Se~o~iinL~n u. M ~ u ~ : UV-Bestrahlung auf kgsereiteehnische Mikroorganismen. I I 183

sieh ansgesprochen ungfinstig aus. Wieweit derartige Zusatze zu Schmelzki~se enzy- matischen Umwandlungen zuganglich sind, bedarf weiterer Untersuehungen.

Zusammen/assung

Mit Hilfe der Decarboxylasenme~hoden wurden Glutaminsi iure-und Lysin- bilanzen in Sauermilchkiise normaler und anomaler Reifungsffihrung aufgestellt and die dureh Abbaumeehanismen verursachten Aminosiiureverluste festgelegt. In einer dritten Versuchsreihe wnrde gezeigt, dab zugesetzte Glutaminatmengen weitgehend ab- gebaut werden and gleichzeitig dureh Bildung yon y-Aminobuttersaure den Charakter des Kgses ungiinstig zu beeinflussen verm5gen. Aus den Ergebnissen ist zu folgern, dal~ neben der Deearboxylierung yon Glut~minsiiure and Lysin noch weitere Abbaume- chanismen in Betraeht zu ziehen sind und gleichzeitig mit Biosynthesen zu reehnen ist.

Uber den Einflufl der UV-Bestrahlung auf l~sereitechnisch wichtige Mikroorganismen

I I . Mitteilung

Die Dehydrasensysteme yon Penicillium camember t i , var. candidum und ihr Verhalten gegeniiber Ultraviolet ts t rahlen +

Von

J. SCnORMCnLEa und H. MAHLER

Mitteilung aus dem Institut ]i~r Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechnologie des Technischen Universitiit Berlin**. ***

Mit 1 Tex~abbildung

(Eingegangen am 13. t'ebruar 1959)

In einer vorhergehenden Arbeit 1 hat ten wir methodische Grundlagen und orientie- rende Versuche fiber die Endogen- und Glucoseatmung des Prizes Penicill ium camem- bertl, var. candidum und deren Abh~ngigkeit yon einer Ultraviolettbestrahlung gebraeht. Wir erw~hnten dort Befunde der Literatur, wonaeh geringe Dosen yon UV-Strahlen das Pilzwachstum und damit die Reifung yon K~se zu beschleunigen verm5gen. Da Waehstum und Fermentaktivi t~t yon Mikroorganismen direkt mit- einander gekoppelt sind, prfiften wir in den folgenden Untersuehungen, ob durch abgestufte Ultraviolettbestrahlung des genannten Pilzes vor der bekannten Enzym- inaktivierung dureh h5here Strahlungsdosen bei geringer Direktbestrahlung zunachst eine Fermenta/ctivierung zu beobaehten sei. Die Erscheinung, dal3 verschiedene Agentien in geringen Mengen ak~ivierend, bei hSheren Dosen jedoch letal auf Mikro- organismen wirken, ist bekannt; wir haben sie z. B. an quatern~tren Ammoniumbasen in ihrer Wirkung auf Penicill ium candidum studiert 2 ,YO:NETAI~II U. Mitarb. s berichten ~hnlieh fiber die Aktivierung der Cytoehromoxydase (lurch synthetisehe Netzmittel.

* Auszug aus der Promotionsarbeit l=I. MA~.~: Die Dehyd~asensysteme yon Penicfllium camemberti, var. candidum. Diss. Techn. Univ. Berlin: 1958. D 83.

** Die Untersuchungen wurden durch eine Beihilfe aus ERP-Mif~teln gefSrdert, woftir wir anch an dieser Steile verbindlich danken.

*** Herrn Prof. Dr. Dr. W. DIEMAm zum 60. Geburtstag freundlichst zugeeignet. Se~O~MiiLLE~, J., u. I-I. I-IvT~: Diese Z. 107, 153 (1958).

2 Se~O~i)LL~, J., u. W. A~D~XSS: Diese Z. 109, 154 (1959). 3 YONETANh T., S. TAKEMORI, I. SEKUZU n. K. OKUNU:KI: Nature (Lond.) 181, 1339 (1958).

184 J. ScHoRM~LLER und H. 1VL~HLER:

Als E n z y m s y s t e m w£hl ten wir das der Redoxasen (Dehydrasen) und als besonderen Reak t ionsweg den Citronensi~urecyclus als wichtiges Bindegl ied zwischen Kohlen- hydra t - , Eiweil3- u n d Fet ts toffwechsel . F i i r den bier un te r such ten Pi lz war auBerdem die Gfi l t igkei t dieses Cyclus b ishcr n ich t gekl£rt . Zun~chst soll te durch Zusa tz spezifischer Hemmstof fe eine Kl~ssif izierung vorhandener D e h y d r a s e n ermSgl icht werden. Anschliel~end wurde die W i r k u n g verschiedener Effectoren, insbesondere yon R e a k t i o n s p a r t n e r n des Ci t ronens~urecyclus un te r such t und schliel~lich wurde die W i r k u n g der U l t r a v i o l e t t s t r a h l e n auf D e h y d r a s e n des Penici l l ium camemberti i iber- prfift , soweit sie sich m i t t t i f fe der bier benu t z t en Verfahren, n£mlich der Te t razol ium- und der W a r b u r g - T e c h n i k erfassen l i ~ t . Wiewei t bei der s t imul ie renden W i r k u n g der UV-Bes t r ah lung die , P h o t o r e a k t i v i e r u n g " eine l~olle spiel t 1, beda r f wei terer Untersuchungen .

L Charakterisierung der Dehydrasensysteme

V e r s u c h s t e i i P ilzraaterial Als Versuchsmaterial diente auch hier das submers gezfichtete Myeel des PeniciIlium camem-

berti, das durch Zerkleinerung ohne wesentliehe Aktivit~tseinbul~e ausreichend homogen ftir Ver- suchszweeke geteflt werden kann. Einzelheiten sind der vorhergehenden Arbeit zu entnehmen 2. Zwei bis vier Tage alte Kulturen erwiesen sich ffir die Untersuchungen als besonders gfinstig. Ffir Versuche, bei denen das Mycelalter eine Rolle spielte, wurde der Pilz in einer Rfihrkultur bei 28 ° C gezfichtet, wobei der erforderliche Sauerstoff aus einer Bombe eingeleitet wurde. Bestimmung der Myceltrockensubstanz erfolgte durch Troeknen bei 105 ° C fiber 60 rain in einer G 3-Fritte. Kugelmycel wurde nicht untersueht. Zur Homogenisierung wurden die Myeelproben mit dem ,,Ultra-Turrax" (Janke & Kunkel, Staufen) fiber 15 sec behandelt.

Methoden a) Die Warburgtechnik (Luftsauerstoff als Aeeeptor) wurde in Gef~Ben durchgeffihrt, die 2 ml

der Pilzsuspension (in m/30 Phosphatpuffer p~ 7,6 nach SSRE~S~N) enthielten und deren Mittelteil mit 0,2 ml Kalilauge besehickt war. Bebrfitung bei 30 ° C, Messung des Druekabfalles alle 20 rain in mm Manometerfliissigkeitss~ule (Diehte 1,034).

b) Bei der Thunbergtechni~ wurden RShrchen naeh KEILIN 2 benutzt. Die RShrchen selbst waren mit 3 ml Pilzsuspension, deren Aufs&tze mit 1 ml Methylenblau-(MB-)lSsung (1:5000) be- sehiekt. Es wurde 3 rain an der Wasserstrahlpumpe entgast. ~aeh dem Evakuieren aller RShrchen wurden die ~eaktionsflfissigkeiten zusammengekippt und im Thermostaten bei 30°C his zur Entf~rbung bebriitet. Mehrmaliges Spfilen der R5hrehen mit Stickstoff vor dem Zusammenkippen blieb ohne Einflu[~ auf die Ergebnisse und wurde deshalb unterlassen.

c) Die Tetrazoliumtechnik (TTC-Technik) war gemeinsam mit Untersuchungen anderer Rich- tung ~ entwiekelt worden, sie ist in der zitierten Arbeit gesehildert. Zur Berechnung der Dehydrasen- wirkung dienten folgende Gr5l~en:

Qo~ = #1 O2 pro mg Trockensubstanz der Pilzsuspension und pro Std Berechnung nach der yon U~REIT 5 gegebenen Ableitung.

Q ~ ~ #1 O2 pro Std und pro mg Troekensubstanz bei 30 ° C. Ffir eine MB-LSsung 1:5000 ergibt sich (allerdings nicht ganz einwandfrei, da Aceeptorkonzentration und Entf~rbungszeit voneinander abh~ngen)

420 - ml MB-LSsung Q~B rain •mg Troekensubstanz

Ubersicht bei JAeGer, J. : Bact. l~ev. 22, 99 (1958). 2 Vgh S. 183, Anm. 1. 3 FI~ANXE, W. : In HOPt'I~]-SEYLEI~-TIIIERFELDEI~. I-Iandbuch der physiologisch- und patho-

logisehchemischen Analyse 10. Aufl. Bd. 2, Allgemeine Untersuchungsmethoden, zweiter Teil; S. 311. Berlin: Springer 1955.

SCHO~i~LLE~, J., u. W. A~DR£SS: Zit. S. 183, Anna. 2. 5 U~CIBREIT, W. W., R. H. BuRI~Is u. J. F. STAUFFER: Manometric Techniques and Related

Methods for the Study of Tissue Metabolism. Minneapolis: Burgess Publ. 1951.

Einflu$ der UV-Bestrahlung auf k~sereitechniseh wichtige Mikroorganismen. I I 185

Q~c = Aktivitgt wie oben angegeben. Fiir die in der friiher zitierten Arbeit genannten Arbeitsbedingungen ergibt sich bei 2 Std Bebriitungszeit

E Q~Tc = 3,59 • mg Trockensubstanz

E ~ Extinktion, gemessen bei Schiehtdicke 0,5 cm und Filter S 49 (ELKO II).

Um die Leistungsfi~higkeit der drei Verfahren zu kermzeiehnen, wurden sie gleichzeitig an denselben Pilzkulturen verschiedenen Alters erprobt. Fiir die Messung mit Hiffe der Tetrazolium- technik dienten 3 versehiedene Ans~tze:

c~) Die Reaktionsfliissigkeiten wurden ohne Evakuieren der l~6hrchen zusammengekippt (normaler Ansatz) ;

fl) die Reaktionspartner wurden nach vorhergehender Entgasung an der Wasserstrahlpumpe gemiseht (entgast) und

~) es wurde 2 rain entgast, mit Stickstoff gefiillt und erneut entgast. Nach zweimaliger Wiederholung wurde der Aufsatz in das l~Shrehen entleert (entgast + N~).

Ergebnisse

Tabelle 1. AbhSngigkeit der Atmungsquotienten vom Pilzalter und vonder Versuchstechnik

Pilzalter in Tagen

WARBLTRG: Qo~ in/xl

T]tUN]3EI~G: QMB in/~1 % yon Qo~ (WA~BV~G)

TTC: a) Q~vc normal in/A % yon Qo~ (WA~BU~G) % yon Q~, (Ta~BE~O)

b) entgast in #1 % yon Q®~c normal

e) entgast + N~ in #1 % von Q~c normal

11,3

1,15 10,2

0,061 0,54 5,3

10,8

0,90 8,3

0,053 0,49 5,9

9,3

0;71 7,6

0,046 0,50 6,5

7,2

0,45 6,2

0,031 0,43 6,9

I 8

5,7

0,43 7,6

0,018 0,32 4,2

10

3,3

0,51 15,4

0,024 0,73 4,7

0,032 133

0,031 129

Beim Vergleich der Ergebnisse f/illt der starke Unterschied in den Atmungs- quotienten Qo~, QMB und Q~c auf. Bezogen auf den Sauerstoffverbraueh naeh W~a~BVgG erfaBt die MB-1Vfethode etwa 1/10, die TTC-Technfl~ weniger als 1/100 der naeh WA~BV~G gemessenen Dehydrasenaktivit / i t . Ent fernung des 'Luftsauerstoffes durch Evakuieren steigert die Formazanbi ldung um etwa 30 %, zus/itzliche Spiilung mit Stiekstoff bleibt ohne EinfluB.

Wegen der wenig fibersichtliehen und schwer berechenbaren l%eaktionskinetik der Methylenblauentf/ irbung wurde die Thunberg-Methode in den folgenden Untersu- chungen nicht welter benutzt .

Die l%age, warum durch die Tetrazoliurntechnik nur ein Bruchteil der naeh WAgBUgG gemessenen Dehydrasenakt iv i tg t erfaBt wird, haben wit an anderer Stelle eingehend er6r~ert 1. Ihre Beantwor tung ist sehr komplexer Natur , wobei folgende Fak toren eine Rolle spielen: 1. konkurrierende, wenn auch nicht wesentliche Wirkung des Luftsauerstoffes (,,in general, however, i t seems tha t molecular oxygen does not have a profoundly disturbing effect on formazan product ion ''2) ; 2. nicht alle Flavin- fermente reagieren mit TTC und 3. Zellw/~nde bilden eine Permeabilit / i tsschranke f/ir

1 SO~OR~ffLLEI~, J., U. It. GERTI~: Diese Z. 106, 13 (1957). 2 ttvoo, W. B. : J. appl. Bact. 17, 31 (1954).

186 J. Sc~o~M~LL~R und H. MANLER:

das TTC-Molek/il. Wieweit noeh andere Einfliisse yon Bedeutung sind, mag dahin- gestellt bleiben.

1. Die Messung beein/lussende Falctoren In allen Versuehsmethoden zeigte sich, dab mit zunehmendem Alter der Pilzlcultur

die Dehydrasenaktiviti~t zuriiekgeht, bei sehr altem Mycel jed0eh Formazanbildung und MB-Reduktion ansteigen, offenbar ist -- wie Versuche yon DOUGLAS U. Mitarb. 1 best/itigen -- hier die Zellwandpermeabilit/it besonders groB geworden.

Die Homogenatlconzentration ist innerhalb welter Grenzen bei allen Methoden ohne EinfluB auf die Ergebnisse.

Fiir Warburg- und Tetrazoliumversuehe besteht zwischen O~-Verbrauch und Formazanbildung jeweils lineare Abhdngiglceit vonder Bebriitungszeit.

Die pH-Abhi~ngigkeit des Aimungs- quotienten, bezogen auf Qo. bzw. QTTC p. I ~,o 7,0 I ~,6 s,o 9,o

bei p~ 7,6 = 100, liegt fiir andere p~-Stu- Qo, i 125 127 100 84 70 fen folgendermaBen (Messungen an 3 ver- Q~c I 26 69 100 91 73 schiedenen Kulturen) :

Die verminderte Formazanbildung unterhalb p~ 7,6 beruht darauf, dab TTC im sauren Bereich nieht zu Formazan reduziert wird und dab diese Reaktion bereits im neutralen Gebiet anl/~uft 2.

Die Hemmwir]cung yon TTC wurde vielfaeh yon verschiedenen Autoren mit tells positivem, tells negativem Befund untersueht. Bei den hier benutzten Konzentrationen ist sie zu vernachlgssigen.

Zusammen/assend k6nnen die Warburg- und die Tetrazoliumteehnik im Rahmen der hier anstehenden Fragen folgendermaBen gekennzeiehnet werden.

a) Die Warburg-Techni]c gestattet es, den nat/ir]ichen Reaktionsablauf bis zum Ende der Atmungskette zu verfolgen. Sie zeigt eine maximale Fehlerbreite yon 5 %, so dag die sp/~ter besehriebenen Ergebnisse auf volle 5 % abgerundet werden. Die Homogenatkonzentration ist yon geringem Einflug.

b) Die Tetrazoliummethode stellt eine wertvolle Erggnzung manometriseher Messungen dar. Giftwirkungen bei normalen Konzentrationen an TTC sind nicht zu befiirchten, was u. a. daraus hervorgeht, dab Formazanbildung und Bebriitungs- dauer in linearer AbMngigkeit stehen. Die Methode liefert sehr gut fibereinstimmende Ergebnisse, erfagt jedoeh gleich der Thunberg-Teehnik dutch Unterbrechung der Atmungskette nut einen begrenzten Teil der Dehydrasen. F/it die folgenden Unter- suchungen yon besonderer Bedeutung ist der Umstand, dab normale Zellw/~nde fiir das Reagens nur begrenzte Durchl/issigkeit besitzen, w~hrend Permeabilit~ts~nde- rungen der Zellwandstruktur erhShte Formazanbildung nach sieh ziehen, da in diesem Fall das Reagens normalerweise blockierte bzw. unzug/~ngliehe Zellenzyme erreichen kann. Gesteigerte Formazanbildung naeh der Bestrahlung erlaubt also aueh um- gekehrt Rficksehlfisse auf ~nderungen der Zellpermeabilitgt.

2. Hemmungs- und A lctivierungsversuehe In den folgenden Versuehen wurden die Warburg- und die TTC-Methode stets

gleichzeitig mit derselben Suspension unter Zusatz der einzelnen Effectorl6sungen durehgef/ihrt, nnd zwar nach folgenden Ansgtzen:

WAR~V~G: 2 ml Itomogenat in m/15 Phosphatpuffer p~ 7,6 1 ml EffectorlSsung 0,2 ml 10 n-KOtt - - im Mittelraum.

1 DOUGLAS, I~., U. C. SAN CLElVIE!gTE: Canad . J . Microbiol. 2, 407 (1956). 2 JAMBO~, B. : Nature (Lond.) 173, 774 (1954).

Einflug der UV-Bestrahlung auf k/~sereiteehniseh wichtige Mikroorganismen. I I 187

TTC: 2 ml ttomogenat (wie oben) 1 ml Effeetorzusatz 1 ml l~oige TTC-LSsung.

Um Aktivit~tssehwankungen innerhalb versehiedener Kulturen auszugleichen, wurden die Ergebnisse stets auf den zusatzfreien Versuch = 100 bezogen, auBerdem wurde zu Beginn und am Ende der TTC-Ans~tze ein Bezugswert mitgemessen. Die Effectorkonzentrationen ]agen zwi- schen 10 -1 bis 10 -~ mmol pro Ansatz, das p~ der Effectorl6sungen wurde vor Zugabe zum Ver- suehsansatz sorgfiiltig auf 7,6 eingestellt.

a) Temperaturemp/indlichlceit des Pilzes Penicillium candidum ist ausgesprochen hitzeempfindlich. Bereits Erw&rmung

fiber 5 rain auf 40 ° C seh&digt die Dehydrasenaktivit/tt merklieh. Erhi tzt man 5 rain auf 55 ° C bzw. !0 rain auf 50 ° C bzw. 15 rain auf 45 ° C, so t r i t t vollsti~ndige Dehy- drasen-Inaktivierung ein, wobei die Temperaturempfindliehkeit verschiedener Pilz- kulturen sich merklieh unterscheiden kann. Streng vergleiehbar sind also nur gleieh- zeitig mit demselben Pilzmaterial durehgeffihrte Versuche.

Einfrieren bei 0 ° C und ansehlieBendes Wiederauftauen sch&digt die Dehydrasen- aktivit~t nicht oder nur geringf/igig.

b) Ein/lu[3 von Hemmsto//en Thiolinhibitoren (Jodosobenzoes~ure, Jodaeetat , Jodacetamid, p-Bromaeeto-

phenon, Phenylmercuriaeetat und -borat sowie das Hg-haltige Benzoxazolderivat ,,Cialit") hemmen aul3erordentlich stark, was auf das Vorliegen yon suffhydrylhaltigen Fermenten weist.

Metalle wie Mo, Fe, Cu, Mn und Co hemmen in hSheren Konzentrationen, gleich- falls durch Thiolgruppenblockierung. In niederen Konzentrationen aktivieren Mo, Mn und Co; insbesondere stimuliert Zn die Formazanbildung, erkl£rbar u. a. damit, dab Zn ++ ein Bestandteil der Alkoholdehydrase ist, die, wie sp£ter besehrieben, besonders gut dureh die TTC-Teehnfl~ erfaBt wird.

Komplexbildner (o-Phenanthrolin, c~,cg-Dipyridyl, Citronens/~ure, Na-amid, Cy- anid und Semicarbazid) hemmen auffallend stark, besonders in der Warburg-Teehnik, wo vor allem metallhaltige Fermente betroffen werden. Aueh die Hemmung dureh Antibiotiea der Tetracycline (Aureomycin, Terramycin) im TTC-Versueh ist auf Hemmung dutch Chelatbildung zurfickzufiihren 1.

Fluoracetat und Malonsaure, die beiden typisehen Inhibitoren des Citronens/~ure- eyelus, waren ohne Wirkung, worauf sp&ter noeh eingegangen wird. Von den als beson- ders starke Dehydrasenhemmer bekannten Schlangengiften hemmt Kobratoxin zu etwa 80 %.

Den Versuehen zufolge liegen bier Dehydrasensysteme vor, die ausgesproehene Thiolfermente darstellen und augerdem spezifische Metallionen zu ihrer Aktivit~t erfordern.

c) Ein/lu/3 von Vitaminen und Co/ermenten Geprfift wurden zun&chst Verbindungen, die an Redoxreaktionen des oxydativen

Abbaues beteiligt sind und zwar: Diphosphopyridinnueleotid (DPN; C. F. Boehringer, Mannheim), Triphosphopyridinnueleotid (TPN, 95%ig) und Coenzym A (CoA, 75%ig), beide yon der SIGMA Chemical Comp. St. Louis, USA, weiterhin Flavin- mononucleotid (FMN), Flavinadenindinucleotid (FAD, 25%ig) und ~-Lipons£ure, jeweils yon Mann Res. Lab. New York und schlieBlieh Thiaminpyrophosphat (Hoff- mann-La Roche, Basel) sowie Adenosintriphosphors&ure (ATP, Sehuehardt, M/inchen).

1 Se~o~iiLnE~, J.: Diese Z. 106, 372 (1957); 1@7, 40, 257 (1958).

188 J. Sego~YIOLLEg und H. M~m~:

Im TTC-Versuch zeigten besonders DPN und FMN stimulierende Wirkung, ein tIinweis darauf, dab TTC den Wasserstoff insbesondere yon den Flavinfermenten fibernimmt, die andererseits ffir die Oxydation yon D P N - t t 2 verantwortlieh sind. Wenig fibersiehtlich ist hier die Wirkung der anderen, oben genannten Cofermente sowie der gleichfalls untersuchten Vitamine B1, B6-phosphat , Pantothens&ure und BI~. Auf ihre Effectorwirkung bei bestimmten Dehydrasensystemen wird in Einzelf/fllen sparer noeh eingegangen.

d) Ein]lu[3 yon organischen LSsungsmitteln und oberfl~ichenalctiven Sto][en MOLLE~ 1 hatte bei Untersuehungen fiber die Aminos&urendeearboxylaseaktivit£t

yon Bakterien festgestellt, dab ein Zusatz yon organisehen L6sungsmitteln (Toluol, J~ther, Aeeton) oder yon oberfl/~ehenaktiven Substanzen (Zephirol, Na-desoxycholat) eine betr/~chtliche Steigerung der Enzymaktivit£t bewirkt und erkl~rte dies damit, dab die genannten Stoffe eine Permeabilit~tserhShung der Zellmembran f/ir die Fermentsubstrate (dort ffir Aminosauren) hervorrufen. Wir haben den EinfluB soleher Stoffe auf die Dehydrasenaktivit/~t yon Penicillium camemberti geprfift und/~hnliehe Ergebnisse erzielt.

Bei Tetrazoliumversuchen lessen sich zwei Reaktionsphasen abgrenzen: 1. Nach Zugabe yon Toluol, Aceton, J~ther und Na-

zusatz Q~c desoxycholat wird zun&chst die Formazanbfldung gesteigert, (2 Tropfen) in und zwar reeht betr&ehtlieh, wie nebenstehende Zusammen-

,1 stellung zeigt. 2. Bei l&ngerer Bebrfitungsdauer oder hoher Konzen- ohne 0,022

Toluol 0,089 tration an den genannten Substanzen tritt zunehmende In- )[ther 0,160 aktivierung der Dehydrasen ein. Die Versuche zeigen, dab zu- Aceton 0,060 n&chst Permeabilit~tserhShung durch die organischen Agen-

tien die Diffusion yon TTC an den 0r t enzymatiseher Ak- tivit~t innerhalb der Zelle ermSglicht und erst in zweiter Folge Fermentseh~di- gung bzw. Fermentinaktivierung durch Denaturierung des Enzymproteins erfolgt.

Mit Hilfe der Warburg-Teehnik 1/iBt sich lediglich die Fermentseh~digung, nieht aber die Permeabilit~tts&nderung zeigen. Versuche dieser Art leiten fiber zu Ersehei- nungen, wie wir sie bei den im folgenden beschriebenen Bestrahlungsversuehen beobaehteten.

e) Ein]lu[3 der Ultraviolettbestrahlung au/ die Endogenatmung Arbeitsweise: Als Strahlungsquelle diente eine U-fSrmig gebogene l~iederdruekquecksilber-

dampflampe der l~a. Osram (HNS 12 of), deren grSl]ter Teil (80%) an Strahlungsenergie auf die biologisch aktivste Wellenl~nge 254 m# en~fMlt. Die Anordnung der L~mloe entsprach frfiheren Angaben 2. ])as zu bestrahlende Mycel wurde w~hrend des Versuches in einer Petrischa]e dureh einen Magnetrfihrer gerfihrt. Einen Anhalt fiber die Bestr~hlungsenergie ]iefert folgende Berech- nung: Bei einer Gesamtstrahlung der Lampe yon 3,0 W~tt, einer Entfernung zwischen Lamloe und Bestrahlungsgut yon 25 cm, einer Lamloenl~nge yon 15 cm, einer Oberfl~ehe der Petrisehale yon 54 cm 2 und einem Sehaleninhalt yon 60 ml errechnet sich eine Bestrahlungsenergie yon 50 # Wattstunden in 10 min pro ml bestrahlter Suspension 2.

Urn vergleiehbare Werte zu erhalten, wurden die Bestrahlungsversuehe fo]gendermaBen durchgeffihrt: aus 60 ml der Pilzsuspension wurden bei fortlaufender Bestrahlung naeh jeweils 10 mill Bestrahlungsdauer laufend je 15 ml zur Analyse entnommen, l~ir 10, 20, 30 und 40 rain betrug die entspreehende Bestrahlungsenergie 50, 120, 220 und 420 # Wh/m]. Die Werte sind an- gegeben in Qo~ bzw. QTTC" 102.

MOLLEg, V. :Acta path. mierobiol, seand. ]4, 102 (!954). SC~O~i~LLE~, J., u. It. H~wg: Zit. S. 183, Anm. 1. Auch bei dieser Arbeit erfreuten wir uns der Beratung dureh tterrn Dr. DzIEg~WA der l~a.

Osram.

EinfluI~ der UV-Bestrahlung auf kasereitechnisch wich~ige Mikroorganismen. II 189

Aus Tab. 2 ist zu ersehen, da~ nach der Warburgtechnik mit steigender Bestrah- lungsdauer eine zunehmende Inaktivierung der Dehydrasen eintritt.

Tabelle 2. Ein/lufi der UV-Bestrahlung au] die Endogenatmung. (Gemessen

n~ch der W~rburg-Technik)

Bestrahlungs- dauer

min

0 10 20 30 40

Atmungsquot ien t Qo~ bei einem

]Kulturalter yon

3 6 10 Tagen Tagen Tagen

in in in

6,2 7,4 3,3 6,5 5,9 2,9

--2,6 3,7 2,6 --2,4 1,1 0 --1,6 ---0,5 0

T~belle 3. Ein]lufl der UV-Bestrahlung au[ die Endogenatmung (gemessen nach der

Tetr~zolium-Technik)

Bestrahlungs- dauer

• min

0 10 20 30 40

Atmungsquotien/~en QTTC " 102 bei einem Kul tura l te r yon

3 Tagen

in

13,1 1~,1

o o

5 Tagen

14,0 16,2 23,0 18,8

6 Tagen

in

12,6 14,1 10,0 o,4

10 Tagen

in

5,5 6,0 5,5 0,1 0

Im TTC-Versuch hingegen zeigt sich zun/~chst deutliche Stimulierung der Form- azanbildung, die nicht auf eine Aktivierung vorhandener Dehydrasen zurfickzufiihren ist. Bei h6heren Bestrahlungsdosen tri t t Aktivit£tsminderung ein. Das Verhalten der Pilzdehydi'asen gegen UV-Be- strahlung entspricht weitgehend qzs F den oben beschriebenen, durch or- ~l l I ganisehe Solventien hervorgerufe- ! hen Erscheinungen. Auch hier kann o~ die erhShte Formazanbildung mit einer Steigerung der Zellpermeabi- lit/~t ffir TTC erkliirt werden, wo- _~ 0,1s durch dieses Agens Wirkm6glieh- ~. keit auf die in der intakten Zelle bloekierten Enzyme erh/~lt. Tab. 3 ~ 0,7~ zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

AuBerdem wttrde noch ein dritter Bestrahlungseffekt beobaeh- tet. ~ach starker Dezimierung der ~o~ Dehydrasenaktivit/it durch 1/ingere ]~estrahlung konnte im Warburg- versueh eine Gasbildung festgestellt werden (negative Werte der Tab. 2). Offenbar wird bei der Bestrahlung Wasserstoffperoxyd gebildet, das dann unter Sauerstoffbfldung der Zersetzung anheimf/~llt.

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~-.--o I I I G 8 1o Tage 1Z

Alter Jet P/'l~ultur

Abb. 1. Ein/lu]~ tier UV-Bestrahlung au] die Atmung versehieden alter Pilzkulturen (TTC--~Iethode; QrTc) Bestrahlung: - - 0 rain;

- - - - 10 rain; . . . . 20 rain; . . . . 30 m in

Durch Kombination der Warburg- und TTC-Methoden konnten also folgende Prozesse bei zunehmender UV-Bestrahlung erfaBt werden:

a) Erh6hung der Permeabilit/tt der Zellw/~nde, verbunden mit gesteigerter Formazanbildung;

b) allgemeine Sch/~digung bzw. Inaktivierung der Dehydrasen; c) Gasbildung bei 1/~ngerer Bestrahlungsdauer.

190 J. S c ~ o ~ O ~ und H. MA~m~:

Die unter a) und b) genannten Einflfisse treten gleiehzeitig in Erscheinung. Zu- ni~chst iiberwiegt a), sparer t r i t t mi t steigender Strahlungsintensit~t b) in den Vorder- grund bis keine Atmungsti~tigkeit mehr festzustellen ist. Gasbildung kann nur fest- gestellt werden, wenn sie den Sauerstoffverbraueh fibertrifft. Die Empfindlieh- keit der Dehydrasen gegen UV-Bestrahlung sowie die Permeabilit~tssteigerung der Zelhnembran erreichen am Ende der Wachstumsphase (5. Tag) ihr Maximum (Abb. 1, S. 189).

In Ubereinstimmung damit stehen Beobaehtungen, wonaeh die ~berlebensraten yon Escherichia coli bei RSntgenbestrahlung 1 sowie die Widerstandskraft yon Mikro- organismen gegen UV-Bestrahlung am Ende der Waehstumsphase ein Minimum aufweisen 2. Lal~t man bestrahlte Kulturen li~ngere Zeit ohne weitere Strahleneinwir- kung stehen, so beobaehtet man -- offenbar infolge yon Sekundgrreaktion - - eine weitere Aktivi tatsabnahme.

Die bisher zum Verhalten yon Penicillium candidum gegeniiber UV-Bestrahlung gebrachten Versuchsergebnisse und ihre Deutung durch Permeabili tatsanderungen erkli~ren zwanglos die untersehiedliche Wirkung versehiedener Bestrahlungsdosen, yon deren AusmaB es abh£ngt, ob in der Bilanz eine Stimulierung oder eineDepression des Sauerstoffverbrauches erseheint. Dureh Bestrahlung werden einmal die Dehydra- sen geschi~digt, erkennbar an einer Minderung der Endogenatmung. In den Primi~r- stadien, vor allem bei unterschwelligen Strahlend0sen, werden Zellsehranken be- seitigt und damit DiffusionsmSgliehkeiten ffir TTC einerseits, fiir zelleigene oder zu- gesetzte Substrate andererseits zu den Dehydrasen gesehaffen. Diese Meehanismen finden Ausdruck in einer ErhShung des Sauerstoffverbrauehes bzw. der Formazan- bildung als Zeiehen gesteigerter Dehydrasenaktiviti~t. Da den vorhandenen Substrat- konzentrationen in der l~egel welt fiberwiegende Fermentmengen gegenfiberstehen, ist der Substanzabbau dureh die vorhandene Substratmenge und nieht durch die wirksamen Fermentsysteme limitiert. Teilweise Schadigung der Dehydrasen kgnn also in diesem Falle bei fibHcher Versuehsffihrung der Erfassung entgehen. Hinzu kommt ein weiterer wesentlicher, im folgenden experimentell erwiesener Punkt. Wie sparer mitgeteilt, ist die Zellwand besonders yon Pilzen ffir verschiedene Metaboliten, z .B. Di- und Triearbonsauren beinahe undurchl~ssig~ Nimmt man an, daI~ dureh UV-Bestrahlung eine Permeabiliti~tserh5hung nicht nur fiir TTC, sondern auch ffir Di- und Tricarbonsauren eintritt, so wird ein Substratzusatz bei bestrahlten Organis- men eine KonzentrationserhShung des betreffenden Substrates am l~eaktions- ort und damit eine Umsatzsteigerung fiir die spezifische Dehydrase zur F olge haben. Diese ~berlegung wird dureh ansehliel~end mitgetei l te Untersuchungen vollauf besti~tigt.

II. Der Citronens~iureeyclus in Penieillium eandidum und seine Beeinflussung dureh UV-Strahlen

Seitdem im Jahre 1937 KREBS die Theorie des Tricarbons~urecyelus aufgestellt hatte, fehlte es nicht an Versuchen, diesen Weg der Acetatoxydation such in Mikroorganismen nachzuweisen. Ohne hier auf Einzelheiten einzugehen, kann gesagt werden, dab es in den letzten Jahren gelang, zun~chst bei Bakterien, sp~ter auch bei Pilzen s~mtliehe Zwischenstufen des Citronens&urecyclus zu fassen. Die Hauptschwierigkeit ]ag, wie schon kurz erw~hnt, in der Undurchl~ssigkeit der Zellmembran fiir Di- und Tricarbons~uren 3. Sie wurde zun~chst durch Verwendung yon zellfreien Extrakten, aufgeschlossenem Zellmaterial oder Trockenpr~iparaten umgangen und so konnte die

1 KELNER, A., W. D. BET.LA~:Z, G. E. STAPLETON U. M. R. ZELLE: Bact. l~ev. 19, 22 (1955). 2 GODBEIaSE~, G.: Milchwiss. 7, 53 (1952). ~: 8 I~EILSO~, N. E. : Biochim. biophys. Acts !7, 139 (1955); J. Bact. 71, 356 (1956).:

Einflul~ der UV-Bestrahlung auf k~sereitechniseh wichtige Mikroorganismen. I I 191

Giiltigkeit des Krebscyclus z. B. fiir Aspergillus niger 1, Penicillium chrysogenum ~, He/ezdlen 3, Rhodospirillium rubrum ~, Pseudomonas-Arten 5, Aeetobacter G, Shigella 7 und Escherichia colis nach- gewiesen werden. Schliel31ich ge]ang es auch, mit Hilfe der Isotopenmethode s~mtliche Zwischen- stufen des Krebscyclus zu ermitteln.

Trotz dieses generellen Nachweises ist es notwendig, den genannten Cyclus fiir jeden Organismus gesondcrt zu iiberpriifen, da er offenbar nicht allen Mikroorganismen eigentiimlich ist, z. B. gilt er nicht fiir Trichomonas vaginalis 9.

In Fi~llen, in denen es nicht mSglich war einzelne Reaktionspartner oder Fermentsysteme des Krebscyclus zu ~assen, haben verschiedene Autoren Cyclen postuliert, bei dcnen eben diese Sub- strafe bzw. Enzyme nicht erforderlich sind, z. B. solche, wonach Kondensation yon zwei Acetat- bausteinen zu Bernsteins~ure 1° oder Oxydation yon Acetat zu Oxalat erfolgen sol111.

Da fiber derartige Cyclen ffir Penic i l l ium candidum nichts be ka nn t ist u n d die Aufkl~rung der Zwischenreakt ionen hier wesentliehe Erkenntn isse ffir die Wirkung yon UV-St rah len auf Reifungsenzyme verspraeh , haben wir die Unte r suehung des in Rede s tehenden Cyclus ffir den genann ten Pilz durchgeffihrt, worfiber im folgenden berichtet wird.

V e r s u c h s t e i l 1..Fermente, Substrate und Alctivatoren Die am Citronens~urecyclus beteiligten Dehydrasen haben wir wie iiblich drei Gruppen zu.

geordnet: a) den ~lavinfermcntcn, b) den Pyridinfermenten und c) den Pyridinfermenten, die auBerdcm Goenzym A erfordern. Die Substratl6sungen (10 -1 bis 10 -3 mmol pro Ansatz) w-arden jeweils vor Zugabe auf p~z 7,6

gebracht. Die Co/ermente (Bezeichnung und Bezugsquellcn vgl. S. 187) wurden in folgenden Konzen- trationen zugesetzt: DPN, CoA, ATP, B1-Pyrophosphat und MgC]2 je 10 -3 mmol pro Ansatz, TPN und ~-Lipons~ure je 10 -4 mmol pro Ansatz. Aui~er den im Citronens~urecyclus auftretenden, hier untersuchten Zwischenstufen (Citronen- und cis-Aconits~ure, yon Nutritional Biochem. Corp. Cleveland, Ohio sowie ~-Ketoglutar-, Bernstein-, Fumar-, J~pfel- und Oxalessigsi~ure yon Fluka AG., Buchs S. G./Schweiz, Isocitronens~ure (94%ig, als a]lofreies Lacton, Sigma Chem. Corp., St. Louis, USA) und Essigs~ure) wurdcn noch cinige andere, besonders interessierende Substrate eingesetzt, n~mlich Xanthin, Ace~aldehyd, Glucose, L-Glutamins~ure, D,L-Mflchs~ure, Lactose, Galaktose und Brenztraubens~ure.

Die Untersuchungen mittels der Warburg- und TTC-Technik erfolgten stets parallel an dem- selben Pilzmaterial, den gleichen LSsungen und zu gleicher Zeit. Nur so karm man die Ergebnisse aus beiden Methoden miteinander in Beziehung bringen. Selbstverst~ndiich sind die in den fol- genden Tabellen gebrachten relativen Aktivit~tszahlen nicht als Absolutwerte fiir den Pilz zu betrachten, da Umwelteinfiiisse beim Wachstum unterschiedliche Eigenschaften der Kulturen bedingen.

Fiir die gleichlaufenden Bestrahlungsversuche wurde unter den oben mitgeteilten Bedingungen (vgl. S. 188) 1O rain mit UV-Licht bestrahlt.

Acetaldehyd als Substrat bewirkt starke ErhShung des Sauertoffverbrauches, w~hrend die Formazanbildung betr~chtlich verringert wird. Versuchen zufolge beruht der letztgenannte Effekt auf einem chemischen Umsatz yon TTC mit Acetaldehyd, so dal~ fiir den 5[achweis der Aldehyd- Dehydrase die TTC-Technik nicht brauchbar ist.

1 R A M A ~ I S ~ , C. V. : Enzymologia 8, 169 (1954). 2 CASlDA, L. E., u. S. G. K~IG~T: J. Bact. 67, 658 (1954). 3 ]~REBS, H. A., S. GuRI-N u. L. V. EGGLESTON: Biochem. J. 51, 614 (1952), - - DEMoss, J.A.,

u. H. E. Swum: J. Bact. 74, 445 (1957). 4 EISE~B~O, M.: J. biol. Chem. 208, 815 (1953).

Robinson, J., u. H. KA~Z~LSO~: Canad. J. Microbiol. 2, 723 (1956); CAM~]~ELL, J. R., u. R. A. S~IT]~: Canad. J. Microbiol. 2, 433 (1956).

3 K ~ , T. E., E. H. I~w~s~KI u. V. It. C~ELD~H~: J. Bact. 72, 418 (1956). P ~ , S. F , R . YEE u. t t .M. G~zo~: J. Bact. 78, 402 (1957).

3 W~A~, R. W., J. RVST jr. u. S J. AJL: J. cell. comp. Physiol. 47, 317 (1956). WmTSC~TER, S., u. T. L. J ~ : J. Protozool. 3, 83; 86 (1956).

10 F()s~E~, J. W.: J. Bact. 56, 329 (1948). ~1 ~O~D, F, IF:, u. J. C. VITVCeI: Advanc. Enzymol. 8, 253 (1948); vgl. aueh S. It. Azn u.

I). T. O. Wo~o: Arch. ]~iochcm. ~4, 474 (1955).

192 J. Se~O~iiLLER und H. M~I~nEg:

Ergebnisse

Die be iden Tab. 4 und 5 br ingen die Versuehsergebnisse, Die angegebenen W e r t e s ind bezogen auf den Normalve r such (Endogena tmung ohne S u b s t r a t bzw. Coferment- zusatz u n d ohne Bestrahlung) , der gleich 100 gesetz t ist. Bes t r ah l t wurde jeweils 10 rain. I n Tab. 4 s ind zun~chst einige Versuchsergebnisse ffir den gesamten unter - suchten Konzen t ra t ionsbe re i ch und ffir verschiedene Versuchsf i ihrungen in Auswahl zusammenges te] l t .

Tabe]]e 4. Ein]lufl der UV-Bestrahlung au] die Endogenatmung Versuchsreihen mit wechselnden Substratkonzentrationen und verschiedener Vorbehandlung

Substrat

Allcohol 1 a) ohne Coferment b) mit Coferment c) bestrahlt 1 Coferment

J~pfelsaure ~ a) ohne Coferment b) mit Coferment c) bestrahlt 1 Coferment

L- Glutamins/~ure 2 a) ohne Cofermen~ b) mit Coferment c) bestrahlt 1 Coferment

_Fumars~iure 2 a) ohne Coferment b) mit Coferment c) bestrahlt 1 Coferment

Oxalessigsdure 3 a) ohne Coferment b) bestrahlt ~ Coferment

Essigs~iure ~ u) ohne Coferment b) bestrahlt 1 Coferment

Endogenatmung bei der

Warburg-Technik Tetrazolium-Technik bei einer Substratkonz. yon mmol bei einer Substratkonz. yon mmol

10-1 10-~ lO-a

in in in ~1 gl #1

10-~ 10-2 10-8

in in in

100 170 200

105 125 120

105 105 150

105 105 150

100

100

100 130 150

100 100 100

100 100 110

100 100 110

I00

100

Tab. 5 b r i ng t eine Zusammens te l lung der Ergebnisse aus al len Subs t r a tve r suehen m i t u n d ohne Bes t r ah lung un te r Besehr~nkung auf jeweils eine Konzen t ra t ion .

III. Diskussion der Ergebnisse

a) Flavin/ermente

Tab. 5 zeigt, dab die S t imul ie rung der MetaUfl~voproteine durch die entsprechen- den Subs t r a t e ohne Cofermentzusatz nach be iden Verfahren erfal3t werden kann.

1 Zusatz: DPN (10 -3 retool); ~ Zus~tze: DPN (10 La mmol) -~ TPN (10 -a mmol); a Zus~tze: TPN + ~-Lipons~ure (je 10 -~ mmol) und DPN -~ CoA ~ B~-Pyrophosphat ~- MgC12 -~ ATP (je 10 -a retool).

EinfluB dcr UV-Bes~rahlung auf kasereitechniseh wichtige lgikroorganismen. I I 193

Auf diese Weise warden Bersteins£uredehydrase und Milchs~uredehydrase nach- gewiesen. Aldehyd-Dehydrase kolmte wohl im Warburg-Versuch, n icht aber (wegen des Umsatzes mi t TTC) im TTC-Versuch sichergestellt werden. Umgekehr t spricht die Xan th in -Dehydr i e rung deutlich auf Tetrazol ium an. Das metall/reie Flavin- ferment der Glucosedehydrase ist im Warburg-Versuch stark aktiv, w~hrend die Formazanb i ldung durch Glucose n icht (auch n icht nach Bestrahlung) gesteigert

Tabelle 5. Ein]lu/3 der UV-Bestrahlung au/ die Endogenatmung. Substrat- konzentration jeweils 10-1retool pro Ansatz mit Ausnahme yon Xanthin

(10 -a mmol) und cis-Aconits~ure (10 -2 retool)

I i~ Endogenatmung bei der Warburg-Technik Tetrazolium-Technik

Substrat unbestrahlt bestrahlt unbestrahl~ bestrahl~ i/~ in in

ohne Co/erment Bernsteinsgure Xanthin . . . . . . . . . Acetaldehyd . . . . . . . D,L-Milchsgure . . . . . .

Glucose . . . . . . . . . . Galaktose . . . . . . . . . Lactose . . . . . . . . . .

mit Co]erment ~ ~thanol . . . . . . . . . . D,L-Apfels~ure . . . . . . . L- Glutamins~ure . . . . . . Citronens~iure . . . . . . . . eis-Aconits~iure . . . . . . . Isocitronens~ure . . . . . .

Fumars~ure . . . . . . . .

mit Co/erment 2 Brenztraubens~iure . . . . . ~-Ketoglu~ars~ure . . . . . Oxalessigs~ure . . . . . . . Essigs~ure . . . . . . . .

130 105 150 120

130 110 130

125 90 90 95

100 85

100

100 100 100 100

i !

155 120 105 l l0 3OO 105 1 ~

170 90 125 90 125 100

125 150 110 ]20 105 125 100 110 10O 1O0 110 10O

120 125

110 100 110 100 100 105 120 100

145 115 __3 110

100 ]00 100

300 160 200 150 110 110

200

115 120 140 120

werden kann , ein Befund, der in der Li te ra tur fiir verschiedene biologische Systeme best~tigt wh'dd; eine Deu tung dieses Ergebnisses ist dadureh gegeben, dab metaU- freies Flavoprote in offenbar nicht mi t TTC reagiert 5 u n d aui~erdem bei Penicil l ium candidum das gleichfalls Glucose dehydrierende, auf TTC anspreehende Pyr id inenzym

fehlt, b) Pyridin/ermente

Der Nachweis yon Pyr id infe rmenten erforderte in den meisten F~llen Coferment- zusatz. Nur nach der TTC-Technik bewirkten Xpfcls~ure, n-Glutaminsi iure und

1 Zu jedem Ansatz wurden gegeben: DPN (10 -3 retool) und TPN (10 -4 retool). Zu jedem Ansatz wurden gegeben: DPI~, CoA, B~-Pyrophosphat, MgCl~, ATP je 10 -3 mmol

und TPN, ~-Liponsi~ure je 10 -a mmol. s l~icht meSbar, da Acetaldehyd mit TTC reagiert (vgl. S. 191). 4 FRED, R. B., U. S. G. K~Isn'r: Science 109, 169 (1949). - - ZIEGL~R, H.: Z. Naturforsch.86,

662 (1953). - - S~rrH, F. G. : Plant Physiol. 27, 445 (1952). M A ~ , H. R., u. J. L. GLENS: Inorganic Nitrogen Metabolism. Baltimore: John Hopkins

Press 1956. - - K~E~, 1%., u. F. LINKE: Liebigs Ann. Chem. ~78, 156 (1952). Z. Lebensmitt.-Untersuch., Band 110 14

194 J. SC~O~M~LL~ undH. MA~LE~:

Citronens£ure allein deutliche Aktivit~tssteigerung. Wesentliche Aktivierung wurde durch gleichzeitige Cofermentzugabe (DPN und TPN) erreieht, mit Hilfe der Warburg- teehnik war hier jedoch lediglich die Alkoholdehydrase faBbar. Erst eine Permeabili- t£tserhShung durch vorhergehendc UV-Bestrahlung ermSglichte die (schwache) Stimulierung der Formazanbildung auch durch cis-Aconits£ure und Isocitronens£ure und die des Sauerstoffverbranches durch J~pfels~ure, L-Glutamins~ure und Iso- citronens~ure.

c) Coenzym A-abhiingige Fermente Enzyme, die eine oxydative Decarboxylierung bewirken, konnten mit Hilfe beider

Methoden erst nach vorhergehender Bestrahlung und Zugabe yon Cofermenten nach- gewiesen werden. So gelang die Aktivierung der Dehydrasen ffir Brenztraubens£ure, ~-Ketoglutars/~nre und Essigs~ure, naehweisbar durch beide Methoden, der Oxal- essigs£uredehydrase dutch Steigerung der Formazanbildung. Aktivierung der Brenz- traubens/~ureoxydation dutch Lipons£ure haben CLAPPER U. Mitarb. 1 bei Strepto- kolJcen-Stiimmen beschrieben.

d) Hydratasen Neben Dehydrasen und oxydativ deearboxylierenden Enzymen sind am Citronen-

s£urecyclus auch Hydratasen beteiligt, und zwar die Fumarase sowie die Aeonitase. Da beide Fermente weder Gasverbrauch zeigen noch einer l~edoxreaktion gehorchen, sind sic durch die hier benutzten Methoden nicht direkt nachweisbar. Der Einflul3 yon Citronens£ure and cis-Aconits~ure auf die Dehydrasenaktivit£t wurde bereits oben im Zusammenhang mit der Isocitronens£ure erw~hnt (unter b). Ein Zusatz yon Fumars/ture bewirkte auch ohne Cofermentzusatz eine ErhShung der Formazanbil- dung. Wurde jedoch die Pilzsuspension bestrahlt und auSerdem noch mit DPN und TPN versetzt, so war auf Fumars~urezugabe eine betr~tchtliche ErhShung des Sauer- stoffverbrauches und der Formazanbildung zu beobachten. Derartige Aktivit£ts- steigerungen lassen indirekt auf das Vorliegen der genannten Fermente schliel3en.

Zusammen/assend f/ihren die bier beschriebenen Ergebnisse zu folgenden Sehlfissen: Zun~chst ist zu betonen, dal~ Substratversuehe an lebenden Mikroorganismen, vor allem mit schwer durch die Zellwand diffundierenden Substanzen, sehr vorsichtig zu beurteilen sind. Da dutch Verreiben mit Quarzsand zerkleinertes Pilzmaterial in der Formazantechnik keine Aktivitat mehr zeigte, haben wit mit Erfolg versucht, die Permeabilit£t der Zcllwgnde durch UV-Bestrahlung zu erhShen, um dadurch eine gesteigerte Diffusion yon Substraten zum Reaktionsort zu ermSglichen. Gemessen am Sauerstoffverbraueh zeigt Penicillium candidum in Bestatigung einiger frfiherer, orientierender Versuche 2 auf Zusatz yon Bernsteins£ure, Acetaldehyd, Milehs£ure, Glucose, Galaktose, Lactose und in geringem Ausmat~ aueh yon Alkohol Aktivit/~ts- steigerung der Dehydrasen. Erh5hung der TTC-Reduktion allein durch Substratzusatz konnte bei folgenden Verbindungen festgestellt werden: Bernsteinsaure, Xanthin, Milchs£ure, ~pfels£ure, T,-Glutamins/ture, Citronens£ure, Fumarsaure und (gering- filgig) Alkohol. Gleichzeitiger Zusatz yon Cofermenten erm6glichte den sicheren Naeh- weis der Alkoholdehydrase und steigerte die Formazanbfldung auf Zusatz yon Apfel-, L- Glutamin- und Fumars£ure. Erh6hung der Dehydrasent~tigkeit durch die Substrate: ~-Ketoglutars/~ure, Brenztrauben-, Essig-, eis-Aconit- nnd Isocitronensaure konnte bei intaktem, lediglich homogenisiertem Zellmaterial nicht festgestellt werden. Eine Erkl£rung hierffir bietet die Undurchlassigkeit der Zellwand ffir diese Substrate. Auch in der Literatur werden, wie oben erw~hnt, f/Jr solche Verbindungen Diffusions-

1 CLAP]?ER, W. ]~., u. G. H. MEADE: J . B&ct. 75, 493 (1958). SCItOR]VI~LLER, J . , u. H. HUTH: Zit. S. 183, Anm. 1.

EinfluB der UV-Bestrahlung auf kasereiteehniseh wichtige Mikroorganismen. II 195

sehwierigkeiten besehrieben. Ultraviolettbestrahlung derartiger Dosierung, da$ zwar die Permeabilit/~t der Zellwgnde erhSht wurde, die Sehgdigung der Dehydrasen jedoeh m6gliehst gering blieb, erm6gliehte den sieheren Nachweis solcher Dehydrasen.

Betraehtet man yon den untersuehten Substraten besonders die am Citronens~ure- eyelus beteiligten, also Citronen-, eis-Aeonit-, Isoeitronens/~ure, sc-Ketoglutar-, Bern- stein-, Fumar-, Xpfel-, Oxalessig- und Essigs/~ure, so ergibt sieh, dag auf Zusatz all dieser Verbindungen eine Stimulierung der Dehydrasenaktivit/~t festgestellt werden kann. Damit ist der Beweis geftihrt, dab der Krebscyelus bei Penicillium candidum einen mSgliehen Abbauweg fiir die Essigs/~ure darstellt.

Es ist interessant, in diesem Zusammenhang die yon einigen Forsehern vorge- sehlagenen Ersatzeyelen zu betraehten (vgl. S. 191). So ist es bei den Angaben yon FOSTS,~ auffallend, dab gerade diejenigen Zwisehenstufen des Krebseyelus, die sieh leieht dem Naehweis entziehen (Citronensgure, eis-Aconits/~ure, Isocitronens/~ure und e-Ketoglutars/~ure) nieht am postuherten Cyclus beteiligt sind. Von besonderer Bedeutung erscheinen die negativen oder nut schwaehen Hemmwirkungen yon Malon- s/~ure oder Fluoraeetat, zwei typisehen Inhibitoren fiir den Citronensgureeyelus. Aueh nach vorhergehender Bestrahlung des Pilzmaterials war der Einflu$ ~uBerst gering. Lediglich eine Aktivierung der Suecinodehydrase dureh Bernsteins/~ure konnte in unseren Versuehen mit Malons/~ure vollst~ndig verhindert werden. Xhnlieh geringe Effekte yon Malons~ure und Fluoracetat beobaehteten auch K~EBS u. Mitarb. 1 bei Versuchen mit Here. Sie werteten dies u. a. als Beweis dafiir, da$ der Citronens~ure- cyclus nicht den Hauptweg ffir den Essigs~ureabbau darstellt, obgleieh sie s/~mtliche Zwischenstufen dieses Prozesses nachweisen konnten. Zweifellos ist die schwache Wirkung der genannten Hemmstoffe auch hier ein Hinweis darauf, dab weder die Oxydation der Bernsteins~ure noch die der Citronens/~ure einen integrierenden Teil der Endogenatmung yon Penicillium candidum darstellen.

Fi~r die Praxis der Kgserei/ung ist aus diesen Untersuchungen zu folgern: 1. Ultraviolettbestrahlung in mi~[3igem Ausmafl zu Beginn der Reifung (w5hrend

der Wachstumsphase der enzymliefernden Mikroorganismen) bewirkt betr~chtliehe Zunahme der erfaf~baren Fermentaktivit~t, insbesondere aueh der am Reifungs- prozeB wesentlich beteiligten Dehydrasensysteme. Die hier gewonnenen Ergebnisse best/~tigen die mehrmals beobachtete und patentm/~Big genutzte, reifungsbeschleuni- gende Wirkung yon Ultraviolettstrahlen.

2. Ultraviolettstrahlen hoher Intensitgt vermSgen Fermentsysteme Vo n enzymatiseh reifendem Material weitgehend zu inaktivieren, vor aIlem dann, wenn die Mikroflora nach tier Wachstumsphase einer UV-Bestrahlung unterwoffen wird.

3. Die Frage, welehe der beiden WirkmSgliehkeiten -- Aktivierung oder Zer- stSrung yon t~ermenten -- bewuSt genutzt werden soll, bedarf weiterer Untersuehun- gen im praktisehen Betrieb unter entsprechender Strahlendosierung und wird sieh danaeh riehten, ob eine Aktivierung tier Reifungsfermente odor aber eine Sistierung der Mikroflora angestrebt wird.

Zusammen/assung Untersuchungen fiber die Dehydrasensysteme yon Penicillium candidum warden

mit Hilfe der Warburg- und Tetrazoliumtechnik durehgeffihrt. Beide Methoden wurden hinsichtlich ihres Wirkungs- bzw. Anwendungsbereiches miteinander ver- gliehen. Einzelne Dehydrasen wurden zun~chst in ihrem Verhalten gegen Effeetoren, (Inhibitoren, Vitamine und Cofermente) gekennzeichnet. Organische LSsungsmittel, oberfl~chenaktive Substanzen und Ultraviolettstrahlung mindern in hohen Dosen die

1 KnEBs, H. A., S. GuRI~ u. L. V. EGGLESTON: Zit. S. 191, Anm. 3. 14"

196 It. ESeENAVEn:

Dehydrasenaktivit/~t und steigern die Fermentwirkung bei niedrigen Konzentrationen. W~hlt man die Dosis der UV-Bestrahlung derart niedrig, dab geringe Dehydrasen- seh/idigung einerseits, gesteigerte Permeabilit/it der Zellw/~nde andererseits eintritt, so gelingt es, eine Aktivierung aller am Citronensgurecyelus beteiligten Enzyme zu erreiehen und diese im spezifischen Substratversueh zu erfassen. Dam_it ist die Gfiltig- keit dieses Cyelns ffir den Aeetatstoffweehsel yon Penicil l ium candidum erwiesen. Folgerungen, die sich aus diesen Untersuchungen ffir praktisehe Probleme enzyma- tisch reifenden Materials ergeben, werden diskutiert.

Beitr~ige zur analytischen Chemie des Weines

V I I I . M#teilung*

Best immung yon Kobal t im Wein mit ~-Nitroso-a-naphthol

Von

H. ]~S(~HNAUER**

Mitteilung aus dem Anorg.-Chem. Institut der Johannes Gutenberg-Universit~it, Malnz a. Rhein

~it 2 Textabbildungen

(Eingegangen am 31. Dezember 1958)

Schon im Jahre 1885 hat der Botaniker FO~CKHAM~Eg Kobalt und Nickel im Eichenholz naehgewiesenL Sparer haben sieh mehrere Forscher mit dem Kobalt- and Igickelgehalt in Pflanzen und Tieren besch~ftigt ~. Besonders BErTRAnD und seine Schfiler S haben ausffihrliche Unter- suchungen hierfiber angesteUt und wahrscheinlieh gemacht, dab alle Pflanzen einen geringen Kobaltgehalt haben, fiber deren Gr6Be Tab. 1 einen orientierenden ~lberblick geben soll ¢.

Angaben fiber einen Gehalt yon Kobalt und Nickel im Wein sind in der Literatur nieht zu finden. Eigene spektralanalytische Untersuchungen yon Weinasehen nach HARVEY 5 zeigen, da{3 diese beiden Elemente auch im Wein enthalten sind. Es wurden 32 Weine aus Ober-Ingelheim (Rheinhessen), dem l~heingau, der Mosel und fran- z6sischen und spanisehen Weinbaugebieten untersueht und festgestellt, dab der Kobaltgehalt yon 0,01--10 #g Co/1 Wein und der Nickelgehalt yon 0,03--30 #g Ni/1 Wein sehwanken. Wegen des groBen Bestimmungsfehlers kann nieht gesagt werden, ob das sonst fibliehe Verh~ltnis Ni:Co = 10:1 aueh hier gfiltig wird.

Das kann nut durch genauere Untersuehungen mit kleinerer FeMerbreite fest- gestellt werden. Dazu mug ein analytisehes Bestimmungsverfahren herangezogen werden, das diese Kobaltspuren mit einem Fehler yon Maximal 10% zu erfassen erlaubt.

* VII. Mitteiinng: Vgl. diese Z. H. 2/110. ** Herrn Prof. Dr. F. ST~ASS~ANN danke ieh fiir die Unterstfitzung der vorliegenden Arbeit. 1 FO~CmIAMMER, J. G.: Poggendorffs Ann. Phys. u. Chem. 95, 60 (1855).

S C ~ E R , K. : Biochemie der Spurenelemente. 3. Auflage. Berlin: Parey 1955. a BERTtCAND, G., U. M. ~VIOKt~AGNATZ: C. I~. Aead. Sci. (Paris) 175, 458 (1922); 179, 1566

(1925); 190, 21 (1930); Bull. Soe. chim. France 31, 1330 u. 1539 (1923); 37, 554 (1925); 47,491 (1930); Ann. Inst. Pasteur 44, 543 (1930).

4 WEISSBECKER, L.: Kobalt als Spurenelement und Pharmakon. S. 29. Stuttgart: Wissen- sehaftl. Verlagsgesell. 1950.

HAtCVE¥, C. E. : Speetrochemieal Procedures. California: Appl. Res. Lab. 4336, San Fer- nando 1949.