400 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 8133

t J B E R D E N A U F B A U D E R W A S S E R L C ) S L I C H E N N U C L E O T I D E U N D

P E P T I D E I N B g . C K E R H E F E U N T E R N O R M A L - U N D M A N G E L B E -

D I N G U N G E N

H. J. BOGEN UND EVA NEUBER Botanisches Institut der Technischen Hochschule, Braunschweig (Westdeutschland)

(Eingegangen am 26. Februar, 1962)

SUMMARY

Synthesis o/water-soluble yeast nucleotides and peptides under normal and lack condi- tions.

Yeast nucleotides and peptides, extracted by hot water, were studied during culture in complete Schopfer medium and under short-time lack of phosphate and nitrogen, respectively. In the synthesis of both nucleotides and peptides a remarkable paral- lelity could be established which maintained even under lack conditions. Neither starvation of nitrogen nor of phosphate caused a decrease of nucleotides and peptides. The changes of nucleotides and peptides are compared with those of the other N-con- taining fractions, their role in cell metabolism is discussed.

EINLEITUNG

ES ist verschiedentlich fiber das Vorkommen yon alkohol- und s/~urel6slichen Peptiden und Nucleotid-Peptid-Verbindungen in der Hefe berichtet worden 1-1°. Wit ex- trahierten B~ckerhefe mit heissem Wasser und fanden in dem Extrakt Nucleotide und Peptide, die sich gemeinsam mit Uranylacetat ausf~llen liessen n. Stickstoff- bestimmungen in dieser Ffillung nach mehrstfindiger Kultur in N~hrl6sung nach Schopfer hat ten einen relativ schnelleren und wesentlich st~rkeren Aufbau gezeigt, als er bei den in heissem Wasser unl6slichen Nucleins~uren und Proteinen zu beobach- ten war, (Abb. z). Der Gedanke lag damit nahe, es k6nne sich hier um einen Speiche- rungsvorgang handeln, ~hnlich wie im Pool der freien Aminos~uren, und es schien von Interesse zu erfahren, ob die Zunahme lediglich durch eine Vermehrung des Peptidanteils der F~llung hervorgerufen wird, oder ob und in welchem Ausmass auch Nucleotidmaterial daran beteiligt ist. Ferner sollte untersucht werden, ob unter Mangelbedingungen ein Abbau von Nucleotiden und Peptiden im Sinne einer Pool- Entleerung zu beobachten ist.

METHODIK

Die Here wurde nach der von KLEINKAUF 11 angegebenen Methode mit heissem Was- ser extrahiert. Aus dem Ext rak t wurden Nucleotide und Peptide gemeinsam mit 8% Uranylacetat-L6sung gef~llt (Nucleotid-Peptid-Fraktion). Das l~berstehende ent-

Abktirzung: FAS, frei-Aminosi~uren.

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WASSERLOSLICHE NUCLEOTIDE UND PEPTIDE IN HEFE 401

(%)

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10

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A.bb. I. Aufbau stickstoffhalt iger Verbindungen bei Kul tu r der Hefe in Schopfer-L6sung. F&S: freie Aminos~iuren; NTP: wasserl6sliche Nucleotide und Peptide; E: wasserunl6sliches Eiweiss; NS: wasserunl6sliche Nucleins~uren. Abszisse: Kul tu rdauer in Stunden; Ordinate: Stickstoffge-

hal t in Prozent der Werte zu Versuchsbeginn; diese wurden gleich lOO% gesetzt.

hielt in der Hauptsache den pool der freien Aminos~iuren (FAS-Fraktion). Aus dem Rtickstand des Heisswasser-Auszuges wurden die in heissem Wasser unl6slichen Nucleins~iuren mit 20 ~o Kochsalzl6sung bei 9 °0 extrahiert (NS-Fraktion). Der Rtickstand des Kochsalzauszuges stellt die Eiweissfraktion (E-Fraktion) dar.

Die Stickstoffbestimmungen wurden nach Kjeldah] durchgefiihrt, die wasser- 16slichen Nucleotide wurden ausserdem nach MILITZER 12, die Peptide nach LOWRY et a l . 13 bestimmt.

Die Kultur der Hefe erfolgte in N/ihrl6sung nach Schopfer. Fiir Kultur unter Mangelbedingungen wurde die N~ihrl6sung ohne Asparagin bzw. ohne Phosphat an- gesetzt.

VERSUCHSERGEBNISSE

Die Hefe wurde zun~ichst in vollst~indiger N~hrl6sung kultiviert. Bevor sie in die Nahrl6sung eingebracht wurde, sowie nach I, 2 und 3 Stunden Kulturdauer wurden Proben zur Bestimmung des Nucleotid- und Peptid-Gehaltes entnommen. Es zeigte sich, dass sowohl Peptide als auch Nucleotide aufgebaut wurden und class die relative Zunahme beider Gruppen yon Verbindungen, bezogen auf die Werte bei Versuchs- beginn, auffallend parallel verl~iuft (Abb. 2). Diese Parallelit~it konnten wir auch dann beobachten, wenn das Asparagin der Schopfer-L6sung dutch eine andere Sfickstoff- quelle, z.B. Glycin, Ammoniumsulfat oder ein Gemisch yon zwanzig verschiedenen Aminos~iuren, ersetzt wurde (Tabelle I).

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%

8o / . 70

NT $o

5o

~o

3 0

2O

Io

tO0 ~ ) l 2 3 Std.

Abb. 2. Zunahme des NT- und P-Oehaltes w/ihrend der Kultur in vollst~ndiger Schopfer-L6sung. NT: Nucleotide; P: Peptide. Abszisse: Kulturdauer in Stunden; Ordinate: Zunahme in Prozent des Anfangsgehaltes vor dem Einbringen der Hefe in die N/~hrl6sung; dieser wurde gleich ioo % gesetzt.

TABELLE I

P R O Z E N T U A L E Z U N A H M E D E R N U C L E O T I D E U N D P E P T I D E B E I V E R W E N D U N G V E R S C H I E D E N E R

S T I C K S T O F F Q U E L L E N IN D E R N A H R L O S U N G

Versuchsdauer: 2 Stunden.

N-Quelle Zunakme (%) Nucleotide Peplide

24 21 44 55

A sparagin 39 38 44 5 ° 69 60

Glycin 67 69 54 68

Aminos~ure- 56 57 Gemisch 32 4 °

Ammoniumsulfat 46 55

Diese Ta t sache liess ve rmuten , dass hier eine echte Kor re la t ion zwischen Nu- c leot iden und Pep t iden bes teh t und n icht nur eine rein zufallsm/issige ~ b e r e i n s t i m - mung einiger phys ika l i scher und chemischer Eigenschaf ten , n~imlich dass beide in heissem Wasse r 16slich und mi t Urany lace t a t l6 sung ausf~l lbar sind.

Wi r wol l ten nun feststellen, ob Pep t id - und Nucleo t id -Synthese notwendiger - weise mi t e inande r gekoppel t s ind und haben daher die Here bei Phospha tmange l ku l t iv ie r t , um die Nuc leo t id -Synthese zu hemmen. Es t r a t eine lag-phase von I bis 2 S tunden im Aufbau n icht nur der Nucleo t ide sondern auch der Pep t ide auf. Da- nach n a h m e n beide wieder gleichm~tssig zu (Abb. 3). Eiweiss- und Nucleins/ iure-Syn- these verl iefen un te r diesen Bedingungen fiber 3 S tunden normal , jedoch bl ieb die s t a rke Aufffi l lung des FAS-poo ls aus. Nach 3 S tunden war der St icks toffgehal t der F A S - F r a k t i o n erst u m 20 bis 30 % angest iegen gegeniiber 15o bis 200 % in voll- stAndiger Schopfer-L6sung.

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WASSERLOSLICHE NUCLEOTIDE UND PEPTIDE IN HEFE 403

0 / P

I00~

t 2 3 > 5 td .

Abtl. 3. NT- und P -Geha l t bei Phosphatmangel. NT: Nucleotide; I~: Peptide. Abszisse: Ver- suchsdaue r in Stunden; Ordinate: Gehalt an NT und P in Prozent der Anfangswerte; diesc wurdcn

gleich zoo % gesetzt.

Wurde die Hefe nach 2-sttindiger Kultur in vollst~tndiger N~ihrl6sung unter Stickstoffmangel weiterkultiviert, dann sank der Stickstoffgehalt der FAS-Fraktion rasch ab. Nucleotide und Peptide hingegen wurden, ebenso wie Eiweiss und Nuclein- s~uren, weiterhin aufgebaut, bis der FAS-pool seinen Tiefpunkt (nach etwa 2 Stunden) erreicht hatte und nicht mehr welter entleert wurde (Abb. 4). Auch bei mehrstiindi- gem Stickstoffmangel war kein wesentlicher Abbau von Nucleotiden oder Peptiden zu beobachten.

N (lJg) ' ~< ÷Asp > *: -Asp >

20 ~ £ tO

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9O 80

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N

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3 0

20 210

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Abb. 4- ~nderungen des •-Gehaltes der einzelnen Fraktionen bei N-Mangel im 2knschluss an 2- stiindige Kultur in vollst~ndiger NAhrl6sung. FAS: freie Aminos~uren; NTP: wasserl6sliche Nu- c leo t ide und Peptide; E: wasserunl6sliches Eiweiss; MS: wasserunl6sliche Nucleins~uren. Abszisse: Versuehsdauer in Stunden; Ordinate: N-Gehalt in Prozent der Werte vor Versuchsbeginn; diese

wurden gleich ioo % gesetzt. Die rechte Ordinate gilt ftir Eiweiss .

Frtihere Untersuchungen, bei denen der Schopfer-L6sung Acridinorange (1:1o 5) zugesetzt wurde, batten gezeigt, class in diesem Medium der Gehalt an Nucleotiden stark abnimmt. Nach 3-sttindiger Kulturdauer waren nut noch ,Spuren, in einem Fall iiberhaupt keine Nucleotide mehr nachweisbar. Der Peptid-Gehalt hingegen blieb

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konstant. Da der N-Gehalt der Nucleotid-Peptid-Fraktion gleichzeitig etwa auf die H~lfte absank, ist daraus zu entnehmen, dass Nucleotid-N und Peptid-N ursprfinglich ungef/ihr zu gleichen Teilen vorgelegen haben. Zu dem gleichen Ergebnis kommt man, wenn man den N-Gehalt der Nucleotide aus den Ribosebestimmungen errechnet und dabei annimmt, dass Purin- und Pyrimidinbasen annithernd im Verh~ltnis I : i vorliegen.

Eine qualitative und quantitative Analyse d e r m i t HC1 (6 N) hydrolysierten Peptide* erbrachte das Ergebnis, dass 17 Aminos/iuren in nachweisbaren Mengen vor- liegen und dass der Anteil der basischen Aminos~turen 18.8 % betr~gt (ohne Trypto- phan).

Unter Bezugnahme auf diese Daten ergibt sich, dass Nucleotide und Amino- s/iuren in einem molaren Verh~ltnis von rund I : 3 vorliegen, d.h. auf I Mononucleotid kommen im Durchschnitt 3 Aminos/iuren. lJber die Zahl der miteinander verbundenen Mononucleotide k6nnen vorerst noch keine Angaben gemacht werden.

DISKUSSION

Aus unseren Versuchsergebnissen geht deutlich hervor, dass eine enge Korrelation zwischen den wasserl6slichen Nucleotiden und Peptiden besteht. Ihre im Vergleich zu den unl6slichen NucleinsAuren und Proteinen auffallend schnelle Vermehrung l~isst vermuten, dass ihnen eine besondere Stellung innerhalb des Stoffwechselgeschehens der Zellen zukommt. W~hrend der absolute Stickstoffeinbau in die Nucleotid- Peptid-Fraktion nur etwa 20 % der Eiweissfraktion ausmacht und dem Einbau in die NucleinsAurefraktion entspricht, erreicht die relative Zunahme den doppelten bis vierfachen Weft.

Die Annahme, es k6nnte sich hier um einen Speicherungsvorgang handeln, hat sich bisher nicht best~tigen lassen, da wir unter unseren Versuchsbedingungen nie einen Abbau von Nucleotiden oder Peptiden im Sinne einer pool-Entleerung beobach- ten konnten.

HARRIS UND NEAL 14 beschreiben zwar einen steilen Abfall im Gehalt an Nucleo- t id-Peptiden in Bierhefe, aber sie beziehen ihre Werte jeweils auf I mg Hefe, w~hrend wir unseren Berechnungen den Nucleotid- und Peptid-Gehalt zu Versuchsbeginn zugrundelegen. Die gleichen Autoren fanden bei Gabe von [14C]Arginin und gleich- zeitiger Hemmung der Proteinsynthese durch Hydroxylamin eine Akkumulation yon E14C]Arginin in den Nucleotid-Peptiden. Hierin k6nnte ein Hinweis darauf gesehen werden, dass die Nucleotid-Peptide Zwischenstufen der Proteine darstellen. Bei Wiederaufnahme tier Proteinsynthese beobachteten HARRIS UND NEAL eine Zunahme der Radioaktivit~it in den Proteinen, die der Abnahme im FAS-pool entsprach. Die RadioaktivitAt der Nucleotid-Peptide blieb konstant, woraus auf ein rasches turn- over der Nucleotid-Peptide geschlossen wurde. Das llisst aber die Frage often, warum nach Entleerung des FAS-pools also bei fehlendem Nachschub an Aminos~uren, nicht auch ein Absinken der Nucleotid-Peptide einsetzt. Weitere Versuche sollen zur Kl~irung dieser Frage beitragen.

"Der Forschungsanstalt fiir Landwirtschaft in ]3raunschweig-V61kenrode, insbesondere Herrn Dr. BREYHAN, der diese Untersuchungen im Beckman Amino Acid Analyzer durchgeffihrt hat. sei auch an dieser Steile herzlich gedankt.

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ZUSAMMENFASSUNG

Die mit heissem Wasser aus Hefe extrahierbaren Nucleotide und Peptide wurden auf ihr Verhalten w~hrend der Kultur in vollstandiger Schopfer-L6sung sowie bei kurzfristigem Phosphat- und Stickstoffmangel untersucht. Es zeigte sich eine auffal- lende Parallelit~it zwischen dem Aufbau von Nucleotiden und Peptiden, die auch durch die Mangelbedingungen nicht gest6rt wird. Weder bei Stickstoff- noch bei Phosphat- mangel war eine Abnahme von Nucleotiden oder Peptiden zu beobachten. Die Ver- Anderungen der Nucleotide und Peptide werden mit denen der tibrigen N-haltigen Fraktionen verglichen, ihre Stellung innerhalb des Zellstoffwechsels wird diskutiert.

DANK

Wir danken ffir die Untersttitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

L I T E R A T U R

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V. V. KONINGSBERGER, CH. O. VAN DER GRINTEN UND J. T. G. OVERBEEK, Proc. Kon. Ned. Akad. Wet., 60 (1957) 144,

9 R. MONIER, M. L. STEPHENSON UND P. C. ZAMECNIK, Biochim. Biophys. Acta, 43 (196o) I. 10 A. GCHNURS UND V. V. KONINGSBERGER, Biochim. Biophys. Acta, 44 (196o) 167. 11 H. KLEINKAUF, Z. Bot., 48 (1"96o) 258. 12 N. MILITZER, in PAECH-TRACEY, Moderne Methoden der P/lanzenanalyse, Vol. IV, 1955, S 291. 13 O. LOWRY, N. ROSEBROUGH, A. FARR UND P. RANDALL, J. Biol. Chem., 193 (1951) 265. 14 G. HARRIS UND G. E. NEAL, Biochim. Biophys. Acta, 47 (1961) 122.

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