232 G. LOSSE, H. JESCHKEIT und H. ZASCHKE Bd. 676

'Uber Aminodicarbonsaurepeptide, 111 *

SYNTHESE DER STRUKTURISOMEREN GLUTAMYL-ORNITHINE

von GUNTER LOSE, HANS JESCHKEIT und HORST ZASCHKE

Aus dem lnstitut fur Organische Chemie der Universitat Halle-Wittenberg

Eingegangen am 4. November 1963

Glutamyl-a- und -8-ornithine sowie a.y-Glutamyl-bis-a-ornithin werden aus ste- risch reinen N-Cbo-glutaminsauremonobenzylestern durch Verknupfung mit der Ornithin-Komponente nach verschiedenen peptidsynthetischen Verfahren unter temporarer Blockierung einer NH2-Gruppe dargestellt. Die Synthese der Glut- amyl-8-ornithine gelingt auch durch direkte Peptidierung von freiem Ornithin.

Beim selektiven Aufbau von Peptiden aus Aminodicarbonsauren und Diamino- carbonsiuren werden zum Schutze von Carboxylgruppen heute vorzugsweise Benzyl- ester 1) und tert.-Butylester 2) verwendet, die sich leicht hydrogenolytisch bzw. acido- lytisch wieder spalten lassen. Die w-Aminogruppe der Diaminocarbonsauren wird allgemein durch N-Acyl-Reste, die a-Aminogruppe am einfachsten durch Metall- komplex-Bildung blockiert3). Der Schutz der a-Aminogruppe eriibrigt sich, wenn man die freie Diaminocarbonsaure in neutralem Medium (Zwitterionenstruktur) einsetzt".

In der vorliegenden Arbeit werden die Synthesen von a-Glu-a-Om, y-Glu-a-Om, a-Glu-8-Om und y-Glu-8-Om sowie von a.y-Glutamyl-bis-a-ornithin beschrieben.

KRYSIN und PODDUBNAJA 5 ) haben im Zusammenhang mit der Strukturaufklarung des Antibiotikums Albomycin6) a-L-Glutamyl-a-DL-ornithin synthetisiert, jedoch nur elektro- phoretisch untersucht. KLIEGER und SCHRODER~) gewannenz-L-Glutamyl-(NG-tosyl)-L-ornithin aus dem Carbobenzoxy-dipeptid-tert.-butylester mit Bromwasserstoff/Eisessig.

* ) 11. Mitteilung: G. LOSE; H. JESCHKEIT und R. HOHN, Liebigs Ann. Chem. 676,222 (1964).

1 ) I;. WEYCAND und K. HUNGER, Chem. Ber. 95, 7 (1962); E. KLIEGER und H. GIBIAN, Lie-

2 ) E. TASCHNER, C. WASIELEWSKI, T. SOKOLOWSKA und J. F. BIERNAT, Liebigs Ann. Chem.

3) Ubersicht bei J. RUDINGER, Collect. czechoslov. chern. Commun. 24, 95 (1959). 4) M. C. KHOSLA, H. G. GARG und N. ANAND, J. sci. ind. Res. [New Delhi], Sect. B 21, 318

5 , E. P. KRYSIN und N. A. PODDUBNAJA, [J. allg. Chem.] 32, 2102 (1902) [C. A. 58, 9227

voranstehend.

bigs Ann. Chem. 655, 195 (1962).

646, 127 (1961); R. SCHWYZER und H. DIETRICH, Helv. chim. Acta 44, 2003 (1961).

(1962) [C. A. 57, 12617 (1962)l.

(1963)l. 6 ) N. A.PODDUBNAJA und E. P. KRYSIN, [J. allg. Chem.] 32, 1005 (1962) [C. A. 58, 6926

(1963)l. 7) E. KLIEGER und E. SCHRODER, Liebigs Ann. Chem. 661, 193 (1963).

1964 Aminodicarbonsaurepeptide, 111 233

a) Carbodiimid CO-NH- CH- CO~BL + I I ____ C02H + H~N-CH-COZBZ

(CHz)z phenylester (CHZ)Z (CHd3-NH-Cbo I (CHz)3-NH-Cbo b, PNitro-

I

I

I

I

I 111 CH-NH-Cbo CH- NH- Cbo

COZBZ I COzBz

y-Glutumyl-a-ornithin ~ Pd/Hz _I

VII : nach a) 65 %, nach b) 69 % d. Th.

( 1 0 0 % d. Th.)

CO-NH-(CH2)3- CH- CO2 I I I

I + HzN-(CHZ)~-CH-COZ a)Ci.COzCzHs (CH2)z HzN---tCu/z I I _____ + I

I IV H 2 N d C u / 2 b)p-Nitro- phenylester CH -N - Cbo

V: nach a) 78%, COZBZ nach b) 58.5% d.Th.

i b ) KCN

a) g-Nitro- I + HzN- (CH2)3- CH- COzH phenylester CO-NH-(CH& -CH-COzH

I -- I I NHz (7Hz)z NHz

CH-NH-Cbo y-Glutamyl-8-ornithin < Pd/Hz I

(100% d. Th.) COzBz VIII : nach a) 69 %, nach b) 100% d. Th.

+ IV C02Bz I VI: 75 % d. Th.

- + I ____ I CH-NH- Cbo I

COzH

CH- NH- Cbo HzN- CU/Z I I I

CO - NH - (CH2)3- CH - COz

jb) KCN

CH-NH-Cbo

CO -NH- (CH2)3- CH-COzH Pd/Hz a-Glutamyl-6-ornithin +--- I

(100% d. Th.) I

I CH-NH-Cbo

CO- NH-CH- COZBZ a-GIiitumyI-a-ornithin Pd/& , I

(100% d. Th.) I 1

Cbo = Carbobenzoxy Bz = C ~ H S - C H ~ (CHz)3-NH-Cbo

234 G. LOSSE, H. JESCHKEIT und H. ZASCHKE Bd. 676

Zur Synthese der Glutamylornithine haben wir ausschlieBlich hydrogenolytisch abspaltbare Schutzgruppen verwendet. Dadurch konnte die Transpeptidierungs) aus- geschlossen werden.

Bei der Darstellung der Glutamyl-a-ornithine wurden N-Cbo-glutaminsaure-a- (I) bzw. -y-benzylester (11) nach der Nitrophenylester- und der Carbodiimid-Methode rnit Ns-Cbo-ornithinbenzylester (111) gekuppelt und die dabei entstehenden Bis-cbo- dipeptiddibenzylester (VII bzw. X) katalytisch hydriert.

Die Glutamyl-6-ornithine wurden durch Umsetzung der N-Cbo-glutaminsaure- monobenzylester mit dem Kupferkomplex des Ornithins (IV) nach der gemischten Anhydrid- und der Nitrophenylester-Methode gewonnen. Aus den N-Cbo-dipeptid- benzylester-kupferkomplexen (V und VI) wurde das Cu rnit Kaliumcyanid entfernt. Die N-Cbo-dipeptidbenzylester (VIII und 1X) wurden durch katalytische Hydrierung in die freien Peptide ubergefiihrt. Als besonders geeignet erwies sich die Synthese der Glutamyl-bornithine aus N-Cbo-glutaminsaure-benzylestern-[p-nitro-phenylestern] und freiem Ornithin in hhanol/Wasser. Die dabei direkt entstehenden N-Cbo-dipep- tidbenzylester (VIII und IX) waren mit den iiber die Kupferkomplexe gewonnenen Verbindungen identisch.

a.y-Glutamyl-bis-a-ornithin wurde aus N-Cbo-glutaminsaure-di-[p-nitro-phenyl- ester] 9) und N-Cbo-ornithin mit nachfolgender katalytischen Hydrierung des Kupp- lungsproduktes gewonnen.

Einzelheiten der Synthesen gehen aus dem Reaktionsschema auf S. 233 hervor.

BESCHREIBUNG D E R VERSUCHE Die Schmelzpunkte sind unkorrigiert. - Samtliche Peptide wurden papierchromatographisch

auf sterische Reinheit gepriift. Papier: SCHLEICHER & SCHULL Nr. 2043 b; Laufmittel B/E/W = Butanol-(2)/Eisessig/Wasser (4:l: 5), B/N = Butanol-(2)/3-proz. Ammoniak (3 : l) , Ph/W =

Phenol/Wasser (5 : 1); Indikator: 100 mg Ninhydrin in 60 ccm Aceton + 0.4 ccm Eisessig und 1.2 ccm Wasser. Das Vortiegen der OL- bzw. y-Glutamylpeptid-Bindung wurde durch Stick- stoffbestimrnung nach VAN SLYKE 10) nachgewiesen.

Derivate des Ornithins

N8-Cbo-L-ornithinbenzylester-hydrochlorid. - 7.28 g (0.03 Mol) N8-Cbo-L-ornithin11), 6.65 g (35 mMol) p-Toluolsulfonsaure, 25 ccm Benzylalkoholund 70 ccm Benzol werden 3 Stdn. unter RuckfluD destilliert (Wasserabscheider). Das abgekiihlte Gemisch wird mit absol. k h e r ver- setzt und zur vollstandigen Abscheidung des Benzylester-p-toluolsulfonats 12 Stdn. im Eis- schrank aufbewahrt (Ausbeute 14.7 g, 97 %). Das p-Toluolsulfonat wird bis zur Aufldsung rnit 200 ccm 2n Na2C03 und 150 ccm Ather geschuttelt, die atherische Losung iiber NazS04 ge-

8) A. R. BATTERSBY und J. C. ROBINSON, J. chem. SOC. [London] 1955,259. 9) H. ZAHN und W. PATZOLD, Chem. Ber. 96, 2566 (1963).

10) H. SACHS und E. BRAND, J. Amer. chem. SOC. 76,3601 (1954). 11) B. C. BARRASS und D. T. ELMORE, J. chem. SOC. [London] 1957,3134.

1964 AminodicarbonsaureDeptide. 111 235

trocknet, das Benzylester-hydrochlorid durch Einleiten von Chlorwasserstoff gefallt und aus Methanol/Ather umkristallisiert. Ausbeute 10.3 g (94%); Schmp. 161". [XI$' = 1-3.1" (c =

2.57, Methanol).

CzoHz4N204.HCI (392.9) Ber. C 61.29 H 6.42 N 7.13 Gef. C 61.42 H 6.62 N 7.40

Freier Benzylester: 9.3 g (24 mMol) Nd-Cbo-L-ornithinbenzylester-hydrochlorid werden in 50 ccm Chloroform I 20 ccm absol. Methanol gelost und rnit 3.6 ccm (25 mMol) Triuthyl- amin versetzt. Unter Ruhren wird absol. Ather (200 ccm) zugefugt und die Mischung einige Stunden im Eisschrank aufbewahrt. Nach dem Abfiltrieren von Triathylammoniumchlorid wird i. Vak. eingedampft und das hellgelbe 01 direkt zur Peptidsynthese verwendet. Ausbeute 8.45 g (quantitativ).

L-Ornithin-kupfer(II) 12) (IV). - In die siedende Losung von 8.5 g (50 mMol) L-Ornithin- hydrochlorid in 50 ccm Wasser werden innerhalb von I5 Min. 6.5 g (65 mMol) fein gepulvertes basisches KupferlIIl-carbonat eingetragen. Vom iiberschiissigen CuCO3 wird abfiltriert und das Filtrat direkt fur die Peptidsynthesen verwendet.

Glutamyl-ornithin-dipeptide N-Cbo-y-L-glutamyl(a-benzylester)-R-L-ornithin-kupfer(II) (V). - a) 9.5 g (25 mMol)

N-Cbo-L-glutaminsuure-a-benzylester 13) ( I ) werden in 100 ccm absol. Tetrahydrofuran bei -- 10" rnit 3.5 ccm (25 mMol) Triathylamin versetzt und mit 2.4 ccm (25 mMol) Chlorameisen- suirreuthylester zum gemischten Anhydrid kondensiert. Nach 30 Min. laRt man bei - 10" in- nerhalb 1 Stde. unter kraftigem Riihren gleichzeitig 8.4 ccm (0.06 Mol) Triathylamin in 40 ccm Tetrahydrofuran und eine wal3rige Losung von 0.05 Mol I V (aus 8.5 g r-Ornithin-hydrochlorid) zutropfen. Nach weiteren 2 Stdn. wird in 1 I Eiswasser gegossen. Ausbeute 10.25 g (78 %) hell- blauer Niederschlag; nach Umkristallisieren aus waBrigem Athanol Schmp. 202" (Zers.. Sin- tern a b 180'). b) In die Losung von 4.92 g (0.01 Mol) N-Cbo-r-gluraminsaure-a-benzylester-y-[p-nitro-

phenylester] 13) in 150 ccm absol. Tetrahydrofuran werden innerhalb 1 Stde. unter Riihren gleichzeitig 2.1 ccm ( 1 5 mMol) Triuthylamin in 30ccm Tetrahydrofuran und 15 mMol IV (aus 2.55 g r-Ornithin-hydrochlorid) getropft. Das entstehende blaue Gemisch wird 1 Tag bei Raumtemperatur geriihrt, wobei sich die Lasung allmahlich tief &run farbt. Die lsolierung des Kupferkomplexes erfolgt wie unter a) beschrieben. Der zunachst graugriin anfallende Nieder- schlag wird bis zur Hellblaufarbung mit Essigester behandelt. Ausbeute 3.0 g (58 %); Schmp. 210" (Zers.; ab 160" Verfarbung, ab 180" Sinterung).

N-Cbo-y-L-~luramyl(a-benzylesler)-6-L-ornithin (VII I) . - a) Durch Zerserzung des Kupfer- komplexes: 5.2 g voranstehender Peptid-Kupferkomplex werden in 50 ccm Wasser + 10 ccm Eisessigsuspendiert und unter kraftigem Riihren bis zur Entfarbung rnit 10-proz. KCN-Losung versetzt. Danach wird noch 1 Stde. weitergeriihrt und mehrere Stunden im Eisschrank aufbe- wahrt. Rohausbeute 4.8 g; feine Nadeln vom Schmp. 185- 187" (aus Wasser), [a]$* -= 1-5.5" (c = 1.0, Eisessig); RF = 0.98 (B/E/W), = 0.86 (B/N). CzsH31N307.1.5 H2O (512.6) Ber. C 58.58 H 6.69 N 8.19 Gef. C 58.50 H 6.87 N 8.21

12) A. NEURERGER und F. SANGER, Biochem. J . 37, 515 (1943). l3) G. LOSSE, H. JESCHKEIT und W. LANGENBECK, Chem. Ber. 96, 204 (1963).

236 G. Lost;., H. JESCHKEIT und H. ZASCHKF. Bd. 676

b) Durch direkte Pepridierung: Zu einer Losung von 1.7 g (0.01 Mol) L-Ornithin-hydro- chlorid in 100 ccm Athanol + 50 ccm Wasser werden I .4 ccm (0.01 Mol) Triuthylamin und 4.92 g (0.01 Mol) N-Cho-~.-glu~ominsaitre-a-benzyle.~ter-~-.rp-nitro-phen~~lester : 13) in 15 ccm Tetrahydrofuran gegeben. Der Ansatz wird 12 Stdn. bei Raumtemperatur stehcngelassen, i. Vak. auf das halbe Volumen eingeengt und mit einem UbcrschuB Ather versetzt. Das aus- fallendc VIIl wird aus Wasser umkristallisiert. Ausbcute 3.35 g (68%); Schmp. 184- 187". [a]&' = t 5 . 8 " ( c - I . Eisessig); RF - 0.97 (B/E/W), = 0.87 (B/N). -- Gef. C 58.77 H 6.83 N 8.08.

./-L-Glurumyl-h-L-ornithin. - I g YIfIwird in 80 ccm Eisessig mit der Suspension von 100 mg Pd-Mohr in 20 ccm Wasser vcrsetzt und 5 Stdn. hydriert. Die vom Katalysator befreite Losung wird i. Vak. eingedampft und der Ruckstand aus Wasser/Aceton umkristallisiert. Ausbeute 0.55 g (quantitativ); Schmp. 225" (Zers.), =. -t 11.5' (c = I , Wasser), [z]" +31.OC (c = I , In HCI); RF - 0.55 (B/E/W), = 0.10 (B/N) = 0.58 (Ph/W).

CloHluN3Os.l.S H2O (270.3) Ber. C44.44 H 7.46 N 15.54 N N H ~ 15.54 Gef. 44.60 7.41 15.52 15.3 I

N-Cbo-u-L-gluramyl(~-benzylester)-~-i.-ornirhin-kupfer(II) (VI). -- Analog V werden 7.5 g (0.02 Mol) N-Chu-L-glutaminsuure-y-henzylester 13) (11). 2.8 ccm (0.02 Mol) Triathylamin sowie 2. I ccm (0.02 Mol) Chlorameisensaureafh~lesrer zum gemischten Anhydrid umgesetzt und danach 8.4 ccm (0.06 Mol) Triuthylamin sowie die Losung von 0.04 Mol I V (aus 6.8 g L-Ornithin-hydrochlorid) zugegeben. Ausbeute 7.8 g (75 "4); Schmp. 178 - 179" (aus Kthanol/ Wasser).

N-Cbo-ci-L-glutamyII~-benzylester)-b-L-ornithin (IX). - a) Aus 5.2 g V I durch Behandeln mit KCN-Losung, wie bei Vll l unter a) beschrieben. Ausbeute 4.8 g (quantitativ); Schmp. 200--201". [z]h2 = --7.8" (c = I , Eisessig); RF = 0.95 (B/E/W), = 0.88 (B/N).

CzsH31N307 (485.5) Ber. C 61.85 H 6.43 N 8.66 Gef. C 61.94 H 6.64 N 8.95

b) Zu einer Losung von 0.85 g (5 mMol) 1.-Ornithin-hydrochlorid in 30 ccm Wasser -1 - 100 ccm Athanol wcrden 0.7 ccm (5 mMol) Triathylamin und 2.4 g (5 mMol) N-Cbo-L-glutamin- suure-y-henzylestcr-a-!'p-nitro-phenylester / 13) in 15 ccm Tetrahydrofuran gegeben. Der An- satz wird 12 Stdn. steHengeIassen, das Losungsmittel i. Vak. abgedampft, dcr Ruckstand in wenig Athanol aufgenommen, IX durch Zusatz von Ather gefiillt und aus Wasser umkristalli- siert. Ausbeute 1 . 1 g (48%); Schmp. 197-201", [ilk5 --2" (c = I , Eisessig); RF = 0.96

CzsH31N307.0.5HzO (494.5) Ber. C 60.72 H 6.52 N 8.49 Gef. C 60.56 H 6.47 N 8.47

n-c.-Glufam~I-S-L-ornithin. -. 0.32 g IX werden in 100 ccm Methanol t 30 ccm Wasser suspendiert und bei Gegenwart von Pd-Mohr hydriert. Nach ca. 2 Stdn. tritt vollstlndige Lo- sung ein, nach weiteren 2 Stdn. wird das Filtrat i. Vak. eingedampft und der Ruckstand aus Wasscr/Aceton umgefallt. Das zunlchst olig anfallende Dipeptid erstarrt beim Verreiben mit Ather zu einer hygroskopischen Masse, die sich beim Erhitzen zersetzt. Ausbeute 170 mg (quantitativ); [a]k5 - - . -23.6"(c = 0.448, 1 n HCI); RF :- 0.71 (B/E/W), --: 0.03 (B/N).

(B/E/W), = 0.88 (B/N).

C I ~ H I ~ N ~ O ~ . I . S H ~ O (288.3) Ber. C41.62 H 7.69 N 14.57 " ~ ~ 9 . 7 3 Gcf. 41.56 7.83 14.20 9.52

I964 Aminodicarbonsaurepeptide, 111 237

N-Cbo-~-r.-gluram~(ci-benzylester)-ci-~N6-cbo)-r.-ornithinbenzylester (VII). - - a) 3.7 I g (0.01 Mol) N-Cbo-~-gluramitisuure-a-benz.~lester ( I ) und 3.56 g (0.01 Mol) I I I werden in einem Gcmisch von 100ccm Acetonitril und 50ccm absol. Tetrahydrofuran bei -10" mit 2.3 g (0.01 Mol) Dic~clohexylcarbodiimid in 20 ccm Tetrahydrofuran versetzt und 2 Stdn. bei - 1 0 sowie I2 Stdn. bei Raumtemperatur stehengelassen. Vom ausgeschiedenen Cyclohcxylharn- stoff wird abgesaugt und das Filtrat i. Vak. eingedampft. Der Riickstand wird in Essigester aufgenommen, init 2n Na2CO3, I n HCI und Wasser gewaschen, uber Na2S04 getrocknet und mit Petrolather gefillt. Ausbcute 4.6 g (65%); Schmp. 130 131" (aus Athanol oder Essig- ester), [a]&' = -- 15.5" ( c = I , Aceton).

b) 3.56 g (0.01 Mol) N6-Cbo-r-ornirhinbenzylester und 4.92 g (0.01 Mol) N-Cbo-L-glutamin- saure-a-henzylester-'/-,'p-nitro-phetiylester j 13) werden in 100 ccm Acetonitril und 50 ccm ab- sol. Tetrahydrofuran 12 Stdn. bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird wie unter a) aufgearbeitet. Ausbeutc 4.9 g (69%); Schmp. 131 - 132", [2]h4 7 . 15.6" (c = I . Aceton).

C4oH43N309 (709.8) Ber. C 67.70 H 6.10 N 5.92 Gef. C 67.64 H 6.22 N 5.94

y-r.-Gliirumyl-a-L-ornirhiti. - 1.5 g VII werden in 100 ccm Eisessig mit 200 mg Pd-Mohr 5 Stdn. hydrierr. Das zunlchst elig anfallende Dipeptid kristallisiert nach einigen Tagen. Aus- beute 0.59 g (quantitativ); Schmp. 209', [a]&' . t 5 . 2 " (c - I , 1 n HCI); RF = 0.58 (B/E/W), -- 0.10 (B/N), = 0.36 (Ph/W).

CloHlyN305.1.5HzO (288.3) Ber. C41.62 H 7.69 N 14.57 N N H ~ 14.57 Gef. 41.85 7.89 14.36 14.05

N-Cbo-a-~.-glrr~amylf~-benzylester)-u- (N6-cbo)-L-ornithinbenzylester (X). -- Analog VII aus 0.0 I Mol I I und 4.92 g (0.01 Mol) N-Cbo-r.-glrrtaminsaure-~/-benzylester-a-[p-nitro- pheny/ester.'I3). Ausbeute 6.6 g (93 %); Schmp. 113" (aus Athanol), [2]&' = --9.6" (c =. I , Eis- ess ig).

C ~ O H ~ J N ~ O ~ (709.8) Bcr. C 67.70 H 6.10 N 5.92 Gef. C 67.63 H 6.02 N 6.28

u-r.-Glutnmyl-u-~-ur~rirhiti. - . I g X wird in I 0 0 ccm Eisessig mit 200 mg Pd-Mohr 5 Stdn. hydriert. Ausbeute 0.39 g (quantitativ); Schmp. 202- 204" (Zers.), [a]&' = + 14.8 (c = I . I n HCI); RF = 0.54 (B/E/W), : 0.08 (B/N) = 0.32 (Ph/W).

C I O H I C , N ~ O ~ . I . ~ H Z O (288.3) Ber. C41.62 H 7.69 N 14.57 NNH* 9.73 Gef. 41.62 7.61 14.28 9.65

N-Cbo-u.~-r-glutumyl-bis-(N6-cbo)-r-ornithinhenzylesrer. - 3.56 g ( I 0 mMol) N-Cbo-1.- ortiithinbenzylesrer und 2.6 g (5 m Mol) N-Cbo-r-gluruminsaure-di-.~p-nitro-phenylesrerJ 9 ) wer- den in 50 ccm absol. Tetrahydrofuran 12 Stdn. bei Raumtcmperatur stehengelasesn. Danach wird i. Vak. eingeengt und der Ruckstand aus Essigester, dann aus Athanol umkristallisiert. Ausbeute 3.4 g (70%); Schmp. 182- 183", [a]" :

C53H59N5012 (958.1) Ber. C 66.14 H 6.20 N 7.31 Gef. C 66.26 H 6.39 N 7.86 -9.5" ( c : 1.0, Eiscssig).

a.y-r.-Gluramyl-bis-u-r.-ornitliin. - 1 g voranstehender Tripepridester wird in 100 ccm Eis- essig bei Gegenwart von 300 mg Pd-Mohr 6 Stdn. hydriert. Nach der Aufarbeitung wird das hygroskopische Tripeptid bei 80" uber P2O5 getrocknet. Ausbeute 0.33 g (69 %); Schmp. 185 - 202' (Zers.); RF = 0.02 (B/N).

C I ~ H ~ ~ N ~ O ~ , . ~ H Z O (411.4) Bcr. C43.79 H 8.07 N 17.02 Gef. C43.65 H 8.08 N 16.68