ 1 bzw. BE~G~E~ ~. Zur Aktiviti~tsmessung wurden ~liquote Tefle der einzelnen Fraktionen (LSsungen bzw. Homogenate) eingesetzt.

Die Auftrennung der Proteinhydrolysate ist bereits in einer frfiheren lY[itteflung beschrieben worden ~.

4. A k t i v i t g t s m e s s u n g

Die Aktivit~tsmessungen erfolgten im allgemeinen nach Verbrennung der Substanzen und 0berfiihren des gebfldeten CO~ in BaCQ. WasserlSshehe Substanzen wurden mit Kaliumperoxydi-

1 ttnNI)LE~, 1%. W. : J. biol. Chem. 284, 1466 (1959). 2 BE~G~E~, ]~, G., u. H. R. P]~r~: Diese Z. 111, 319 (1960).

S c I ~ O ~ v . ~ , J., u. H.-D. B]~L~TZ: Zit. S. 539, Anm. 2.

Stoffweehseluntersuehungen an lebensmitteltechnologisch wichtigen Mikroorganismen. IV 541

sulfat ~, wasserunlSsliche nach der Methode yon Va~rS~YKE ~ verbrannt. In beiden F/~llen hat sieh die flit die Persulfatmethode besehriebene Apparatur 1, ~ gut bew~hrt. Das BaC03 wurde auf einer Hahnschen Nutsehe selmell abgesaug~ and naeh dem Waschen mit Wasser und Alkohol auf einem Aluminiumschalchen (2,8 cm Durchmesser) lufttroeken ausgewogen. Blindwerte mit definierter NaHCO~-lSsung dienten zur Korrektur auf absorbiertes CO~ aus der Lv:ft. Gemessen wurde die Unterseite der BaCO~-P1/~ttchen. Dies liil~t sich leicht bewerkstelligen, da die auf der Nutsche abgeschiedenen P1/~t~chen ohne Verlust abgehoben und gewendet werden kSnnen. Diese 3~aBnahme eliminiert Absorptionseffekte, die dadurch entsCehen, dab w~hrend des Absaugens auf der Oberfl~ehe sich inaktives BaC03 bfldet.

Bei den N/~hrboderffraktionen und bei der si~ulenchromatographischen Auftrennung der Proteinhydrolysate wurden die Impulsausbeu~en dutch direktes ]21attieren bestimmt a. Die er- haltenen Impulsausbeuten wurden an Hand einer selbs~ ermittelten Absorp~io~skurve auf Stan- dardbedingungen (BaCOa-l~essung) umgereehnet. Uber Einzelheiten hierzu wird demn~chst berichte~. Die Ak~ivita~smessungen effolgten mit einem GM-Z~hlrohr unger konstanten ]3edin- gungen (1 mC~aC A 1,37" 10 s I/rain korr.). Alle Werge sind auf Selbstabsorption und Nulleffekt korrigiert. Die Gerate der Zi~hlanordnung sind Fabrikate der Firma Frieseke & Hoepfner GmbH., Erlangen-Bruck.

Ergebnisse und Diskussion Die Wachs~umsans~tze wurden in drei Para l le lchargen durchgeffihr~. I n den

Tabel len s ind die Mi t te lwer te zweier Ans~tze angegeben, deren Mycel fe ingr ieNge S t r u k t u r aufwies. E i n A n s a t z , bei dem das Mycel in kugelfSrmigen Aggrega ten anfiel, liefer~e hin- s ichtl ich 3/Iycelausbeute und Akt iv i t / i t saufnahme abweichende Ergebnisse und wurde hier n icht ber / ieksicht igt .

Die Myee lausbeu ten der K u l t u r e n waren im Gegensatz zu frfiheren Ergebnissen 4, sehr gering; sie differ ier ten in den N~hrmedien a und b nur unwesent l ieh. Es is t anzunehmen, dal~ bei der

Tabelle 1. MyceIgewichte und gebildetes CO 2

lV[yeel- N~hrmedium gewicht CO~

mg mg

a) synghetiseh 87 160 b) ~olke . . 97 172

durch unsere Versuchsf i ihrung bed ing ten Zfichtung in verschlossenen Gef/iBen Sauer- s toffmangel auf t r i t t .

Die Ver te i lung der e ingesetzten Akt iv i t / i t yon 0,1 mC (spez. Aktivit /~t 5,7 • 106 I / ra in • mgC) auf CO s, Mycel und Nghrboden is t aus der folgenden Tabel le ersichtl ich.

Dergenaxmte Pilz h a t bei unsererVersuchsff ihrung im synthe t i s chen N/ ihrmedium 10,5 % und be ide r Zt ichtung in Molke 9 % der eingesetz- t en Ak~ivi t£ ten ~ufgenom- men. Der n ich t f ixierte t I a u p t a n t e i l l iegt bffolge der Verdf innung durch At- m u n g s - C O 2 a m Versuchs- ende mi t s t a rk geminder-

Tabelle 2. AktivitSten yon C02, Mycel und Nghrboden

Anbeil der eingesetzten Aktivit~t

Untersuchungs- material %

a* b**

CO~ . . . . . 85 92 ~ycel . . . . . 6,4 6,0 N~hrboden . . 4,1 2,9

* Synthetisches Medium; ** 3[olke.

Spez. A k t i v i t ~ I/rain •mg C • 10 -4

I~ $ b**

25,4 25,5 1,98 1,37

t e r spezifischer A k t i v i ~ t vor. Leg4 m a n ffir die Berechnung der E i n b a u r a t e die Mi t te lwer te der spezifisehen A k t i v i t a t e n des COs zu Versuehsbegirm und a m Ver- suehsende zugrunde, so ergeben sieh ftir den An~eil des C0~-Kohlens tof fs a m Mycelkohlenstoff 0,67 % bei a u n d 0,46 % bei b.

1 CALVIN-, ~/~., Ctr. HEIDELBERGER, J . C. ~:~EID, B . M. TOLBEI~T U. P . ]~. YANKW-ICtt: Isoi~opic Carbon. S. 92. New York: J. Wiley 1949.

2 ARo~ro~-T, S.: Techniques of Radiobiochemistry. S. 45, Ames, Iowa: Iowa State College Press 1956.

3 SCHO~MiiLLV.R, &, U. H.-D. BELITZ: Zi~. S. 539, Anm. 2. SC~ORM~LLE~, J., u. It. ttVT~: Zit. S. 539, Anm. 3.

Z. Lebensmiti~.-Untersuch., Band 115 36

5 4 2 J . S c i ~ O l ~ n L m ~ , W . HErT~CEI~ u n d H . - D . BELITZ:

Eine Betrachtung der Verteilung der Mycelaktivit~t auf die einzelnen Fraktionen zeigt (Tab. 3), dab C0~ hauptsgehlich an der Bildung yon Nucleinsguren und Amino- s~uren beteiligt ist. Die geringere Aktivit£t der Fettfraktion leitet sich wahrsehein-

lich yon den stickstoffhal- T a b e l l e 3. Aktivitgten der Mycel/raktionen

Anteil an der Mycelakt ivi~t

FrakOon %

a* b**

31 38 * Synthetisehes ~edium ** Molke.

P r o t e i n e . . . F e t t e . . . . i k Iuc le ins~uren .

Spez. Aktivit~it I/rain • rag C - 10 -4

a* b**

1,84 1,10 0 ,32 0 ,13 3 ,90 3 ,20

tigen Bestandteilen der Li- poide her. Eine ghnliche Verteilung wnrde yon ]3O1.- TOI~ 1 bei Escherichia coli gefunden.

Die Verlninderung der CO2-Aufnahme bei den auf Molke gewaehsenen Knl- turen kommt in den spezi- fisehen Aktiviti~ten vonPro-

rein- und Fettfraktion sehr deut]ich zum Ausdruek und wird durch den Gehalt der Molke an Carbon- und Aminos~uren verursacht. Schon ABELSO~ ~ hatte in verschie- denen Arbeiten gezeigt, da{~ auf Zusatz einer Aminosi~ure zuln I~i~hrmediuln eine

T a b e l l e 4. Aktivittiten der I5hrboden]raktionen

Anteil an der N~hrl)oden-

Fraktion aktiviti i t (Vgl. Abb. 1) %

a* b**

A m i n o s ~ u r e n . . . 17,6 21 ,8 C~rbons /~uren . . . 60 ,7 59 ,0 d a v o n K e t o s g u r e n . 1,1 0,3 f l i i e h t i g e S ~ u r e n . . 0 .5 0 ,5 R e s t s t o f f e . . . . . 12~1 15,0

* S y n t h e t i s c h e s M e d i u m ; ** ~ o l k e .

Verminderung der Aktivit~tsaufnahme bei dieser Siiure oder bei einer aus dieser synthetisierten Verbindung eintritt. Die I~ueleinsaurefraktion zeigt dagegen nur eine sehr geringe Depression ihrer spezifischen Aktivit~t. Dies ist darauf zu- rfiekzuffihren, dai~ COs aueh direkt am Aufbau der Pyrimidin- und Purinkerne beteiligt sein kalm (vgl. z. B.a). Beiden wasserlSsliehen Stoffwechsel- produkten f~llt, wie Tab. 4 zeigt, der I-Iauptan- tell der Aktiviti~ auf die nichtflfichtigen Car- bons~uren.

Es fMlt auf, daI~ die Ketos~uren nur wenig Inark~ert sind. Sie weisen aul~erdem -- wie sieh aus halbquantitativen Bestimmnngen ergab --

eine sehr niedrige spezifische Aktivit~t auf. Die Aminosgurefraktion des I~£hrbodens ist im Gegensatz zur Proteinfraktion des Mycels mit wesentlieh geringeren Aktivi- ti~tsbetr~gen beteiligt. N~here Aussagen fiber den genetischen Zusalnmenhang der einzelnen Verbindungsgruppen wfirden die Kenntnis der Zeitabh~ngigkeit des CO 2- Einbaues voraussetzen.

Die Proteinfraktionen des Mycels wurden welter untersueht. Die Ergebnisse der Auftrennung ihrer Hydrolysate sind in Tab. 5 zusammengefai~t.

Danach ist Arginin mit 25 bzw. 32 % hervorragend an der Proteinaktivit~t be- teiligt, gefolgt yon Asparaginsi~ure mit 15 bzw. 22 %. In Threonin, Glutamins~ure und Isoleucin wurden etwa gleiehe laC-Betr~ge eingebaut. Eine geringere Aktivitiit weisen Prolin, Glykokoll, Serin und Alanin auf. Bei Valin und Leuein war die Impulsaus- beute geringer aLs 1% der Proteinaktivit~t. In den restlichen Alninosiiuren lieI3 sich keine Aktivit£t nachweisen.

Auf Grund der spezifischen Aktiviti~ten yon Asparaginsgure und Arginin sind Inindestens zwei voneinander unabhiingige Fixierungsmechanismen wahrscheinlich:

1 ]~OLTON, E . T. , P . H . ABELSON U. ]~. ALDOUS: J . b io l . C h e m . 198, 172 (1952). ABELSON, P . H . : J . b io l . C h e m . 206, 335 (1954) u n d f r f iher .

a B V C ~ A N , J . 1~., J . C. S O ~ E u. A. M. D E L L U V i : J . b io l . C h e m . 173, 81 (1948).

Stoffwechseluntersuchungen an lebensmitteltechnologisch wichtigen Mikroorganismen. IV 543

die Carboxylierung yon Brenzt raubens~ure zu 0xalessigs~ure I oder Apfels£ure ~ und d i e Synthese yon Arginin aus 0 r n i t h i n via Ci~rullin a. Versuche zur K1/~rung der letzt- genann t en Reak t ion durch Bes t immung der Akt iv i t~ t des Guanidyl-C-Atoms beim Argin in sind im Gange. Bemerkenswert sind die recht/ih~xlichen spezifisehen Aktivi- tg ten yon Asparaginsaure u n d Threonin sowie die starke Markierung yon Isoleuein. Hier ist an eine t~eaktionsfo]ge zu denken, wie sie yon verschiedenen Autoren ~ bei Escherichia coli, 2Veurospora crassa u n d Torulopsis utilis sichergestellt wurde. Danach geht Asparagins£ure fiber Homoser in in Threonin fiber, das seinerseits wiederum an der Synthese yon Isoleuein betefligt ist.

Tabelle 5. Aktivit~iten der AminosSuren

Amino- sthtren (AS)

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala. Val. Leu Iso Phe Tyr Lys His. Arg

AS- Zusammen-

setzmag gAS/16 gN a*

0,1 16 6,0 11 6,5 3 1,6 9 5,0 7 4,8 5 7,0 2 5,7 < 1 8,1 < 1 4,4 9 5,4 0 2,5 0 7,3 0 2,0 0 6,5 27

* Synthetisehes Medium; ** ~olke

Anteil der Proteinaktivit~t** *

%

b**

24 14 1

12

< 1 0 0 9

0 0 0 0

34

Spez. Aktivit~it I/rain •mg C. 10 -a

a ¢ b * *

116 66,0 123 60,1 36,2 6.O 48,8 25fl 52,1 73;5 14,2 15,8

224 135

*** Die Proteinaktivit/~t wurde hicr durch direktes Plattiercn aliquoter Teile s~te nach Abtrennung der tiuminstoffe ermittelt.

Depression der spez. Aktiviti~t bei :~¢folke

%

43 51 83 48

81

57

40

der Hydroly-

])as Verhi~ltnis der spezifischen Akt iv i t£ ten yon Asparagins£ure zu Glutamin- sgure be~r/~g~ etw~ 2,5 u n d zwar sowohl bei der K u l t u r in synthet ischem N~hrmedium wie in Molke. Dies l~Bt auf Synthesem6glichkei ten fiber den Citronens~urecyclus sehlieSen, der frfiher yon uns bei dem hier un te r such ten Mikroorganismus nach- gewiesen worden war 5. An der l%eaktionsfolge des Krebscyclus litl~t sich zeigen, dab die genannte t%elation Asparaginsiiure : Glutamins£ure im s~ation£ren Zus tand gr61~er als 1,25, doch kleiner als 2,5 sein mull.

Bemerkenswer~ ist die hohe spezifische A k t i v i t ~ yon Glykokoll, die wir frfiher aueh bei Unte r suchungen fiber Mflchsi~urebakterien gefunden ha t t en ~. Es liegt nahe,

1 WO~0NICK, C. L., u. M. J. J o n s o n : J. biol. Chem. 235, 9 (1960). 20c~oA, S.: In: J. B. S~M~]~ ,,The Enzymes". S. 929. Academic Press Inc., 1)ublishers

New York (1952). a I~AT~ , S. : In: W. D. ~cEL~oY u. B. GLASS: ,,Amino Acid ~etabolism", S. 231. ]~altimore:

Johns Hopkins Press (1955). - - ST~ASS~A~, ~., u. S. WEI~KOVSE: J. Amer. chem. Soc. 74, 1726 (1952).

4 Vgl. die Arbeiten verschiedener Autoren bei 3. - - STRASSMA~, iV[., A. J. TEO~AS, L. A. LOCKE u. S. W]~OUSE: J. Amer. chem. Soc. 78, 228 (1956).

S c ~ o ~ L ] ~ , J., u. It. ~I~LE~: Zit. S. 539, Anm. 3. 6 SC~O~Mi)LLV, R, J., u. tt.-D. B]~Lrrz: Zit. S. 539, Anm. 2.

36*

544 SCHOR~i~nLER, H~PTNv, R U. BEnlTZ: Stoffwechseluntersuchungen ~n Mikroorganismen. IV

bier an eine Beteiligung der IsocRricase zu denken. Dieses Ferment war yon OLSON I in Penicillium chrysogenum nachgewiesen worden. Die sehr ~hnlichen Depressionen der spezifisehen Aktivit£ten ffir Serin und Glykokoll deuten weiterhin auf Zusammen- h~nge zwischen diesen beiden AminosSuren hin, wie sie bei zahlreichen Stoffwechsel- meehanismen bekannt geworden sind. Betrachtet man die Abnahme der spezi- fischen Aktivit~t in Molke (Spalte 6 der Tab. 5), so ergibt sich eine Gliederung der Aminos~uren in Gruppen, die sehr fiir die bier kurz erSrterten Zusammenh~tnge spricht. Zu erw&hnen ist schliel~lich noeh der auffallende Befund, dal] bei dem auf Molke geziiehteten Pilz ein Aktivit~tsiibergang in Prolin und Alanin praktiseh unter- bleibt.

Zur Klgrung der Biosynthese versehiedener Aminos~uren bei Penicillium camem- berti var. candidum fin Sinne hier besproehener MSgliehkeiten beabsiehtigen wir, mit ttilfe der Isotopenteehnik weitere Untersuehungen durchzuiiihren.

Zusammen]assung

Penicillium camemberti var. candidum wurde auf einem synthetischen N~hrboden und a ~ Molke in Gegenwart yon NaH14C03 geziichtet. Mycel und N~hrboden wurden in verschiedene Fraktionen aufgeteilt, die ~uf den Einbau yon 14C untersucht wurden. Beim Mycel ist CO 2 vornehmlich an der Synthese yon ~ueleins~uren und Protein beteiligt. Die Proteinaktivit~t verteilt sieh auf verschiedene Aminos~uren, vor allem aber auf Arginin, Threonin, Asparagins~ure, Glutamins~ure und Isoleucin. Mehr als die tt~lfte der N&hrbodenaktivit~t ist in den niehtfliiehtigen Carbonsauren enthalten. Die Verminderung der spezifischen Aktivit&ten bei der Ziichtung auf Molke zeigt, dal~ die AnwesenheR yon Carbon- und Aminos~turen synthetisehe Reaktionen zuriick- treten l~l~t. MSgliehe Synthesemechanismen warden diskutiert.

10Lsol% J. A.: Nature (Lond.) 174, 695 (1954).