Jg . 40, Heft 10 KLAIJS LOt~ENTZ : l)ber d e n E i n f l u g d e r Den~turierung a u f d a s Etektrophoresediagramm 527 15. Nai 1962

Diese Herabsetzung kSnnte mehrere Grfinde haben. Sic mug z .B . dadureh entstehen, dab die alimen- t~ire Lip/imie bei geringem Angebot yon Nahrungs fett nut sehwaeh ist, so dab wenig Leukoeyten ftir eine Lipophagoeytose ben6tigt werden. AuBerdem wird bei vermindertem Nahrungsangebot nut wenig Depotiet t fixiert werden. Oder die Depots kSnnen erschSpft sein. Vielleieht ist aueh die Lipolyse selbst bei verst/ irktem Fet tansatz in der Genesung vermin- deft, wem~ der Hungerstoffwechsel fiberwtmden ist. PC'erden Ern/ihrung und Stoffweehsel wieder normati- siert, so wird ein physiologisches Gleiehgewieht ein- treten, bei dem sich Abbau und Aufbau yon Depot- Fet t und damit aueh der leukocyt/~re Ab- und An- t ransport die Waage halten.

Wahrseheinlieh wirken andere Mechanismen mit. t I ier sei erinnert an die Funktion der I~ber , die wesent- liehe Bedeutung ftir den Fettstoffweehsel hat. Aueh bei konstant bleibendera Fet tbes tand des KSrpers wird stets Fe t t aus den Depots mobil~iert und anf dem Blutweg zur Leber gebraeht. So geschieht es aueh, wenn Fet t dureh Hunger oder krankhafte Ur- saehen mobilisiert wird. Beim Hungern entsteht eine vor/ibergehende Fettleber. Anscheinend kann das Depotfett nur in der Leber abgebant werden. Ande- rerseits wird das neu in der Leber synthetisierte Fet t auf dem Blutweg zu den Depots transportiert .

T~F~I~O~ u. Mitarb. haben bei Kwashiorkor, zu dem ja eine hoehgradige Leberverfet tung geh6rt, don LipidgehMt der Leber bioptisch untersucht und zu- gleieh den Lipidgehalt der Leukoeyten im ]31utaus- strich dutch Fgrbnng mi t Sudanschwarz ]3 gepr/ift. Sie deuten ihre Beobaehtungen dahin, dab die Granulo- cyten Ms Vehikel solehe Lipide transportieren, die yon der Leber wghrend der Heilung des Kwashiorkor freigelassen werden.

Zahlreiehe klinische Fragen erhalten eine neue Beleuehtung, wenn die t~olle der Leukocy~en beim Fet t t ranspor t und beim Austauseh der Fet te z~dschen Blur und Geweben zur Disknssion steht.

Zusammen/assunff. I. Die Zahlen der mit Sudan- Schwarz ]3 gef~rbten Leukoeyten des Blares warden bei gesunden Kindern und solchen in extremen Stoff- wechselsituationen best immt. Dabeiwurden die Leuko- eyten naeh dem Grad der Sudanophilie in ftinf Gruppen eingeteflt.

2. I m Coma diabeticum (ohne entziindliehe Kom- plikationen) ist die Zahl der mit viel Lipid versehenen Leukocyten s~ark vermehrt . ZugMch besteht eine relative Anreieherung derjenigen Leukoeyten, die sehr

viel Lipide enthMten auf Kosten der lipid/~rmeren. Ein Zusammenhang mit der diabetisehen Transport- t Iyperl ipgmie ist naheliegend.

3. ]~ei S/~uglingen, die wegen einer aliment/~ren Dyspepsie ausgiebig digtetiseh behandelt werden, n immt wghrend des dosierten Hungers die Zahl der viel Lipid enthaltenden Leukoeyten signifikant ab. Dieser Schwund lipidreieher GranuIocyten dauert fund 8 Tage.

4. Sechs S~uglinge mi t sehwerer tIungerdystrophie, die frei yon Entz/indungen und Infekten waren, zeigten im Blur eine noeh st/~rkere Verminderung der viel Lipid enthaltenden Zellen. Naeh 26 tggiger Be- obaehtnng war noch keine Normalisierung eingetreten.

5. Der Wirkungsmechanismus dieser Vergnderun- gen wlrd er6rtert. Die vorliegenden Beobachtungen werden in Verbindung gebracht zu den Versuchen yon IzaK u. ])]~ Vm~s, die den Leukocyten eine wiehtige Rolle beim Fet t t ranspor t im Blur und beim Av~stauseh der Fetge zwischen Blur und Gewebe zuschreiben.

Den technischen Assistentinnen Frau Se~V~AOH~ und Fr/tuleia PO~LI~ danke ich Iiir ihre Mitarbeit.

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~ber den Einflul~ der Denaturierung auf das Elektrophoresediagramm Von

N_~AVS LO~E~TZ Aus der II. !Kedizinischen Klinik und ]~oliklinik tier :Freien lJniversitlit :Berlin (Direktor: n2rof. Dr. G. SCttI~TTLElt)

W~hrend die Bedeutung der Proteindichte and -menge bei der Anf/~rbung yon Eiweil~ im Phero- g ramm hinl~nglich untersucht worden ist, sind /~hn- liche Beobachtungen fiber Denaturierungseffekte sel- ten 5. So fund HSLzs~ s bei kritischer Pr/ifung der PAS-Methode zttr GIykoproteidf/~rbung, dab naeh der /ibhchen I4itzedenaturierung yon 30 rain bei I10°C noeh Eiweil3 bei der F/irbung aus dem Tr/~ger in L6sung geht.

Diese Beobachtung and die seit 1/~ngerem bekannte Tatsache, dab zwischen der Anf~rbung yon nat ivem und denaturiertem Eiweig dentliche Differenzen be- stehen, veranlaBten die folgende Untersuchung.

Material and Methoden

1 ml einer 0,1%igen LSsung yon HumanMbumin bzw. ~- Globulin veto I~ind (beides ,,reinst", Behringwerke Marburg) in physiologischer I~ochsMzlSsung wurden mit 10 ml eines

528 XLAVS Lom~N~rz: (Jber den EinfluB der Denaturierung auf das Elektrophoresediagramm Xlinische Woehenselffift

Citronensi~ure-Phosphatpnffers yon p~ 2,2 versetzt, die jeweils 10/~Mol Amidoschwarz, Chromotrop oder Neucocein ent- hielten. Nach 30 rain wurde der Eiweigniederschlag 15 min bei 3000U/rain zentrifugiert, mehrmals gewaschen, mit Natronlauge gelSst und dann an Hand einer Eiehkurve sein ~'arbstoffgehalt bestimmt ~. Dies gesehah bei nativem Eiweig und nach fortlaufender Denaturierung, die dureh Koehen der ProteinlSsungen unter st~ndigem Sehiitteln vor sieh ging. Letzteres ist zur Verhiitung groBer denaturierter Protein- partikel unbedingt notwendig.

Zur Messung der Amidosehwarzbindung yon EiweiB auf Filtrierpal0ier warden jeweils 0,04 ml einer 1%igen Albumin- sowie 7-Globulin-LSsung auf Elektrophoresel0apier (Maeherey & Nagel Nr. 214) naeh vorheriger Befeuehtung mit Elektro- phoresepuffer (10,8 g Veronalnatrinm auf i000 ml Aqua dest.) aufgetragen. Die Denaturierung der feuchten Streifen wurde bei einer Temperatur yon II0°C und untersehiedlieher Dauer vorgenommen.

Amidosehwarz diente ebenfalls zur F~rbung yon Phero- grammen eines normalen Mischserums yon 6,97 g-% Eiweig- gehalt. Die Auftrennung yon 0,01 ml Serum gesehah bei 7 V/era innerhalb 5 Std mit oben angegebenem Papier nnd Puffer. Gefarbt wurde 40 min mit einer Mischung yon 100 ml Eisessig, 400 ml Aqua dest. und 500 ml Methanol, die 1 g l~arbstoff enthielt. Zur Entf&rbung diente die gMehe LSsung ohne Farbstoff, wobei die Streifen unter mehrmaligem Weehset des BaBes 4 Std gewasehen wurden. Mit n/10 NaOH outer Zusatz yon 0,05 ml Serum auf 5 ml Natronlauge wurde eluiert und naeh 50 min die Extinktion am Photometer ,,Eppendorf" bei 578 m/~ gegen einen Leerwert (proteinfreies Papier) ab- getesen.

Ergebnisse

Wie zu erwar ten , n i m m t die Aufnahme yon F a r b - stoff dureh EiweiB m i t s te igendem Denatur ie rungs- g rad ab'. Dieser Abfa l l erfolgt i m wesent l ichen inner- ha tb de r e rs ten 40 rain u n d ve rsch ieb t das Verh/i l tnis yon Albumin zu y -Globu l in zuguns ten des ersteren.

Tabelle I. BindungskapazitSt von I mg Eiweifl bei verschiedener DenaJurierungsdauer gegeni~ber Amidoschwarz, Elution

rnit 100 mt n [10 NaOH, Able, sung bei 578 ml~

Nativ . . . . . . 10 min Koehen . . 20 min Kochen . . 40 min Kochen . . 60 min Koehen . .

7-Globulin

E

0,173 0,142 0,134 0,120 0,110

Albumin

~1~ol E ~Mol

1,14 0,256 1,69 1,0 0,232 1,53 0,95 0,226 1,49 0,86 0,215 1,42 0,79 0,208 1,37

Quotient ?- Globulin Albumin

1 : 1,43 1 : 1,53 1 : 1,57 1 : 1,67 1 : 1,73

Tabelle 2. Bindungslsapazitiit yon I m g Eiweifl bei verschiedener Denaturierungsdauer gegeniiber Chromotrop, Elution mit

25 ml n/10 NaOH, Abtesung bei 54.6 m#

y- Globulin

E

Nativ . . . . . . 1 0,194 10 Min Kochen . . ~ 0,178 20 Min Koehen . . 1 0,170 40 min Koehen . . ~ 0,156 60 rain Kochen . . ~ 0,145

Albumin

~Mol E ~Mol

0,64 0,300 1,0 0,595 0,270 0,9 0,566 0,260 0,866 0,52 0,240 0,8 0,483 0,232 0,773

Quotient y-Glqbulin Albumin

1:1,56 1:1,505 !:1,515 1:1,52 1:1,62

Tabetle 3. Bindungskapazitiit yon I m g Eiweifi bei verschiedener Denaturierungsdauer ffegeniiber Neucoccin,

Elution mit 50 ml n/lO 2VaOH, Ablesung bei 486 m/~

~- Globulin Albumin Quotient y-Globulin

E t*~ol Albumin E ~1~Iol

Nativ . . . . . . 1 0,063 0,58 10 rain Koehen . • 1 0,052 t 0,48 20 rain Kochen . . ~ 0,042 f 0,385 40 min Koehen . . ~ 0,034 I 0,31 60 rain Kochen . . 10,03071 0,29

0,095 0,88 1:1,52 0,086 0,795 1:1,66 0,074 0,685 i : 1,78 0,066 0,61 1 : 1,96 0,058 0,54 i : 1,91

Auch anf F i l t e r p a p i e r laBt sich das genann te Ver- ha l t en nachweisen; die re la t ive Zunahme des Albumins t r i t t nach 60 rain Dena tu r i e rnngsdaue r deu t l i ch in Ersche inung und i s t d a n n im wesent l ichen abge- sehlossen. Aus 6 0 r a i n und l~nger dena tu r i e r t en Streifen geh t aueh be im Spfilen mi t w~grigen oder a lkohol isehen B/tdern ke in Eiweig mehr in LSsung.

Tabelle 4. Amidoschwarz-Au]nahrae yon 0,4 mg Eiweifi au] Filtrierpapier in Abhiingigkeit von der Denaturierungsdauer bei 1100C. Extinktion (E) gemessen bei 578 m# nach Elution mit

10 ml n/lO lgaOH. Mittelwerte yon sechs Bestimmungen

Denaturierungs- dauer

Albumin

0,58 0,55 0,62 0,66 0,64 0,64

15 rain 30 min 45 min 60 min

120 min 180 min

I y-Globulin

0,38 0,35 0,36 0,32 0,31 0,31

Quotient y-Globulin Albumin

1,53:1 1,57 : 1 1,8 : 1 2,07 : 1 2,07 : 1 2,07 : 1

Die untersehiedl iehe Dena tu r i e rungsdaue r des- selben mehrma l s aufge t renn ten Norma l se rums lieB ebenfal ls eine re la t ive Zunahme der A l b u m i n i r a k t i o n m i t s te igendem Dena tu r i e rungsg rad erkennen. Be- merkenswer t i s t h ier vor a l lem die re la t ive A b n a h m e der fl- Globuline.

Tabelle 5. Verd~nderung eines normalen Pherogramms mit ~teige~u~em JDenatu~'ierungsgrad

Albumin . . . el-Globuline ~ - Globuline fl-Globuline . . y-Globuline . .

Denaturierun

15min I 30rain I 45min

4,35 I 2,87 t 2,63 6,54 I 5,51 I 3,36 7,45 I S,9 I 6,3

17,56 I lS,12 118,2

~ 120 r a i n

71,9 0,I

2 ,98[ 1,54 5,72 I 4,42

16,8 I 22,1

Dislcussion

Bei der F/~llung gelSster P ro te ine s inkt die Bindung yon Farbs to f fen m i t zunehmender Dena tu r i e rung ab. Diese Verminde rung erfolgt be i y -Globu l in n n d Albumin kont inuier l ieh , w/~hrend auf dem Fi l t r i e r - pap~er die Fa rb s to f f au fnahme du tch A lbumin naeh 15 und 30 min Dena tu r i e rung Minima zeigt und ers t naeh fiber 45 rain wieder abf/il l t . Dieses VerhMten dfirf te d u t c h die LSsung na t i ven Albumins aus d e m Pap i e r bed ing t sein, da sich bei 30 min lung dena- tu r i e r t en Streifen noeh Eiweig in w/~griger Spfil- flfissigkeit nachweisen 1/~Bt. Dieser Ver lus t l e n t bei de r q u a n t i t a t i v e n F g l l a n g im sauren Milieu, da der gesamte Niedersehlag gemessen wird.

Abgesehen yon diesem anf£nglichen Albumin- ver lus t f/~llt bei be iden Verfahren f ibere ins t immend die Fa rb s to f f au fnahme von y-Globul in s tg rker als die yon Albumin ab, n n d der y -Globn l in -Albumin-Quo- t i en t der Fa rbs to f fb indung wi rd kleiner. D a na t ive Pro te ine st/~rkere Anf/~rbung als dena tu r i e r t e zeigen, dfirfte dieses Verha l t en auf der grSBeren Hi tzes tab i l i - t / i t des A lbumins (MG 69000) gegeni iber dem y-Glo- bul in (MG 156000) beruhen. Noeh deu t l i eher wi rd dieser Ef fek t im Pherogramm, wo die f l-Globulin- F r a k t i o n (MG 125000) m i t s te igender Dena tu r i e rung einen merkl ichen Sehwund zeigt. Die c~-Globulin- F r a k t i o n e n kTnnen wegen ihrer ger ingen Menge ~nd

5g. 40, ]teft 10 R. I~ICI-ITERICH und J. P. COLOS~BO : Ul~ramikromethoden im Klinischen Laboratorium. I I 529 15. Mai 1962

der dami t verbundenen erhShten Mel3fehler hier nieht bewerte t werden.

Von mehreren Untersuehern ~, ~, ~, sind far die untersehiedliehe Anf£rbung yon Albumin und y- Globu- lin Kor rek tur fak toren zwisehen 1,37 und 1,7 angegeben worden, die naeh dem oben ausgeffihrten auf unter- sehiedlieher Denatur ie rung beruhen kSnnten. P v 6 ~ : errechnet sugar einen Kor rek tu r fak to r yon 2,2 ffir ~-Globulin gegenfiber Albumin, er f/~rbt jedoch naeh Trocknung bei 110°C und 2 - - 3 min langem Kochen in absolutem Methanol, bei 800 C in essigsaurem Milieu. Es liegt auf der Hand, dab hierdureh eine viel weiter- gehende Denatur ierung erreieht wird als dureh ein F/~rbebad bei Zimmertempera tur . Abschliegend sei noeh darauf verwiesen, dug luf tgetroeknete Streifen gegeniiber heigluf t -denatur ier ten eine Abnahme der Albumin-Frakt ionen zeigen. Aueh dieser Albumin- sehwund dfirfte auf einer unvollst/~ndigen Denatu-

r ierung des hitze-stabilen Albumins und seiner sp~teren HerauslSsung im Fgrbebad beruhen.

Zusammen/assung. Mit fort laufender Denatur ie rung n immt die Anf~rbung yon y-Globulin starker als die des Albumins ab. Als Ursache dieses Effektes ist die grSBere Hitzestabilit / i t des Albumins anzusehen. Eine v611ige Denatur ierung des letzteren erfolgt erst naeh 60 min Erh i tzung der Pherogramme auf l l0°C, eine kfirzere Dauer gibt ebenso wie Luf t t roeknung der Streifen keine reproduzierbaren Ergebnisse. Der so best immte Kor rek tu r fak to r ffir ~- Globulin betr~gt 2,07.

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Ultramikromethoden im Klinischen Laboratorium II. Die Ilestimmung der Zuverliissigkeit yon Laboratoriums-Methoden

V o n

1%. t~C~TEnICI~ und J. P. COLO31BO

Aus dem 5'[edizinisch-Chemischen Institut (Direktor: Prof. Dr. N. AEBI)

Die Kenntn is der Zuverl/~ssigkeit der im Klini- sehen Labora to r ium durehgeffihrten Untersuehungen ha t eine k a u m zu unterseh~tzende praktiseh-medi- zinisehe Bedeutung. Mit der zunehmenden Verfeine- rung der Diagnost ik stfitzt sich der Arzt immer mehr auf die t~esultate der Labora tor iumsuntersuehungenL Dami t verschiebt sieh ein groger Tell der grztliehen Veran twor tung yore Arzt auf das Laborator iums- personal. Die Entseheidung, ob ein I~esultat patho- logiseh ist oder nicht, kann heute nur noch im Labo- ra tor ium getroffen werden. Sie stfitzt sieh einerseits auf eine genaue Kenntnis der Normalwerte - - auf deren Ermi t t lung wir in einer sp/~teren Arbeit zurfickkom- men werden - - und andererseits auf eine genaue Kenntnis der Zuverliissig~eit der einzelnen Methoden. Unte r der Kenntn is der Zuverl/issigkeit verstehen wir :

1. die periodische, etwa j~hrliehe Prfifung der Prgzision jeder einzelnen Teehnik und

2. die fortlaufende, t~gliche Kontrolle der Methode mit Hilfe eines Kontrollsystems (Kontro]lkarten).

Leider sind nur in wenigen Laborator iums- bfiehern 2-5 Angaben fiber die Prfifung der Zuverl/tssig- keit einer Methode enthalten, obschon aus der AnMy- tisehen Chemie seit Jahren mehrere Verfahren zur Pr/ i fung der Zuverl~ssigkeit bekann t sind und auch yon seiten Kliniseher Chemiker besondere Methoden zur Pr/izisionsmessung entwiekelt wurden. Die mei- sten dieser Vorseh]gge werden jedoch der besonderen Stellung des Klinisehen Labora tor iums nieht gereeht. Vor Mlem ber/ieksichtigen sie die beiden folgenden Voraussetzungen zu wenig:

1. Die Arbeitsbedingungen im klinischen Labomtorium sind in der Regel viel ungfinstiger als in analytischen L~bora- torien (Bestimmungen zu jeder Tages- und Nachtzeit; Aus- ffihrung der Arbeiten durch verschieden ausgebildete Labo- ran~innen; oft m~ngelha.fte und verMtete Ausrfistung mit Apparaten und Gergten).

2. Die beschriebenen Prfifmethoden nnd die statis~isehen Auswertungen der l~esultate sind so kompliziert, dag die Art- weisungen nieht genfigen, um einer Laborantin selbstgndig die Durchfiihrung einer Zuverlgssigkeitsprfifung zu ermSgli-

Klin . Wschr., 40. Jahrg.

und der Kinderklinik (Direktor: Prof. Dr. ]~. tlossI) der Uni~'ersit~t Bein

chen. Nun sollte aber gerade die ohne Unterstfitzung eines Klinischen Chemikers arbeitende Laborantin f~hig sein, ihre Methoden zu prfifen und fortlaufend zu kontrollieren.

Wir eraehten es daher als eine wiehtige Aufgabe, eine ein/ache Methode zur /ortlau/enden Prii /ung der Zuverliissiglceit yon Bestimmungsmethoden zu empfeh- len. Dieses Prfifverfahren soll theoret isehen und prakt isehen Anspr/iehen genfigen, andererseits aber auch yon einer Laboran t in selbst/~ndig durchgef/ ihrt und ausgewertet werden kSnnen. Sollte sieh das im iolgenden besehriebene Verfahren aueh in anderen Laborator ien bewghren, so kSnnten die angef/ihrten Prfifsysteme als Grundlage ffir eine in einer zweiten Phase zu erfolgenden Standardis ierung der Labora- tor iumsmethoden, / ihnl ieh den amerikanisehen ,,Stun- dard Methods in Clinical Chemis t ry" ~, dienen.

A. Die Zuverldissig~eitsprii/ung

Einleitung. Der Begriff der Zuverliissigkeit (,,per- formance" , ,,reliability") einer Methode ist sehwierig zu definieren, da er dureh eine Reihe yon Fak to ren bes t immt wird :

1. die Spezifitgt, 2. die l~iehtigkeit, 3. die Prgzision, 4. die Empfindliehkeit und 5. die praktische Bewiihrung fiber eine l~ngere Zeitdauer.

Je naeh dem praktiseh-medizinisehen Zweek, der diagnostisehen Bedeutung einer bes t immten Methode, muB den einzelnen Fak to ren ein untersehiedliehes Gewieht zugemessen werden.

Methoden mit hoher Spezi/it~it. Bereits erreicht bei der Be- stimmung der Glucose (enzymatisch mit Glucose-Oxydase), des Harnstoffes (enzymatisch mit Urease), der Harns~ure (enzymatisch mit Uricase). Spezifischere Methoden fordert der Kliniker ffir die Erfassung des Kreatinins, des Cholesterins, der Ke~okSrper und des e-Amino-Stickstoffes.

Methoden mit hoher Richtigkeit. Dieser Faktor ist besonders bei Itormon-Analysen yon Bedeutung, sowie bei der Erfas- sung yon 3/[etaboliten wie Lactat und Pyruvat, deren Non- zentration durch serumeigene Enzyme leicht vergndert wird.

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