Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin-like growth factor systems in vitro und der peripartalen Expression von IRS1
und IRS2 im Plazentom und in interplazentomaren Bereichen des Rindes
in vivo
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der
Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Lisa Lenz, geb. Schütte
Helmstedt
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover 1. Gutachterin: Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke Institut für Reproduktionsbiologie Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2015 Diese Arbeit wurde unterstützt von Pfizer Inc.
Für Marko, Frieda und Lennard
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht
2.1. Der bovine Uterus 3
2.2. Die bovine Plazenta 4
2.3. Peri- und postpartale Änderungen in Uterus und Plazenta 7
2.4. Komplikationen im Puerperium 9
2.5. Das IGF-System 11
2.5.1. Liganden des IGF-Systems 13
2.5.1.1. IGF1 14
2.5.1.2. IGF2 15
2.5.2. Rezeptoren des IGF-Systems 15
2.5.2.1. IGF1R 16
2.5.2.2. IGF2R 17
2.5.2.3. HR 18
2.5.3. IGFBPs 19
2.6. Das IGF-System in der Plazenta und im Zusammenhang mit 21
der Fortpflanzung
2.7. IRS-Proteine 26
2.8. EGF 28
3. Material und Methoden
3.1. In vitro Versuche
3.1.1. Zelllinien 29
3.1.2. Isolation BUVEC 29
3.1.3. Kultivierung der Zellen 30
3.1.4. LDL-Färbung 31
3.1.5. Quantifizierung der Zellen 32
3.1.6. Proliferations-Assay 32
3.1.7. Motilitäts-Assay 35
3.1.8. Molekularbiologie 36
3.1.9. Proteinbiochemie 39
3.1.10. Statistische Auswertung 43
3.2. Untersuchung von Proben aus der in vivo Studie
3.2.1. Material und Gewebeentnahme und -aufbereitung 44
3.2.2. Gruppe 1: Proben der präpartalen Phase 44
3.2.3. Gruppe 2: Proben der postpartalen Phase 45
3.3. Histologie 47
3.3.1. Protokoll der Handeinbettung 47
3.3.2. Protokoll der automatischen Einbettung 47
3.3.3. Vorbereitung der Schnitte für Histologie und Immunhistochemie 48
3.3.4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung 49
3.3.5. Immunhistochemie 50
4. Ergebnisse
4.1. Ergebnisse der in vitro Versuche 53
4.1.1. Ergebnisse der RT-PCR 53
4.1.2. Untersuchung des Einflusses von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF 56
und IGF2+EGF auf die Proliferation plazentarer Zellen in vitro
4.1.2.1. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BCEC 58
4.1.2.2. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei F3 Zellen 59
4.1.2.3. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei Fibroblasten 60
4.1.3. Einfluss von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF, EGF und 61
IGF2+EGF auf die Motilität plazentarer Zellen in vitro
4.1.3.1. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BCEC 62
4.1.3.2. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei F3 Zellen 63
4.1.3.3. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei Fibroblasten 64
4.1.3.4. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BUVEC 65
4.1.4. Aktivierung verschiedener Signalwege in plazentaren Zellen in vitro 66
4.1.4.1. Aktivierung des MAPK Kinase 42/44, Akt-Kinase und 66
p38-MAP Kinase Signalweges bei BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten
4.1.4.2. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei BCEC 68
4.1.4.3. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei F3 Zellen 70
4.1.4.4. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei Fibroblasten 72
4.2. Ergebnisse der in vivo Studien 75
4.2.1. Morphologie von interplazentomaren Gewebe und Plazentom 75
4.2.2. Immunhistochemie 76
4.2.2.1. IRS1 76
4.2.2.1.1. IRS1-Expression im Plazentom 77
4.2.2.1.2. IRS1-Expression im interplazentomaren Gewebe 80
4.2.2.2. IRS2 83
4.2.2.2.1. IRS2-Expression im Plazentom 83
4.2.2.2.2. IRS2-Expression im interplazentomaren Gewebe 86
4.2.2.2.3. Zusammenfassung der immunhistologischen 89
Untersuchungen an Plazentom und interkarunkulärem Gewebe
5. Diskussion 91
5.1. Wirkung von IGF1 und EGF 91
5.2. Wirkung von IGF2 und EGF 97
5.3. Expression von IRS1 und IRS2 mRNA in BCEC, F3-Zellen und
Fibroblasten 100
5.4. Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 und IRS2 101
5.5. Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und Vergleich mit 102
IGF1 und IGF2
5.6. Expression von IRS1 und IRS2 im interplazentomaren Gewebe 106
und Vergleich mit IGF1 und IGF2
5.7. Schlussfolgerung 109
6. Zusammenfassung 110
7. Summary 113
8. Literaturverzeichnis 116
9. Anhang 135
9.1. Abkürzungen 135
9.2. Puffer und Lösungen 140
9.3. Reagenzien 146
9.4. Verbrauchsmaterialien 150
9.5. Geräte 151
9.6. Abbildungsverzeichnis 154
9.7. Tabellenverzeichnis 156
10. Danksagung 156
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1. Einleitung
Das insulin-like growth factor (IGF)-System spielt während der Trächtigkeit und auch
post partal beim Rind eine große Rolle. Den einzelnen Komponenten kommen
verschiedene Aufgaben zu. Unter anderem sind sie wichtig für die feto-maternale
Kommunikation, das fetale Wachstum und das der Plazenta, sowie die entsprechende
Nährstoffversorgung des Fetus über die Plazenta (Giudice et al., 1995; Klauwer et al.,
1997; Forbes und Westwood, 2008). Durch die bekannte positive Wirkung des IGF-
Systems auf die Wundheilung (Lynch et al., 1987; Bitar, 1997) ist auch eine Beteiligung
an den Heilungsprozessen des Uterus nach der Geburt denkbar (Piechotta et al.,
2012), auch durch immunmodulatorische Effekte von IGF1 (Vangroenweghe et al.,
2005).
Ein im Puerperium verringerter IGF1-Spiegel im Blut wird mit verzögerter
Uterusinvolution und erhöhten Entzündungsgraden des Uterus in Verbindung gebracht
(Wathes et al., 2007; Wathes et al., 2009; Wathes et al, 2011), postpartale
Erkrankungen sind beim Rind von enormer wirtschaftlicher Bedeutung, weshalb die
genaue Rolle des IGF hierbei geklärt werden soll.
Ein weiterer potenter Wachstumsfaktor dessen positiver Einfluss auf die Plazenta
schon nachgewiesen wurde, ist EGF (Miettinen et al., 1995; Dilly et al., 2010;
Hambruch et al., 2010). Im Rahmen dieser Dissertation soll auch das mögliche
Zusammenwirken dieser beiden Stoffe untersucht werden.
Dafür wurden verschiedene Zelllinien, bovine Karunkelepithelzellen (BCEC),
Trophoblastzellen (F3), Fibroblasten und bovine Endothelzellen der Nabelvene
(BUVEC), aus der bovinen Plazenta gewonnen und der Einfluss von IGF1, IGF2, EGF
und einer Kombination aus IGF1+EGF bzw. IGF2+EGF auf die Proliferation und
Motilität dieser Zellen in vitro analysiert. Weiterhin wurden mit der MAP-Kinase 42/44,
der Akt Kinase und der p38-MAP Kinase mögliche intrazelluläre Signalwege nach
Aktivierung durch bereits genannte Faktoren mittels Western Blot untersucht.
Für eine Kommunikation zwischen IGF und EGF innerhalb der Zelle und eine
Vermittlung der Signale nach IGF-Aktivierung, kommen mit großer Wahrscheinlichkeit
die IRS-Proteine in Frage (Myers et al., 1992; White, 1997; Lassarre und Ricort, 2003;
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O’Connor, 2003). Aus diesem Grund wurde eine Lokalisation der IRS1- und IRS2-
Proteine in Plazenta und Uterus des Rindes, mittels Immunhistochemie,
vorgenommen. Hierfür wurden Proben von Rindern gewonnen, die entweder eine
Sectio caesarea oder eine spontane Geburt erfuhren. Diese wurden außerdem
aufgrund ihrer IGF-Blut-Spiegel in eine IGF-low- und IGF-high-Gruppe eingeteilt. Nach
einer bestimmten Zeitspanne wurde den Tieren eine LPS-Instillation zugeführt und die
Kühe im Folgenden euthanasiert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Bedeutung von IGF, aber auch die
Wechselwirkung von IGF und EGF, in der Plazenta auf. Die in dieser Arbeit
gesammelten Erkenntnisse, zusammen mit dem Nachweis von IRS1 und IRS2 in
Plazenta und Uterus des Rindes, können nach weitergehenden Untersuchungen
möglicherweise eine Diagnostik und Therapie puerperaler, boviner Erkrankungen
ermöglichen.
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2. Literaturübersicht
2.1. Der bovine Uterus
Das Rind weist einen Uterus bicornis auf, der sich nach kranial verjüngende Hörner
besitzt. Diese sind widderhornartig aufgerollt. Kaudal davon liegt das Corpus uteri. Die
Cervix uteri liegt zwischen Vagina und Corpus uteri und ist außer zur Geburt und
während der Brunst verschlossen. Die Schleimhaut des Uterus, welche in Längs- und
Querfalten angeordnet ist, besitzt außerdem eine tierartliche Besonderheit, die
Karunkeln. Diese sind in vier Reihen unregelmäßig angeordnet (Nickel et al., 1987;
Budras, 2002).
Histologisch ist die Gebärmutter in vier verschiedene Schichten einzuteilen. Dem
Lumen anliegend befindet sich die Mukosa (Endometrium). Sie besteht aus einem
einschichtig hochprismatischen Epithel, das teilweise aber auch mehrreihig sein kann,
und der Lamina propria mucosae. In dieser sind die uterinen Drüsen zu finden. Die
Karunkeln stellen knopfförmige, drüsenfreie Bezirke mit einer bindegewebigen
Grundlage in der Mukosa dar, welche sich in der Trächtigkeit vergrößern. Daran
schließt sich die Tunica muscularis (Myometrium) an. Sie besteht aus zwei
Muskelschichten, von denen die innen liegende zirkulär und die äußere longitudinal
verläuft. Es folgt die Tela subserosa und anschließend die Tunica serosa
(Perimetrium) (Liebich, 2010).
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Abb. 1: Übersicht Uterus Rind (HE). Abgebildet sind die Mukosa mit Stratum compactum (A) und luminalem Epithel (Pfeil) und das Stratum reticulare (B) mit den uterinen Drüsen (gelber Pfeil) sowie das Myometrium (C). Messbalken: 50µm.
2.2. Die bovine Plazenta
Säugetiere bilden während der Trächtigkeit die Plazenta, ein temporäres Organ, aus.
Sie entsteht an den Kontaktstellen der fetalen Membranen mit der Mukosa des Uterus
und ermöglicht den fetomaternalen Austausch (Leiser und Kaufmann, 1994). Neben
dieser entscheidenden Aufgabe ist sie auch in der Lage unterschiedliche Stoffe wie
Hormone (Schlafer et al., 2000; Sousa et al., 2008) oder auch Wachstumsfaktoren
(Richterich, 2008) zu sezernieren. Es sind zwei Anteile der Plazenta zu unterscheiden,
die Pars fetalis, welche vom mit Zotten besetzten Chorion gebildet wird, und die Pars
maternalis, die durch das Endometrium der uterinen Karunkel gebildet wird (Michel,
1995). Beim Rind formen beide Anteile zusammen etwa 80-140 Plazentome. Zwischen
diesen liegen die interkotyledonären Bereiche. An diesen Stellen weist das Chorion
nur eine dünne Membran mit atrophierten Zotten auf, die der Mukosa des Uterus
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gegenüberliegt und auch als Chorion laeve bezeichnet wird (Leiser und Kaufmann,
1994). Deshalb wird von einer Placenta cotyledonaria sive multiplex gesprochen
(Strahl, 1906; Grosser ,1927). Allerdings wird auch in gewissem Maße über das
Chorion laeve ein fetomaternaler Austausch ermöglicht (Leiser und Kaufmann, 1994).
Die verzweigten Zottenbüschel der Kotyledone, die im gegenüberliegenden
maternalen Gewebe, den Krypten der Karunkel liegen, haben zur Klassifikation als
villöser Plazentatyp geführt (Steven, 1975; Kaufmann, 1981; Wooding, 1992). Die
Zotten bestehen aus vaskularisiertem Mesenchym (Grosser, 1927), welches mit einer
Zellschicht aus Trophoblastektoderm überzogen ist (Björkmann und Sollen, 1960). In
den maternalen Krypten ist ein gut vaskularisiertes Bindegewebe zu finden, welches
von einem einschichtigen, kubischen Epithel bekleidet wird (Björkmann und Sollen,
1960). Gegenüberliegendes Kryptenepithel und Trophoblasten tragen jeweils Mikrovilli
und stehen in engem Kontakt. Dies führt zu einer Vergrößerung der Kontaktfläche
zwischen fetalen und maternalen Gewebeanteilen (Björkmann und Bloom, 1957). Die
wohl bekannteste Klassifizierung der Plazenta erfolgt nach Grosser (1909; 1927).
Hierbei werden die verschiedenen Schichten herangezogen, die fetales und
maternales Blut voneinander trennen. Das Rind wird hier prinzipiell zum
epitheliochorialen Typ gezählt, da alle sechs Gewebsschichten, die für die
Klassifizierung wichtig sind, vorhanden sind. Dazu gehören das maternale Epithel,
Bindegewebe und Endothel sowie fetales Epithel/Trophoblasten, Bindegewebe und
Endothel. Bei einer epitheliochorialen Plazenta liegt das Chorion also einer fast
intakten uterinen Mukosa an, ohne endometriale Invasion, mit den entsprechenden
Folgen für den Stoffaustausch zwischen Muttertier und Fetus. Bei den Wiederkäuern
kommt es allerdings zu einer geringgradigen Invasion. Spezielle Trophoblastzellen, die
Trophoblast giant cells (TGC) oder auch binukleäre Riesenzellen (BNC) genannt,
fusionieren mit dem maternalen Epithel zu feto-maternalen Hybridzellen, die per
definitionem Synzytien sind (Wooding, 1992; Leiser und Kaufmann, 1994; Schlafer et
al., 2000). Dieses spezielle Charakteristikum hat zur einer weiteren Spezifizierung als
synepitheliochoriale Plazenta geführt (Wooding, 1992). Die TGC haben große
Granula, die mehr als die Hälfte des Volumens ausmachen können. In diesen Granula
sind verschiedene Proteine und Glykoproteine gespeichert, wie z.B. das plazentare
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Laktogen (Wooding, 1992). Die ersten TGC sind kurz vor der Implantation
nachzuweisen (Leiser, 1975; Wooding, 1984) und sie machen etwa 15-20% der fetalen
Epithelzellen aus. Trotz ihres mikroskopisch gleichen Erscheinungsbildes sind
verschiedene Subpopulationen von binukleären Trophoblasten bekannt (Munson,
1989; Jones et al., 1994;). Ein bis zwei Tage vor der Geburt kommt es zu einem
starken Absinken der Anzahl an TGC (Wooding, 1984). Die Aufgabe der TGC ist
einerseits fetomaternale Synzytien zu bilden und andererseits die Produktion und
Abgabe verschiedener steroidaler Hormone (Reimers et al., 1985; Wooding, 1992;
Matamoros et al., 1994; Roberts et al., 1995). Es ist auch bekannt, dass TGC eine
Reihe von Wachstumsfaktoren exprimieren wie z.B: FGF-1, -2 und -7 (Pfarrer et al.,
2006 a), VEGF (Pfarrer et al., 2006 b) oder PAF (Bücher et al., 2006). Es wird vermutet,
dass der Vorgang der Fusion und die spezifischen Produkte für eine erfolgreiche
Implantation und ein entsprechendes Wachstum der Plazentome wichtig sind.
Die Form der Plazenta beeinflusst auch die plazentare Separation während/nach der
Geburt. Die Trennung erfolgt entlang der fetomaternalen Kontaktfläche, wodurch das
maternale Gewebe zu weiten Teilen intakt bleibt und die größtenteils fetale Plazenta
ohne großen Gewebsverlust oder Blutungen ausgeschieden wird (Leiser und
Kaufmann, 1994). Damit gehört das Rind zu den „Adeciduata“. Nach Huxley (1864)
wird diese Form der Plazenta auch als Plazenta apposita oder nach Strahl als
Semiplazenta (Strahl, 1906) bezeichnet.
Eine weitere Form der Einteilung betrifft die Anordnung von maternalen und fetalen
Blutgefäßen zueinander und die vorherrschende Blutflussrichtung. Dies bestimmt die
Effizienz des Sauerstoffaustauschs zwischen Muttertier und Fetus und beeinflusst so
auch die Relation zwischen Gewicht der Plazenta und des Fetus (Leiser und
Kaufmann, 1994). Es wurde zunächst angenommen, dass es bei den Wiederkäuern
einen so genannten multivillösen Blutfluss gibt, der nur zu einem gewissen Grad ein
Gegenstromprinzip aufweist, sonst aber zwischen Parallelstrom und
Gegenstromprinzip anzusiedeln ist (Dantzer et al., 1988). Neuere Arbeiten ergaben
jedoch, dass im 3./4. Monat der Trächtigkeit das Gegenstromprinzip vorherrscht. Vom
mittleren Drittel bis zum Ende spielt diese Art des Blutaustausches immer noch die
größte Rolle. Mit der Entwicklung der tertiären Krypten und der entsprechenden
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interdigitierenden Zotten, erfolgt der Blutaustausch in den Kapillaren dieser Bereichen
nach dem Querstromprinzip (Pfarrer et al., 2001).
Abb. 2: Histologischer Schnitt der Rinderplazenta (HE). Zu erkennen sind sowohl die fetalen Zotten mit uninukleären Trophoblasten (blauer Pfeil), TGC (schwarzer Pfeil) und fetalem Mesenchym (F), als auch die Pars maternalis, die Krypten, mit maternalen Epithelzellen (grüner Pfeil) und Stroma (M). Die Länge des Messbalkens entspricht 50µm
2.3. Peri- und postpartale Änderungen in Uterus und Plazenta
Während der Trächtigkeit, welche beim Rind 285 Tage dauert (Grosser, 1927), kommt
es zu erheblichen Veränderungen auf maternaler aber auch fetaler Seite des
Kontaktbereiches zwischen Muttertier und Fetus. Etwa in der vierten
Trächtigkeitswoche kommt es zur Kontaktaufnahme zwischen Chorioallantois und
dem Endometrium. Am engsten wird diese Verbindung im Bereich der Karunkeln. Die
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Chorioallantois bildet auf der den Karunkeln gegenüberliegenden Fläche die
Kotyledonen aus, welche mit ihren Zotten in die Oberfläche der Karunkeln hineinragen
und somit die Kontaktoberfläche vergrößern. Im Verlauf der Trächtigkeit nehmen die
Plazentome an Größe zu, sie werden bis zu 12cm lang und 2-3cm dick. In dem
tragenden Uterushorn sind sie deutlich größer als im nicht tragenden (Schlafer et al.,
2000).
Gegen Ende der Trächtigkeit kann das maternale Epithel in einigen Krypten abflachen,
atrophieren oder auch komplett fehlen (Björkmann und Sollen, 1960). Andererseits ist
es aber auch möglich, dass sich zu diesem Zeitpunkt Plasmodien ausbilden, welche
10-20 Kerne besitzen können (Björkmann, 1954).
Bei der Geburt kommt es zur Ablösung der fetalen Membranen. Damit ein
physiologischer Nachgeburtsabgang stattfinden kann, ist eine abgeschlossene
Reifung der Plazenta Voraussetzung (Paisley et al., 1986). Der dafür notwendige
Lösungsprozess beginnt bereits in den letzten Monaten der Gravidität (Grunert et al.,
1983). Dazu zählt unter anderem das bereits erwähnte Abflachen des maternalen
Epithels, aber auch ein Umbau der bindegewebigen Grundlage der Plazentome
(Schulz und Merkt, 1956). Welche Mechanismen aber genau ausschlaggebend sind,
ist immer noch nicht endgültig geklärt (Schlafer et al., 2000; Dilly et al., 2011; Shenavai
et al., 2012). Nach dem Abgang der Nachgeburt, also den fetalen Anteilen der
Plazenta, sind die Karunkeln als bindegewebiges System zurückgeblieben, die
Krypten sind meist leer und kollabiert (Björkmann und Sollen 1969), können aber auch
verbliebene Reste der fetalen Anteile enthalten. Diese werden phagozytiert und gehen
im weiteren Verlauf, als physiologischer Prozess, mit den Lochien ab. Die
oberflächlichen Anteile der Karunkel werden ebenfalls mit den Lochien abgestoßen
(Archbald et al., 1972). In den ersten Tagen post partum kommt es außerdem, durch
Vasokonstriktion bedingt, zu Nekrosen in den Karunkeln und damit einhergehend zu
Nekrosen und einer Desorganisation des Gewebes. Dies wiederum führt zur
Einwanderung von Leukozyten (Gier und Marion, 1968) und der vorangehend
beschriebenen Abschilferung in der Karunkel.
Wird die Nachgeburt nicht in einem bestimmten Zeitfenster abgestoßen, wird von einer
Nachgeburtsverhaltung/Retentio secundinarum gesprochen. Für einige Autoren ist
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dies nach 12 Stunden der Fall (Herschler und Lawrence, 1984; Borsberry und Dobson,
1989; Eiler und Hopkins, 1993) für andere wiederum erst nach 24 Stunden (Holt et al.,
1989; Brooks, 2001; Drillich et al., 2003).
Während der ersten Woche post partum kommt es zu Kontraktionen des Uterus, die
dafür sorgen, dass noch verbliebene Reste fetaler Membranen und Flüssigkeiten mit
den Lochien ausgestoßen werden (Sheldon et al., 2009). Im folgenden Verlauf findet
eine Ausheilung statt, wobei unterschiedliche Angaben zur Dauer existieren, sie
reichen von 19 Tagen (Archbald et al., 1972) bis zu mindestens 25 Tagen (Gier und
Marion, 1968). Während der Heilungs- und Rückbildungsphase des Uterus kommt es
zu einer Ödembildung. Die Involution des Uterus ist in der Regel 40 Tage post partum
abgeschlossen, während die endgültige Wiederherstellung nach histologischer
Kontrolle erst nach 50 Tagen erreicht wird (Gier und Marion, 1968).
2.4. Komplikationen im Puerperium
Zu den möglichen Erkrankungen des Uterus post partum zählen beim Rind die
puerperale Metritis, Pyometra und die Endometritis. Diese können die Fertilität
erheblich beeinflussen (Sheldon et al, 2009).
In der Gravidität ist der Uterus steril, aber post partum ist die Wahrscheinlichkeit einer
Kontamination des Uterus mit Bakterien sehr groß, da sonst vorhandene
Schutzmechanismen zu diesem Zeitpunkt nur eingeschränkt vorhanden sind (Singh et
al., 2008; Sheldon et al., 2008). Etwa 80-100% aller Kühe weisen, in den ersten zwei
Wochen nach dem Kalben, Bakterien im Uteruslumen auf. Auch wenn bei einem
Großteil der Tiere das Immunsystem eine Erkrankung verhindern kann, kommt es
immer noch bei bis zu 40%, innerhalb von drei Wochen post partum, zu einer
bakteriellen Infektion des Uterus. Eine Nachgeburtsverhaltung stellt ein großes Risiko
für folgende Infektionen des Uterus dar (Sheldon et al., 2008).
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Da verschiedene klinische Definitionen zu den Uteruserkrankungen vorlagen, wurde
von Sheldon et al. (2006; 2008) eine einheitliche Nomenklatur zur besseren
Differenzierung und Therapie vorgeschlagen.
Die puerperale Metritis bezeichnet eine akute, systemische Erkrankung, welche durch
eine bakterielle Uterusinfektion bedingt ist. Sie tritt in den ersten zehn Tagen post
partum auf. Tritt in den 21 Tagen nach der Geburt purulenter Ausfluss mit einem
vergrößerten Uterus einhergehend auf, wird dies als klinische Metritis bezeichnet.
Hierbei sind meist keine weiteren Symptome erkennbar und das Allgemeinbefinden ist
ungestört.
Die klinische Endometritis zeichnet sich nach Sheldon durch purulenten, bzw.
mukopurulenten Ausfluss nach dem 21. Tag post partum aus, ohne dass systemische
Symptome vorliegen.
Die subklinische Endometritis kann durch zytologische Untersuchungen
nachgewiesen werden und stellt eine Entzündung des Endometriums dar, mit
signifikanter Reduktion der Fertilität. Es ist in diesem Fall kein purulentes Material in
der Vagina nachzuweisen. Ausschlaggebend ist der Zeitpunkt und die Anzahl
vorhandener neutrophiler Granulozyten.
Als Pyometra wird ein Zustand beschrieben, bei dem es zu einer Ansammlung von
purulentem oder auch mukopurulentem Exsudat in der Gebärmutter kommt, der mit
einer Erweiterung des Uterus und einem aktiven Corpus luteum einhergeht. Die Zervix
ist zu diesem Zeitpunkt funktionell verschlossen, es ist aber dennoch möglich, dass
durch eine kleine Öffnung purulentes Material in die Vagina gelangt und dort sichtbar
wird (Sheldon et al., 2006, Sheldon et al., 2008; Sheldon et al., 2009).
Infektionen des Uterus spielen eine wichtige Rolle, denn sie können unter anderem zu
Infertilität oder systemischen Erkrankungen führen und sich insgesamt negativ auf die
Reproduktion auswirken (Gilbert et al., 2005; Lincke et al., 2007; Sheldon et al., 2009;
Turner et al., 2012). Bedingt durch die Erkrankung des Uterus sinkt die
Wahrscheinlichkeit einer Ovulation, denn die Ovarfunktion ist eingeschränkt.
Außerdem kommt es zu einer geringeren Östradiol Konzentration im Plasma und einer
Dysregulation von Hypothalamus und Hypophyse. Auch die Lutealphase ist verlängert.
Insgesamt haben etwa 50% aller Milchkühe abweichende Zyklen in der postpartalen
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Phase (Sheldon, 2009). Nach LeBlanc (2008) erkranken 15-20% der
Hochleistungsmilchkühe an klinischer und 30% an subklinischer Endometritis
(LeBlanc, 2008). Um aber das Zwischenkalbeintervall möglichst kurz halten zu
können, muss der Genitaltrakt sowohl anatomisch als auch funktionell wieder den
intakten Zustand erreichen (Mateus et al., 2002). Die Zwischenkalbezeit sollte nach
wirtschaftlichen Maßstäben bei 12-13 Monaten liegen, folglich müsste die Kuh 80-110
Tage post partum wieder trächtig werden (Bretzlaff, 1987). Dies kann aber nur erreicht
werden, wenn keine Erkrankungen des Uterus im Puerperium auftreten.
In der peripartalen Phase weist die Mehrheit der Milchkühe eine negative
Energiebalance auf, während der verschiedene Parameter der Fett- und
Proteinmobilisation verändert sind. Kühe, die eine Erkrankung des Uterus aufweisen,
sind hiervon noch stärker betroffen, da sie weniger Trockenmasse aufnehmen, als
klinisch gesunde Tiere (Wathes et al., 2007). Diese Veränderungen beeinflussen die
Immunabwehr und in der Folge auch das Entstehen von Infektionen im Uterus, die
wiederum mit unter anderem verschlechterter Fertilität einhergehen (Cai et al., 1994;
Sheldon et al., 2004). Die metabolischen Veränderungen post partum mit der
negativen Energiebalance führen zu einer Entkopplung der Growth Hormone (GH)-
Insulin-like growth factor (IGF) Achse, was zur Folge hat, dass der IGF1-Spiegel im
Blut sinkt. Dieser Vorgang wird mit einer Verzögerung der Uterusinvolution,
schlechterer Heilung und erhöhten Entzündungsgraden des Uterus in Verbindung
gebracht (Wathes et al., 2007; Wathes et al., 2009; Wathes et al., 2011). Auch
präpartal verringerte IGF1-Werte scheinen auf ein erhöhtes Risiko post partaler
Erkrankungen hinzudeuten (Piechotta et al., 2012). Die Liganden des IGF-Systems
sind als potente Faktoren in der Wundheilung bekannt (Lynch et al., 1987; Bitar, 1997).
Auch als Immunmodulatoren scheinen sie als ein wichtiger Faktor bei der
Verhinderung und Bekämpfung uteriner Erkrankungen post partum denkbar
(Vangroenweghe et al., 2005). Ebenfalls denkbar ist ein Einfluss von MMPs (Matrix-
Metallo-Proteinasen) bei der Involution und Heilung des Uterus nach der Geburt
(Wathes et al., 2011).
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2.5. Das IGF-System
Das Insulin-like growth factor System besteht aus zwei Liganden, dem Insulin-like
growth factor 1 (IGF1) und dem Insulin-like growth factor 2 (IGF2), den Insulin-like
growth factor binding proteins (IGFBPs) sowie den spezifischen Zelloberflächen-
Rezeptoren Insulin-like growth factor Rezeptor 1 (IGF1R) und Insulin-like growth factor
Rezeptor 2 (IGF2R). Weiterhin können auch der Insulin Rezeptor (IR) und der Insulin-
Hybrid Rezeptor (HR) die Wirkung der Liganden vermitteln. In den folgenden
Abschnitten werden die einzelnen Bestandteile näher erläutert.
Erste Hinweise auf das IGF-System finden sich in der „Somatomedin-Hypothese“. Ziel
dieser Versuche war es, zu verstehen, wie das somatische Wachstum durch Faktoren
aus der Hypophyse beeinflusst wird. Dabei stellte sich heraus, dass dort produziertes
Growth hormone (GH) nicht direkt das Wachstum der Zielorgane beeinflusst, sondern
dass eine zwischengeschaltete Substanz wie ein endokrines Hormon oder ein
Wachstumsfaktor nötig ist (Salmon und Daughaday ,1957). Dieser Wirkstoff wurde als
Somatomedin bezeichnet, um deutlich zu machen, dass er die Wirkung von GH, das
auch als Somatropin bezeichnet wird, vermittelt. Später erfolgte eine Einteilung der
Somatomedine und die, die GH-Wirkung mediierende Substanz, wurde als
Somatomedin C bezeichnet. Etwa 20 Jahre später wurden IGF1 und IGF2 das erste
Mal charakterisiert und es wurde bewiesen, dass IGF1 dem Somatomedin C entspricht
(Rinderknecht und Humbel, 1978). Sie wurden als „insulin-like“ benannt, da sie
genauso wie Insulin in der Lage sind, die Aufnahme von Glukose in Fett- und
Muskelzellen zu stimulieren (Randle, 1954).
Zu dieser Zeit wurde davon ausgegangen, dass IGFs vornehmlich als
Wachstumsfaktoren wirken, auch wenn ihre Ähnlichkeit zu Insulin metabolische
Funktionen nahe legte. In der zu dieser Zeit noch gängigen ursprünglichen
„Somatomedin-Hypothese“ hieß es, dass das in der Hypophyse gebildete GH vor allen
Dingen die Leber beeinflusse, welche daraufhin IGF1 synthetisiere und ausschütte.
Dieses sollte dann zu den Zielorganen zirkulieren und somit seine endokrine Wirkung
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vermitteln (Le Roith et al., 2001). Versuche an Rindern, denen bovines Somatotropin
(bST) injiziert wurde, bestätigten diese Hypothese. Das bST führte sowohl in der
Laktation, als auch während der Trockenstehphase zu einem Anstieg von IGF1 im
Serum. Die Konzentration von IGF2 im Serum hingegen wurde nur während der
Trockenstehphase durch bST-Applikation gesteigert, nicht während der Laktation
(Vicini et al., 1991). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen von Bilby et. al., in
denen gezeigt wurde, dass die Verabreichung von rekombinantem bovinen GH (rbGH)
zu einem Anstieg des Blut-IGF1 Gehaltes führte (Bilby et al., 1999).
Weitere Experimente zeigten allerdings, dass IGF1 in zahlreichen Organen
synthetisiert und auch durch verschiedene lokale und endokrine Faktoren beeinflusst
wird (D’Ercole et al., 1980; Le Roith et al., 2001).
Dies führte zu einer modifizierten Form der „Somatomedin-Hypothese“. Der Nachweis
der Expression des IGF1-Gens in verschiedenen Geweben prä- und postnatalen
Ursprungs bestärkte die Annahme, dass IGF1 eine wichtige Rolle in der Regulation
des Wachstums verschiedener Zellen und Gewebe spielt. Dabei kann es lokal auf
parakrine und autokrine Weise Einfluss ausüben (Roberts et al., 1987; Han et al.,
1988).
Alle diese Erkenntnisse finden sich in der „alternativen Somatomedin-Hypothese“
wieder. Diese beschreibt, dass sowohl endokrines IGF1, als auch lokal produziertes
IGF1 auf GH reagieren und dessen Effekte vermitteln. Allerdings wird hier auch die
Möglichkeit in Betracht gezogen, dass sowohl GH, als auch IGF1 unabhängig
voneinander, positiv das Wachstum beeinflussen können (Le Roith et al., 2001).
2.5.1. Liganden des IGF-Systems
Die Liganden IGF1 und IGF2 sind sequenzhomologe, einzelkettige Polypeptide mit
großer struktureller Ähnlichkeit (50% homolog) zu Pro-Insulin (Le Roith et al., 2001).
Beide können die Aufnahme von Glukose in Fett- und Muskelzellen stimulieren
(Rinderknecht und Humbel, 1978). Die Aminosäuresequenz des bovinen IGF1
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entspricht der des humanen IGF1, wohingegen bovines IGF2 sich in drei
Aminosäureresten von der humanen Variante unterscheidet (Honegger und Humbel,
1986).
Beim Rind konnte die Expression der IGFs in verschiedenen Organsystemen
nachgewiesen werden. Unter anderem im Reproduktionstrakt (Geisert et al., 1991;
Kirby et al., 1996; Ohtani et al., 1996; Wathes et al., 1998; Robinson et al., 2000; Meikle
et al., 2001; Pershing et al., 2002; Pushpakumara et al., 2002; Llewellyn et al., 2007;
Fenwick et al., 2008; Rhoads et al., 2008), in unterschiedlichen fetalen (Farin et al.,
2010) und embryonalen Geweben (Moore et al.,2007) wie auch in der Leber (Fenwick
et al., 2008; Rhoads et al., 2008).
2.5.1.1. IGF1
Für IGF1 sind zahlreiche unterschiedliche Funktionen im Organismus beschrieben und
aufgrund der Vielfalt ist zu erkennen, dass es eine wichtige Rolle bei vielen
verschiedenen Prozessen spielt.
In vitro spielt dieser Wachstumsfaktor eine große Rolle bei der DNA-Synthese und
Zellreplikation. Er kann als Progressions-Faktor im Zell-Zyklus bezeichnet werden,
dessen Aktivität zu DNA-Synthese und Zellproliferation führt. Außerdem kann IGF1
den Zelltod verhindern, die Zelldifferenzierung fördern und verschiedene Zellen zur
Hormonsekretion anregen (Jones und Clemmons, 1995).
Auch in vivo gibt es eine Vielzahl von beschriebenen Wirkungen für IGF1. Unter
anderem wurde in Studien festgestellt, dass es nach IGF1-Infusionen zu
Hypoglykämie durch Stimulation der Glukose-Aufnahme kommt (Rossetti et al., 1991).
Anabolische Effekte wie eine Beeinflussung der Protein-Synthese und der Stickstoff-
Balance wurden ebenfalls nachgewiesen (Jones und Clemmons, 1995).
Versuche mit Mäusen die IGF1-Null-Mutationen aufwiesen zeigten, dass in diesem
Fall eine erhöhte neonatale Todesrate vorhanden war und die Tiere nur 60% des
normalen Geburtsgewichts hatten. Mäuse, die eine Null-Mutation für sowohl IGF1 als
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auch IGF2 aufwiesen, hatten nur noch 30% des normalen Geburtsgewichts und
starben innerhalb einiger Minuten post partum (Baker et al., 1993). Da IGF1 in so
vielen verschiedene Geweben im Körper produziert wird und an unterschiedlichen
Stoffwechselprozessen beteiligt ist, liegt auch eine Beteiligung an der Entstehung
vieler Krankheiten, wie unter anderem IUGR (intrauterine growth restriction),
neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes oder auch malignen Veränderungen
nahe (Monzavi und Cohen, 2002; Cohen, 2006).
2.5.1.2. IGF2
Durch die Sequenzierung eines zweiten, bioaktiven insulin-like Moleküls, das in seiner
Struktur ähnlich zu IGF1 war, wurde IGF2 entdeckt und benannt (Rinderknecht und
Humbel, 1978).
Bei Versuchen, in denen IGF2-Null-Mutationen bei Mäusen untersucht wurden, zeigte
sich, dass diese Tiere nur 60% des üblichen Geburtsgewichts hatten, aber eine
normale Überlebensrate. Das plazentare Wachstum bei diesen Tieren war außerdem
reduziert und schien unabhängig von IGF1 und IGF1R zu sein (Baker et al., 1993).
2.5.2. Rezeptoren des IGF-Systems
Die Liganden des IGF-Systems können an verschiedene Rezeptoren mit
unterschiedlicher Affinität binden. Dazu gehören der Insulin-like growth factor receptor
1 (IGF1R), der Insulin-like growth factor receptor 2 (IGF2R), der Insulin Rezeptor (IR)
und der Insulinhybrid Rezeptor (HR).
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2.5.2.1. IGF1R
Dieser Rezeptor besteht aus einer extrazellulären α-Untereinheit und einer
transmembranären β-Untereinheit, die miteinander durch Disulfidbrücken verbunden
sind. Zwei dieser αβ-Halbrezeptoren sind jeweils durch Disulfidbrücken zwischen den
α-Untereinheiten miteinander zu einem α2β2-Holorezeptor verbunden. Die
Ligandenbindungsspezifität ist durch die Cystein-reichen Regionen in der
extrazellulären Domäne der α-Untereinheit gegeben (Jones und Clemmons, 1995).
Die β-Untereinheit besitzt eine ATP-Bindungsstelle und eine cytoplasmatische
Tyrosin-Kinase-Domäne, die intrazelluläre Signaltransduktion als Reaktion auf
Ligandenbindung vermittelt (Cohen, 2006; Bowman et al., 2010).
Von den möglichen Liganden hat IGF1 die höchste Affinität zu IGF1R, gefolgt von
IGF2, Insulin besitzt die geringste Affinität zu diesem Rezeptor (Jones und Clemmons,
1995).
Bindet IGF1 an den IGF1R, kommt es zu einer Autophosphorylierung an Tyrosin- und
Serinresten. Bei dem Vorgang, der auch als intramolekulare Transreaktion bezeichnet
wird, phosphoryliert die Tyrosin-Kinase einer β-Untereinheit die Reste auf der anderen
β-Untereinheit des α2β2-Holorezeptors (Frattali und Pessin, 1993). Die
Phosphorylierung des Rezeptors führt zu einer Vermittlung von Signalen ins
Zellinnere. Die Bindung von IGF1 verursacht die Phosphorylierung von unter anderem
Insulin Rezeptor Substrat 1 (IRS1). Dieses wiederum kann zwei SH2-Domänen
besitzende Proteine binden, die Phosphatidylinositol-3 Kinase (PI3K) und das growth
factor rebound protein (Grb2), so werden intrazelluläre Signalketten aktiviert (Myers et
al., 1992; Giorgetti et al., 1993; O’Connor, 2003). Weiterhin kann es zu einer
Aktivierung von den MAPK 42/44 (mitogen activated protein kinases) kommen.
Studien haben zudem ergeben, dass vermutlich sowohl die Tyrosinkinase-Aktivität, als
auch die Autophosphorylierung nötig sind, um eine vollständige Aktivierung des IGF1R
zu erreichen (Jones und Clemmons, 1995). Auch aktiviert werden können sogenannte
stress activated protein kinases (SAPKs), zu denen unter anderem die p38 MAPK
(phospho-p38 MAP Kinase) zählt. Dieser Signalweg steht in Zusammenhang mit der
Regulation von DNA-Schäden und dem Zell-überleben (Héron-Milhavet et al., 2001).
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Die Bedeutung des IGF1R für die physiologische Entwicklung der Nachkommen sowie
das Erreichen eines durchschnittlichen Geburtsgewichtes wurde durch Experimente
deutlich gemacht, in denen eine Deletion des IGF1R vorgenommen wurde. In
Versuchen, bei denen Mäuse IGF1R-Null-Mutationen aufwiesen, zeigten diese ein um
55% geringeres Geburtsgewicht als durchschnittlich und sie starben sofort nach der
Geburt (Baker et al., 1993).
2.5.2.2. IGF2R
Dieser Rezeptor wird auch als kationenunabhängiger Mannose-6-Phosphat-Rezeptor
bezeichnet, da er Mannose-6-Phosphat Reste an lysosomalen Enzymen bindet (Jones
und Clemmons, 1995). Nur ungefähr 10% der IGF2R einer Zelle liegen an der
Zelloberfläche. Der Rest befindet sich im Golgi-Apparat oder endo- beziehungsweise
lysosomalen Bereichen (Chakraborty et al., 2002). Es ist ein monomerer Rezeptor, der
weder Tyrosinkinase-Aktivität noch eine Autophosphorylierungsstelle besitzt. Der
IGF2R bindet mit der höchsten Affinität IGF2, während die Affinität zu IGF1 500-fach
niedriger ist und Insulin gar nicht gebunden wird (Jones und Clemmons, 1995). Die
Bindung von IGF2 an den IGF2R führt zu einer Internalisierung und folgenden
Degradation des Wachstumsfaktors (Clairmont und Czech, 1991). Somit kommt es zu
einer Entfernung des IGF2 aus dem Kreislauf (Jones und Clemmons, 1995; Forbes
und Westwood, 2008). Allerdings gibt es auch Studien, die zu dem Ergebnis kommen,
dass auch IGF2R für die Signaltransduktion verantwortlich ist und abweichend von der
traditionell beschriebenen Rolle auch Migration, (Chakraborty et al., 2002; Harris et al.,
2011) Invasion, (Hamilton et al., 1998) plazentare Angiogenese und vaskuläres
remodelling (Herr et al., 2003) vermittelt.
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2.5.2.3. HR
Durch die Dimerisierung von IGF1R αβ-Halbrezeptoren mit Insulin αβ-Halbrezeptoren
in Anwesenheit von ATP (Adenosintriphosphat), IGF1 oder Insulin kommt es zur
Bildung von Hybridrezeptoren (Treadway et al., 1992). Die Affinität von IGF1 und
Insulin zum HR entspricht in etwa der zum IGF1R. Sie ist im Fall von IGF1 15-50-fach
höher als von Insulin (Jones und Clemmons, 1995). Auch die IGF1R αβ-
Halbrezeptoren können IGF1 binden, aber für die Autophosphorylierung und
Tyrosinkinase-Aktivität ist die Dimerisierung nötig (Frattali und Pessin, 1993). Da zwei
verschiedene Splice-Varianten des Insulin-Rezeptors vorkommen (IR-A und IR-B),
kommt es in der Folge zur Ausbildung von zwei Isoformen der Hybridrezeptoren
(IGF1/IR-A und IGF1/IR-B). Diese Varianten wurden bis jetzt in allen Zellen
vorgefunden, in denen sowohl IGF1R, als auch IR exprimiert werden (Slaaby et al.,
2006). Die Affinität von IGF2 zu den beiden Isoformen der Hybridrezeptoren liegt
zwischen der von Insulin und IGF1 (Slaaby et al., 2006). Der wichtigste funktionelle
Unterschied dieser beiden Isoformen besteht in der hohen Affinität von IGF2 zu IR-A
(Belfiore et al., 2009). IR-A wird hauptsächlich während der pränatalen Phase
exprimiert und kann so die Effekte von IGF2 auf Embryogenese und fetale Entwicklung
steuern, während IR-B vornehmlich in adultem, ausdifferenzierten Gewebe
vorzufinden ist (Belfiore et al., 2009).
Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die in erster Linie mitogenen Wirkungen
von IGF1 und IGF2 durch den IGF1R vermittelt werden und bei hohen IGF-
Konzentrationen auch der IR aktiviert werden kann (Jones und Clemmons, 1995;
Forbes und Westwood, 2008).
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2.5.3. IGFBPs
Es gibt sechs hochaffine IGFBPs und eine Reihe von IGFBP-related Proteinen, die
eine geringere Affinität zu den Liganden IGF1 und IGF2 haben (Rechler und
Clemmons, 1998; Hwa et al., 1999; Monzavi und Cohen, 2002). Diese unterscheiden
sich in ihrem molekularen Gewicht, der Anordnung der Aminosäuren, der Verteilung
im Organismus und dem unterschiedlich stark ausgeprägten Einfluss auf die IGF-
Aktivität. Sie erfüllen verschiedene Aufgaben, wie die Inhibierung aber auch
Potenzierung von IGF-Effekten, die Inaktivierung von IGFs oder den Transport der IGF
Moleküle zu den Rezeptoren (Kostecka und Blahovec, 1999). Im Serum kommen die
Liganden zu etwa 75% als ein gebundener Komplex mit IGFBP3 und einer nicht IGF-
bindenden Komponente, dem ALS (acid labile subunit), vor. In diesem biologisch
inaktiven, ternären Komplex können sie das vaskuläre System nicht verlassen und ihre
Halbwertszeit verlängert sich auf mehrere Stunden. Sind sie frei im Organismus
vorhanden, beträgt diese z.B. bei IGF1 nur circa 10 min. Vermutlich kann so ein Pool
an verfügbarem IGF1 und IGF2 bereitgehalten werden, der bei Bedarf durch IGFBP3
spaltende Proteasen schnell genutzt werden kann (Jones und Clemmons, 1995).
Dissoziiert der Komplex aus IGFBP3, ALS und dem Liganden, formen die IGFs
kleinere, binäre Komplexe mit anderen IGFBPs, die sie durch das Endothel zu den
Zielgeweben transportieren (Le Roith et al., 2001). Auch IGFBP5 kann solche ternären
Komplexe bilden, es kommt allerdings nur in viel geringerer Menge als IGFBP3 vor.
Alle IGFBPs können auch in freier Form oder wie oben erwähnt als binärer Komplex
mit IGF vorliegen (Firth und Baxter, 2002).
Die Affinität der IGFs zu den IGFBPs ist höher, als zu den dazugehörigen Rezeptoren.
Die IGF-Bindungsproteine können sowohl hemmend als auch fördernd auf die IGF-
Aktivität wirken. Die Effekte der IGFBPs sind von verschiedenen Faktoren wie
unterschiedlichen Proteasen, posttranslationalen Modifikationen oder den
unterschiedlichen Lokalisationen der IGFBPs abhängig, welche alle die Affinität zu den
Liganden beeinflussen (Jones und Clemmons, 1995). Unter bestimmten Bedingungen,
wie zum Beispiel während der Trächtigkeit, werden die IGFBPs anders
posttranslational modifiziert, wodurch ihre Affinität zu den IGFs reduziert wird. So ist
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eine höhere Bioverfügbarkeit zu diesem Zeitraum vorhanden (Forbes und Westwood,
2008).
Außerdem sind inzwischen auch IGF-unabhängige Wirkungen der IGFBPs bekannt
(Jones und Clemmons, 1995). Zu diesen gehören unter anderem Wachstums-
Hemmung oder auch direkte Apoptose-Induktion. Vermittelt werden diese Wirkungen
durch eigene Rezeptoren wie z.B. den nuclear transcription factor RXR (Lee und
Cohen, 2002). Aber auch die Förderung der Motilität und Zelladhäsion (Jones et al.,
1993) oder die Beeinflussung des Zellzyklus gehören dazu. Es sind auch IGF1R-
unabhängige Wirkungen von IGFBPs beschrieben worden (Firth und Baxter, 2002).
Abb. 3: Darstellung des IGF-Systems mit Liganden, Rezeptoren und IGFBPs.
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2.6. Das IGF-System in der Plazenta und im Zusammen hang mit der
Fortpflanzung
Es ist bekannt, dass IGF wichtig für die Regulation des fetalen Wachstums ist. Immer
mehr Studien deuten darauf hin, dass dieser Effekt über die Förderung der plazentaren
Entwicklung und Sicherstellung der Funktion der Plazenta erreicht wird (Sibley et al.,
2005; Forbes und Westwood, 2008). Erste Hinweise, dass IGFs an der Regulation des
fetalen Wachstums beteiligt sind, gab es, als Messungen von IGF1 im Nabelschnurblut
gemacht wurden und sich eine positive Korrelation zwischen Geburtsgewicht und
IGF1-Spiegel ergab (Klauwer et al., 1997). Small-for-gestational-age (SGA)
Neugeborene hatten erniedrigte und large-for-gestational-age (LGA) Neugeborene
hatten erhöhte IGF-Level (Giudice et al., 1995). Durch restriktive Ernährung kann es
zu einer Reduktion der IGF1- und IGF2- Konzentrationen im Fetus, der Mutter und der
Plazenta kommen. Dies kann zu plazentarer und fetaler Mangelentwicklung führen
(Roberts et al., 2008). Bei Versuchen an Meerschweinchen wurde allerdings auch
festgestellt, dass die Behandlung mit IGF1 und IGF2 zu einem erhöhtem
Geburtsgewicht und erhöhter plazentarer Transportrate führt, wobei IGF2 eher die
Morphologie der Plazenta und IGF1 eher die Verteilung der Nährstoffe über die
Plazenta beeinflusste (Sferruzzi-Perri et al., 2006). Beide Liganden werden schon von
Beginn der Embryonalphase an im Embryo produziert. In der fortgeschrittenen
Trächtigkeit ist die Konzentration von IGF2 10-fach höher als die von IGF1
(Daughaday et al., 1982; Jones et al., 1987; Gluckmann und Ambler, 1993), wobei sich
dieses Verhältnis nach der Geburt allerdings umkehrt (Jones und Clemmons, 1995).
Außerdem ist der IGF1 Wert bei den Feten niedriger als bei Adulten, steigt jedoch im
Laufe der Trächtigkeit an (Gluckmann und Butler, 1983). Ein kritischer Punkt in der
Trächtigkeit ist die Angiogenese, welche entscheidend für eine normale Entwicklung
von Plazenta und Fetus ist. Studien deuten darauf hin, dass IGF2 für diesen Prozess
wichtig ist (Herr et al., 2003). Auch die Menge an vorhandenen IGFBPs scheint
ausschlaggebend für die altersgerechte Entwicklung der Feten zu sein (Klauwer et al.,
1997). Bei Erkrankungen wie Präeklampsie oder intrauterine growth restriction (IUGR)
wurden erhöhte maternale IGFBP1 Spiegel im Blut festgestellt (Forbes und Westwood,
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2008). Auch Veränderungen des IGF1R können das fetale Wachstum beeinflussen.
Der IGF1R ist hauptsächlich für die Vermittlung der Wirkungen von IGF1 und IGF2
zuständig. So können Veränderungen dieses Rezeptors durch Wirkungen auf
Zellproliferation, Differenzierung oder die Sicherung des Zellüberlebens, das fetale
Wachstum beeinflussen (Walenkamp et al., 2006). Der IGF2R ist hauptsächlich für die
Entfernung von IGF2 aus der Zirkulation und damit einhergehend, die Inaktivierung,
zuständig. Wird er ausgeschaltet oder ist fehlerhaft führt dies zu stark erhöhten
Geburtsgewichten bei Neugeborenen (Lau et al., 1994).
Reduziertes fetales Wachstum ist in den meisten Fällen mit abnormer plazentarer
Entwicklung verbunden und es wurde schon früh angenommen, dass dies in
Zusammenhang mit IGFs steht (Forbes und Westwood, 2008). Bestätigt wurde diese
Annahme unter anderem durch Versuche in denen imprinted genes untersucht
wurden. Bei Mäusen mit fehlendem Promotor (P0) des igf2 Gens, einem Plazenta-
spezifischen Transkript, trat reduzierte fetale Größe kombiniert mit Veränderungen der
Plazenta im Bezug auf Morphologie und Größe auf (Constância et al., 2002).
Außerdem wird durch das Fehlen des igf2 Gens erheblich die Transportkapazität der
Plazenta beeinträchtigt (Sferruzzi-Perri et al., 2011). Auch beim Rind konnte der
Einfluss des IGF-Systems auf die Trächtigkeit nachgewiesen werden. Die Deletion von
IGF1 hingegen, führte zu keiner Beeinflussung des plazentaren Gewichts. Erfolgt die
Beeinflussung des plazentaren Wachstums am Anfang der Trächtigkeit, kann die
Anzahl der Plazentome reduziert werden. Erfolgt die negative Beeinflussung jedoch
später, kommt es eher zu einer Veränderung der Größe und der Morphologie der
Plazentome (Wathes et al., 1998).
Beide Liganden sind in der Lage, die Entwicklung von kultivierten, präimplantierten
Blastozysten zu stimulieren (Kaye et al., 1992). IGF1 und IGF2 werden sowohl im
bovinen Uterus, als auch im Konzeptus exprimiert (Geisert et al., 1991; Kirby et al.,
1996). Außerdem wurde gezeigt, dass sie beim Schaf in vitro die embryonale
Produktion von INF-τ (Interferon-Tau) stimulieren (Ko et al., 1991). Dieses
antiluteolytische Hormon ist entscheidend für eine erfolgreiche Trächtigkeit bei
Wiederkäuern. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass zum Zeitpunkt des
maternalen Erkennens der Trächtigkeit, IGF1 und IGF2 mRNA erhöht waren, während
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die von IGFBP3 im Endometrium des graviden Uterus erniedrigt war (Geisert et al.,
1991; Kirby et al., 1996). Eine Studie von Robinson et al. (2000) untersuchte die
Expression der einzelnen Faktoren des IGF-Systems im bovinen Uterus. Die stärkste
Expression von IGF1 mRNA im bovinen Endometrium wurde im subepithelialen
Stroma festgestellt, schwächere Expressionen konnten auch im Myometrium und
restlichen Stroma beobachtet werden. IGF2 mRNA war hauptsächlich im karunkulären
Stroma zu finden, zu geringeren Teilen aber auch im Myometrium, endometrialen
Stroma und uterinen Drüsen. IGF1R mRNA wurde auf einem hohen Niveau in den
Drüsen und zu geringeren Teilen im luminalen Epithel exprimiert. Diese Erkenntnisse
decken sich, was IGF1 und IGF1R betrifft, auch mit den von Wathes et al. (1998)
erhobenen Befunden, dass die IGF1 Konzentrationen während der Trächtigkeit
abfallen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die Expression der Liganden im
Verlauf des Zyklus im Endometrium aber auch in Uterusspülungen unterscheiden
(Geisert et a., 1991; Ohtani, et al., 1996; Meikle et al., 2001). IGF1R und IGF2R
konnten sowohl im Uterus, als auch der Plazenta des Rindes nachgewiesen werden
(Robinson et al., 2000; Llewellyn et al., 2008; Richterich, 2008; Wathes et al., 2011).
Auch im Eileiter (Pushpakumara et al., 2002) und fetalen Geweben (Farin et al., 2010)
wurden beide Rezeptoren detektiert. Llwellyn et al. untersuchten die Expression
verschiedener Mitglieder des IGF-Systems post partum, da sie eine Beteiligung dieser
Wachstumsfaktoren am Geschehen der Retentio secundinarum vermuteten. Sie
stellten eine Expression von IGF1 mRNA im subepithelialen Stroma sowie im inter-
karunkulären und karunkulären Endometrium fest. IGF2 mRNA und IGF1R mRNA
wurden im tiefen endometrialen Stroma und Myometrium lokalisiert (Llewellyn et al.,
2007).
Viele Studien beschäftigten sich mit dem Zusammenhang von IGF-Expression und
dem Ernährungszustand der Kühe post partum. Es wurde nachgewiesen, dass die
Konzentration von IGF1 im Blut mit der Energieverfügbarkeit zusammenhängt (Rutter
et al., 1989; Spicer et al., 1990). Geraten die Kühe nach der Abkalbung in eine negative
Energiebalance, kommt es zu einem Absinken des IGF1 Wertes im Blut (Llewellyn et
al., 2007; Wathes et al., 2007). Außerdem wurde berichtet, dass peripartal weniger
GH-Rezeptoren in der Leber exprimiert werden, was wiederum zu einem Absinken des
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Blut IGF-Wertes führt (Kobayashi et al., 1999; Lucy et al., 2001; Radcliff et al., 2004).
Es wird weiterhin angenommen, dass dieser niedrige IGF1 Wert post partum und damit
zu Beginn der Laktation, mit einer erhöhten Anfälligkeit für Krankheiten in Verbindung
steht. Als mögliche Erklärung wird angenommen, dass die stimulatorische Wirkung
von IGF1 auf neutrophile Granulozyten vermindert sei (Vangroenweghe et al., 2005).
Beim Menschen sind IGF1 und IGF2 ab der 6. Schwangerschaftswoche in allen
Zelltypen der Plazenta nachzuweisen (Han et al., 1996). Studien ergaben, dass sowohl
IGF1 als auch IGF2 die Proliferation plazentarer Fibroblasten erhöhen und IGF1 die
Apoptose von Trophoblasten und Fibroblasten verhindern kann (Miller et al., 2005).
Beide Liganden können außerdem die Trophoblastenmigration und auch -invasion
fördern. In der humanen Plazenta ist es von entscheidender Bedeutung, dass
Zytotrophoblasten sich zu Synzytiotrophoblasten oder extravillösen Trophoblasten
differenzieren. IGF1 reguliert auch diesen Prozess (Forbes und Westwood, 2008),
wobei IGF2 eher bei der Regulation des Nährstoffaustauschs eine Rolle zu spielen
scheint. Die Oberfläche, über die ein Austausch stattfinden kann, ist bei IGF2 Knock-
out Mäusen erniedrigt, genauso wie die Permeabilität für Nährstoffe reduziert ist. Diese
Auswirkungen wurden auch bei Meerschweinchen beobachtet (Constância et al.,
2005; Sferruzzi-Perri et al., 2006). Allerdings scheinen IGF2 und IGFBP1 beim
Menschen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Migration und Invasion
von extravillösen Trophoblasten (Irving und Lala, 1995; Hamilton et al., 1998;
Chakraborty et al., 2000) und der Stimulation eines erhöhten uteroplazentaren
Blutflusses zu spielen (Nayak und Giudice, 2003). Andere Studien wiederum zeigten,
dass IGFBP1 die durch IGF1 vermittelte Trophoblastenmigration verhinderte. Durch
die Multimerisierung von IGFBP1 konnte dieser inhibitorische Effekt von IGFBP1
vermindert werden (Shibuya et al., 2010).
Der IGF1R kommt in allen Zelltypen der humanen Plazenta vor (Holmes et al., 1999).
Der Insulinrezeptor wird in der Plazenta in zwei Isoformen exprimiert, IR-A und IR-B.
Die Affinität von IGF2 zum IR-A im fetalen Gewebe ist genauso groß wie die zum
IGF1R. Allerdings werden bei Bindung von IGF2 an den IR-A hauptsächlich mitogene
Signale ausgesendet, anders als bei Aktivierung durch Insulin (Frasca et al., 1999).
Das Zusammenspiel von IGF2 und IR-A könnte erklären, warum Versuchstiere, denen
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sowohl IGF1R als auch IGF2 fehlen, sehr viel stärker in ihrem fetalen Wachstum
eingeschränkt sind, als die Tiere, denen nur IGF1R fehlt (Baker et al., 1993).
Das IGF-System ist auch für die hormonelle Steuerung in der Trächtigkeit von
entscheidender Bedeutung. So werden unter anderem die Wirkungen von Östradiol
und Progesteron durch das IGF-System beeinflusst (Bowman et al., 2010). Aber auch
in entgegen gesetzter Richtung ist eine Beeinflussung möglich, da z.B. Cortisol und
Schilddrüsenhormone einen Einfluss auf IGF1 und IGF2 zu haben scheinen (Fowden,
2003).
Die Wachstumsfaktoren vermitteln ihre Wirkungen, wie bereits erwähnt, über
intrazelluläre Signalkaskaden. Die Kenntnis dieser Wege in der Zelle ist wichtig, da sie
mögliche Angriffspunkte in der Therapie verschiedener Dysregulationen in der
Trächtigkeit darstellen (Forbes und Westwood, 2010). In Versuchen an Mäusen wurde
festgestellt, dass MAPK essentiell für eine normale Entwicklung der Plazenta sind. In
der humanen Plazenta werden sie im Trophoblasten exprimiert und sind unter
anderem für die Entwicklung von einzelnen Trophoblasten zu Synzytien verantwortlich
(Kita et al., 2003; Daoud et a., 2005). Sie stellen den Hauptsignalweg nach Aktivierung
durch Wachstumsfaktoren dar (Forbes und Westwood, 2010). Die p38 MAPK schien
in vielen Versuchen nur für die Vermittlung von Stresssignalen in der Plazenta
verantwortlich zu sein (Renaud et al., 2009). Neuere Ergebnisse zeigen aber, dass sie
auch Signale von Wachstumsfaktoren vermittelt (Forbes und Westwood, 2010). Von
anderen Geweben ist bekannt, dass durch Aktivierung des IGF1R das
Insulinrezeptorsubstrat (IRS) phosphoryliert und somit aktiviert wird, was wiederum zu
einer Aktivierung von PI3K/Akt (Akt Kinase) führt. Für Akt ist bekannt, dass es bei
Nagern für die Regulation von fetalem Wachstum und die Entwicklung der Plazenta
wichtig ist (Forbes und Westwood, 2008).
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2.7. IRS-Proteine
Die IRS-Proteine sind eine Gruppe von zytoplasmatischen Adaptor-Proteinen, die
Signale von IGF1, Insulin und verschiedenen Zytokinen vermitteln. Unter anderem sind
sie auch für Signalvermittlung der Rezeptorsysteme der IL6 Familie (Interleukin 6), der
IL2 Familie (Interleukin 2) und der Interferone zuständig (White, 1997). Dies geschieht
insbesondere über IGF1R und IR (White, 1998; Karas et al., 2001; Chitnis et al., 2008;
Shaw, 2011). Bis jetzt wurden sechs verschiedene IRS-Proteine identifiziert (White,
1985; Cai et al., 2003; Boller et al., 2012). IRS1 und IRS2 werden beim Menschen
ubiquitär exprimiert und sind die hauptsächlichen Vermittler Insulin-abhängiger
Wirkungen der Regulation des Glukosestoffwechsels (White, 2002). IRS1 wird in allen
Zelltypen von Mäuseembryonen der Periimplantationsphase exprimiert (Puscheck et
al., 1998). Außerdem wird im humanen Organismus auch IRS4 exprimiert, allerdings
nur in einigen Geweben, vor allem in Gehirn, Niere, Thymus und Leber (Lavan et al.,
1997). IRS3 hingegen wurde bis jetzt nur bei Nagern identifiziert (Boller et al., 2012).
Es bestehen Unterschiede in der subzellulären Lokalisierung der Mitglieder dieser
Gruppe. In den Adipozyten sind IRS1 und IRS2 vor allen Dingen in den Mikrosomen
zu finden, während IRS3 eher an der Plasmamembran angesiedelt ist (Anai et al.,
1998). Die IRS-Proteine haben keine intrinsische Enzymaktivität, sondern vermitteln
die Signale von IGF1R und IR, indem sie als Proteingerüste fungieren, die
Signalkomplexe organisieren (Sun et al., 1991). Eine wichtige Funktion der IRS-
Proteine ist die Aktivierung der PI3K und anschließend der Akt (Okada et al., 1994;
Robey und Hay, 2009). IRS binden an Proteine mit SH2 Domänen (Src homology 2),
wie z.B. Shc, Nck (non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1), Grb2
(growth factor receptor-bound protein 2) oder die p85 Untereinheit der PI3K. Über
diese Protein-Protein-Interaktionen wird die Aktivierung verschiedener Signalwege
sichergestellt, mit denen die spezifischen biologischen Aktivitäten von IGFs vermittelt
werden (White, 1997; Lassarre und Ricort, 2003; Tsuruzoe et al., 2001). Die IRS-
Proteine scheinen verschiedene Aufgaben zu übernehmen und für viele verschiedene
physiologische Prozesse von Bedeutung zu sein. Dazu gehören unter anderem der
Kohlenhydratstoffwechsel und die ß-Zellfunktion im Pankreas (Withers et al., 1999),
- 27 -
aber auch das somatische Zellwachstum (Brüning et al., 1997) und die weibliche
Reproduktion (Burks et al., 2000). Für einige Zellen ist beschrieben, dass IRS1 nach
Aktivierung durch den IGF1R Zellproliferation vermittelt (O’Connor, 2003; Byron et al.,
2006), während IRS2 die Motilität stimuliert (Byron et al., 2006). Aber auch IRS2
scheint für die Proliferation von Bedeutung zu sein (Lingohr et al., 2002). Aus
verschiedenen Versuchen ist bekannt, dass diese beiden Adaptorproteine eine
wichtige Rolle in der Vermittlung der IGF1 Signale spielen und nicht ohne weiteres
austauschbar sind. Deletion von IRS1 z.B. führt zu intrauteriner growth restriction
(IUGR) und peripherer Insulinresistenz. Die Deletion von IRS2 wiederum führt zu
Insulin-Resistenz und einer defekten Entwicklung von ß-Zellen im Pankreas, die
ihrerseits einen Diabetes verursachen (Tsuruzoe et al., 2001). Die bis jetzt noch nicht
so gut charakterisierten IRS3 und IRS4 könnten die IGF1R Funktion aber auch durch
die Modulation der Expression von IRS1 und IRS2 Proteinen indirekt beeinflussen
(Tsuruzoe et al. 2001; Tseng et al., 2003) Ob IRS4, genauso wie IRS1, mitogene
Signale vermittelt, ist umstritten (Tsuruzoe et al., 2001). Mäuse, denen IRS3 oder IRS4
fehlen, haben keine augenscheinlichen Phänotypen, im Gegensatz zu IRS1- oder
IRS2-knockout Mäusen (Liu et al., 1999; Fantin et al., 2000). Für IRS5 (DOK4) ist
bekannt, dass dieses nach Phosphorylierung durch IGF1-Signale den MAPK
Signalweg aktiviert. Auch IRS6 (DOK5) kann durch IGF1 aktiviert werden. Weitere
Details zu diesen beiden Vertretern müssen aber noch erforscht werden (Cai et al.,
2003). Außerdem sollte bedacht werden, dass sie nur entfernt ähnlich zu den
restlichen IRS-Proteinen sind (Versteyhe et al., 2010).
- 28 -
2.8. EGF
EGF gehört ebenfalls zu den Wachstumsfaktoren und übernimmt mitogene Rollen in
vielen verschiedenen Organen (Casalini et al., 2004), unter anderem auch im
Zusammenhang mit der Regulation von fetalem Wachstum und Entwicklung (Forbes
und Westwood, 2010). Die Wirkung von EGF (Epidermal growth factor) wird durch den
EGFR (Epidermal growth factor receptor) vermittelt. Nach Bindung des Liganden
kommt es zu intrinsischer Tyrosin Phosphorylierung und nachfolgender Aktivierung
promitogener Signalmoleküle (Prenzel et al., 2001), wie z.B. MAPK, Akt, p38 MAPK
oder PI3K (Oda et al., 2005; LaMarca et al., 2008). Veränderungen des EGFR führen
zu reduzierter plazentarer und fetaler Entwicklung sowohl bei Mäusen als auch bei
Menschen (Fondacci et al., 1994; Dackor et al., 2009). Unterstützt wurden diese
Annahmen durch Versuche, in denen gezeigt werden konnte, dass die Konzentration
maternalen EGFs mit dem fetalen Wachstum korreliert (Kamei et al., 1999), und
Mäuse ohne EGFR signifikant kleinere Plazenten aufwiesen (Miettinen et al., 1995).
Belege für die Wichtigkeit von EGF bei der Regulation von plazentarer Funktion und
Entwicklung beim Menschen kommen auch aus vielen in vitro Studien, in denen
nachgewiesen wurde, dass EGF die Trophoblastendifferenzierung (Barnea et al.,
1990; Garcia-Lloret et al., 1996), -proliferation (Li und Zhuang, 1997) und -motilität
stimuliert (LaMarca et al., 2008) sowie die Apoptose der Trophoblasten verhindert
(Johnstone et al., 2005; Moll et al., 2007). Auch für das Rind konnte gezeigt werden,
dass EGF die Motilität und Proliferation von fetalen Trophoblastzellen fördert (Dilly et
al., 2010; Hambruch et al., 2010).
EGF wird in der bovinen Plazenta ubiquitär, der EGFR im Trophoblasten und im
maternalen Epithel exprimiert (Weise, 2001). Auch in Blastozysten und dem
Endometrium des Rindes konnte EGF nachgewiesen werden (Ohtani et al., 1996;
Kliem et al., 1998). In vitro konnte der EGFR in bovinen fetalen Trophoblastzellen
nachgewiesen werden (Dilly et al., 2010).
In verschiedenen Arbeiten, wird von synergistischen Wirkungen zwischen IGF1 und
EGF berichtet (Qureshi et al., 1997), wobei verschiedene Interaktionen denkbar sind
und diskutiert werden. Dies wird in Kapitel 5.1. weiter ausgeführt.
- 29 -
3. Material und Methoden
Alle benutzten Reagenzien und Materialien sowie die Zusammensetzungen der Puffer
und Lösungen werden im Anhang beschrieben.
3.1. In vitro Versuche
3.1.1. Zelllinien
Im Rahmen dieser Arbeit wurden in den Versuchen vier verschiedene bovine,
plazentare Zelllinien untersucht: BCEC (bovine Karunkelepithelzellen), F3 (fetale
Trophoblasten), bovine plazentare Fibroblasten und BUVEC (bovine Endothelzellen
der Nabelvene). BCEC (Bridger et al., 2007), F3-Zellen (Hambruch et al., 2010) und
Fibroblasten (Häger et al., 2010) waren als permanente Zelllinien im Labor vorhanden.
Diese waren bei -150°C in DMSO/FCS eingefroren (100µl DMSO, 100µl FCS und
800µl Zellsuspension) und wurden bei Bedarf aufgetaut und fortlaufend kultiviert (siehe
3.1.3.). Die Isolation der BUVEC ist unter 3.1.2. beschrieben.
3.1.2. Isolation BUVEC
Für die Isolation von BUVEC wurden ungefähr im 4./5. Monat trächtige Uteri vom
Schlachthof verwendet. Nach Eröffnung der Uteri mit einer sterilen Schere wurde die
jeweilige Nabelschnur abgetrennt und in ein Becherglas mit Hanks Balanced Salt
Solution (Hanks BSS) gegeben. Die folgenden Schritte fanden alle unter der sterilen
Werkbank statt. Aus der Nabelschnur wurden die Blutgefäße von der Wharton’schen
Sulze befreit und anschließend die Arterien verworfen. In die Venen wurde ein
Katheter eingeführt und diese mit ca. 5ml Hanks BSS gespült. Anschließend wurde
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durch denselben Katheter eine Spülung mit einer zuvor hergestellten Kollagenase
Lösung (0,025% in Hanks mit Ca2+/Mg2+) durchgeführt. Waren die Venen komplett mit
Kollagenase Lösung gefüllt, wurden sie an beiden Enden abgeklemmt und in diesem
Zustand für 20min in den Inkubator (37°C, 5%CO2) verbracht. Nach dieser Zeit wurden
die Venen aus dem Inkubator geholt und über ein mit einigen ml Hanks BSS befülltes
50ml Reaktionsgefäß gehalten, die Klemmen gelöst und eine Spülung mit FCS (Fetal
Calf Serum) durchgeführt. Die so gewonnene Suspension wurde zentrifugiert (5min,
1000rpm, 23,5°C).
Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 10ml EBM (Endothelzell-Basal-
Medium) resuspendiert. Die Aussaat erfolgte in 75cm² Zellkulturflaschen. Am Ende
wurde eine optische Kontrolle der Zellen unter dem Mikroskop vorgenommen, bevor
sie in den Inkubator verbracht wurden.
Nach 24h wurde ein Mediumwechsel vorgenommen, der von da an alle drei Tage
wiederholt wurde. Zur Charakterisierung der BUVEC erfolgte ein Nachweis der
erhöhten Aufnahme von acetyliertem LDL (Low Density Lipoprotein) (siehe 3.1.5).
3.1.3. Kultivierung der Zellen
Die Zellen (BCEC, F3, Fibroblasten) wurden in 75 cm2 Zellkulturflaschen bei 37°C und
5%CO2 in FSM (Vollmedium), bzw. die BUVEC in EBM (Endothelzell-Basal-Medium)
kultiviert. Nach ca. einer Woche erreichten die Zellen eine 90%ige Konfluenz und
wurden daraufhin passagiert. Hierbei wurden die Zellen voneinander und von der
Zellkulturflasche abgelöst und konnten dann in eine neue Zellkulturflasche überführt
werden oder für die verschiedenen Versuchsreihen genutzt werden. Zur Passage
wurde das in der Flasche vorhandene Medium abgesaugt und 5ml steriles PEM (PBS
mit 2mM EDTA) hineingegeben. Bei F3, Fibroblasten und BUVEC erfolgte eine kurze
Spülung mit PEM, welches dann wieder entfernt wurde. BCEC wurden mit dem PEM
für 6 min in den Inkubator gegeben. Hiermit sollten Reste des FSM ausgespült werden
und Ca2+-abhängige Zelladhäsionsmoleküle inhibiert werden. Das PEM wurde dann
aus der Flasche abgenommen. Im nächsten Schritt wurden 3ml Trypsin hinzugefügt
- 31 -
und die Zellen unter den bereits angegebenen Bedingungen, für 4-6min inkubiert, um
die Zelladhäsion aufzuheben. Nach diesem Zeitraum wurde die Zellkulturflasche aus
dem Inkubator genommen, vorsichtig geschwenkt und leicht dagegen geklopft um die
Ablösung der Zellen in die Flüssigkeit zu erleichtern. Nach mikroskopischer Kontrolle,
ob sich die Zellen vollständig abgelöst hatten, erfolgte eine Zugabe von 7ml FSM/EBM.
Die gesamt Lösung wurde in ein 15ml Röhrchen überführt und anschließend bei
900rpm und RT für 4min zentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde, nach
Entfernung des Überstandes, mit FSM/EBM resuspendiert. Je nach gewünschter
Verdünnung erfolgte dann die Aussaat der Zellen in FSM/EBM in die
Zellkulturflaschen. Der Mediumwechsel wurde am folgenden Tag und daraufhin alle 2
Tage unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Die BUVEC wurden, im Gegensatz
zu den BCEC, F3-Zellen und Fibroblasten, nur in der Primärkultur verwendet (Passage
0-1).
3.1.4. LDL-Färbung
Zur Charakterisierung der Endothelzellen, BUVEC, wurde die erhöhte Aufnahme von
acetyliertem LDL (Ac-LDL) nachgewiesen. Diese Methode schloss sich der Isolierung
an. Die Endothelzellen sind in der Lage, acetyliertes LDL in vermehrtem Umfang
aufzunehmen und im Zytoplasma anzureichern. Das verwendete Ac-LDL ist an den
Fluoreszenzfarbstoff 1,1’Dioctaldecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbozyanin Perchlorat
(Dil) gekoppelt. Nach erfolgter Aufnahme durch die Zelle, wird das Ac-LDL-Dil durch
lysosomale Enzyme gespalten und der fluoreszierende Farbstoff reichert sich an der
Membran des Lysosoms an (Voyta et al., 1984). Diese Anlagerungen sind mittels
Fluoreszenzmikroskopie als punktförmige, perinukleäre Bereiche zu identifizieren. Ihr
Auftreten gilt als Nachweis für die erfolgreiche Isolation von Endothelzellen.
Hierfür wurden die BUVEC passagiert und ein Teil der Zellsuspension auf
Deckgläschen in einer 24 well-Platte aufgebracht. Mit 500µl EBM wurden sie für 2-3d
in den Inkubator verbracht (37°C, 5%CO2). Nach diesem Zeitraum wurde das EBM
abgenommen und 300µl/well LDL-Farbstoff in einer Verdünnung von 10µg/ml (in EBM)
- 32 -
aufgetragen. Die Zellen wurden abermals für 4h inkubiert (37°C, 5%CO2). Nach dem
Abnehmen des Farbstoffs erfolgte eine Spülung mit PBS1x. Im nächsten Schritt wurde
500µl/well Hoechst-Farbstoff 33342 (5mg/ml) in einer Verdünnung von 1:15.000 (in
PBS1x) aufgetragen und wirkte 10min auf dem Schüttler ein. Überschüssige Reste
wurden durch mehrmaliges Waschen mit PBS1x entfernt. Die Deckgläschen wurden
mit Prolong Antifade auf Objektträgern befestigt und über Nacht trocknen gelassen.
Am darauf folgenden Tag erfolgte die Kontrolle unter dem Fluoreszenz Mikroskop (Carl
Zeiss Vision®, MTB 2004).
3.1.5. Quantifizierung der Zellen
Hierfür wurde das Zellpellet nach der Passage mit einer Menge von 5-8ml Medium
resuspendiert. Zur zuverlässigen Quantifizierung der Zellen wurde eine Neubauer-
Zählkammer verwendet. Vor dem Gebrauch wurde ein Deckgläschen auf die
Grundplatte aufgelegt und der korrekte Sitz durch Auftreten von Newtonschen
Interferenzfarben bestätigt. Nach Mischen von Zellpellet und Medium wurden 10µl
dieser Suspension abgenommen und in die Neubauer-Zählkammer gegeben. Unter
dem Lichtmikroskop, bei Durchlicht und 10-facher Vergrößerung, wurden vitale Zellen
in den Zählfeldern ausgezählt, wobei pro Auszählung eines Quadrates nur zwei
Grenzlinien verwendet wurden, um doppelte Zählung zu vermeiden. Aus Anzahl der
Zellen und dem Volumen wurde abschließend die Zellmenge errechnet.
3.1.6. Proliferations-Assay
Die jeweils zu untersuchenden Zellen wurden passagiert, gezählt (siehe 3.1.5.) und in
96 well-Platten (F3, Fibroblasten) bzw. 24 well-Platten (BCEC) ausgesät. BUVEC
wurden von den Proliferations-Assays mit kombinierten Stimulationen
ausgeschlossen, da sie in den Vorversuchen auf keine Stimulation reagierten.
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Tab. 1: Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Proliferations-Assay
Zelllinie Zellzahl/well
BCEC 15.000
F3 10.000
Fibroblasten 10.000
Nach 24h (37°C und 5%CO2) wurde das FSM durch SFM (serum free medium) für 4h
ersetzt, um eine Beeinflussung durch die Bestandteile des FSM ausschließen zu
können. Nach diesem Serum-Entzug folgte die Stimulation mit den unterschiedlichen
Wachstumsfaktoren. Diese wurden in der jeweiligen Konzentration (Tab. 2) in
SFM/EBM 1% angesetzt und jeweils 100µl (96 well-Platte)/500µl (24 well-Platte) pro
well appliziert. Die genannten Konzentrationen wurden in Vorversuchen als am besten
geeignet ermittelt, genauso wie die Stimulationszeit von insgesamt 48h.
Tab. 2: Konzentrationen der untersuchten Wachstumsfaktoren im MTT-Assay und Live Cell Imaging
Zelllinie Wachstumsfaktor
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF
BCEC 100ng/ml 100+20ng/ml 20ng/ml 50ng/ml 50+20ng/ml
F3 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml
Fibroblasten 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml
Nach weiteren 24h wurde die Stimulation wiederholt. Zum späteren Bezug wurde SFM
zu einer Gruppe von Zellen gegeben. Als interne Kontrolle wurde eine Gruppe von
Zellen mit FSM geführt.
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Nach insgesamt 48h wurde das Medium von den Zellen abgenommen und eine MTT-
Lösung aufgegeben. Diese bestand aus 5mg MTT (3(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazoliumbromid) in 1ml PBS (phosphat buffered saline) und 9ml SFM. Nach
einer Inkubationszeit von 4h kommt es durch intrazelluläre Stoffwechselprozesse zur
Ausfällung von Formazan, das in Form von violetten Kristallen sichtbar wird. Durch die
Zugabe von 300µl DMSO (Dimethylsulfoxid)/well wurde das Formazan gelöst.
Unterstützt wurde dieser Vorgang durch 15min auf dem Schüttler.
Im ELISA-Reader erfolgten die Messungen der Absorption bei 550nm und 690nm in
der Ascent Software for Multiskan. In Excel wurden dann Mittelwerte, SEM (standard
error of the mean) und Standardabweichungen für jede Stimulation und Zellart
ermittelt. Für jede unterschiedliche Stimulation wurden 24 wells benutzt und die
Versuche wurden dreimal wiederholt.
- 35 -
3.1.7. Motilitäts-Assay
Die verschiedenen Zelllinien wurden passagiert, gezählt und in 12 well-Platten
ausgesät.
Tab. 3: Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Motilitäts-Assay
Zelllinie Zellzahl/well
BCEC 40.000
F3 25.000
Fibroblasten 25.000
BUVEC 25.000
Die Zellen wurden für 24h bei 37°C und 5%CO2 in FSM bzw. EBM inkubiert und
anschließend für 4h in SFM/EBM 1% verbracht. Nach dieser Zeit wurden die Zellen
mit 1000µl der unterschiedlichen Lösungen mit Wachstumsfaktoren in SFM/EBM 1%
stimuliert (Tab. 2). Als Bezug dienten auch hier die unstimulierten, daher nur mit
SFM/EBM 1% inkubierten, Zellen. Eine Positiv-Kontrolle mit FSM/EBM wurde
ebenfalls durchgeführt. Direkt im Anschluss an die Stimulation wurden die Platten in
die Inkubationskammer (37°C, 5%CO2) des Mikroskops verbracht. Die Aufnahmen
erfolgten mit dem Cell Observer System, Zeiss MicroImaging, Jena, Deutschland. Pro
well wurden zwei geeignete Positionen ausgewählt, an denen die folgenden
Aufnahmen vorgenommen wurden. Insgesamt wurden über einen Zeitraum von 18h
alle 15min Bilder aufgenommen. Die anschließende Auswertung der Bilder erfolgte mit
ImageJ® (Schneider et al., 2012). So ermittelte Strecken, von 50 Zellen/well, wurden
im Weiteren mit Excel im Hinblick auf Mittelwerte, Standardabweichung und SEM
untersucht. Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt.
- 36 -
3.1.8. Molekularbiologie
Zur RNA Extraktion wurde das SV Total RNA Isolation System (Promega, USA)
entsprechend den Herstellerangaben verwendet. Alle nachfolgenden Schritte wurden,
wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die m-RNA Extraktion erfolgte aus in PBS gewaschenen und bei -21°C eingefrorenen
Zellpellets. Um die Zellen aufzuschließen wurde RNA-Lysis-Buffer mit 10µl ß-
Mercapthoenthanol zu den Zellen hinzugegeben und anschließend gevortext, davon
wurden ca. 175µl in ein neues Eppendorf Gefäß überführt. Im nächsten Schritt wurden
350µl RNA-Dilution-Buffer dazugegeben, die Probe wurde dann für 3min bei 70°C im
Heizblock erhitzt und im Folgenden zentrifugiert (12.000-14.000g für 10min).
Der Überstand wurde mit 200µl 95%igem Ethanol vermischt, auf ein Spin Basket
gegeben und zentrifugiert (1min, 12.000-14.000g). Die Membran wurde dann mit 600µl
RNA Wash Solution ausgewaschen (12.000-14.000g, 1min). Verbliebene DNA wurde
mittels 50µl DNAse Incubation Mix verdaut, nach 15min Inkubation wurde dies mit
200µl DNAse Stop Solution unterbunden. Es folgten zwei Wasch-Schritte mit je 600µl
und 250µl RNA Wash Solution (12.000-14.000g, 30s). Die Elution der RNA erfolgte in
100µl Nuklease freiem Wasser.
Die Konzentration und Reinheit der RNA wurde mittels eines Spektrophotometers bei
einer 1:50 Verdünnung (E260/E280) gemessen und ein Quotient berechnet, der die
Reinheit der RNA wiedergab. Die Menge an enthaltener RNA wurde mit folgender
Formel ermittelt: Konzentration [µg/ml]=OD26040µg/ml x Verdünnungsfaktor.
Im folgenden Schritt wurde die gewonnene RNA in cDNA umgeschrieben. Für die
Reverse Transkription (RT-reaction) wurde ImPromII reverse transcriptase (Promega)
mit dem dazugehörigen Standardprotokoll verwendet.
Es wurden 0,5µg RNA und 1µl Random Primer (0,5µg) zusammen gegeben und mit
Nuklease freiem Wasser auf 5µl aufgefüllt. Anschließend erfolgte eine Erhitzung auf
70°C für 5min, um sekundäre Strukturen zu denaturieren. Nach dem Kühlen wurde
dann der Reverse Transcription Mix dazugegeben (RT-Mix).
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RT-Mix
Nuklease freies Wasser 6,1µl
ImPromII 5x Reaktionspuffer 4,0µl
MgCl2 (25mM) 2,4µl
dNTP (10mM) 1µl
RNasin (2.500 U) Ribonuclease Inhibitor 0,5µl
ImPromII Reverse Transkriptase 1,0µl
Die Annealing Temperatur wurde auf 25°C festgelegt und die anschließende
Elongation erfolgte bei 42°C für 60min. Mit 70°C für 15min wurde die Reaktion durch
Enzym Denaturierung gestoppt.
Um die Expression von IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R, den IGFBPs 1-7 in den bovinen
Zelllinien BCEC, F3, Fibroblasten und BUVEC sowie die Expression von IRS1-4 in
BCEC, F3 und Fibroblasten zu erfassen, wurde anschließend eine PCR durchgeführt.
Der Versuch wurde nach einem Promega PCR Protokoll durchgeführt, Reagenzien
wurden von Promega verwendet.
Reaction-Mix
5x Green go Taq Reaction Buffer 4µl
MgCl2 (25mM) 1,6µl
dNTP (10mM) 0,4µl
Primer forward (10µm) 1µl
Nuklease freies Wasser 10,9µl
Go Taq Polymerase (5u/µl) 0,1µl
Template (cDNA) 1µl
Als Negativ-Kontrolle wurde cDNA durch Nuklease freies Wasser ersetzt.
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Tab. 4: Verwendete PCR Primer
Ta Annealing temperature
Name Sequenz (5’ zu 3’) Amplicon Accession Ta
IGF1 For: CTA CAG TGA AGA TGC CCA TCA CA Rev: GGT GAA GGC GAG CAA GCA 65bp HQ324244.1 59°C
IGF2 For: TGC CTC TAC GAC CGT GCT T Rev: GAC TGC TTC CAG ATG TCA TAT TGG 80bp NM_174087.3 60°C
IGF1R For: GCT CAA CCC AGG GAA CTA CAC A Rev: GAT CCG TCC ACG ACC CAT T 70bp XM_002696504.1 60°C
IGF2R For: CCA GCA CTT CAG TCG CAA A Rev: GGT CGC CAT CTT GAA CGT 64bp NM_174352.2 56,5°C
IGFBP1 For: CAG TGA GCG CCG GTT CCT GT Rev: GTG AGT TCC GGG CAG GAG GC 200bp NM_174554.2 64,5°C
IGFBP2 For: GAC GGG AAC GTG AAC TTG AT Rev: ACC TGG TCC AAT TCC TGC T 212bp NM_174555.1 57°C
IGFBP3 For: CTG GCA TCT TTC CAC TTT CC Rev: AGA CGA AGC GCG TCT AAC AT 201bp NM_174557.3 57,3°C
IGFBP4 For: CCC AAG TCT GTG GGA GAA GA Rev: AAG GAC CTG GGG AGG AGT AA 198bp NM_174557.3 59,4°C
IGFBP5 For: TCG TGC GGC GTC TAC ACT Rev: GGG TGA GTA GGT CTC CTC T 207bp NM_001105327.1 59°C
IGFBP6 For: GCCCGGGTCTTCAGAAGGCG Rev: ATGTGAGGCCCCAGGGGTGA 188bp NM_001040495.1 64,5°C
IGFBP7 For: GGT GCC CAG GTG TAT TTG AG Rev: CAG CAC CCA GCC AGT AAC TT 183bp NM_001102300.1 59,4°C
IRS1 For: GAG CGG TAG TGG CAA ACT CT Rev: GGA ACT TGA GGA AAG GCG GA 228bp XM_002685642.1 59,4°C
IRS2 For: AGC CAA GTT CAC TGC CTC CTC Rev: GCT GGA GCC ATA CTC GTC CAA G 286bp XM_003582887.1 63°C
IRS3 For: CTC GCT ATA TTG GGG CCT GG Rev: AGC CTC CAC CTC TGA TGG AT 201bp XM_002698132.1 60,4°C
IRS4 For: CGC AAT GGT GGC AGA GAA TG Rev: ACA GAA CCT CCT CGT CGG TA 262bp XM_592483.3 59,4°C
RPS9 For: AAA CGT GAG GTC TGG AGG GTC AAA Rev :GCA ACA GGG CAT TAC TTC GAA CA 117bp NM_001101152 60°C
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Während der PCR wurde der Deckel des Cyclers auf 105°C erhitzt, um zu verhindern,
dass sich während dieses Vorgangs Flüssigkeit am Deckel sammelt. Die initiale
Denaturierung erfolgte bei 95°C für 2min. Daraufhin folgten 37 Zyklen, in denen zuerst
bei 94°C die Denaturierung (30s), dann bei 60°C die Primeranlagerung (45s) und
abschließend bei 72°C (30s) die Elongation stattfand. Anschließend folgte für 5min
eine finale Polymerisation. Für die Primer IGFBP 1-7 und IRS 1-4 wurde ein
abweichendes Programm gewählt, das sich dadurch unterschied, dass ein
Temperaturgradient von 60°C ± 3.5°C für das Annealing vorhanden war. Die jeweiligen
Ta können Tab.4 entnommen werden.
Die spezifischen PCR-Produkte wurden dann auf ein 2%iges Agarose-Gel, welches
Ethidiumbromid enthielt, aufgetragen und eine Elektrophorese bei 80mV in TBE-Puffer
durchgeführt.
Die Visualisierung erfolgte unter UV Licht mit der Vision-Capt Software (Vilber
Lourmat) und die Auswertung mittels Bio-1D.
3.1.9. Proteinbiochemie
Die Zellen wurden für diesen Versuch in Zellkulturschälchen ausgesät (40x11mm) und
für drei Tage in den Inkubator (37°C, 5%CO2) verbracht, um ein möglichst konfluentes
Wachstum zu erreichen. In die Zellkulturschälchen wurden jeweils 1,5ml FSM
gegeben. BUVEC wurden von diesen Versuchen ausgeschlossen, da in den
vorangehenden Untersuchungen zu Proliferation und Motilität keine signifikanten
Änderungen im Bezug zu FSM oder SFM beobachtet werden konnten.
- 40 -
Tab. 5: Verwendete Zellzahl/dish und Zelllinie für Western Blotting
Zelllinie Zellzahl/dish
BCEC 250.000
F3 150.000
Fibroblasten 150.000
War nach drei Tagen die Konfluenz erreicht, wurde das vorhandene FSM
abgenommen und für vier Stunden durch SFM ersetzt. Die Stimulation mit den
verschiedenen Faktoren erfolgte anschließend für 15min bzw. 7,5min im Inkubator.
Die eingesetzten Konzentrationen sind Tab. 6 zu entnehmen.
.
Tab. 6: Konzentrationen der untersuchten Wachstumsfaktoren im Western Blotting
Zelllinie Wachstumsfaktor
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF
BCEC 100ng/ml 100+20ng/ml 20ng/ml 50ng/ml 50+20ng/ml
F3 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml
Fibroblasten 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml
Nach Ablauf der Zeit wurde die Reaktion gestoppt, in dem die Schälchen auf Eis
gestellt wurden, das Medium unverzüglich abgesaugt und zweimal mit kaltem PBS
gespült wurde. Daraufhin wurden 75µl Boehringer Lyse-Puffer pro Zellkulturschälchen
dazugegeben, dieser enthielt AEBSF (1mM), Pepstatin (1µM), Leupeptin (1µg/ml)
sowie Phospahatase-Inhibitoren. Zur Zelllyse wurde auch weiterhin auf Eis gearbeitet
und die Zellen mit einem Policeman-Schaber abgelöst, das gewonnene Zelllysat
wurde in Eppendorfgefäße überführt und zentrifugiert (17.000g, 5min, 4°C). Im so
gewonnen Überstand ist das Protein nun enthalten.
- 41 -
Im Folgenden wurde die enthaltene Proteinmenge bestimmt, dazu wurde ein auf der
Proteinbestimmung nach Lowry basierendes DC Protein Assay Kit™ verwendet (Bio-
Rad, München). Grundlage dieses Verfahrens ist die Biuret-Reaktion, bei der durch
die Bindung von Cu2+O mit Peptidbindungen ein gefärbter Komplex entsteht. Wird die
Absorption dieses Komplexes nun bei 690nm im ELISA Reader Thermo Multiskan
(ThermoFischer Scientific Inc, USA) gemessen, kann durch den linearen
Zusammenhang mit der Proteinkonzentration, die Menge des enthaltenen Proteins in
der Probe bestimmt werden. Als Vergleichsprotein wurde Bovines Serum Albumin
verwendet.
Mithilfe der Geradengleichung wurde die benötigte Menge an Probe ermittelt
(10µg/15µg Protein/Probe). Die Differenz zwischen Füllmenge (20µl) der Taschen und
der benötigten Menge Probe, sowie 5µl 4xLämmli-Puffer mit ß-Mercaptoenthanol
wurde mit Boehringer-Lyse-Puffer aufgefüllt. Anschließend erfolgte eine kurze
Zentrifugation, danach wurden die Proteine auf dem Heizblock denaturiert (5min,
95°C). Es folgte nach dem Abstellen auf Eis ein abermaliges Zentrifugieren (2min,
17.000g).
Es wurde für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ein diskontinuierliches Gel,
bestehend aus Sammelgel, Trenngel und Stopfgel verwendet. Bei einer SDS-PAGE
werden die Proteine durch das negative geladene SDS (Natriumdodecylsulfat)
denaturiert und mit einer identischen Ladungsdichte ausgestattet. So werden sie,
ladungsunabhängig, nach Größe aufgetrennt. Außerdem werden Wechselwirkungen
unter den Proteinen verhindert. Durch Verwendung eines diskontinuierlichen Gels wird
eine bessere Auftrennung der Proteine erreicht. Für die isolierten Proteine wurden
jeweils 12%ige Trenngele verwendet. Die Gele wurden in die Apparatur eingespannt
und SDS-Laufpuffer eingefüllt, damit wurden auch die Geltaschen vor der Befüllung
gespült. Die Taschen wurden jeweils mit 20µl Probe, bzw. 5µl SDS-Marker (Sigma
Aldrich, SDS7B) befüllt. Bei einer Spannung von 100V wurde gewartet, bis sich eine
Lauffront gebildet hatte. Anschließend wurde die Spannung auf 150V erhöht und die
Proben benötigten ca. 1h, um das Gel zu durchlaufen.
Um die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran zu
überführen, wurde nun das Western Blotting durchgeführt. Angewendet wurde das
- 42 -
Wet-Blot System. Die verwendeten Geräte zur Gelherstellung sowie die Western-Blot-
Apparatur stammten von Bio-Rad (München). Die eingespannten Pakete aus
Schwämmchen, Filterpapieren (6x1mm), Nitrocellulosemembran und Gel wurden in
die Blot-Apparatur überführt und diese mit Blot-Puffer aufgefüllt. Unter Rühren und
Kühlung lief der Blot für 1h bei 100V. Die nun auf der Membran gebundenen Proteine
konnten im Folgenden für die Immunodetektion genutzt werden.
Die freien Bindungsstellen auf der Membran konnten mit Milchpulverlösung (5%
Magermilchpulver in TBS-T) blockiert werden, um unspezifische Bindungen zu
verhindern. Die Inkubation mit dem Erst-Antikörper erfolgte über Nacht bei 4°C auf
dem Rüttler, der entsprechende Antikörper wurde mit 5ml Magermilchpulver in TBS-T
und 5ml TBS1x zuvor vermischt. Es wurden folgende Antikörper verwendet:
Tab. 7: Im Western Blotting verwendete Antikörper mit jeweiliger Verdünnung
Antikörper Verdünnung
Phospho-MAP Kinase 42/44 (Sigma Aldrich) 1:10000
Phospho-Akt (Ser 473) (Cell Signaling) 1:4000
Phospho-p38-MAP Kinase (Cell Signaling) 1:4000
Am folgenden Tag wurde diese Lösung entfernt und die Membran 3x mit TBS-T
gewaschen (alle Waschschritte wurden auf dem Schüttler bei Raumtemperatur
durchgeführt). Der Zweit-Antikörper IgG-HRP wurde mit einer Verdünnung von 1:4000
(in TBS1x) für 1h dazugegeben. Für die pMAPK 42/44 wurde ein goat anti-mouse IgG-
HRP (sc-2005, Santa Cruz), für pAkt (Ser 473) und p38 MAPK wurden ein goat-anti-
rabbit IgG-HRP Zweit-Antikörper verwendet. Es folgte abermals 3x Waschen für je
10min.
Die Detektion erfolgte mit einer Fusion SL Chemilumineszenz-Detektionseinheit mit
entsprechender Fusion Software. Zuvor wurde die Membran mit Luminol und
- 43 -
Enhancer (SuperSignal® West Dura, Thermo Scientific) behandelt, um die
Chemilumineszenz zu ermöglichen.
Zur Normierung der Ergebnisse und internen Kontrolle folgte die Redetektion mit ß-
Aktin. Die Membran wurde 3x10min in TBS-T gewaschen und anschließend für 30min
im Stripping Buffer inkubiert, um die vorherigen Antikörper wieder zu lösen. Es folgte
nochmaliges Waschen mit TBS1x (3x10min). Auch in diesem Fall wurde die
unspezifische Bindung mittels Blocken durch Magermilchpulver verhindert (5%
Magermilchpulver in TBS-T), bevor der Antikörper ß-Aktin (C4) (sc-47778, Santa
Cruz), mit einer Verdünnung von 1:6000 für 1h bei Raumtemperatur einwirken konnte.
Danach wurde abermals für 3x10min mit TBS-T gewaschen und anschließend der
Zweitantikörper goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005, Santa Cruz) in einer Verdünnung
von 1:4000 aufgetragen, bei einer Einwirkzeit von 1h. Nach 3x10min Waschen wurde
die Redetektion durchgeführt, entsprechend der vorherigen Detektionsbeschreibung.
Im Anschluss an die Versuche wurden die Ergebnisse der Chemilumineszenz mit Hilfe
des Programms BIO-1D quantitativ analysiert und abschließend mit Excel
ausgewertet.
3.1.10. Statistische Auswertung
Die Ergebnisse aus den Versuchen der Proliferation, Motilität und der
Proteinbiochemie wurden mithilfe von SPSS-Software (SPSS, Chicago, IL, USA)
ausgewertet. Hierfür wurde der Tukey’s honestly significant difference (HSD) Test
angewendet, um signifikante Unterschiede zwischen stimulierten und unstimulierten
Zellen, sowie zwischen den einzelnen Stimulantien, zu erkennen. Signifikanzen
wurden ab p<0,05 festgelegt.
- 44 -
3.2. Untersuchung von Proben aus der In vivo Studie
3.2.1. Material und Gewebeentnahme und -aufbereitun g
Es standen Gewebeproben aus einem Kooperationsprojekt mit der Klinik für Rinder
und der Arbeitsgruppe Immunologie zur Verfügung, die im Rahmen der Dissertationen
von Fr. Dr. Lütkehus (Lütkehus, 2012) und Fr. Dr. Laue (Laue, 2014) gewonnen
wurden. Die Schritte 3.2.2. bis 3.3.2. wurden im Rahmen der Dissertationen von Fr.
Dr. Lütkehus (Lütkehus, 2012) und Fr. Dr. Laue (Laue, 2014) durchgeführt. Zur
besseren Verständlichkeit des Tierversuches, der vollständigen Beschreibung und
Nachverfolgbarkeit der Proben sind sie hier aufgeführt.
3.2.2. Gruppe 1: Proben der präpartalen Phase
Für diesen Anteil an der Studie wurden 17 klinisch gesunde, multipaare Kühe beprobt,
die alle aus dem gleichen Betrieb stammten (Großbetrieb der Agrargesellschaft mbH
Siedenlangenbeck, Kuhfelde). Die ausgewählten Kühe hatten alle einen
vergleichbaren Body Condition Score (BCS) und in der letzten Laktation eine
Milchleistung von nicht mehr als 9500kg. Außerdem befanden sich alle in der 2. oder
3. Laktationsperiode.
Den Versuchstieren wurde am 248. Tag der Trächtigkeit aus der V. caudalis mediana
Blut entnommen und der IGF1 Wert bestimmt. Daraus wurde die Zuteilung zur IGF-
high-Gruppe (180-250ng/ml IGF1) oder IGF-low-Gruppe (60-100ng/ml IGF1)
vorgenommen. Der Grenzwert zwischen den beiden Gruppen wurde auf 140ng/ml
festgelegt. So kam es zu einer Zahl von 10 Tieren in der IGF-high-Gruppe und 7 Tieren
in der IGF-low-Gruppe. Die Auswahl der Tiere mit der Blutentnahme und -analyse,
sowie die Betreuung und tägliche Untersuchung in der Zeit der Einstallung an der
Tierärztlichen Hochschule Hannover übernahm die Klinik für Rinder der Tierärztlichen
Hochschule Hannover.
- 45 -
Am 275. Tag der Trächtigkeit wurde bei den Kühen ein Kaiserschnitt, ohne
medikamentelle Einleitung, durchgeführt und nach der Entwicklung des Kalbes zwei
Plazentome entnommen. Hierfür wurde am Karunkelstiel ein Emaskulator angesetzt,
um die Blutungen einzudämmen, und anschließend das Plazentom mit einem Skalpell
abgesetzt. Im weiteren Verlauf entnahmen die Operateure interkarunkuläres
Uterusgewebe, mit einer Größe von ca. 5x10cm, ebenfalls mit einem Skalpell.
Zur weiteren histologischen Untersuchung war es nötig, die gewonnen Proben zu
fixieren. Dies erfolgte in Formalin nach Lillie sowie in Bouin’scher Lösung, für jeweils
48h. Die Proben der Plazentome enthielten sowohl maternale Anteile (Karunkelstiel)
als auch fetale Anteile (plazentomares Chorion) und interdigitierendes Gewebe. Sie
wurden vor der Fixierung in Scheiben geschnitten, um diese zu erleichtern. Auch das
interkarunkuläre Uterusgewebe wurde in ca. 10x10x5mm große Stücke zerschnitten
und fixiert. Nach abgeschlossener Fixierung wurden die Gewebeproben in
Einbettungskapseln überführt. Die formalinfixierten Proben wurden nun für etwa drei
Stunden unter fließendem Wasser gespült, um das Fixans zu entfernen und daran
anschließend in den Einbettungsautomaten (Fa. Leica, Nussloch) verbracht (siehe
3.3.2.) und abschließend in Paraffin eingebettet. Die Proben, welche in Bouin’scher
Lösung fixiert wurden, erfuhren eine abweichende Behandlung. Sie wurden zunächst
in 70%igen Alkohol überführt, der an mehreren aufeinander folgenden Tagen
gewechselt wurde. Auch hier mit dem Ziel, das Fixans auszuwaschen. Diese Proben
wurden nach ca. 1-2 Wochen in der Handeinbettung (siehe 3.3.1.) weiter bearbeitet.
3.2.3. Gruppe 2: Proben der postpartalen Phase
Die Tiere für diese Gruppe stammten aus demselben Betrieb. Es wurden 12 klinisch
gesunde und multipaare Kühe nach den gleichen Kriterien wie bereits angeführt
ausgewählt. Auch in diesem Fall wurde eine Einteilung in eine IGF-high- (n=6) und
eine IGF-low-Gruppe (n=6) unternommen. Die Versuchstiere der IGF-high-Gruppe
wiesen IGF1 Spiegel im Blut von 180-280ng/ml und die der IGF-low-Gruppe von 80-
140ng/ml auf.
- 46 -
In diesem Versuchsteil wurde die spontane Abkalbung abgewartet und 30min post
partum die Proben transvaginal gewonnen. Zu diesem Zeitpunkt wurden zwei
Plazentome mittels Emaskulator entnommen. Die Behandlung der Proben erfolgte wie
bereits in 3.2.2. beschrieben. Nun wurde der Abgang der Nachgeburt abgewartet,
erfolgte dieser nicht innerhalb von 12h post partum, wurde die Kuh von der Studie
ausgeschlossen. Dieser Fall trat mehrere Male ein, weshalb sich die Anzahl der Kühe
von je n=10 pro Gruppe auf jeweils n=6 dezimierte. Wenn die Nachgeburt abgegangen
war, wurde 1l einer NaCl-Lösung (39°C) (Braun, Melsungen, Deutschland), die mit
5mg LPS (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) versetzt war in den
Uterus eingegeben. Dies erfolgte mit einem transvaginalen Katheter und hatte das
Ziel, eine lokale Entzündungsreaktion hervorzurufen. Die Kühe wurden drei Stunden
später euthanasiert. Dies wurde intravenös mit Pentobarbital-Natrium (Release®,
WDT, Garbsen, Deutschland), in einer Dosierung von 30000mg vorgenommen. Der
Uterus wurde im Folgenden komplett entnommen, hierfür wurden die Tiere an den
Hinterbeinen aufgehängt und 2-5cm kranial des Euteransatzes ein etwa 50cm langer,
transversaler Schnitt, zur Eröffnung der Bauchhöhle vorgenommen. Der Uterus wurde
kaudal der Zervix abgesetzt.
Nun erfolgte eine erneute Beprobung, um die Proben vor und nach LPS-Instillation
miteinander vergleichen zu können. Dazu wurde der Uterus an seiner dorsalen Seite
eröffnet und mittels eines Skalpells zwei Plazentome entnommen. Es wurde ebenfalls
ein ca. 5x10cm großes Stück interkarunkuläres Uterusgewebe gewonnen. Die
Vorbereitungen zur histologischen Untersuchung wurden, wie bereits in 3.2.2.
beschrieben, vorgenommen.
Die Tierversuche, wie in 3.2.2. und 3.2.3. beschrieben, sind vom Niedersächsischen
Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Laves, Oldenburg,
genehmigt worden; AZ 33.9-42502-04-09/1696.
- 47 -
3.3. Histologie
3.3.1. Protokoll der Handeinbettung
Alle Schritte liefen bei Raumtemperatur ab, abweichende Temperaturen sind
angegeben.
70% Ethanol über Nacht
80% Ethanol über Nacht
100% Ethanol 2h
100% Ethanol 2h
Isopropanol 2h
Xylol I 2h
Xylol II 2h
Paraffin I (ca. 62°C) über Nacht
Paraffin II (ca. 62°C) 2h
Paraffin III (ca. 62°C) 1h
3.3.2. Protokoll der automatischen Einbettung
Alle Schritte liefen bei Raumtemperatur ab, es sei denn die abweichende Temperatur
ist angegeben. Programm: Routine Overnight.
70% Ethanol Prä (Warteschritt) 2h
70% Ethanol 1,5h
80% Ethanol 1,5h
90% Ethanol 1,5h
100% Ethanol 1h
- 48 -
100% Ethanol 1h
Isopropanol 1h
Xylol I 1h
Xylol II (35°C) 1h
Xylol III (50°C) 1h
Paraffin I (62°C) 1h
Paraffin II (62°C) 1h
Paraffin III (62°C) 1h
Nach beiden Einbettungsvorgängen wurden die Kapseln geöffnet und die Proben auf
der Einbettstation (Fa. Leica, Nussloch) in 60°C warme Metallförmchen gegeben, die
dann mit flüssigem Paraffin ausgegossen wurden. Zum Aushärten wurden die
ausgegossenen Proben anschließend auf eine 5°C kalte Platte gelegt. Es folgte die
Entfernung aus den Förmchen und bis zur weiteren Bearbeitung wurden die so fertig
aufbereiteten Proben in speziellen Aufbewahrungsboxen (Fa. Medite, Burgdorf) bei
Raumtemperatur gelagert.
3.6.3.Vorbereitung der Schnitte für Histologie und Immunhistochemie
Von den gekühlten Paraffin eingebetteten Proben wurden mit einem
Rotationsmikrotom (Fa. Leica, Nussloch) 4µm dicke Schnitte hergestellt. Diese wurden
vorsichtig in ein Wasserbad überführt, welches mit destilliertem, erwärmtem Wasser
gefüllt war. Anschließend wurden sie auf silanbehandelte, gläserne Objektträger
(HistoBond® adhäsive Objektträger, Marienfeld, Laboratory Glassware, Lauda-
Königshofen) aufgezogen und zum Trocknen über Nacht in einen Wärmeschrank
(60°C) verbracht. Die gebrauchsfertigen Objektträger wurden dann bis zum Färben in
speziellen lichtdichten Aufbewahrungskisten bei Raumtemperatur gelagert.
- 49 -
3.3.4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Um die Morphologie der einzelnen Proben besser beurteilen zu können und Schnitte
für die folgende immunhistochemische Behandlung auszuwählen, wurden die Schnitte
im Vorfeld mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt.
Diese dichromatische Färbung ermöglicht es, basophile Strukturen, wie zum Beispiel
Zellkerne, von azidophilen Strukturen, wie unter anderem dem Zytoplasma, zu
unterscheiden.
Die Entparaffinierung der Schnitte erfolgte zunächst mittels Xylol-Behandlung, eine
Rehydrierung mittels absteigender Alkoholreihe wurde angeschlossen und mit Aqua
dest. beendet.
Xylol I 10min
Xylol II 10min
Isopropanol (99%) 2min
Ethanol (99%) 2min
Ethanol (80%) 2min
Ethanol (70%) 2min
Aqua dest 2min
Nach der erfolgten Rehydrierung wurden die Schnitte 6min in Hämalaun nach Delafield
gefärbt und anschließend kurz in 0,1% HCl gespült. Daran angeschlossen wurde ein
15-minütiges Spülen unter Leitungswasser, um ein Bläuen der Schnitte, durch
Erhöhung des pH-Wertes zu erreichen. Die Färbung in 0,1% Eosin erfolgte für 5min
unter Zugabe von 3-4 Tropfen Eisessig. Auch nach dieser Färbung erfolgte Spülen in
Aqua dest.
Die nächsten Schritte dienten der Dehydrierung:
Ethanol (70%) zweimaliges Spülen
Ethanol (80%) zweimaliges Spülen
Ethanol (99%) 2min
Isopropanol (99%) 2min
- 50 -
Xylol I 5min
Xylol II 5min
Am Ende wurden die Schnitte mit Eukitt und Deckgläschen eingedeckt.
3.3.5. Immunhistochemie
Zunächst wurden die Schnitte wie folgt entparaffiniert und rehydriert:
Xylol 2x10min
Isopropanol 2min
absoluter Alkohol 2min
Ethanol (80%) +H2O2 (30%) 30min
Ethanol (70%) 2min
Es folgten drei Waschschritte mit PBS (je 5min), bevor eine Citrat Puffer (pH 6,0)
Vorbehandlung angeschlossen wurde, um eine bessere Bindung der Antikörper an die
Antigene zu ermöglichen.
Die Schnitte verblieben bei 96-99°C für 15min in dem Puffer. Nach Abkühlung auf circa
60°C folgten abermals drei Waschschritte mit PBS (je 5min). Um unspezifische
Bindungen zu verhindern, wurden 80µl Ziegennormalserum (20%) auf jeden Schnitt
aufgetragen. Diese Behandlung erfolgte in einer feuchten Kammer für 20min. Im
Anschluss wurden jeweils 80µl des Antikörpers IRS1(sc-559) (siehe Tab.8), in einer
Verdünnung von 1:500 (in PBS/BSA), auf die Plazentom-Schnitte und 1:250 auf die
Uterus-Schnitte aufgetragen und in der feuchten Kammer bei 4°C über Nacht inkubiert.
Nach etwa 12h wurde überschüssiger, nicht gebundener Antikörper mit drei
Waschschritten PBS1x (je 5min) entfernt. Der Zweit-Antikörper (Envision rabbit,
DAKO) wurde dann aufgetragen und konnte 30min einwirken. Abermals folgten drei
Waschschritte mit PBS (je 5min). Im nun folgenden Schritt wurde DAB auf die Proben
- 51 -
aufgetragen. Dieses wurde durch die an den Zweitantikörper gebundene Peroxidase
reduziert und es erfolgte im Fall eines positiven Nachweises eine braune Farbreaktion.
Es folgte wieder ein Waschschritt in PBS (5min) und im Anschluss wurden die Proben
10min unter fließendem Wasser gespült. Zur besseren Differenzierung während des
Auswertens erfolgte eine Gegenfärbung mit Hämalaun nach Delafield (1sec) und
wiederum 10-minütiges Spülen unter fließendem Leitungswasser, um eventuelle
Farbreste zu entfernen.
Zur Dehydrierung wurden die Proben mit einer Alkoholreihe behandelt:
Ethanol (70%) 2min
Ethanol (80%) 2min
absoluter Ethanol 2min
Isopropanol 2min
Xylol 2x5min
Abschließend wurden die einzelnen Schnitte mit Eukitt eingedeckelt. Bis zur
Auswertung wurden die Schnitte in lichtdichten Boxen bei Raumtemperatur
aufbewahrt.
Die Behandlung der Schnitte für eine Färbung mit IRS2 (sc1555) (siehe Tab. 8) wich
in folgenden Schritten ab: Das Blockieren unspezifischer Bindungen erfolgte mit
Pferdeserum (1:5) und es wurde ein Zwei-Schrittpolymersystem verwendet (DCS
Supervision, 2-Schrittpolymersystem, Hamburg). Hier wurde nach dem Abwaschen
des Erst-Antikörpers ein Polymer-Enhancer auf die Schnitte aufgetragen, der für 20min
einwirken musste. Im nächsten Schritt wurde ein HRP-Polymer für 30min auf die
Schnitte gegeben. Nach diesen vorbereitenden Arbeitsschritten erfolgte die Zugabe
von DAB (DCS) für 10min. Zwischen den einzelnen Behandlungen erfolgte jeweils
dreimaliges waschen mit PBS.
Zum Ausschluss unspezifischer Bindungen wurden Negativkontrollen mitgeführt, bei
denen der Primärantikörper durch PBS ersetzt wurde, ansonsten erfuhren sie die
- 52 -
gleiche Behandlung. Als Isotypenkontrolle dienten IgG aus Ziegen-, bzw.
Pferdeserum.
Pro Versuchstier und Gewebe wurden jeweils zwei Schnitte von unterschiedlichen
Proben untersucht.
Die Auswertung wurde nach folgenden Kriterien vorgenommen:
- negativ, keine Anfärbung
(+) schwach positive Reaktion
+ positive Reaktion
++ sehr stark positive Reaktion
Var. variable Reaktion
Tab. 8: In der Immunhistochemie verwendete Primärantikörper
Antikörper Spezifität Konzentration
(µg/ml) Detektionssystem Herkunft
IRS1 Kaninchen IgG,
polyklonal
0,4 Plazentom
0,8 Uterus
DAKO Envision+ System/rabbit, HRP
Santa Cruz
(sc-559)
IRS2 Ziege IgG, monoklonal
0,4 SuperVision2 two-
step polymer system anti-goat
Santa Cruz
(sc-1555)
.
- 53 -
4. Ergebnisse
4.1. Ergebnisse der in vitro Versuche
4.1.1. Ergebnisse der RT-PCR
Mittels konventioneller RT-PCR und anschließender Gelelektrophoerese wurde die
Expression der Liganden IGF1 und IGF2, der Rezeptoren IGF1R und IGF2R, der
IGFBPs 1-7 und der Adaptermoleküle IRS1-4 in den verwendeten Zelllinien
untersucht. Es wurden für jede cDNA eine Positivkontrolle mit RPS9 durchgeführt und
zur Kontrolle der Primer jeweils eine Negativkontrolle.
Die Expression spezifischer mRNA der untersuchten Wachstumsfaktoren und der
dazugehörigen Rezeptoren konnte bei allen untersuchten Zellarten (BCEC, F3,
Fibroblasten, BUVEC) nachgewiesen werden (Abb. 5). Bis auf das IGFBP 3, welches
bei F3 und Fibroblasten nicht gezeigt werden konnte, wurden die IGF-
Bindungsproteine 1-7 bei den untersuchten Zelllinien ebenfalls nachgewiesen (Abb.
4). BCEC und F3 exprimierten jeweils nur IRS1, aber nicht IRS2, 3 oder 4, während
Fibroblasten spezifische mRNA für IRS1 und IRS3 enthielten, nicht aber für IRS2 und
IRS4 (Abb. 6). Allerdings können für die Primer IRS2 und IRS4 falsch negative
Ergebnisse, aufgrund nicht durchgeführter Positivproben, mit der durchgeführten
Methode nicht ausgeschlossen werden. Anhand der Bandenhöhe und der erwarteten
Produktgröße (siehe Tab. 4) konnten die Ergebnisse verifiziert werden. Pro Gen war
jeweils eine spezifische Bande zu sehen.
- 54 -
F3 Zellen Fib roblasten
M BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 BP7 BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 BP7 NK RPS9
BCEC BUVEC
M BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6 BP7 BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 NK RPS9 BP6 BP7
Abb. 4: Expression von IGFBPs bei F3/Fibroblasten u nd BCEC/BUVEC Qualitativer Nachweis von IGFBP1-7 (BP1-7) bei F3 Zellen/Fibroblasten, BCEC und darauf folgend BUVEC auf mRNA-Ebene mittels konventioneller RT-PCR und daran anschließender Agarose-Gelelektrophorese. M=100bp DNA-Marker, NK=Negativkontrolle, RPS9=Ribosomales Protein S9, Positivkontrolle.
- 55 -
F3 Zellen Fibroblasten
M IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R NK RPS9
BCEC BUVEC
M IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R IGF1 IGF2 IGF1R IGF2R NK RPS9
Abb. 5: Expression von IGF1, IGF2, IGF1R und IGF2R bei F3/Fibroblasten und BCEC/BUVEC Qualitativer Nachweis von IGF1, IGF2 sowie der IGF1 und IGF2 Rezeptoren (IGF1R/IGF2R) bei F3 Zellen/Fibroblasten, BCEC und darauf folgend BUVEC auf mRNA-Ebene mittels konventioneller RT-PCR und daran anschließender Agarose-Gelelektrophorese. M=100bp DNA-Marker, NK=Negativkontrolle, RPS9=Ribosomales Protein S9, Positivkontrolle.
- 56 -
F3 Zellen BCEC
M IRS1 IRS2 IRS3 IRS4 IRS1 IRS2 IRS3 IRS4 NK RPS9 M
Fibroblasten
M IRS1 IRS2 IRS3 IRS4 NK RPS9 M
Abb. 6: Expression von IRS1, 2, 3 und 4 bei F3, BCE C und Fibroblasten Qualitativer Nachweis von IRS1-4 bei F3 Zellen, BCEC und Fibroblasten auf mRNA-Ebene mittels konventioneller RT-PCR und daran anschließender Agarose-Gelelektrophorese. M=100bp DNA-Marker, NK=Negativkontrolle, RPS9=Ribosomales Protein S9, Positivkontrolle.
4.1.2. Untersuchung des Einflusses von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF und
IGF2+EGF auf die Proliferation plazentarer Zellen in vitro
Da die Proliferation für die Funktion der Plazenta eine wichtige Rolle einnimmt, wurde
diese mittels MTT-Assays untersucht. Es erfolgte eine Stimulation der BCEC, F3 und
Fibroblasten mit den Liganden des IGF-Systems, EGF sowie Kombinationen von
IGF1+EGF und IGF2+EGF.
- 57 -
Im Folgenden sind die Ergebnisse der Proliferations-Assays dargestellt. Hierbei wurde
die Proliferation stimulierter Proben in Bezug zur Proliferation der unstimulierten
Proben (BCEC, F3, Fibroblasten: SFM) gesetzt. Alle Werte sind in Prozent angegeben
und die Proliferation der unstimulierten Kontrolle entspricht 100%. Die Konzentration
der Stimulantien wurde in Vorversuchen ermittelt, genauso wie die Stimulationsdauer,
bei der sich 48h als optimal erwies. Da bei den BUVEC schon in den Vorversuchen
keine Steigerungen der Proliferation nach den verschiedenen Stimulationen zu
verzeichnen waren, wurden sie von den Endversuchen ausgeschlossen und sind im
Folgenden nicht weiter aufgeführt.
- 58 -
4.1.2.1. Proliferation nach Stimulation mit IGFs un d EGF bei BCEC
Die Stimulation mit IGF1 führte bei BCEC zu einer signifikanten Steigerung der
Proliferation (151%), während die Applikation von IGF2 oder EGF keinen signifikanten
Einfluss hatte. Die Proliferation, verursacht durch die Kombination IGF1+EGF, war
vergleichbar zur alleinigen Stimulation mit IGF1 (177%). Die Stimulation mit einer
Kombination aus IGF2+EGF verursachte einen signifikanten Anstieg der Proliferation
(190%), obwohl sowohl IGF2 (114%) als auch EGF (121%) alleine keine signifikanten
Steigerungen erzielten. Die Wachstumskontrolle mit FSM erzielte ebenfalls eine
signifikante Steigerung der Proliferation bei den BCEC (siehe Abb. 7.).
Abb. 7: Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IG F2 und EGF bei BCEC Signifikante Steigerungen im Vergleich zu SF wurden durch IGF1, IGF1+EGF und IGF2+EGF erreicht. Wurde IGF1 oder IGF2 mit EGF kombiniert, konnte eine signifikante Steigerung verglichen mit EGF erzielt werden. Genauso verhielt es sich mit IGF2 und IGF2+EGF. *, statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) der einzelnen Behandlungen im Vergleich zur Kultur in serumfreiem Medium (SF); # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.
BCEC
0
50
100
150
200
250
FSM SF SF+IGF1100ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF250ng/ml
SF+IGF2+EGF
Pro
lifer
atio
n (%
)
*
*
**
*
*
*
BCEC
0
50
100
150
200
250
FSM SF SF+IGF1100ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF250ng/ml
SF+IGF2+EGF
Pro
lifer
atio
n (%
)
*
*
**
BCEC
0
50
100
150
200
250
FSM SF SF+IGF1100ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF250ng/ml
SF+IGF2+EGF
Pro
lifer
atio
n (%
)
*
*
**
*
*
*
#
# #
- 59 -
4.1.2.2. Proliferation nach Stimulation mit IGFs un d EGF bei F3 Zellen
Bei den F3 Zellen wurde durch die Stimulation mit IGF1 (139%), IGF2 (135%) und
EGF (182%) jeweils eine signifikante Steigerung der Proliferation erreicht, wobei die
durch EGF verursachte Erhöhung am deutlichsten war. Die Kombination von
IGF1+EGF (191%) resultierte in einer Steigerung, welche vergleichbar mit der nach
Applikation von EGF alleine, aber signifikant höher als nach IGF1-Applikation, war.
Hervorzuheben ist die Kombination von IGF2+EGF (148%), diese verursachte eine
Steigerung der Proliferation, die einerseits signifikant schwächer war, als die durch
EGF verursachte Erhöhung und andererseits erheblich höher, als nach Stimulation mit
IGF2. Auch durch FSM wurde ein signifikanter Anstieg der Proliferation verzeichnet
(siehe Abb. 8).
Abb. 8: Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IG F2 und EGF bei F3 Zellen Alle durchgeführten Stimulationen führten bei F3 Zellen zu signifikanten,* (p<0,05), Steigerungen gegenüber SF. Durch Kombination von IGF1+EGF konnte eine signifikant höhere Proliferation als bei alleiniger Gabe von IGF1 erreicht werden. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.
F3
0
50
100
150
200
250
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF 1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Pro
lifer
atio
n (%
) **
**
**
F3
0
50
100
150
200
250
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF 1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Pro
lifer
atio
n (%
) **
**
**
*
*
*# #
#
- 60 -
4.1.2.3. Proliferation nach Stimulation mit IGFs un d EGF bei Fibroblasten
Ein signifikanter Anstieg der Proliferation bei Fibroblasten konnte durch Stimulation mit
IGF1 (172%) und IGF2 (141%), aber nicht EGF (109%) erreicht werden. Durch die
Kombination von IGF1+EGF (187%) konnte ein signifikanter Anstieg der Proliferation
beobachtet werden, der sich auch deutlich von der Stimulation mit den einzelnen
Wachstumsfaktoren abhob. Die Stimulation mit IGF2+EGF (147%) führte hingegen zu
einem ähnlichen Anstieg der Proliferation wie bei einer Stimulation mit IGF2 allein, war
allerdings signifikant höher als bei Stimulation mit EGF. FSM erreichte den höchsten
signifikanten Anstieg der Proliferation bei den Fibroblasten (siehe Abb. 9).
Abb. 9: Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IG F2 und EGF bei Fibroblasten Signifikante,* (p<0,05), Steigerungen der Proliferation gegenüber der Kultur in serumfreien Medium wurden durch Stimulation allen Faktoren außer EGF erzielt. Die Kombination von IGF1+EGF führte zu einer signifikant höheren Proliferation als die Stimulation mit EGF oder IGF1 alleine. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.
Fibroblasten
0
50
100
150
200
250
300
350
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2 100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Pro
lifer
atio
n (%
)
*
**
* *
Fibroblasten
0
50
100
150
200
250
300
350
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2 100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Pro
lifer
atio
n (%
)
*
**
* *
*
*
*
#
#
#
- 61 -
4.1.3. Einfluss von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGf und I GF2+EGF auf die Motilität
plazentarer Zellen in vitro
Es werden die Auswirkungen der unterschiedlichen Stimulationen auf die Motilität der
untersuchten Zellen dargestellt, welche mit dem Live Cell Imaging ermittelt wurden.
Die Stimulationsdauer betrug 18h. Dabei wurden stimulierte Proben in Bezug zu
unstimulierten Proben gesetzt (SFM) und Werte in Prozent angegeben. Die Motilität
der unstimulierten Zellen entspricht dabei 100%.
- 62 -
4.1.3.1. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei BCEC
Die Stimulation mit IGF1 (124%), IGF1+EGF (137%), EGF (130%), IGF2 (123%) und
IGF2+EGF (130%) führte zu einem signifikanten Anstieg der Motilität bei BCEC. Durch
die kombinierte Stimulation mit IGF1+EGF wurde ein leichter, aber nicht signifikanter
Anstieg der Motilität verzeichnet, wo hingegen die Kombination von IGF2+EGF keinen
deutlichen Anstieg, verglichen mit den einzelnen Faktoren, bewirkte (siehe Abb. 10).
Abb. 10: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, I GF2 und EGF bei BCEC Die Stimulation mit allen untersuchten Wachstumsfaktoren führte zu einer signifikanten,* (p<0,05), Erhöhung der Motilität gegenüber der Kultur in serumfreiem Medium.
BCEC
0
20
40
60
80
100
120
140
160
FSM SF SF+IGF1100ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF250ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
**
**
*
BCEC
0
20
40
60
80
100
120
140
160
FSM SF SF+IGF1100ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF250ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
**
**
*
- 63 -
4.1.3.2. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei F3 Zellen
Bei den F3 Zellen wurde nach Stimulation mit IGF1 (135%), IGF1+EGF (150%),
IGF2+EGF (181%) und EGF (157%) eine signifikante Steigerung der Motilität
beobachtet. Durch die Stimulation mit IGF1+EGF konnte eine signifikante Steigerung
der Motilität, im Vergleich zur alleinigen Stimulation mit IGF1 erreicht werden. Genauso
führte eine Kombination von IGF2+EGF bei den F3 mit einem synergistischen Effekt
zu einer signifikanten Steigerung der Motilität. Auch mit dem FSM konnte ein
signifikanter Anstieg der Motilität beobachtet werden (siehe Abb. 11).
Abb. 11: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, I GF2 und EGF bei F3 Zellen Durch die Kombination von IGF2 mit EGF konnten signifikante, * (p<0,05), Steigerungen der Proliferation im Bezug zur alleinigen Stimulation mit IGF2 oder EGF erreicht werden. Auch die Kombination von IGF1+EGF brachte eine signifikant höhere Motilität als IGF alleine. Alle untersuchten Wachstumsfaktoren, bis auf IGF2, erhöhten signifikant die Proliferation verglichen mit SF. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.
F3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
**
* *
*
F3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
**
* *
*
*
*
*#
#
#
- 64 -
4.1.3.3. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei Fibroblasten
Die Applikation von IGF1 (117%) und IGF2 (117%) führte bei den Fibroblasten zu einer
signifikanten Steigerung der Motilität. Wurden IGF1+EGF (98%) kombiniert, konnte
kein Anstieg der Motilität verzeichnet werden. Der Einfluss von EGF schien sich in
diesem Fall durchzusetzen und es wurden die antagonistischen Effekte auf
Fibroblasten sichtbar. EGF (97%) alleine erreichte keine Steigerung der Motilität bei
Fibroblasten. Auch bei IGF2+EGF (112%) konnten keine synergistischen Effekte
beobachtet werden, der Anstieg der Motilität war vergleichbar mit dem Anstieg der
Motilität nach Stimulation mit IGF2. FSM verzeichnete ebenfalls einen signifikanten
Anstieg der Motilität (siehe Abb. 12).
Abb. 12: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, I GF2 und EGF bei Fibroblasten Durch Stimulation mit IGF1, IGF2 und IGF2+EGF wurden signifikante, * (p<0,05), Steigerungen der Proliferation gegenüber Stimulation mit SF nachgewiesen. IGF1+EGF und EGF hatten keinen positiven Einfluss auf die Proliferation. # über Klammern bezeichnet Signifikanzen zwischen den jeweils eingefassten Balken.
Fibroblasten
0
20
40
60
80
100
120
140
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
* * * *
Fibroblasten
0
20
40
60
80
100
120
140
FSM SF SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
* * * *
* *# #
- 65 -
4.1.3.4. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EG F bei BUVEC
Die Stimulation mit EBM (121%), EGF (109%) und IGF2+EGF (116%) führte zu einer
signifikanten Steigerung der Motilität bei den BUVEC. Durch alle anderen Stimulanzien
konnten keine Steigerungen erreicht werden (siehe Abb. 13).
Abb. 13.: Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei BUVEC Durch Stimulation mit EBM, IGF2+EGF und EGF konnten signifikante, * (p<0,05), Erhöhungen der Motilität im Vergleich mit SF festgestellt werden.
BUVEC
0
20
40
60
80
100
120
140
EBM EBM1% SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
BUVEC
0
20
40
60
80
100
120
140
EBM EBM1% SF+IGF150ng/ml
SF+IGF1+EGF
SF+EGF20ng/ml
SF+IGF2100ng/ml
SF+IGF2+EGF
Zel
lmot
ilitä
t(%
)
***
- 66 -
4.1.4. Aktivierung verschiedener Signalwege in plaz entaren Zellen in vitro
In den Versuchen zu Proliferation und Motilität (siehe Kapitel 4.1.2. und 4.1.3.) wurde
deutlich, dass durch verschiedene Wachstumsfaktoren und deren Kombinationen
jeweils Veränderungen erreicht werden konnten. Um die möglichen intrazellulären
Signalwege genauer einzugrenzen, die nach Stimulation für Steigerungen des
Zellwachstums und Zellmotilität verantwortlich sind, wurden mittels Western Blot der
MAP Kinase 42/44 (MAPK 42/44), Akt Kinase (Akt) und p38-MAP Kinase (p38 MAPK)
Signalweg untersucht. Die BUVEC wurden aus bereits genannten Gründen
ausgeschlossen (Kapitel 4.1.2.). Jeder Versuch wurde dreimal (BCEC und F3-Zellen)
bzw. zweimal (Fibroblasten) durchgeführt. Zur Normierung der Ergebnisse und
internen Kontrolle erfolgte die Redetektion mit ß-Aktin.
4.1.4.1. Aktivierung des MAP Kinase 42/44, Akt-Kina se und p38-MAP Kinase
Signalwegs bei BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten
Bei den BCEC konnte weder durch Stimulation mit IGF1 noch durch die Applikation
von IGF2 eine Aktivierung der untersuchten Signalwege beobachtet werden. EGF
allerdings verursachte eine Aktivierung aller drei Signalwege. Wurde EGF dann mit
IGF1 oder IGF2 kombiniert, wurden in beiden Fällen MAPK 42/44 und p38 MAPK
aktiviert, allerdings konnte keine Veränderung, verglichen mit EGF alleine, dargestellt
werden. Die durch EGF induzierte Aktivierung von Akt wurde durch Kostimulation mit
IGF1 und IGF2 aufgehoben (siehe Abb. 14 und 15).
Bei Stimulation von F3 mit allen untersuchten Faktoren konnte eine Aktivierung von
MAPK 42/44 und Akt beobachtet werden. Eine Aktivierung von p38 MAPK konnte
allerdings nur durch IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF erzielt werden (siehe Abb.16
und 17).
Bei den Fibroblasten konnte durch alle durchgeführten Stimulationen eine Aktivierung
von MAPK 42/44, Akt und p38 MAPK festgestellt werden (siehe Abb. 18 und 19). In
- 67 -
Tab. 9 ist eine Zusammenfassung der Ergebnisse des Western Blotting bei BCEC, F3
und Fibroblasten für alle untersuchten Signalwege dargestellt.
- 68 -
4.1.4.2. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei BCEC
Abb. 14: Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und p38 MA PK bei BCEC Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase, sowie die Ladungskontrolle mit Aktin (42kDa), in BCEC. Abb. 14 zeigt die Banden, welche durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht wurden, MAPK 42/44 (42/44kDa), Akt (60kDa) und p38 MAPK (43kDa). Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min.
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
- 69 -
Abb. 15: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei BCEC Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase in BCEC. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. In Abb. 15 sind die arithmetischen Mittelwerte aufgetragen ±SEM der densitometrisch ermittelten Werte in Bezug zur unstimulierten Kontrolle (0min).
BCEC
-200
0
200
400
600
800
1000
IGF17.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF27.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
(%
)
MAPK 42
MAPK 44
-100-50
0
50
100
150200
250
300
350400450
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF7.5min
IGF1+EGF15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
Akt
(%)
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF15min
0min
Akt
ivie
rung
der
p38
MA
PK
(%
)
BCEC
-200
0
200
400
600
800
1000
IGF17.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF27.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
(%
)
BCEC
-200
0
200
400
600
800
1000
IGF17.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF27.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
(%
)
MAPK 42
MAPK 44
MAPK 42
MAPK 44
-100-50
0
50
100
150200
250
300
350400450
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF7.5min
IGF1+EGF15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
Akt
(%)
-100-50
0
50
100
150200
250
300
350400450
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF7.5min
IGF1+EGF15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
Akt
(%)
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF15min
0min
Akt
ivie
rung
der
p38
MA
PK
(%
)
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF15min
0min
Akt
ivie
rung
der
p38
MA
PK
(%
)
- 70 -
4.1.4.3. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei F3 Zellen
Abb. 16: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt und p38 MA PK bei F3 Zellen Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase, sowie die Ladungskontrolle mit Aktin (42kDa), bei F3 Zellen. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. Abb. 16 zeigt die Banden, welche durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht wurden, MAPK 42/44 (42/44kDa), Akt (60kDa) und p38 MAPK (43kDa).
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
- 71 -
Abb. 17: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei F3 Zellen Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase bei F3 Zellen. In Abb. 17 sind die arithmetischen Mittelwerte aufgetragen ±SEM der densitometrisch ermittelten Werte in Bezug zur unstimulierten Kontrolle (0min). Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min.
MAPK42
MAPK44
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
Akt
(%
)
0
100
200
300
400
500
600
700
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
p38
MA
PK
(%
)
0%
20000%
40000%
60000%
80000%
100000%
120000%
140000%
0%
200%
400%
600%
800%
1000%
1200%
1400%
IGFI 7.5minIGFI 15minIGFI+EGF 7.5minIGFI+Egf 15minEGF 7.5minEGF 15minIGFII 7.5minIGFII 15minIGFII+Egf 7.5minIGFII+EGF 15min0min
F3-Zellen
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
42
(%)
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
44
(%)
- 72 -
4.1.4.4. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei Fibroblasten
Abb. 18: Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und p38MAP K bei Fibroblasten Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase, sowie die Ladungskontrolle mit Aktin (42kDa), bei Fibroblasten. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. Abb 18 zeigt die Banden, welche durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht wurden, MAPK 42/44 (42/44kDa), Akt (60kDa) und p38 MAPK (43kDa).
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF NK 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min 7.5min 15min
- 73 -
Abb. 19: Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase nach Stimulation mit IGF1, IGF2 und EGF bei Fibroblasten Dargestellt ist der Einfluss von IGF1, IGF1+EGF, EGF, IGF2 und IGF2+EGF auf die Aktivierung von MAP Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase bei Fibroblasten. Die Stimulationsdauer betrug 7.5 und 15min. In Abb.19 sind die arithmetischen Mittelwerte aufgetragen ±SEM der densitometrisch ermittelten Werte in Bezug zur unstimulierten Kontrolle (0min).
Fibroblasten
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
(%
)
MAPK42MAPK44
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
Akt
(%)
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
p38
MA
PK
(%
)
Fibroblasten
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
(%
)
Fibroblasten
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
MA
PK
(%
)
MAPK42MAPK44MAPK42MAPK44MAPK42MAPK44
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
Akt
(%)
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
Akt
(%)
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
p38
MA
PK
(%
)
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
IGF1 7.5min
IGF1 15min
IGF1+EGF 7.5min
IGF1+EGF 15min
EGF 7.5min
EGF 15min
IGF2 7.5min
IGF2 15min
IGF2+EGF 7.5min
IGF2+EGF 15min
0min
Akt
ivie
rung
der
p38
MA
PK
(%
)
- 74 -
Tab. 9: Übersicht über die Aktivierung der verschiedenen Signalwege bei F3 Zellen,
Fibroblasten und BCEC
- keine Aktivierung, + Aktivierung nach 7.5min und 15min, -/+ Aktivierung nach 15min aber nicht 7.5min, +/- Aktivierung nach 7.5min aber nicht 15min. Orange Felder: antagonistische Wirkung, lila Felder: synergistische Wirkung der Stimulantien.
- 75 -
4.2. Ergebnisse der in vivo Studien
4.2.1. Morphologie von interplazentomarem Gewebe un d Plazentom
Es konnten deutliche Unterschiede der Morphologie zwischen den Proben der
präpartalen Kaiserschnittgruppe (Gruppe 1) und den Plazentomen der postpartalen,
mit LPS behandelten Gruppe 2 ausgemacht werden. Ähnliches beschreiben Laue
(2014) und Lütkehus (2012), deren Untersuchungen mit dem gleichen Probenmaterial
durchgeführt wurden.
Bei den während des Kaiserschnitts entnommenen Proben konnte eine gute
Unterscheidung der einzelnen Zelltypen vorgenommen werden, sowohl das
mütterliche Gewebe, als auch der fetale Anteil waren noch vollständig erhalten und
intakt. Die Proben aus der postpartalen Gruppe, welche drei Stunden nach LPS-
Instillation genommen wurden, wiesen einen größeren Zusammenhangsverlust
zwischen maternalem und fetalem Anteil des Plazentoms auf und das Karunkelepithel
war deutlich abgeflacht. Erwartungsgemäß war auch die Anzahl der TGC geringer.
Nach der LPS-Instillation genommene Proben zeigten insgesamt eine hohe
Gewebsdegradation mit viel Zelldetritus und wiesen außerdem einen erhöhten Anteil
an Immunzellen auf. Diese wiesen kein einheitliches Erscheinungsbild auf, wurden
jedoch nicht genauer charakterisiert. Anzutreffen waren sie sowohl in den Bereichen
der Karunkel als auch in den Bezirken mit Resten der Kotyledonen. Durch das
morphologische Erscheinungsbild der Plazentome nach LPS war im größten Anteil der
Proben keine Unterscheidung der verschiedenen Bestandteile (mononukleäre
Trophoblasten, TGC, fetales Mesenchym, fetale Blutgefäße) des fetalen
Kompartimentes möglich. Daher bezieht sich die weitere Beschreibung von Gruppe 2
hauptsächlich auf die Verhältnisse im Bereich der Karunkel.
Das interplazentomare Gewebe zeigte nach LPS-Instillation eine verstärkte
Einwanderung von Immunzellen sowie eine Ödematisierung.
Die Immunzellen waren vor allen Dingen im Stratum compactum bzw. reticulare zu
finden. Teilweise waren sie aber auch in den Lumina der Drüsen und den Blutgefäßen
- 76 -
anzutreffen. Das luminale Epithel der Proben war überwiegend hochprismatisch,
teilweise jedoch abgeflacht oder fehlend.
4.2.2. Immunhistochemie
Wie bereits in der Literaturübersicht beschrieben, werden intrazelluläre Signale nach
Aktivierung durch IGF1 und IGF2 durch verschiedene Signalmoleküle weitergeleitet
und verarbeitet. Dazu zählen auch IRS-Moleküle. Da IRS1 und IRS2 hierbei die
wichtigste Rolle zu spielen scheinen, wurde mittels Immunhistochemie untersucht, ob
diese auch beim Rind in Plazenta und Uterus vorkommen und in welchen
Zellpopulationen sie lokalisiert sind.
- 77 -
4.2.2.1. IRS1
4.2.2.1.1. IRS1-Expression im Plazentom
Überwiegend glichen sich die Reaktionen in den Proben der präpartalen Gruppe und
postpartalen Gruppe. Weiterhin konnten auch keine Unterschiede in der Reaktion
zwischen den Proben vor und nach LPS-Instillation, oder zwischen der IGF-high- und
IGF-low-Gruppe festgestellt werden.
Im Plazentom war das stärkste Signal in den mononukleären Trophoblasten zu sehen,
die eine positive bis sehr stark positive Reaktion zeigten. Das Zytoplasma der TGC
war negativ bis schwach positiv angefärbt und auch die Zellkerne variierten zwischen
negativ bis schwach positiv. Das fetale Mesenchym zeigte weitgehend keine
Expression von IRS1, vereinzelte Kerne waren jedoch positiv.
In den Chorionzotten zeigten die Arterien häufig eine Expression im Endothel, jedoch
nur selten in den Gefäßwänden, während die Venen komplett negativ waren. Die
Reaktion der Immunzellen fiel variabel aus, von negativ bis hin zu sehr stark positiv.
Im Epithel der karunkulären Kryten wechselten sich schwach positiv angefärbte
Bereiche mit negativen Regionen ab. Allerdings wiesen einige Proben auch
ausschließlich negative Reaktionen im Epithel auf. Genauso verhielt es sich im
maternalen Stroma und im Karunkelstiel. Die Arterien waren schwach positiv bis
positiv, während die Venen keine Anfärbung aufwiesen. Die Gefäßwände waren im
Großteil negativ, vereinzelt aber auch schwach positiv. Die freien Zellen des
Immunsystems waren auch hier variabel angefärbt (siehe Abb. 20-21).
- 78 -
Abb. 20: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 in Plazentomen der präpartalen Gruppe
Die stärksten Signale waren in den einkernigen Trophoblastzellen (T) vorhanden, während die TGC überwiegend negativ waren (rote Kästchen). Das Karunkelepithel (KE) stellte sich negativ (C) bis schwach positiv (A, B, D) dar. Im maternalen Stroma (MS) und fetalen Mesenchym (FM) konnte keine IRS1-Expression nachgewiesen werden. E: Arterie (Ar) mit schwach positiver Intima und negativer Media sowie komplett negative Vene (V) in der Chorionplatte (CP). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge beträgt in A, E und F 100µm und in B, C und D 50µm.
- 79 -
Abb. 21: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 in Plazentomen der postpartalen Gruppe Vor LPS Instillation (A, B) konnte die stärkste Expression in einkernigen Trophoblastzellen (T) beobachtet werden, während das Karunkelepithel (KE) nur eine schwache Immunreaktion zeigte. Außerdem waren die Kerne der TGC (rote Kästchen) leicht gefärbt. Das fetale Mesenchym (FM) und das maternale Stroma (MS) waren negativ. Nach LPS-Instillation (C, D) waren in den zusammen gefallenen Krypten der Karunkel vermehrt Immunzellen und Zelldetritus (gelbe Pfeile) vorzufinden. Das Karunkelepithel war zu dieser Zeit weitgehend negativ. E: Arterien (Ar) mit positiver Intima und positiven Kernen in der Tunica media in der Chorionplatte (CP). F: Negativkontrolle.Die Balkenlänge betrug in A, C, E und F 100µm und in B und D 50µm.
- 80 -
4.2.2.1.2. IRS1-Expression im interplazentomaren Ge webe
Die stärkste positive Reaktion war in den uterinen Drüsen zu sehen. Im luminalen
Epithel konnten bei den Kühen Reaktionen von negativ über schwach positiv bis positiv
beobachtet werden. Allen gemein war eine deutlich positive Anfärbung auf der
apikalen Seite im Bereich der Glykokalix. Das Stratum compactum war weitgehend
negativ, jedoch zeigten sich bei den Proben einiger Tiere positive Bereiche um
Immunzellen herum und in aufgelockerten Zonen. Das Stratum reticulare, sowie das
Myometrium wiesen keine IRS1-Expression auf. Die Tunica interna der Arterien war
positiv angefärbt, während die Tunica media meist negativ war. Die Muskulatur in der
Media zeigte allerdings in einigen Fällen auch eine schwach positive Reaktion. Venen
waren in den meisten Fällen negativ. Auffällig waren wiederum kleinere Gefäße im
Myometrium, die positive Reaktionen aufwiesen. Immunzellen waren auch in diesen
Proben variabel angefärbt (siehe Abb. 22-23).
- 81 -
Abb. 22: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1- Expression im interplazentomaren Gewebe der präpartalen Gruppe Die Färbung des uterinen Epithels (ME) variierte von ausschließlich apikal (A) bis zu einer stark positiven Reaktion in Zytoplasma und der apikalen Zellmembran (B, D). Eine ähnliche Variation war im Stratum compactum (SC) zu beobachten (vergleiche A, B, D ). C, E: Die uterinen Drüsen (UD) wiesen das stärkste Signal auf, während das Stratum reticulare (SR) negativ war. Endothelien und glatte Muskelzellen von Venen (V) im Stratum compactum (SC) aber auch im Stratum reticulare (SR) zeigten meist eine positive Reaktion (D, E). In den Lumina der uterinen Drüsen waren häufig IRS-1 positive Immunzellen zu finden (gelbe Pfeile). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge in B, C und F betrug 100µm in A, D und E 50µm.
- 82 -
Abb. 23: Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 im interplazentomaren Gewebe der postpartalen Gruppe Die Färbung des uterinen Epithels (ME) variierte von ausschließlich apikal (A) bis zu einer stark positiven Reaktion in Zytoplasma und der apikalen Zellmembran (B). Die stärkste Reaktion zeigten die uterinen Drüsen (UD) im negativen Stratum reticulare (SR) (C,D). Es waren viele eingewanderte Immunzellen zu erkennen (gelbe Pfeile), die vor allem im Stratum compactum, Stratum reticulare und in den Drüsen lokalisiert waren (A, B, C ). Die Arterien (Ar) wiesen eine positive Intima und schwach positive Media auf, die Venen (V) waren schwach positiv (E). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in F 50µm, in A, B, C, D und E 100µm.
- 83 -
4.2.2.2. IRS2
4.2.2.2.1. IRS2-Expression im Plazentom
Überwiegend glichen sich die Reaktionen in den Proben der präpartalen Gruppe und
postpartalen Gruppe, wie auch bei der Untersuchung von IRS1. Weiterhin konnten
auch keine Unterschiede in der Reaktion zwischen den Proben vor und nach LPS-
Instillation, oder zwischen der IGF-high- und IGF-low-Gruppe festgestellt werden.
Im Plazentom konnte die stärkste IRS2-Expression im fetalen Mesenchym festgestellt
werden, in einigen Fällen auch in den mononukleären Trophoblasten. In beiden Fällen
schwankte die Intensität der Färbung zwischen positiv bis stark positiv.
Das Karunkelepithel war negativ bis schwach positiv angefärbt, während das
maternale Stroma und der Karunkelstiel negativ waren. Das Endothel und die
Gefäßwand der Arterien in den maternalen Anteilen waren negativ bis schwach positiv.
Die Venen wiesen eine negative Reaktion auf. Die TGC wiesen eine negative bis
schwach positive Reaktion auf. Eine IRS2-Expression konnte in der Chorionplatte nicht
festgestellt werden. Die Blutgefäße in den Zotten der Kotyledone verhielten sich
genauso wie in der Karunkel. Bei den Immunzellen konnten variable Reaktionen
nachgewiesen werden (siehe Abb. 24-25).
- 84 -
Abb. 24: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im Plazentom der präpartalen Gruppe
Die stärkste Expression von IRS2 war im fetalen Mesenchym (FM) festzustellen, auch die mononukleären Trophoblastzellen (T) wiesen eine positive Anfärbung auf (A, B, C, D ), während sich das Karunkelepithel (KE) negativ (A, B ) bis schwach positiv darstellte (C, D). Im maternalen Stroma (MS) und in den TGC (rote Kästchen) war ebenfalls keine Färbung für IRS2 auszumachen (A, B, C, D ). In der Arterie (Ar) der Chorionplatte (CP) konnte eine positive Anfärbung der Intima erkannt werden. Gelber Pfeil, Zelldetritus. (E). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A, E und F 100µm und in B,C und D 50µm.
- 85 -
Abb. 25: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im Plazentom der postpartalen Gruppe
Am stärksten angefärbt waren das fetale Mesenchym (FM) und in einigen Fällen die Trophoblastzellen (T) (A, B ). Das maternale Stroma (MS) wies keine IRS2-Expression auf, während das Karunkelepithel eine negative (A, B ) bis schwach positive Reaktion zeigte (C, D). Auch die Färbung der TGC (rote Kästchen) variierte zwischen negativ und schwach positiv (A, B ). Nach LPS-Instillation waren in der Karunkel vermehrt Zelldetritus und beginnende Gewebsdegeneration festzustellen (C, D). E: In der Chorionplatte (CP) zeigten Arterien eine schwach positive Tunica media (Ar), während Venen (V) negativ waren. F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A-F 100µm.
- 86 -
4.2.2.2.2. IRS2-Expression im interplazentomaren Ge webe
Die stärkste IRS2-Expression wurde in den Zellen der uterinen Drüsen festgestellt, die
eine positive bis sehr stark positive Reaktion zeigten. Im Gegensatz dazu wurden im
luminalen Epithel variable Reaktionen von selten negativ, über schwach positiv bis hin
zu positiv beobachtet. Das Stratum compactum wies unterschiedlich gefärbte Bereiche
auf, die zwischen negativ und positiv schwankten. Dabei fiel auf, dass einzelne
Fibrozyten um Immunzellen deutlich positiv angefärbt waren. Das Stratum reticulare
war in den allermeisten Fällen negativ, während in Ausnahmen eine positive Reaktion
des Sratum reticulare zu beobachten war, die mit einer nicht angefärbten Zone um
Drüsen und Blutgefäße einherging. Das Gefäßendothel war in Arterien schwach positiv
bis positiv, das der Venen negativ. Die Gefäßwände waren überwiegend negativ, bis
auf einige Arterien, die eine schwach positive Reaktion zeigten. Kleinere Gefäße im
Stratum compactum waren meist negativ.
Das Myometrium war in der präpartalen Gruppe negativ bis schwach positiv gefärbt.
Die postpartale Gruppe wies ein ähnliches Erscheinungsbild auf, jedoch waren hier
einige Kerne positiv angefärbt. Im Myometrium fiel außerdem auf, dass das
Bindegewebe zwischen den Muskelzellen häufig positiv war. Auch in diesen Proben
variierte die Anfärbung der freien Zellen des Immunsystems von negativ bis sehr stark
positiv (siehe Abb. 26-27).
- 87 -
Abb. 26: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im interplazentomaren Gewebe der präpartalen Gruppe Die stärkste IRS2-Expression war in den uterinen Drüsen (UD) vorzufinden (D, E). Das maternale Epithel (ME) war unterschiedlich stark angefärbt von positiv (A) bis schwach positiv (B) bis negativ (C), genauso wie das Myometrium (M), das eine negative bis schwach positive Reaktion aufwies (E). Das Stratum compactum (SC) war in den meisten Bereichen ohne IRS2-Expression, jedoch gab es vereinzelt positive Bezirke (A, B, C ) und auch die Venen (V) zeigten eine Expression von IRS2, während das Stratum reticulare (SR) keine Anfärbung aufwies (D, E). In einigen Proben konnten Immunzellen im Stratum compactum (SC) lokalisiert werden (gelbe Pfeile) (B). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A, B, E und F 100µm und in C und D 50µm.
- 88 -
Abb. 27: Immunhistochemische Lokalisation von IRS2 im interplazentomaren Gewebe der postpartalen Gruppe Die uterinen Drüsen (UD) wiesen die stärkste Anfärbung auf (C, D). Das luminale Epithel (ME) variierte von schwach positiv (B) bis positiv (A). In einigen Fällen konnte eine positive Reaktion des Stratum reticulare (SR) mit negativen Bezirken (gelbe Pfeile) um Drüsen (UD) und Venen (V) beobachtet werden (D). Das oft positiv reagierende Stratum compactum (SC), beinhaltete in bestimmten Bereichen eingewanderte Immunzellen (gelbe Pfeile) (B). Intima und Media einer Arterie (Ar) im negativen Myometrium (M), sind positiv, während die Membrana elastica interna keine Färbung zeigte (E). F: Negativkontrolle. Die Balkenlänge betrug in A, B, E und F 100µm und in C und D 50µm.
- 89 -
4.2.2.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse aus den immunhistolo gischen
Untersuchungen an Plazentom und interkarunkulärem G ewebe
Die durchgeführten Untersuchungen ergaben, dass es keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Gruppen der präpartalen und postpartalen Proben im
Bezug auf die IRS1- und IRS2-Expression gab. Auch die LPS-Instillation hatte keinen
Einfluss auf die Lokalisation, das Verteilungmuster und die Intensität der
Immunreaktion. Aus diesem Grund wurden die Ergebnisse aller untersuchter Proben
in der Folge ohne weitere Aufgliederung zusammengefasst tabellarisch dargestellt
(siehe Tab. 10 und Tab. 11).
Tab. 10: Übersicht über die Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom-
Zusammenfassung der Ergebnisse der prä- und postpartalen Gruppe
AK: Antikörper, KE: Karunkelepithel, MS: Maternales Stroma, KS: Karunkelstiel, ME-A: Maternales Endothel Arterien, ME-V: Maternales Endothel Venen, MGW: Maternale Gefäßwände, IZ: Immunzellen, T: Trophoblasten, TGC: Trophoblast Giant Cells, FM: Fetales Mesenchym, CP: Chorionplatte, FE-A: Fetales Endothel Arterien, FE-V: Fetales Endothel Venen, FGW: Fetale Gefäßwände, IZ: Immunzellen. Intensität der Anfärbung: - = negativ, keine Anfärbung, (+) = schwach positive Reaktion, + = positive Reaktion, ++ = sehr stark positive Reaktion, var. = variable Reaktion.
var.--+--/(+)+/++var.-/(+)-(+)/+-/(+)-/(+)-/(+)IRS1
Plazentom
var.-/(+)--/(+)-+/++-/(+)+/++var. ---/(+)-/(+)--/(+)IRS2
IZFGWFE-VFE-ACPFMTGCsTIZMGWME-VME-AKSMSKEAK
Placenta fetalisPlacenta maternalis
var.--+--/(+)+/++var.-/(+)-(+)/+-/(+)-/(+)-/(+)IRS1
Plazentom
var.-/(+)--/(+)-+/++-/(+)+/++var. ---/(+)-/(+)--/(+)IRS2
IZFGWFE-VFE-ACPFMTGCsTIZMGWME-VME-AKSMSKEAK
Placenta fetalisPlacenta maternalis
- 90 -
Tab. 11: Übersicht über die Expression von IRS1 und IRS2 im interkarunkulären
Gewebe- Zusammenfassung der Ergebnisse der prä- und postpartalen Gruppe
AK: Antikörper, UE: Uterines Epithel, MS-C: maternales Stroma Stratum compactum, MS-R: maternales Stroma Stratum reticulare, UDE: uterines Drüsenepithel, EN-A: Endothel Arterien, EN-V: Endothel Venen, GW: Gefäßwände, MY: Myometrium, IZ: Immunzellen. Intensität der Anfärbung: - = negativ, keine Anfärbung, (+) = schwach positive Reaktion, + = positive Reaktion, ++ = sehr stark positive Reaktion, var. = variable Reaktion
var. -/(+)--(+)/++/++--/+var.IRS2
var.--/+-++/++--/teilw.+var.IRS1
IZMYGWEN-VEN-AUDEMS-RMS-CUEAK
Interkarunkuläres Gewebe
var. -/(+)--(+)/++/++--/+var.IRS2
var.--/+-++/++--/teilw.+var.IRS1
IZMYGWEN-VEN-AUDEMS-RMS-CUEAK
Interkarunkuläres Gewebe
- 91 -
5. Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit wurde einerseits untersucht, ob die Komponenten des IGF-
Systems eine positive Auswirkung auf das Proliferations- und Migrationsverhalten
verschiedener boviner Zelllinien aus Uterus und Fetus haben, und andererseits ob
Wechselwirkungen mit EGF vorhanden sind. Begründet ist das Interesse an den
Wirkungen dieser potenten Wachstumsfaktoren durch ihren wissenschaftlich
erwiesenen, positiven Einfluss auf embryonale und maternale Zellen verschiedener
Spezies (Klauwer et al., 1997; Miller et al., 2005; Sibley et al., 2005; Forbes und
Westwood, 2008). Diese Eigenschaft macht sowohl die IGF-Familie, als auch EGF zu
vielversprechenden Kandidaten, um wirtschaftlich bedeutende Erkrankungen des
Rindes, wie die Endometritis und auch die Nachgeburtsverhaltung besser therapieren
und beeinflussen zu können. Auch erfolgte eine Analyse von möglicherweise für die
intrazelluläre Signalvermittlung verantwortlichen Wegen.
Andererseits wurde in prä- und postpartalen Proben von Plazentom und
interkarunkulärem Gewebe die Lokalisation von IRS1 und IRS2 bestimmt. Diese
Adaptorproteine sind eine denkbare Verbindungsstelle zwischen den Komponenten
des IGF-Systems und EGF (Zhang et al., 2000; Lassarre und Ricort, 2003; Karam et
al., 2012). Hierfür wurden Kühe in IGF-high und IGF-low Gruppen eingeteilt und
während eines Kaiserschnitts vor dem errechneten Termin bzw. nach spontan erfolgter
Geburt beprobt.
5.1. Wirkung von IGF1 und EGF
In den durchgeführten Versuchen konnte gezeigt werden, dass durch die Stimulation
von BCEC, F3 und Fibroblasten mit IGF1 eine Steigerung sowohl der Proliferation als
auch der Motilität möglich war. Wurde dieses mit EGF kombiniert, kam es bei den F3-
Zellen und Fibroblasten zu einer weiteren, signifikanten Steigerung der Proliferation,
verglichen mit der Stimulation mit IGF1 alleine. Im Gegensatz zu der alleinigen
- 92 -
Stimulation mit EGF kam es bei BCEC und den Fibroblasten zu einem synergistischen
Effekt bei Kombination von IGF1 und EGF und somit zu einem signifikanten Anstieg
der Proliferation.
Dass EGF und IGF die Proliferation positiv beeinflussen, ist bekannt. IGF führt in vitro
in vielen verschiedenen Zelllinien zu einer gesteigerten Proliferation (Jones und
Clemmons, 1995; Li und Zhuang, 1997; Miller et al., 2005). In früheren Arbeiten
unserer Gruppe wurde bereits festgestellt, dass EGF zu einem Anstieg der
Proliferation von F3-Zellen führt. Diese Wirkung wurde über Ras und die MAPK 42/44
vermittelt (Hambruch et al., 2010). Auch in NPC (Normal Placental Cytotrophoblast
Cell Line) wurde eine Steigerung der Proliferation nach EGF-Applikation festgestellt
(Li und Zhuang, 1997).
Betrachtet man die Motilität, fällt auf, dass bei F3-Zellen durch die Kombination von
IGF1 und EGF eine signifikante Steigerung gegenüber der alleinigen Stimulation mit
IGF1 erreicht werden konnte. Allerdings ist die Steigerung gegenüber der Stimulation
mit EGF allein nicht signifikant verändert. Bei den Fibroblasten kommt es zu einem
gegensätzlichen Effekt, hier führt die Kombination von IGF1+EGF im Vergleich zur
Stimulation mit IGF1 alleine zu einer signifikanten Senkung der Motilität. Dieser scheint
auf einem durch EGF vermittelten antagonistischen Effekt zu beruhen, da EGF auch
in alleiniger Stimulation keine positiven Auswirkungen auf die Motilität der bovinen,
plazentären Fibroblasten hat. Im Gegensatz dazu steigert EGF bei sowohl BCEC als
auch F3-Zellen die Motilität signifikant.
Dies passt zu Studien aus der Humanforschung, in denen ebenfalls eine positive
Wirkung von IGF1 auf das Migrationsverhalten von Trophoblasten festgestellt wurde
(Lacey et al., 2002; Forbes und Westwood, 2008). Auch für EGF sind positive
Auswirkungen auf die Invasion und Trophoblastenmigration bekannt (Bass et al., 1994;
Qiu et al., 2004).
In verschiedenen Arbeiten wird von synergistischen Wirkungen zwischen IGF1 und
EGF berichtet (Qureshi et al., 1997). Dabei variieren die Theorien in der Frage, wie es
zu einer Interaktion zwischen diesen beiden Wachstumsfaktoren kommen kann. Eine
Vermutung ist, dass es durch die Aktivierung des IGF1R durch IGF1 einerseits zu einer
vom EGFR unabhängigen Aktivierung des IRS/PI3K/Akt Signalweges und
- 93 -
andererseits zu einer Transaktivierung des EGFR kommt. Diese Aktivierung wird durch
einen autokrinen Mechanismus verursacht, bei dem HB-EGF mit Hilfe von Matrix-
Metalloproteinasen abgegeben wird und dann zur Phosphorylierung des EGFR führt.
Dies leitet die Aktivierung des Shc/Ras/Raf/ERK1/2 Signalweges mit anschließender
Vermittlung entsprechender intrazellulärer Signale ein (Roudabush et al., 2000).
Andere Forscher kommen wiederum zu dem Ergebnis, dass auch EGF, über die
Modulation von IRS1, den durch IGF1-Aktivierung eingeschlagenen Signalweg
beeinflussen kann. Sie fanden heraus, dass EGF in MCF-7 Zellen (Michigan Cancer
Foundation-7, Brustkrebs-Zelllinie) zu einem Anstieg von IRS1 in der Zelle führt.
Dieser Anstieg war abhängig von der MAPK aber unabhängig von der PI3K.
Gleichzeitig konnte EGF aber nicht der Herunterregulation von IRS1 durch IGF1
entgegenwirken (Lassarre und Ricort, 2003). Im Gegensatz dazu kommen andere
Arbeitsgruppen zu dem Resultat, dass EGF doch den Abbau von IRS1 durch IGF1
verhindern kann und dies sogar in Anwesenheit von IGF1 auszugleichen vermag.
Allerdings fanden diese Experimente an einer anderen Zelllinie, nämlich Epithelzellen
aus der Prostata statt (Zhang et al., 2000). Beiden Studien gemein ist jedoch die
Erkenntnis, dass EGF und IGF antagonistische Wirkungen auf die IRS-Spiegel haben.
In weiteren Versuchen zeigte sich, dass EGF die IGF1 stimulierte
Tyrosinphosphorylierung von IRS1 und nachfolgende Phosphorylierung von der PI3K
verhindern konnte. Dies geschah durch dem IRS1 vorgeschaltete PI3K und PKD1,
welche nach Aktivierung durch den EGFR wahrscheinlich andere Serinreste
phosphorylieren als nach Aktivierung durch den IGF1R (Karam et al., 2012). Auch
Zhang et al. (2000) kamen zu dem Schluss, dass die PI3K für die Abregulation des
IRS1 nach IGF1-Aktivierung entscheidend ist. Putz et. al. fanden heraus, dass durch
eine selektive Blockade des EGFR nicht nur die Wirkung von EGF verhindert wird,
sondern auch die Aktivierung von MAPK und Interaktion mit PKA durch IGF1 (Putz et
al., 1999).
Diese Ergebnisse passen zu Studien, in denen beobachtet wurde, dass eine Depletion
von EGFR zu einer verstärkten Ubiquitinierung und Degradation von IGF1R führt
(Riedemann et al., 2007). Eine weitere Möglichkeit der gegenseitigen Beeinflussung
zwischen IGF1 und EGF besteht darin, dass p57 zwischen den aktivierten ERK bzw.
- 94 -
Akt Signalwegen vermittelt. EGF scheint vor allen Dingen den ERK Signalweg zu
stimulieren, während durch IGF1 eine Aktivierung von Akt hervorgerufen wird. Auf
diese Art und Weise ist eine Wechselwirkung zwischen den beiden
Wachstumsfaktoren denkbar. In der erwähnten Studie hatte dies das Resultat, dass
IGF in den untersuchten Epithelzellen den proliferativen Einfluss von EGF verstärkte
(Worster et al., 2012).
In der singulären in vitro Stimulation von pankreatischen ß-Zellen mit IGF1 oder EGF
wurde festgestellt, dass sowohl IGF1, als auch EGF die gleichen Signalwege
aktivieren, aber die Rekrutierung von IRS-Proteinen, die Stärke und Dauer der
Aktivierung, sowie die Glukose-Unabhängigkeit unterschiedlich sind. Nach Aktivierung
des EGFR kam es nicht zur Signaltransduktion via IRS. Dies hatte zur Folge, dass
EGF im Gegensatz zu IGF1 keine Proliferation verursachen konnte. Der Unterschied
schien maßgeblich durch IRS2 verursacht worden zu sein (Lingohr et al., 2002).
EGF kann aber auch durch die Modulation der IGFBP-Expression in den IGF1-
Signalweg eingreifen. Durch die Erhöhung der Expression der IGFBPs kommt es unter
anderem zu vermehrter Sequestrierung von IGF1 und daraus resultierend zu einer
verminderten Antwort auf die IGF1-Stimulation (Angervo et al., 1992; Murray et al.,
1993).
Um aufzuklären, welche intrazellulären Mechanismen und Signalwege hinter den von
den untersuchten Wachstumsfaktoren ausgelösten Veränderungen bei Proliferation
und Motilität stehen, wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen auf
Proteinebene durchgeführt. Hierfür wurde die Phosphorylierung von MAPK42/44, Akt
und p38 MAPK mittels Western Blot untersucht. Diese Signalwege werden von IGF
(Jones und Clemmons, 1995) und EGF (Oda et al., 2005; LaMarca et al., 2008)
aktiviert und spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Plazenta und des
Embryos (Forbes und Westwood, 2008; Forbes und Westwood, 2010).
Bei der Stimulation von BCEC mit EGF wurden sowohl MAPK 44/42, Akt als auch p38
MAPK aktiviert. IGF1 führte zu keiner messbaren Aktivierung eines untersuchten
Signalweges. Die Kombination von IGF1 mit EGF verursachte jedoch Aktivierungen
von MAPK 42/44 und p38 MAPK. Hier schien die Phosphorylierung der Kinasen
- 95 -
ausschließlich durch Wirkung des EGF vermittelt zu werden. Bei der Untersuchung
der Aktivierung der Akt fiel auf, dass IGF1 sogar die aktivierende Wirkung von EGF
inhibierte, denn in der alleinigen Stimulation mit EGF kam es zu einer Aktivierung. Für
die Steigerung der Proliferation von BCEC sind anscheinend nicht die untersuchten
Signalwege alleine zuständig, denn eine signifikante Steigerung wurde, wie bereits
erwähnt, durch IGF1 erzielt, nicht aber durch EGF.
Ähnlich sind bei den BCEC die Ergebnisse der Motilitäts-Assays zu bewerten. Zwar
wurden durch Stimulation mit IGF1, EGF und IGF1+EGF signifikante Steigerungen
gegenüber den serumfreien Kontrollen erreicht, allerdings sind keine synergistischen
Wirkungen zu beobachten gewesen.
Die Stimulation der F3-Zellen mit IGF1 aktivierte die MAPK 42/44 und die Akt. Nach
Stimulation mit EGF oder IGF1+EGF kam es zu einer Aktivierung der MAPK 42/44,
Akt und p38 MAPK. EGF war scheinbar nötig, um eine Aktivierung der p38 MAPK
auszulösen. Diese Aktivierung der p38 MAPK wiederum scheint nicht unbedingt
notwendig für eine signifikante Steigerung der Proliferation bei F3-Zellen, denn eine
signifikante Steigerung wurde auch mit IGF1 erreicht.
Die F3-Zellen sprachen in den Motilitäts-Assays ähnlich auf die Stimulationen an, wie
bei den Proliferations-Messungen. Wie bereits beschrieben, gab es sowohl durch die
Stimulation mit IGF1, EGF als auch durch Stimulation mit IGF1+EGF signifikante
Steigerungen gegenüber den unstimulierten Kontrollen. Allerdings war auch eine
signifikant höhere Motilität nach der Kombination von IGF1+EGF gegenüber IGF1
auszumachen. Die Ergebnisse der Motilität lassen sich ähnlich wie die der Proliferation
interpretieren. Auch für die Stimulation der Motilität scheint die Aktivierung der p38
MAPK nicht unbedingt notwendig zu sein, denn auch durch IGF2 kam es zu einer
signifikanten Steigerung der Motilität, während die p38 MAPK durch diese Stimulanz
nicht aktiviert wurde. Daraus kann gefolgert werden, dass dieser Signalweg nicht
entscheidend zur Steigerung der Motilität bei F3-Zellen beiträgt.
Bei den Fibroblasten wurde nach Stimulation mit IGF1, EGF und IGF2 sowie den
verwendeten Kombinationen der Stimulantien eine Aktivierung aller drei mitogenen
Signalwege festgestellt. Gleichzeitig konnte aber kein biologischer Effekt nach der
Behandlung der Fibroblasten mit EGF beobachtet werden.
- 96 -
Die biologischen Effekte nach Stimulation mit IGF1+EGF unterscheiden sich bei den
Fibroblasten. So führte diese Stimulation zu einer signifikant erhöhten Proliferation,
während kein synergistischer Effekt in den Untersuchungen der Motilität auftrat. EGF
hatte bei dieser Zelllinie keinen steigernden Effekt auf die Motilität, wie auch schon bei
der Proliferation.
Es wird angenommen, dass der Signalweg über die MAPK 42/44 die Hauptachse nach
Aktivierung durch Wachstumsfaktoren bildet, während über p38 MAPK eher eine
Antwort der Zelle auf Stress oder Zytokine statt findet (Pearson et al., 2001).
Abweichend davon haben neuere Studien ergeben, dass auch die p38 MAPK in der
Plazenta eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von wachstumsfaktorvermittelten
Signalen, wie z.B. durch EGF, spielt (Johnstone et al., 2005a; LaMarca et al., 2008).
Es ist bekannt, dass über die Aktivierung des EGFR und IGF2R und daraus folgend
der MAPK 42/44 zum Beispiel Trophoblastenmigration und -invasion reguliert werden
(McKinnon et al., 2001; Forbes und Westwood, 2010). Viele verschiedene Studien
haben ergeben, dass die Akt Kinase eine entscheidende Rolle in der IGF-Achse bei
der Vermittlung plazentaren Wachstums übernimmt (Forbes und Westwood, 2010).
Akt ist aber nicht nur bei der Vermittlung von intrazellulären Signalen nach Aktivierung
des IGF1R verantwortlich, sondern vermittelt auch die Antwort auf EGF-Stimulation in
der Plazenta (Johnstone et al., 2005b) Die zusätzlich nach Kombination mit EGF
aktivierten Kinasen könnten auch durch veränderte IRS1-Spiegel verursacht worden
sein. Es ist denkbar, dass durch die Wirkung des EGF der durch IGF1 bedingte Abbau
des IRS1 ausgeglichen werden kann. So könnte intrazellulär eine abweichende
Signalkette in Gang gesetzt werden.
- 97 -
5.2. Wirkung von IGF2 und EGF
Die Stimulation mit IGF2 verursachte wie bereits beschrieben bei den F3-Zellen und
den Fibroblasten, aber nicht den BCEC, signifikante Steigerungen der Proliferation.
Durch EGF kam es nur bei den F3-Zellen zu einer signifikanten Steigerung. Die
Kombination der beiden Wachstumsfaktoren führte bei allen drei Zelllinien zu einer
signifikanten Steigerung, allerdings konnten synergistische Effekte nur bei den BCEC
beobachtet werden. Diese sind besonders hervorzuheben, da weder IGF2 noch EGF
alleine die Proliferation signifikant steigern konnten. Bei den F3-Zellen war die
proliferationsfördernde Wirkung folglich eher auf den Einfluss von EGF und bei den
Fibroblasten eher auf den von IGF2 zurück zu führen, denn dies waren die
Stimulantien, die auch alleine für signifikant höhere Ergebnisse sorgten. Die
Ergebnisse der Versuche lassen also darauf schließen, dass IGF2 eine wichtige Rolle
bei der Entwicklung und für die Funktion der Plazenta spielt.
Andere Studien kommen zu dem gleichen Schluss. So ist bekannt, dass IGF2 zur
Invasion (Chakraborty et al., 2002), Migration (Irving und Lala, 1995; McKinnon et al.,
2001) und Proliferation (Lala und Hamilton, 1996; Harris et al., 2010) von humanen
Trophoblasten und zur Migration trophektodermer Zellen des Schafes (Kim et al.,
2008) beiträgt. Ob diese Wirkungen über den IGF1R oder den IGF2R vermittelt
werden, wird noch diskutiert. Einige Arbeitsgruppen berichten, dass der IGF2R
unabhängig vom IGF1R verantwortlich für die Vermittlung der IGF2-Signale ist
(McKinnon et al., 2001). Harris et. al. (2010) berichten von antiapoptotischen Signalen
von IGF2 auf Trophoblasten, die durch den IGF2R direkt vermittelt werden, aber sie
fanden auch heraus, dass bei verminderter Expression des IGF2R die Wirkung von
IGF2 noch verstärkt werden kann. Sie vermuten, dass der IGF2R hauptsächlich als
Clearance-Rezeptor funktioniert und dadurch, dass er ausgeschaltet wurde, mehr
IGF2 zur Verfügung steht, welches dann über den IGF1R seine antiapoptotischen
Signale weitergeben kann. Die allgemein wichtige Rolle von IGF2 in der Plazenta wird
durch Studien belegt, die hervorbrachten, dass die Deletion des igf2 Gens zu einem
reduzierten Wachstum der Plazenta und daraus resultierend zu einem verminderten
fetalen Wachstum führt (Constância et al., 2002).
- 98 -
Bei der Betrachtung der Ergebnisse der Motilitätsmessungen fällt auf, dass bei den
BCEC zwar durch sowohl IGF2, EGF als auch die Kombination der beiden signifikante
Steigerungen der Motilität gegenüber SF erzielt werden konnten, aber gleichzeitig
durch die Kombination keine weitere signifikante Steigerung verursacht werden
konnte.
Bei den F3-Zellen hingegen hatte IGF2 allein keinen Einfluss auf die Motilität. Durch
die Kombination mit EGF kam es aber zu einer signifikanten Steigerung der Motilität.
Diese war so hoch, dass sowohl zu EGF als auch zu IGF2 ein signifikanter Unterschied
festgestellt werden konnte. Die signifikant höhrere Steigerung der Motilität, besonders
nach Stimulation mit IGF2+EGF in vitro, könnte auch in vivo eine entscheidende Rolle
spielen. Denn während der Trächtigkeit ist die Fähigkeit der Trophoblasten zu
migrieren und fetomaternale Hybridzellen zu bilden von entscheidender Bedeutung.
So kann die fetomaternale Kommunikation sichergestellt werden und fetale Produkte
in das maternale Kompartiment der Plazenta überführt werden (Klisch et al., 1999). Es
wäre also ein enormer Vorteil die Migration der Trophoblasten stimulieren zu können.
Bei den Fibroblasten kam es durch Stimulation mit IGF2 zu einer signifikant höheren
Motilität, aber nicht durch Applikation von EGF. In der Kombination der beiden
Wachstumsfaktoren wurde eine Wirkung vergleichbar mit der des IGF2 beobachtet.
Ob IGF2 eher die Proliferation oder die Motilität beeinflusst, scheint von dem Zelltyp
abhängig zu sein. Werden die Beobachtungen aus den Messungen der Proliferations-
und Motilitäts-Assays zusammen betrachtet, fällt auf, das IGF2 bei den BCEC eine
signifikante Steigerung nur bei der Motilität aber nicht der Proliferation verursacht. Bei
den F3-Zellen ist es hingegen genau umgekehrt.
Denkbar ist, dass die Erklärung hierfür bei den IRS-Proteinen liegt. Studien zufolge
kommt es nach Aktivierung des IGF1R, mit anschließender Signalvermittlung durch
IRS1, zu einer Stimulation der Proliferation, während IRS2 eher für verstärkte Motilität
sorgt (Byron et al., 2006). Diese Aussage kann für IGF1 und IGF2 in Betracht gezogen
werden, da sie beide über den IGF1R Signale vermitteln (siehe Literaturübersicht Kap.
2.5.2.1.).
Bei humanen Trophoblasten wurde festgestellt, dass IGF2 die Invasivität positiv
beeinflusst (Hamilton et al., 1998; Chakraborty et al., 2002). Diese Beobachtungen
- 99 -
weichen also von den Ergebnissen der vorgenommenen Studie ab und konnten nicht
für das Rind bestätigt werden. Beim Rind ist die beschränkte Invasion der
Trophoblasten in das maternale Epithel von entscheidender Bedeutung. So werden
feto-maternale Hybridzellen gebildet, die in der Lage sind, Produkte aus dem fetalen
in den maternalen Anteil der Plazenta zu transferieren (Klisch et al., 1999). Aus diesem
Grund sollte das Zusammenwirken von IGF2 und EGF, welches diesen Vorgang zu
steuern vermag, genauer untersucht werden.
Auch zur tiefergehenden Analyse dieser Ergebnisse wurden Untersuchungen auf
Proteinebene durchgeführt, die die intrazellulären Signalwege über die MAPK 42/44,
die Akt-Kinase und die p38 MAPK auf ihre mögliche Relevanz hin zum Inhalt hatten.
Bei den BCEC wurde, wie bereits beschrieben, durch IGF2 keine Aktivierung
verzeichnet. EGF hingegen vermochte alle drei untersuchten Signalwege zu
aktivieren. Interessanterweise konnte durch die Stimulation mit IGF2+EGF eine
Aktivierung von MAPK 42/44 und p38 MAPK, aber nicht der Akt erreicht werden. Es
ist anzunehmen, dass die Aktivierung der MAPK 42/44 auf die Wirkung von EGF
zurückzuführen ist, während IGF2 in seiner Wirkung auf die Akt Kinase zu überwiegen
schien.
Die Stimulation von F3-Zellen mit EGF oder IGF2+EGF führte zur Aktivierung der
untersuchten Signalwege. IGF2 hingegen, aktivierte nur MAPK 42/44 und Akt. Aus der
Literatur ist bekannt, dass es bei humanen extravillösen Trophoblasten ebenfalls zu
einer Aktivierung der MAPK nach Stimulation mit IGF2 kam (McKinnon et al., 2001).
Eine vorherige Arbeit aus unserer Gruppe zeigte bereits die Aktivierung von MAPK
nach Stimulation mit EGF in F3-Zellen. Auch eine Aktivierung von der PI3K, die der
Akt Kinase vorgeschaltet ist, konnte hier gezeigt werden (Dilly et al., 2010). Diese
Ergebnisse sind also übereinstimmend. Die Aktivierung der p38 MAPK nach der
Kombination der beiden Wachstumsfaktoren ist also vermutlich auf die Wirkung des
EGF zurückzuführen. Beim Menschen wurde bereits eine Aktivierung der p38 MAPK
in Trophoblasten durch EGF bewiesen (Johnstone et al., 2005b). Auch LaMarca et al.
(2008) konnten eine Aktivierung der p38 MAPK nach Stimulation mit EGF bei
extravillösen Zytotrophoblasten zeigen.
- 100 -
In Studien, die an ovinen Trophoblasten durchgeführt wurden, konnte eine Aktivierung
von p38 MAPK und MAPK 42/44 nach IGF2-Stimulation bestätigt werden (Kim et al.,
2008). Hier scheinen also Unterschiede zwischen bovinen und ovinen Trophoblasten
vorzuliegen.
Bei den Fibroblasten konnte abermals nach allen untersuchten Stimulationen die
Aktivierung aller drei Kinasen festgestellt werden. Diese Ergebnisse lassen darauf
schließen, dass nach Aktivierung des IGFR und des EGFR unterschiedliche
Signalwege eingeschlagen werden. Dies wiederum führt dazu, dass nach Kombination
der Wachstumsfaktoren, andere Signalwege als nach alleiniger Stimulation aktiviert
werden. Offensichtlich ist EGF notwendig, um die p38 MAPK in BCEC und F3-Zellen
zu aktivieren.
Wenn nun die Erkenntnisse aus den vorgenommenen Versuchen mit IGF1 und IGF2
mit den Resultaten der Proliferations- und Motilitäts-Assays zusammen gebracht
werden und die dort sowohl synergistischen, als auch antagonistischen Effekte
betrachtet werden, kommen verschiedene Erklärungsmöglichkeiten in Betracht.
Denkbar wäre ein reziproker Einfluss der Rezeptoren untereinander, aber auch der
Einfluss intrazellulärer Signalmoleküle. Aus der Literatur ist bekannt, dass die IRS-
Proteine bei der Vermittlung von Signalen des IGF-Systems eine große Rolle spielen.
Dies war ausschlaggebend für folgende Untersuchungen mittels PCR und
Immunhistochemie, um zu klären, an welcher Lokalisation in Plazentom und Uterus
und in den gewonnenen Zelllinien diese vorhanden sind.
5.3. Expression von IRS1 und IRS2 mRNA in BCEC, F3- Zellen und Fibroblasten
Mittels RT-PCR wurden die Adaptorproteine IRS1 und IRS2 in den untersuchten
Zelllinien lokalisiert. Die mRNA von IRS1 wurde in BCEC, F3 und Fibroblasten
gefunden, während die mRNA von IRS2 nicht nachgewiesen werden konnte (siehe
Kapitel 4.1.1.).
- 101 -
Der Nachweis von IRS1 in allen Zelllinien bestätigt die in der Literatur beschriebene
Wichtigkeit dieses Proteins für essentielle Abläufe in der Zelle (White, 1997), sowie
das ubiquitäre Vorkommen (White, 2002). Der nicht mögliche Nachweis von IRS2 in
den Zellen ist vermutlich eher in der Methodik begründet.
5.4. Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 und IRS2
Bei der Untersuchung der Proben fiel auf, dass keine Unterschiede in der Expression
von IRS1 und IRS2 zwischen der prä- und postpartalen Gruppe oder den IGF-high und
IGF-low Tieren ausgemacht werden konnten. Weiterhin hatte die LPS-Instillation
keinen Einfluss auf die IRS1 und IRS2 Färbeintensität. In Arbeiten, die an Muskelzellen
der Maus durchgeführt wurden, kam es nach LPS-induzierter Insulin-Resistenz zu
reduzierter IRS1-Expression und die Insulin-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung von
IRS1 war ebenfalls reduziert (Carvalho-Filho et al., 2006). Ähnliche Ergebnisse gab es
auch in Studien mit Adipozyten. Hier wurde ebenfalls durch LPS-Einfluss eine Insulin-
induzierte Aktivierung von IRS1 und IRS2 verhindert und auch die Aktivierung von Akt
über diese beiden Adaptor-Proteine beeinflusst (Wakayama et al., 2014). Für die von
unserer Studie abweichenden Ergebnisse gibt es verschiedene Erklärungsansätze.
Einerseits erfolgten die beschriebenen Untersuchungen an isolierten Zellen unter in
vitro Bedingungen, während die LPS-Instillation bei unserer Arbeit am lebenden
Organismus vorgenommen wurde. Andererseits waren die eingesetzten Methoden
sensitiver für geringfügige Veränderungen als die in unserem Fall gewählte
Immunhistochemie. Auch in einer vorangehenden Arbeit, die sich mit der Lokalisation
des IGF-Systems in Uterus und Plazenta des Rindes beschäftigt, konnten zwischen
den erwähnten Gruppen keine Unterschiede in der Expression von IGF1 oder IGF2
mittels Immunhistochemie und Realtime-PCR festgestellt werden (Lütkehus 2012). Es
ist also denkbar, dass durch die gleich bleibenden Spiegel an IGF1 und IGF2 auch die
Expression der IRS-Proteine in der Zelle keine bemerkbaren Unterschiede erfuhr.
- 102 -
Andererseits ist es auch denkbar, dass die Sensitivität der gewählten
immunhistochemischen Methode für den Nachweis geringer Unterschiede nicht
ausreicht. Möglicherweise wären Real-time PCR oder Western Blot geeigneter, um
Änderungen in der Expressionsmenge feststellen zu können.
Um eine Aussage treffen zu können, ob ein Zusammenhang zwischen der Häufung
von postpartalen Erkrankungen bei niedrigem IGF1-Spiegel (Wathes et al., 2007b;
Wathes et al., 2009a; Wathes et al., 2011; Piechotta et al., 2012) und den IRS-Spiegeln
besteht, müssten weitere Untersuchungen folgen, in denen Kühe beprobt werden, die
Krankheitsbilder wie z.B. verzögerte Uterusinvolutionen oder Entzündungen des
Uterus aufweisen. Diese könnten dann mit den bereits gesammelten und in dieser
Arbeit ausgewerteten Daten verglichen werden.
5.5. Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und Vergleich mit IGF1 und
IGF2
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass sich die stärkste
Expression von IRS1 im Plazentom in den mononukleären Trophoblastzellen fand. In
den TGC hingegen schwankte die Expression von nicht vorhanden bis zu geringfügig.
Auch im fetalen Mesenchym konnte IRS1 nicht nachgewiesen werden. Auf maternaler
Seite waren das Karunkelepithel und Stroma variabel zwischen negativ und schwach
positiv. In den Arterien beider Komponenten wies das Endothel in den meisten Fällen
eine Expression von IRS1 auf, während die Venen negativ waren. Bei den
Immunzellen konnten große Schwankungen in der Expression beobachtet werden.
Allerdings muss bedacht werden, dass keine weitere Typisierung dieser vorgenommen
wurde, und so eine denkbare Erklärung die unterschiedlichen Zelltypen wären.
In der humanen Plazenta wurde IRS1 vor allem im Synzytiotrophoblasten, im Stroma
der Zotten und um fetale Blutgefäße herum detektiert (Colomiere et al., 2009). Die
Expression von IRS1 in den Trophoblasten ist also übereinstimmend mit den
Ergebnissen dieser Arbeit.
- 103 -
IRS2 wurde am stärksten im fetalen Mesenchym und den einkernigen
Trophoblastzellen exprimiert, während die TGC eine schwache bis keine Expression
aufwiesen. In der Placenta maternalis hingegen, war eine Expression von IRS2 nur in
geringem Maße im Karunkelepithel festzustellen. Im Stroma und dem Karunkelstiel
konnte IRS2 nicht detektiert werden. Die Arterien waren sowohl im maternalen als
auch im fetalen Kompartiment negativ bis schwach positiv, während die Venen
ungefärbt blieben. Die Anfärbung der Immunzellen war variabel.
Es fällt auf, dass sowohl IRS1, als auch IRS2 vornehmlich auf fetaler Seite exprimiert
werden und ihr Hauptsyntheseort jeweils der mononukleäre Trophoblast ist. IRS2 wird
im fetalen Mesenchym ebenfalls in hoher Konzentration exprimiert.
Beim Menschen wurde IRS2 vornehmlich im Synzytiotrophoblasten nachgewiesen, es
war aber auch im Endothel fetaler Blutgefäße und im Stroma der Zotten zu finden
(Colomiere et al., 2009). Die genaue Rolle von IRS1 und IRS2 in der humanen
Plazenta in vitro wurde allerdings noch nicht geklärt (Laviola et al., 2005).
Sowohl die IRS1- als auch die IRS2-Expression wird beim Menschen durch maternale
Insulinspiegel reguliert, wohingegen fetales Insulin gar keine oder nur schwache
Auswirkungen auf die Regulation dieser Signalmoleküle hatte (Colomiere et al., 2009).
White (1997) gelangt zu der Ansicht, dass IRS1 das vorherrschende Signalmolekül
der IRS-Proteine ist, welches metabolische Signale vermittelt.
Wird die Expression der beiden Signalmoleküle IRS1 und IRS2 im Zusammenhang mit
der Expression von IGF1 und IGF2 (Lütkehus, 2012) im Plazentom des Rindes
betrachtet, fällt auf, dass auf fetaler Seite eine sehr deutliche Lokalisation von sowohl
den beiden Liganden, als auch den Signalmolekülen in den einkernigen Trophoblasten
ausgemacht werden kann. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass zum Ende der
Trächtigkeit bzw. während der Geburt im einkernigen Trophoblasten IGF1- und IGF2-
abhängige Prozesse stattfinden, die über die Signalmoleküle IRS1 und IRS2 gesteuert
werden. Gleichzeitig scheinen sie aber unabhängig vom IGF1-Serumspiegel zu sein,
da keine Unterschiede zwischen IGF-high- und IGF-low-Tieren nachzuweisen waren
bzw. diese mit der Immunhistochemie nicht detektiert werden konnten. Prozesse, die
zu diesen Zeitpunkten im Plazentom ablaufen, sind unter anderem die
- 104 -
(voranschreitende) Ablösung der fetalen von der maternalen Plazenta. Die zugrunde
liegenden Mechanismen sind aber noch nicht endgültig identifiziert (Dilly et al., 2011,
Shenavai et al., 2012). Außerdem kommt es zu diesem Zeitpunkt zum gesteuerten
Rückbau der Karunkeln (Grunert et al., 1983) und dem Rückgang der
Trophoblastriesenzellen (Wooding, 1984). Es wäre also möglich, dass die Liganden
des IGF-Systems diese Vorgänge über IRS-Adaptorproteine regulieren. Die
einkernigen Trophoblastzellen liegen im Plazentom dem maternalen Epithel direkt
gegenüber und sind aufgrund ihrer Lage wahrscheinlich entscheidend in diesen
Prozess involviert. Auch die deutliche Expression von sowohl Liganden als auch
Signalmolekülen unterstützt diese Annahme. Um diese These bestätigen zu können,
müssten in zukünftigen Studien Proben aus früheren Trächtigkeitsstadien auf diese
Proteine untersucht werden. Dies wäre sehr sinnvoll, da eine schnelle und vollständige
Ablösung der fetalen Anteile von großer wirtschaftlicher Bedeutung ist. Die
Nachgeburtsverhaltung ist Wegbereiter für verschiedene pathogene Geschehen im
Uterus, die wiederum zu verlängerten Zwischenkalbeintervallen führen (Sheldon et al.,
2008).
Die sehr deutliche Expression von IRS2 im fetalen Mesenchym scheint oberflächlich
betrachtet nicht im Zusammenhang mit der IGF1- oder IGF2-Expression zu stehen,
die in der Arbeit von Lütkehus (2012) in diesem Gewebe mit unterschiedlichen
Intensitäten (von gar nicht vorhanden bis positiv) beschrieben wurde. Dennoch ist ein
Einfluss der Faktoren auf die Expression von IRS2 denkbar. Eine mögliche Erklärung
wäre, dass es zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits zur Internalisierung und zum
Abbau des Liganden-/Rezeptorkomplexes aus IGF1/IGF2 und IGF1R gekommen ist
und so ein Nachweis mittels Immunhistochemie nicht mehr möglich ist. Gleichzeitig
wurde die Signalkette mit dazugehöriger IRS2-Aktivierung aber bereits in Gang
gesetzt.
Wird die Arbeit im Zusammenhang betrachtet fällt auf, dass in vivo mittels
Immunhistochemie, IRS1 und IRS2 in Trophoblastzellen nachgewiesen werden
können, sogar mit deutlicher Intensität. Dieses Ergebnis konnte bei den in vitro
Versuchen mit den bovinen Trophoblastzellen (F3) Zellen auf mRNA Ebene nur für
IRS1 erzielt werden, nicht aber für IRS2.
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Ähnlich verhielt es mit den Ergebnissen von Karunkelepithel bzw. BCEC. Auch hier
konnte in vitro mittels RT-PCR in den BCEC IRS1, nicht aber IRS2 nachgewiesen
werden. In vivo zeigte das Karunkelepithel eine negative bis schwach positive
Reaktion bei beiden Adaptormolekülen. Wobei die Aussagekraft der PCR für IRS2
eigeschränkt ist, da keine Positivproben mitgeführt wurden. So könnte es zu falsch
negativen Ergebnissen gekommen sein.
In den Fibroblasten, welche aus der Karunkel isoliert wurden, konnte bei der RT-PCR
IRS1 und IRS3 nachgewiesen werden. Immunhistochemisch konnte IRS1 in negativer
bis schwach positiver Ausprägung im maternalen Stroma nachgewiesen werden,
während IRS2 auch mittels Immunhistochemie nicht an dieser Lokalisation detektiert
werden konnte.
Bedacht werden muss bei diesem Vergleich aber, dass die Proben für in vitro und in
vivo Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten der Trächtigkeit genommen
wurden. Proben, die zur Zellgewinnung dienten, kamen aus eher frühen
Trächtigkeitsstadien, während Plazentome und interplazentomares Gewebe für
immunhistochemische Untersuchungen kurz vor der Geburt bzw. kurz nach der Geburt
gewonnen wurden.
Um zu klären, ob sich das IRS-Profil im Verlauf der Trächtigkeit möglicherweise ändert,
oder ob Unterschiede durch die Kultivierung der Zellen bedingt sind, wäre es sinnvoll,
Proben sowohl für die Zellkultur als auch für die Immunhistochemie zum gleichen
Zeitpunkt und in verschiedenen Stadien der Trächtigkeit zu gewinnen. So könnten
auch methodikbedingte Unterschiede minimiert werden. Diese Überlegungen gilt es
bei zukünftigen Untersuchungen zu berücksichtigen.
- 106 -
5.6. Expression von IRS1 und IRS2 im interplazentom aren Gewebe und Vergleich
mit IGF1 und IGF2
Die Untersuchung der interplazentomaren Proben ergab folgendes
Expressionsmuster für IRS1: am stärksten angefärbt waren die uterinen Drüsen,
während das luminale Epithel variabel angefärbt war, im Bereich der Glykokalix jedoch
immer deutlich. Denkbar ist, dass im Uteruslumen eine hohe Konzentration an IGF
vorhanden gewesen ist, welches auf das Epithel eingewirkt hat. So könnte es zu der
IRS1-Expression gekommen sein. Darauf deutet der Nachweis dieses Proteins in der
direkten Kontaktzone, nämlich der apikalen Membran hin. Die Intensität der
Expression im Epithel könnte allerdings auch durch die Individualität des
Trächtigkeitsverlaufes bedingt sein. Denn der vom Versuchsablauf vorgegebene Tag
der Probenentnahme, könnte je nach Tier, unterschiedlich weit vom natürlichen
Zeitpunkt der Geburt entfernt sein, bzw. die Geburt fand spontan statt im Gegensatz
zur Sectio caesarea. Das Stratum reticulare, das Myometrium, die Venen und meist
auch das Stratum compactum wiesen keine Expression von IRS1 auf. Bei einigen
Tieren konnten jedoch in aufgelockerten Bereichen, vermutlich ödematöse Bezirke,
und um Immunzellen herum positive Areale festgestellt werden. Außerdem konnte
eine IRS1 Expression in der Tunica interna der Arterien und in kleinen Blutgefäßen im
Myometrium gezeigt werden. Die Immunzellen waren abermals nicht einheitlich
angefärbt.
Auch IRS2 wurde am stärksten in den uterinen Drüsen exprimiert. Das uterine Epithel
zeigte eine variable Reaktion, in den meisten Fällen war jedoch eine Expression
festzustellen. Auch hier gelten die Überlegungen zum tatsächlichen Zeitpunkt im
Trächtigkeitsverlau, wie bei IRS1, die Expressionsstärke betreffend. Sowohl das
Stratum compactum als auch das Stratum reticulare wiesen unterschiedlich gefärbte
Bereiche auf. Im Stratum compactum waren vornehmlich Fibrozyten und Immunzellen
positiv angefärbt, während im Stratum reticulare negative Bereiche um Drüsen und
Blutgefäße herum auffielen. Bei den Blutgefäßen wies nur das Endothel der Arterien
eine IRS2-Expression auf. Das Myometrium war schwach positiv bis positiv angefärbt,
auffällig war jedoch bei vielen Tieren das deutlich angefärbte Bindegewebe zwischen
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den Muskelzellen. Die Expression von IRS2 in den Immunzellen war abermals
unterschiedlich.
Damit werden IRS1 und IRS2 hauptsächlich in den uterinen Drüsen exprimiert. Im
Vergleich zur IGF1 und IGF2 Expression an dieser Lokalisation fallen verschiedene
Dinge auf. Sowohl IGF1 als auch IGF2 sind in hohem Maße im Epithel, den Drüsen
und im Stratum compactum zu finden. Das Myometrium und die Blutgefäße sind
hingegen nur positiv für IGF1 (Lütkehus, 2012). Die Liganden des IGF-Systems sind
also fast im gesamten Uterus bis auf das Stratum reticulare vertreten. Eine
Übereinstimmung kann für IRS1 und IRS2 in den uterinen Drüsen und im Stratum
reticulare festgestellt werden, das Epithel ist nur bei einigen Tieren deutlich positiv für
IRS1 und IRS2. Abweichende Ergebnisse zwischen den IRS-Proteinen und den IGFs
sind folglich im Stratum compactum, und Myometrium vorzufinden.
Übereinstimmende Ergebnisse im Uterus deuten auf einen Gebrauch der IRS1- und
IRS2-Proteine in der IGF-Signalkaskade der betroffenen Zellpopulationen. Das
größtenteils negativ angefärbte Stratum reticulare lässt vermuten, dass zu beiden
Zeitpunkten der Probenentnahme keine IGF-Signale über die Adaptormoleküle IRS1
und IRS2 abliefen. Die im Stratum reticulare, Myometrium und Stratum compactum
voneinander abweichenden Ergebnisse lassen auf eine Verwendung anderer
intrazellulärer Signalmoleküle schließen. In Betracht kämen unter anderem auch IRS3
und IRS4, deren Rolle beim Rind noch nicht weiter untersucht ist (Tsuruzoe et al.,
2001). Geklärt werden müsste, ob diese beiden Adaptorproteine im Reproduktionstrakt
des Rindes vorkommen. Bislang ist bekannt, dass sie nicht in allen Geweben
vorhanden sind, bzw. IRS3 bislang erst beim Nager identifiziert wurde (Lavan et al.,
1997; Boller et al., 2012). In der durchgeführten RT-PCR wurde allerdings IRS3 in den
in vitro kultivierten Fibroblasten nachgewiesen.
Der Grund für die unterschiedlich starken Immunreaktionen einzelner Tiere, aber auch
von IGF1 und IRS2, könnte der Östrogenspiegel sein. Es erscheint wahrscheinlich,
dass Östrogene, nach Aktivierung des IGF1R durch IGF, für eine Modifizierung des
IRS2 verantwortlich sind. Denkbar wären Vorgänge wie eine Phosphorylierung, die
wiederum zu Ubiquitinierung oder Degradation führen könnte. Durch diesen
Mechanismus könnten IRS2-Signale im Uterus inhibiert werden. Bei Mäusen wurde
- 108 -
die IRS2-Expression im Uterus durch Östrogene reduziert. Dieser Prozess lief
vornehmlich posttranslational ab und war einerseits abhängig von proteosomalen
Proteasen und IGF1, aber andererseits nicht allein abhängig vom IRS1-PI3K
Signalweg (Richards et al., 2001). Der Einfluss von Östrogenen auf IGF1 wurde auch
in den Arbeiten von Ohtani (1996) und Robinson (2000) bestätigt. Da bei den von uns
gewählten Versuchstieren, bedingt durch die späte Phase der Trächtigkeit (bzw. die
Geburt), der Östrogenspiegel Maximalwerte aufwies (Holzhausen, 2012), käme diese
Erklärung in Betracht. Allerdings konnten in der erwähnten Studie von Holzhausen
(2012), in der 17ß-Östradiol im Serum bestimmt wurde, kein signifikanter Unterschied
zwischen der IGF-low- und der IGF-high-Gruppe gemessen werden. Der Einfluss von
steroidalen Hormonen auf die Expression von Bestandteilen des IGF-Systems wird
schon lange diskutiert. So existieren Arbeiten, in denen eine Beeinflussung des IGF-
Systems durch steroidale Hormone beim Rind nachgewiesen werden konnte (Ohtani
et al., 1996; Robinson et al., 2000), neben solchen, in denen dies aber nicht gelang
(Geisert et al., 1991). Es wurde im Rahmen der letztgenannten Arbeit aber festgestellt,
dass östrogenbedingt ein vermehrter Transport von IGF aus dem Blutkreislauf in das
Uteruslumen hinein erfolgt (Geisert et al., 1991). Dies müsste zur Konsequenz haben,
dass von hier ausgehend auch die IRS-Signalkette in Gang gesetzt wird. Neben
Östrogen ist auch Progesteron in der Lage, den IRS2-Spiegel zu beeinflussen. Dieser
Vorgang ist auf Zellen mit Progesteron-Rezeptor beschränkt und vermag nicht auf den
IRS1-Spiegel einzuwirken. Gleichzeitig wird aber das IRS1/IRS2-Mengenverhältnis
verändert. Durch die Beeinflussung von IRS2 kann Progesteron so also in die
Signalwege von IGF1, Insulin und verschiedenen anderen Zytokinen eingreifen
(Vaßen et al., 1999; Vaßen et al., 1999 (2)).
- 109 -
5.7. Schlussfolgerung
Das Vorhandensein der einzelnen Komponenten des IGF-Systems in Uterus und
Plazenta des Rindes (Wathes et al., 1998; Robinson et al., 2000; Richterich, 2008;
Lütkehus, 2012) lassen darauf schließen, dass sie eine wichtige Rolle während der
Trächtigkeit, aber auch der folgenden Regeneration spielen. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IGF1 und IGF2 positiven Einfluss auf
die Proliferation und Motilität boviner Zellen plazentaren Ursprungs hatten. Beide
Vorgänge sind für eine erfolgreiche Trächtigkeit von entscheidender Bedeutung. Auch
Wechselwirkungen mit EGF waren ersichtlich. Die Erkenntnis, dass MAPK, Akt und
p38 MAPK an der intrazellulären Signalvermittlung beteiligt sind und der Nachweis von
IRS1 und IRS2, welche intrazelluläre Signalvermittler nach Aktivierung von IGF sind,
in Teilen von Uterus und Plazenta bieten für die Zukunft mögliche Startpunkte für die
Entwicklung prophylaktischer und therapeutischer Maßnahmen. Dies ist von
Bedeutung, da verschiedene Studien zu dem Schluss kamen, dass die IGF-
Komponenten Einfluss auf die postpartale Heilung haben (Vangroenweghe et al.,
2005; Piechotta et al., 2012). Daher sind weitergehende Untersuchungen in Bezug auf
die Eignung von IRS1 und IRS2 als Marker zur prophylaktischen Diagnostik
puerperaler Erkrankungen beim Rind und zur genauen Kommunikation zwischen den
potenten Wachstumsfaktoren IGF1/IGF2 und EGF denkbar und wünschenswert.
- 110 -
6. Zusammenfassung
„Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin- like growth factor Systems
in vitro und der peripartalen Expression von IRS1 und IRS2 i m Plazentom und in
interplazentomaren Bereichen des Rindes in vivo.“ Von Lisa Lenz (Helmstedt)
Postpartale Erkrankungen des Uterus spielen bei den heutigen Hochleistungs-
Milchkühen eine große Rolle, da sie zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führen.
Hierbei wird eine Beteiligung des IGF-Systems vermutet, da veränderte IGF-
Serumspiegel mit negativer Energie-Balance und einem erhöhten Risiko von einer
puerperalen Erkrankung betroffen zu sein vergesellschaftet sind (Wathes et al., 2009;
Piechotta et al., 2012). Nach der Lokalisation von Mitgliedern des IGF-Systems im
Reproduktionstrakt des Rindes (Robinson et al., 2000; Richterich, 2008; Lütkehus,
2012) ist das Ziel der vorliegenden Studie, die der IGF Signalgebung
zugrundeliegenden Mechanismen auf in vitro Ebene zu erforschen.
Hierfür wurden bovine plazentäre Zelllinien (BCEC, F3, Fibroblasten) mit IGF1 und
IGF2 alleine, beziehungsweise in Kombination mit EGF stimuliert und die Wirkungen
auf die Zellproliferation und Motilität untersucht. Die intrazelluläre Signalvermittlung
wurde mittels Western Blot über die Aktivierung der MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase
und p38 MAP Kinase analysiert.
Da nach Aktivierung des IGF1R die Adaptorproteine IRS1 und IRS2 für die
Signalvermittlung in der Zelle entscheidend sind, wurden diese im Plazentom und in
interplazentomaren Bereichen des Rindes mittels Immunhistochemie lokalisiert. Das
Material wurde am 275. Tag der Trächtigkeit während einer Sectio caesarea oder nach
spontan erfolgter Geburt, normalem Abgang der Nachgeburt und Instillation von LPS-
Lösung in den Uterus mit anschließender Euthanasie entnommen. Beide Gruppen
wurden zusätzlich anhand ihrer IGF1-Blutspiegel noch in IGF-high und IGF-low Tiere
eingeteilt.
In Vitro kam es bei den BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten nach Stimulation mit IGF1
und IGF1+EGF zu einer signifikant höheren Steigerung der Proliferation. IGF2
- 111 -
vermochte die Proliferation von F3 Zellen und Fibroblasten signifikant zu steigern. Die
Kombination von IGF2+EGF führte bei den untersuchten Zelllinien ebenfalls zu einer
signifikant höheren Proliferation, während EGF ausschließlich die Proliferation von F3
Zellen signifikant steigern konnte. Hervorzuheben ist, dass die Kombination von IGF2
+EGF bei den BCEC diese signifikante Steigerung erreichen konnte, obwohl die Stoffe
einzeln nicht dazu in der Lage waren. Bei den F3 Zellen hingegen war eine
antagonistische Wirkung festzustellen. IGF2+EGF verursachten eine signifikant
schwächere Proliferation im Vergleich mit EGF, wenn auch signifikant höher als die
Wachstumskontrolle.
Bei den BCEC wurde mit jeder Stimulation eine signifikante Steigerung der Motilität
erreicht. IGF1 und IGF2+EGF verursachten eine signifikante Steigerung bei den F3
Zellen und den Fibroblasten, ebenso wie IGF1+EGF bei den F3 Zellen und IGF2 bei
den Fibroblasten. Bei den F3 Zellen kam es durch Kombination von IGF2 und EGF zu
einem synergistischen Effekt, die Motilität war signifikant höher als nach Stimulation
mit den einzelnen Wachstumsfaktoren. Bei den Fibroblasten kam es hingegen durch
das Zusammenwirken von IGF1+EGF zu einem antagonistischen Effekt.
Die Untersuchung der intrazellulären Signalwege brachte folgende Ergebnisse: bei
den F3 Zellen wurden die MAP-Kinase 42/44 und die Akt Kinase durch alle
eingesetzten Stimulantien aktiviert. Die p38 MAPKinase erfuhr durch Stimulation mit
IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF eine Aktivierung. Bei den Fibroblasten kam es durch
jede Stimulation zu einer Aktivierung aller untersuchten Kinasen. Die MAP-Kinase
42/44 und die p38 MAP Kinase wurden bei den BCEC durch IGF1+EGF, EGF und
IGF2+EGF aktiviert, die Akt Kinase durch EGF. Es ist erkennbar, dass bei den F3
Zellen und den BCEC die Wirkung von EGF überwiegt.
Im Folgenden werden die immunhistochemischen Färbungen der Plazentome
betrachtet. Die Orte der stärksten Expression waren für sowohl IRS1 als auch IRS2
die mononukleären Trophoblasten. IRS2 wurde in gleichem Maße auch im fetalen
Mesenchym exprimiert. Auf maternaler Seite waren nur schwache bis negative
Expression auszumachen, bis auf die Arterien, welche positiv angefärbt waren. In den
interplazentomaren Proben wurde eine deutliche Expression von IRS1 und IRS2 in
den uterinen Drüsen festgestellt. Das luminale Epithel wies eine von negativ bis positiv
- 112 -
ausfallende Expression beider Adaptormoleküle auf. Auffällig war eine sehr starke
Anfärbung der darauf sitzenden apikalen Membran bei IRS1. Auch die Arterien waren
wieder positiv, im Gegensatz zu den Venen. Die Immunzellen zeigten für beide
Antikörper sowohl im Plazentom, als auch im interplazentomaren Bereich eine variable
Anfärbung.
Die Ergebnisse lassen auf zellspezifische Aufgaben der beiden Adaptormoleküle IRS1
und IRS2 in den peripartalen Umbauvorgängen im Uterus schließen.
Insgesamt betrachtet lassen die Ergebnisse dieser Arbeit den Schluss zu, dass IGF1
und IGF2 während der Trächtigkeit des Rindes für Proliferation und Motilität im
Plazentom entscheidend sind und in Wechselwirkung mit EGF stehen. Für diese
Vorgänge werden in vitro je nach Zelltyp, in unterschiedlicher Ausprägung, die
Signalwege von MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase genutzt. Die
Expression von IRS1 und IRS2 in Plazentom und interkarunkulären Bereichen des
Rindes lassen eine Beteiligung an der Vermittlung intrazellulärer Signale nach IGF-
Stimulation vermuten. Aufgrund dieser Erkenntnisse bieten sich verschiedene
Angriffspunkte für eine Modulation zur Bekämpfung puerperaler Erkrankungen, aber
auch mögliche Marker für die Diagnostik. Hierfür müssten weiterführende
Untersuchungen vorgenommen werden.
- 113 -
7. Summary
„Characterization of the bovine placental insulin-l ike growth factor system in
vitro and the peripartal expression of IRS1 and IRS2 in the placentome and
interplacentomal tissue of dairy cows in vivo.” Lisa Lenz (Helmstedt)
Postpartal uterine dieseases are one of the major problems in the dairy cow herd
management today, because they provoke severe economical losses. In this regard,
the IGF-system might play a significant role as there is evidence that negative energy
balance and deviating IGF level are associated with puerperal diseases in dairy cows
(Wathes et al., 2009; Piechotta et al., 2012). After the localization of the members of
the IGF-system in the uterus and placentome of cattle (Robinson et al., 2000;
Richterich, 2008; Lütkehus, 2012), the goal of this study was to elucidate the underlying
mechanisms of the IGF-system in vitro.
Three bovine, placental cell lines (BCEC, F3, fibroblasts) were stimulated with IGF1
and IGF2 alone or in combination with EGF, and the influence on proliferation and
motility was examined. The intracellular signaling after stimulation was analysed by
western blots for the activation of MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase, and p38 MAP
Kinase.
Since the adaptorproteins IRS1 and IRS2 are crucial for downstream signaling after
IGF1R activation their expression was examined in the bovine placentome and in
interplacentomal areas by immunohistochemistry. The material was taken on day 275
of gestation during a caesarian section or after spontaneous labour. After release of
fetal membranes, LPS-instillation and euthanization were conducted. Both groups
were further subgrouped into IGF-low and IGF-high animals, according to their blood
IGF-levels.
In vitro a significant increase of proliferation after stimulation with IGF1 and IGF1+EGF
was seen in BCEC, F3 cells and fibroblasts. On the contrary, IGF2 was capable of
significantly increasing the proliferation of F3 cells and fibroblasts. The combination of
IGF2+EGF was again able to enhance the proliferation of all three analyzed cell lines,
- 114 -
whereas EGF only enhanced the proliferation of F3 cells. It has to be emphasized that
the combination of IGF2+EGF was able to increase the proliferation significantly, while
the two growth factors on their own failed to do so. Regarding F3 cells, a contrary result
was obtained: IGF2+EGF seemed to have an antagonistic effect. Their combination
resulted in a significantly lower proliferation compared to EGF, although a significant
increase related to the cells grown in serumfree medium was observed. In BCEC, a
significant enhancement of motility was found after each stimulation. IGF1 and
IGF2+EGF led to a significant increase of the motility of F3 cells and fibroblasts, just
as IGF1+EGF in F3 cells and IGF2 in fibroblasts. The combination of IGF2 and EGF
had a synergistic effect on F3 cells; the motility was significantly higher compared to
the single stimulations. Considering fibroblasts an antagonistic effect was noticeable
after stimulation with IGF1+EGF.
The results of the investigation regarding the intracellular signal cascades were as
follows: the MAP-Kinase 42/44 and the Akt Kinase of F3 cells was activated by all
analyzed growth factors. The p38 MAPK Kinase was activated by IGF1+EGF, EGF,
and IGF2+EGF. Regarding the fibroblasts, an activation of the examined kinases was
seen after every stimulation. MAP-Kinase 42/44 and p38 MAP Kinase were activated
by IGF1+EGF, EGF, and IGF2+EGF in BCEC, whereas the Akt Kinase was only
activated by EGF. Thus it appears that the impact of EGF exceeded that of the other
two growth factors in F3 cells and BCEC.
In the immunohistochemical stainings of the placentomes it is obvious that IRS1 and
IRS2 are mainly located in the mononuclear trophoblasts. IRS2 is as prominent in the
fetal mesenchyme. Concerning the maternal part, there was a variation from a weak
to no expression, except for the arteries, which were positive. In the interplacentomal
samples IRS1 and IRS2 were located in the uterine glands. In the luminal epithelium
the staining of both adaptor proteins varied from negative to positive. Remarkable was
the intense staining of the apical membrane for IRS1. Again, only the arteries, but not
the venes were positive. The intense of staining of immune cells was variable in
interplacentomal areas and in the placentome and for both antibodies.
In conclusion, there seem to be cell-specific functions of both adaptorproteins IRS1
and IRS2 in the ongoing remodeling processes during the peripartal time.
- 115 -
In summary, the results of this work led to the conclusion that IGF1 and IGF2 during
gestation are crucial for proliferation and motility in the bovine placentome and interact
with EGF. Depending on the cell type, these processes in vitro are differentially
regulated by MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase, and p38 MAP Kinase. The expression of
IRS1 and IRS2 in the placentome and intercaruncular tissue led to the assumption that
they take part in the intracellular signaling after IGF stimulation. Based on these
findings, new various targets for modulation as well as some potential novel markers
for diagnostics could be developed to combat puerperal diseases. However, further
investigations are needed.
- 116 -
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- 135 -
9. Anhang
9.1. Abkürzungen
µ Mikro (10-6)
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µg Mikrogramm
°C Grad Celsius
A Ampere
ABA Acrylamid-Bisacrylamid (1:37,5), Rotiphorese
Gel 30
ALS Acid Labile Subunit
APS Amoniumperoxidsulfat
Aqua dest Aqua destillata
AEBSF 4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluorid
hydrochlorid
Akt Akt Kinase
Anova Analysis of variance
ATP Adenosintriphosphat
bp Base pairs (Basen Paare)
BCEC Bovine caruncular epithelial cells
BSA Bovines Serum Albumin
bST Bovines Somatotropin
BUVEC Bovine uterine vein endothelial cells
cDNA Complementary DNA
cm Zentimeter
DAB 3,3´-Diaminobenzidin-tetra-hydrochlorid
DMEM/HAM’s F12 Dulbecco Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxide
- 136 -
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic
acid)
dNTP Didesoxyribonukleosid-Triphosphate
EBM Endothelzell-Basal-Medium
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGF Epidermal growth factor
ERK Extracellular-signal regulated kinase
F3 Fetale Trophoblasten
FCS Fetales Kälber Serum (fetal calf serum)
FGF Fibroblast growth factor
FSM Vollmedium (full supplemented medium)
for Forward (Primer)
g Gramm
g Normfallbeschleunigung (g=9,81 m/s2)
GH Growth Hormone
Grb2 Growth factor rebound protein
HCL Salzsäure
HE Hämatoxylin-Eosin
HR Insulin-Hybrid Rezeptor
HRP Horse radish peroxidase
IL2 Interleukin 2
IL6 Interleukin 6
IGF Insulin-like growth factor
IGF1 Insulin-like growth factor 1
IGF2 Insulin-like growth factor 2
IGFBP Insulin-like growth factor binding protein
IGF1R Insulin-like growth factor receptor 1
IGF2R Insulin-like growth factor receptor 2
INF-Ʈ Interferon-Ʈ
IR Insulin Rezeptor
IR-A Insulin Rezeptor, Isoform A
- 137 -
IR-B Insulin Rezeptor, Isoform B
IRS Insulin receptor substrat
IRS1 Insulin receptor substrat 1
ISR2 Insulin receptor substrat 2
ISR3 Insulin receptor substrat 3
ISR4 Insulin receptor substrat 4
ISR5 Insulin receptor substrat 5
ISR6 Insulin receptor substrat 6
kDa Kilodalton
l Liter
LDL Low density lipoprotein
LGA Large for gestational age
LPS Lipopolysaccharid
m Milli (10-3)
MCF-7 Michigena Cancer Foundation-7, Brustkrebs-
Zellinie
ml Milliliter
mm Millimeter
mg Milligramm
mM Millimolar
MMP Matrix-Metalloproteinase
min Minute
M Molar
MAPK Mitogen-activated protein kinase
Mean Arithmetischer Mittelwert
mRNA Messenger RNA
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium Bromid
n Nano (10-9)
N2 Stickstoff
NaCl Natriumchlorid
- 138 -
Nck Non-catalytic region of tyrosine kinase
adaptor protein 1
NGS Normal goat serum
NHS Normal horse serum
p p-Wert
p38 MAPK Phospho-p38 MAP Kinase
pAkt Phospho Akt
PAF Platelet activating factor
PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate
buffered saline)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase
chain reaction)
PEM PBS-EDTA-Wasser
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase
pMAPK 42/44 Phosphorylated mitogen-activated protein
kinase 42/44
rev Reverse (Primer)
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse-Transkriptase PCR
RNA Ribonucleid acid
RPS9 40S ribosomal protein S9
SDS Sodium dodecylsulfate
SEM Standard error of the mean
SGA Small for gestional age
SNEB Severe negative energy balance
SFM Serum freies Medium
TBE TRIS-boronic acid-EDTA-buffer
TBS Salty buffered TRIS
TEMED Tetramethylethyldiamin
TG TRIS-Glycine
TGC Trophoblast Giant Cells
- 139 -
TRIS Tris-Borat-EDTA-Puffer
TEMED Tetramethylethylendiamine
V Volt
VEGF Vascular endothelial growth factor
VE Voll entsalzt
v/v Volumen pro Volume
w/v Gewicht pro Volumen
- 140 -
9.2. Puffer und Lösungen
Blot-Puffer
TG 10x 250ml
Methanol 500ml
Aqua dest. 2250ml
Boehringer-Lyse-Puffer
TRIS pH 7,4 50mM
NaCl 150mM
NaF 40mM
EDTA 3mM
EGTA 2mM
NP40 (Nonidet) 1% (v/v)
SDS 0,1% (w/v)
NaDox 0,1% (w/v)
AEBSF (1mM) 1:100
Leupeptin (1µM) 1:100
Pepstatin (1µg/ml) 1:1000
Phosphatase-Inhibitoren 1:100
Citrat-Puffer (pH 6,0)
Lösung A (0,1M Zitronensäure)
C6H8O7 x H20 21g
Aqua dest. ad 1000ml
Lösung B (0,1 M Natriumcitrat)
C6H5O7Na3 x 2H2O 29,41g
Aqua dest. ad 1000ml
- 141 -
Delafield’s Hämalaun
Hämatoxylin 1g
Isopropanol 6ml
Ammoniumalaun Lösung, gesättigt 100ml
4 Tage Reifung bei Tageslicht
Glycerin 25ml
Methanol 25ml
Eosin (1%)
Eosin G 5g
Aqua dest. 500ml
Vor Gebrauch 3-4 Tropfen Eisessig hinzugeben.
Endothelzell-Basal-Medium MV2 (EBM)
EBM MV2 500ml
Penicillin/Streptomycin (10.000U/ml) 5ml
Glutamin 5ml
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 50ml
Epidermal growth factor (5ng/ml) 500µl
Basic fibroblast growth factor (10ng/ml) 500µl
Insulin-like growth factor 1 (20ng/ml) 500µl
Vascular endothelial growth factor (0,5ng/ml) 500µl
Ascorbic acid(1mg/ml) 500µl
Hydrocortisone (0,2µg/ml) 500µl
Endothelzell-Basal-Medium 1% (EBM 1%)
EBM MV2 500ml
Penicillin/Streptomycin (10.000U/ml) 5ml
L-Glutamin 5ml
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) (0,5%) 5ml
- 142 -
Formalin nach Lillie
37%iges Formaledhyd 100ml
NaH2PO4 6,5g
NaH2PO4 4,0g
Aqua dest. Ad 1000ml
H2O2-Lösung (0,6%)
H2O2 (30%) 4ml
Ethanol (80%) ad 200ml
Lower TRIS (pH 8,8)
TRIS base 1,5M
SDS 0,4% (v/v)
Lämmli Puffer (4x)
TRIS-HCl 240mM
SDS 8%
Glycerol 40%
Bromphenolblau 0,04%
Beta-Mercaptoethanol 5%
Milchpulverlösung
Magermilchpulver, blotting grade 1,25g
TBS-T 25ml
NaOH-Lösung
NaOH Pellets 40g
Aqua dest. 1000ml
- 143 -
PEM
EDTA 200mM 5ml
PBS 10x 50ml
Aqua dest. 450ml
PBS (pH 7,2)) (für den Gebrauch in der Histologie)
Aqua dest. 5l
Na2HPO4- 7,8g
NaCl 40g
NaOH 40ml
PBS 10x (pH 7,2)
Na2HPO4 7,8g
NaCl 40g
Aqua dest. 500ml
Trypsin 2x
Trypsin 10x (0,5%) 8ml
PEM 32ml
Trenngel 12%
VE-freies Wasser 2400µl
ABA (Acrylamid-Bisacrylamid 1:37,5) 3100µl
Lower TRIS 2000µl
APS (Ammoniumperoxidsulfat) 75µl
Temed 5µl
Sammelgel
Aqua dest. 2700µl
ABA (Rotophorese® Gel 30) 670µl
Upper TRIS 500µl
- 144 -
Bromphenolblau (1%) 50µl
APS (10%) 40µl
TEMED 8µl
Stopfgel
Temed 4µl
Trenngel 500µl
Serumfreies Medium (SFM)
DMEM/Ham’s F12 500ml
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) 5ml
L-Glutamin 5ml
SDS-Laufpuffer
TG 10x 100ml
SDS 10% 10ml
Aqua dest. 890ml
Stripping-Buffer (pH 2,0)
Glycin 0,2M
Tween20 20% 0,05%
SDS 1%
TBS (10x) (pH 7,4)
TRIS Base 60,55g
NaCl 90g
Aqua dest. 1000ml
TBS (1x)
TBS (10x) 100ml
Aqua dest. Ad 1000ml
- 145 -
TBS-T (TRIS buffered saline with Tween)
Tween20 20% 2,5ml
TBS (1x) 1000ml
TBE (10x)
TRIS 108g
Borsäure 55g
0,5M EDTA (pH8) 40ml
Aqua dest. Ad 1000ml
TBE (1x)
TBE (10x) 100ml
Aqua dest. Ad 1000ml
TG (10x)
TRIS Base 29g
Glycin 144g
SDS 10g
Aqua dest. Ad 1000ml
Upper TRIS (pH 6,8)
TRIS-HCl 500mM
SDS 0,4% (v/v)
Vollmedium (FSM)
DMEM Ham’s F12 500ml
Penicillin/Streptomycin (10.000U/ml) 5ml
L-Glutamin 5ml
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 50ml
- 146 -
9.3. Reagenzien
Reagenzien Bezugsquelle
5x Colourless GoTaq Reaction buffer Promega, Mannheim
AEBSF A1721 AppliChem, Darmstadt
Agarose NEEO Ultra Quality Roti® Garose Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Ammonium-Alaun AppliChem GmbH, Darmstadt
Anti-Goat-HRP (sc2056) SantaCruz Biotechnology, Inc.;
Heidelberg
Anti-Rabbit-HRP (sc-2004) SantaCruz Biotechnology, Inc.;
Heidelberg
APS (10%) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
Borsäure Carl Roth GmbH + Co.KG; Karlsruhe
Bovines Serumalbumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen bei München
DAKO Envision+ system/rabbit HRP DAKO Deutschland GmbH, Hamburg
DC Protein Assay Kit™ Bio-Rad Laboratories, München
DCS Supervision, 2-Schrittpolymersystem, DCS, Hamburg
Ziege
DilLDL 200ug/ml Harbor Bio-Products, USA
Di-Natriumhydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merck KGaA, Darmstadt
DMEM/Ham’s F12 PAA Laboratories GmbH, Cölbe
dNTP (10nM) Promega GmbH, Mannheim
Dulbecco’s PBS (10x) without Ca+Mg PAA Laboratories GmbH, Cölbe
EBM MV2 Promo Cell GmbH, Heidelberg
EDTA Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
Epidermal growth factor, human Biomol GmbH, Hamburg
Recombinant (50349.1000)
- 147 -
Ethidiumbromidlösung (1%) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
Eosin G Merck KGaA, Darmstadt
Ethanol, vollständig vergällt SAV, Liquid Production GmbH,
Eukitt® O. Kindler GmbH, Freiburg
Fetales Kälberserum PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Formaldehylösung min. 37% säurefrei Merck KGaA, Darmstadt
Glutamin PAA Laboratories GmbH, Cölbe
GoScript™ Reverse Transcription System Promega GmbH, Mannheim
Go TaqHotStart polymerase (5u/µl) Promega GmbH, Mannheim
5x Green Go Taq reaction buffer Promega GmbH, Mannheim
Hämatoxylin Merck KGaA, Darmstadt
Hank’s BSS with/without Ca+Mg PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Hoechst 33342 Life Technologies GmbH,
Darmstadt
H2O2 (30%) Merck KGaA, Darmstadt
Insulin-like Growth Factor-1, human Biomol GmbH, Hamburg
recombinant (50356, 100)
Insulin-like Growth Factor-2, Biomol GmbH, Hamburg
human recombinant (50342.10)
ImPromII 5x Reaction buffer Promega, Mannheim
ImPromII Reverse Transcriptase Promega, Mannheim
Isopropanol Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
Leupeptin (L2884) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen bei München
L-Glutamine 200mM PAA Labortaories GmbH, Cölbe
Loading Dye (6x) MBI-Fermentas, St. Leon-Rot
LPS, E. coli O55:B5 Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri
MgCl2 Promega, Mannheim
Methanol Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
Milchpulver, blotting grade (fettarm) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
MTT SigmaAldrich, Germany
- 148 -
Natriumchlorid Fluka-Chemie, neu-Ulm
NP-40 (Nonidet p-40) AppliChem, Dramstadt
Paraffin, Leica SurgiPath Paraplast Leica Biosystems GmbH, Illinois, USA
PBS PAA, Austria
Penicillin/Streptomycin PAA, Austria
Pepstatin A2205 AppliChem GmbH, Darmstadt
Pferdeserum eigene Gewinnung, in 30min (56°C)
inaktiviert anschließend bei
eingefroren (-21°C) bis Gebrauch
Physiologische NaCl-Lösung Braun, Meldungen
Phosphatase-Inhibitor-Mix P0044 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen bei München
Primer Eurofins MWG, Operon, Ebersberg
Proteinmarker SDS7B Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen bei München
Random Primers (3µg/µl) Life Technologies GmbH, Darmstadt
Release® Pentobarbital WDT, Garbsen
RNAsin (2,500U) Promega, Mannheim
Super Signal® West Dura Trail Kit Thermo Scientific, Illinois, USA
SV Total RNA Isolation system Promega GmbH, Mannheim
SYBR Green PCR MasterMix Applied Biosystems, Life
Technologies, USA
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide Sigma Aldrich Chemie GmbH,
97,5% TLC Taufkirchen bei München
TRIS (Base) Pufferan® Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
TRIS (HCL) Pufferan® Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
Trypsin (10x) PAA, Austria
Xylol SAV Liquid Production GmbH,
Flintsbach
- 149 -
Ziegenserum (Normal Goat Serum) eigene Gewinnung, in 30min (56°C)
inaktiviert anschließend bei
eingefroren (-21°C) bis Gebrauch
- 150 -
9.4. Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien Bezugsquelle
12-well-Platte Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
24-well-Platte TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadingen, Schweiz
96-well-Platte TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadingen, Schweiz
Aufbewahrungsboxen für Paraffinblöcke Medite Medizinprodukte, Burgdorf
Blot absorber Filterpapier (1mm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Cell scraper (Policeman) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen bei München
Cell Star Cell Culture Plate 12 well Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen
Cell Star Tubes (15ml/50ml) Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen
Deckgläschen (24x33mm) Knittel, Braunschweig
Einbettungskapseln Jet Aktiv Flo™ Leica Biosystems GmbH, Illinois, USA
Routine I embedding capsules
HistoBond® adhesive Objektträger Paul Marienfeld GmbH & Co. KG,
Lauda-Königshofen
Handschuhe Nobaglove Nitril® Puderfrei NOBA Verbandmittel Danz GmbH,
Wetter
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems, Life
Technologies, USA
Microtome Blades S 35 Type FEATHER, Japan
Pipettenspitzen für Biohit-Pipetten:
Pipetten 0,1-3µl und 0,5-1µl: Kisker, Biotech, Steinfurt
A300S Quali Filterpipettenspitzen
DNAse/RNAse-frei
- 151 -
Pipetten 10-100µl: Kisker, Biotech, Steinfurt
Spitzen 250µl,
DNAse/RNAse-frei
Pipetten 100-1000µl: Kisker, Biotech, Steinfurt
Spitzen 1000µl
DNAse/RNAse-frei
Plastibrand PCR-Tubes 1,5ml, transparent Brandt GmbH, Wertheim
Zellkulturflasche 150 cm² TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadingen, Schweiz
Zellkulturflasche 75 cm² TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadingen, Schweiz
Zellkulturschalen (60x15mm) TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadingen , Schweiz
Zellkulturtestplatte (96 Wells/24 Wells) TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadinegn, Schweiz
9.5. Geräte
Geräte Bezugsquelle
Bio-Vision-3026 WLI26M Vilber-Lourmat, Eberhardzell
+ Software VisionCapt
Cell Observer System (Zeiss MicroImaging) Carl Zeiss AG, Oberkochen
+ Software AxioVision
ELISA Reader Thermo Multiskan ThermoFisher Scientific Inc., USA
+ Software Ascent for Multiskan
- 152 -
Biorad SmartSpec™ Plus Spectrometer Bio-Rad Laboratories GmbH
Einbettungsautomat Leica ASP 300S Leica Biosystems GmbH, Nussloch
Elektrophorese- und Blottingapparatur Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Mini-Sub Cell GT Cell,
Gießkammer und Kamm
Fusion SL Chemiluminescence Vilber-Lourmat, Eberhardzell
Documentation 3500 WL
HandyStep® Multistep Pipette Brand GmbH, Wertheim
Heizblock Mixing Block MB-120 Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch
Oldendorf
Heraeus Fresco 17 Zentrifuge Andreas Hettich GmbH & Co. KG,
Tuttlingen
Kühlplatte EG1150C Leica Instruments GmbH, Nussloch
Labor-ph-Meter 766 Calimatic® Knick Elektronische Messgeräte
GmbH&Co. KG, Berlin
Laborwasseraufbereitungsanlagen:
Miele Aqua Purificator G7795 mit Miele&Cie. KG, Gütersloh
Patrone E310
Ionenaustauscher (VE-Wasser-Patrone) Landgraf Laborsysteme, Langenhagen
Leica LMD 7000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar
+ Software Leica Application Suite
Magnetrührer MR Hei-Standard Heidolph Instruments GmbH&Co. KG,
Schwabach
Microtom Leitz 1512 Leica Instruments GmbH, Nussloch
Mikroskop-Kamera DFC310FX Leica Microsystems GmbH, Wetzlar
Mini-Protean Tetra Cell electrophoresis Bio-Rad Laboratories GmbH, München
System
Mixing Block MB 120 Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch
Oldendorf
Neubauer-Zählkammer Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe
Pipetten von Biohit: Biohit Deutschland GmbH, Rosbach
- 153 -
0,1-3µl
0,5-10µl
10-100µl
100-1000µl
Power Supply PowerPac™ Basic für Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Elketrophorese
Reagenzglasschüttler – IDL RS1 Landgraf Laborsysteme, Langenhagen
PCR-Cycler PeqStar 96 Universal Gradient PEQLAB Biotechnologie GmbH,
Erlangen
Plattformschüttler Promax 1020 Heidolph Instruments GmbH%Co. KG,
Schwabach
Plattformschüttler CAT S20 Landgraf Laborsysteme, Langenhagen
UV-Transluminator Bio-Vision-3026 mit Vilber-Lourmat, Eberhardzell
Bildbearbeitungssoftware VisionCapt
Waage TE 313S Sartorius AG, Göttingen
Zentrifuge Heraeus Fresco 17 ThermoFisher Scientific Inc., USA
- 154 -
9.6. Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Übersicht Uterus Rind (HE) Seite 4
Abb. 2 Übersicht Plazenta Rind (HE) Seite 7
Abb. 3 Darstellung des IGF-Systems mit Liganden, Seite 20
Rezeptoren und IGFBPs
Abb. 4 Expression von IGFBPs bei F3/Fibroblasten Seite 54
und BCEC/BUVEC
Abb. 5 Expression von IGF1, IGF2, IGF1R und Seite 55
IGF2R bei F3/Fibroblasten und BCEC/BUVEC
Abb. 6 Expression von IRS1, 2, 3 und 4 bei F3, BCEC Seite 56
und Fibroblasten
Abb. 7 Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 58
und EGF bei BCEC
Abb. 8 Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 59
und EGF bei F3 Zellen
Abb. 9 Proliferation nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 60
und EGF bei Fibroblasten
Abb. 10 Motilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 62
und EGF bei BCEC
Abb. 11 Motilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 63
und EGF bei F3 Zellen
Abb. 12 Motilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 64
und EGF bei Fibroblasten
Abb. 13 Zellmotilität nach Stimulation mit IGF1, IGF2 Seite 65
und EGF bei BUVEC
Abb. 14 Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und Seite 68
p38 MAPK bei BCEC
Abb. 15 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase Seite 69
und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1,
IGF2 und EGF bei BCEC
- 155 -
Abb. 16 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt und Seite70
p38 MAP Kinase bei F3 Zellen
Abb. 17 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt Kinase Seite 71
und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1,
IGF2 und EGF bei F3 Zellen
Abb. 18 Aktivierung von MAPK 42/44, Akt und Seite 72
p38 MAPK bei Fibroblasten
Abb. 19 Aktivierung der MAPK 42/44, Akt KInase Seite 73
und p38 MAPK nach Stimulation mit IGF1,
IGF2 und EGF bei Fibroblasten
Abb. 20 IRS1-Expression im Plazentom der Seite 78
präpartalen Gruppe
Abb. 21 IRS1-Expression im Plazentom der Seite 79
postpartalen Gruppe
Abb. 22 IRS1-Expression im interplazentomaren Seite 81
Gewebe der präpartalen Gruppe
Abb. 23 IRS1-Expression im interplazentomaren Seite 82
Gewebe der postpartalen Gruppe
Abb. 24 IRS2-Expression im Plazentom der Seite 84
präpartalen Gruppe
Abb. 25 IRS2-Expression im Plazentom der Seite 85
postpartalen Gruppe
Abb. 26 IRS2-Expression im interplazentomaren Seite 87
Gewebe der präpartalen Gruppe
Abb. 27 IRS2-Expression im interplazentomaren Seite 88
Gewebe der postpartalen Gruppe
- 156 -
9.7. Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Verwendete Zellzahlen und Zelllinie im Seite 33
Proliferationsassay
Tab. 2 Konzentrationen der untersuchten Seite 33
Wachstumsfaktoren im MTT-Assay und Live
Cell Imaging
Tab. 3 Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Seite 35
Motilitäts-Assay
Tab. 4 Verwendete Primer Seite 38
Tab. 5 Verwendete Zellzahl/well und Zelllinie für Seite 40
Western Blotting
Tab. 6 Konzentrationen der untersuchten Seite 40
Wachstumsfaktoren im Western Blotting
Tab. 7 Im Western Blotting verwendete Antikörper Seite 42
mit jeweiliger Verdünnung
Tab. 8 In der Immunhistochemie verwendete Seite 52
Primärantikörper
Tab. 9 Übersicht über die Aktivierung verschiedener Seite 74
Signalwege bei F3 Zellen, Fibroblasten und BCEC
Tab. 10 Übersicht über die Expression von IRS1 Seite 89
und IRS2 im PLazentom- Zusammenfassung der
Ergebnisse der prä- und postpartalen Gruppe
Tab. 11 Übersicht über die Expression von IRS1 Seite 90
und IRS2 im interkarunkulären Gewebe-
Zusammenfassung der Ergebnisse der prä- und
postpartalen Gruppe
- 157 -
10. Danksagung
Ich möchte mich bei meiner Doktormutter Prof. Dr. Christiane Pfarrer für die
Überlassung des interessanten Themas und die gewährten Einblicke in die Arbeit in
der Forschung und Lehre sowie die Betreuung bedanken. Vielen Dank auch für die
Aufnahme in die Arbeitsgruppe am Anatomischen Institut. Die gewonnen Erkenntnisse
werden sicherlich nützlich für meine weitere Laufbahn sein.
Auch bei unserer Postdoc Dr. Nina Hambruch möchte ich mich für die
wissenschaftliche Betreuung, schnellen Antworten und die Unterstützung in allen
fachlichen Fragen bedanken.
Ich danke der Firma Pfizer Inc. für die Finanzierung.
Für die Unterstützung im Labor bedanke ich mich bei Doris Walter, Marion Gähle und
Ines Blume. Sie waren eine große Hilfe bei der Durchführung der Versuche.
Bei Dr. Marion Piechotta und Dr. Lars Holzhausen bedanke ich mich für die Betreuung
der Versuchstiere in der Klinik und die durchgeführten Probenentnahmen.
Auch Dr. Hanna Lütkehus und Dr. Sarah Laue gilt mein Dank für die Entnahme und
Aufbereitung der verwendeten Proben.
Mein besonderer Dank gilt Sarah Laue, die mir nicht nur die verschiedensten
Methoden im Labor beigebracht hat und immer mit Rat und Tat zur Seite stand,
sondern auch eine liebe Freundin geworden ist.
Auch bei Eva Wehrmeister und Manon Scheld möchte ich mich für die tolle
gemeinsame Zeit in unserem Büro und die darüber hinaus gewachsene Freundschaft
bedanken. Genauso wie bei meinen Mitdoktoranden Indra Huels, Anja Lang, Carina
- 158 -
Eydt und Hannes Reinhard. Ihr habt alle dazu beigetragen, dass es eine schöne Zeit
war.
Bedanken möchte ich mich auch bei Judith Graß für die großartige Unterstützung
jeglicher Art während der gesamten Zeit der Doktorarbeit und auch schon während
des Studiums. Und natürlich für unsere Freundschaft.
Meiner Familie danke ich für den Rückhalt und die Unterstützung während des
Studiums und der Doktorarbeit, besonders meiner Oma Maria.
Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Mann Marko für die Liebe und
Unterstützung bedanken und natürlich für unsere wunderbaren Kinder.