Bioehern. Physiol. Pflanzen 175, (;11-620 (1980)

Studien an Cuscuta reflexa ROXB.

IV. Der Nachweis eines hohen Abscisinsäuregehaltes im Parasiten im Vergleich zum Wirt V icia faba L.

BERND IHL und FRIEDRICH JACOB

Sektion Biowissenschaften der Martin-Luther-Universität Halle, Wissenschaftsbereich Pflanzenphysiologie und Mikrobiologie

Studies ou Cuscuta reflexa ROXB.

IV. Evideuce of a Digh Abscisie Acid Couteut in the Parasite in Comparison with its Dost Vicia Jaba L.

Key Term lnde x: abseisic acid, parasitic nutrition; Cuscuta reflexa, Vicia faba.

Summary

Investigations on the endogenous level of growth affecting substances, which have proved to be growth inhibitors of wheat seedlings, have been carried out in the parasitejhost system of Cuscuta reflexa ROXB.jVicia faba L. The parasite Cuscuta contained a high level of endogenous growth in­hibitors. Ey using gas chromatography, abscisie acid was shown to be the most important inhibitor within Cuscuta' The maximum rontent of abscisic acid within the parasite was found in its haustorial region, where the level was mueh higher than that of host's inhibitor. A possible participation of abscisic aeid in the proeess of transferring Ulltrients from hast to p<uasite is discussed.

Einleitung

Der Parasit Cuscuta besitzt die Fähigkeit, den Organen seines Wirts einen großen Teil der Nährstoffe zu entziehen, selbst wenn es sich um starke sink-Orte wie jüngste Sproßorgane handelt (JACOB et al. 1968). Dieser Stofftransfer erfolgt über spezialisierte Organe des Parasiten, die Haustorien, deren zentralen Schlauchzellen sich bis zu den Leitbündelelementen des Wirtes erstrecken. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von DÖRR (1972) ließen keine direkte, plasmatische Verbindungen in Form von Plasmo­desmen zwischen den Siebröhren/Geleitzellen-Komplexen des Wirtes und den Schlauch­zellen des Parasiten erkennen, so daß die Möglichkeit des plasmatischen Weges beim Stoffühertritt als unwahrscheinlich angesehen wird. Auch WOLSWINKEL (1974) und TSIVro;l1 (1978a) nehmen an, daß der Ühertritt der Assimilate vom Wirt zum Parasiten über den Apoplasten erfolgt. Frühere Untersuchungen (JACOB et al. 1968) zeigten, daß der Umfang des parasitischen Zuckerentzugs aus dem Phloem des Wirtes ein relativ gleiehhleihellder Anteil der Gesamtmellge des aus dem Fütterungsblatt des Wirt ps aus­transportierten Zuckers ist. Die Menge erwies sieh als weitgehend unahhängig von Größe

A bkii TZ U ngen: A BA, Abs('isinsäure; DC, Düunsehiehtehromatogmphie; FG, Fris('hgewicht; Csp., Cuscuta-Spitzenregion; Cll., Cu'cuta-:\Iittelteil; CH., Cuscuta-Haustorialregion

612 B. IIIL und F. JACOJl

und Gewicht der Wirtspflanze bzw. des Parasiten, von der Anzahl der vom Parasiten angelegten Haustorien und von dem Vorhandensein wachsender, als sink-Orte wirksamer Sproßtcile des Parasiten. Es erscheint möglich, daß der Parasit an den KontaktsteIlen eine lokale Permeabilitätserhöhung veranlaßt, die dazu führt, daß ein bestimmter Anteil der transportierten Nährstoffmenge abgegeben wird (THATCHER 1942; JACOB et al. 1975). Für die besonderen parasitischen Leistungen von CusGuta könnte der Gehalt an endogenen Hormonen und deren Verteilung von Bedeutung sein.

ABou-MANDOUR et al. (1968) gelang es, aus CusGuta reflexa einen nicht näher identi­fizierten cytokininartigen Faktor zu isolieren. Die Autoren vermuteten, angeregt durch Befunde von MOTHES und ENGELBRECHT (1959), daß dieser Faktor eine Ursache für den parasitischen Stoffentzug aus dem Wirt ist. Dem stehen aber die Ergebnisse ver­gleichender Untersuchungen /lum Cytokininhaushalt in Wirt und Parasit von JACOB et al. (1975) gegenüber, wonach der Gehalt an Cytokininell in Cuseuta keinesfalls höher ist als im Wirt Vicia faba und diesem Hormon daher nicht die entscheidende Rolle bei der parasitischen Nährstoffaufnahme von Cuscuta zukommen kann. Bei der Ausbildung funktionstüchtiger Haustorien spielen Cytokinine bei Cuseuta aber eine sehr wesentliche Rolle (PAUYATH et al. 1978; TSIVION 1978b). IES düdte auf die Hallstol'ienbildung keinen entscheidenden Einfluß haben (LIBBERT und URBAN 1967), doch vermag der Befall durch Cuscuta den endogenen Auxinspiegel in der Wirtspflanze zu erhöhen (GUSTAVSOX 1946). Dem entsprechen auch Befunde, wonach von Cnseuta befallene Coleus-Pflanzen eine höhere Neigung zur Adventivwurzel­bildung zeigten als nicht befallene. TRONCHET (1960) berichtete über einen aus Samen von CU.'if:nta, isolierten, nicht näher identifizierten Inhibitor. In der vorliegenden Publikation wird über das Vorkommen des nativen Wachstumsinhibitors Abscisinsäure und weiterer endogener Hemmstoffe berichtet.

Material und Methoden

Als Pflanzenmaterial diente der bereits in früheren Versuchen benutzte Stamm von Cuscuta reflexa (JAroR 19(;G), sowi e Ficia (aba. L. (Sorte " Dreifach Weiße") a,ls Wirt. Die Kultur erfolgte im Gewä('hsha,us unter Langtagbedingllngen bei 18-24 °C. Untersucht wurden Stengelabschnit te para­sitierter und niehtparasitierter l'1:cia-Pflanzen sowie von Cuscuta-Sprossen die Spitzenregion, da.s Mittelteil ohne Haustorien und die Haustorialregion.

Das Frischmaterial wurde mehrmals mit 80%igem }lethano[ (lVIeOH) extrahiert lind anschließend die Extrakte bei 40°C im Vakuum bis zur wäßrigen Phase eingeengt. Dnrch Ausfrieren und Abfil­trieren erfolgte eine Y orreinigung. Ansehließend wurde bei plI 2,5 zunächst mit Ath ylacetat (EtOAe) und dann mit n-Butanol (n- BllOlI) ausgesehüttelt. Beide Auszüge wu rden über DEA E-Sepha,dex A-2i'l Säu len weiter gereinigt, entspre<'hend ei ner von G IÜB :> EH et a l. (1975) entwickelten Methode. Die Sit lll enabmessllngen betrugen 1,1 x 25 rln , Elution lind Fraktionierlln~ sind in Abb. 1 darge­stell t . Als weiterer Reini gullgssehri tt wnrrle die DC-Chromatogmphie durchgeführt. Wir benntzten Kieselge l GF251 (1 mm Srhichtdicke). Als Laufmittel diente Benzol: EtOAc: Aeeton : Eisessig =

80: ZO: 10: 2. Für eine gasehrolll~,tographi sch e Bestimmung war naC"h <l er DC ein weiterer Säu len­luuf über DEAE-Sephadex A-Z5 erforderlieh. In den Vorlauf-Fraktionen VI und V2 (vgl. Abb. 1, 3) auftretende neutrale Inhibitoren wurden mit 1 X HCI (0,5 h, 70 Oe) hydTolysiert, ansehließend mit EtOAe bei pH 2,f> ausgesehüttelt und an DEAE-Sephadex A-25 gereinigt. Qualitative und quantita­tive Bestimmung der endogenen Inhibitoren erfolgte im Weizenkeim lings-Hemmtest (vgl. DATHE

et al. 1978).

Studien an Cuscuta 1'eflexa 613

,'/ ,0.25; 02Sn , 05n I o.7Sn I 7.On I J.On I Elvlionsmilfel. Essigsövrekonzentrolion in tJO% tfeOll

2f 5f' . Kf .1fO . 2P~ 2fO Elvtionsvolumen (ml) , V1 , V2 ,1 5, "', 15, , FraK/ion

Wasser Kontrolle

C5p

J,.)osser kontrolLe

eH

J,Josser KonlroHe

-ti

10-S-

ASA

Abb.1. Hemmstoffgehalt verschiedener Cuscuta-Abschnitte. CSp 114 g FG, CM 125 g FG, CII 125 g FG, nach Chromatographie der EtOAe-Extrakte an DEAE­Sephadex A-25 und anschließendem Biotest (Weizenkeimlingshemmtest, LI L = Längendifferenz (cm) der Weizenkeimlinge zur Wasserkontrolle).

Ergebnisse

Die in den folgenden Abbildungen enthaltenen Histogramme stellen die Gehalte an endogenen Hemmstoffen dar, wobei jedes Diagramm das Ergebnis eines Einzelversuches repräsentiert. Die Ordinate gibt die Längendifferenz der mit Extrakt behandelten Wei­zenkeimlinge zu der unbehandelten Kontrolle in cm an, auf der Abscisse ist das Elutions­profil aufgetragen. Bereits bei einem ersten Vergleich von Cuscuta-Gewebe mit Gewebe

614 B. IIIT. uud F. JACOB

5 10 Rt (min)

Abb. 2. Oaschrornatoflramme der flereiniflten ABA-Praktion nach Veresterung mit Diazornethan (links) und nach Umlagerung des AHA-Methylesters im UV-Licht (rechts). Die Chromatographie wurde an 3 % XE 60 auf Chromosorb W bei 200 °C durchgeführt (Säule: 90 X 0,4 em, Trägergas: Stickstoff 68 ml/min).

von Vitia-Pflanzen ohne Cuscuta-Befall (Ganzpflanzenextrakt aller oberirdischen Pflanzenteile) fällt auf, daß Cuscuta im Verhältnis zu Vicia ein hemmstoffreiches Objekt darstellt. Bei diesen einführenden Versuchen wurde der EtOAc-Ausschüttelung bei pH 2,5 zunächst noch eine Petrolätherausschüttelung bei pH 7,5 vorgeschaltet. In diesem Petrolätherextrakt, der nicht weiter aufgetrennt oder gereinigt wurde, konnte sowohl bei Cuscuta als auch bei Vicia im Weizenkeimlings-Hemmtest nur eine sehr geringe Hemmaktivität festgestellt werden, so daß in den folgenden Versuehen auf diese basische Petrolätherreinigung verzichtet wurde. Der EtOAe-Etxrakt zeigte nach Auftrennung an DEAE-Sephadex A-25 Säulen sowohl bei Cuscuta als auch bei Vicict Hemmaktivität in solchen Elutionsbereichen, in denen auch freie ABA erscheint (bei Cnscuta in den Fraktionen 5 bis 8, bei Vicia in den Fraktionen 4 und 5).

Untersucht man die endogenen Hemmstoffe in CU8cuta getrennt in den Bereichen Spitzenregion (CSp), mittlerer, haustorienfreier Teil (CM) und basaler, funktionstüchtige Haustorien tragender Abschnitt (e1l), so erhält man die folgenden Ergebnisse:

In der EtOAc-Fraktion finden wir nach Auftn'l1nung an DEAE-Seph. A-25 in den Fraktionen 5-8 (bei CSp [) und G) eine starke biologische Hemmaktivität. In diesem Elutions-Bereieh erscheint bei der angewandten Methode freie ABA.

Nach unseren Ergebnissen (Abb. 1) existiert ein Gradient in der endogenen ABA­Konzentration, wobei der Gehalt an freier ABA in der Spitze am geringsten (CSp 650,ug ABA-Äqu/kg FG) und im Haustorialbereich am höchsten(CH 1030,ug ABA-Äqujkg FG)

..6L (em)

VI I V2 11

Studien an Cuscula retlea;a

Fraktion

o -+--I--+-,-,---r-rl--r-rT--,-h-..."rr-h-~--,-- Wasser KonlroUe

-5

-10 ~------------~------------------- 10-5

CSp -15

Wasser KanfroUe

eH -1.

615

Abb. C5. Hemmslotfgehalt der C/lscata 8pitzenregion (C8p) und des Cuscuta Hauslorialteils (CH) nach Chromatographie der n-BuOH-Rxtrakte an ])EAE-Sephadex A-25 und anschließendem Biotest.

ist. Der mittlere Teil liegt in seinem Wert dazwischen (CM 757 ftg ABA-Äqujkg FG). Um abzusichern. daß es sich bei der in den Fraktionen 5 -8 enthaltenen Substanz tatsächlich um ABA handelt, wurdC11 weitere Reinigungs- und Nachweisschritte durchgeführt.DC Co-Chromatographie von den Fraktionen 5-8 mit ABA ergab eine Fluoreszenzlöschung in der mit ABA korrespondierenden Bande (RF 0,27). Reextraktion bei diesem R F-

Wert mit MeOH und anschließende Biotestung zeigte erneut eine deutliche Hemm­aktivität. Durch eine zweite Reinigung an DEAE-Sephadex A-25, eine weitere verglei­chende DC Co-Chromatographie und abschließende Gaschromatographie konnte dieser Inhibitor eindeutig als ABA identifiziert werden (Abb. 2).

Bei den in den Vorlauffraktionen auftretenden Hemmaktivitäten (Csp 64,ug ABA­Äqu!kg FG, CM GO,5 ftg, eH (j:3 ,ug) (vgl. Abb. 1) konnte auf Grund des chromatographi­sehen Verhaltens vermtüpt ,wrden. daJ3 sie von einem ABA-Konjugat hervorgerufen werdpn. Naeh saurer H~-drol~·se dieser Vorlaufreaktionen und ansehlief3ender Aus­sehüttelung mit EtOAe und Chromatographie an DEAE-Sephadex A-25 prhieltel1 wir eine sehwaehe biologische Hell1l1laktivität im Bereich (kr freien ABA (Fraktion 4) als Hinweis für die RiehtigkPit dieser Annahmt'. Die naeh Hydrolyse in dPll Vorlauffrak­tionen verbleibencleHellllllaktivität war abel" bedeutend höher als die der Fraktion 4

616

c,L (em)

1 JI1 1 V2 11

B. IHL und F. heoB

1I, 15", Fraktion

o +---._--''-'-h-+-L..L.-'-'---L.LJ..+-1f--L-'---....L-.....L- Wasser kontroll!

-5-

WOsser Kon/roUe

-5

+-___ _._t-----c-lI-S-c-u,-ta- 10-S

r---------~~------------------- 10-~ -1fJ ABA

Abb. 4. Hernrnstoffverteilung zw/:schen Wirt (parasitierte Stengelabschnitte ) und Parasit (Haustorial­region). Chromatographie der EtOAc-Extrakte an DEAE-Sephadex A-25 und anschließendem Biotest (FG jeweils 100 g).

(freie ABA). Danach besteht der neutrale Inhibitor der Vorlauffraktionen vermutlich aus 2 Substanzen, von denen die hydrolisierbare ein ABA-Konjugat sein könnte, die Hauptkomponente aber ein anderer, nicht näher identifizierter neutraler Hemmstoff. Ähnliche Resultate hatten auch DATHE et al. (1978) bei Untersuchungen über Inhibitoren in Birken.

Auch der n-Butanol-Extrakt (n-BuOH) erhielt weitere Hemmstoffe. Diese waren vor allem im Bereich der beiden Vorlauffraktionen (V 1, V 2) festzustellen, sowie im Bereich der Fraktion 7 (Abb. 3). Der Hemmstoff der Vorlauffraktionen wurde weiter untersucht. Um zu prüfen, ob es sich bei dieser neutralen Verbindung ebenfalls um ein ABA-Konjugat handelt, wurde wiederum eine saure Hydrolyse durchgeführt, danach mit EtOAc ausgeschüttelt und die EtOAc-Fraktion an DEAE-Sephadex A-25 aufge­trennt. Die Biotestung ergab, daß in den Vorlauffraktionen keine Hemmaktivität mehr auftrat, wohl aber in den Fraktionen, in denen freie ABA zu erwarten ist (Fraktionen 4, 5) Der nicht näher identifizierten Hemmstoffe im Bereich der Fraktion 7 lag im Haustorial­bereich von Cuscuta ebenfalls in einer höheren Konzentration vor als in der Spitzenregion.

Von besonderem Interesse für die Klärung der Frage eines hormonvermittelten Assimilatübertritts vom Wirt zum Parasiten Cuscuta ist der Vergleich des endogenen Hormongehaltes in der Haustorialregion von Cuscuta mit dem des parasitierten Stengel­abschnittes von Vicia. In der Abb. 4 sind die bedeutenden Unterschiede im Hemmstoff-

Studien an Cuscuta reflexa

5, ~,

-5

-10

O+--r--~"",-rrO+".-rr.-.-.-­-1

-10

L:JL (em)

Cvscuta

Abb. 5. Hemmstoffverteilung zwischen W'irt und Parasit.

Fraktion

Vossu KIJfIlroile

Wosser Kontrolle

617

Chromatographie der n-BuOH Extrakte ,ln DEAE-Sephadex A-25 und anschließendem Biotest.

gehalt des EtOAc-Extraktes zu erkennen. Die jeweils stärkste Wirkung im Weizenkeim­lings-Hemmtest ergab sich sowohl bei Vicia als auch bei Cnscnta in der Fraktion 5 Cnscuta übertrifft seinen Wirt Vicia im Hemmstoffgehalt aber um ein Vielfaches. Die Natur dieses Hemmstoffes konnte für Cuscuta durch die echon erwähnten chromato­graphischen Vergleichs- und Nachweisverfahren eindeutig als ABA bestimmt werden. Der Hemmstoff aus Vicia, der nach DEAE Sephadex A-25 Säulencbromatographie in den gleicben Fraktionen wie ABA erscheint, und der auch mit dem als ABA identifi­zierten Hemmstoff aus Cuscuta fraktionsmäßig korrespondiert, konnte auf Grund zu geringer biologischer Ausgangsaktivität noch nicht eindeutig, charakterisiert werden.

Die hemmenden Wirkungen des n-BuOH-Extraktes sind aus Abb.5 ersichtlich. Sowohl von Cuscuta als auch von Vicia zeigen die Vorlauffraktionen (bei Vicia etwas verzögert und nur in Vorlauffraktion 2) eine Hemmaktivität, hervorgerufen durcb einen neutralen Hemmstoff. Bei Cuscuta wurde versucht diesen Hemmstoff näher zu charakterisieren (s. 0.). Die bei Cuscuta auftretende Hemmaktivität im Bereich der Frak­tion 7, hervorgerufen durch einen Hemmstoff unbekannter Natur, fehlt bei Vicia völlig. Insgesamt läßt der Wirt Vicia auch im BuOH-Extrakt einen geringeren Gehalt an endogenen Hemmstoffen als Cuscuta erkennen.

Um zu klären, ob der parasitische Befall durch Cuscuta den Gehalt an endogenen Hemmstoffen in Vicia beeinflußt, wurden Stengelabschnitte von Vicia, die mit Cuscuta

618 B. IUL und F. JACOB

infiziert waren (Haustorien wurden herausgetrennt und verworfen) mit entsprechenden Stengelabschnitten ohne Cuscuta-Befall vergleichend untersucht. Es zeigt sich, daß durch die Infektion mit dem Parasiten Cuscuta keine oder nur unbedeutende Veränderungen im Gehalt an endogenen Hemmstoffen im Wirt feststellbar waren. Nicht mit Cuscuta infizierte Stengelabschnitte enthielten 28,2 flg ABA Äqujkg FG, mit Cuscuta infizierte Stengelabschnitte 20flg ABA Äqujkg FG.

Diskussion

Der Parasit Cuscuta reflexa erwies sich in unseren Untersuchungen als überraschend reich an Hemmstoffen. In verschiedenartigen Früchten und Samen sind zwar Hemmstoff­gehalte von mehreren Milligramm ABA Äqujkg FG festgestellt worden, in vegetativen Organen liegen die durchschnittlich ermittelten endogenen ABA-Konzentrationen aber meist weit darunter (Mr1,BORROW 1967; DÖRFLING 1971; Mr1,BoRROW 1978). Innerhalb Cuscuta existiert ein zur Spitze hin abfallender Gradient an endogener ABA, wobei aber selbst diese wachsende Spitzenregion mit durchschnittlich 600 flg ABA Äqujkg FG in Anbetracht ihrer vegetativen Natur immer noch ein hemmstoffreiches Objekt darstellt. Deutlich übertroffen wird sie aber von der Haustorialregion des Parasiten, in der ABA­Konzentrationen von über 1000 flg ABA Äqujkg FG festgestellt werdtm konnten. Ver­gleicht man diese Werte mit dem ermittelten Gehalt an endogenen Hemmstoffen in parasitierten Vicia-Stengelabschnitten, so ist festzustellen, daß der Parasit in dem Be­reich engsten Kontaktes mit seinem Wirt, in welchem die Haustorien den Stofftransport vermitteln, eine mehr als fünfzigfache Menge an endogenen Hemmstoffen bzw. ABA gegenüber seinem Wirt besitzt ..

Neben der bekannten Tatsache, daß alternde oder ruhende Organe einen hohen endo­genen ABA-Gehalt besitzen, gibt es in der Literatur auch Befunde, wonach hohe endogene ABA-Konzentrationen in jungen Tomatenfrüchten während ihres stärksten Wachstums und im Roggen während der Embryogenese und Fruchtentwicklung (DÖRFLING 1970; DATHE 1978, s. a. BORRIS 1978) auftreten. Diese Organe sind Orte mit hoher Nährstoff­attraktivität, wie das auch für den Parasiten Cuscuta zutrifft. Über die Funktion der ABA in jungen Organen wissen wir noch nichts Gesichertes. Es wäre aber denkbar, daß ein als sink wirkendes, wachsendes Pflanzenl)J'gan außer durch hohe Syntheseaktivität auch dadurch charakterisiert wird, daß durch eine hormonell regulierte, erhöhte Mem­branpermeabilität der Siebröhren das Nährstoffangebot für das umliegende Gewebe erhöht wird. HursINGA (1979) postulierte eine Kontrolle der Be- und Entladungsprozesse durch eine Turgorregulation. Auch Cuscuta könnte sniner Auffassung nach durch eine lokale Erhöhung des Wasserpotwtials im Apoplastell, unmittelbar dort, wo das Hausto­rium an die Wirtssiebröhrell gelangt, diese veranlassen, Inhaltsstoffe zu exportieren, die sowohl vom Parasiten als auch vom benachbarten Wirtsparellchym aufgenommen werden könnten. VOll eIn Abscisinsäure ist bekannt, daß sie an der Turgorregulation der Schließ­zellen beteiligt ist. Sie vermag die Permeabilität pflanzlieher Zellen für Wasser zu er­höhcu(GLINKA und REINIlOLD 1 H71), hemmt dcn Influx von K -. und Cl- Ionen in Schließ­zellen und Parench}Tntzellen (M\XSFI 1-:1,]) und .JOXES 1971: HO}{,fOX und BRUCE 1972;

Studien an Guscuta reflexa 619

REED und BO~NER 1979) stimuliert aber andererseits den K + und CI- Ionenflux ins Xylem (KARl\WKER und VA~ STEVENINCK 1978). MALEK und BAKER (1978) berichteten von einer Hemmung des H+-Influxes durchABA und des damit verbundenen Saccharose Co-Transportes in die Zellel1. Einen erhöhten Efflux von Amino-Stickstoff in das Außen­medium von Lemna-Kulturen nach ABA-Behandlung konnten ANDRES und SMITH (1976) nachweisen.

Der von uns festgestellte, relativ hohe Gehalt von ABA in Cuscuta im Vergleich zum Wirt, läßt einen Zusammenhang mit dem parasitischen Stoffentzug als möglich erschei­nen. Außerdem könnte aber auch das besondere WachstumsverhaIten der Cuscuta mit dem kontinuierlichen Altern und Absterben des basalen SproßteiIs mit dem hohen endogenen ABA-Gehalt und dem festgestellten ABA-Gradienten in Beziehung stehen.

Wir danken den Mitarbeitern des Instituts für Biochemie der Pflanzen der AdW Halle, Herrn Dr. W. DATIIE und Frau J. DEY für die wertvolle Unterstützung der Arbeit, insbesondere bei der Durchführung der Bioteste.

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Eingegangen am 21. Februar 1980.

Anschrift der Verfasser: Dipl.-Biol. B. IHL und Prof. Dr. F. JACOB Sektion Biowissenschaften der Martin-Luther-Universität, Wissensehaftsbereich Pflanzenphysiologie und Mikrobiologie, DDR-4020 Halle (Saale), Am Kirchtor 1.