Acta Medica Scandinavica. Vol. LXXXVII, fasc. V-VI, 1936.

Aus der inneren Abteilung des allg. Krankenhauses zu Jonkoping (Schweden).

ober den isoelektrischen Punkt des nativen Serumalbumins des Menschen.

von

ESKIL KYLIN.

Wahrend der letzten Jahre hat das Studiuni der Bluteiweisse sich gesteigertes Interesse zugezogen und es sind eine Rcihe wichtiger Resultate erreicht worden.

Hier mogen nur folgende genannt sein:

Die Feststellung der Bedeutung der Bluteiweisse fur den Transport bestimmter Stoffe innerhalb der Blutbahnen und der Vehikelfunktion der Bluteiweisse (Bennhold). Die Bedeutung der Bluteiweisse fur die osmotischen Druckverhaltnisse und daniit aucli fur den Wasserhaushalt. Die Bedeutung der Bluteiweisse fur gewisse serologische Reaktionen.

Unter diesen Verhaltnissen ist es offenbar geworden, dass die Bluteiweisse eine bedeutend grossere physiologische und sicher auch klinische Bedeutung haben, als wir vorher ahnten. Am kuhnsten und konsequentesten sind die Schlussfolgerungen hier- aus von Bennhold gezogen worden der das Bluteiweiss als ein sprzielles Organ auffasst.

Trotz des Umstandes, dass die Forschung wahrend der letzten Jalire auf diesem Gebiet mit grosser Kraft eingesetzt hat, sind doch weiterhin auch rein grundlegende Tatsachen unbekannt. Wir wissen, dass man noch bis in die allerletzte Zeit das Blut- eiweiss als eine Mischung drei getrennter chemischer Stoffe auf- fassen wollte, namlich Fibrinogen, Globuliri und Albumin.

Bei der Redaktion am 6. December 1835 eingegangen.

U B E R J j E S [ S O E L E K T R I S C H E N P U N K T D E S N A T I V E N S E R U M A L B U M I N S . 537

Gegen die Auffassung von der Einheitlichkeit dieser Eiweiss- stoffe sind von inedicinischcr Seite imnier mehr Einwendungen laut geworden. Der Umstand, das init steigender Sattigung eines Fiillungsriiittels z. B. Ammonsulfat, neue Fraktionen von Blut- eiwciss ausfalleii, scheint fur einen fliessenden Ubergang zwischen den verschiedeiien erwahntcn Eiweissen zu sprechen. Man fand nicht einmal, wic GeiIl hervorhebt, dort irgendeinen scharfen Unterschied in der Fallungskurvc des Eiweisses, wo wir ini allge- nieinen die Grenzen fur die Fallbarkeit der Eiweissfraktionen setzen, denen wir die Namen Fibrinogen, Globulin und Albumin ge- gebcn liabcn. Dass irii ubrigen die Fallbarkeit mit einem bestimm- ten Salz, wic in unserem Fall Ammonsulfat, nicht irgendeinen wissenschaftlichcn Beweis fur die Bereclitigung zur Akgrenzung chernisch getrennter Stoffe bilden kann, ist an und fur sich selbst- verstandlich und schon friilier von Hofmeister betont worden.

Uesonders Hennhold hal; sich gegen die Auffassung der Blut- eiweisse als selbstandiper, einheitlicher Stoffe gewandt. Bennhold ist anscheinend mehr geneigt, die Rlutaiweisse als eirie Sammlung einer grossen Anzahl an sich nahe verwandter Stoffe aufzufassen, h i derieii die Ubc-rgange fliessend sind, wie es z. B. der Fall rnit dcn Stralilen in1 Spcktrurn ist.

Es scheint, als ob einige Untersucliungsresultate, die in den Itktzten Jahren herausgekommen sind, geeignet sind, Rennholds Ansicht zu stutzen. So hat z. B. mein Mitarbeiter Gronwall unt,er nieirier Lcitung gezeigt, dass im elektrischen Feld gewisse Albumin- fraktionen schneller wandern als andere. Ich selljst habe festge- stellt, dass die schneller wandernden Albuminfraktionen ein be- dcutend grosseres Verniogen besitzen, bestimmte Farbstoffe zu binden als die langsanier wandernden. Dass eiri analoges Verhalten in Bezirg auf den kolloidosrnotischen Druck gilt, hat in meineni Laboratorium Gronwall gezeigt.

Uci den Untersuchungen betrcffs des physikochemischen Ver- haltens der Hluteiweisse fand ich, dass bei dem normalen pH des Blutcs (7.3-7.4) gewisse Fibrinogenfraktionen im elektrischen lceld zur Kathode wandern. Diese Fralctionen waren also bei diesem pII Wert positiv geladcn. Ihr isoelektrischer Punkt musste deingrrniiss uber 111 1 7.:;-7.4 liegen. Durcli diesen Ucfund ver- adass t trug ich meinern Mitarlwiter I’aulsen auf, den isoelektrischen Punkt des Fibrinogens zu untersuchen. Paulsen stellte dahei fest,

538 ESKIL K Y L I N .

dass verschiedene Fibrinogenfraktionen einen verschiedenen iso- elektrischen Punkt haben.

Es erschien mir wertvoll, auch den isoelektrischeii Punkt fur natives Albumin zu erforschen.

In der Literatur finden sich betreffs des isoelektrischen Punktes der Albuniine folgende Angaben: Michaelis und Davidsohn haben den j. P. bei pH 4.7 gefunden, Ito und Pauli bei pH 4.99, und Hona und Michaelis bei pH 5.5. Alle diesen Autoren haben fur ihre Bestimmungen die elektrophoretische Methode angewandt.

Methodik. Bei meinen Untersuchen uber den i. P. des Serumalbumines

1) Ausgangsmaterial war Menschenblut. 2) Durch Kataphorese von Plasma oder Serum habe ich niir

reines natives Serumalbumin verschafft. Rei der Kataphorese habe ich niich des von Beniihold konstruier-

ten Apparates bedient, welcher eine zweckmassige Modifikation des Micliaelischen Uberfiihrungsapparates bildet. Als Seitenflussigkeit verwendeten wir Kinger- oder physiologische NaCl Losung.

Das anodenwarts wandernde globulinfreie Albumin wurde schichtweise abpipettiert in ein his zwei mm dicken Schichten.

3) Bei einer Reihe von Versuchen wurde das reine, native Albumin mit verschiedenen Pufferlosungen gemischt, deren pH zwischen 1.174.24 lag. Das Mischungsverhaltnis Albumin: Pufferlosung war 1:4 oder 1:s. Hierdurch wurde eine Losung erhalten, die den urspruuglichen pH der Pufferlosung bewahrte oder nur unwesentlich nach deni Neutralpunkt liin verschob. Die pH Bestimmung wurde niit Lautenschlagers Jonometer ausgefiihrt unter Anwendung einer Chinhydronelektrode, die mit einer Genauigkeit von 0.01-0.02 arbeitct. Die hergestellten Pufferlosungen wurden niit demselben Jononieter kontrolliert. Als Pufferlosungen wurden verwendet: Citrat-HC1, Citrat-NaOH, Veronal-HC1 und priin.-sek. Phosphat.

Die auf diese Weise erhaltenen Albuminpuffermischungen wurden in einem kleineren Kataphoreseapparat kataphoretisiert, wobei als Seitenfliissigkeit der gleiche Puffer angewandt wurde, mit dem das Albumin verdunnt worden war. Nach dieser Kata- phorese wurde die Seitenflussigkeit schichtweise bis zu einer

habe ich folgende Methodik angewandt.

[ J E E R D E N I S O E L E K T R I S C H E N P U N h T U E S N A T I V E N S E R U M A L B U M I N S . 539

Tiefe voii ungefahr 1 cm iiber der Null-linie abpipettiert. Vor- sichtshalber wurde nicht tiefer lieruntergegangen, da man in diesem Bereich eine meclianische Vcrmischung mit Albumin aus der ur- spriingliclien Albuminlosung iiicht ausschliessen kann.

Die entnommcnen Schichten wurden durch Sulfosalicylsaure und Salpetersaurc auf das Vorkoninien von Eiweiss gepriift.

Nach dern Abschluss dcr Kataphoresc wurde der pH der Mittel- fliissigkeit von neueni bestininit. Die Verscliiebung der p H wahrend der Versuchc war so uiibedeutend, dass sie das Untersuchungs- resultat nicht beeinflusste, sie war nahmlich niemals holier als 0.1.

4) Eine andere Untersuchungsscrie hatte zum Ziel, den pH festzustellen, bei deni die Fallungsoptima vcrschiedener Albumin- fraktionen liegen. Hirrbei wurde nach folgender Art verfahren: Das reinc Albumin wurdc mit der Pufferlosung so gemischt, dass eine Albuminlosung iiiit dem pH zwischen 4.5-5 erhalten wurde. In einern kleineren Kataphoreseapparat liess ich diese Albuminlosung im elektrischen Feld wandern. Nach beendigter Kdtaphorese wurde sowohl an dcr Anode wie an der Kathode die Fliissigkeit iiber der Nullinic abpipettiert. Dicse Albuminlosungen wurden mit einer Scrie von Pufferlosungen vermisclit, deren pH zwischen 2.69 und 6.65 variierte. Das Albumin wurdc cntweder niit Ammonsulfat oder Alkohol absolutus gefallt.

5) U m festzustcllen, iiiwiewcit die sclinellcr wandernden Albumin- fraktionen einrn anderen isoelektrischen Punkt besitzen als die langsanier wandernden, wurden weiter folgende Versuche ausge- fuhrt: lieines Albumin wanderte im elektiischen Feld bei einem pH wenig uber 7. Nach beendeter Kataphorese wurde die Albuminfrak- tion die zur Anode wauderte, hber der Nullinie abpipettiert. Ebenso wurde an der Kathodenseite unter der Null-linie eine 2 bis 3 cm dicke Scliicht von Albumin abpipettiert. Die crhaltenen Albumin- losungen wurden in eincr Pufferserie auf die gleiclie Art ausgefallt, die unter Punkt 4 beschrie1)en wurde.

Material und Ergebnisse. Die Wanderung des reinen Nafiualbumins im elektrischen Feld.

Die Waiiderung des nativen Albumins wurde im elektrischen Feld beim pII zwisclien 1.17 und 6.24 gepriift. Hierbei zeigte cs sich, dass bei einem pH unter 3,890 das Albumin ausschliesslich

540 E S K l L K Y L I N .

zur Kathode wandert. Bei diesem pH war also alles Albumin positiv geladen. Sein isoelektrischer Punkt lag iiber 3,890. Beim pH 4.16 wanderte das Albumin gleichzeitig zur Anode wie zur Kathode, wenn auch die Wanderung zur Kathode ausgesprochen starker war als die zur Anode. Bei pH 5.99 wanderte alles Albumin zur Anode. Bei diesem pH und dariiber - war also alles Albumin negativ geladen. Bei pH 5,930 wanderte der grossere Teil der Al- bumine zur Anode ein kleinere Teil zur Kathode. Beim pH zwischen 4.1 und 5,930 wanderte Albumin sowohl zur Anode wie zur Kathodc. Die Untersuchungen, die diesen Resultaten zu Grunde liegen, sind in der Tabelle 1 zusamniengefasst.

Tabelle 1. Heines Albumin.

PH

1.17

2.972

3.364

3.529

3.800

3.890

4.16

4.447

4.958

5.568

5.930

5.99

6.24

Heller Sulfos a 1.

Heller Sulfosal. Heller Sulfosal. Heller Sulfosal. Heller Sulfosal. Heller Sulfosal. Heller Sulf osal, Heller Sulfosal.

Heller Sulfosal. Neller Heller Sulfosal. Heller Sulfosal. Heller Sulfosal.

Kathode

111

+++ +++ +++ +++ +++ + + +

+ ++

+++ +++

+ + + +

++ +++ + + +- +++ + + + + - __ - -

- 111 - -

- - - - -

(--I (+) __ - - -

+ + t++ +++ + + -I- +++ +++ ++ ++

+++ +++ +++ +++

Anode

C B E R D E N I S O E L E K T R I S C H E N P U N K T D E S N A T I V E N SERUMALBUMINS. 541

Um die angewandte Technik zu veranschaulichen, werden zwei Versuchsprotokolle beigefugt.

Versuch 2 4 .

Mittelflussigkeit: 1/4 Albumin + 3/4 Citratpuffer p H 4,447. Seitenfliissigkeit: Citratpuffer bei demselben pH.

Beginn 1255 Spannung 155 Volt Schluss 1355 n 170 r)

Abpipettierung der Seitenflussigkeit an der Anode und an der Kathode in 3 Schichten bis 4 mm oberhalb der 0-Linie.

K l K2 K3 A1 Aa A3 Heller +++ +++ +++ +++ +++ +++ S u I f o s a l . + + + +++ +++ +++ +++ +++

Versuch 2 8 .

Mittelfliissigkeit: 1/4 rein Albumin + Phosphatpuffer pH 6.2. Seitenflussigkeit: Phosphatpuffer bei demselben pH.

Beginn 142O Spannung 175 Volt Schluss 15S0 w 200 0

Abpipettierung der Seitenfliissigkeit an der Anode und an der Kathode in 3 Schichten bis 4 mm oberhalb d'er 0-Linie.

K l K2 K3 A1 A2 A3 ++ +++ Heller Sulfosal. - - - - ++ ++f

_ _ _ -

Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dass das native Serum- albumin beim Menschen nicht cinen einzigen bestimmten iso- elektrischen Punkt besitzt, sondern verschiedene isolektrische Punkte, die ungefahr zwischen 4 und 6.0 variieren.

2. uber die Fallungsoptima des reinen Nativalbumins bei ver- schiedenen p H .

Wie ich schon angeben habe, haben friiher verschiedene Forscher den isoeloktrischen Punkt des Albumins zwischen 4.69-4.99-5.5 angcgeben. Wenn diese Angaben richtig sind, miisste das Fallungs- optimum fur Serumalburniii irgendwo bci diesem Ziffern liegen, da wir ja wisscn, dass cin in Losung hefindlicher Stoff in seineni isoc 11 ktl ischeii Punkt am leichtesten ausfallt. Zunachst versuchte ich clie optimale Fallbarkeit des zur Anode wandernden Serum- 3; - dcla med. scandinau Vol. LXXXVII.

542 ESKIL KYLIN.

albumins zu bestimmen. Ich fand, hierbei dass dieses Optimum bei ungefahr pH 4.55-5.03 liegt, wie aus der Tabelle 4 hervorgeht. Das Resultat stimmt also, wie wir finden, recht wohl mit deli fruhc- ren Angaben iiberein.

+

Fdllungsreihen in Citrafpuffern. 2 cmS Puffer + 2 ems Alcohol.

Tabelle 4.

+ + + + + + + + + + ( + ) - (+) + + + + + + + (+)

+ + f + (+) (+) + (+)

+

Nachdem die maximale Fallbarkeit des nativen Albumins festgestellt war, untersuchte ich die maximale Fallbarkeit fur das bei pH 4.83 zur Anode und zur Kathode wandernde Albumin. Fur das zur Anode wandernde Albumin fand ich eine maximale Fallbarkeit bei 4.3. Fur das zur Kathode wandernde dagegen bei 5.6-5.8. In der Tabelle 5-6 sieht man des Resultat dieses Versuchs.

Tabelle 5.

+ (+) + + f + -t ( + I (+) - (+) + + + + + + + + + +

+

(+) ( + I ( + I - + + (+( + + +

+ + + + + + +

f (+) + +

U B E R D E N I S O E L E K T R I S C H E N P U N K T D E S N A T I V E N S E R U M A L B U M I N S . 543 In eineni anderen Versuch liess ich das reine native

Albumin beim pH 4.5 im elektrischen Feld wandern. Hierbei fand ich die maximale Fallbarkeit fur das anodenwarts ge- wanderte bei pH 4.05 liegen.

Aus diesen Untersuchungen geht also hervor, dass dadurch, dass man Nativalbumin im elektrischen Feld wandern lasst, bei einem p1-f der ungefahr in der Mitte zwischen der oberen und der unteren Grenze der isoelektrischen Punltte des Albumins liegt, das Nativalbumin in zwci verschiedene Fraktionen geschiederi werden kann, deren niaximale Fallbarkeit bei verscliicdeneni pH liegt. Das zur Anode wandernde Albumin hat seine maxi- male Fallbarkeit bei einem pH der sic11 der unteren Grenze nlhert, das zur Anode wandernde dagegen bei einem pI-1, der sich der oberen Grenze nahert. Weiter fanden wir, dass durch Senkung des pH der zu kataphoretisierenden Albuminliisung das Fallungsoptimnm des anodenwarts wandernden Albumin zu einem niedrigeren pH gesenkt werden konnle.

3. Wo liegt der maximale Fiillungspunkt fur die schneller wandernden AlbuminfraktionPn im Verhiiliniss zu den langsamer wandernden?

Um diese Fragen zu untersuchen, liess icli reines Nativalbumin in dem elektrischen Feld bei einem pH ein wenig iiher 7 wandern. Hierbei wandert alles Albumin zur Anode.

Wie nieiri Mitarbeiter Gronwall festgestellt hat, wandern jedoch bestimmte Fraktionen schneller als andere. Die am schnellsten wandernden Fraktionen sammeln sicli an der Anodenseite und wandern in die Seitenfliissigkeit, Die am langsamsten wandernden bleiben, wcnn ich so sagen darf, an der Kathodenseite zuruck und sind in der Schicht vorhanden, die an der Kathodenseite nahe unter der Nullinie liegt. Ich habe die Fallbarkeitsverhaltiiisse fur die Albuminfraktionrn, die a11 der Anodenseite in die Seiten- flussigkeit wandern und fur die, die an der Kathorlenscitc unter der Nullinie in einer 2 cm tiefen Schicht entnommen wurden, gepriift.

Es zeigte sich, dass, wahrend das Fallungspotimum fur die Anoden-Albumine zwischen 4 uiid 4.3 lag, so lag es fur die Katho- den-Alburnine zwischen 4.8 und 5.4. Dic Primarresultate gehen aus der Tabcllc 7-8 hervor.

pH 2.69 3.43 4.05 4.31 I I I I + + + + + + + + + + + +

(+) + + (+) f -

4.55 4.62 5.02 I I

4.05 4.31

+ -t + + + + + +

4. Weiiere Lrntersuchungen uber die Fallungsopiima fiir uer- schiedene Albuminfraktionen.

Zuni Schluss habe ich urn meine Ergebnisse durch noch eine Serie Untersuchungen zu erharten, folgendermassen verfahren.

4.55 4.82 5.03

+ + + + + + + + + + + + + + + (+) (+) (+)

( + I + + + + (+) + ( + I -

Versuch N:o 34.

Urosster Apparat. Zwischenfliissigkeit: Menschenserum. Seitenfliissigkeit: physiologische

Kochsalzldsung. Spannung 80 Volt. Abbruch des Stromes nach 20 Stunden. Anodenspiegel bei 6 . Schichtweisses Abpipettieren an der Anode bis 3. Das reine Albumin wurde in einer Serie Pufferlosungen gefallt, wobei folgende Ergebnisse gewonnen wurde.

f

qL - - - - _

b B E R D E N I S O E L E K T R I S C H E N P U N K T D E S N A T I V E N S E R U M A L B U M I N S . 545 Von dern reinen Albumin wurde 2 crns rnit 4 cms P u f f e r h u n g

von pH 4,447 gernischt und in einem kleineren Apparat wahrend einer Stunde kataphoretisiert. An der Anode und an der Kathode wurde die Seitenfliissigkeit abpipettiert bis 3 rnrn. oberhalb der 0-Linie. Fallungs- versuche wie oben.

Seitenfliissigkeit an der Anode.

+ +

+

+ + + + + + + ( + I + + +

+ + 4- + + +

( + I

--

-

- - - -- -

Nach der Abpipettierung an der Anode in dem grossen Apparat wurde der Strorn wieder geschlossen. Nach ungefahr 20 Stunden wurde der Strorn wieder unterbrochen und das reine Albumin an der Anode wieder abpipet- tiert. Die Abpipettierung wurde diesrnal bis an die 0-linie fortgesetzt rim auf diese Weise so vie1 wie rnoglich von den schneller wandernden Eiweissfraktionen wegzuschaffen.

Das reine Albumin wurde wieder in einer Serie Pufferlasungen gefallt, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:

Nach der Abpipettierung wurde Seitenfliissigkeit zugegossen, und danach dcr Strorn wieder geschlossen. Nach einer neuen Kataphoretisie- rring whhrend ungefahr 24 Stunden wurde der Strorn wieder unterbrochen.

546 E S K I L K Y L I N .

und das reine Albumin wieder abpipettiert. Auch diesmal wurde die1 Abpipettierung bis an die 0-Linie fortgesetzt. Das Albumin wurde wieder in Pufferlosungen gefallt.

pH 3.25 I +

3.55 3.92 4.05 4.38 4.62 4.80 4.89 5.10 5.32 5.53 5.93 6.15 l l I I I I I I I _ + + + + + + + + ( + ) - - -

( + ) + + + + + + (t) + + + +

(+) 4- + Zum vierten Ma1 wurde das Serum kataphoretisiert und das reinc

FBllung wie in den fruheren Portionen in einer Albumin abpipettiert. Serie Pufferlosungen.

(+) + + + + (-I) + + +

+ + (+) +

+ + + + + ( + ) - -

+ + + + + (+)

Zum funften Ma1 wurde kataphoretisiert, das Albumin abpipettiert, und in Pufferlosungen gefallt.

1.62

+

(+) + + + (+) + +

4.8C

+ + + + + +

+ + (+)

+ (+) _ -

Eine Portion von dem reinen Albumin aus der fiinften Abpipettierung wurde mit einer Pufferlosung von pH 4,447 gemischt (2 cms Alb + 4 cms Pufferlosung) die Mischung in einem kleineren Apparat, kataphoretisiert und nachher die Seitenflussigkeit teils an der Anode und teils an der Kathode abpipettiert. Fallungen in Pufferlosungen wie fruhrr erwlhnt ist.

L B E R D E N I S O E L E K T R I S C H E N P U N K T DES N A T I V E N S E R U M A L B U M I N S . 547

(+) I + 4- + + + + + ( - I - ) - - - - + -c + + + +

(+) + + (+) -t

Seilenfliissigkeil an der Kalhode.

pH 3.25 3.55 3.92 4.05 4.38 4.62 4.80 4.89 5.10 5.32 I I I I I / / I l l - (+) + + + + I + + + (+)

+ + + + + ( + ) + + + +

( f ) +

5.53 5.93 6.15 1 1 - - -

AL~S dieser Serie Untersucliungen finden wir, dass das Fallungs- optimum in der ersten Albuminportion bei p H 3.92 lag. In der zweiten Portion lag das Fallungsoptimuni bei pH 3.92--4.059. In der dritten bei pH 4.38--4.62, in der vierten bei p H 4.62 und hci der funften Abpipettierung gleichfalls bei 4.62. J.s ist also deutlich, dass in den sputer erhallenen Portionen das Falliingsoptimum bei hoherem p h lag als bei den zuersl erhallenen Albuminportionen.

Zusammenstellung der Ergebnisse.

Weiin wir nun die Resultate betrachten, die unsere Unter- suchungeii erbracht haben, so konnen wir zunachst feststellen, dass es ini menschlichenl Blutserum verschiedene Albuminfraktioneii gibt, die einen verschiedenen isoelektrischen Punkt besitzen. In den Albuminfraktionen, die sich am leichtesten durch Entmischung im elektrischen Felde gewinnen lassen, d. h. die Fraktionen, die durch Abpipettieren nach dem ersten oder zweiten Katapho- retisieren erhalteii werden, liegt der isoelektrische Punkt niedrig. Durch weiteres Kataphoretisieren lassen sich iieue Albumin- fraktionen mit einem Iioheren isoelektrischen Punkt gewinnen.

548 ESKIL K Y L I N .

Diese letzten Albuniinfraktionen, deren isoelektrischer Punkt hoch liegt, konnen nur rnit einer gewissen Schwierigkeit durch Entmischung im elektrischen Felde gewonnen werden. Der iso- elektrische Punkt dieser Albuminfraktionen lie@ namlich bei oder sogar etwas uber den isoelektrischen Punkt gewisser Globulin- fraktionen, den ich zusammen rnit meinem Mitarbeiter Paulsen feststellen konnte. Ihre Wanderungsgeschwindigkeit im elektri- schen Felde war also ebenso gering oder sogar geringer als die der am schnellsten Globulinfraktionen.

Wie ich durch eiiien Versuch zeigen konnte, kann man jedoch durch eine besondere Methode auch diese Albuimne rnit einem hbherem isoelektrischem Punkt gewinnen. Wenn man nach einer erstrn Kataphorese alles Eiweiss iiber der 0-Linie abpipettiert, schafft man einen Teil der am schnellsten wandernden Albumine und Globuline fort. Nach wiederholten Kataphoresen rnit Ab- pipettieren oberhalh der 0-Ihie , bleiben nur die langsani wan- defnden Albumine und Globuline in der Zwischenfliissigkeit zuriick. Durch abermalige Kataphorese gliickte es mir, aus dieseni Serurn- rest diese am langsamsten wandernden AlbiimiDe zu gewinnen, deren isoclektrischer Punkt nahe pH 6 liegt.

Man konnte eventuell versucht sein, anzunehmen, dass diese Albumine rnit hohem isoelektrischen Punkt durch die langdauernde Einwirkung des elektrischen Stromes oder auf andere Weise erst cntstanden. Um diese Moglichkeit auszuschliessen, liess ich frisch geworinenes Serum bei pH 5.9 kataphoretisieren und konnte zeigen, dass auch hierbei ein Albumin gefunden wurde, da; zur Kathodc wanderte, also auch bei diesern pW positiv geladen war.

Versuch 4 6 .

Mittelfliissigkeit 1/4 Serum + 3/4 Phosphatpuffer pH 5.9. Seitenfliissigkeit: Phosphatpuffer bei demselben pH

Beginn 161° Spannung 170 Volt Schluss 1816 B n n

Die Seitenflussigkeit wurde bis ungefahr 5 mm oberhalb der 0-Linie abpipettiert und zwar sowohl an der Kathodenseite wie an der Anoden- seite. An der Kathodenseite war reichlich Ulobulin vorhanden. Das Ulobulin wurde mit Ammonsulfatlosung bis Halbsattigung ausgefallt. Die Fallung wurde abfiltriert. In dem Filtrat war Albumin deutlich vorhanden wenn auch nur wenig.

Bei einem folgendem Versuch, in dem Serum bei pH 6.0 kataphorrfi- siert wurde, wanderte kein Albumin kathodenwiirts.

1 B E R D E N I S O E L E K T R I S C H E N P U N K T D E S N A T I V E N S E R U M A L B U M I N S . 549

Durch meine Untersuchungen ist also festgestellt, dass das reine liative Serumalbumin heim Menschen aus einer Reihe ver- schiedener Fraktionen bestelit. deren isoelektrischer Punkt ungefahr zwischen den Werten 4 4 liegt.

Ein anderes Untersuchungsresultat von grossem Wert ist, dass es mir gelang, festzustellen, dass die schneller wandernden Albuniine den niedrigeren isoelektrischen Punkt haben. Das war ja eigentlicli riichts anderes als wir erwarteten. Die Wanderungsgeschwindig- keit eiiies Stoffes im elektrisclien Feld beruht auf dem Abstand zwischen sciiiem isoelektrischen Punkt und dem aktuellen pH. Eiii solches Verhalten ist auf verschiedene Weise bewiesen worden.

So konnte ich zeigen, dass bei wiederholten Kataphoresen niit folgendem Abpipettieren, das Fallungsoptimuni. der ethaltenen Albuminfraktionen sich in der Weise verschob, dass die zuerst abpipettierten Fraktionen bei einem niedrigeren, die zuletzt ab- pipettierten bei einen hoheren pH ihre Fallungsoptima haben.

Teils konnte ich zeigen, dass in reinem, bei einem p H uni unge- fahr 7 dem elektrischen Stroni im Kataphoreseapparat ausge- setzten Albumine das Fallungsoptimum fur die anodenwarts iiber die O-Linie wandernden Albuminfraktionen niedriger liegt, als fur die an der Kathoden-O-Linie zuriickbleibcnden.

Dieses Faktum, dass man durch Kataphorese verschiedene Albuminfraktionen mit verscliiedenen physikocheniischen E*g 4 1 en- schaften isolieren kann, habe ich schon fruher festgestellt, in dem icli zeigte, dass verschiedene Albuminfraktionen ein verschiedenes Vermogen besitzen, gewisse Farbstoffe zu binden, wie Naphtol- gelb S und Eosin. Die am schnellsten wandernden Albuminfraktio- lien hatten ein starkeres Verniogen dieser Art als die langsanicr wandernden.

Ein drittes Kesultat von Interesse betrifft die Fallungsoptima einer Mischung verschiedener Albuminfraktionen. Bei eineni Ver- such, wobri ich als Material eine Mischung von Albuminen RUS

rnehrfacher Kataphoretisierung anwandte, fand ich ein Fallungs- optimum bei ungefahr pH 4.7. Dieses Resultat stimnit gut iiberein Init den bisherigen Angaben iiber den isoelektrischen Punkt des Albumins, der mit ungefahr 4 .7 -4 .9 angeben wird. Bei der Kata- phorese dieser Albuminmischung bei pH 4.6 erhielten wir indessen zwei Fraktionen, von drnen die eine zur Anode, die andere zu Kathode wanderte. In der anodenwarts wandernden Fraktiori

550 E S K I L K Y L I N .

lag das Fallurigsoptimum bei pH 4.0, in den kathodenwarts wan- deniden bei pH 5.5. Prinzipiell gesehen wurde der Versuch wieder- liolt, wobei jedoch eiriige Details in der Untersuchurigstcchnik gcandert werden. Standig ergab sich in Prinzip das gleiche Re- sultat. Das Fallungsop timum fur verschiedene reine Albumin- fraktionen das menschlichen Serums liegt bei verschiedenem pH und seine Lage ist ahlitingig von der Zusammensetzung der Albu- minmiscliung. .Je mehr von den schnell wandernden Albumin sich in dcr Losung finden, bei desto riiedrigerem pH liegt das Fallungsoptimum.

Zusammenfassung.

1) In dem reinen rnenschlichen Nativalbumin gibt es cine Reihe verschiedener Fraktionen mit gcsondertem isoelektrischen Pu nkt .

2) Der isoelektrische Punkt fur diese verschiedenen Albu- minfr2ktioiieii liegt zwischen den ungefiihren Grenzwerten pH -1 und pH 6.

3) Die im elektrischen Feld schneller wandernden Albumin- fraktioiien haben einen niedrigen isoelektrischen Punkt als die langsamer wandernden.

Litteratur.

Bunnhold: Erg. inn. Med. Bd. 42. Gronwall: Kungl. Fysiogr. sallsk. i Lund Forh. 5 . 13. 1935. Gronwall: Naunyn-Schmiedebergs Arch. Bd. 175. Kylin: Naunyn-Schmiedebergs Arch. Bd. 175. Kylin-Paulsen: Acln med. scand. Im Druck. Pauli-Walko: Kolloidchemie d w Eiweiss- korper. Steinkopf Dresden 1933.