Tierärztliche Hochschule Hannover

Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin-like growth factor systems in vitro und der peripartalen Expression von IRS1

und IRS2 im Plazentom und in interplazentomaren Bereichen des Rindes

in vivo

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der

Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Lisa Lenz, geb. Schütte

Helmstedt

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover 1. Gutachterin: Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke Institut für Reproduktionsbiologie Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2015 Diese Arbeit wurde unterstützt von Pfizer Inc.

Für Marko, Frieda und Lennard

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

2. Literaturübersicht

2.1. Der bovine Uterus 3

2.2. Die bovine Plazenta 4

2.3. Peri- und postpartale Änderungen in Uterus und Plazenta 7

2.4. Komplikationen im Puerperium 9

2.5. Das IGF-System 11

2.5.1. Liganden des IGF-Systems 13

2.5.1.1. IGF1 14

2.5.1.2. IGF2 15

2.5.2. Rezeptoren des IGF-Systems 15

2.5.2.1. IGF1R 16

2.5.2.2. IGF2R 17

2.5.2.3. HR 18

2.5.3. IGFBPs 19

2.6. Das IGF-System in der Plazenta und im Zusammenhang mit 21

der Fortpflanzung

2.7. IRS-Proteine 26

2.8. EGF 28

3. Material und Methoden

3.1. In vitro Versuche

3.1.1. Zelllinien 29

3.1.2. Isolation BUVEC 29

3.1.3. Kultivierung der Zellen 30

3.1.4. LDL-Färbung 31

3.1.5. Quantifizierung der Zellen 32

3.1.6. Proliferations-Assay 32

3.1.7. Motilitäts-Assay 35

3.1.8. Molekularbiologie 36

3.1.9. Proteinbiochemie 39

3.1.10. Statistische Auswertung 43

3.2. Untersuchung von Proben aus der in vivo Studie

3.2.1. Material und Gewebeentnahme und -aufbereitung 44

3.2.2. Gruppe 1: Proben der präpartalen Phase 44

3.2.3. Gruppe 2: Proben der postpartalen Phase 45

3.3. Histologie 47

3.3.1. Protokoll der Handeinbettung 47

3.3.2. Protokoll der automatischen Einbettung 47

3.3.3. Vorbereitung der Schnitte für Histologie und Immunhistochemie 48

3.3.4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung 49

3.3.5. Immunhistochemie 50

4. Ergebnisse

4.1. Ergebnisse der in vitro Versuche 53

4.1.1. Ergebnisse der RT-PCR 53

4.1.2. Untersuchung des Einflusses von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF 56

und IGF2+EGF auf die Proliferation plazentarer Zellen in vitro

4.1.2.1. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BCEC 58

4.1.2.2. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei F3 Zellen 59

4.1.2.3. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei Fibroblasten 60

4.1.3. Einfluss von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF, EGF und 61

IGF2+EGF auf die Motilität plazentarer Zellen in vitro

4.1.3.1. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BCEC 62

4.1.3.2. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei F3 Zellen 63

4.1.3.3. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei Fibroblasten 64

4.1.3.4. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BUVEC 65

4.1.4. Aktivierung verschiedener Signalwege in plazentaren Zellen in vitro 66

4.1.4.1. Aktivierung des MAPK Kinase 42/44, Akt-Kinase und 66

p38-MAP Kinase Signalweges bei BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten

4.1.4.2. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei BCEC 68

4.1.4.3. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei F3 Zellen 70

4.1.4.4. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei Fibroblasten 72

4.2. Ergebnisse der in vivo Studien 75

4.2.1. Morphologie von interplazentomaren Gewebe und Plazentom 75

4.2.2. Immunhistochemie 76

4.2.2.1. IRS1 76

4.2.2.1.1. IRS1-Expression im Plazentom 77

4.2.2.1.2. IRS1-Expression im interplazentomaren Gewebe 80

4.2.2.2. IRS2 83

4.2.2.2.1. IRS2-Expression im Plazentom 83

4.2.2.2.2. IRS2-Expression im interplazentomaren Gewebe 86

4.2.2.2.3. Zusammenfassung der immunhistologischen 89

Untersuchungen an Plazentom und interkarunkulärem Gewebe

5. Diskussion 91

5.1. Wirkung von IGF1 und EGF 91

5.2. Wirkung von IGF2 und EGF 97

5.3. Expression von IRS1 und IRS2 mRNA in BCEC, F3-Zellen und

Fibroblasten 100

5.4. Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 und IRS2 101

5.5. Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und Vergleich mit 102

IGF1 und IGF2

5.6. Expression von IRS1 und IRS2 im interplazentomaren Gewebe 106

und Vergleich mit IGF1 und IGF2

5.7. Schlussfolgerung 109

6. Zusammenfassung 110

7. Summary 113

8. Literaturverzeichnis 116

9. Anhang 135

9.1. Abkürzungen 135

9.2. Puffer und Lösungen 140

9.3. Reagenzien 146

9.4. Verbrauchsmaterialien 150

9.5. Geräte 151

9.6. Abbildungsverzeichnis 154

9.7. Tabellenverzeichnis 156

10. Danksagung 156

- 1 -

1. Einleitung

Das insulin-like growth factor (IGF)-System spielt während der Trächtigkeit und auch

post partal beim Rind eine große Rolle. Den einzelnen Komponenten kommen

verschiedene Aufgaben zu. Unter anderem sind sie wichtig für die feto-maternale

Kommunikation, das fetale Wachstum und das der Plazenta, sowie die entsprechende

Nährstoffversorgung des Fetus über die Plazenta (Giudice et al., 1995; Klauwer et al.,

1997; Forbes und Westwood, 2008). Durch die bekannte positive Wirkung des IGF-

Systems auf die Wundheilung (Lynch et al., 1987; Bitar, 1997) ist auch eine Beteiligung

an den Heilungsprozessen des Uterus nach der Geburt denkbar (Piechotta et al.,

2012), auch durch immunmodulatorische Effekte von IGF1 (Vangroenweghe et al.,

2005).

Ein im Puerperium verringerter IGF1-Spiegel im Blut wird mit verzögerter

Uterusinvolution und erhöhten Entzündungsgraden des Uterus in Verbindung gebracht

(Wathes et al., 2007; Wathes et al., 2009; Wathes et al, 2011), postpartale

Erkrankungen sind beim Rind von enormer wirtschaftlicher Bedeutung, weshalb die

genaue Rolle des IGF hierbei geklärt werden soll.

Ein weiterer potenter Wachstumsfaktor dessen positiver Einfluss auf die Plazenta

schon nachgewiesen wurde, ist EGF (Miettinen et al., 1995; Dilly et al., 2010;

Hambruch et al., 2010). Im Rahmen dieser Dissertation soll auch das mögliche

Zusammenwirken dieser beiden Stoffe untersucht werden.

Dafür wurden verschiedene Zelllinien, bovine Karunkelepithelzellen (BCEC),

Trophoblastzellen (F3), Fibroblasten und bovine Endothelzellen der Nabelvene

(BUVEC), aus der bovinen Plazenta gewonnen und der Einfluss von IGF1, IGF2, EGF

und einer Kombination aus IGF1+EGF bzw. IGF2+EGF auf die Proliferation und

Motilität dieser Zellen in vitro analysiert. Weiterhin wurden mit der MAP-Kinase 42/44,

der Akt Kinase und der p38-MAP Kinase mögliche intrazelluläre Signalwege nach

Aktivierung durch bereits genannte Faktoren mittels Western Blot untersucht.

Für eine Kommunikation zwischen IGF und EGF innerhalb der Zelle und eine

Vermittlung der Signale nach IGF-Aktivierung, kommen mit großer Wahrscheinlichkeit

die IRS-Proteine in Frage (Myers et al., 1992; White, 1997; Lassarre und Ricort, 2003;

- 2 -

O’Connor, 2003). Aus diesem Grund wurde eine Lokalisation der IRS1- und IRS2-

Proteine in Plazenta und Uterus des Rindes, mittels Immunhistochemie,

vorgenommen. Hierfür wurden Proben von Rindern gewonnen, die entweder eine

Sectio caesarea oder eine spontane Geburt erfuhren. Diese wurden außerdem

aufgrund ihrer IGF-Blut-Spiegel in eine IGF-low- und IGF-high-Gruppe eingeteilt. Nach

einer bestimmten Zeitspanne wurde den Tieren eine LPS-Instillation zugeführt und die

Kühe im Folgenden euthanasiert.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Bedeutung von IGF, aber auch die

Wechselwirkung von IGF und EGF, in der Plazenta auf. Die in dieser Arbeit

gesammelten Erkenntnisse, zusammen mit dem Nachweis von IRS1 und IRS2 in

Plazenta und Uterus des Rindes, können nach weitergehenden Untersuchungen

möglicherweise eine Diagnostik und Therapie puerperaler, boviner Erkrankungen

ermöglichen.

- 3 -

2. Literaturübersicht

2.1. Der bovine Uterus

Das Rind weist einen Uterus bicornis auf, der sich nach kranial verjüngende Hörner

besitzt. Diese sind widderhornartig aufgerollt. Kaudal davon liegt das Corpus uteri. Die

Cervix uteri liegt zwischen Vagina und Corpus uteri und ist außer zur Geburt und

während der Brunst verschlossen. Die Schleimhaut des Uterus, welche in Längs- und

Querfalten angeordnet ist, besitzt außerdem eine tierartliche Besonderheit, die

Karunkeln. Diese sind in vier Reihen unregelmäßig angeordnet (Nickel et al., 1987;

Budras, 2002).

Histologisch ist die Gebärmutter in vier verschiedene Schichten einzuteilen. Dem

Lumen anliegend befindet sich die Mukosa (Endometrium). Sie besteht aus einem

einschichtig hochprismatischen Epithel, das teilweise aber auch mehrreihig sein kann,

und der Lamina propria mucosae. In dieser sind die uterinen Drüsen zu finden. Die

Karunkeln stellen knopfförmige, drüsenfreie Bezirke mit einer bindegewebigen

Grundlage in der Mukosa dar, welche sich in der Trächtigkeit vergrößern. Daran

schließt sich die Tunica muscularis (Myometrium) an. Sie besteht aus zwei

Muskelschichten, von denen die innen liegende zirkulär und die äußere longitudinal

verläuft. Es folgt die Tela subserosa und anschließend die Tunica serosa

(Perimetrium) (Liebich, 2010).

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Abb. 1: Übersicht Uterus Rind (HE). Abgebildet sind die Mukosa mit Stratum compactum (A) und luminalem Epithel (Pfeil) und das Stratum reticulare (B) mit den uterinen Drüsen (gelber Pfeil) sowie das Myometrium (C). Messbalken: 50µm.

2.2. Die bovine Plazenta

Säugetiere bilden während der Trächtigkeit die Plazenta, ein temporäres Organ, aus.

Sie entsteht an den Kontaktstellen der fetalen Membranen mit der Mukosa des Uterus

und ermöglicht den fetomaternalen Austausch (Leiser und Kaufmann, 1994). Neben

dieser entscheidenden Aufgabe ist sie auch in der Lage unterschiedliche Stoffe wie

Hormone (Schlafer et al., 2000; Sousa et al., 2008) oder auch Wachstumsfaktoren

(Richterich, 2008) zu sezernieren. Es sind zwei Anteile der Plazenta zu unterscheiden,

die Pars fetalis, welche vom mit Zotten besetzten Chorion gebildet wird, und die Pars

maternalis, die durch das Endometrium der uterinen Karunkel gebildet wird (Michel,

1995). Beim Rind formen beide Anteile zusammen etwa 80-140 Plazentome. Zwischen

diesen liegen die interkotyledonären Bereiche. An diesen Stellen weist das Chorion

nur eine dünne Membran mit atrophierten Zotten auf, die der Mukosa des Uterus

- 5 -

gegenüberliegt und auch als Chorion laeve bezeichnet wird (Leiser und Kaufmann,

1994). Deshalb wird von einer Placenta cotyledonaria sive multiplex gesprochen

(Strahl, 1906; Grosser ,1927). Allerdings wird auch in gewissem Maße über das

Chorion laeve ein fetomaternaler Austausch ermöglicht (Leiser und Kaufmann, 1994).

Die verzweigten Zottenbüschel der Kotyledone, die im gegenüberliegenden

maternalen Gewebe, den Krypten der Karunkel liegen, haben zur Klassifikation als

villöser Plazentatyp geführt (Steven, 1975; Kaufmann, 1981; Wooding, 1992). Die

Zotten bestehen aus vaskularisiertem Mesenchym (Grosser, 1927), welches mit einer

Zellschicht aus Trophoblastektoderm überzogen ist (Björkmann und Sollen, 1960). In

den maternalen Krypten ist ein gut vaskularisiertes Bindegewebe zu finden, welches

von einem einschichtigen, kubischen Epithel bekleidet wird (Björkmann und Sollen,

1960). Gegenüberliegendes Kryptenepithel und Trophoblasten tragen jeweils Mikrovilli

und stehen in engem Kontakt. Dies führt zu einer Vergrößerung der Kontaktfläche

zwischen fetalen und maternalen Gewebeanteilen (Björkmann und Bloom, 1957). Die

wohl bekannteste Klassifizierung der Plazenta erfolgt nach Grosser (1909; 1927).

Hierbei werden die verschiedenen Schichten herangezogen, die fetales und

maternales Blut voneinander trennen. Das Rind wird hier prinzipiell zum

epitheliochorialen Typ gezählt, da alle sechs Gewebsschichten, die für die

Klassifizierung wichtig sind, vorhanden sind. Dazu gehören das maternale Epithel,

Bindegewebe und Endothel sowie fetales Epithel/Trophoblasten, Bindegewebe und

Endothel. Bei einer epitheliochorialen Plazenta liegt das Chorion also einer fast

intakten uterinen Mukosa an, ohne endometriale Invasion, mit den entsprechenden

Folgen für den Stoffaustausch zwischen Muttertier und Fetus. Bei den Wiederkäuern

kommt es allerdings zu einer geringgradigen Invasion. Spezielle Trophoblastzellen, die

Trophoblast giant cells (TGC) oder auch binukleäre Riesenzellen (BNC) genannt,

fusionieren mit dem maternalen Epithel zu feto-maternalen Hybridzellen, die per

definitionem Synzytien sind (Wooding, 1992; Leiser und Kaufmann, 1994; Schlafer et

al., 2000). Dieses spezielle Charakteristikum hat zur einer weiteren Spezifizierung als

synepitheliochoriale Plazenta geführt (Wooding, 1992). Die TGC haben große

Granula, die mehr als die Hälfte des Volumens ausmachen können. In diesen Granula

sind verschiedene Proteine und Glykoproteine gespeichert, wie z.B. das plazentare

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Laktogen (Wooding, 1992). Die ersten TGC sind kurz vor der Implantation

nachzuweisen (Leiser, 1975; Wooding, 1984) und sie machen etwa 15-20% der fetalen

Epithelzellen aus. Trotz ihres mikroskopisch gleichen Erscheinungsbildes sind

verschiedene Subpopulationen von binukleären Trophoblasten bekannt (Munson,

1989; Jones et al., 1994;). Ein bis zwei Tage vor der Geburt kommt es zu einem

starken Absinken der Anzahl an TGC (Wooding, 1984). Die Aufgabe der TGC ist

einerseits fetomaternale Synzytien zu bilden und andererseits die Produktion und

Abgabe verschiedener steroidaler Hormone (Reimers et al., 1985; Wooding, 1992;

Matamoros et al., 1994; Roberts et al., 1995). Es ist auch bekannt, dass TGC eine

Reihe von Wachstumsfaktoren exprimieren wie z.B: FGF-1, -2 und -7 (Pfarrer et al.,

2006 a), VEGF (Pfarrer et al., 2006 b) oder PAF (Bücher et al., 2006). Es wird vermutet,

dass der Vorgang der Fusion und die spezifischen Produkte für eine erfolgreiche

Implantation und ein entsprechendes Wachstum der Plazentome wichtig sind.

Die Form der Plazenta beeinflusst auch die plazentare Separation während/nach der

Geburt. Die Trennung erfolgt entlang der fetomaternalen Kontaktfläche, wodurch das

maternale Gewebe zu weiten Teilen intakt bleibt und die größtenteils fetale Plazenta

ohne großen Gewebsverlust oder Blutungen ausgeschieden wird (Leiser und

Kaufmann, 1994). Damit gehört das Rind zu den „Adeciduata“. Nach Huxley (1864)

wird diese Form der Plazenta auch als Plazenta apposita oder nach Strahl als

Semiplazenta (Strahl, 1906) bezeichnet.

Eine weitere Form der Einteilung betrifft die Anordnung von maternalen und fetalen

Blutgefäßen zueinander und die vorherrschende Blutflussrichtung. Dies bestimmt die

Effizienz des Sauerstoffaustauschs zwischen Muttertier und Fetus und beeinflusst so

auch die Relation zwischen Gewicht der Plazenta und des Fetus (Leiser und

Kaufmann, 1994). Es wurde zunächst angenommen, dass es bei den Wiederkäuern

einen so genannten multivillösen Blutfluss gibt, der nur zu einem gewissen Grad ein

Gegenstromprinzip aufweist, sonst aber zwischen Parallelstrom und

Gegenstromprinzip anzusiedeln ist (Dantzer et al., 1988). Neuere Arbeiten ergaben

jedoch, dass im 3./4. Monat der Trächtigkeit das Gegenstromprinzip vorherrscht. Vom

mittleren Drittel bis zum Ende spielt diese Art des Blutaustausches immer noch die

größte Rolle. Mit der Entwicklung der tertiären Krypten und der entsprechenden

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interdigitierenden Zotten, erfolgt der Blutaustausch in den Kapillaren dieser Bereichen

nach dem Querstromprinzip (Pfarrer et al., 2001).

Abb. 2: Histologischer Schnitt der Rinderplazenta (HE). Zu erkennen sind sowohl die fetalen Zotten mit uninukleären Trophoblasten (blauer Pfeil), TGC (schwarzer Pfeil) und fetalem Mesenchym (F), als auch die Pars maternalis, die Krypten, mit maternalen Epithelzellen (grüner Pfeil) und Stroma (M). Die Länge des Messbalkens entspricht 50µm

2.3. Peri- und postpartale Änderungen in Uterus und Plazenta

Während der Trächtigkeit, welche beim Rind 285 Tage dauert (Grosser, 1927), kommt

es zu erheblichen Veränderungen auf maternaler aber auch fetaler Seite des

Kontaktbereiches zwischen Muttertier und Fetus. Etwa in der vierten

Trächtigkeitswoche kommt es zur Kontaktaufnahme zwischen Chorioallantois und

dem Endometrium. Am engsten wird diese Verbindung im Bereich der Karunkeln. Die

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Chorioallantois bildet auf der den Karunkeln gegenüberliegenden Fläche die

Kotyledonen aus, welche mit ihren Zotten in die Oberfläche der Karunkeln hineinragen

und somit die Kontaktoberfläche vergrößern. Im Verlauf der Trächtigkeit nehmen die

Plazentome an Größe zu, sie werden bis zu 12cm lang und 2-3cm dick. In dem

tragenden Uterushorn sind sie deutlich größer als im nicht tragenden (Schlafer et al.,

2000).

Gegen Ende der Trächtigkeit kann das maternale Epithel in einigen Krypten abflachen,

atrophieren oder auch komplett fehlen (Björkmann und Sollen, 1960). Andererseits ist

es aber auch möglich, dass sich zu diesem Zeitpunkt Plasmodien ausbilden, welche

10-20 Kerne besitzen können (Björkmann, 1954).

Bei der Geburt kommt es zur Ablösung der fetalen Membranen. Damit ein

physiologischer Nachgeburtsabgang stattfinden kann, ist eine abgeschlossene

Reifung der Plazenta Voraussetzung (Paisley et al., 1986). Der dafür notwendige

Lösungsprozess beginnt bereits in den letzten Monaten der Gravidität (Grunert et al.,

1983). Dazu zählt unter anderem das bereits erwähnte Abflachen des maternalen

Epithels, aber auch ein Umbau der bindegewebigen Grundlage der Plazentome

(Schulz und Merkt, 1956). Welche Mechanismen aber genau ausschlaggebend sind,

ist immer noch nicht endgültig geklärt (Schlafer et al., 2000; Dilly et al., 2011; Shenavai

et al., 2012). Nach dem Abgang der Nachgeburt, also den fetalen Anteilen der

Plazenta, sind die Karunkeln als bindegewebiges System zurückgeblieben, die

Krypten sind meist leer und kollabiert (Björkmann und Sollen 1969), können aber auch

verbliebene Reste der fetalen Anteile enthalten. Diese werden phagozytiert und gehen

im weiteren Verlauf, als physiologischer Prozess, mit den Lochien ab. Die

oberflächlichen Anteile der Karunkel werden ebenfalls mit den Lochien abgestoßen

(Archbald et al., 1972). In den ersten Tagen post partum kommt es außerdem, durch

Vasokonstriktion bedingt, zu Nekrosen in den Karunkeln und damit einhergehend zu

Nekrosen und einer Desorganisation des Gewebes. Dies wiederum führt zur

Einwanderung von Leukozyten (Gier und Marion, 1968) und der vorangehend

beschriebenen Abschilferung in der Karunkel.

Wird die Nachgeburt nicht in einem bestimmten Zeitfenster abgestoßen, wird von einer

Nachgeburtsverhaltung/Retentio secundinarum gesprochen. Für einige Autoren ist

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dies nach 12 Stunden der Fall (Herschler und Lawrence, 1984; Borsberry und Dobson,

1989; Eiler und Hopkins, 1993) für andere wiederum erst nach 24 Stunden (Holt et al.,

1989; Brooks, 2001; Drillich et al., 2003).

Während der ersten Woche post partum kommt es zu Kontraktionen des Uterus, die

dafür sorgen, dass noch verbliebene Reste fetaler Membranen und Flüssigkeiten mit

den Lochien ausgestoßen werden (Sheldon et al., 2009). Im folgenden Verlauf findet

eine Ausheilung statt, wobei unterschiedliche Angaben zur Dauer existieren, sie

reichen von 19 Tagen (Archbald et al., 1972) bis zu mindestens 25 Tagen (Gier und

Marion, 1968). Während der Heilungs- und Rückbildungsphase des Uterus kommt es

zu einer Ödembildung. Die Involution des Uterus ist in der Regel 40 Tage post partum

abgeschlossen, während die endgültige Wiederherstellung nach histologischer

Kontrolle erst nach 50 Tagen erreicht wird (Gier und Marion, 1968).

2.4. Komplikationen im Puerperium

Zu den möglichen Erkrankungen des Uterus post partum zählen beim Rind die

puerperale Metritis, Pyometra und die Endometritis. Diese können die Fertilität

erheblich beeinflussen (Sheldon et al, 2009).

In der Gravidität ist der Uterus steril, aber post partum ist die Wahrscheinlichkeit einer

Kontamination des Uterus mit Bakterien sehr groß, da sonst vorhandene

Schutzmechanismen zu diesem Zeitpunkt nur eingeschränkt vorhanden sind (Singh et

al., 2008; Sheldon et al., 2008). Etwa 80-100% aller Kühe weisen, in den ersten zwei

Wochen nach dem Kalben, Bakterien im Uteruslumen auf. Auch wenn bei einem

Großteil der Tiere das Immunsystem eine Erkrankung verhindern kann, kommt es

immer noch bei bis zu 40%, innerhalb von drei Wochen post partum, zu einer

bakteriellen Infektion des Uterus. Eine Nachgeburtsverhaltung stellt ein großes Risiko

für folgende Infektionen des Uterus dar (Sheldon et al., 2008).

- 10 -

Da verschiedene klinische Definitionen zu den Uteruserkrankungen vorlagen, wurde

von Sheldon et al. (2006; 2008) eine einheitliche Nomenklatur zur besseren

Differenzierung und Therapie vorgeschlagen.

Die puerperale Metritis bezeichnet eine akute, systemische Erkrankung, welche durch

eine bakterielle Uterusinfektion bedingt ist. Sie tritt in den ersten zehn Tagen post

partum auf. Tritt in den 21 Tagen nach der Geburt purulenter Ausfluss mit einem

vergrößerten Uterus einhergehend auf, wird dies als klinische Metritis bezeichnet.

Hierbei sind meist keine weiteren Symptome erkennbar und das Allgemeinbefinden ist

ungestört.

Die klinische Endometritis zeichnet sich nach Sheldon durch purulenten, bzw.

mukopurulenten Ausfluss nach dem 21. Tag post partum aus, ohne dass systemische

Symptome vorliegen.

Die subklinische Endometritis kann durch zytologische Untersuchungen

nachgewiesen werden und stellt eine Entzündung des Endometriums dar, mit

signifikanter Reduktion der Fertilität. Es ist in diesem Fall kein purulentes Material in

der Vagina nachzuweisen. Ausschlaggebend ist der Zeitpunkt und die Anzahl

vorhandener neutrophiler Granulozyten.

Als Pyometra wird ein Zustand beschrieben, bei dem es zu einer Ansammlung von

purulentem oder auch mukopurulentem Exsudat in der Gebärmutter kommt, der mit

einer Erweiterung des Uterus und einem aktiven Corpus luteum einhergeht. Die Zervix

ist zu diesem Zeitpunkt funktionell verschlossen, es ist aber dennoch möglich, dass

durch eine kleine Öffnung purulentes Material in die Vagina gelangt und dort sichtbar

wird (Sheldon et al., 2006, Sheldon et al., 2008; Sheldon et al., 2009).

Infektionen des Uterus spielen eine wichtige Rolle, denn sie können unter anderem zu

Infertilität oder systemischen Erkrankungen führen und sich insgesamt negativ auf die

Reproduktion auswirken (Gilbert et al., 2005; Lincke et al., 2007; Sheldon et al., 2009;

Turner et al., 2012). Bedingt durch die Erkrankung des Uterus sinkt die

Wahrscheinlichkeit einer Ovulation, denn die Ovarfunktion ist eingeschränkt.

Außerdem kommt es zu einer geringeren Östradiol Konzentration im Plasma und einer

Dysregulation von Hypothalamus und Hypophyse. Auch die Lutealphase ist verlängert.

Insgesamt haben etwa 50% aller Milchkühe abweichende Zyklen in der postpartalen

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Phase (Sheldon, 2009). Nach LeBlanc (2008) erkranken 15-20% der

Hochleistungsmilchkühe an klinischer und 30% an subklinischer Endometritis

(LeBlanc, 2008). Um aber das Zwischenkalbeintervall möglichst kurz halten zu

können, muss der Genitaltrakt sowohl anatomisch als auch funktionell wieder den

intakten Zustand erreichen (Mateus et al., 2002). Die Zwischenkalbezeit sollte nach

wirtschaftlichen Maßstäben bei 12-13 Monaten liegen, folglich müsste die Kuh 80-110

Tage post partum wieder trächtig werden (Bretzlaff, 1987). Dies kann aber nur erreicht

werden, wenn keine Erkrankungen des Uterus im Puerperium auftreten.

In der peripartalen Phase weist die Mehrheit der Milchkühe eine negative

Energiebalance auf, während der verschiedene Parameter der Fett- und

Proteinmobilisation verändert sind. Kühe, die eine Erkrankung des Uterus aufweisen,

sind hiervon noch stärker betroffen, da sie weniger Trockenmasse aufnehmen, als

klinisch gesunde Tiere (Wathes et al., 2007). Diese Veränderungen beeinflussen die

Immunabwehr und in der Folge auch das Entstehen von Infektionen im Uterus, die

wiederum mit unter anderem verschlechterter Fertilität einhergehen (Cai et al., 1994;

Sheldon et al., 2004). Die metabolischen Veränderungen post partum mit der

negativen Energiebalance führen zu einer Entkopplung der Growth Hormone (GH)-

Insulin-like growth factor (IGF) Achse, was zur Folge hat, dass der IGF1-Spiegel im

Blut sinkt. Dieser Vorgang wird mit einer Verzögerung der Uterusinvolution,

schlechterer Heilung und erhöhten Entzündungsgraden des Uterus in Verbindung

gebracht (Wathes et al., 2007; Wathes et al., 2009; Wathes et al., 2011). Auch

präpartal verringerte IGF1-Werte scheinen auf ein erhöhtes Risiko post partaler

Erkrankungen hinzudeuten (Piechotta et al., 2012). Die Liganden des IGF-Systems

sind als potente Faktoren in der Wundheilung bekannt (Lynch et al., 1987; Bitar, 1997).

Auch als Immunmodulatoren scheinen sie als ein wichtiger Faktor bei der

Verhinderung und Bekämpfung uteriner Erkrankungen post partum denkbar

(Vangroenweghe et al., 2005). Ebenfalls denkbar ist ein Einfluss von MMPs (Matrix-

Metallo-Proteinasen) bei der Involution und Heilung des Uterus nach der Geburt

(Wathes et al., 2011).

- 12 -

2.5. Das IGF-System

Das Insulin-like growth factor System besteht aus zwei Liganden, dem Insulin-like

growth factor 1 (IGF1) und dem Insulin-like growth factor 2 (IGF2), den Insulin-like

growth factor binding proteins (IGFBPs) sowie den spezifischen Zelloberflächen-

Rezeptoren Insulin-like growth factor Rezeptor 1 (IGF1R) und Insulin-like growth factor

Rezeptor 2 (IGF2R). Weiterhin können auch der Insulin Rezeptor (IR) und der Insulin-

Hybrid Rezeptor (HR) die Wirkung der Liganden vermitteln. In den folgenden

Abschnitten werden die einzelnen Bestandteile näher erläutert.

Erste Hinweise auf das IGF-System finden sich in der „Somatomedin-Hypothese“. Ziel

dieser Versuche war es, zu verstehen, wie das somatische Wachstum durch Faktoren

aus der Hypophyse beeinflusst wird. Dabei stellte sich heraus, dass dort produziertes

Growth hormone (GH) nicht direkt das Wachstum der Zielorgane beeinflusst, sondern

dass eine zwischengeschaltete Substanz wie ein endokrines Hormon oder ein

Wachstumsfaktor nötig ist (Salmon und Daughaday ,1957). Dieser Wirkstoff wurde als

Somatomedin bezeichnet, um deutlich zu machen, dass er die Wirkung von GH, das

auch als Somatropin bezeichnet wird, vermittelt. Später erfolgte eine Einteilung der

Somatomedine und die, die GH-Wirkung mediierende Substanz, wurde als

Somatomedin C bezeichnet. Etwa 20 Jahre später wurden IGF1 und IGF2 das erste

Mal charakterisiert und es wurde bewiesen, dass IGF1 dem Somatomedin C entspricht

(Rinderknecht und Humbel, 1978). Sie wurden als „insulin-like“ benannt, da sie

genauso wie Insulin in der Lage sind, die Aufnahme von Glukose in Fett- und

Muskelzellen zu stimulieren (Randle, 1954).

Zu dieser Zeit wurde davon ausgegangen, dass IGFs vornehmlich als

Wachstumsfaktoren wirken, auch wenn ihre Ähnlichkeit zu Insulin metabolische

Funktionen nahe legte. In der zu dieser Zeit noch gängigen ursprünglichen

„Somatomedin-Hypothese“ hieß es, dass das in der Hypophyse gebildete GH vor allen

Dingen die Leber beeinflusse, welche daraufhin IGF1 synthetisiere und ausschütte.

Dieses sollte dann zu den Zielorganen zirkulieren und somit seine endokrine Wirkung

- 13 -

vermitteln (Le Roith et al., 2001). Versuche an Rindern, denen bovines Somatotropin

(bST) injiziert wurde, bestätigten diese Hypothese. Das bST führte sowohl in der

Laktation, als auch während der Trockenstehphase zu einem Anstieg von IGF1 im

Serum. Die Konzentration von IGF2 im Serum hingegen wurde nur während der

Trockenstehphase durch bST-Applikation gesteigert, nicht während der Laktation

(Vicini et al., 1991). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen von Bilby et. al., in

denen gezeigt wurde, dass die Verabreichung von rekombinantem bovinen GH (rbGH)

zu einem Anstieg des Blut-IGF1 Gehaltes führte (Bilby et al., 1999).

Weitere Experimente zeigten allerdings, dass IGF1 in zahlreichen Organen

synthetisiert und auch durch verschiedene lokale und endokrine Faktoren beeinflusst

wird (D’Ercole et al., 1980; Le Roith et al., 2001).

Dies führte zu einer modifizierten Form der „Somatomedin-Hypothese“. Der Nachweis

der Expression des IGF1-Gens in verschiedenen Geweben prä- und postnatalen

Ursprungs bestärkte die Annahme, dass IGF1 eine wichtige Rolle in der Regulation

des Wachstums verschiedener Zellen und Gewebe spielt. Dabei kann es lokal auf

parakrine und autokrine Weise Einfluss ausüben (Roberts et al., 1987; Han et al.,

1988).

Alle diese Erkenntnisse finden sich in der „alternativen Somatomedin-Hypothese“

wieder. Diese beschreibt, dass sowohl endokrines IGF1, als auch lokal produziertes

IGF1 auf GH reagieren und dessen Effekte vermitteln. Allerdings wird hier auch die

Möglichkeit in Betracht gezogen, dass sowohl GH, als auch IGF1 unabhängig

voneinander, positiv das Wachstum beeinflussen können (Le Roith et al., 2001).

2.5.1. Liganden des IGF-Systems

Die Liganden IGF1 und IGF2 sind sequenzhomologe, einzelkettige Polypeptide mit

großer struktureller Ähnlichkeit (50% homolog) zu Pro-Insulin (Le Roith et al., 2001).

Beide können die Aufnahme von Glukose in Fett- und Muskelzellen stimulieren

(Rinderknecht und Humbel, 1978). Die Aminosäuresequenz des bovinen IGF1

- 14 -

entspricht der des humanen IGF1, wohingegen bovines IGF2 sich in drei

Aminosäureresten von der humanen Variante unterscheidet (Honegger und Humbel,

1986).

Beim Rind konnte die Expression der IGFs in verschiedenen Organsystemen

nachgewiesen werden. Unter anderem im Reproduktionstrakt (Geisert et al., 1991;

Kirby et al., 1996; Ohtani et al., 1996; Wathes et al., 1998; Robinson et al., 2000; Meikle

et al., 2001; Pershing et al., 2002; Pushpakumara et al., 2002; Llewellyn et al., 2007;

Fenwick et al., 2008; Rhoads et al., 2008), in unterschiedlichen fetalen (Farin et al.,

2010) und embryonalen Geweben (Moore et al.,2007) wie auch in der Leber (Fenwick

et al., 2008; Rhoads et al., 2008).

2.5.1.1. IGF1

Für IGF1 sind zahlreiche unterschiedliche Funktionen im Organismus beschrieben und

aufgrund der Vielfalt ist zu erkennen, dass es eine wichtige Rolle bei vielen

verschiedenen Prozessen spielt.

In vitro spielt dieser Wachstumsfaktor eine große Rolle bei der DNA-Synthese und

Zellreplikation. Er kann als Progressions-Faktor im Zell-Zyklus bezeichnet werden,

dessen Aktivität zu DNA-Synthese und Zellproliferation führt. Außerdem kann IGF1

den Zelltod verhindern, die Zelldifferenzierung fördern und verschiedene Zellen zur

Hormonsekretion anregen (Jones und Clemmons, 1995).

Auch in vivo gibt es eine Vielzahl von beschriebenen Wirkungen für IGF1. Unter

anderem wurde in Studien festgestellt, dass es nach IGF1-Infusionen zu

Hypoglykämie durch Stimulation der Glukose-Aufnahme kommt (Rossetti et al., 1991).

Anabolische Effekte wie eine Beeinflussung der Protein-Synthese und der Stickstoff-

Balance wurden ebenfalls nachgewiesen (Jones und Clemmons, 1995).

Versuche mit Mäusen die IGF1-Null-Mutationen aufwiesen zeigten, dass in diesem

Fall eine erhöhte neonatale Todesrate vorhanden war und die Tiere nur 60% des

normalen Geburtsgewichts hatten. Mäuse, die eine Null-Mutation für sowohl IGF1 als

- 15 -

auch IGF2 aufwiesen, hatten nur noch 30% des normalen Geburtsgewichts und

starben innerhalb einiger Minuten post partum (Baker et al., 1993). Da IGF1 in so

vielen verschiedene Geweben im Körper produziert wird und an unterschiedlichen

Stoffwechselprozessen beteiligt ist, liegt auch eine Beteiligung an der Entstehung

vieler Krankheiten, wie unter anderem IUGR (intrauterine growth restriction),

neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes oder auch malignen Veränderungen

nahe (Monzavi und Cohen, 2002; Cohen, 2006).

2.5.1.2. IGF2

Durch die Sequenzierung eines zweiten, bioaktiven insulin-like Moleküls, das in seiner

Struktur ähnlich zu IGF1 war, wurde IGF2 entdeckt und benannt (Rinderknecht und

Humbel, 1978).

Bei Versuchen, in denen IGF2-Null-Mutationen bei Mäusen untersucht wurden, zeigte

sich, dass diese Tiere nur 60% des üblichen Geburtsgewichts hatten, aber eine

normale Überlebensrate. Das plazentare Wachstum bei diesen Tieren war außerdem

reduziert und schien unabhängig von IGF1 und IGF1R zu sein (Baker et al., 1993).

2.5.2. Rezeptoren des IGF-Systems

Die Liganden des IGF-Systems können an verschiedene Rezeptoren mit

unterschiedlicher Affinität binden. Dazu gehören der Insulin-like growth factor receptor

1 (IGF1R), der Insulin-like growth factor receptor 2 (IGF2R), der Insulin Rezeptor (IR)

und der Insulinhybrid Rezeptor (HR).

- 16 -

2.5.2.1. IGF1R

Dieser Rezeptor besteht aus einer extrazellulären α-Untereinheit und einer

transmembranären β-Untereinheit, die miteinander durch Disulfidbrücken verbunden

sind. Zwei dieser αβ-Halbrezeptoren sind jeweils durch Disulfidbrücken zwischen den

α-Untereinheiten miteinander zu einem α2β2-Holorezeptor verbunden. Die

Ligandenbindungsspezifität ist durch die Cystein-reichen Regionen in der

extrazellulären Domäne der α-Untereinheit gegeben (Jones und Clemmons, 1995).

Die β-Untereinheit besitzt eine ATP-Bindungsstelle und eine cytoplasmatische

Tyrosin-Kinase-Domäne, die intrazelluläre Signaltransduktion als Reaktion auf

Ligandenbindung vermittelt (Cohen, 2006; Bowman et al., 2010).

Von den möglichen Liganden hat IGF1 die höchste Affinität zu IGF1R, gefolgt von

IGF2, Insulin besitzt die geringste Affinität zu diesem Rezeptor (Jones und Clemmons,

1995).

Bindet IGF1 an den IGF1R, kommt es zu einer Autophosphorylierung an Tyrosin- und

Serinresten. Bei dem Vorgang, der auch als intramolekulare Transreaktion bezeichnet

wird, phosphoryliert die Tyrosin-Kinase einer β-Untereinheit die Reste auf der anderen

β-Untereinheit des α2β2-Holorezeptors (Frattali und Pessin, 1993). Die

Phosphorylierung des Rezeptors führt zu einer Vermittlung von Signalen ins

Zellinnere. Die Bindung von IGF1 verursacht die Phosphorylierung von unter anderem

Insulin Rezeptor Substrat 1 (IRS1). Dieses wiederum kann zwei SH2-Domänen

besitzende Proteine binden, die Phosphatidylinositol-3 Kinase (PI3K) und das growth

factor rebound protein (Grb2), so werden intrazelluläre Signalketten aktiviert (Myers et

al., 1992; Giorgetti et al., 1993; O’Connor, 2003). Weiterhin kann es zu einer

Aktivierung von den MAPK 42/44 (mitogen activated protein kinases) kommen.

Studien haben zudem ergeben, dass vermutlich sowohl die Tyrosinkinase-Aktivität, als

auch die Autophosphorylierung nötig sind, um eine vollständige Aktivierung des IGF1R

zu erreichen (Jones und Clemmons, 1995). Auch aktiviert werden können sogenannte

stress activated protein kinases (SAPKs), zu denen unter anderem die p38 MAPK

(phospho-p38 MAP Kinase) zählt. Dieser Signalweg steht in Zusammenhang mit der

Regulation von DNA-Schäden und dem Zell-überleben (Héron-Milhavet et al., 2001).

- 17 -

Die Bedeutung des IGF1R für die physiologische Entwicklung der Nachkommen sowie

das Erreichen eines durchschnittlichen Geburtsgewichtes wurde durch Experimente

deutlich gemacht, in denen eine Deletion des IGF1R vorgenommen wurde. In

Versuchen, bei denen Mäuse IGF1R-Null-Mutationen aufwiesen, zeigten diese ein um

55% geringeres Geburtsgewicht als durchschnittlich und sie starben sofort nach der

Geburt (Baker et al., 1993).

2.5.2.2. IGF2R

Dieser Rezeptor wird auch als kationenunabhängiger Mannose-6-Phosphat-Rezeptor

bezeichnet, da er Mannose-6-Phosphat Reste an lysosomalen Enzymen bindet (Jones

und Clemmons, 1995). Nur ungefähr 10% der IGF2R einer Zelle liegen an der

Zelloberfläche. Der Rest befindet sich im Golgi-Apparat oder endo- beziehungsweise

lysosomalen Bereichen (Chakraborty et al., 2002). Es ist ein monomerer Rezeptor, der

weder Tyrosinkinase-Aktivität noch eine Autophosphorylierungsstelle besitzt. Der

IGF2R bindet mit der höchsten Affinität IGF2, während die Affinität zu IGF1 500-fach

niedriger ist und Insulin gar nicht gebunden wird (Jones und Clemmons, 1995). Die

Bindung von IGF2 an den IGF2R führt zu einer Internalisierung und folgenden

Degradation des Wachstumsfaktors (Clairmont und Czech, 1991). Somit kommt es zu

einer Entfernung des IGF2 aus dem Kreislauf (Jones und Clemmons, 1995; Forbes

und Westwood, 2008). Allerdings gibt es auch Studien, die zu dem Ergebnis kommen,

dass auch IGF2R für die Signaltransduktion verantwortlich ist und abweichend von der

traditionell beschriebenen Rolle auch Migration, (Chakraborty et al., 2002; Harris et al.,

2011) Invasion, (Hamilton et al., 1998) plazentare Angiogenese und vaskuläres

remodelling (Herr et al., 2003) vermittelt.

- 18 -

2.5.2.3. HR

Durch die Dimerisierung von IGF1R αβ-Halbrezeptoren mit Insulin αβ-Halbrezeptoren

in Anwesenheit von ATP (Adenosintriphosphat), IGF1 oder Insulin kommt es zur

Bildung von Hybridrezeptoren (Treadway et al., 1992). Die Affinität von IGF1 und

Insulin zum HR entspricht in etwa der zum IGF1R. Sie ist im Fall von IGF1 15-50-fach

höher als von Insulin (Jones und Clemmons, 1995). Auch die IGF1R αβ-

Halbrezeptoren können IGF1 binden, aber für die Autophosphorylierung und

Tyrosinkinase-Aktivität ist die Dimerisierung nötig (Frattali und Pessin, 1993). Da zwei

verschiedene Splice-Varianten des Insulin-Rezeptors vorkommen (IR-A und IR-B),

kommt es in der Folge zur Ausbildung von zwei Isoformen der Hybridrezeptoren

(IGF1/IR-A und IGF1/IR-B). Diese Varianten wurden bis jetzt in allen Zellen

vorgefunden, in denen sowohl IGF1R, als auch IR exprimiert werden (Slaaby et al.,

2006). Die Affinität von IGF2 zu den beiden Isoformen der Hybridrezeptoren liegt

zwischen der von Insulin und IGF1 (Slaaby et al., 2006). Der wichtigste funktionelle

Unterschied dieser beiden Isoformen besteht in der hohen Affinität von IGF2 zu IR-A

(Belfiore et al., 2009). IR-A wird hauptsächlich während der pränatalen Phase

exprimiert und kann so die Effekte von IGF2 auf Embryogenese und fetale Entwicklung

steuern, während IR-B vornehmlich in adultem, ausdifferenzierten Gewebe

vorzufinden ist (Belfiore et al., 2009).

Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die in erster Linie mitogenen Wirkungen

von IGF1 und IGF2 durch den IGF1R vermittelt werden und bei hohen IGF-

Konzentrationen auch der IR aktiviert werden kann (Jones und Clemmons, 1995;

Forbes und Westwood, 2008).

- 19 -

2.5.3. IGFBPs

Es gibt sechs hochaffine IGFBPs und eine Reihe von IGFBP-related Proteinen, die

eine geringere Affinität zu den Liganden IGF1 und IGF2 haben (Rechler und

Clemmons, 1998; Hwa et al., 1999; Monzavi und Cohen, 2002). Diese unterscheiden

sich in ihrem molekularen Gewicht, der Anordnung der Aminosäuren, der Verteilung

im Organismus und dem unterschiedlich stark ausgeprägten Einfluss auf die IGF-

Aktivität. Sie erfüllen verschiedene Aufgaben, wie die Inhibierung aber auch

Potenzierung von IGF-Effekten, die Inaktivierung von IGFs oder den Transport der IGF

Moleküle zu den Rezeptoren (Kostecka und Blahovec, 1999). Im Serum kommen die

Liganden zu etwa 75% als ein gebundener Komplex mit IGFBP3 und einer nicht IGF-

bindenden Komponente, dem ALS (acid labile subunit), vor. In diesem biologisch

inaktiven, ternären Komplex können sie das vaskuläre System nicht verlassen und ihre

Halbwertszeit verlängert sich auf mehrere Stunden. Sind sie frei im Organismus

vorhanden, beträgt diese z.B. bei IGF1 nur circa 10 min. Vermutlich kann so ein Pool

an verfügbarem IGF1 und IGF2 bereitgehalten werden, der bei Bedarf durch IGFBP3

spaltende Proteasen schnell genutzt werden kann (Jones und Clemmons, 1995).

Dissoziiert der Komplex aus IGFBP3, ALS und dem Liganden, formen die IGFs

kleinere, binäre Komplexe mit anderen IGFBPs, die sie durch das Endothel zu den

Zielgeweben transportieren (Le Roith et al., 2001). Auch IGFBP5 kann solche ternären

Komplexe bilden, es kommt allerdings nur in viel geringerer Menge als IGFBP3 vor.

Alle IGFBPs können auch in freier Form oder wie oben erwähnt als binärer Komplex

mit IGF vorliegen (Firth und Baxter, 2002).

Die Affinität der IGFs zu den IGFBPs ist höher, als zu den dazugehörigen Rezeptoren.

Die IGF-Bindungsproteine können sowohl hemmend als auch fördernd auf die IGF-

Aktivität wirken. Die Effekte der IGFBPs sind von verschiedenen Faktoren wie

unterschiedlichen Proteasen, posttranslationalen Modifikationen oder den

unterschiedlichen Lokalisationen der IGFBPs abhängig, welche alle die Affinität zu den

Liganden beeinflussen (Jones und Clemmons, 1995). Unter bestimmten Bedingungen,

wie zum Beispiel während der Trächtigkeit, werden die IGFBPs anders

posttranslational modifiziert, wodurch ihre Affinität zu den IGFs reduziert wird. So ist

- 20 -

eine höhere Bioverfügbarkeit zu diesem Zeitraum vorhanden (Forbes und Westwood,

2008).

Außerdem sind inzwischen auch IGF-unabhängige Wirkungen der IGFBPs bekannt

(Jones und Clemmons, 1995). Zu diesen gehören unter anderem Wachstums-

Hemmung oder auch direkte Apoptose-Induktion. Vermittelt werden diese Wirkungen

durch eigene Rezeptoren wie z.B. den nuclear transcription factor RXR (Lee und

Cohen, 2002). Aber auch die Förderung der Motilität und Zelladhäsion (Jones et al.,

1993) oder die Beeinflussung des Zellzyklus gehören dazu. Es sind auch IGF1R-

unabhängige Wirkungen von IGFBPs beschrieben worden (Firth und Baxter, 2002).

Abb. 3: Darstellung des IGF-Systems mit Liganden, Rezeptoren und IGFBPs.

- 21 -

2.6. Das IGF-System in der Plazenta und im Zusammen hang mit der

Fortpflanzung

Es ist bekannt, dass IGF wichtig für die Regulation des fetalen Wachstums ist. Immer

mehr Studien deuten darauf hin, dass dieser Effekt über die Förderung der plazentaren

Entwicklung und Sicherstellung der Funktion der Plazenta erreicht wird (Sibley et al.,

2005; Forbes und Westwood, 2008). Erste Hinweise, dass IGFs an der Regulation des

fetalen Wachstums beteiligt sind, gab es, als Messungen von IGF1 im Nabelschnurblut

gemacht wurden und sich eine positive Korrelation zwischen Geburtsgewicht und

IGF1-Spiegel ergab (Klauwer et al., 1997). Small-for-gestational-age (SGA)

Neugeborene hatten erniedrigte und large-for-gestational-age (LGA) Neugeborene

hatten erhöhte IGF-Level (Giudice et al., 1995). Durch restriktive Ernährung kann es

zu einer Reduktion der IGF1- und IGF2- Konzentrationen im Fetus, der Mutter und der

Plazenta kommen. Dies kann zu plazentarer und fetaler Mangelentwicklung führen

(Roberts et al., 2008). Bei Versuchen an Meerschweinchen wurde allerdings auch

festgestellt, dass die Behandlung mit IGF1 und IGF2 zu einem erhöhtem

Geburtsgewicht und erhöhter plazentarer Transportrate führt, wobei IGF2 eher die

Morphologie der Plazenta und IGF1 eher die Verteilung der Nährstoffe über die

Plazenta beeinflusste (Sferruzzi-Perri et al., 2006). Beide Liganden werden schon von

Beginn der Embryonalphase an im Embryo produziert. In der fortgeschrittenen

Trächtigkeit ist die Konzentration von IGF2 10-fach höher als die von IGF1

(Daughaday et al., 1982; Jones et al., 1987; Gluckmann und Ambler, 1993), wobei sich

dieses Verhältnis nach der Geburt allerdings umkehrt (Jones und Clemmons, 1995).

Außerdem ist der IGF1 Wert bei den Feten niedriger als bei Adulten, steigt jedoch im

Laufe der Trächtigkeit an (Gluckmann und Butler, 1983). Ein kritischer Punkt in der

Trächtigkeit ist die Angiogenese, welche entscheidend für eine normale Entwicklung

von Plazenta und Fetus ist. Studien deuten darauf hin, dass IGF2 für diesen Prozess

wichtig ist (Herr et al., 2003). Auch die Menge an vorhandenen IGFBPs scheint

ausschlaggebend für die altersgerechte Entwicklung der Feten zu sein (Klauwer et al.,

1997). Bei Erkrankungen wie Präeklampsie oder intrauterine growth restriction (IUGR)

wurden erhöhte maternale IGFBP1 Spiegel im Blut festgestellt (Forbes und Westwood,

- 22 -

2008). Auch Veränderungen des IGF1R können das fetale Wachstum beeinflussen.

Der IGF1R ist hauptsächlich für die Vermittlung der Wirkungen von IGF1 und IGF2

zuständig. So können Veränderungen dieses Rezeptors durch Wirkungen auf

Zellproliferation, Differenzierung oder die Sicherung des Zellüberlebens, das fetale

Wachstum beeinflussen (Walenkamp et al., 2006). Der IGF2R ist hauptsächlich für die

Entfernung von IGF2 aus der Zirkulation und damit einhergehend, die Inaktivierung,

zuständig. Wird er ausgeschaltet oder ist fehlerhaft führt dies zu stark erhöhten

Geburtsgewichten bei Neugeborenen (Lau et al., 1994).

Reduziertes fetales Wachstum ist in den meisten Fällen mit abnormer plazentarer

Entwicklung verbunden und es wurde schon früh angenommen, dass dies in

Zusammenhang mit IGFs steht (Forbes und Westwood, 2008). Bestätigt wurde diese

Annahme unter anderem durch Versuche in denen imprinted genes untersucht

wurden. Bei Mäusen mit fehlendem Promotor (P0) des igf2 Gens, einem Plazenta-

spezifischen Transkript, trat reduzierte fetale Größe kombiniert mit Veränderungen der

Plazenta im Bezug auf Morphologie und Größe auf (Constância et al., 2002).

Außerdem wird durch das Fehlen des igf2 Gens erheblich die Transportkapazität der

Plazenta beeinträchtigt (Sferruzzi-Perri et al., 2011). Auch beim Rind konnte der

Einfluss des IGF-Systems auf die Trächtigkeit nachgewiesen werden. Die Deletion von

IGF1 hingegen, führte zu keiner Beeinflussung des plazentaren Gewichts. Erfolgt die

Beeinflussung des plazentaren Wachstums am Anfang der Trächtigkeit, kann die

Anzahl der Plazentome reduziert werden. Erfolgt die negative Beeinflussung jedoch

später, kommt es eher zu einer Veränderung der Größe und der Morphologie der

Plazentome (Wathes et al., 1998).

Beide Liganden sind in der Lage, die Entwicklung von kultivierten, präimplantierten

Blastozysten zu stimulieren (Kaye et al., 1992). IGF1 und IGF2 werden sowohl im

bovinen Uterus, als auch im Konzeptus exprimiert (Geisert et al., 1991; Kirby et al.,

1996). Außerdem wurde gezeigt, dass sie beim Schaf in vitro die embryonale

Produktion von INF-τ (Interferon-Tau) stimulieren (Ko et al., 1991). Dieses

antiluteolytische Hormon ist entscheidend für eine erfolgreiche Trächtigkeit bei

Wiederkäuern. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass zum Zeitpunkt des

maternalen Erkennens der Trächtigkeit, IGF1 und IGF2 mRNA erhöht waren, während

- 23 -

die von IGFBP3 im Endometrium des graviden Uterus erniedrigt war (Geisert et al.,

1991; Kirby et al., 1996). Eine Studie von Robinson et al. (2000) untersuchte die

Expression der einzelnen Faktoren des IGF-Systems im bovinen Uterus. Die stärkste

Expression von IGF1 mRNA im bovinen Endometrium wurde im subepithelialen

Stroma festgestellt, schwächere Expressionen konnten auch im Myometrium und

restlichen Stroma beobachtet werden. IGF2 mRNA war hauptsächlich im karunkulären

Stroma zu finden, zu geringeren Teilen aber auch im Myometrium, endometrialen

Stroma und uterinen Drüsen. IGF1R mRNA wurde auf einem hohen Niveau in den

Drüsen und zu geringeren Teilen im luminalen Epithel exprimiert. Diese Erkenntnisse

decken sich, was IGF1 und IGF1R betrifft, auch mit den von Wathes et al. (1998)

erhobenen Befunden, dass die IGF1 Konzentrationen während der Trächtigkeit

abfallen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die Expression der Liganden im

Verlauf des Zyklus im Endometrium aber auch in Uterusspülungen unterscheiden

(Geisert et a., 1991; Ohtani, et al., 1996; Meikle et al., 2001). IGF1R und IGF2R

konnten sowohl im Uterus, als auch der Plazenta des Rindes nachgewiesen werden

(Robinson et al., 2000; Llewellyn et al., 2008; Richterich, 2008; Wathes et al., 2011).

Auch im Eileiter (Pushpakumara et al., 2002) und fetalen Geweben (Farin et al., 2010)

wurden beide Rezeptoren detektiert. Llwellyn et al. untersuchten die Expression

verschiedener Mitglieder des IGF-Systems post partum, da sie eine Beteiligung dieser

Wachstumsfaktoren am Geschehen der Retentio secundinarum vermuteten. Sie

stellten eine Expression von IGF1 mRNA im subepithelialen Stroma sowie im inter-

karunkulären und karunkulären Endometrium fest. IGF2 mRNA und IGF1R mRNA

wurden im tiefen endometrialen Stroma und Myometrium lokalisiert (Llewellyn et al.,

2007).

Viele Studien beschäftigten sich mit dem Zusammenhang von IGF-Expression und

dem Ernährungszustand der Kühe post partum. Es wurde nachgewiesen, dass die

Konzentration von IGF1 im Blut mit der Energieverfügbarkeit zusammenhängt (Rutter

et al., 1989; Spicer et al., 1990). Geraten die Kühe nach der Abkalbung in eine negative

Energiebalance, kommt es zu einem Absinken des IGF1 Wertes im Blut (Llewellyn et

al., 2007; Wathes et al., 2007). Außerdem wurde berichtet, dass peripartal weniger

GH-Rezeptoren in der Leber exprimiert werden, was wiederum zu einem Absinken des

- 24 -

Blut IGF-Wertes führt (Kobayashi et al., 1999; Lucy et al., 2001; Radcliff et al., 2004).

Es wird weiterhin angenommen, dass dieser niedrige IGF1 Wert post partum und damit

zu Beginn der Laktation, mit einer erhöhten Anfälligkeit für Krankheiten in Verbindung

steht. Als mögliche Erklärung wird angenommen, dass die stimulatorische Wirkung

von IGF1 auf neutrophile Granulozyten vermindert sei (Vangroenweghe et al., 2005).

Beim Menschen sind IGF1 und IGF2 ab der 6. Schwangerschaftswoche in allen

Zelltypen der Plazenta nachzuweisen (Han et al., 1996). Studien ergaben, dass sowohl

IGF1 als auch IGF2 die Proliferation plazentarer Fibroblasten erhöhen und IGF1 die

Apoptose von Trophoblasten und Fibroblasten verhindern kann (Miller et al., 2005).

Beide Liganden können außerdem die Trophoblastenmigration und auch -invasion

fördern. In der humanen Plazenta ist es von entscheidender Bedeutung, dass

Zytotrophoblasten sich zu Synzytiotrophoblasten oder extravillösen Trophoblasten

differenzieren. IGF1 reguliert auch diesen Prozess (Forbes und Westwood, 2008),

wobei IGF2 eher bei der Regulation des Nährstoffaustauschs eine Rolle zu spielen

scheint. Die Oberfläche, über die ein Austausch stattfinden kann, ist bei IGF2 Knock-

out Mäusen erniedrigt, genauso wie die Permeabilität für Nährstoffe reduziert ist. Diese

Auswirkungen wurden auch bei Meerschweinchen beobachtet (Constância et al.,

2005; Sferruzzi-Perri et al., 2006). Allerdings scheinen IGF2 und IGFBP1 beim

Menschen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Migration und Invasion

von extravillösen Trophoblasten (Irving und Lala, 1995; Hamilton et al., 1998;

Chakraborty et al., 2000) und der Stimulation eines erhöhten uteroplazentaren

Blutflusses zu spielen (Nayak und Giudice, 2003). Andere Studien wiederum zeigten,

dass IGFBP1 die durch IGF1 vermittelte Trophoblastenmigration verhinderte. Durch

die Multimerisierung von IGFBP1 konnte dieser inhibitorische Effekt von IGFBP1

vermindert werden (Shibuya et al., 2010).

Der IGF1R kommt in allen Zelltypen der humanen Plazenta vor (Holmes et al., 1999).

Der Insulinrezeptor wird in der Plazenta in zwei Isoformen exprimiert, IR-A und IR-B.

Die Affinität von IGF2 zum IR-A im fetalen Gewebe ist genauso groß wie die zum

IGF1R. Allerdings werden bei Bindung von IGF2 an den IR-A hauptsächlich mitogene

Signale ausgesendet, anders als bei Aktivierung durch Insulin (Frasca et al., 1999).

Das Zusammenspiel von IGF2 und IR-A könnte erklären, warum Versuchstiere, denen

- 25 -

sowohl IGF1R als auch IGF2 fehlen, sehr viel stärker in ihrem fetalen Wachstum

eingeschränkt sind, als die Tiere, denen nur IGF1R fehlt (Baker et al., 1993).

Das IGF-System ist auch für die hormonelle Steuerung in der Trächtigkeit von

entscheidender Bedeutung. So werden unter anderem die Wirkungen von Östradiol

und Progesteron durch das IGF-System beeinflusst (Bowman et al., 2010). Aber auch

in entgegen gesetzter Richtung ist eine Beeinflussung möglich, da z.B. Cortisol und

Schilddrüsenhormone einen Einfluss auf IGF1 und IGF2 zu haben scheinen (Fowden,

2003).

Die Wachstumsfaktoren vermitteln ihre Wirkungen, wie bereits erwähnt, über

intrazelluläre Signalkaskaden. Die Kenntnis dieser Wege in der Zelle ist wichtig, da sie

mögliche Angriffspunkte in der Therapie verschiedener Dysregulationen in der

Trächtigkeit darstellen (Forbes und Westwood, 2010). In Versuchen an Mäusen wurde

festgestellt, dass MAPK essentiell für eine normale Entwicklung der Plazenta sind. In

der humanen Plazenta werden sie im Trophoblasten exprimiert und sind unter

anderem für die Entwicklung von einzelnen Trophoblasten zu Synzytien verantwortlich

(Kita et al., 2003; Daoud et a., 2005). Sie stellen den Hauptsignalweg nach Aktivierung

durch Wachstumsfaktoren dar (Forbes und Westwood, 2010). Die p38 MAPK schien

in vielen Versuchen nur für die Vermittlung von Stresssignalen in der Plazenta

verantwortlich zu sein (Renaud et al., 2009). Neuere Ergebnisse zeigen aber, dass sie

auch Signale von Wachstumsfaktoren vermittelt (Forbes und Westwood, 2010). Von

anderen Geweben ist bekannt, dass durch Aktivierung des IGF1R das

Insulinrezeptorsubstrat (IRS) phosphoryliert und somit aktiviert wird, was wiederum zu

einer Aktivierung von PI3K/Akt (Akt Kinase) führt. Für Akt ist bekannt, dass es bei

Nagern für die Regulation von fetalem Wachstum und die Entwicklung der Plazenta

wichtig ist (Forbes und Westwood, 2008).

- 26 -

2.7. IRS-Proteine

Die IRS-Proteine sind eine Gruppe von zytoplasmatischen Adaptor-Proteinen, die

Signale von IGF1, Insulin und verschiedenen Zytokinen vermitteln. Unter anderem sind

sie auch für Signalvermittlung der Rezeptorsysteme der IL6 Familie (Interleukin 6), der

IL2 Familie (Interleukin 2) und der Interferone zuständig (White, 1997). Dies geschieht

insbesondere über IGF1R und IR (White, 1998; Karas et al., 2001; Chitnis et al., 2008;

Shaw, 2011). Bis jetzt wurden sechs verschiedene IRS-Proteine identifiziert (White,

1985; Cai et al., 2003; Boller et al., 2012). IRS1 und IRS2 werden beim Menschen

ubiquitär exprimiert und sind die hauptsächlichen Vermittler Insulin-abhängiger

Wirkungen der Regulation des Glukosestoffwechsels (White, 2002). IRS1 wird in allen

Zelltypen von Mäuseembryonen der Periimplantationsphase exprimiert (Puscheck et

al., 1998). Außerdem wird im humanen Organismus auch IRS4 exprimiert, allerdings

nur in einigen Geweben, vor allem in Gehirn, Niere, Thymus und Leber (Lavan et al.,

1997). IRS3 hingegen wurde bis jetzt nur bei Nagern identifiziert (Boller et al., 2012).

Es bestehen Unterschiede in der subzellulären Lokalisierung der Mitglieder dieser

Gruppe. In den Adipozyten sind IRS1 und IRS2 vor allen Dingen in den Mikrosomen

zu finden, während IRS3 eher an der Plasmamembran angesiedelt ist (Anai et al.,

1998). Die IRS-Proteine haben keine intrinsische Enzymaktivität, sondern vermitteln

die Signale von IGF1R und IR, indem sie als Proteingerüste fungieren, die

Signalkomplexe organisieren (Sun et al., 1991). Eine wichtige Funktion der IRS-

Proteine ist die Aktivierung der PI3K und anschließend der Akt (Okada et al., 1994;

Robey und Hay, 2009). IRS binden an Proteine mit SH2 Domänen (Src homology 2),

wie z.B. Shc, Nck (non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1), Grb2

(growth factor receptor-bound protein 2) oder die p85 Untereinheit der PI3K. Über

diese Protein-Protein-Interaktionen wird die Aktivierung verschiedener Signalwege

sichergestellt, mit denen die spezifischen biologischen Aktivitäten von IGFs vermittelt

werden (White, 1997; Lassarre und Ricort, 2003; Tsuruzoe et al., 2001). Die IRS-

Proteine scheinen verschiedene Aufgaben zu übernehmen und für viele verschiedene

physiologische Prozesse von Bedeutung zu sein. Dazu gehören unter anderem der

Kohlenhydratstoffwechsel und die ß-Zellfunktion im Pankreas (Withers et al., 1999),

- 27 -

aber auch das somatische Zellwachstum (Brüning et al., 1997) und die weibliche

Reproduktion (Burks et al., 2000). Für einige Zellen ist beschrieben, dass IRS1 nach

Aktivierung durch den IGF1R Zellproliferation vermittelt (O’Connor, 2003; Byron et al.,

2006), während IRS2 die Motilität stimuliert (Byron et al., 2006). Aber auch IRS2

scheint für die Proliferation von Bedeutung zu sein (Lingohr et al., 2002). Aus

verschiedenen Versuchen ist bekannt, dass diese beiden Adaptorproteine eine

wichtige Rolle in der Vermittlung der IGF1 Signale spielen und nicht ohne weiteres

austauschbar sind. Deletion von IRS1 z.B. führt zu intrauteriner growth restriction

(IUGR) und peripherer Insulinresistenz. Die Deletion von IRS2 wiederum führt zu

Insulin-Resistenz und einer defekten Entwicklung von ß-Zellen im Pankreas, die

ihrerseits einen Diabetes verursachen (Tsuruzoe et al., 2001). Die bis jetzt noch nicht

so gut charakterisierten IRS3 und IRS4 könnten die IGF1R Funktion aber auch durch

die Modulation der Expression von IRS1 und IRS2 Proteinen indirekt beeinflussen

(Tsuruzoe et al. 2001; Tseng et al., 2003) Ob IRS4, genauso wie IRS1, mitogene

Signale vermittelt, ist umstritten (Tsuruzoe et al., 2001). Mäuse, denen IRS3 oder IRS4

fehlen, haben keine augenscheinlichen Phänotypen, im Gegensatz zu IRS1- oder

IRS2-knockout Mäusen (Liu et al., 1999; Fantin et al., 2000). Für IRS5 (DOK4) ist

bekannt, dass dieses nach Phosphorylierung durch IGF1-Signale den MAPK

Signalweg aktiviert. Auch IRS6 (DOK5) kann durch IGF1 aktiviert werden. Weitere

Details zu diesen beiden Vertretern müssen aber noch erforscht werden (Cai et al.,

2003). Außerdem sollte bedacht werden, dass sie nur entfernt ähnlich zu den

restlichen IRS-Proteinen sind (Versteyhe et al., 2010).

- 28 -

2.8. EGF

EGF gehört ebenfalls zu den Wachstumsfaktoren und übernimmt mitogene Rollen in

vielen verschiedenen Organen (Casalini et al., 2004), unter anderem auch im

Zusammenhang mit der Regulation von fetalem Wachstum und Entwicklung (Forbes

und Westwood, 2010). Die Wirkung von EGF (Epidermal growth factor) wird durch den

EGFR (Epidermal growth factor receptor) vermittelt. Nach Bindung des Liganden

kommt es zu intrinsischer Tyrosin Phosphorylierung und nachfolgender Aktivierung

promitogener Signalmoleküle (Prenzel et al., 2001), wie z.B. MAPK, Akt, p38 MAPK

oder PI3K (Oda et al., 2005; LaMarca et al., 2008). Veränderungen des EGFR führen

zu reduzierter plazentarer und fetaler Entwicklung sowohl bei Mäusen als auch bei

Menschen (Fondacci et al., 1994; Dackor et al., 2009). Unterstützt wurden diese

Annahmen durch Versuche, in denen gezeigt werden konnte, dass die Konzentration

maternalen EGFs mit dem fetalen Wachstum korreliert (Kamei et al., 1999), und

Mäuse ohne EGFR signifikant kleinere Plazenten aufwiesen (Miettinen et al., 1995).

Belege für die Wichtigkeit von EGF bei der Regulation von plazentarer Funktion und

Entwicklung beim Menschen kommen auch aus vielen in vitro Studien, in denen

nachgewiesen wurde, dass EGF die Trophoblastendifferenzierung (Barnea et al.,

1990; Garcia-Lloret et al., 1996), -proliferation (Li und Zhuang, 1997) und -motilität

stimuliert (LaMarca et al., 2008) sowie die Apoptose der Trophoblasten verhindert

(Johnstone et al., 2005; Moll et al., 2007). Auch für das Rind konnte gezeigt werden,

dass EGF die Motilität und Proliferation von fetalen Trophoblastzellen fördert (Dilly et

al., 2010; Hambruch et al., 2010).

EGF wird in der bovinen Plazenta ubiquitär, der EGFR im Trophoblasten und im

maternalen Epithel exprimiert (Weise, 2001). Auch in Blastozysten und dem

Endometrium des Rindes konnte EGF nachgewiesen werden (Ohtani et al., 1996;

Kliem et al., 1998). In vitro konnte der EGFR in bovinen fetalen Trophoblastzellen

nachgewiesen werden (Dilly et al., 2010).

In verschiedenen Arbeiten, wird von synergistischen Wirkungen zwischen IGF1 und

EGF berichtet (Qureshi et al., 1997), wobei verschiedene Interaktionen denkbar sind

und diskutiert werden. Dies wird in Kapitel 5.1. weiter ausgeführt.

- 29 -

3. Material und Methoden

Alle benutzten Reagenzien und Materialien sowie die Zusammensetzungen der Puffer

und Lösungen werden im Anhang beschrieben.

3.1. In vitro Versuche

3.1.1. Zelllinien

Im Rahmen dieser Arbeit wurden in den Versuchen vier verschiedene bovine,

plazentare Zelllinien untersucht: BCEC (bovine Karunkelepithelzellen), F3 (fetale

Trophoblasten), bovine plazentare Fibroblasten und BUVEC (bovine Endothelzellen

der Nabelvene). BCEC (Bridger et al., 2007), F3-Zellen (Hambruch et al., 2010) und

Fibroblasten (Häger et al., 2010) waren als permanente Zelllinien im Labor vorhanden.

Diese waren bei -150°C in DMSO/FCS eingefroren (100µl DMSO, 100µl FCS und

800µl Zellsuspension) und wurden bei Bedarf aufgetaut und fortlaufend kultiviert (siehe

3.1.3.). Die Isolation der BUVEC ist unter 3.1.2. beschrieben.

3.1.2. Isolation BUVEC

Für die Isolation von BUVEC wurden ungefähr im 4./5. Monat trächtige Uteri vom

Schlachthof verwendet. Nach Eröffnung der Uteri mit einer sterilen Schere wurde die

jeweilige Nabelschnur abgetrennt und in ein Becherglas mit Hanks Balanced Salt

Solution (Hanks BSS) gegeben. Die folgenden Schritte fanden alle unter der sterilen

Werkbank statt. Aus der Nabelschnur wurden die Blutgefäße von der Wharton’schen

Sulze befreit und anschließend die Arterien verworfen. In die Venen wurde ein

Katheter eingeführt und diese mit ca. 5ml Hanks BSS gespült. Anschließend wurde

- 30 -

durch denselben Katheter eine Spülung mit einer zuvor hergestellten Kollagenase

Lösung (0,025% in Hanks mit Ca2+/Mg2+) durchgeführt. Waren die Venen komplett mit

Kollagenase Lösung gefüllt, wurden sie an beiden Enden abgeklemmt und in diesem

Zustand für 20min in den Inkubator (37°C, 5%CO2) verbracht. Nach dieser Zeit wurden

die Venen aus dem Inkubator geholt und über ein mit einigen ml Hanks BSS befülltes

50ml Reaktionsgefäß gehalten, die Klemmen gelöst und eine Spülung mit FCS (Fetal

Calf Serum) durchgeführt. Die so gewonnene Suspension wurde zentrifugiert (5min,

1000rpm, 23,5°C).

Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 10ml EBM (Endothelzell-Basal-

Medium) resuspendiert. Die Aussaat erfolgte in 75cm² Zellkulturflaschen. Am Ende

wurde eine optische Kontrolle der Zellen unter dem Mikroskop vorgenommen, bevor

sie in den Inkubator verbracht wurden.

Nach 24h wurde ein Mediumwechsel vorgenommen, der von da an alle drei Tage

wiederholt wurde. Zur Charakterisierung der BUVEC erfolgte ein Nachweis der

erhöhten Aufnahme von acetyliertem LDL (Low Density Lipoprotein) (siehe 3.1.5).

3.1.3. Kultivierung der Zellen

Die Zellen (BCEC, F3, Fibroblasten) wurden in 75 cm2 Zellkulturflaschen bei 37°C und

5%CO2 in FSM (Vollmedium), bzw. die BUVEC in EBM (Endothelzell-Basal-Medium)

kultiviert. Nach ca. einer Woche erreichten die Zellen eine 90%ige Konfluenz und

wurden daraufhin passagiert. Hierbei wurden die Zellen voneinander und von der

Zellkulturflasche abgelöst und konnten dann in eine neue Zellkulturflasche überführt

werden oder für die verschiedenen Versuchsreihen genutzt werden. Zur Passage

wurde das in der Flasche vorhandene Medium abgesaugt und 5ml steriles PEM (PBS

mit 2mM EDTA) hineingegeben. Bei F3, Fibroblasten und BUVEC erfolgte eine kurze

Spülung mit PEM, welches dann wieder entfernt wurde. BCEC wurden mit dem PEM

für 6 min in den Inkubator gegeben. Hiermit sollten Reste des FSM ausgespült werden

und Ca2+-abhängige Zelladhäsionsmoleküle inhibiert werden. Das PEM wurde dann

aus der Flasche abgenommen. Im nächsten Schritt wurden 3ml Trypsin hinzugefügt

- 31 -

und die Zellen unter den bereits angegebenen Bedingungen, für 4-6min inkubiert, um

die Zelladhäsion aufzuheben. Nach diesem Zeitraum wurde die Zellkulturflasche aus

dem Inkubator genommen, vorsichtig geschwenkt und leicht dagegen geklopft um die

Ablösung der Zellen in die Flüssigkeit zu erleichtern. Nach mikroskopischer Kontrolle,

ob sich die Zellen vollständig abgelöst hatten, erfolgte eine Zugabe von 7ml FSM/EBM.

Die gesamt Lösung wurde in ein 15ml Röhrchen überführt und anschließend bei

900rpm und RT für 4min zentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde, nach

Entfernung des Überstandes, mit FSM/EBM resuspendiert. Je nach gewünschter

Verdünnung erfolgte dann die Aussaat der Zellen in FSM/EBM in die

Zellkulturflaschen. Der Mediumwechsel wurde am folgenden Tag und daraufhin alle 2

Tage unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Die BUVEC wurden, im Gegensatz

zu den BCEC, F3-Zellen und Fibroblasten, nur in der Primärkultur verwendet (Passage

0-1).

3.1.4. LDL-Färbung

Zur Charakterisierung der Endothelzellen, BUVEC, wurde die erhöhte Aufnahme von

acetyliertem LDL (Ac-LDL) nachgewiesen. Diese Methode schloss sich der Isolierung

an. Die Endothelzellen sind in der Lage, acetyliertes LDL in vermehrtem Umfang

aufzunehmen und im Zytoplasma anzureichern. Das verwendete Ac-LDL ist an den

Fluoreszenzfarbstoff 1,1’Dioctaldecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbozyanin Perchlorat

(Dil) gekoppelt. Nach erfolgter Aufnahme durch die Zelle, wird das Ac-LDL-Dil durch

lysosomale Enzyme gespalten und der fluoreszierende Farbstoff reichert sich an der

Membran des Lysosoms an (Voyta et al., 1984). Diese Anlagerungen sind mittels

Fluoreszenzmikroskopie als punktförmige, perinukleäre Bereiche zu identifizieren. Ihr

Auftreten gilt als Nachweis für die erfolgreiche Isolation von Endothelzellen.

Hierfür wurden die BUVEC passagiert und ein Teil der Zellsuspension auf

Deckgläschen in einer 24 well-Platte aufgebracht. Mit 500µl EBM wurden sie für 2-3d

in den Inkubator verbracht (37°C, 5%CO2). Nach diesem Zeitraum wurde das EBM

abgenommen und 300µl/well LDL-Farbstoff in einer Verdünnung von 10µg/ml (in EBM)

- 32 -

aufgetragen. Die Zellen wurden abermals für 4h inkubiert (37°C, 5%CO2). Nach dem

Abnehmen des Farbstoffs erfolgte eine Spülung mit PBS1x. Im nächsten Schritt wurde

500µl/well Hoechst-Farbstoff 33342 (5mg/ml) in einer Verdünnung von 1:15.000 (in

PBS1x) aufgetragen und wirkte 10min auf dem Schüttler ein. Überschüssige Reste

wurden durch mehrmaliges Waschen mit PBS1x entfernt. Die Deckgläschen wurden

mit Prolong Antifade auf Objektträgern befestigt und über Nacht trocknen gelassen.

Am darauf folgenden Tag erfolgte die Kontrolle unter dem Fluoreszenz Mikroskop (Carl

Zeiss Vision®, MTB 2004).

3.1.5. Quantifizierung der Zellen

Hierfür wurde das Zellpellet nach der Passage mit einer Menge von 5-8ml Medium

resuspendiert. Zur zuverlässigen Quantifizierung der Zellen wurde eine Neubauer-

Zählkammer verwendet. Vor dem Gebrauch wurde ein Deckgläschen auf die

Grundplatte aufgelegt und der korrekte Sitz durch Auftreten von Newtonschen

Interferenzfarben bestätigt. Nach Mischen von Zellpellet und Medium wurden 10µl

dieser Suspension abgenommen und in die Neubauer-Zählkammer gegeben. Unter

dem Lichtmikroskop, bei Durchlicht und 10-facher Vergrößerung, wurden vitale Zellen

in den Zählfeldern ausgezählt, wobei pro Auszählung eines Quadrates nur zwei

Grenzlinien verwendet wurden, um doppelte Zählung zu vermeiden. Aus Anzahl der

Zellen und dem Volumen wurde abschließend die Zellmenge errechnet.

3.1.6. Proliferations-Assay

Die jeweils zu untersuchenden Zellen wurden passagiert, gezählt (siehe 3.1.5.) und in

96 well-Platten (F3, Fibroblasten) bzw. 24 well-Platten (BCEC) ausgesät. BUVEC

wurden von den Proliferations-Assays mit kombinierten Stimulationen

ausgeschlossen, da sie in den Vorversuchen auf keine Stimulation reagierten.

- 33 -

Tab. 1: Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Proliferations-Assay

Zelllinie Zellzahl/well

BCEC 15.000

F3 10.000

Fibroblasten 10.000

Nach 24h (37°C und 5%CO2) wurde das FSM durch SFM (serum free medium) für 4h

ersetzt, um eine Beeinflussung durch die Bestandteile des FSM ausschließen zu

können. Nach diesem Serum-Entzug folgte die Stimulation mit den unterschiedlichen

Wachstumsfaktoren. Diese wurden in der jeweiligen Konzentration (Tab. 2) in

SFM/EBM 1% angesetzt und jeweils 100µl (96 well-Platte)/500µl (24 well-Platte) pro

well appliziert. Die genannten Konzentrationen wurden in Vorversuchen als am besten

geeignet ermittelt, genauso wie die Stimulationszeit von insgesamt 48h.

Tab. 2: Konzentrationen der untersuchten Wachstumsfaktoren im MTT-Assay und Live Cell Imaging

Zelllinie Wachstumsfaktor

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF

BCEC 100ng/ml 100+20ng/ml 20ng/ml 50ng/ml 50+20ng/ml

F3 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml

Fibroblasten 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml

Nach weiteren 24h wurde die Stimulation wiederholt. Zum späteren Bezug wurde SFM

zu einer Gruppe von Zellen gegeben. Als interne Kontrolle wurde eine Gruppe von

Zellen mit FSM geführt.

- 34 -

Nach insgesamt 48h wurde das Medium von den Zellen abgenommen und eine MTT-

Lösung aufgegeben. Diese bestand aus 5mg MTT (3(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazoliumbromid) in 1ml PBS (phosphat buffered saline) und 9ml SFM. Nach

einer Inkubationszeit von 4h kommt es durch intrazelluläre Stoffwechselprozesse zur

Ausfällung von Formazan, das in Form von violetten Kristallen sichtbar wird. Durch die

Zugabe von 300µl DMSO (Dimethylsulfoxid)/well wurde das Formazan gelöst.

Unterstützt wurde dieser Vorgang durch 15min auf dem Schüttler.

Im ELISA-Reader erfolgten die Messungen der Absorption bei 550nm und 690nm in

der Ascent Software for Multiskan. In Excel wurden dann Mittelwerte, SEM (standard

error of the mean) und Standardabweichungen für jede Stimulation und Zellart

ermittelt. Für jede unterschiedliche Stimulation wurden 24 wells benutzt und die

Versuche wurden dreimal wiederholt.

- 35 -

3.1.7. Motilitäts-Assay

Die verschiedenen Zelllinien wurden passagiert, gezählt und in 12 well-Platten

ausgesät.

Tab. 3: Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Motilitäts-Assay

Zelllinie Zellzahl/well

BCEC 40.000

F3 25.000

Fibroblasten 25.000

BUVEC 25.000

Die Zellen wurden für 24h bei 37°C und 5%CO2 in FSM bzw. EBM inkubiert und

anschließend für 4h in SFM/EBM 1% verbracht. Nach dieser Zeit wurden die Zellen

mit 1000µl der unterschiedlichen Lösungen mit Wachstumsfaktoren in SFM/EBM 1%

stimuliert (Tab. 2). Als Bezug dienten auch hier die unstimulierten, daher nur mit

SFM/EBM 1% inkubierten, Zellen. Eine Positiv-Kontrolle mit FSM/EBM wurde

ebenfalls durchgeführt. Direkt im Anschluss an die Stimulation wurden die Platten in

die Inkubationskammer (37°C, 5%CO2) des Mikroskops verbracht. Die Aufnahmen

erfolgten mit dem Cell Observer System, Zeiss MicroImaging, Jena, Deutschland. Pro

well wurden zwei geeignete Positionen ausgewählt, an denen die folgenden

Aufnahmen vorgenommen wurden. Insgesamt wurden über einen Zeitraum von 18h

alle 15min Bilder aufgenommen. Die anschließende Auswertung der Bilder erfolgte mit

ImageJ® (Schneider et al., 2012). So ermittelte Strecken, von 50 Zellen/well, wurden

im Weiteren mit Excel im Hinblick auf Mittelwerte, Standardabweichung und SEM

untersucht. Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt.

- 36 -

3.1.8. Molekularbiologie

Zur RNA Extraktion wurde das SV Total RNA Isolation System (Promega, USA)

entsprechend den Herstellerangaben verwendet. Alle nachfolgenden Schritte wurden,

wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die m-RNA Extraktion erfolgte aus in PBS gewaschenen und bei -21°C eingefrorenen

Zellpellets. Um die Zellen aufzuschließen wurde RNA-Lysis-Buffer mit 10µl ß-

Mercapthoenthanol zu den Zellen hinzugegeben und anschließend gevortext, davon

wurden ca. 175µl in ein neues Eppendorf Gefäß überführt. Im nächsten Schritt wurden

350µl RNA-Dilution-Buffer dazugegeben, die Probe wurde dann für 3min bei 70°C im

Heizblock erhitzt und im Folgenden zentrifugiert (12.000-14.000g für 10min).

Der Überstand wurde mit 200µl 95%igem Ethanol vermischt, auf ein Spin Basket

gegeben und zentrifugiert (1min, 12.000-14.000g). Die Membran wurde dann mit 600µl

RNA Wash Solution ausgewaschen (12.000-14.000g, 1min). Verbliebene DNA wurde

mittels 50µl DNAse Incubation Mix verdaut, nach 15min Inkubation wurde dies mit

200µl DNAse Stop Solution unterbunden. Es folgten zwei Wasch-Schritte mit je 600µl

und 250µl RNA Wash Solution (12.000-14.000g, 30s). Die Elution der RNA erfolgte in

100µl Nuklease freiem Wasser.

Die Konzentration und Reinheit der RNA wurde mittels eines Spektrophotometers bei

einer 1:50 Verdünnung (E260/E280) gemessen und ein Quotient berechnet, der die

Reinheit der RNA wiedergab. Die Menge an enthaltener RNA wurde mit folgender

Formel ermittelt: Konzentration [µg/ml]=OD26040µg/ml x Verdünnungsfaktor.

Im folgenden Schritt wurde die gewonnene RNA in cDNA umgeschrieben. Für die

Reverse Transkription (RT-reaction) wurde ImPromII reverse transcriptase (Promega)

mit dem dazugehörigen Standardprotokoll verwendet.

Es wurden 0,5µg RNA und 1µl Random Primer (0,5µg) zusammen gegeben und mit

Nuklease freiem Wasser auf 5µl aufgefüllt. Anschließend erfolgte eine Erhitzung auf

70°C für 5min, um sekundäre Strukturen zu denaturieren. Nach dem Kühlen wurde

dann der Reverse Transcription Mix dazugegeben (RT-Mix).

- 37 -

RT-Mix

Nuklease freies Wasser 6,1µl

ImPromII 5x Reaktionspuffer 4,0µl

MgCl2 (25mM) 2,4µl

dNTP (10mM) 1µl

RNasin (2.500 U) Ribonuclease Inhibitor 0,5µl

ImPromII Reverse Transkriptase 1,0µl

Die Annealing Temperatur wurde auf 25°C festgelegt und die anschließende

Elongation erfolgte bei 42°C für 60min. Mit 70°C für 15min wurde die Reaktion durch

Enzym Denaturierung gestoppt.

Um die Expression von IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R, den IGFBPs 1-7 in den bovinen

Zelllinien BCEC, F3, Fibroblasten und BUVEC sowie die Expression von IRS1-4 in

BCEC, F3 und Fibroblasten zu erfassen, wurde anschließend eine PCR durchgeführt.

Der Versuch wurde nach einem Promega PCR Protokoll durchgeführt, Reagenzien

wurden von Promega verwendet.

Reaction-Mix

5x Green go Taq Reaction Buffer 4µl

MgCl2 (25mM) 1,6µl

dNTP (10mM) 0,4µl

Primer forward (10µm) 1µl

Nuklease freies Wasser 10,9µl

Go Taq Polymerase (5u/µl) 0,1µl

Template (cDNA) 1µl

Als Negativ-Kontrolle wurde cDNA durch Nuklease freies Wasser ersetzt.

- 38 -

Tab. 4: Verwendete PCR Primer

Ta Annealing temperature

Name Sequenz (5’ zu 3’) Amplicon Accession Ta

IGF1 For: CTA CAG TGA AGA TGC CCA TCA CA Rev: GGT GAA GGC GAG CAA GCA 65bp HQ324244.1 59°C

IGF2 For: TGC CTC TAC GAC CGT GCT T Rev: GAC TGC TTC CAG ATG TCA TAT TGG 80bp NM_174087.3 60°C

IGF1R For: GCT CAA CCC AGG GAA CTA CAC A Rev: GAT CCG TCC ACG ACC CAT T 70bp XM_002696504.1 60°C

IGF2R For: CCA GCA CTT CAG TCG CAA A Rev: GGT CGC CAT CTT GAA CGT 64bp NM_174352.2 56,5°C

IGFBP1 For: CAG TGA GCG CCG GTT CCT GT Rev: GTG AGT TCC GGG CAG GAG GC 200bp NM_174554.2 64,5°C

IGFBP2 For: GAC GGG AAC GTG AAC TTG AT Rev: ACC TGG TCC AAT TCC TGC T 212bp NM_174555.1 57°C

IGFBP3 For: CTG GCA TCT TTC CAC TTT CC Rev: AGA CGA AGC GCG TCT AAC AT 201bp NM_174557.3 57,3°C

IGFBP4 For: CCC AAG TCT GTG GGA GAA GA Rev: AAG GAC CTG GGG AGG AGT AA 198bp NM_174557.3 59,4°C

IGFBP5 For: TCG TGC GGC GTC TAC ACT Rev: GGG TGA GTA GGT CTC CTC T 207bp NM_001105327.1 59°C

IGFBP6 For: GCCCGGGTCTTCAGAAGGCG Rev: ATGTGAGGCCCCAGGGGTGA 188bp NM_001040495.1 64,5°C

IGFBP7 For: GGT GCC CAG GTG TAT TTG AG Rev: CAG CAC CCA GCC AGT AAC TT 183bp NM_001102300.1 59,4°C

IRS1 For: GAG CGG TAG TGG CAA ACT CT Rev: GGA ACT TGA GGA AAG GCG GA 228bp XM_002685642.1 59,4°C

IRS2 For: AGC CAA GTT CAC TGC CTC CTC Rev: GCT GGA GCC ATA CTC GTC CAA G 286bp XM_003582887.1 63°C

IRS3 For: CTC GCT ATA TTG GGG CCT GG Rev: AGC CTC CAC CTC TGA TGG AT 201bp XM_002698132.1 60,4°C

IRS4 For: CGC AAT GGT GGC AGA GAA TG Rev: ACA GAA CCT CCT CGT CGG TA 262bp XM_592483.3 59,4°C

RPS9 For: AAA CGT GAG GTC TGG AGG GTC AAA Rev :GCA ACA GGG CAT TAC TTC GAA CA 117bp NM_001101152 60°C

- 39 -

Während der PCR wurde der Deckel des Cyclers auf 105°C erhitzt, um zu verhindern,

dass sich während dieses Vorgangs Flüssigkeit am Deckel sammelt. Die initiale

Denaturierung erfolgte bei 95°C für 2min. Daraufhin folgten 37 Zyklen, in denen zuerst

bei 94°C die Denaturierung (30s), dann bei 60°C die Primeranlagerung (45s) und

abschließend bei 72°C (30s) die Elongation stattfand. Anschließend folgte für 5min

eine finale Polymerisation. Für die Primer IGFBP 1-7 und IRS 1-4 wurde ein

abweichendes Programm gewählt, das sich dadurch unterschied, dass ein

Temperaturgradient von 60°C ± 3.5°C für das Annealing vorhanden war. Die jeweiligen

Ta können Tab.4 entnommen werden.

Die spezifischen PCR-Produkte wurden dann auf ein 2%iges Agarose-Gel, welches

Ethidiumbromid enthielt, aufgetragen und eine Elektrophorese bei 80mV in TBE-Puffer

durchgeführt.

Die Visualisierung erfolgte unter UV Licht mit der Vision-Capt Software (Vilber

Lourmat) und die Auswertung mittels Bio-1D.

3.1.9. Proteinbiochemie

Die Zellen wurden für diesen Versuch in Zellkulturschälchen ausgesät (40x11mm) und

für drei Tage in den Inkubator (37°C, 5%CO2) verbracht, um ein möglichst konfluentes

Wachstum zu erreichen. In die Zellkulturschälchen wurden jeweils 1,5ml FSM

gegeben. BUVEC wurden von diesen Versuchen ausgeschlossen, da in den

vorangehenden Untersuchungen zu Proliferation und Motilität keine signifikanten

Änderungen im Bezug zu FSM oder SFM beobachtet werden konnten.

- 40 -

Tab. 5: Verwendete Zellzahl/dish und Zelllinie für Western Blotting

Zelllinie Zellzahl/dish

BCEC 250.000

F3 150.000

Fibroblasten 150.000

War nach drei Tagen die Konfluenz erreicht, wurde das vorhandene FSM

abgenommen und für vier Stunden durch SFM ersetzt. Die Stimulation mit den

verschiedenen Faktoren erfolgte anschließend für 15min bzw. 7,5min im Inkubator.

Die eingesetzten Konzentrationen sind Tab. 6 zu entnehmen.

.

Tab. 6: Konzentrationen der untersuchten Wachstumsfaktoren im Western Blotting

Zelllinie Wachstumsfaktor

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF

BCEC 100ng/ml 100+20ng/ml 20ng/ml 50ng/ml 50+20ng/ml

F3 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml

Fibroblasten 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml

Nach Ablauf der Zeit wurde die Reaktion gestoppt, in dem die Schälchen auf Eis

gestellt wurden, das Medium unverzüglich abgesaugt und zweimal mit kaltem PBS

gespült wurde. Daraufhin wurden 75µl Boehringer Lyse-Puffer pro Zellkulturschälchen

dazugegeben, dieser enthielt AEBSF (1mM), Pepstatin (1µM), Leupeptin (1µg/ml)

sowie Phospahatase-Inhibitoren. Zur Zelllyse wurde auch weiterhin auf Eis gearbeitet

und die Zellen mit einem Policeman-Schaber abgelöst, das gewonnene Zelllysat

wurde in Eppendorfgefäße überführt und zentrifugiert (17.000g, 5min, 4°C). Im so

gewonnen Überstand ist das Protein nun enthalten.

- 41 -

Im Folgenden wurde die enthaltene Proteinmenge bestimmt, dazu wurde ein auf der

Proteinbestimmung nach Lowry basierendes DC Protein Assay Kit™ verwendet (Bio-

Rad, München). Grundlage dieses Verfahrens ist die Biuret-Reaktion, bei der durch

die Bindung von Cu2+O mit Peptidbindungen ein gefärbter Komplex entsteht. Wird die

Absorption dieses Komplexes nun bei 690nm im ELISA Reader Thermo Multiskan

(ThermoFischer Scientific Inc, USA) gemessen, kann durch den linearen

Zusammenhang mit der Proteinkonzentration, die Menge des enthaltenen Proteins in

der Probe bestimmt werden. Als Vergleichsprotein wurde Bovines Serum Albumin

verwendet.

Mithilfe der Geradengleichung wurde die benötigte Menge an Probe ermittelt

(10µg/15µg Protein/Probe). Die Differenz zwischen Füllmenge (20µl) der Taschen und

der benötigten Menge Probe, sowie 5µl 4xLämmli-Puffer mit ß-Mercaptoenthanol

wurde mit Boehringer-Lyse-Puffer aufgefüllt. Anschließend erfolgte eine kurze

Zentrifugation, danach wurden die Proteine auf dem Heizblock denaturiert (5min,

95°C). Es folgte nach dem Abstellen auf Eis ein abermaliges Zentrifugieren (2min,

17.000g).

Es wurde für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ein diskontinuierliches Gel,

bestehend aus Sammelgel, Trenngel und Stopfgel verwendet. Bei einer SDS-PAGE

werden die Proteine durch das negative geladene SDS (Natriumdodecylsulfat)

denaturiert und mit einer identischen Ladungsdichte ausgestattet. So werden sie,

ladungsunabhängig, nach Größe aufgetrennt. Außerdem werden Wechselwirkungen

unter den Proteinen verhindert. Durch Verwendung eines diskontinuierlichen Gels wird

eine bessere Auftrennung der Proteine erreicht. Für die isolierten Proteine wurden

jeweils 12%ige Trenngele verwendet. Die Gele wurden in die Apparatur eingespannt

und SDS-Laufpuffer eingefüllt, damit wurden auch die Geltaschen vor der Befüllung

gespült. Die Taschen wurden jeweils mit 20µl Probe, bzw. 5µl SDS-Marker (Sigma

Aldrich, SDS7B) befüllt. Bei einer Spannung von 100V wurde gewartet, bis sich eine

Lauffront gebildet hatte. Anschließend wurde die Spannung auf 150V erhöht und die

Proben benötigten ca. 1h, um das Gel zu durchlaufen.

Um die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran zu

überführen, wurde nun das Western Blotting durchgeführt. Angewendet wurde das

- 42 -

Wet-Blot System. Die verwendeten Geräte zur Gelherstellung sowie die Western-Blot-

Apparatur stammten von Bio-Rad (München). Die eingespannten Pakete aus

Schwämmchen, Filterpapieren (6x1mm), Nitrocellulosemembran und Gel wurden in

die Blot-Apparatur überführt und diese mit Blot-Puffer aufgefüllt. Unter Rühren und

Kühlung lief der Blot für 1h bei 100V. Die nun auf der Membran gebundenen Proteine

konnten im Folgenden für die Immunodetektion genutzt werden.

Die freien Bindungsstellen auf der Membran konnten mit Milchpulverlösung (5%

Magermilchpulver in TBS-T) blockiert werden, um unspezifische Bindungen zu

verhindern. Die Inkubation mit dem Erst-Antikörper erfolgte über Nacht bei 4°C auf

dem Rüttler, der entsprechende Antikörper wurde mit 5ml Magermilchpulver in TBS-T

und 5ml TBS1x zuvor vermischt. Es wurden folgende Antikörper verwendet:

Tab. 7: Im Western Blotting verwendete Antikörper mit jeweiliger Verdünnung

Antikörper Verdünnung

Phospho-MAP Kinase 42/44 (Sigma Aldrich) 1:10000

Phospho-Akt (Ser 473) (Cell Signaling) 1:4000

Phospho-p38-MAP Kinase (Cell Signaling) 1:4000

Am folgenden Tag wurde diese Lösung entfernt und die Membran 3x mit TBS-T

gewaschen (alle Waschschritte wurden auf dem Schüttler bei Raumtemperatur

durchgeführt). Der Zweit-Antikörper IgG-HRP wurde mit einer Verdünnung von 1:4000

(in TBS1x) für 1h dazugegeben. Für die pMAPK 42/44 wurde ein goat anti-mouse IgG-

HRP (sc-2005, Santa Cruz), für pAkt (Ser 473) und p38 MAPK wurden ein goat-anti-

rabbit IgG-HRP Zweit-Antikörper verwendet. Es folgte abermals 3x Waschen für je

10min.

Die Detektion erfolgte mit einer Fusion SL Chemilumineszenz-Detektionseinheit mit

entsprechender Fusion Software. Zuvor wurde die Membran mit Luminol und

- 43 -

Enhancer (SuperSignal® West Dura, Thermo Scientific) behandelt, um die

Chemilumineszenz zu ermöglichen.

Zur Normierung der Ergebnisse und internen Kontrolle folgte die Redetektion mit ß-

Aktin. Die Membran wurde 3x10min in TBS-T gewaschen und anschließend für 30min

im Stripping Buffer inkubiert, um die vorherigen Antikörper wieder zu lösen. Es folgte

nochmaliges Waschen mit TBS1x (3x10min). Auch in diesem Fall wurde die

unspezifische Bindung mittels Blocken durch Magermilchpulver verhindert (5%

Magermilchpulver in TBS-T), bevor der Antikörper ß-Aktin (C4) (sc-47778, Santa

Cruz), mit einer Verdünnung von 1:6000 für 1h bei Raumtemperatur einwirken konnte.

Danach wurde abermals für 3x10min mit TBS-T gewaschen und anschließend der

Zweitantikörper goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005, Santa Cruz) in einer Verdünnung

von 1:4000 aufgetragen, bei einer Einwirkzeit von 1h. Nach 3x10min Waschen wurde

die Redetektion durchgeführt, entsprechend der vorherigen Detektionsbeschreibung.

Im Anschluss an die Versuche wurden die Ergebnisse der Chemilumineszenz mit Hilfe

des Programms BIO-1D quantitativ analysiert und abschließend mit Excel

ausgewertet.

3.1.10. Statistische Auswertung

Die Ergebnisse aus den Versuchen der Proliferation, Motilität und der

Proteinbiochemie wurden mithilfe von SPSS-Software (SPSS, Chicago, IL, USA)

ausgewertet. Hierfür wurde der Tukey’s honestly significant difference (HSD) Test

angewendet, um signifikante Unterschiede zwischen stimulierten und unstimulierten

Zellen, sowie zwischen den einzelnen Stimulantien, zu erkennen. Signifikanzen

wurden ab p<0,05 festgelegt.

- 44 -

3.2. Untersuchung von Proben aus der In vivo Studie

3.2.1. Material und Gewebeentnahme und -aufbereitun g

Es standen Gewebeproben aus einem Kooperationsprojekt mit der Klinik für Rinder

und der Arbeitsgruppe Immunologie zur Verfügung, die im Rahmen der Dissertationen

von Fr. Dr. Lütkehus (Lütkehus, 2012) und Fr. Dr. Laue (Laue, 2014) gewonnen

wurden. Die Schritte 3.2.2. bis 3.3.2. wurden im Rahmen der Dissertationen von Fr.

Dr. Lütkehus (Lütkehus, 2012) und Fr. Dr. Laue (Laue, 2014) durchgeführt. Zur

besseren Verständlichkeit des Tierversuches, der vollständigen Beschreibung und

Nachverfolgbarkeit der Proben sind sie hier aufgeführt.

3.2.2. Gruppe 1: Proben der präpartalen Phase

Für diesen Anteil an der Studie wurden 17 klinisch gesunde, multipaare Kühe beprobt,

die alle aus dem gleichen Betrieb stammten (Großbetrieb der Agrargesellschaft mbH

Siedenlangenbeck, Kuhfelde). Die ausgewählten Kühe hatten alle einen

vergleichbaren Body Condition Score (BCS) und in der letzten Laktation eine

Milchleistung von nicht mehr als 9500kg. Außerdem befanden sich alle in der 2. oder

3. Laktationsperiode.

Den Versuchstieren wurde am 248. Tag der Trächtigkeit aus der V. caudalis mediana

Blut entnommen und der IGF1 Wert bestimmt. Daraus wurde die Zuteilung zur IGF-

high-Gruppe (180-250ng/ml IGF1) oder IGF-low-Gruppe (60-100ng/ml IGF1)

vorgenommen. Der Grenzwert zwischen den beiden Gruppen wurde auf 140ng/ml

festgelegt. So kam es zu einer Zahl von 10 Tieren in der IGF-high-Gruppe und 7 Tieren

in der IGF-low-Gruppe. Die Auswahl der Tiere mit der Blutentnahme und -analyse,

sowie die Betreuung und tägliche Untersuchung in der Zeit der Einstallung an der

Tierärztlichen Hochschule Hannover übernahm die Klinik für Rinder der Tierärztlichen

Hochschule Hannover.

- 45 -

Am 275. Tag der Trächtigkeit wurde bei den Kühen ein Kaiserschnitt, ohne

medikamentelle Einleitung, durchgeführt und nach der Entwicklung des Kalbes zwei

Plazentome entnommen. Hierfür wurde am Karunkelstiel ein Emaskulator angesetzt,

um die Blutungen einzudämmen, und anschließend das Plazentom mit einem Skalpell

abgesetzt. Im weiteren Verlauf entnahmen die Operateure interkarunkuläres

Uterusgewebe, mit einer Größe von ca. 5x10cm, ebenfalls mit einem Skalpell.

Zur weiteren histologischen Untersuchung war es nötig, die gewonnen Proben zu

fixieren. Dies erfolgte in Formalin nach Lillie sowie in Bouin’scher Lösung, für jeweils

48h. Die Proben der Plazentome enthielten sowohl maternale Anteile (Karunkelstiel)

als auch fetale Anteile (plazentomares Chorion) und interdigitierendes Gewebe. Sie

wurden vor der Fixierung in Scheiben geschnitten, um diese zu erleichtern. Auch das

interkarunkuläre Uterusgewebe wurde in ca. 10x10x5mm große Stücke zerschnitten

und fixiert. Nach abgeschlossener Fixierung wurden die Gewebeproben in

Einbettungskapseln überführt. Die formalinfixierten Proben wurden nun für etwa drei

Stunden unter fließendem Wasser gespült, um das Fixans zu entfernen und daran

anschließend in den Einbettungsautomaten (Fa. Leica, Nussloch) verbracht (siehe

3.3.2.) und abschließend in Paraffin eingebettet. Die Proben, welche in Bouin’scher

Lösung fixiert wurden, erfuhren eine abweichende Behandlung. Sie wurden zunächst

in 70%igen Alkohol überführt, der an mehreren aufeinander folgenden Tagen

gewechselt wurde. Auch hier mit dem Ziel, das Fixans auszuwaschen. Diese Proben

wurden nach ca. 1-2 Wochen in der Handeinbettung (siehe 3.3.1.) weiter bearbeitet.

3.2.3. Gruppe 2: Proben der postpartalen Phase

Die Tiere für diese Gruppe stammten aus demselben Betrieb. Es wurden 12 klinisch

gesunde und multipaare Kühe nach den gleichen Kriterien wie bereits angeführt

ausgewählt. Auch in diesem Fall wurde eine Einteilung in eine IGF-high- (n=6) und

eine IGF-low-Gruppe (n=6) unternommen. Die Versuchstiere der IGF-high-Gruppe

wiesen IGF1 Spiegel im Blut von 180-280ng/ml und die der IGF-low-Gruppe von 80-

140ng/ml auf.

- 46 -

In diesem Versuchsteil wurde die spontane Abkalbung abgewartet und 30min post

partum die Proben transvaginal gewonnen. Zu diesem Zeitpunkt wurden zwei

Plazentome mittels Emaskulator entnommen. Die Behandlung der Proben erfolgte wie

bereits in 3.2.2. beschrieben. Nun wurde der Abgang der Nachgeburt abgewartet,

erfolgte dieser nicht innerhalb von 12h post partum, wurde die Kuh von der Studie

ausgeschlossen. Dieser Fall trat mehrere Male ein, weshalb sich die Anzahl der Kühe

von je n=10 pro Gruppe auf jeweils n=6 dezimierte. Wenn die Nachgeburt abgegangen

war, wurde 1l einer NaCl-Lösung (39°C) (Braun, Melsungen, Deutschland), die mit

5mg LPS (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) versetzt war in den

Uterus eingegeben. Dies erfolgte mit einem transvaginalen Katheter und hatte das

Ziel, eine lokale Entzündungsreaktion hervorzurufen. Die Kühe wurden drei Stunden

später euthanasiert. Dies wurde intravenös mit Pentobarbital-Natrium (Release®,

WDT, Garbsen, Deutschland), in einer Dosierung von 30000mg vorgenommen. Der

Uterus wurde im Folgenden komplett entnommen, hierfür wurden die Tiere an den

Hinterbeinen aufgehängt und 2-5cm kranial des Euteransatzes ein etwa 50cm langer,

transversaler Schnitt, zur Eröffnung der Bauchhöhle vorgenommen. Der Uterus wurde

kaudal der Zervix abgesetzt.

Nun erfolgte eine erneute Beprobung, um die Proben vor und nach LPS-Instillation

miteinander vergleichen zu können. Dazu wurde der Uterus an seiner dorsalen Seite

eröffnet und mittels eines Skalpells zwei Plazentome entnommen. Es wurde ebenfalls

ein ca. 5x10cm großes Stück interkarunkuläres Uterusgewebe gewonnen. Die

Vorbereitungen zur histologischen Untersuchung wurden, wie bereits in 3.2.2.

beschrieben, vorgenommen.

Die Tierversuche, wie in 3.2.2. und 3.2.3. beschrieben, sind vom Niedersächsischen

Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Laves, Oldenburg,

genehmigt worden; AZ 33.9-42502-04-09/1696.

- 47 -

3.3. Histologie

3.3.1. Protokoll der Handeinbettung

Alle Schritte liefen bei Raumtemperatur ab, abweichende Temperaturen sind

angegeben.

70% Ethanol über Nacht

80% Ethanol über Nacht

100% Ethanol 2h

100% Ethanol 2h

Isopropanol 2h

Xylol I 2h

Xylol II 2h

Paraffin I (ca. 62°C) über Nacht

Paraffin II (ca. 62°C) 2h

Paraffin III (ca. 62°C) 1h

3.3.2. Protokoll der automatischen Einbettung

Alle Schritte liefen bei Raumtemperatur ab, es sei denn die abweichende Temperatur

ist angegeben. Programm: Routine Overnight.

70% Ethanol Prä (Warteschritt) 2h

70% Ethanol 1,5h

80% Ethanol 1,5h

90% Ethanol 1,5h

100% Ethanol 1h

- 48 -

100% Ethanol 1h

Isopropanol 1h

Xylol I 1h

Xylol II (35°C) 1h

Xylol III (50°C) 1h

Paraffin I (62°C) 1h

Paraffin II (62°C) 1h

Paraffin III (62°C) 1h

Nach beiden Einbettungsvorgängen wurden die Kapseln geöffnet und die Proben auf

der Einbettstation (Fa. Leica, Nussloch) in 60°C warme Metallförmchen gegeben, die

dann mit flüssigem Paraffin ausgegossen wurden. Zum Aushärten wurden die

ausgegossenen Proben anschließend auf eine 5°C kalte Platte gelegt. Es folgte die

Entfernung aus den Förmchen und bis zur weiteren Bearbeitung wurden die so fertig

aufbereiteten Proben in speziellen Aufbewahrungsboxen (Fa. Medite, Burgdorf) bei

Raumtemperatur gelagert.

3.6.3.Vorbereitung der Schnitte für Histologie und Immunhistochemie

Von den gekühlten Paraffin eingebetteten Proben wurden mit einem

Rotationsmikrotom (Fa. Leica, Nussloch) 4µm dicke Schnitte hergestellt. Diese wurden

vorsichtig in ein Wasserbad überführt, welches mit destilliertem, erwärmtem Wasser

gefüllt war. Anschließend wurden sie auf silanbehandelte, gläserne Objektträger

(HistoBond® adhäsive Objektträger, Marienfeld, Laboratory Glassware, Lauda-

Königshofen) aufgezogen und zum Trocknen über Nacht in einen Wärmeschrank

(60°C) verbracht. Die gebrauchsfertigen Objektträger wurden dann bis zum Färben in

speziellen lichtdichten Aufbewahrungskisten bei Raumtemperatur gelagert.

- 49 -

3.3.4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Um die Morphologie der einzelnen Proben besser beurteilen zu können und Schnitte

für die folgende immunhistochemische Behandlung auszuwählen, wurden die Schnitte

im Vorfeld mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt.

Diese dichromatische Färbung ermöglicht es, basophile Strukturen, wie zum Beispiel

Zellkerne, von azidophilen Strukturen, wie unter anderem dem Zytoplasma, zu

unterscheiden.

Die Entparaffinierung der Schnitte erfolgte zunächst mittels Xylol-Behandlung, eine

Rehydrierung mittels absteigender Alkoholreihe wurde angeschlossen und mit Aqua

dest. beendet.

Xylol I 10min

Xylol II 10min

Isopropanol (99%) 2min

Ethanol (99%) 2min

Ethanol (80%) 2min

Ethanol (70%) 2min

Aqua dest 2min

Nach der erfolgten Rehydrierung wurden die Schnitte 6min in Hämalaun nach Delafield

gefärbt und anschließend kurz in 0,1% HCl gespült. Daran angeschlossen wurde ein

15-minütiges Spülen unter Leitungswasser, um ein Bläuen der Schnitte, durch

Erhöhung des pH-Wertes zu erreichen. Die Färbung in 0,1% Eosin erfolgte für 5min

unter Zugabe von 3-4 Tropfen Eisessig. Auch nach dieser Färbung erfolgte Spülen in

Aqua dest.

Die nächsten Schritte dienten der Dehydrierung:

Ethanol (70%) zweimaliges Spülen

Ethanol (80%) zweimaliges Spülen

Ethanol (99%) 2min

Isopropanol (99%) 2min

- 50 -

Xylol I 5min

Xylol II 5min

Am Ende wurden die Schnitte mit Eukitt und Deckgläschen eingedeckt.

3.3.5. Immunhistochemie

Zunächst wurden die Schnitte wie folgt entparaffiniert und rehydriert:

Xylol 2x10min

Isopropanol 2min

absoluter Alkohol 2min

Ethanol (80%) +H2O2 (30%) 30min

Ethanol (70%) 2min

Es folgten drei Waschschritte mit PBS (je 5min), bevor eine Citrat Puffer (pH 6,0)

Vorbehandlung angeschlossen wurde, um eine bessere Bindung der Antikörper an die

Antigene zu ermöglichen.

Die Schnitte verblieben bei 96-99°C für 15min in dem Puffer. Nach Abkühlung auf circa

60°C folgten abermals drei Waschschritte mit PBS (je 5min). Um unspezifische

Bindungen zu verhindern, wurden 80µl Ziegennormalserum (20%) auf jeden Schnitt

aufgetragen. Diese Behandlung erfolgte in einer feuchten Kammer für 20min. Im

Anschluss wurden jeweils 80µl des Antikörpers IRS1(sc-559) (siehe Tab.8), in einer

Verdünnung von 1:500 (in PBS/BSA), auf die Plazentom-Schnitte und 1:250 auf die

Uterus-Schnitte aufgetragen und in der feuchten Kammer bei 4°C über Nacht inkubiert.

Nach etwa 12h wurde überschüssiger, nicht gebundener Antikörper mit drei

Waschschritten PBS1x (je 5min) entfernt. Der Zweit-Antikörper (Envision rabbit,

DAKO) wurde dann aufgetragen und konnte 30min einwirken. Abermals folgten drei

Waschschritte mit PBS (je 5min). Im nun folgenden Schritt wurde DAB auf die Proben

- 51 -

aufgetragen. Dieses wurde durch die an den Zweitantikörper gebundene Peroxidase

reduziert und es erfolgte im Fall eines positiven Nachweises eine braune Farbreaktion.

Es folgte wieder ein Waschschritt in PBS (5min) und im Anschluss wurden die Proben

10min unter fließendem Wasser gespült. Zur besseren Differenzierung während des

Auswertens erfolgte eine Gegenfärbung mit Hämalaun nach Delafield (1sec) und

wiederum 10-minütiges Spülen unter fließendem Leitungswasser, um eventuelle

Farbreste zu entfernen.

Zur Dehydrierung wurden die Proben mit einer Alkoholreihe behandelt:

Ethanol (70%) 2min

Ethanol (80%) 2min

absoluter Ethanol 2min

Isopropanol 2min

Xylol 2x5min

Abschließend wurden die einzelnen Schnitte mit Eukitt eingedeckelt. Bis zur

Auswertung wurden die Schnitte in lichtdichten Boxen bei Raumtemperatur

aufbewahrt.

Die Behandlung der Schnitte für eine Färbung mit IRS2 (sc1555) (siehe Tab. 8) wich

in folgenden Schritten ab: Das Blockieren unspezifischer Bindungen erfolgte mit

Pferdeserum (1:5) und es wurde ein Zwei-Schrittpolymersystem verwendet (DCS

Supervision, 2-Schrittpolymersystem, Hamburg). Hier wurde nach dem Abwaschen

des Erst-Antikörpers ein Polymer-Enhancer auf die Schnitte aufgetragen, der für 20min

einwirken musste. Im nächsten Schritt wurde ein HRP-Polymer für 30min auf die

Schnitte gegeben. Nach diesen vorbereitenden Arbeitsschritten erfolgte die Zugabe

von DAB (DCS) für 10min. Zwischen den einzelnen Behandlungen erfolgte jeweils

dreimaliges waschen mit PBS.

Zum Ausschluss unspezifischer Bindungen wurden Negativkontrollen mitgeführt, bei

denen der Primärantikörper durch PBS ersetzt wurde, ansonsten erfuhren sie die

- 52 -

gleiche Behandlung. Als Isotypenkontrolle dienten IgG aus Ziegen-, bzw.

Pferdeserum.

Pro Versuchstier und Gewebe wurden jeweils zwei Schnitte von unterschiedlichen

Proben untersucht.

Die Auswertung wurde nach folgenden Kriterien vorgenommen:

- negativ, keine Anfärbung

(+) schwach positive Reaktion

+ positive Reaktion

++ sehr stark positive Reaktion

Var. variable Reaktion

Tab. 8: In der Immunhistochemie verwendete Primärantikörper

Antikörper Spezifität Konzentration

(µg/ml) Detektionssystem Herkunft

IRS1 Kaninchen IgG,

polyklonal

0,4 Plazentom

0,8 Uterus

DAKO Envision+ System/rabbit, HRP

Santa Cruz

(sc-559)

IRS2 Ziege IgG, monoklonal

0,4 SuperVision2 two-

step polymer system anti-goat

Santa Cruz

(sc-1555)

.

- 53 -

4. Ergebnisse

4.1. Ergebnisse der in vitro Versuche

4.1.1. Ergebnisse der RT-PCR

Mittels konventioneller RT-PCR und anschließender Gelelektrophoerese wurde die

Expression der Liganden IGF1 und IGF2, der Rezeptoren IGF1R und IGF2R, der

IGFBPs 1-7 und der Adaptermoleküle IRS1-4 in den verwendeten Zelllinien

untersucht. Es wurden für jede cDNA eine Positivkontrolle mit RPS9 durchgeführt und

zur Kontrolle der Primer jeweils eine Negativkontrolle.

Die Expression spezifischer mRNA der untersuchten Wachstumsfaktoren und der

dazugehörigen Rezeptoren konnte bei allen untersuchten Zellarten (BCEC, F3,

Fibroblasten, BUVEC) nachgewiesen werden (Abb. 5). Bis auf das IGFBP 3, welches

bei F3 und Fibroblasten nicht gezeigt werden konnte, wurden die IGF-

Bindungsproteine 1-7 bei den untersuchten Zelllinien ebenfalls nachgewiesen (Abb.

4). BCEC und F3 exprimierten jeweils nur IRS1, aber nicht IRS2, 3 oder 4, während

Fibroblasten spezifische mRNA für IRS1 und IRS3 enthielten, nicht aber für IRS2 und

IRS4 (Abb. 6). Allerdings können für die Primer IRS2 und IRS4 falsch negative

Ergebnisse, aufgrund nicht durchgeführter Positivproben, mit der durchgeführten

Methode nicht ausgeschlossen werden. Anhand der Bandenhöhe und der erwarteten

Produktgröße (siehe Tab. 4) konnten die Ergebnisse verifiziert werden. Pro Gen war

jeweils eine spezifische Bande zu sehen.

- 54 -

F3 Zellen Fib roblasten

M BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 BP7 BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 BP7 NK RPS9

BCEC BUVEC

M BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 BP7 BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 NK RPS9 BP6 BP7

Abb. 4: Expression von IGFBPs bei F3/Fibroblasten u nd BCEC/BUVEC Qualitativer Nachweis von IGFBP1-7 (BP1-7) bei F3 Zellen/Fibroblasten, BCEC und darauf folgend BUVEC auf mRNA-Ebene mittels konventioneller RT-PCR und daran anschließender Agarose-Gelelektrophorese. M=100bp DNA-Marker, NK=Negativkontrolle, RPS9=Ribosomales Protein S9, Positivkontrolle.

- 55 -

F3 Zellen Fibroblasten

M IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R NK RPS9

BCEC BUVEC

M IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R NK RPS9

Abb. 5: Expression von IGF1, IGF2, IGF1R und IGF2R bei F3/Fibroblasten und BCEC/BUVEC Qualitativer Nachweis von IGF1, IGF2 sowie der IGF1 und IGF2 Rezeptoren (IGF1R/IGF2R) bei F3 Zellen/Fibroblasten, BCEC und darauf folgend BUVEC auf mRNA-Ebene mittels konventioneller RT-PCR und daran anschließender Agarose-Gelelektrophorese. M=100bp DNA-Marker, NK=Negativkontrolle, RPS9=Ribosomales Protein S9, Positivkontrolle.

- 56 -

F3 Zellen BCEC

M IRS1 IRS2 IRS3 IRS4 IRS1 IRS2 IRS3 IRS4 NK RPS9 M

Fibroblasten

M IRS1 IRS2 IRS3 IRS4 NK RPS9 M

Abb. 6: Expression von IRS1, 2, 3 und 4 bei F3, BCE C und Fibroblasten Qualitativer Nachweis von IRS1-4 bei F3 Zellen, BCEC und Fibroblasten auf mRNA-Ebene mittels konventioneller RT-PCR und daran anschließender Agarose-Gelelektrophorese. M=100bp DNA-Marker, NK=Negativkontrolle, RPS9=Ribosomales Protein S9, Positivkontrolle.

4.1.2. Untersuchung des Einflusses von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF und

IGF2+EGF auf die Proliferation plazentarer Zellen in vitro

Da die Proliferation für die Funktion der Plazenta eine wichtige Rolle einnimmt, wurde

diese mittels MTT-Assays untersucht. Es erfolgte eine Stimulation der BCEC, F3 und

Fibroblasten mit den Liganden des IGF-Systems, EGF sowie Kombinationen von

IGF1+EGF und IGF2+EGF.

- 57 -

Im Folgenden sind die Ergebnisse der Proliferations-Assays dargestellt. Hierbei wurde

die Proliferation stimulierter Proben in Bezug zur Proliferation der unstimulierten

Proben (BCEC, F3, Fibroblasten: SFM) gesetzt. Alle Werte sind in Prozent angegeben

und die Proliferation der unstimulierten Kontrolle entspricht 100%. Die Konzentration

der Stimulantien wurde in Vorversuchen ermittelt, genauso wie die Stimulationsdauer,

bei der sich 48h als optimal erwies. Da bei den BUVEC schon in den Vorversuchen

keine Steigerungen der Proliferation nach den verschiedenen Stimulationen zu

verzeichnen waren, wurden sie von den Endversuchen ausgeschlossen und sind im

Folgenden nicht weiter aufgeführt.

- 58 -

4.1.2.1. Proliferation nach Stimulation mit IGFs un d EGF bei BCEC

Die Stimulation mit IGF1 führte bei BCEC zu einer signifikanten Steigerung der

Proliferation (151%), während die Applikation von IGF2 oder EGF keinen signifikanten

Einfluss hatte. Die Proliferation, verursacht durch die Kombination IGF1+EGF, war

vergleichbar zur alleinigen Stimulation mit IGF1 (177%). Die Stimulation mit einer

Kombination aus IGF2+EGF verursachte einen signifikanten Anstieg der Proliferation

(190%), obwohl sowohl IGF2 (114%) als auch EGF (121%) alleine keine signifikanten

Steigerungen erzielten. Die Wachstumskontrolle mit FSM erzielte ebenfalls eine

signifikante Steigerung der Proliferation bei den BCEC (siehe Abb. 7.).

Abb. 7: Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IG F2 und EGF bei BCEC Signifikante Steigerungen im Vergleich zu SF wurden durch IGF1, IGF1+EGF und IGF2+EGF erreicht. Wurde IGF1 oder IGF2 mit EGF kombiniert, konnte eine signifikante Steigerung verglichen mit EGF erzielt werden. Genauso verhielt es sich mit IGF2 und IGF2+EGF. *, statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) der einzelnen Behandlungen im Vergleich zur Kultur in serumfreiem Medium (SF); # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.

BCEC

0

50

100

150

200

250

FSM SF SF+IGF1100ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF250ng/ml

SF+IGF2+EGF

Pro

lifer

atio

n (%

)

*

*

**

*

*

*

BCEC

0

50

100

150

200

250

FSM SF SF+IGF1100ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF250ng/ml

SF+IGF2+EGF

Pro

lifer

atio

n (%

)

*

*

**

BCEC

0

50

100

150

200

250

FSM SF SF+IGF1100ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF250ng/ml

SF+IGF2+EGF

Pro

lifer

atio

n (%

)

*

*

**

*

*

*

#

# #

- 59 -

4.1.2.2. Proliferation nach Stimulation mit IGFs un d EGF bei F3 Zellen

Bei den F3 Zellen wurde durch die Stimulation mit IGF1 (139%), IGF2 (135%) und

EGF (182%) jeweils eine signifikante Steigerung der Proliferation erreicht, wobei die

durch EGF verursachte Erhöhung am deutlichsten war. Die Kombination von

IGF1+EGF (191%) resultierte in einer Steigerung, welche vergleichbar mit der nach

Applikation von EGF alleine, aber signifikant höher als nach IGF1-Applikation, war.

Hervorzuheben ist die Kombination von IGF2+EGF (148%), diese verursachte eine

Steigerung der Proliferation, die einerseits signifikant schwächer war, als die durch

EGF verursachte Erhöhung und andererseits erheblich höher, als nach Stimulation mit

IGF2. Auch durch FSM wurde ein signifikanter Anstieg der Proliferation verzeichnet

(siehe Abb. 8).

Abb. 8: Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IG F2 und EGF bei F3 Zellen Alle durchgeführten Stimulationen führten bei F3 Zellen zu signifikanten,* (p<0,05), Steigerungen gegenüber SF. Durch Kombination von IGF1+EGF konnte eine signifikant höhere Proliferation als bei alleiniger Gabe von IGF1 erreicht werden. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.

F3

0

50

100

150

200

250

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF 1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Pro

lifer

atio

n (%

) **

**

**

F3

0

50

100

150

200

250

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF 1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Pro

lifer

atio

n (%

) **

**

**

*

*

*# #

#

- 60 -

4.1.2.3. Proliferation nach Stimulation mit IGFs un d EGF bei Fibroblasten

Ein signifikanter Anstieg der Proliferation bei Fibroblasten konnte durch Stimulation mit

IGF1 (172%) und IGF2 (141%), aber nicht EGF (109%) erreicht werden. Durch die

Kombination von IGF1+EGF (187%) konnte ein signifikanter Anstieg der Proliferation

beobachtet werden, der sich auch deutlich von der Stimulation mit den einzelnen

Wachstumsfaktoren abhob. Die Stimulation mit IGF2+EGF (147%) führte hingegen zu

einem ähnlichen Anstieg der Proliferation wie bei einer Stimulation mit IGF2 allein, war

allerdings signifikant höher als bei Stimulation mit EGF. FSM erreichte den höchsten

signifikanten Anstieg der Proliferation bei den Fibroblasten (siehe Abb. 9).

Abb. 9: Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IG F2 und EGF bei Fibroblasten Signifikante,* (p<0,05), Steigerungen der Proliferation gegenüber der Kultur in serumfreien Medium wurden durch Stimulation allen Faktoren außer EGF erzielt. Die Kombination von IGF1+EGF führte zu einer signifikant höheren Proliferation als die Stimulation mit EGF oder IGF1 alleine. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.

Fibroblasten

0

50

100

150

200

250

300

350

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2 100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Pro

lifer

atio

n (%

)

*

**

* *

Fibroblasten

0

50

100

150

200

250

300

350

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2 100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Pro

lifer

atio

n (%

)

*

**

* *

*

*

*

#

#

#

- 61 -

4.1.3. Einfluss von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGf und I GF2+EGF auf die Motilität

plazentarer Zellen in vitro

Es werden die Auswirkungen der unterschiedlichen Stimulationen auf die Motilität der

untersuchten Zellen dargestellt, welche mit dem Live Cell Imaging ermittelt wurden.

Die Stimulationsdauer betrug 18h. Dabei wurden stimulierte Proben in Bezug zu

unstimulierten Proben gesetzt (SFM) und Werte in Prozent angegeben. Die Motilität

der unstimulierten Zellen entspricht dabei 100%.

- 62 -

4.1.3.1. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei BCEC

Die Stimulation mit IGF1 (124%), IGF1+EGF (137%), EGF (130%), IGF2 (123%) und

IGF2+EGF (130%) führte zu einem signifikanten Anstieg der Motilität bei BCEC. Durch

die kombinierte Stimulation mit IGF1+EGF wurde ein leichter, aber nicht signifikanter

Anstieg der Motilität verzeichnet, wo hingegen die Kombination von IGF2+EGF keinen

deutlichen Anstieg, verglichen mit den einzelnen Faktoren, bewirkte (siehe Abb. 10).

Abb. 10: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, I GF2 und EGF bei BCEC Die Stimulation mit allen untersuchten Wachstumsfaktoren führte zu einer signifikanten,* (p<0,05), Erhöhung der Motilität gegenüber der Kultur in serumfreiem Medium.

BCEC

0

20

40

60

80

100

120

140

160

FSM SF SF+IGF1100ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF250ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

**

**

*

BCEC

0

20

40

60

80

100

120

140

160

FSM SF SF+IGF1100ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF250ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

**

**

*

- 63 -

4.1.3.2. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei F3 Zellen

Bei den F3 Zellen wurde nach Stimulation mit IGF1 (135%), IGF1+EGF (150%),

IGF2+EGF (181%) und EGF (157%) eine signifikante Steigerung der Motilität

beobachtet. Durch die Stimulation mit IGF1+EGF konnte eine signifikante Steigerung

der Motilität, im Vergleich zur alleinigen Stimulation mit IGF1 erreicht werden. Genauso

führte eine Kombination von IGF2+EGF bei den F3 mit einem synergistischen Effekt

zu einer signifikanten Steigerung der Motilität. Auch mit dem FSM konnte ein

signifikanter Anstieg der Motilität beobachtet werden (siehe Abb. 11).

Abb. 11: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, I GF2 und EGF bei F3 Zellen Durch die Kombination von IGF2 mit EGF konnten signifikante, * (p<0,05), Steigerungen der Proliferation im Bezug zur alleinigen Stimulation mit IGF2 oder EGF erreicht werden. Auch die Kombination von IGF1+EGF brachte eine signifikant höhere Motilität als IGF alleine. Alle untersuchten Wachstumsfaktoren, bis auf IGF2, erhöhten signifikant die Proliferation verglichen mit SF. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.

F3

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

**

* *

*

F3

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

**

* *

*

*

*

*#

#

#

- 64 -

4.1.3.3. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei Fibroblasten

Die Applikation von IGF1 (117%) und IGF2 (117%) führte bei den Fibroblasten zu einer

signifikanten Steigerung der Motilität. Wurden IGF1+EGF (98%) kombiniert, konnte

kein Anstieg der Motilität verzeichnet werden. Der Einfluss von EGF schien sich in

diesem Fall durchzusetzen und es wurden die antagonistischen Effekte auf

Fibroblasten sichtbar. EGF (97%) alleine erreichte keine Steigerung der Motilität bei

Fibroblasten. Auch bei IGF2+EGF (112%) konnten keine synergistischen Effekte

beobachtet werden, der Anstieg der Motilität war vergleichbar mit dem Anstieg der

Motilität nach Stimulation mit IGF2. FSM verzeichnete ebenfalls einen signifikanten

Anstieg der Motilität (siehe Abb. 12).

Abb. 12: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, I GF2 und EGF bei Fibroblasten Durch Stimulation mit IGF1, IGF2 und IGF2+EGF wurden signifikante, * (p<0,05), Steigerungen der Proliferation gegenüber Stimulation mit SF nachgewiesen. IGF1+EGF und EGF hatten keinen positiven Einfluss auf die Proliferation. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.

Fibroblasten

0

20

40

60

80

100

120

140

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

* * * *

Fibroblasten

0

20

40

60

80

100

120

140

FSM SF SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

* * * *

* *# #

- 65 -

4.1.3.4. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei BUVEC

Die Stimulation mit EBM (121%), EGF (109%) und IGF2+EGF (116%) führte zu einer

signifikanten Steigerung der Motilität bei den BUVEC. Durch alle anderen Stimulanzien

konnten keine Steigerungen erreicht werden (siehe Abb. 13).

Abb. 13.: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei BUVEC Durch Stimulation mit EBM, IGF2+EGF und EGF konnten signifikante, * (p<0,05), Erhöhungen der Motilität im Vergleich mit SF festgestellt werden.

BUVEC

0

20

40

60

80

100

120

140

EBM EBM1% SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

BUVEC

0

20

40

60

80

100

120

140

EBM EBM1% SF+IGF150ng/ml

SF+IGF1+EGF

SF+EGF20ng/ml

SF+IGF2100ng/ml

SF+IGF2+EGF

Zel

lmot

ilitä

t(%

)

***

- 66 -

4.1.4. Aktivierung verschiedener Signalwege in plaz entaren Zellen in vitro

In den Versuchen zu Proliferation und Motilität (siehe Kapitel 4.1.2. und 4.1.3.) wurde

deutlich, dass durch verschiedene Wachstumsfaktoren und deren Kombinationen

jeweils Veränderungen erreicht werden konnten. Um die möglichen intrazellulären

Signalwege genauer einzugrenzen, die nach Stimulation für Steigerungen des

Zellwachstums und Zellmotilität verantwortlich sind, wurden mittels Western Blot der

MAP Kinase 42/44 (MAPK 42/44), Akt Kinase (Akt) und p38-MAP Kinase (p38 MAPK)

Signalweg untersucht. Die BUVEC wurden aus bereits genannten Gründen

ausgeschlossen (Kapitel 4.1.2.). Jeder Versuch wurde dreimal (BCEC und F3-Zellen)

bzw. zweimal (Fibroblasten) durchgeführt. Zur Normierung der Ergebnisse und

internen Kontrolle erfolgte die Redetektion mit ß-Aktin.

4.1.4.1. Aktivierung des MAP Kinase 42/44, Akt-Kina se und p38-MAP Kinase

Signalwegs bei BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten

Bei den BCEC konnte weder durch Stimulation mit IGF1 noch durch die Applikation

von IGF2 eine Aktivierung der untersuchten Signalwege beobachtet werden. EGF

allerdings verursachte eine Aktivierung aller drei Signalwege. Wurde EGF dann mit

IGF1 oder IGF2 kombiniert, wurden in beiden Fällen MAPK 42/44 und p38 MAPK

aktiviert, allerdings konnte keine Veränderung, verglichen mit EGF alleine, dargestellt

werden. Die durch EGF induzierte Aktivierung von Akt wurde durch Kostimulation mit

IGF1 und IGF2 aufgehoben (siehe Abb. 14 und 15).

Bei Stimulation von F3 mit allen untersuchten Faktoren konnte eine Aktivierung von

MAPK 42/44 und Akt beobachtet werden. Eine Aktivierung von p38 MAPK konnte

allerdings nur durch IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF erzielt werden (siehe Abb.16

und 17).

Bei den Fibroblasten konnte durch alle durchgeführten Stimulationen eine Aktivierung

von MAPK 42/44, Akt und p38 MAPK festgestellt werden (siehe Abb. 18 und 19). In

- 67 -

Tab. 9 ist eine Zusammenfassung der Ergebnisse des Western Blotting bei BCEC, F3

und Fibroblasten für alle untersuchten Signalwege dargestellt.

- 68 -

4.1.4.2. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei BCEC

Abb. 14: Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und p38 MA PK bei BCEC Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase, sowie die Ladungskontrolle mit Aktin (42kDa), in BCEC. Abb. 14 zeigt die Banden, welche durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht wurden, MAPK 42/44 (42/44kDa), Akt (60kDa) und p38 MAPK (43kDa). Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min.

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

- 69 -

Abb. 15: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei BCEC Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase in BCEC. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. In Abb. 15 sind die arithmetischen Mittelwerte aufgetragen ±SEM der densitometrisch ermittelten Werte in Bezug zur unstimulierten Kontrolle (0min).

BCEC

-200

0

200

400

600

800

1000

IGF17.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF27.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

(%

)

MAPK 42

MAPK 44

-100-50

0

50

100

150200

250

300

350400450

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF7.5min

IGF1+EGF15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

Akt

(%)

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF15min

0min

Akt

ivie

rung

der

p38

MA

PK

(%

)

BCEC

-200

0

200

400

600

800

1000

IGF17.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF27.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

(%

)

BCEC

-200

0

200

400

600

800

1000

IGF17.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF27.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

(%

)

MAPK 42

MAPK 44

MAPK 42

MAPK 44

-100-50

0

50

100

150200

250

300

350400450

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF7.5min

IGF1+EGF15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

Akt

(%)

-100-50

0

50

100

150200

250

300

350400450

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF7.5min

IGF1+EGF15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

Akt

(%)

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF15min

0min

Akt

ivie

rung

der

p38

MA

PK

(%

)

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF15min

0min

Akt

ivie

rung

der

p38

MA

PK

(%

)

- 70 -

4.1.4.3. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei F3 Zellen

Abb. 16: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt und p38 MA PK bei F3 Zellen Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase, sowie die Ladungskontrolle mit Aktin (42kDa), bei F3 Zellen. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. Abb. 16 zeigt die Banden, welche durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht wurden, MAPK 42/44 (42/44kDa), Akt (60kDa) und p38 MAPK (43kDa).

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

- 71 -

Abb. 17: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei F3 Zellen Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase bei F3 Zellen. In Abb. 17 sind die arithmetischen Mittelwerte aufgetragen ±SEM der densitometrisch ermittelten Werte in Bezug zur unstimulierten Kontrolle (0min). Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min.

MAPK42

MAPK44

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

Akt

(%

)

0

100

200

300

400

500

600

700

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

p38

MA

PK

(%

)

0%

20000%

40000%

60000%

80000%

100000%

120000%

140000%

0%

200%

400%

600%

800%

1000%

1200%

1400%

IGFI 7.5minIGFI 15minIGFI+EGF 7.5minIGFI+Egf 15minEGF 7.5minEGF 15minIGFII 7.5minIGFII 15minIGFII+Egf 7.5minIGFII+EGF 15min0min

F3-Zellen

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

42

(%)

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

44

(%)

- 72 -

4.1.4.4. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei Fibroblasten

Abb. 18: Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und p38MAP K bei Fibroblasten Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase, sowie die Ladungskontrolle mit Aktin (42kDa), bei Fibroblasten. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. Abb 18 zeigt die Banden, welche durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht wurden, MAPK 42/44 (42/44kDa), Akt (60kDa) und p38 MAPK (43kDa).

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min

- 73 -

Abb. 19: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei Fibroblasten Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase bei Fibroblasten. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. In Abb.19 sind die arithmetischen Mittelwerte aufgetragen ±SEM der densitometrisch ermittelten Werte in Bezug zur unstimulierten Kontrolle (0min).

Fibroblasten

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

(%

)

MAPK42MAPK44

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

Akt

(%)

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

-2000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

p38

MA

PK

(%

)

Fibroblasten

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

(%

)

Fibroblasten

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

MA

PK

(%

)

MAPK42MAPK44MAPK42MAPK44MAPK42MAPK44

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

Akt

(%)

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

Akt

(%)

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

-2000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

p38

MA

PK

(%

)

-2000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

IGF1 7.5min

IGF1 15min

IGF1+EGF 7.5min

IGF1+EGF 15min

EGF 7.5min

EGF 15min

IGF2 7.5min

IGF2 15min

IGF2+EGF 7.5min

IGF2+EGF 15min

0min

Akt

ivie

rung

der

p38

MA

PK

(%

)

- 74 -

Tab. 9: Übersicht über die Aktivierung der verschiedenen Signalwege bei F3 Zellen,

Fibroblasten und BCEC

- keine Aktivierung, + Aktivierung nach 7.5min und 15min, -/+ Aktivierung nach 15min aber nicht 7.5min, +/- Aktivierung nach 7.5min aber nicht 15min. Orange Felder: antagonistische Wirkung, lila Felder: synergistische Wirkung der Stimulantien.

- 75 -

4.2. Ergebnisse der in vivo Studien

4.2.1. Morphologie von interplazentomarem Gewebe un d Plazentom

Es konnten deutliche Unterschiede der Morphologie zwischen den Proben der

präpartalen Kaiserschnittgruppe (Gruppe 1) und den Plazentomen der postpartalen,

mit LPS behandelten Gruppe 2 ausgemacht werden. Ähnliches beschreiben Laue

(2014) und Lütkehus (2012), deren Untersuchungen mit dem gleichen Probenmaterial

durchgeführt wurden.

Bei den während des Kaiserschnitts entnommenen Proben konnte eine gute

Unterscheidung der einzelnen Zelltypen vorgenommen werden, sowohl das

mütterliche Gewebe, als auch der fetale Anteil waren noch vollständig erhalten und

intakt. Die Proben aus der postpartalen Gruppe, welche drei Stunden nach LPS-

Instillation genommen wurden, wiesen einen größeren Zusammenhangsverlust

zwischen maternalem und fetalem Anteil des Plazentoms auf und das Karunkelepithel

war deutlich abgeflacht. Erwartungsgemäß war auch die Anzahl der TGC geringer.

Nach der LPS-Instillation genommene Proben zeigten insgesamt eine hohe

Gewebsdegradation mit viel Zelldetritus und wiesen außerdem einen erhöhten Anteil

an Immunzellen auf. Diese wiesen kein einheitliches Erscheinungsbild auf, wurden

jedoch nicht genauer charakterisiert. Anzutreffen waren sie sowohl in den Bereichen

der Karunkel als auch in den Bezirken mit Resten der Kotyledonen. Durch das

morphologische Erscheinungsbild der Plazentome nach LPS war im größten Anteil der

Proben keine Unterscheidung der verschiedenen Bestandteile (mononukleäre

Trophoblasten, TGC, fetales Mesenchym, fetale Blutgefäße) des fetalen

Kompartimentes möglich. Daher bezieht sich die weitere Beschreibung von Gruppe 2

hauptsächlich auf die Verhältnisse im Bereich der Karunkel.

Das interplazentomare Gewebe zeigte nach LPS-Instillation eine verstärkte

Einwanderung von Immunzellen sowie eine Ödematisierung.

Die Immunzellen waren vor allen Dingen im Stratum compactum bzw. reticulare zu

finden. Teilweise waren sie aber auch in den Lumina der Drüsen und den Blutgefäßen

- 76 -

anzutreffen. Das luminale Epithel der Proben war überwiegend hochprismatisch,

teilweise jedoch abgeflacht oder fehlend.

4.2.2. Immunhistochemie

Wie bereits in der Literaturübersicht beschrieben, werden intrazelluläre Signale nach

Aktivierung durch IGF1 und IGF2 durch verschiedene Signalmoleküle weitergeleitet

und verarbeitet. Dazu zählen auch IRS-Moleküle. Da IRS1 und IRS2 hierbei die

wichtigste Rolle zu spielen scheinen, wurde mittels Immunhistochemie untersucht, ob

diese auch beim Rind in Plazenta und Uterus vorkommen und in welchen

Zellpopulationen sie lokalisiert sind.

- 77 -

4.2.2.1. IRS1

4.2.2.1.1. IRS1-Expression im Plazentom

Überwiegend glichen sich die Reaktionen in den Proben der präpartalen Gruppe und

postpartalen Gruppe. Weiterhin konnten auch keine Unterschiede in der Reaktion

zwischen den Proben vor und nach LPS-Instillation, oder zwischen der IGF-high- und

IGF-low-Gruppe festgestellt werden.

Im Plazentom war das stärkste Signal in den mononukleären Trophoblasten zu sehen,

die eine positive bis sehr stark positive Reaktion zeigten. Das Zytoplasma der TGC

war negativ bis schwach positiv angefärbt und auch die Zellkerne variierten zwischen

negativ bis schwach positiv. Das fetale Mesenchym zeigte weitgehend keine

Expression von IRS1, vereinzelte Kerne waren jedoch positiv.

In den Chorionzotten zeigten die Arterien häufig eine Expression im Endothel, jedoch

nur selten in den Gefäßwänden, während die Venen komplett negativ waren. Die

Reaktion der Immunzellen fiel variabel aus, von negativ bis hin zu sehr stark positiv.

Im Epithel der karunkulären Kryten wechselten sich schwach positiv angefärbte

Bereiche mit negativen Regionen ab. Allerdings wiesen einige Proben auch

ausschließlich negative Reaktionen im Epithel auf. Genauso verhielt es sich im

maternalen Stroma und im Karunkelstiel. Die Arterien waren schwach positiv bis

positiv, während die Venen keine Anfärbung aufwiesen. Die Gefäßwände waren im

Großteil negativ, vereinzelt aber auch schwach positiv. Die freien Zellen des

Immunsystems waren auch hier variabel angefärbt (siehe Abb. 20-21).

- 78 -

Abb. 20: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 in Plazentomen der präpartalen Gruppe

Die stärksten Signale waren in den einkernigen Trophoblastzellen (T) vorhanden, während die TGC überwiegend negativ waren (rote Kästchen). Das Karunkelepithel (KE) stellte sich negativ (C) bis schwach positiv (A, B, D) dar. Im maternalen Stroma (MS) und fetalen Mesenchym (FM) konnte keine IRS1-Expression nachgewiesen werden. E: Arterie (Ar) mit schwach positiver Intima und negativer Media sowie komplett negative Vene (V) in der Chorionplatte (CP). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge beträgt in A, E und F 100µm und in B, C und D 50µm.

- 79 -

Abb. 21: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 in Plazentomen der postpartalen Gruppe Vor LPS Instillation (A, B) konnte die stärkste Expression in einkernigen Trophoblastzellen (T) beobachtet werden, während das Karunkelepithel (KE) nur eine schwache Immunreaktion zeigte. Außerdem waren die Kerne der TGC (rote Kästchen) leicht gefärbt. Das fetale Mesenchym (FM) und das maternale Stroma (MS) waren negativ. Nach LPS-Instillation (C, D) waren in den zusammen gefallenen Krypten der Karunkel vermehrt Immunzellen und Zelldetritus (gelbe Pfeile) vorzufinden. Das Karunkelepithel war zu dieser Zeit weitgehend negativ. E: Arterien (Ar) mit positiver Intima und positiven Kernen in der Tunica media in der Chorionplatte (CP). F: Negativkontrolle.Die Balkenlänge betrug in A, C, E und F 100µm und in B und D 50µm.

- 80 -

4.2.2.1.2. IRS1-Expression im interplazentomaren Ge webe

Die stärkste positive Reaktion war in den uterinen Drüsen zu sehen. Im luminalen

Epithel konnten bei den Kühen Reaktionen von negativ über schwach positiv bis positiv

beobachtet werden. Allen gemein war eine deutlich positive Anfärbung auf der

apikalen Seite im Bereich der Glykokalix. Das Stratum compactum war weitgehend

negativ, jedoch zeigten sich bei den Proben einiger Tiere positive Bereiche um

Immunzellen herum und in aufgelockerten Zonen. Das Stratum reticulare, sowie das

Myometrium wiesen keine IRS1-Expression auf. Die Tunica interna der Arterien war

positiv angefärbt, während die Tunica media meist negativ war. Die Muskulatur in der

Media zeigte allerdings in einigen Fällen auch eine schwach positive Reaktion. Venen

waren in den meisten Fällen negativ. Auffällig waren wiederum kleinere Gefäße im

Myometrium, die positive Reaktionen aufwiesen. Immunzellen waren auch in diesen

Proben variabel angefärbt (siehe Abb. 22-23).

- 81 -

Abb. 22: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1- Expression im interplazentomaren Gewebe der präpartalen Gruppe Die Färbung des uterinen Epithels (ME) variierte von ausschließlich apikal (A) bis zu einer stark positiven Reaktion in Zytoplasma und der apikalen Zellmembran (B, D). Eine ähnliche Variation war im Stratum compactum (SC) zu beobachten (vergleiche A, B, D ). C, E: Die uterinen Drüsen (UD) wiesen das stärkste Signal auf, während das Stratum reticulare (SR) negativ war. Endothelien und glatte Muskelzellen von Venen (V) im Stratum compactum (SC) aber auch im Stratum reticulare (SR) zeigten meist eine positive Reaktion (D, E). In den Lumina der uterinen Drüsen waren häufig IRS-1 positive Immunzellen zu finden (gelbe Pfeile). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge in B, C und F betrug 100µm in A, D und E 50µm.

- 82 -

Abb. 23: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 im interplazentomaren Gewebe der postpartalen Gruppe Die Färbung des uterinen Epithels (ME) variierte von ausschließlich apikal (A) bis zu einer stark positiven Reaktion in Zytoplasma und der apikalen Zellmembran (B). Die stärkste Reaktion zeigten die uterinen Drüsen (UD) im negativen Stratum reticulare (SR) (C,D). Es waren viele eingewanderte Immunzellen zu erkennen (gelbe Pfeile), die vor allem im Stratum compactum, Stratum reticulare und in den Drüsen lokalisiert waren (A, B, C ). Die Arterien (Ar) wiesen eine positive Intima und schwach positive Media auf, die Venen (V) waren schwach positiv (E). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in F 50µm, in A, B, C, D und E 100µm.

- 83 -

4.2.2.2. IRS2

4.2.2.2.1. IRS2-Expression im Plazentom

Überwiegend glichen sich die Reaktionen in den Proben der präpartalen Gruppe und

postpartalen Gruppe, wie auch bei der Untersuchung von IRS1. Weiterhin konnten

auch keine Unterschiede in der Reaktion zwischen den Proben vor und nach LPS-

Instillation, oder zwischen der IGF-high- und IGF-low-Gruppe festgestellt werden.

Im Plazentom konnte die stärkste IRS2-Expression im fetalen Mesenchym festgestellt

werden, in einigen Fällen auch in den mononukleären Trophoblasten. In beiden Fällen

schwankte die Intensität der Färbung zwischen positiv bis stark positiv.

Das Karunkelepithel war negativ bis schwach positiv angefärbt, während das

maternale Stroma und der Karunkelstiel negativ waren. Das Endothel und die

Gefäßwand der Arterien in den maternalen Anteilen waren negativ bis schwach positiv.

Die Venen wiesen eine negative Reaktion auf. Die TGC wiesen eine negative bis

schwach positive Reaktion auf. Eine IRS2-Expression konnte in der Chorionplatte nicht

festgestellt werden. Die Blutgefäße in den Zotten der Kotyledone verhielten sich

genauso wie in der Karunkel. Bei den Immunzellen konnten variable Reaktionen

nachgewiesen werden (siehe Abb. 24-25).

- 84 -

Abb. 24: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im Plazentom der präpartalen Gruppe

Die stärkste Expression von IRS2 war im fetalen Mesenchym (FM) festzustellen, auch die mononukleären Trophoblastzellen (T) wiesen eine positive Anfärbung auf (A, B, C, D ), während sich das Karunkelepithel (KE) negativ (A, B ) bis schwach positiv darstellte (C, D). Im maternalen Stroma (MS) und in den TGC (rote Kästchen) war ebenfalls keine Färbung für IRS2 auszumachen (A, B, C, D ). In der Arterie (Ar) der Chorionplatte (CP) konnte eine positive Anfärbung der Intima erkannt werden. Gelber Pfeil, Zelldetritus. (E). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A, E und F 100µm und in B,C und D 50µm.

- 85 -

Abb. 25: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im Plazentom der postpartalen Gruppe

Am stärksten angefärbt waren das fetale Mesenchym (FM) und in einigen Fällen die Trophoblastzellen (T) (A, B ). Das maternale Stroma (MS) wies keine IRS2-Expression auf, während das Karunkelepithel eine negative (A, B ) bis schwach positive Reaktion zeigte (C, D). Auch die Färbung der TGC (rote Kästchen) variierte zwischen negativ und schwach positiv (A, B ). Nach LPS-Instillation waren in der Karunkel vermehrt Zelldetritus und beginnende Gewebsdegeneration festzustellen (C, D). E: In der Chorionplatte (CP) zeigten Arterien eine schwach positive Tunica media (Ar), während Venen (V) negativ waren. F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A-F 100µm.

- 86 -

4.2.2.2.2. IRS2-Expression im interplazentomaren Ge webe

Die stärkste IRS2-Expression wurde in den Zellen der uterinen Drüsen festgestellt, die

eine positive bis sehr stark positive Reaktion zeigten. Im Gegensatz dazu wurden im

luminalen Epithel variable Reaktionen von selten negativ, über schwach positiv bis hin

zu positiv beobachtet. Das Stratum compactum wies unterschiedlich gefärbte Bereiche

auf, die zwischen negativ und positiv schwankten. Dabei fiel auf, dass einzelne

Fibrozyten um Immunzellen deutlich positiv angefärbt waren. Das Stratum reticulare

war in den allermeisten Fällen negativ, während in Ausnahmen eine positive Reaktion

des Sratum reticulare zu beobachten war, die mit einer nicht angefärbten Zone um

Drüsen und Blutgefäße einherging. Das Gefäßendothel war in Arterien schwach positiv

bis positiv, das der Venen negativ. Die Gefäßwände waren überwiegend negativ, bis

auf einige Arterien, die eine schwach positive Reaktion zeigten. Kleinere Gefäße im

Stratum compactum waren meist negativ.

Das Myometrium war in der präpartalen Gruppe negativ bis schwach positiv gefärbt.

Die postpartale Gruppe wies ein ähnliches Erscheinungsbild auf, jedoch waren hier

einige Kerne positiv angefärbt. Im Myometrium fiel außerdem auf, dass das

Bindegewebe zwischen den Muskelzellen häufig positiv war. Auch in diesen Proben

variierte die Anfärbung der freien Zellen des Immunsystems von negativ bis sehr stark

positiv (siehe Abb. 26-27).

- 87 -

Abb. 26: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im interplazentomaren Gewebe der präpartalen Gruppe Die stärkste IRS2-Expression war in den uterinen Drüsen (UD) vorzufinden (D, E). Das maternale Epithel (ME) war unterschiedlich stark angefärbt von positiv (A) bis schwach positiv (B) bis negativ (C), genauso wie das Myometrium (M), das eine negative bis schwach positive Reaktion aufwies (E). Das Stratum compactum (SC) war in den meisten Bereichen ohne IRS2-Expression, jedoch gab es vereinzelt positive Bezirke (A, B, C ) und auch die Venen (V) zeigten eine Expression von IRS2, während das Stratum reticulare (SR) keine Anfärbung aufwies (D, E). In einigen Proben konnten Immunzellen im Stratum compactum (SC) lokalisiert werden (gelbe Pfeile) (B). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A, B, E und F 100µm und in C und D 50µm.

- 88 -

Abb. 27: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im interplazentomaren Gewebe der postpartalen Gruppe Die uterinen Drüsen (UD) wiesen die stärkste Anfärbung auf (C, D). Das luminale Epithel (ME) variierte von schwach positiv (B) bis positiv (A). In einigen Fällen konnte eine positive Reaktion des Stratum reticulare (SR) mit negativen Bezirken (gelbe Pfeile) um Drüsen (UD) und Venen (V) beobachtet werden (D). Das oft positiv reagierende Stratum compactum (SC), beinhaltete in bestimmten Bereichen eingewanderte Immunzellen (gelbe Pfeile) (B). Intima und Media einer Arterie (Ar) im negativen Myometrium (M), sind positiv, während die Membrana elastica interna keine Färbung zeigte (E). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A, B, E und F 100µm und in C und D 50µm.

- 89 -

4.2.2.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse aus den immunhistolo gischen

Untersuchungen an Plazentom und interkarunkulärem G ewebe

Die durchgeführten Untersuchungen ergaben, dass es keine signifikanten

Unterschiede zwischen den Gruppen der präpartalen und postpartalen Proben im

Bezug auf die IRS1- und IRS2-Expression gab. Auch die LPS-Instillation hatte keinen

Einfluss auf die Lokalisation, das Verteilungmuster und die Intensität der

Immunreaktion. Aus diesem Grund wurden die Ergebnisse aller untersuchter Proben

in der Folge ohne weitere Aufgliederung zusammengefasst tabellarisch dargestellt

(siehe Tab. 10 und Tab. 11).

Tab. 10: Übersicht über die Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom-

Zusammenfassung der Ergebnisse der prä- und postpartalen Gruppe

AK: Antikörper, KE: Karunkelepithel, MS: Maternales Stroma, KS: Karunkelstiel, ME-A: Maternales Endothel Arterien, ME-V: Maternales Endothel Venen, MGW: Maternale Gefäßwände, IZ: Immunzellen, T: Trophoblasten, TGC: Trophoblast Giant Cells, FM: Fetales Mesenchym, CP: Chorionplatte, FE-A: Fetales Endothel Arterien, FE-V: Fetales Endothel Venen, FGW: Fetale Gefäßwände, IZ: Immunzellen. Intensität der Anfärbung: - = negativ, keine Anfärbung, (+) = schwach positive Reaktion, + = positive Reaktion, ++ = sehr stark positive Reaktion, var. = variable Reaktion.

var.--+--/(+)+/++var.-/(+)-(+)/+-/(+)-/(+)-/(+)IRS1

Plazentom

var.-/(+)--/(+)-+/++-/(+)+/++var. ---/(+)-/(+)--/(+)IRS2

IZFGWFE-VFE-ACPFMTGCsTIZMGWME-VME-AKSMSKEAK

Placenta fetalisPlacenta maternalis

var.--+--/(+)+/++var.-/(+)-(+)/+-/(+)-/(+)-/(+)IRS1

Plazentom

var.-/(+)--/(+)-+/++-/(+)+/++var. ---/(+)-/(+)--/(+)IRS2

IZFGWFE-VFE-ACPFMTGCsTIZMGWME-VME-AKSMSKEAK

Placenta fetalisPlacenta maternalis

- 90 -

Tab. 11: Übersicht über die Expression von IRS1 und IRS2 im interkarunkulären

Gewebe- Zusammenfassung der Ergebnisse der prä- und postpartalen Gruppe

AK: Antikörper, UE: Uterines Epithel, MS-C: maternales Stroma Stratum compactum, MS-R: maternales Stroma Stratum reticulare, UDE: uterines Drüsenepithel, EN-A: Endothel Arterien, EN-V: Endothel Venen, GW: Gefäßwände, MY: Myometrium, IZ: Immunzellen. Intensität der Anfärbung: - = negativ, keine Anfärbung, (+) = schwach positive Reaktion, + = positive Reaktion, ++ = sehr stark positive Reaktion, var. = variable Reaktion

var. -/(+)--(+)/++/++--/+var.IRS2

var.--/+-++/++--/teilw.+var.IRS1

IZMYGWEN-VEN-AUDEMS-RMS-CUEAK

Interkarunkuläres Gewebe

var. -/(+)--(+)/++/++--/+var.IRS2

var.--/+-++/++--/teilw.+var.IRS1

IZMYGWEN-VEN-AUDEMS-RMS-CUEAK

Interkarunkuläres Gewebe

- 91 -

5. Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurde einerseits untersucht, ob die Komponenten des IGF-

Systems eine positive Auswirkung auf das Proliferations- und Migrationsverhalten

verschiedener boviner Zelllinien aus Uterus und Fetus haben, und andererseits ob

Wechselwirkungen mit EGF vorhanden sind. Begründet ist das Interesse an den

Wirkungen dieser potenten Wachstumsfaktoren durch ihren wissenschaftlich

erwiesenen, positiven Einfluss auf embryonale und maternale Zellen verschiedener

Spezies (Klauwer et al., 1997; Miller et al., 2005; Sibley et al., 2005; Forbes und

Westwood, 2008). Diese Eigenschaft macht sowohl die IGF-Familie, als auch EGF zu

vielversprechenden Kandidaten, um wirtschaftlich bedeutende Erkrankungen des

Rindes, wie die Endometritis und auch die Nachgeburtsverhaltung besser therapieren

und beeinflussen zu können. Auch erfolgte eine Analyse von möglicherweise für die

intrazelluläre Signalvermittlung verantwortlichen Wegen.

Andererseits wurde in prä- und postpartalen Proben von Plazentom und

interkarunkulärem Gewebe die Lokalisation von IRS1 und IRS2 bestimmt. Diese

Adaptorproteine sind eine denkbare Verbindungsstelle zwischen den Komponenten

des IGF-Systems und EGF (Zhang et al., 2000; Lassarre und Ricort, 2003; Karam et

al., 2012). Hierfür wurden Kühe in IGF-high und IGF-low Gruppen eingeteilt und

während eines Kaiserschnitts vor dem errechneten Termin bzw. nach spontan erfolgter

Geburt beprobt.

5.1. Wirkung von IGF1 und EGF

In den durchgeführten Versuchen konnte gezeigt werden, dass durch die Stimulation

von BCEC, F3 und Fibroblasten mit IGF1 eine Steigerung sowohl der Proliferation als

auch der Motilität möglich war. Wurde dieses mit EGF kombiniert, kam es bei den F3-

Zellen und Fibroblasten zu einer weiteren, signifikanten Steigerung der Proliferation,

verglichen mit der Stimulation mit IGF1 alleine. Im Gegensatz zu der alleinigen

- 92 -

Stimulation mit EGF kam es bei BCEC und den Fibroblasten zu einem synergistischen

Effekt bei Kombination von IGF1 und EGF und somit zu einem signifikanten Anstieg

der Proliferation.

Dass EGF und IGF die Proliferation positiv beeinflussen, ist bekannt. IGF führt in vitro

in vielen verschiedenen Zelllinien zu einer gesteigerten Proliferation (Jones und

Clemmons, 1995; Li und Zhuang, 1997; Miller et al., 2005). In früheren Arbeiten

unserer Gruppe wurde bereits festgestellt, dass EGF zu einem Anstieg der

Proliferation von F3-Zellen führt. Diese Wirkung wurde über Ras und die MAPK 42/44

vermittelt (Hambruch et al., 2010). Auch in NPC (Normal Placental Cytotrophoblast

Cell Line) wurde eine Steigerung der Proliferation nach EGF-Applikation festgestellt

(Li und Zhuang, 1997).

Betrachtet man die Motilität, fällt auf, dass bei F3-Zellen durch die Kombination von

IGF1 und EGF eine signifikante Steigerung gegenüber der alleinigen Stimulation mit

IGF1 erreicht werden konnte. Allerdings ist die Steigerung gegenüber der Stimulation

mit EGF allein nicht signifikant verändert. Bei den Fibroblasten kommt es zu einem

gegensätzlichen Effekt, hier führt die Kombination von IGF1+EGF im Vergleich zur

Stimulation mit IGF1 alleine zu einer signifikanten Senkung der Motilität. Dieser scheint

auf einem durch EGF vermittelten antagonistischen Effekt zu beruhen, da EGF auch

in alleiniger Stimulation keine positiven Auswirkungen auf die Motilität der bovinen,

plazentären Fibroblasten hat. Im Gegensatz dazu steigert EGF bei sowohl BCEC als

auch F3-Zellen die Motilität signifikant.

Dies passt zu Studien aus der Humanforschung, in denen ebenfalls eine positive

Wirkung von IGF1 auf das Migrationsverhalten von Trophoblasten festgestellt wurde

(Lacey et al., 2002; Forbes und Westwood, 2008). Auch für EGF sind positive

Auswirkungen auf die Invasion und Trophoblastenmigration bekannt (Bass et al., 1994;

Qiu et al., 2004).

In verschiedenen Arbeiten wird von synergistischen Wirkungen zwischen IGF1 und

EGF berichtet (Qureshi et al., 1997). Dabei variieren die Theorien in der Frage, wie es

zu einer Interaktion zwischen diesen beiden Wachstumsfaktoren kommen kann. Eine

Vermutung ist, dass es durch die Aktivierung des IGF1R durch IGF1 einerseits zu einer

vom EGFR unabhängigen Aktivierung des IRS/PI3K/Akt Signalweges und

- 93 -

andererseits zu einer Transaktivierung des EGFR kommt. Diese Aktivierung wird durch

einen autokrinen Mechanismus verursacht, bei dem HB-EGF mit Hilfe von Matrix-

Metalloproteinasen abgegeben wird und dann zur Phosphorylierung des EGFR führt.

Dies leitet die Aktivierung des Shc/Ras/Raf/ERK1/2 Signalweges mit anschließender

Vermittlung entsprechender intrazellulärer Signale ein (Roudabush et al., 2000).

Andere Forscher kommen wiederum zu dem Ergebnis, dass auch EGF, über die

Modulation von IRS1, den durch IGF1-Aktivierung eingeschlagenen Signalweg

beeinflussen kann. Sie fanden heraus, dass EGF in MCF-7 Zellen (Michigan Cancer

Foundation-7, Brustkrebs-Zelllinie) zu einem Anstieg von IRS1 in der Zelle führt.

Dieser Anstieg war abhängig von der MAPK aber unabhängig von der PI3K.

Gleichzeitig konnte EGF aber nicht der Herunterregulation von IRS1 durch IGF1

entgegenwirken (Lassarre und Ricort, 2003). Im Gegensatz dazu kommen andere

Arbeitsgruppen zu dem Resultat, dass EGF doch den Abbau von IRS1 durch IGF1

verhindern kann und dies sogar in Anwesenheit von IGF1 auszugleichen vermag.

Allerdings fanden diese Experimente an einer anderen Zelllinie, nämlich Epithelzellen

aus der Prostata statt (Zhang et al., 2000). Beiden Studien gemein ist jedoch die

Erkenntnis, dass EGF und IGF antagonistische Wirkungen auf die IRS-Spiegel haben.

In weiteren Versuchen zeigte sich, dass EGF die IGF1 stimulierte

Tyrosinphosphorylierung von IRS1 und nachfolgende Phosphorylierung von der PI3K

verhindern konnte. Dies geschah durch dem IRS1 vorgeschaltete PI3K und PKD1,

welche nach Aktivierung durch den EGFR wahrscheinlich andere Serinreste

phosphorylieren als nach Aktivierung durch den IGF1R (Karam et al., 2012). Auch

Zhang et al. (2000) kamen zu dem Schluss, dass die PI3K für die Abregulation des

IRS1 nach IGF1-Aktivierung entscheidend ist. Putz et. al. fanden heraus, dass durch

eine selektive Blockade des EGFR nicht nur die Wirkung von EGF verhindert wird,

sondern auch die Aktivierung von MAPK und Interaktion mit PKA durch IGF1 (Putz et

al., 1999).

Diese Ergebnisse passen zu Studien, in denen beobachtet wurde, dass eine Depletion

von EGFR zu einer verstärkten Ubiquitinierung und Degradation von IGF1R führt

(Riedemann et al., 2007). Eine weitere Möglichkeit der gegenseitigen Beeinflussung

zwischen IGF1 und EGF besteht darin, dass p57 zwischen den aktivierten ERK bzw.

- 94 -

Akt Signalwegen vermittelt. EGF scheint vor allen Dingen den ERK Signalweg zu

stimulieren, während durch IGF1 eine Aktivierung von Akt hervorgerufen wird. Auf

diese Art und Weise ist eine Wechselwirkung zwischen den beiden

Wachstumsfaktoren denkbar. In der erwähnten Studie hatte dies das Resultat, dass

IGF in den untersuchten Epithelzellen den proliferativen Einfluss von EGF verstärkte

(Worster et al., 2012).

In der singulären in vitro Stimulation von pankreatischen ß-Zellen mit IGF1 oder EGF

wurde festgestellt, dass sowohl IGF1, als auch EGF die gleichen Signalwege

aktivieren, aber die Rekrutierung von IRS-Proteinen, die Stärke und Dauer der

Aktivierung, sowie die Glukose-Unabhängigkeit unterschiedlich sind. Nach Aktivierung

des EGFR kam es nicht zur Signaltransduktion via IRS. Dies hatte zur Folge, dass

EGF im Gegensatz zu IGF1 keine Proliferation verursachen konnte. Der Unterschied

schien maßgeblich durch IRS2 verursacht worden zu sein (Lingohr et al., 2002).

EGF kann aber auch durch die Modulation der IGFBP-Expression in den IGF1-

Signalweg eingreifen. Durch die Erhöhung der Expression der IGFBPs kommt es unter

anderem zu vermehrter Sequestrierung von IGF1 und daraus resultierend zu einer

verminderten Antwort auf die IGF1-Stimulation (Angervo et al., 1992; Murray et al.,

1993).

Um aufzuklären, welche intrazellulären Mechanismen und Signalwege hinter den von

den untersuchten Wachstumsfaktoren ausgelösten Veränderungen bei Proliferation

und Motilität stehen, wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen auf

Proteinebene durchgeführt. Hierfür wurde die Phosphorylierung von MAPK42/44, Akt

und p38 MAPK mittels Western Blot untersucht. Diese Signalwege werden von IGF

(Jones und Clemmons, 1995) und EGF (Oda et al., 2005; LaMarca et al., 2008)

aktiviert und spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Plazenta und des

Embryos (Forbes und Westwood, 2008; Forbes und Westwood, 2010).

Bei der Stimulation von BCEC mit EGF wurden sowohl MAPK 44/42, Akt als auch p38

MAPK aktiviert. IGF1 führte zu keiner messbaren Aktivierung eines untersuchten

Signalweges. Die Kombination von IGF1 mit EGF verursachte jedoch Aktivierungen

von MAPK 42/44 und p38 MAPK. Hier schien die Phosphorylierung der Kinasen

- 95 -

ausschließlich durch Wirkung des EGF vermittelt zu werden. Bei der Untersuchung

der Aktivierung der Akt fiel auf, dass IGF1 sogar die aktivierende Wirkung von EGF

inhibierte, denn in der alleinigen Stimulation mit EGF kam es zu einer Aktivierung. Für

die Steigerung der Proliferation von BCEC sind anscheinend nicht die untersuchten

Signalwege alleine zuständig, denn eine signifikante Steigerung wurde, wie bereits

erwähnt, durch IGF1 erzielt, nicht aber durch EGF.

Ähnlich sind bei den BCEC die Ergebnisse der Motilitäts-Assays zu bewerten. Zwar

wurden durch Stimulation mit IGF1, EGF und IGF1+EGF signifikante Steigerungen

gegenüber den serumfreien Kontrollen erreicht, allerdings sind keine synergistischen

Wirkungen zu beobachten gewesen.

Die Stimulation der F3-Zellen mit IGF1 aktivierte die MAPK 42/44 und die Akt. Nach

Stimulation mit EGF oder IGF1+EGF kam es zu einer Aktivierung der MAPK 42/44,

Akt und p38 MAPK. EGF war scheinbar nötig, um eine Aktivierung der p38 MAPK

auszulösen. Diese Aktivierung der p38 MAPK wiederum scheint nicht unbedingt

notwendig für eine signifikante Steigerung der Proliferation bei F3-Zellen, denn eine

signifikante Steigerung wurde auch mit IGF1 erreicht.

Die F3-Zellen sprachen in den Motilitäts-Assays ähnlich auf die Stimulationen an, wie

bei den Proliferations-Messungen. Wie bereits beschrieben, gab es sowohl durch die

Stimulation mit IGF1, EGF als auch durch Stimulation mit IGF1+EGF signifikante

Steigerungen gegenüber den unstimulierten Kontrollen. Allerdings war auch eine

signifikant höhere Motilität nach der Kombination von IGF1+EGF gegenüber IGF1

auszumachen. Die Ergebnisse der Motilität lassen sich ähnlich wie die der Proliferation

interpretieren. Auch für die Stimulation der Motilität scheint die Aktivierung der p38

MAPK nicht unbedingt notwendig zu sein, denn auch durch IGF2 kam es zu einer

signifikanten Steigerung der Motilität, während die p38 MAPK durch diese Stimulanz

nicht aktiviert wurde. Daraus kann gefolgert werden, dass dieser Signalweg nicht

entscheidend zur Steigerung der Motilität bei F3-Zellen beiträgt.

Bei den Fibroblasten wurde nach Stimulation mit IGF1, EGF und IGF2 sowie den

verwendeten Kombinationen der Stimulantien eine Aktivierung aller drei mitogenen

Signalwege festgestellt. Gleichzeitig konnte aber kein biologischer Effekt nach der

Behandlung der Fibroblasten mit EGF beobachtet werden.

- 96 -

Die biologischen Effekte nach Stimulation mit IGF1+EGF unterscheiden sich bei den

Fibroblasten. So führte diese Stimulation zu einer signifikant erhöhten Proliferation,

während kein synergistischer Effekt in den Untersuchungen der Motilität auftrat. EGF

hatte bei dieser Zelllinie keinen steigernden Effekt auf die Motilität, wie auch schon bei

der Proliferation.

Es wird angenommen, dass der Signalweg über die MAPK 42/44 die Hauptachse nach

Aktivierung durch Wachstumsfaktoren bildet, während über p38 MAPK eher eine

Antwort der Zelle auf Stress oder Zytokine statt findet (Pearson et al., 2001).

Abweichend davon haben neuere Studien ergeben, dass auch die p38 MAPK in der

Plazenta eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von wachstumsfaktorvermittelten

Signalen, wie z.B. durch EGF, spielt (Johnstone et al., 2005a; LaMarca et al., 2008).

Es ist bekannt, dass über die Aktivierung des EGFR und IGF2R und daraus folgend

der MAPK 42/44 zum Beispiel Trophoblastenmigration und -invasion reguliert werden

(McKinnon et al., 2001; Forbes und Westwood, 2010). Viele verschiedene Studien

haben ergeben, dass die Akt Kinase eine entscheidende Rolle in der IGF-Achse bei

der Vermittlung plazentaren Wachstums übernimmt (Forbes und Westwood, 2010).

Akt ist aber nicht nur bei der Vermittlung von intrazellulären Signalen nach Aktivierung

des IGF1R verantwortlich, sondern vermittelt auch die Antwort auf EGF-Stimulation in

der Plazenta (Johnstone et al., 2005b) Die zusätzlich nach Kombination mit EGF

aktivierten Kinasen könnten auch durch veränderte IRS1-Spiegel verursacht worden

sein. Es ist denkbar, dass durch die Wirkung des EGF der durch IGF1 bedingte Abbau

des IRS1 ausgeglichen werden kann. So könnte intrazellulär eine abweichende

Signalkette in Gang gesetzt werden.

- 97 -

5.2. Wirkung von IGF2 und EGF

Die Stimulation mit IGF2 verursachte wie bereits beschrieben bei den F3-Zellen und

den Fibroblasten, aber nicht den BCEC, signifikante Steigerungen der Proliferation.

Durch EGF kam es nur bei den F3-Zellen zu einer signifikanten Steigerung. Die

Kombination der beiden Wachstumsfaktoren führte bei allen drei Zelllinien zu einer

signifikanten Steigerung, allerdings konnten synergistische Effekte nur bei den BCEC

beobachtet werden. Diese sind besonders hervorzuheben, da weder IGF2 noch EGF

alleine die Proliferation signifikant steigern konnten. Bei den F3-Zellen war die

proliferationsfördernde Wirkung folglich eher auf den Einfluss von EGF und bei den

Fibroblasten eher auf den von IGF2 zurück zu führen, denn dies waren die

Stimulantien, die auch alleine für signifikant höhere Ergebnisse sorgten. Die

Ergebnisse der Versuche lassen also darauf schließen, dass IGF2 eine wichtige Rolle

bei der Entwicklung und für die Funktion der Plazenta spielt.

Andere Studien kommen zu dem gleichen Schluss. So ist bekannt, dass IGF2 zur

Invasion (Chakraborty et al., 2002), Migration (Irving und Lala, 1995; McKinnon et al.,

2001) und Proliferation (Lala und Hamilton, 1996; Harris et al., 2010) von humanen

Trophoblasten und zur Migration trophektodermer Zellen des Schafes (Kim et al.,

2008) beiträgt. Ob diese Wirkungen über den IGF1R oder den IGF2R vermittelt

werden, wird noch diskutiert. Einige Arbeitsgruppen berichten, dass der IGF2R

unabhängig vom IGF1R verantwortlich für die Vermittlung der IGF2-Signale ist

(McKinnon et al., 2001). Harris et. al. (2010) berichten von antiapoptotischen Signalen

von IGF2 auf Trophoblasten, die durch den IGF2R direkt vermittelt werden, aber sie

fanden auch heraus, dass bei verminderter Expression des IGF2R die Wirkung von

IGF2 noch verstärkt werden kann. Sie vermuten, dass der IGF2R hauptsächlich als

Clearance-Rezeptor funktioniert und dadurch, dass er ausgeschaltet wurde, mehr

IGF2 zur Verfügung steht, welches dann über den IGF1R seine antiapoptotischen

Signale weitergeben kann. Die allgemein wichtige Rolle von IGF2 in der Plazenta wird

durch Studien belegt, die hervorbrachten, dass die Deletion des igf2 Gens zu einem

reduzierten Wachstum der Plazenta und daraus resultierend zu einem verminderten

fetalen Wachstum führt (Constância et al., 2002).

- 98 -

Bei der Betrachtung der Ergebnisse der Motilitätsmessungen fällt auf, dass bei den

BCEC zwar durch sowohl IGF2, EGF als auch die Kombination der beiden signifikante

Steigerungen der Motilität gegenüber SF erzielt werden konnten, aber gleichzeitig

durch die Kombination keine weitere signifikante Steigerung verursacht werden

konnte.

Bei den F3-Zellen hingegen hatte IGF2 allein keinen Einfluss auf die Motilität. Durch

die Kombination mit EGF kam es aber zu einer signifikanten Steigerung der Motilität.

Diese war so hoch, dass sowohl zu EGF als auch zu IGF2 ein signifikanter Unterschied

festgestellt werden konnte. Die signifikant höhrere Steigerung der Motilität, besonders

nach Stimulation mit IGF2+EGF in vitro, könnte auch in vivo eine entscheidende Rolle

spielen. Denn während der Trächtigkeit ist die Fähigkeit der Trophoblasten zu

migrieren und fetomaternale Hybridzellen zu bilden von entscheidender Bedeutung.

So kann die fetomaternale Kommunikation sichergestellt werden und fetale Produkte

in das maternale Kompartiment der Plazenta überführt werden (Klisch et al., 1999). Es

wäre also ein enormer Vorteil die Migration der Trophoblasten stimulieren zu können.

Bei den Fibroblasten kam es durch Stimulation mit IGF2 zu einer signifikant höheren

Motilität, aber nicht durch Applikation von EGF. In der Kombination der beiden

Wachstumsfaktoren wurde eine Wirkung vergleichbar mit der des IGF2 beobachtet.

Ob IGF2 eher die Proliferation oder die Motilität beeinflusst, scheint von dem Zelltyp

abhängig zu sein. Werden die Beobachtungen aus den Messungen der Proliferations-

und Motilitäts-Assays zusammen betrachtet, fällt auf, das IGF2 bei den BCEC eine

signifikante Steigerung nur bei der Motilität aber nicht der Proliferation verursacht. Bei

den F3-Zellen ist es hingegen genau umgekehrt.

Denkbar ist, dass die Erklärung hierfür bei den IRS-Proteinen liegt. Studien zufolge

kommt es nach Aktivierung des IGF1R, mit anschließender Signalvermittlung durch

IRS1, zu einer Stimulation der Proliferation, während IRS2 eher für verstärkte Motilität

sorgt (Byron et al., 2006). Diese Aussage kann für IGF1 und IGF2 in Betracht gezogen

werden, da sie beide über den IGF1R Signale vermitteln (siehe Literaturübersicht Kap.

2.5.2.1.).

Bei humanen Trophoblasten wurde festgestellt, dass IGF2 die Invasivität positiv

beeinflusst (Hamilton et al., 1998; Chakraborty et al., 2002). Diese Beobachtungen

- 99 -

weichen also von den Ergebnissen der vorgenommenen Studie ab und konnten nicht

für das Rind bestätigt werden. Beim Rind ist die beschränkte Invasion der

Trophoblasten in das maternale Epithel von entscheidender Bedeutung. So werden

feto-maternale Hybridzellen gebildet, die in der Lage sind, Produkte aus dem fetalen

in den maternalen Anteil der Plazenta zu transferieren (Klisch et al., 1999). Aus diesem

Grund sollte das Zusammenwirken von IGF2 und EGF, welches diesen Vorgang zu

steuern vermag, genauer untersucht werden.

Auch zur tiefergehenden Analyse dieser Ergebnisse wurden Untersuchungen auf

Proteinebene durchgeführt, die die intrazellulären Signalwege über die MAPK 42/44,

die Akt-Kinase und die p38 MAPK auf ihre mögliche Relevanz hin zum Inhalt hatten.

Bei den BCEC wurde, wie bereits beschrieben, durch IGF2 keine Aktivierung

verzeichnet. EGF hingegen vermochte alle drei untersuchten Signalwege zu

aktivieren. Interessanterweise konnte durch die Stimulation mit IGF2+EGF eine

Aktivierung von MAPK 42/44 und p38 MAPK, aber nicht der Akt erreicht werden. Es

ist anzunehmen, dass die Aktivierung der MAPK 42/44 auf die Wirkung von EGF

zurückzuführen ist, während IGF2 in seiner Wirkung auf die Akt Kinase zu überwiegen

schien.

Die Stimulation von F3-Zellen mit EGF oder IGF2+EGF führte zur Aktivierung der

untersuchten Signalwege. IGF2 hingegen, aktivierte nur MAPK 42/44 und Akt. Aus der

Literatur ist bekannt, dass es bei humanen extravillösen Trophoblasten ebenfalls zu

einer Aktivierung der MAPK nach Stimulation mit IGF2 kam (McKinnon et al., 2001).

Eine vorherige Arbeit aus unserer Gruppe zeigte bereits die Aktivierung von MAPK

nach Stimulation mit EGF in F3-Zellen. Auch eine Aktivierung von der PI3K, die der

Akt Kinase vorgeschaltet ist, konnte hier gezeigt werden (Dilly et al., 2010). Diese

Ergebnisse sind also übereinstimmend. Die Aktivierung der p38 MAPK nach der

Kombination der beiden Wachstumsfaktoren ist also vermutlich auf die Wirkung des

EGF zurückzuführen. Beim Menschen wurde bereits eine Aktivierung der p38 MAPK

in Trophoblasten durch EGF bewiesen (Johnstone et al., 2005b). Auch LaMarca et al.

(2008) konnten eine Aktivierung der p38 MAPK nach Stimulation mit EGF bei

extravillösen Zytotrophoblasten zeigen.

- 100 -

In Studien, die an ovinen Trophoblasten durchgeführt wurden, konnte eine Aktivierung

von p38 MAPK und MAPK 42/44 nach IGF2-Stimulation bestätigt werden (Kim et al.,

2008). Hier scheinen also Unterschiede zwischen bovinen und ovinen Trophoblasten

vorzuliegen.

Bei den Fibroblasten konnte abermals nach allen untersuchten Stimulationen die

Aktivierung aller drei Kinasen festgestellt werden. Diese Ergebnisse lassen darauf

schließen, dass nach Aktivierung des IGFR und des EGFR unterschiedliche

Signalwege eingeschlagen werden. Dies wiederum führt dazu, dass nach Kombination

der Wachstumsfaktoren, andere Signalwege als nach alleiniger Stimulation aktiviert

werden. Offensichtlich ist EGF notwendig, um die p38 MAPK in BCEC und F3-Zellen

zu aktivieren.

Wenn nun die Erkenntnisse aus den vorgenommenen Versuchen mit IGF1 und IGF2

mit den Resultaten der Proliferations- und Motilitäts-Assays zusammen gebracht

werden und die dort sowohl synergistischen, als auch antagonistischen Effekte

betrachtet werden, kommen verschiedene Erklärungsmöglichkeiten in Betracht.

Denkbar wäre ein reziproker Einfluss der Rezeptoren untereinander, aber auch der

Einfluss intrazellulärer Signalmoleküle. Aus der Literatur ist bekannt, dass die IRS-

Proteine bei der Vermittlung von Signalen des IGF-Systems eine große Rolle spielen.

Dies war ausschlaggebend für folgende Untersuchungen mittels PCR und

Immunhistochemie, um zu klären, an welcher Lokalisation in Plazentom und Uterus

und in den gewonnenen Zelllinien diese vorhanden sind.

5.3. Expression von IRS1 und IRS2 mRNA in BCEC, F3- Zellen und Fibroblasten

Mittels RT-PCR wurden die Adaptorproteine IRS1 und IRS2 in den untersuchten

Zelllinien lokalisiert. Die mRNA von IRS1 wurde in BCEC, F3 und Fibroblasten

gefunden, während die mRNA von IRS2 nicht nachgewiesen werden konnte (siehe

Kapitel 4.1.1.).

- 101 -

Der Nachweis von IRS1 in allen Zelllinien bestätigt die in der Literatur beschriebene

Wichtigkeit dieses Proteins für essentielle Abläufe in der Zelle (White, 1997), sowie

das ubiquitäre Vorkommen (White, 2002). Der nicht mögliche Nachweis von IRS2 in

den Zellen ist vermutlich eher in der Methodik begründet.

5.4. Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 und IRS2

Bei der Untersuchung der Proben fiel auf, dass keine Unterschiede in der Expression

von IRS1 und IRS2 zwischen der prä- und postpartalen Gruppe oder den IGF-high und

IGF-low Tieren ausgemacht werden konnten. Weiterhin hatte die LPS-Instillation

keinen Einfluss auf die IRS1 und IRS2 Färbeintensität. In Arbeiten, die an Muskelzellen

der Maus durchgeführt wurden, kam es nach LPS-induzierter Insulin-Resistenz zu

reduzierter IRS1-Expression und die Insulin-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung von

IRS1 war ebenfalls reduziert (Carvalho-Filho et al., 2006). Ähnliche Ergebnisse gab es

auch in Studien mit Adipozyten. Hier wurde ebenfalls durch LPS-Einfluss eine Insulin-

induzierte Aktivierung von IRS1 und IRS2 verhindert und auch die Aktivierung von Akt

über diese beiden Adaptor-Proteine beeinflusst (Wakayama et al., 2014). Für die von

unserer Studie abweichenden Ergebnisse gibt es verschiedene Erklärungsansätze.

Einerseits erfolgten die beschriebenen Untersuchungen an isolierten Zellen unter in

vitro Bedingungen, während die LPS-Instillation bei unserer Arbeit am lebenden

Organismus vorgenommen wurde. Andererseits waren die eingesetzten Methoden

sensitiver für geringfügige Veränderungen als die in unserem Fall gewählte

Immunhistochemie. Auch in einer vorangehenden Arbeit, die sich mit der Lokalisation

des IGF-Systems in Uterus und Plazenta des Rindes beschäftigt, konnten zwischen

den erwähnten Gruppen keine Unterschiede in der Expression von IGF1 oder IGF2

mittels Immunhistochemie und Realtime-PCR festgestellt werden (Lütkehus 2012). Es

ist also denkbar, dass durch die gleich bleibenden Spiegel an IGF1 und IGF2 auch die

Expression der IRS-Proteine in der Zelle keine bemerkbaren Unterschiede erfuhr.

- 102 -

Andererseits ist es auch denkbar, dass die Sensitivität der gewählten

immunhistochemischen Methode für den Nachweis geringer Unterschiede nicht

ausreicht. Möglicherweise wären Real-time PCR oder Western Blot geeigneter, um

Änderungen in der Expressionsmenge feststellen zu können.

Um eine Aussage treffen zu können, ob ein Zusammenhang zwischen der Häufung

von postpartalen Erkrankungen bei niedrigem IGF1-Spiegel (Wathes et al., 2007b;

Wathes et al., 2009a; Wathes et al., 2011; Piechotta et al., 2012) und den IRS-Spiegeln

besteht, müssten weitere Untersuchungen folgen, in denen Kühe beprobt werden, die

Krankheitsbilder wie z.B. verzögerte Uterusinvolutionen oder Entzündungen des

Uterus aufweisen. Diese könnten dann mit den bereits gesammelten und in dieser

Arbeit ausgewerteten Daten verglichen werden.

5.5. Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und Vergleich mit IGF1 und

IGF2

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass sich die stärkste

Expression von IRS1 im Plazentom in den mononukleären Trophoblastzellen fand. In

den TGC hingegen schwankte die Expression von nicht vorhanden bis zu geringfügig.

Auch im fetalen Mesenchym konnte IRS1 nicht nachgewiesen werden. Auf maternaler

Seite waren das Karunkelepithel und Stroma variabel zwischen negativ und schwach

positiv. In den Arterien beider Komponenten wies das Endothel in den meisten Fällen

eine Expression von IRS1 auf, während die Venen negativ waren. Bei den

Immunzellen konnten große Schwankungen in der Expression beobachtet werden.

Allerdings muss bedacht werden, dass keine weitere Typisierung dieser vorgenommen

wurde, und so eine denkbare Erklärung die unterschiedlichen Zelltypen wären.

In der humanen Plazenta wurde IRS1 vor allem im Synzytiotrophoblasten, im Stroma

der Zotten und um fetale Blutgefäße herum detektiert (Colomiere et al., 2009). Die

Expression von IRS1 in den Trophoblasten ist also übereinstimmend mit den

Ergebnissen dieser Arbeit.

- 103 -

IRS2 wurde am stärksten im fetalen Mesenchym und den einkernigen

Trophoblastzellen exprimiert, während die TGC eine schwache bis keine Expression

aufwiesen. In der Placenta maternalis hingegen, war eine Expression von IRS2 nur in

geringem Maße im Karunkelepithel festzustellen. Im Stroma und dem Karunkelstiel

konnte IRS2 nicht detektiert werden. Die Arterien waren sowohl im maternalen als

auch im fetalen Kompartiment negativ bis schwach positiv, während die Venen

ungefärbt blieben. Die Anfärbung der Immunzellen war variabel.

Es fällt auf, dass sowohl IRS1, als auch IRS2 vornehmlich auf fetaler Seite exprimiert

werden und ihr Hauptsyntheseort jeweils der mononukleäre Trophoblast ist. IRS2 wird

im fetalen Mesenchym ebenfalls in hoher Konzentration exprimiert.

Beim Menschen wurde IRS2 vornehmlich im Synzytiotrophoblasten nachgewiesen, es

war aber auch im Endothel fetaler Blutgefäße und im Stroma der Zotten zu finden

(Colomiere et al., 2009). Die genaue Rolle von IRS1 und IRS2 in der humanen

Plazenta in vitro wurde allerdings noch nicht geklärt (Laviola et al., 2005).

Sowohl die IRS1- als auch die IRS2-Expression wird beim Menschen durch maternale

Insulinspiegel reguliert, wohingegen fetales Insulin gar keine oder nur schwache

Auswirkungen auf die Regulation dieser Signalmoleküle hatte (Colomiere et al., 2009).

White (1997) gelangt zu der Ansicht, dass IRS1 das vorherrschende Signalmolekül

der IRS-Proteine ist, welches metabolische Signale vermittelt.

Wird die Expression der beiden Signalmoleküle IRS1 und IRS2 im Zusammenhang mit

der Expression von IGF1 und IGF2 (Lütkehus, 2012) im Plazentom des Rindes

betrachtet, fällt auf, dass auf fetaler Seite eine sehr deutliche Lokalisation von sowohl

den beiden Liganden, als auch den Signalmolekülen in den einkernigen Trophoblasten

ausgemacht werden kann. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass zum Ende der

Trächtigkeit bzw. während der Geburt im einkernigen Trophoblasten IGF1- und IGF2-

abhängige Prozesse stattfinden, die über die Signalmoleküle IRS1 und IRS2 gesteuert

werden. Gleichzeitig scheinen sie aber unabhängig vom IGF1-Serumspiegel zu sein,

da keine Unterschiede zwischen IGF-high- und IGF-low-Tieren nachzuweisen waren

bzw. diese mit der Immunhistochemie nicht detektiert werden konnten. Prozesse, die

zu diesen Zeitpunkten im Plazentom ablaufen, sind unter anderem die

- 104 -

(voranschreitende) Ablösung der fetalen von der maternalen Plazenta. Die zugrunde

liegenden Mechanismen sind aber noch nicht endgültig identifiziert (Dilly et al., 2011,

Shenavai et al., 2012). Außerdem kommt es zu diesem Zeitpunkt zum gesteuerten

Rückbau der Karunkeln (Grunert et al., 1983) und dem Rückgang der

Trophoblastriesenzellen (Wooding, 1984). Es wäre also möglich, dass die Liganden

des IGF-Systems diese Vorgänge über IRS-Adaptorproteine regulieren. Die

einkernigen Trophoblastzellen liegen im Plazentom dem maternalen Epithel direkt

gegenüber und sind aufgrund ihrer Lage wahrscheinlich entscheidend in diesen

Prozess involviert. Auch die deutliche Expression von sowohl Liganden als auch

Signalmolekülen unterstützt diese Annahme. Um diese These bestätigen zu können,

müssten in zukünftigen Studien Proben aus früheren Trächtigkeitsstadien auf diese

Proteine untersucht werden. Dies wäre sehr sinnvoll, da eine schnelle und vollständige

Ablösung der fetalen Anteile von großer wirtschaftlicher Bedeutung ist. Die

Nachgeburtsverhaltung ist Wegbereiter für verschiedene pathogene Geschehen im

Uterus, die wiederum zu verlängerten Zwischenkalbeintervallen führen (Sheldon et al.,

2008).

Die sehr deutliche Expression von IRS2 im fetalen Mesenchym scheint oberflächlich

betrachtet nicht im Zusammenhang mit der IGF1- oder IGF2-Expression zu stehen,

die in der Arbeit von Lütkehus (2012) in diesem Gewebe mit unterschiedlichen

Intensitäten (von gar nicht vorhanden bis positiv) beschrieben wurde. Dennoch ist ein

Einfluss der Faktoren auf die Expression von IRS2 denkbar. Eine mögliche Erklärung

wäre, dass es zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits zur Internalisierung und zum

Abbau des Liganden-/Rezeptorkomplexes aus IGF1/IGF2 und IGF1R gekommen ist

und so ein Nachweis mittels Immunhistochemie nicht mehr möglich ist. Gleichzeitig

wurde die Signalkette mit dazugehöriger IRS2-Aktivierung aber bereits in Gang

gesetzt.

Wird die Arbeit im Zusammenhang betrachtet fällt auf, dass in vivo mittels

Immunhistochemie, IRS1 und IRS2 in Trophoblastzellen nachgewiesen werden

können, sogar mit deutlicher Intensität. Dieses Ergebnis konnte bei den in vitro

Versuchen mit den bovinen Trophoblastzellen (F3) Zellen auf mRNA Ebene nur für

IRS1 erzielt werden, nicht aber für IRS2.

- 105 -

Ähnlich verhielt es mit den Ergebnissen von Karunkelepithel bzw. BCEC. Auch hier

konnte in vitro mittels RT-PCR in den BCEC IRS1, nicht aber IRS2 nachgewiesen

werden. In vivo zeigte das Karunkelepithel eine negative bis schwach positive

Reaktion bei beiden Adaptormolekülen. Wobei die Aussagekraft der PCR für IRS2

eigeschränkt ist, da keine Positivproben mitgeführt wurden. So könnte es zu falsch

negativen Ergebnissen gekommen sein.

In den Fibroblasten, welche aus der Karunkel isoliert wurden, konnte bei der RT-PCR

IRS1 und IRS3 nachgewiesen werden. Immunhistochemisch konnte IRS1 in negativer

bis schwach positiver Ausprägung im maternalen Stroma nachgewiesen werden,

während IRS2 auch mittels Immunhistochemie nicht an dieser Lokalisation detektiert

werden konnte.

Bedacht werden muss bei diesem Vergleich aber, dass die Proben für in vitro und in

vivo Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten der Trächtigkeit genommen

wurden. Proben, die zur Zellgewinnung dienten, kamen aus eher frühen

Trächtigkeitsstadien, während Plazentome und interplazentomares Gewebe für

immunhistochemische Untersuchungen kurz vor der Geburt bzw. kurz nach der Geburt

gewonnen wurden.

Um zu klären, ob sich das IRS-Profil im Verlauf der Trächtigkeit möglicherweise ändert,

oder ob Unterschiede durch die Kultivierung der Zellen bedingt sind, wäre es sinnvoll,

Proben sowohl für die Zellkultur als auch für die Immunhistochemie zum gleichen

Zeitpunkt und in verschiedenen Stadien der Trächtigkeit zu gewinnen. So könnten

auch methodikbedingte Unterschiede minimiert werden. Diese Überlegungen gilt es

bei zukünftigen Untersuchungen zu berücksichtigen.

- 106 -

5.6. Expression von IRS1 und IRS2 im interplazentom aren Gewebe und Vergleich

mit IGF1 und IGF2

Die Untersuchung der interplazentomaren Proben ergab folgendes

Expressionsmuster für IRS1: am stärksten angefärbt waren die uterinen Drüsen,

während das luminale Epithel variabel angefärbt war, im Bereich der Glykokalix jedoch

immer deutlich. Denkbar ist, dass im Uteruslumen eine hohe Konzentration an IGF

vorhanden gewesen ist, welches auf das Epithel eingewirkt hat. So könnte es zu der

IRS1-Expression gekommen sein. Darauf deutet der Nachweis dieses Proteins in der

direkten Kontaktzone, nämlich der apikalen Membran hin. Die Intensität der

Expression im Epithel könnte allerdings auch durch die Individualität des

Trächtigkeitsverlaufes bedingt sein. Denn der vom Versuchsablauf vorgegebene Tag

der Probenentnahme, könnte je nach Tier, unterschiedlich weit vom natürlichen

Zeitpunkt der Geburt entfernt sein, bzw. die Geburt fand spontan statt im Gegensatz

zur Sectio caesarea. Das Stratum reticulare, das Myometrium, die Venen und meist

auch das Stratum compactum wiesen keine Expression von IRS1 auf. Bei einigen

Tieren konnten jedoch in aufgelockerten Bereichen, vermutlich ödematöse Bezirke,

und um Immunzellen herum positive Areale festgestellt werden. Außerdem konnte

eine IRS1 Expression in der Tunica interna der Arterien und in kleinen Blutgefäßen im

Myometrium gezeigt werden. Die Immunzellen waren abermals nicht einheitlich

angefärbt.

Auch IRS2 wurde am stärksten in den uterinen Drüsen exprimiert. Das uterine Epithel

zeigte eine variable Reaktion, in den meisten Fällen war jedoch eine Expression

festzustellen. Auch hier gelten die Überlegungen zum tatsächlichen Zeitpunkt im

Trächtigkeitsverlau, wie bei IRS1, die Expressionsstärke betreffend. Sowohl das

Stratum compactum als auch das Stratum reticulare wiesen unterschiedlich gefärbte

Bereiche auf. Im Stratum compactum waren vornehmlich Fibrozyten und Immunzellen

positiv angefärbt, während im Stratum reticulare negative Bereiche um Drüsen und

Blutgefäße herum auffielen. Bei den Blutgefäßen wies nur das Endothel der Arterien

eine IRS2-Expression auf. Das Myometrium war schwach positiv bis positiv angefärbt,

auffällig war jedoch bei vielen Tieren das deutlich angefärbte Bindegewebe zwischen

- 107 -

den Muskelzellen. Die Expression von IRS2 in den Immunzellen war abermals

unterschiedlich.

Damit werden IRS1 und IRS2 hauptsächlich in den uterinen Drüsen exprimiert. Im

Vergleich zur IGF1 und IGF2 Expression an dieser Lokalisation fallen verschiedene

Dinge auf. Sowohl IGF1 als auch IGF2 sind in hohem Maße im Epithel, den Drüsen

und im Stratum compactum zu finden. Das Myometrium und die Blutgefäße sind

hingegen nur positiv für IGF1 (Lütkehus, 2012). Die Liganden des IGF-Systems sind

also fast im gesamten Uterus bis auf das Stratum reticulare vertreten. Eine

Übereinstimmung kann für IRS1 und IRS2 in den uterinen Drüsen und im Stratum

reticulare festgestellt werden, das Epithel ist nur bei einigen Tieren deutlich positiv für

IRS1 und IRS2. Abweichende Ergebnisse zwischen den IRS-Proteinen und den IGFs

sind folglich im Stratum compactum, und Myometrium vorzufinden.

Übereinstimmende Ergebnisse im Uterus deuten auf einen Gebrauch der IRS1- und

IRS2-Proteine in der IGF-Signalkaskade der betroffenen Zellpopulationen. Das

größtenteils negativ angefärbte Stratum reticulare lässt vermuten, dass zu beiden

Zeitpunkten der Probenentnahme keine IGF-Signale über die Adaptormoleküle IRS1

und IRS2 abliefen. Die im Stratum reticulare, Myometrium und Stratum compactum

voneinander abweichenden Ergebnisse lassen auf eine Verwendung anderer

intrazellulärer Signalmoleküle schließen. In Betracht kämen unter anderem auch IRS3

und IRS4, deren Rolle beim Rind noch nicht weiter untersucht ist (Tsuruzoe et al.,

2001). Geklärt werden müsste, ob diese beiden Adaptorproteine im Reproduktionstrakt

des Rindes vorkommen. Bislang ist bekannt, dass sie nicht in allen Geweben

vorhanden sind, bzw. IRS3 bislang erst beim Nager identifiziert wurde (Lavan et al.,

1997; Boller et al., 2012). In der durchgeführten RT-PCR wurde allerdings IRS3 in den

in vitro kultivierten Fibroblasten nachgewiesen.

Der Grund für die unterschiedlich starken Immunreaktionen einzelner Tiere, aber auch

von IGF1 und IRS2, könnte der Östrogenspiegel sein. Es erscheint wahrscheinlich,

dass Östrogene, nach Aktivierung des IGF1R durch IGF, für eine Modifizierung des

IRS2 verantwortlich sind. Denkbar wären Vorgänge wie eine Phosphorylierung, die

wiederum zu Ubiquitinierung oder Degradation führen könnte. Durch diesen

Mechanismus könnten IRS2-Signale im Uterus inhibiert werden. Bei Mäusen wurde

- 108 -

die IRS2-Expression im Uterus durch Östrogene reduziert. Dieser Prozess lief

vornehmlich posttranslational ab und war einerseits abhängig von proteosomalen

Proteasen und IGF1, aber andererseits nicht allein abhängig vom IRS1-PI3K

Signalweg (Richards et al., 2001). Der Einfluss von Östrogenen auf IGF1 wurde auch

in den Arbeiten von Ohtani (1996) und Robinson (2000) bestätigt. Da bei den von uns

gewählten Versuchstieren, bedingt durch die späte Phase der Trächtigkeit (bzw. die

Geburt), der Östrogenspiegel Maximalwerte aufwies (Holzhausen, 2012), käme diese

Erklärung in Betracht. Allerdings konnten in der erwähnten Studie von Holzhausen

(2012), in der 17ß-Östradiol im Serum bestimmt wurde, kein signifikanter Unterschied

zwischen der IGF-low- und der IGF-high-Gruppe gemessen werden. Der Einfluss von

steroidalen Hormonen auf die Expression von Bestandteilen des IGF-Systems wird

schon lange diskutiert. So existieren Arbeiten, in denen eine Beeinflussung des IGF-

Systems durch steroidale Hormone beim Rind nachgewiesen werden konnte (Ohtani

et al., 1996; Robinson et al., 2000), neben solchen, in denen dies aber nicht gelang

(Geisert et al., 1991). Es wurde im Rahmen der letztgenannten Arbeit aber festgestellt,

dass östrogenbedingt ein vermehrter Transport von IGF aus dem Blutkreislauf in das

Uteruslumen hinein erfolgt (Geisert et al., 1991). Dies müsste zur Konsequenz haben,

dass von hier ausgehend auch die IRS-Signalkette in Gang gesetzt wird. Neben

Östrogen ist auch Progesteron in der Lage, den IRS2-Spiegel zu beeinflussen. Dieser

Vorgang ist auf Zellen mit Progesteron-Rezeptor beschränkt und vermag nicht auf den

IRS1-Spiegel einzuwirken. Gleichzeitig wird aber das IRS1/IRS2-Mengenverhältnis

verändert. Durch die Beeinflussung von IRS2 kann Progesteron so also in die

Signalwege von IGF1, Insulin und verschiedenen anderen Zytokinen eingreifen

(Vaßen et al., 1999; Vaßen et al., 1999 (2)).

- 109 -

5.7. Schlussfolgerung

Das Vorhandensein der einzelnen Komponenten des IGF-Systems in Uterus und

Plazenta des Rindes (Wathes et al., 1998; Robinson et al., 2000; Richterich, 2008;

Lütkehus, 2012) lassen darauf schließen, dass sie eine wichtige Rolle während der

Trächtigkeit, aber auch der folgenden Regeneration spielen. Im Rahmen der

vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IGF1 und IGF2 positiven Einfluss auf

die Proliferation und Motilität boviner Zellen plazentaren Ursprungs hatten. Beide

Vorgänge sind für eine erfolgreiche Trächtigkeit von entscheidender Bedeutung. Auch

Wechselwirkungen mit EGF waren ersichtlich. Die Erkenntnis, dass MAPK, Akt und

p38 MAPK an der intrazellulären Signalvermittlung beteiligt sind und der Nachweis von

IRS1 und IRS2, welche intrazelluläre Signalvermittler nach Aktivierung von IGF sind,

in Teilen von Uterus und Plazenta bieten für die Zukunft mögliche Startpunkte für die

Entwicklung prophylaktischer und therapeutischer Maßnahmen. Dies ist von

Bedeutung, da verschiedene Studien zu dem Schluss kamen, dass die IGF-

Komponenten Einfluss auf die postpartale Heilung haben (Vangroenweghe et al.,

2005; Piechotta et al., 2012). Daher sind weitergehende Untersuchungen in Bezug auf

die Eignung von IRS1 und IRS2 als Marker zur prophylaktischen Diagnostik

puerperaler Erkrankungen beim Rind und zur genauen Kommunikation zwischen den

potenten Wachstumsfaktoren IGF1/IGF2 und EGF denkbar und wünschenswert.

- 110 -

6. Zusammenfassung

„Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin- like growth factor Systems

in vitro und der peripartalen Expression von IRS1 und IRS2 i m Plazentom und in

interplazentomaren Bereichen des Rindes in vivo.“ Von Lisa Lenz (Helmstedt)

Postpartale Erkrankungen des Uterus spielen bei den heutigen Hochleistungs-

Milchkühen eine große Rolle, da sie zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führen.

Hierbei wird eine Beteiligung des IGF-Systems vermutet, da veränderte IGF-

Serumspiegel mit negativer Energie-Balance und einem erhöhten Risiko von einer

puerperalen Erkrankung betroffen zu sein vergesellschaftet sind (Wathes et al., 2009;

Piechotta et al., 2012). Nach der Lokalisation von Mitgliedern des IGF-Systems im

Reproduktionstrakt des Rindes (Robinson et al., 2000; Richterich, 2008; Lütkehus,

2012) ist das Ziel der vorliegenden Studie, die der IGF Signalgebung

zugrundeliegenden Mechanismen auf in vitro Ebene zu erforschen.

Hierfür wurden bovine plazentäre Zelllinien (BCEC, F3, Fibroblasten) mit IGF1 und

IGF2 alleine, beziehungsweise in Kombination mit EGF stimuliert und die Wirkungen

auf die Zellproliferation und Motilität untersucht. Die intrazelluläre Signalvermittlung

wurde mittels Western Blot über die Aktivierung der MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase

und p38 MAP Kinase analysiert.

Da nach Aktivierung des IGF1R die Adaptorproteine IRS1 und IRS2 für die

Signalvermittlung in der Zelle entscheidend sind, wurden diese im Plazentom und in

interplazentomaren Bereichen des Rindes mittels Immunhistochemie lokalisiert. Das

Material wurde am 275. Tag der Trächtigkeit während einer Sectio caesarea oder nach

spontan erfolgter Geburt, normalem Abgang der Nachgeburt und Instillation von LPS-

Lösung in den Uterus mit anschließender Euthanasie entnommen. Beide Gruppen

wurden zusätzlich anhand ihrer IGF1-Blutspiegel noch in IGF-high und IGF-low Tiere

eingeteilt.

In Vitro kam es bei den BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten nach Stimulation mit IGF1

und IGF1+EGF zu einer signifikant höheren Steigerung der Proliferation. IGF2

- 111 -

vermochte die Proliferation von F3 Zellen und Fibroblasten signifikant zu steigern. Die

Kombination von IGF2+EGF führte bei den untersuchten Zelllinien ebenfalls zu einer

signifikant höheren Proliferation, während EGF ausschließlich die Proliferation von F3

Zellen signifikant steigern konnte. Hervorzuheben ist, dass die Kombination von IGF2

+EGF bei den BCEC diese signifikante Steigerung erreichen konnte, obwohl die Stoffe

einzeln nicht dazu in der Lage waren. Bei den F3 Zellen hingegen war eine

antagonistische Wirkung festzustellen. IGF2+EGF verursachten eine signifikant

schwächere Proliferation im Vergleich mit EGF, wenn auch signifikant höher als die

Wachstumskontrolle.

Bei den BCEC wurde mit jeder Stimulation eine signifikante Steigerung der Motilität

erreicht. IGF1 und IGF2+EGF verursachten eine signifikante Steigerung bei den F3

Zellen und den Fibroblasten, ebenso wie IGF1+EGF bei den F3 Zellen und IGF2 bei

den Fibroblasten. Bei den F3 Zellen kam es durch Kombination von IGF2 und EGF zu

einem synergistischen Effekt, die Motilität war signifikant höher als nach Stimulation

mit den einzelnen Wachstumsfaktoren. Bei den Fibroblasten kam es hingegen durch

das Zusammenwirken von IGF1+EGF zu einem antagonistischen Effekt.

Die Untersuchung der intrazellulären Signalwege brachte folgende Ergebnisse: bei

den F3 Zellen wurden die MAP-Kinase 42/44 und die Akt Kinase durch alle

eingesetzten Stimulantien aktiviert. Die p38 MAPKinase erfuhr durch Stimulation mit

IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF eine Aktivierung. Bei den Fibroblasten kam es durch

jede Stimulation zu einer Aktivierung aller untersuchten Kinasen. Die MAP-Kinase

42/44 und die p38 MAP Kinase wurden bei den BCEC durch IGF1+EGF, EGF und

IGF2+EGF aktiviert, die Akt Kinase durch EGF. Es ist erkennbar, dass bei den F3

Zellen und den BCEC die Wirkung von EGF überwiegt.

Im Folgenden werden die immunhistochemischen Färbungen der Plazentome

betrachtet. Die Orte der stärksten Expression waren für sowohl IRS1 als auch IRS2

die mononukleären Trophoblasten. IRS2 wurde in gleichem Maße auch im fetalen

Mesenchym exprimiert. Auf maternaler Seite waren nur schwache bis negative

Expression auszumachen, bis auf die Arterien, welche positiv angefärbt waren. In den

interplazentomaren Proben wurde eine deutliche Expression von IRS1 und IRS2 in

den uterinen Drüsen festgestellt. Das luminale Epithel wies eine von negativ bis positiv

- 112 -

ausfallende Expression beider Adaptormoleküle auf. Auffällig war eine sehr starke

Anfärbung der darauf sitzenden apikalen Membran bei IRS1. Auch die Arterien waren

wieder positiv, im Gegensatz zu den Venen. Die Immunzellen zeigten für beide

Antikörper sowohl im Plazentom, als auch im interplazentomaren Bereich eine variable

Anfärbung.

Die Ergebnisse lassen auf zellspezifische Aufgaben der beiden Adaptormoleküle IRS1

und IRS2 in den peripartalen Umbauvorgängen im Uterus schließen.

Insgesamt betrachtet lassen die Ergebnisse dieser Arbeit den Schluss zu, dass IGF1

und IGF2 während der Trächtigkeit des Rindes für Proliferation und Motilität im

Plazentom entscheidend sind und in Wechselwirkung mit EGF stehen. Für diese

Vorgänge werden in vitro je nach Zelltyp, in unterschiedlicher Ausprägung, die

Signalwege von MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase genutzt. Die

Expression von IRS1 und IRS2 in Plazentom und interkarunkulären Bereichen des

Rindes lassen eine Beteiligung an der Vermittlung intrazellulärer Signale nach IGF-

Stimulation vermuten. Aufgrund dieser Erkenntnisse bieten sich verschiedene

Angriffspunkte für eine Modulation zur Bekämpfung puerperaler Erkrankungen, aber

auch mögliche Marker für die Diagnostik. Hierfür müssten weiterführende

Untersuchungen vorgenommen werden.

- 113 -

7. Summary

„Characterization of the bovine placental insulin-l ike growth factor system in

vitro and the peripartal expression of IRS1 and IRS2 in the placentome and

interplacentomal tissue of dairy cows in vivo.” Lisa Lenz (Helmstedt)

Postpartal uterine dieseases are one of the major problems in the dairy cow herd

management today, because they provoke severe economical losses. In this regard,

the IGF-system might play a significant role as there is evidence that negative energy

balance and deviating IGF level are associated with puerperal diseases in dairy cows

(Wathes et al., 2009; Piechotta et al., 2012). After the localization of the members of

the IGF-system in the uterus and placentome of cattle (Robinson et al., 2000;

Richterich, 2008; Lütkehus, 2012), the goal of this study was to elucidate the underlying

mechanisms of the IGF-system in vitro.

Three bovine, placental cell lines (BCEC, F3, fibroblasts) were stimulated with IGF1

and IGF2 alone or in combination with EGF, and the influence on proliferation and

motility was examined. The intracellular signaling after stimulation was analysed by

western blots for the activation of MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase, and p38 MAP

Kinase.

Since the adaptorproteins IRS1 and IRS2 are crucial for downstream signaling after

IGF1R activation their expression was examined in the bovine placentome and in

interplacentomal areas by immunohistochemistry. The material was taken on day 275

of gestation during a caesarian section or after spontaneous labour. After release of

fetal membranes, LPS-instillation and euthanization were conducted. Both groups

were further subgrouped into IGF-low and IGF-high animals, according to their blood

IGF-levels.

In vitro a significant increase of proliferation after stimulation with IGF1 and IGF1+EGF

was seen in BCEC, F3 cells and fibroblasts. On the contrary, IGF2 was capable of

significantly increasing the proliferation of F3 cells and fibroblasts. The combination of

IGF2+EGF was again able to enhance the proliferation of all three analyzed cell lines,

- 114 -

whereas EGF only enhanced the proliferation of F3 cells. It has to be emphasized that

the combination of IGF2+EGF was able to increase the proliferation significantly, while

the two growth factors on their own failed to do so. Regarding F3 cells, a contrary result

was obtained: IGF2+EGF seemed to have an antagonistic effect. Their combination

resulted in a significantly lower proliferation compared to EGF, although a significant

increase related to the cells grown in serumfree medium was observed. In BCEC, a

significant enhancement of motility was found after each stimulation. IGF1 and

IGF2+EGF led to a significant increase of the motility of F3 cells and fibroblasts, just

as IGF1+EGF in F3 cells and IGF2 in fibroblasts. The combination of IGF2 and EGF

had a synergistic effect on F3 cells; the motility was significantly higher compared to

the single stimulations. Considering fibroblasts an antagonistic effect was noticeable

after stimulation with IGF1+EGF.

The results of the investigation regarding the intracellular signal cascades were as

follows: the MAP-Kinase 42/44 and the Akt Kinase of F3 cells was activated by all

analyzed growth factors. The p38 MAPK Kinase was activated by IGF1+EGF, EGF,

and IGF2+EGF. Regarding the fibroblasts, an activation of the examined kinases was

seen after every stimulation. MAP-Kinase 42/44 and p38 MAP Kinase were activated

by IGF1+EGF, EGF, and IGF2+EGF in BCEC, whereas the Akt Kinase was only

activated by EGF. Thus it appears that the impact of EGF exceeded that of the other

two growth factors in F3 cells and BCEC.

In the immunohistochemical stainings of the placentomes it is obvious that IRS1 and

IRS2 are mainly located in the mononuclear trophoblasts. IRS2 is as prominent in the

fetal mesenchyme. Concerning the maternal part, there was a variation from a weak

to no expression, except for the arteries, which were positive. In the interplacentomal

samples IRS1 and IRS2 were located in the uterine glands. In the luminal epithelium

the staining of both adaptor proteins varied from negative to positive. Remarkable was

the intense staining of the apical membrane for IRS1. Again, only the arteries, but not

the venes were positive. The intense of staining of immune cells was variable in

interplacentomal areas and in the placentome and for both antibodies.

In conclusion, there seem to be cell-specific functions of both adaptorproteins IRS1

and IRS2 in the ongoing remodeling processes during the peripartal time.

- 115 -

In summary, the results of this work led to the conclusion that IGF1 and IGF2 during

gestation are crucial for proliferation and motility in the bovine placentome and interact

with EGF. Depending on the cell type, these processes in vitro are differentially

regulated by MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase, and p38 MAP Kinase. The expression of

IRS1 and IRS2 in the placentome and intercaruncular tissue led to the assumption that

they take part in the intracellular signaling after IGF stimulation. Based on these

findings, new various targets for modulation as well as some potential novel markers

for diagnostics could be developed to combat puerperal diseases. However, further

investigations are needed.

- 116 -

8. Literaturverzeichnis

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- 135 -

9. Anhang

9.1. Abkürzungen

µ Mikro (10-6)

µl Mikroliter

µm Mikrometer

µg Mikrogramm

°C Grad Celsius

A Ampere

ABA Acrylamid-Bisacrylamid (1:37,5), Rotiphorese

Gel 30

ALS Acid Labile Subunit

APS Amoniumperoxidsulfat

Aqua dest Aqua destillata

AEBSF 4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluorid

hydrochlorid

Akt Akt Kinase

Anova Analysis of variance

ATP Adenosintriphosphat

bp Base pairs (Basen Paare)

BCEC Bovine caruncular epithelial cells

BSA Bovines Serum Albumin

bST Bovines Somatotropin

BUVEC Bovine uterine vein endothelial cells

cDNA Complementary DNA

cm Zentimeter

DAB 3,3´-Diaminobenzidin-tetra-hydrochlorid

DMEM/HAM’s F12 Dulbecco Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxide

- 136 -

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic

acid)

dNTP Didesoxyribonukleosid-Triphosphate

EBM Endothelzell-Basal-Medium

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGF Epidermal growth factor

ERK Extracellular-signal regulated kinase

F3 Fetale Trophoblasten

FCS Fetales Kälber Serum (fetal calf serum)

FGF Fibroblast growth factor

FSM Vollmedium (full supplemented medium)

for Forward (Primer)

g Gramm

g Normfallbeschleunigung (g=9,81 m/s2)

GH Growth Hormone

Grb2 Growth factor rebound protein

HCL Salzsäure

HE Hämatoxylin-Eosin

HR Insulin-Hybrid Rezeptor

HRP Horse radish peroxidase

IL2 Interleukin 2

IL6 Interleukin 6

IGF Insulin-like growth factor

IGF1 Insulin-like growth factor 1

IGF2 Insulin-like growth factor 2

IGFBP Insulin-like growth factor binding protein

IGF1R Insulin-like growth factor receptor 1

IGF2R Insulin-like growth factor receptor 2

INF-Ʈ Interferon-Ʈ

IR Insulin Rezeptor

IR-A Insulin Rezeptor, Isoform A

- 137 -

IR-B Insulin Rezeptor, Isoform B

IRS Insulin receptor substrat

IRS1 Insulin receptor substrat 1

ISR2 Insulin receptor substrat 2

ISR3 Insulin receptor substrat 3

ISR4 Insulin receptor substrat 4

ISR5 Insulin receptor substrat 5

ISR6 Insulin receptor substrat 6

kDa Kilodalton

l Liter

LDL Low density lipoprotein

LGA Large for gestational age

LPS Lipopolysaccharid

m Milli (10-3)

MCF-7 Michigena Cancer Foundation-7, Brustkrebs-

Zellinie

ml Milliliter

mm Millimeter

mg Milligramm

mM Millimolar

MMP Matrix-Metalloproteinase

min Minute

M Molar

MAPK Mitogen-activated protein kinase

Mean Arithmetischer Mittelwert

mRNA Messenger RNA

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium Bromid

n Nano (10-9)

N2 Stickstoff

NaCl Natriumchlorid

- 138 -

Nck Non-catalytic region of tyrosine kinase

adaptor protein 1

NGS Normal goat serum

NHS Normal horse serum

p p-Wert

p38 MAPK Phospho-p38 MAP Kinase

pAkt Phospho Akt

PAF Platelet activating factor

PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate

buffered saline)

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase

chain reaction)

PEM PBS-EDTA-Wasser

PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase

pMAPK 42/44 Phosphorylated mitogen-activated protein

kinase 42/44

rev Reverse (Primer)

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse-Transkriptase PCR

RNA Ribonucleid acid

RPS9 40S ribosomal protein S9

SDS Sodium dodecylsulfate

SEM Standard error of the mean

SGA Small for gestional age

SNEB Severe negative energy balance

SFM Serum freies Medium

TBE TRIS-boronic acid-EDTA-buffer

TBS Salty buffered TRIS

TEMED Tetramethylethyldiamin

TG TRIS-Glycine

TGC Trophoblast Giant Cells

- 139 -

TRIS Tris-Borat-EDTA-Puffer

TEMED Tetramethylethylendiamine

V Volt

VEGF Vascular endothelial growth factor

VE Voll entsalzt

v/v Volumen pro Volume

w/v Gewicht pro Volumen

- 140 -

9.2. Puffer und Lösungen

Blot-Puffer

TG 10x 250ml

Methanol 500ml

Aqua dest. 2250ml

Boehringer-Lyse-Puffer

TRIS pH 7,4 50mM

NaCl 150mM

NaF 40mM

EDTA 3mM

EGTA 2mM

NP40 (Nonidet) 1% (v/v)

SDS 0,1% (w/v)

NaDox 0,1% (w/v)

AEBSF (1mM) 1:100

Leupeptin (1µM) 1:100

Pepstatin (1µg/ml) 1:1000

Phosphatase-Inhibitoren 1:100

Citrat-Puffer (pH 6,0)

Lösung A (0,1M Zitronensäure)

C6H8O7 x H20 21g

Aqua dest. ad 1000ml

Lösung B (0,1 M Natriumcitrat)

C6H5O7Na3 x 2H2O 29,41g

Aqua dest. ad 1000ml

- 141 -

Delafield’s Hämalaun

Hämatoxylin 1g

Isopropanol 6ml

Ammoniumalaun Lösung, gesättigt 100ml

4 Tage Reifung bei Tageslicht

Glycerin 25ml

Methanol 25ml

Eosin (1%)

Eosin G 5g

Aqua dest. 500ml

Vor Gebrauch 3-4 Tropfen Eisessig hinzugeben.

Endothelzell-Basal-Medium MV2 (EBM)

EBM MV2 500ml

Penicillin/Streptomycin (10.000U/ml) 5ml

Glutamin 5ml

Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 50ml

Epidermal growth factor (5ng/ml) 500µl

Basic fibroblast growth factor (10ng/ml) 500µl

Insulin-like growth factor 1 (20ng/ml) 500µl

Vascular endothelial growth factor (0,5ng/ml) 500µl

Ascorbic acid(1mg/ml) 500µl

Hydrocortisone (0,2µg/ml) 500µl

Endothelzell-Basal-Medium 1% (EBM 1%)

EBM MV2 500ml

Penicillin/Streptomycin (10.000U/ml) 5ml

L-Glutamin 5ml

Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) (0,5%) 5ml

- 142 -

Formalin nach Lillie

37%iges Formaledhyd 100ml

NaH2PO4 6,5g

NaH2PO4 4,0g

Aqua dest. Ad 1000ml

H2O2-Lösung (0,6%)

H2O2 (30%) 4ml

Ethanol (80%) ad 200ml

Lower TRIS (pH 8,8)

TRIS base 1,5M

SDS 0,4% (v/v)

Lämmli Puffer (4x)

TRIS-HCl 240mM

SDS 8%

Glycerol 40%

Bromphenolblau 0,04%

Beta-Mercaptoethanol 5%

Milchpulverlösung

Magermilchpulver, blotting grade 1,25g

TBS-T 25ml

NaOH-Lösung

NaOH Pellets 40g

Aqua dest. 1000ml

- 143 -

PEM

EDTA 200mM 5ml

PBS 10x 50ml

Aqua dest. 450ml

PBS (pH 7,2)) (für den Gebrauch in der Histologie)

Aqua dest. 5l

Na2HPO4- 7,8g

NaCl 40g

NaOH 40ml

PBS 10x (pH 7,2)

Na2HPO4 7,8g

NaCl 40g

Aqua dest. 500ml

Trypsin 2x

Trypsin 10x (0,5%) 8ml

PEM 32ml

Trenngel 12%

VE-freies Wasser 2400µl

ABA (Acrylamid-Bisacrylamid 1:37,5) 3100µl

Lower TRIS 2000µl

APS (Ammoniumperoxidsulfat) 75µl

Temed 5µl

Sammelgel

Aqua dest. 2700µl

ABA (Rotophorese® Gel 30) 670µl

Upper TRIS 500µl

- 144 -

Bromphenolblau (1%) 50µl

APS (10%) 40µl

TEMED 8µl

Stopfgel

Temed 4µl

Trenngel 500µl

Serumfreies Medium (SFM)

DMEM/Ham’s F12 500ml

Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) 5ml

L-Glutamin 5ml

SDS-Laufpuffer

TG 10x 100ml

SDS 10% 10ml

Aqua dest. 890ml

Stripping-Buffer (pH 2,0)

Glycin 0,2M

Tween20 20% 0,05%

SDS 1%

TBS (10x) (pH 7,4)

TRIS Base 60,55g

NaCl 90g

Aqua dest. 1000ml

TBS (1x)

TBS (10x) 100ml

Aqua dest. Ad 1000ml

- 145 -

TBS-T (TRIS buffered saline with Tween)

Tween20 20% 2,5ml

TBS (1x) 1000ml

TBE (10x)

TRIS 108g

Borsäure 55g

0,5M EDTA (pH8) 40ml

Aqua dest. Ad 1000ml

TBE (1x)

TBE (10x) 100ml

Aqua dest. Ad 1000ml

TG (10x)

TRIS Base 29g

Glycin 144g

SDS 10g

Aqua dest. Ad 1000ml

Upper TRIS (pH 6,8)

TRIS-HCl 500mM

SDS 0,4% (v/v)

Vollmedium (FSM)

DMEM Ham’s F12 500ml

Penicillin/Streptomycin (10.000U/ml) 5ml

L-Glutamin 5ml

Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 50ml

- 146 -

9.3. Reagenzien

Reagenzien Bezugsquelle

5x Colourless GoTaq Reaction buffer Promega, Mannheim

AEBSF A1721 AppliChem, Darmstadt

Agarose NEEO Ultra Quality Roti® Garose Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe

Ammonium-Alaun AppliChem GmbH, Darmstadt

Anti-Goat-HRP (sc2056) SantaCruz Biotechnology, Inc.;

Heidelberg

Anti-Rabbit-HRP (sc-2004) SantaCruz Biotechnology, Inc.;

Heidelberg

APS (10%) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

Borsäure Carl Roth GmbH + Co.KG; Karlsruhe

Bovines Serumalbumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen bei München

DAKO Envision+ system/rabbit HRP DAKO Deutschland GmbH, Hamburg

DC Protein Assay Kit™ Bio-Rad Laboratories, München

DCS Supervision, 2-Schrittpolymersystem, DCS, Hamburg

Ziege

DilLDL 200ug/ml Harbor Bio-Products, USA

Di-Natriumhydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merck KGaA, Darmstadt

DMEM/Ham’s F12 PAA Laboratories GmbH, Cölbe

dNTP (10nM) Promega GmbH, Mannheim

Dulbecco’s PBS (10x) without Ca+Mg PAA Laboratories GmbH, Cölbe

EBM MV2 Promo Cell GmbH, Heidelberg

EDTA Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

Epidermal growth factor, human Biomol GmbH, Hamburg

Recombinant (50349.1000)

- 147 -

Ethidiumbromidlösung (1%) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

Eosin G Merck KGaA, Darmstadt

Ethanol, vollständig vergällt SAV, Liquid Production GmbH,

Eukitt® O. Kindler GmbH, Freiburg

Fetales Kälberserum PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Formaldehylösung min. 37% säurefrei Merck KGaA, Darmstadt

Glutamin PAA Laboratories GmbH, Cölbe

GoScript™ Reverse Transcription System Promega GmbH, Mannheim

Go TaqHotStart polymerase (5u/µl) Promega GmbH, Mannheim

5x Green Go Taq reaction buffer Promega GmbH, Mannheim

Hämatoxylin Merck KGaA, Darmstadt

Hank’s BSS with/without Ca+Mg PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Hoechst 33342 Life Technologies GmbH,

Darmstadt

H2O2 (30%) Merck KGaA, Darmstadt

Insulin-like Growth Factor-1, human Biomol GmbH, Hamburg

recombinant (50356, 100)

Insulin-like Growth Factor-2, Biomol GmbH, Hamburg

human recombinant (50342.10)

ImPromII 5x Reaction buffer Promega, Mannheim

ImPromII Reverse Transcriptase Promega, Mannheim

Isopropanol Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

Leupeptin (L2884) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen bei München

L-Glutamine 200mM PAA Labortaories GmbH, Cölbe

Loading Dye (6x) MBI-Fermentas, St. Leon-Rot

LPS, E. coli O55:B5 Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri

MgCl2 Promega, Mannheim

Methanol Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

Milchpulver, blotting grade (fettarm) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

MTT SigmaAldrich, Germany

- 148 -

Natriumchlorid Fluka-Chemie, neu-Ulm

NP-40 (Nonidet p-40) AppliChem, Dramstadt

Paraffin, Leica SurgiPath Paraplast Leica Biosystems GmbH, Illinois, USA

PBS PAA, Austria

Penicillin/Streptomycin PAA, Austria

Pepstatin A2205 AppliChem GmbH, Darmstadt

Pferdeserum eigene Gewinnung, in 30min (56°C)

inaktiviert anschließend bei

eingefroren (-21°C) bis Gebrauch

Physiologische NaCl-Lösung Braun, Meldungen

Phosphatase-Inhibitor-Mix P0044 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen bei München

Primer Eurofins MWG, Operon, Ebersberg

Proteinmarker SDS7B Sigma Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen bei München

Random Primers (3µg/µl) Life Technologies GmbH, Darmstadt

Release® Pentobarbital WDT, Garbsen

RNAsin (2,500U) Promega, Mannheim

Super Signal® West Dura Trail Kit Thermo Scientific, Illinois, USA

SV Total RNA Isolation system Promega GmbH, Mannheim

SYBR Green PCR MasterMix Applied Biosystems, Life

Technologies, USA

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide Sigma Aldrich Chemie GmbH,

97,5% TLC Taufkirchen bei München

TRIS (Base) Pufferan® Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

TRIS (HCL) Pufferan® Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

Trypsin (10x) PAA, Austria

Xylol SAV Liquid Production GmbH,

Flintsbach

- 149 -

Ziegenserum (Normal Goat Serum) eigene Gewinnung, in 30min (56°C)

inaktiviert anschließend bei

eingefroren (-21°C) bis Gebrauch

- 150 -

9.4. Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterialien Bezugsquelle

12-well-Platte Greiner Bio-One GmbH,

Frickenhausen

24-well-Platte TPP Techno Plastic Products AG,

Trasadingen, Schweiz

96-well-Platte TPP Techno Plastic Products AG,

Trasadingen, Schweiz

Aufbewahrungsboxen für Paraffinblöcke Medite Medizinprodukte, Burgdorf

Blot absorber Filterpapier (1mm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Cell scraper (Policeman) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen bei München

Cell Star Cell Culture Plate 12 well Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen

Cell Star Tubes (15ml/50ml) Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen

Deckgläschen (24x33mm) Knittel, Braunschweig

Einbettungskapseln Jet Aktiv Flo™ Leica Biosystems GmbH, Illinois, USA

Routine I embedding capsules

HistoBond® adhesive Objektträger Paul Marienfeld GmbH & Co. KG,

Lauda-Königshofen

Handschuhe Nobaglove Nitril® Puderfrei NOBA Verbandmittel Danz GmbH,

Wetter

MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems, Life

Technologies, USA

Microtome Blades S 35 Type FEATHER, Japan

Pipettenspitzen für Biohit-Pipetten:

Pipetten 0,1-3µl und 0,5-1µl: Kisker, Biotech, Steinfurt

A300S Quali Filterpipettenspitzen

DNAse/RNAse-frei

- 151 -

Pipetten 10-100µl: Kisker, Biotech, Steinfurt

Spitzen 250µl,

DNAse/RNAse-frei

Pipetten 100-1000µl: Kisker, Biotech, Steinfurt

Spitzen 1000µl

DNAse/RNAse-frei

Plastibrand PCR-Tubes 1,5ml, transparent Brandt GmbH, Wertheim

Zellkulturflasche 150 cm² TPP Techno Plastic Products AG,

Trasadingen, Schweiz

Zellkulturflasche 75 cm² TPP Techno Plastic Products AG,

Trasadingen, Schweiz

Zellkulturschalen (60x15mm) TPP Techno Plastic Products AG,

Trasadingen , Schweiz

Zellkulturtestplatte (96 Wells/24 Wells) TPP Techno Plastic Products AG,

Trasadinegn, Schweiz

9.5. Geräte

Geräte Bezugsquelle

Bio-Vision-3026 WLI26M Vilber-Lourmat, Eberhardzell

+ Software VisionCapt

Cell Observer System (Zeiss MicroImaging) Carl Zeiss AG, Oberkochen

+ Software AxioVision

ELISA Reader Thermo Multiskan ThermoFisher Scientific Inc., USA

+ Software Ascent for Multiskan

- 152 -

Biorad SmartSpec™ Plus Spectrometer Bio-Rad Laboratories GmbH

Einbettungsautomat Leica ASP 300S Leica Biosystems GmbH, Nussloch

Elektrophorese- und Blottingapparatur Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Mini-Sub Cell GT Cell,

Gießkammer und Kamm

Fusion SL Chemiluminescence Vilber-Lourmat, Eberhardzell

Documentation 3500 WL

HandyStep® Multistep Pipette Brand GmbH, Wertheim

Heizblock Mixing Block MB-120 Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch

Oldendorf

Heraeus Fresco 17 Zentrifuge Andreas Hettich GmbH & Co. KG,

Tuttlingen

Kühlplatte EG1150C Leica Instruments GmbH, Nussloch

Labor-ph-Meter 766 Calimatic® Knick Elektronische Messgeräte

GmbH&Co. KG, Berlin

Laborwasseraufbereitungsanlagen:

Miele Aqua Purificator G7795 mit Miele&Cie. KG, Gütersloh

Patrone E310

Ionenaustauscher (VE-Wasser-Patrone) Landgraf Laborsysteme, Langenhagen

Leica LMD 7000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar

+ Software Leica Application Suite

Magnetrührer MR Hei-Standard Heidolph Instruments GmbH&Co. KG,

Schwabach

Microtom Leitz 1512 Leica Instruments GmbH, Nussloch

Mikroskop-Kamera DFC310FX Leica Microsystems GmbH, Wetzlar

Mini-Protean Tetra Cell electrophoresis Bio-Rad Laboratories GmbH, München

System

Mixing Block MB 120 Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch

Oldendorf

Neubauer-Zählkammer Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe

Pipetten von Biohit: Biohit Deutschland GmbH, Rosbach

- 153 -

0,1-3µl

0,5-10µl

10-100µl

100-1000µl

Power Supply PowerPac™ Basic für Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Elketrophorese

Reagenzglasschüttler – IDL RS1 Landgraf Laborsysteme, Langenhagen

PCR-Cycler PeqStar 96 Universal Gradient PEQLAB Biotechnologie GmbH,

Erlangen

Plattformschüttler Promax 1020 Heidolph Instruments GmbH%Co. KG,

Schwabach

Plattformschüttler CAT S20 Landgraf Laborsysteme, Langenhagen

UV-Transluminator Bio-Vision-3026 mit Vilber-Lourmat, Eberhardzell

Bildbearbeitungssoftware VisionCapt

Waage TE 313S Sartorius AG, Göttingen

Zentrifuge Heraeus Fresco 17 ThermoFisher Scientific Inc., USA

- 154 -

9.6. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Übersicht Uterus Rind (HE) Seite 4

Abb. 2 Übersicht Plazenta Rind (HE) Seite 7

Abb. 3 Darstellung des IGF-Systems mit Liganden, Seite 20

Rezeptoren und IGFBPs

Abb. 4 Expression von IGFBPs bei F3/Fibroblasten Seite 54

und BCEC/BUVEC

Abb. 5 Expression von IGF1, IGF2, IGF1R und Seite 55

IGF2R bei F3/Fibroblasten und BCEC/BUVEC

Abb. 6 Expression von IRS1, 2, 3 und 4 bei F3, BCEC Seite 56

und Fibroblasten

Abb. 7 Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 58

und EGF bei BCEC

Abb. 8 Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 59

und EGF bei F3 Zellen

Abb. 9 Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 60

und EGF bei Fibroblasten

Abb. 10 Motilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 62

und EGF bei BCEC

Abb. 11 Motilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 63

und EGF bei F3 Zellen

Abb. 12 Motilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 64

und EGF bei Fibroblasten

Abb. 13 Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 65

und EGF bei BUVEC

Abb. 14 Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und Seite 68

p38 MAPK bei BCEC

Abb. 15 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase Seite 69

und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1,

IGF2 und EGF bei BCEC

- 155 -

Abb. 16 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt und Seite70

p38 MAP Kinase bei F3 Zellen

Abb. 17 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase Seite 71

und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1,

IGF2 und EGF bei F3 Zellen

Abb. 18 Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und Seite 72

p38 MAPK bei Fibroblasten

Abb. 19 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt KInase Seite 73

und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1,

IGF2 und EGF bei Fibroblasten

Abb. 20 IRS1-Expression im Plazentom der Seite 78

präpartalen Gruppe

Abb. 21 IRS1-Expression im Plazentom der Seite 79

postpartalen Gruppe

Abb. 22 IRS1-Expression im interplazentomaren Seite 81

Gewebe der präpartalen Gruppe

Abb. 23 IRS1-Expression im interplazentomaren Seite 82

Gewebe der postpartalen Gruppe

Abb. 24 IRS2-Expression im Plazentom der Seite 84

präpartalen Gruppe

Abb. 25 IRS2-Expression im Plazentom der Seite 85

postpartalen Gruppe

Abb. 26 IRS2-Expression im interplazentomaren Seite 87

Gewebe der präpartalen Gruppe

Abb. 27 IRS2-Expression im interplazentomaren Seite 88

Gewebe der postpartalen Gruppe

- 156 -

9.7. Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Verwendete Zellzahlen und Zelllinie im Seite 33

Proliferationsassay

Tab. 2 Konzentrationen der untersuchten Seite 33

Wachstumsfaktoren im MTT-Assay und Live

Cell Imaging

Tab. 3 Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Seite 35

Motilitäts-Assay

Tab. 4 Verwendete Primer Seite 38

Tab. 5 Verwendete Zellzahl/well und Zelllinie für Seite 40

Western Blotting

Tab. 6 Konzentrationen der untersuchten Seite 40

Wachstumsfaktoren im Western Blotting

Tab. 7 Im Western Blotting verwendete Antikörper Seite 42

mit jeweiliger Verdünnung

Tab. 8 In der Immunhistochemie verwendete Seite 52

Primärantikörper

Tab. 9 Übersicht über die Aktivierung verschiedener Seite 74

Signalwege bei F3 Zellen, Fibroblasten und BCEC

Tab. 10 Übersicht über die Expression von IRS1 Seite 89

und IRS2 im PLazentom- Zusammenfassung der

Ergebnisse der prä- und postpartalen Gruppe

Tab. 11 Übersicht über die Expression von IRS1 Seite 90

und IRS2 im interkarunkulären Gewebe-

Zusammenfassung der Ergebnisse der prä- und

postpartalen Gruppe

- 157 -

10. Danksagung

Ich möchte mich bei meiner Doktormutter Prof. Dr. Christiane Pfarrer für die

Überlassung des interessanten Themas und die gewährten Einblicke in die Arbeit in

der Forschung und Lehre sowie die Betreuung bedanken. Vielen Dank auch für die

Aufnahme in die Arbeitsgruppe am Anatomischen Institut. Die gewonnen Erkenntnisse

werden sicherlich nützlich für meine weitere Laufbahn sein.

Auch bei unserer Postdoc Dr. Nina Hambruch möchte ich mich für die

wissenschaftliche Betreuung, schnellen Antworten und die Unterstützung in allen

fachlichen Fragen bedanken.

Ich danke der Firma Pfizer Inc. für die Finanzierung.

Für die Unterstützung im Labor bedanke ich mich bei Doris Walter, Marion Gähle und

Ines Blume. Sie waren eine große Hilfe bei der Durchführung der Versuche.

Bei Dr. Marion Piechotta und Dr. Lars Holzhausen bedanke ich mich für die Betreuung

der Versuchstiere in der Klinik und die durchgeführten Probenentnahmen.

Auch Dr. Hanna Lütkehus und Dr. Sarah Laue gilt mein Dank für die Entnahme und

Aufbereitung der verwendeten Proben.

Mein besonderer Dank gilt Sarah Laue, die mir nicht nur die verschiedensten

Methoden im Labor beigebracht hat und immer mit Rat und Tat zur Seite stand,

sondern auch eine liebe Freundin geworden ist.

Auch bei Eva Wehrmeister und Manon Scheld möchte ich mich für die tolle

gemeinsame Zeit in unserem Büro und die darüber hinaus gewachsene Freundschaft

bedanken. Genauso wie bei meinen Mitdoktoranden Indra Huels, Anja Lang, Carina

- 158 -

Eydt und Hannes Reinhard. Ihr habt alle dazu beigetragen, dass es eine schöne Zeit

war.

Bedanken möchte ich mich auch bei Judith Graß für die großartige Unterstützung

jeglicher Art während der gesamten Zeit der Doktorarbeit und auch schon während

des Studiums. Und natürlich für unsere Freundschaft.

Meiner Familie danke ich für den Rückhalt und die Unterstützung während des

Studiums und der Doktorarbeit, besonders meiner Oma Maria.

Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Mann Marko für die Liebe und

Unterstützung bedanken und natürlich für unsere wunderbaren Kinder.