Synthese von 0-Glycopeptiden des tumorassoziierten T N - und T-Antigen-Typs und deren Ankniipfung an Rinderserumalbumin"" Von Horst Kunz* und Stefan Birnbach Professor Siegjiried Hiinig turn 65. Geburtstag gewidrnel

Nach zellbiologischen und biochemischen Untersuchun- gen uben Glycoproteine bei der Zelldifferenzierung und bei der Regulierung des Zellwachstums wichtige Funktio- nen ausl'l. Normale Zellen und unreguliert wachsende Tu- morzellen unterscheiden sich stark im Glycolipid- und Glycoproteinprofil ihrer Zellmembranenlzl. Die Glycopro- teine der Tumorzellmembranen werden als tumorassozi- ierte Antigene angesehen. Nachgewiesen wurde diese Ei- genschaft besonders fur das T-Antigen, ein O-Glycopro- tein, das in enger Beziehung zu Glycophorin A steht und als typisches Strukturelement 2 die a-glycosidisch an Serin oder Threonin gebundene Disaccharideinheit PGal( 1- 3)GalNAc enthilt[']. Dabei sind haufig mehrere solcher- maBen glycosylierte Aminosauren unmittelbar miteinander verknupft. Auch das monosaccharidische Strukturelement 1, das T,-Antigen, findet sich in den Membranen mensch- licher Epitheltum~rzellen[~~ und in den Erythrocyten- Membranen von Leukopenie- und Thrombopenie-Patien- ten''].

5a Ser 65+ 9Oh.B 5a Thr 60+ 4%p 5b Ser 51 + 20%p 5b Thr 30 + 2 1% .B

HO

HO 6. Ser 86 6a Thr 85 6b Ser 70 6b Thr 60

AcNH I HO AcNH 1 TN T

T T p p I I -Ser- -Thr- -Ser- -Thr-

1 2

Entsprechend der immunologischen Bedeutung der Strukturen 1 und 2 sind Glycopeptide vom TN-lsl und T- Antigen-Typt6.'] schon mehrfach hergestellt worden. Fur die immunologische Anwendung synthetischer Antigene ist jedoch deren Fixierung auf einem biologisch sinnvollen Trager notig. Wahrend das Disaccharid p-Gal( 1 -3)Gal- NAc des T-Antigens uber kunstliche Ankergruppen (Spa- cer) an Rinderserumalbumin gebunden werden konnte[*l, war die Verkniipfung von Glycopeptiden vom Typ 1 und 2 rnit biologischem Material bisher noch nicht gelungen.

Wir beschreiben die Synthese von Glycotripeptiden des tumorassoziierten TN- und T-Antigen-Typs, die dem N- Terminus von Glycophorin A rnit M-Blutgruppenaktivi- tatf9' entsprechen, und erstmals deren Aufpfropfung auf Rinderserumalbumin. Dabei kommen wir ohne Spacer aus, das heiBt wir erreichen eine ,,natiirliche" Verknup- fung der Antigenstrukturen rnit dem biologischen Trager- molekill.

Als Schutzgruppen verwenden wir im Glycosylierungs- schritt die erprobte Kombinationllol aus N-terminaler 9- Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Gruppet'll und C-ter- minalem Benzylester und bei den Kettenverlhngerun- gen die loslichkeitsfiirdernde 2-(4-Pyridyl)ethoxycarbo- nyl( Pyoc)-Gruppe["I.

[*] Prof. Dr. H. Kunz, Dip1.-Chem. S. Birnbach lnstitut fur Organische Chemie der Universitlt Johann-Joachim-Becher-Weg 18-20, D-6500 Mainz

vom Fonds der Chemischen Industrie gefardert. [**I Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft und

3 Fmoc-M-OBzl +

Fmoc-M-OBzl 3 +-

N3 I

AcO I 1" N3 Ar

R - k O B z l R-h-OBzl

5b. X = N,. R = Fmoc

6b , X = AcNH, R = Frnoc

50. X = N,, R = Frnoc

6a, X = AcNH, R = Frnoc

L 7 a , X = AcNH, R = H B L 7 b , X = AcNH, R = H

Schema 1. AA=Ser oder Thr. Uzl=Benzyl, Bz=Henzoyl. A: I ) NaBH,/ NiCII, 2) Ac>O/Pyridin: B: Morpholin.

Tabelle 1. Ausbeuten der Verbindungen 5 und 6.

Verb. AA Ausb. [%I I Verb. AA Ausb. ["/I

Schema 1 zeigt die Synthese der partiell geschutzten Se- rin- und Threonin-Derivate rnit TN- 7a oder T-Antigen- struktur 7b (siehe auch Tabelle 1). Fmoc-Serin-benzylester 3, AA= Ser["l, und Fmoc-Threonin-benzylester 3, AA=Thr, werden rnit den Glycosyldonoren 4a[I3l und 4bI6' uberwiegend zu den a-Glycosiden 5 umgesetzt. Die insbesondere bei den Disaccharid-Derivaten 5b auftreten- den p-Glycoside werden chromatographisch abgetrennt. Nach Reduktion der Az idof~nk t ion~ '~* '~~ und sofortiger Acetylierung werden die vollgeschiitzten O-Glycosylami- noslure-Derivate 6 erhalten. Von diesen empfindlichen Verbindungen kann die Fmoc-Gruppe in Morpholin['ol se- lektiv abgelost werden. Fur den Erfolg der weiteren Syn- these ist entscheidend, daB die so erhaltenen N-unge- schiitzten Verbindungen 7 rnit ausreichender Geschwin- digkeit weiter umgesetzt werden konnen, da sie sich sonst durch intramolekulare p-Eliminierung des Glycanteils zer- setzen. Fmoc-geschiitzte Carboxykomponenten reagieren zu trage.

Die kettenverllngernden Schritte (Schema 2) unter Bil- dung von 8 und 10 gelingen dagegen effektiv mit Pyoc- Serin['51 bzw. rnit den Pyoc-geschiitzten Glycodipeptiden 9 in Gegenwart von Ethyl-2-ethoxy- 1,2-dihydrochinolin-l- carboxylat (EEDQ)["]. Bei der selektiven Deblockierung der Carboxyfunktion an den vollgeschiitzten Glycodipepti- den 8 zeigt sich ein weiterer Vorteil der Pyoc-Gruppe: Sie ist im Gegensatz zur Fm~c-Gruppe"'~ stabil gegen Hydro- genolyse. Zur Vorbereitung der Verkniipfung rnit dem Al- bumin wird aus den vollgeschutzten Glycopeptiden 10 se- lektiv der Pyoc-Rest entfernt, indem er zur Pyridiniumform methyliert und rnit Morpholin in Dichlormethan[I2] ohne Beeintrachtigung der baseempfindlichen 0-glycosidischen

3 54 0 VCH Verlagsgesell.vchaft mhH, 0-6940 Weinheim. 1986 0044-8249/86/0404-0354 0 02.50/0 Angew. Chem. 98 (1986) Nr. 4

Pyoc-Ser-OH + 7a, b, AA = Ser

kM Pyoc-Ser-Ser-OBzl 80, 75%

8b. 51% I

HO (OH I

HO m Pyoc-Ser-Ser-OH 9a, 1 00%

I Y 9b, 90%

9a + 70 , AA = Thr 9b + 7b. AA = Thr

Pyoc-Ser-SerlThr-OBzI 1 Oa, 81 X

lob. 44% I I

J c y

b y Ac-Ser(Ac)-Ser-Thr-OBzI 1 l a , b

I I

Ac-Ser-Ser-Thr-OH 12a, 74% I I Y ' Y ' 12b, 76%

7-11:a. Y = 1% = Ac3TN

AcNH

b, y = roo&oq 002 OBZ = Ac4Bz,T

AcO AcNH

12a, Y' = T,; 12b, Y' = T

Schema 2. C: I ) CHII/CH:C12. 2) Morpholin/CHzC12. 3) AczO/Pyridin D: I) HdPd. 2) Hydrazinhydrat/Methanol. Die Ausbeute an 12 bezieht sich auf 10.

Bindungen von Serin und Threonin zerlegt wird. Der freie terminale Serinrest wird zu 11 acetyliert, damit die freien Aminofunktionen keine basekatalysierte Zerstiirung der 0- glycosidischen Bindungen bewirken und splter auch nicht die immunologische Erkennung der Kohlenhydrat-Peptid- Verknupfungsregion beeintrachtigen kiinnen1'81. Nach Cty- drogenolyse der C-terminalen Benzylester und schonencier Spaltung aller Ester[''l werden die im Kohlenhydrarteil deblockierten Glycopeptide mit TN- 12a und T-Antigen- struktur 12b in hoher Ausbeute erhalten. Ihre Struktur und Reinheit wird durch ''C-NMR-Spektren[201 eindeutig be- legt.

Die Verknupfung der synthetischen Antigen-Glycopep- tide 12 mit Rinderserumalbumin (BSA) - vermutlich an den E-Aminofunktionen der Lysinbausteine -, kann nur in wlDriger Lasung durchgefiihrt werden (Schema 3). Die Konjugate 13a und 13b werden durch Dialyse gegen Was- ser von niedermolekularen Verunreinigungen befreit. Sie enthalten nach photometrischer Kohlenhydratbestim- mung[''] (N-Acetylgalactosamin/Galactose als Standard) ca. 130 pg Kohlenhydratll mg Konjugat (13a) bzw. 281) pg KohlenhydraUl mg Konjugat (13b). Das bedeutet, tia0 von den etwa 60 Lysinresten von BSA 25 bzw. 38 mit den synthetischen tumorassoziierten TN- bzw. T-Antigenstruk- turen belegt sind. Die Konjugate 13 sind somit die enten immunologisch relevant gebundenen synthetischen GI) co- peptide mit den tumorspezifischen Kennstrukturen 1 und

ACNH I BSA

120 + Ac-Ser-Ser-Thr-NH- BSA E I

12b BSA +

E

HO Ho& ,3a

HO

HO

AcNH

Ac-Ser-Ser-Thr-NH- BSA I

Schema 3. E: Rinderserumalbumin (BSA), (wasserlosliches) Et N-C-N(C H2)) N MeZ, 1 -Hydroxybenzotriazol. 4°C [2 I I.

2, die dariiber hinaus nur iiber natiirliche Peptid- und Amidbindungen an das biologische Trlgermolekiil gebun- den sind. Mit 13a und 13b sollte sich die Bildung von An- tikarpern gegen die fur Tumonellmembranen typischen Strukturen induzieren lassen.

Eingegangen am 19. November 1985 [Z 15411

[I] Ubersicht: R. T. Schwarz, R. Datema, Adu. Carhohydr. Chem. Biochem.

[2] Vgl. beispielsweise W. W. Young Jr., S. Hakomon, ACS Symp. Ser. 80

[3] G. F. Springer, P. R. Desai, M. S. Murthy, E. F. Scanlon, ACS Symp.

141 J. P. Carton, A. T. Nurdem, Nature (London) 282 (1978) 621. 151 B. Ferrari, A. A. Pavia, Tetrahedron 41 (1985) 1939. [6] H. Paulsen, M. Paal, M. Schultz, Tetrahedron Lett. 24 (1983) 1759. [7] V. Verez Bencomo, P. Sinay, Glycoconjugate 1. 1 (1984) I . (81 H. Paulsen, M. Paal, Carbohydr. Rer. 113 (1983) 203. 191 M. Tomita, V. F. Marchesi, Proc. Not. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2964. [lo] P. SchultheiO-Reimann, H. Kunz, Angew. Chem. 95 (1983) 64; Angew.

Chem. lnt. Ed. Engl. 22 (1983) 62; Angew Chem. Suppl. 1983, 39. [Ill L. A. Carpino, N. Y. Han, J . Org. Chem. 37(1972) 3404. [I21 H. Kunz, S. Birnbach, Tetrahedron Lett. 25 (1984) 3567. [I31 H. Paulsen, J.-P. Hdck, Carbohydr. Res. 101 (1982) 89. [I41 K. Heyns, D. Feldmann, D. Hadamczyk, J. Schwentner. J. Thiem, Chem.

(I51 Hergestellt nach in Lit. (121 angegebenen Verfahren: Fp = 145°C. [a]&'

[I61 G. Malek, B. Belleau, J. Am. Chem. SOC. 90 (1968) 1651. [I71 J. Martinez, J. C. Tolle, M. Bodanszky, 1. Org. Chem. 44 (1979) 3596. [IS] Wir danken Herrn Dr. R. Wieser, lnstitut fur Toxikologie der Universi-

tgt Mainz, fiir wertvolle Diskussionen und Ralschlilge in immunologi- schen Fragen sowie fiir die Kohlcnhydratanalysen an den Konjugaten 22 und 23 nach 1191.

[I91 M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, F. Smith, Anal. Chem. 28 (1956) 350.

[20] I2a: [a]L2 + 122.8 (c- 1.2, H20); 12b: [a]g +80.8 (c=0.8. H20). 100.6MHz-"C-NMR (DzO, CSz int.): 12r: 6- 174.54, 174.44, 173.72, 171.99, 171.12, (5xC-0); 98.90 (C-I an Thr), 97.92 (C-1, gebunden an Se?): 57.86, 55.53, 53.49 (C-a von Ser'.', Thr); 22.27, 22.12, 21.82 (CHj, NAc), 17.90 (CH3. Thr). 12b: 6=174.78, 174.30, 174.17. 173.92, 171.60, 170.28, (6x C=O): 104.32, 104.24, @Gal-C-1'). 98.58 (C-l an Thr) 97.58 (C-1 an Ser), 58.63,55.13.53.21,(C-avon Ser'.2,Thr),22.05. 21.78.21.44,

40 (1982) 287.

(1978) 357.

Ser. 80(1978)311.

Ber. 114 (1981) 232.

-4.0 (c= 1, DMF).

(CH3, NAc), 17.49 (CHj, Thr). [21] W. KBnig, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970) 788.

Angew. Chem. 98 (1986) Nr. 4 0 VCH Verlagsgesellschaft mbH 0-6940 Weinheim. 1986 0044-8249/86/0404-0355 S 02.SO/O 355