ZeitschriR ffir Krebsforschung 63, 263--268 (1960)

Aus dem Tuberkulose-Forschungsinstitut Berlin-Buch (Direktor: Dr. reed. P. STEINBRUCK)

0ber die Beeinflussung yon Ehrlichschem Ascitescarcinom der Maus (lurch Isonicotins~iurehydrazid

Von

D. SIEGEL u n d H. IWAINSKY

Mit 2 Textabbildungen

(Eingegangen am 10. Juli 1959)

Ffir ein Medikament, das wie das Isonicotins/iurehydrazid (INH) fiber Monate, oft sogar fiber Jahre hinaus in relativ hohen Dosen verabreicht wird, ist die Frage nach der Wirkung auf sich entwickelnde oder im maximalen Wachs tum befind- liche bSsartige Tumoren ebenso bedeutungsvoll wie die Prfifung auf eine mSgliche earcinogene Wirksamkeit . Beide Fragestel lungen kSnnen gegenwgrtig yon kli- nischer SeRe naturgemiil~ nur mit Einschrs beantwor te t werden. Ange- siehts der weiten Verbreitung der INH-Behand lung darf jedoch angenommen werden, dai~ ihre Gefahren bei der fiblichen Dosierung aui3erordentlich gering sind. Andersart ige Meinungen sind bisher sehr seRen ge~ul~ert worden.

So fanden z.B. I-IE~N und ST]~FA:~ bei einem Tuberkulosekranken, der naeh 10j~ihriger Lungentuberkulose mit insgesamt 126tggiger Rimifonbehandlung verstarb, adenomartige hyperplastische I-Ierde in der Lunge und deuteten diese Ver~nderungen als Folge chemothera- peutischer Behandlung. BERE~CSI und Mitarbeiter (1) beschrieben einen Fall yon Lungen- krebs, der bis kurz vor dem Tode des Patienten fiir eine Tuberkulose gehalten und dementspre- chend mit grSl~eren Mengen yon INH behandelt wurde. Wegen der ausgedehnten Metasta- sierung wurde an einen fSrdernden Effekt des INI-I gedacht. In experimentellen Versuchen fanden Ju]~Xsz, BAL5 und K~D~,Y bei der Priifung eines ungarisehen Prgparates in 30 % der Fi~lle bei M~usen eine geschwulsterzeugende Wirkung. HACX~A~ und HECXT konnten da- gegen mit Neoteben (Bayer) einen solchen Effekt nieht beobachten. Am ]~rown-Pearce-Tumor des Kaninchens erhoben TIBOLDI und Mitarbeiter einen ghnlichen Befund. Bei peroraler Ver- abreiehung yon 10 nag INH/kg zeigten sich in der Zahl der Mitosen keine Unterschiede zu den KontrolRieren. Zahl und GrSl~e der Metastasen stiegen dagegen an. Als Ursache fiir diese Steigerung wurde eine Vergnderung der l%eaktionen des Wirtsorganismus angenommen. BERESCSI und Mitarbeiter (2) konnten einen Einflul~ des INI-I auf das experimentelle Teer- Carcinom beim Kaninchen nicht feststellen.

Wegen der praktischen und theoret ischen Bedeutung dieser Fragen erscheinen weitere Untersuchungen fiber die Wirkung des I N H auf die Entwicklung bSs- artiger Tumoren durchaus gerechtfertigt. Wertvolle Aussagem6glichkeiten ffir die Wechselwirkung zwischen I N H und Makroorganismus und u . U . sogar ffir die Wirkungsweise des I N H sind zu erwarten. Als Untersuchungsobjekt erscheint das Ehrlichsche Ascitescarcinom der Maus sehr geeignet, da das methodische Vorgehen durch seine Besonderhei ten aul]erordentlich erleichtert wird.

Durch]i~hrung der Versuche Im einzelnen wurden untersucht: 1. der Einflul~ der INH-Dosis (0,1; 0,8; 1,0 uud 1,6 mg pro Tier und Tag), 2. der Einflu~ der Applikationsart (oral, subeutan und intraperitoneal bei einer INH-

Dosis yon 1,6 nag),

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264 D. S~E~EL und H. IWAINSKY:

3. der Einflul3 der Zeitdifferenz zwisehen Transplantation und INH-Verabreiehung (INH- Dosis 1,6 rag).

Transplantation des Tumors1: Fiir die Versuche wurden gesunde Albinom~use beiderlei Gesehleehts im Gewieht yon 17--24 g herangezogen. Die tumortragende Maus wurde dutch Genicksehlag get5tet, das Fell der Bauehseite jodiert. Mit den iiblichen Sektionssehnitten wurde das Peritoneum aseptisch ffeigelegt und mit Hilfe einer sterilen Spritze der Aseites abges~ugt. Nach entspreehender Verdiinnung (1:5) mit physiologiseher KochsalzlSsung wur- den yon dieser Suspension jeweils 0,5 ml pro Maus naeh Jodierung der Einstiehstelle intra- peritoneal transplantiert. Vor jeder Injektion wurde die Aseitessuspension griindlieh umge- schiittelt, um eine weitgehend gleiehm~13ige Verteilung der Zellen zu gew~hrleisten.

Verabreichung des INH: INH-,,Leuna" wurde in Reinsubstanz (Fp 1770 C) verwendet. Die verschiedenen LSsungen wurden so angesetzt, d~l~ die zu verabreichende Menge in 0,5 ml entha]ten war. Die LSsungen wurden im Eisschrank aufbewahrt, vor Gebraueh auf K6rper- temperatur gebraeht und dureh ein Bakterienfilter (Sehott nnd Gen., Jena) steril filtriert.

Die Dosierung bei der oralen Apptikationsweise war nieht exakt. Es war uns teehniseh und personell nicht m5glich, mit Hilfe einer Sehlundsonde jedem Tier eine definierte Dosis einzuverleiben. Die IlqH-Menge wurde daher fiir jeweils fiinf Tiere in einem gemeinsamen SaugrShrchen mit einer konstanten, in jedem Fall verbrauehten Milehmenge gemischt. Der dadurch entstehende Unsieherheitsfaktor hinsichtlieh der yon jedem Tier aufgenommenen INH-Menge mul~te in Kauf genommen werden.

Zur Beurteilung fiir einen cytostatisehen Effekt wurden als Kriterien herangezogen : 1. Gewichtszunahme der Tiere, 2. Milliliter gebildeter Aseites, 3. Zellvolumen in diesem Ascites, 4. Trypanblauf~rbung der Aseiteszellen naeh HAAG~ und SEEGER, 5. Uberlebenszeit der Tiere, 6. Angehh~ufigkeit der Tumoren. Zur Frage der iKitosenhs (Anf~rbung naeh FEULa]~N) k5nnen keine Aussagen ge-

macl~t werden, da bei der gewahlteu Versuchsdauer das Maximum tier lVfitosenh~ufigkeit bereits [iberschritten ist.

Der Untersuchungsgang war wie folgt: Am 13. Tag nach der Transplantation wurden die Tiere dm'eh Geniekschlag get6tet, der Ascites mittels Recordspritze nach Freilegung des Peritoneums quantitativ abpunktiert und sein Volumen bestimmt. Von jeweils 0,5 ml des durch griindliches Umsehiitteln gleichmgl]ig suspendierten Ascites wurde das Zellvolumen mit Hilfe' yon HgmstokrRr6hrchen bestimmt (3000 U/rain, 15 rain Laufzeit). Die Suspension wurde weiter zur Differenzierung abgestorbener und lebender Tumorzellen mit Hilfe der Try- panblaufgrbung herangezogen. Naeh HAAG~ und S]~.o]~g nehmen nur tote Zellen den Farb- stoff auf, w~hrend lebende ungefi~rbt bleiben. Uberlebenszeit und AngehhSufigkeit muBten naturgemi~B in besonderen Versuchsreihen untersucht werden.

Fiir die statistisehe Bewertung der Ergebnisse wurde folgende GrSBe ermittelt: 1

s 2 - - IF, ( x l - - 2 )z _[_ F, (Yl - - ~ ) 2 ] . n q - m - - 2 Mit Hilfe des t-Testes wurde auf Signifikanz geprii~t:

t = x---Y �9 | / n . m w

Die Zahl der Freiheitsgrade ergibt sich dabei naeh / -- n -~- m--2.

~Ergebnisse

Als maximal zu verabreichende Dosis wurde die etwa einer ha lben LD 50 bei in t raper i tonealer Verabreiohung entsprechende Menge yon 1,6 mg INH/Tie r ge-

l Herrn Dr. H. BIELK.~, DAdW, Institut fiir Medizin und Biologie, Berlin-Buch, Arbeits- bereich Biologisehe Krebsforsehnng (Direktor: Prof. Dr. A. GRAF•I) sind wit fiir die ~)berlas- sung yon Ehrliohsehem Ascitescareinom und fiir wertvo]le Ratsohlage sehr zu Dank verpfliohtet.

Ober die Beeinflussung yon Ehrlichschem Ascitescarciztom 265

wghlt. Die weiteren Abstufungen waren 1,0 nag, 0,8 mg und 0,1 mg/Tier. Der Beginn der INH-Injektion wurde ungef/~hr auf den 6.--10. Tag nach der Trans- plantation gelegt. Zu diesem Zeitpunkt mani- festierte sieh in der Regel das Angehen des Tumors dureh ei- nen dentliehen Anstieg des KSrpergewiehtes der Tiere. Die Ergebnisse der entsprechenden Ver- suchsreihen sind in Ta- belle 1 wiedergegeben. Eindeutige Untersehiede zu den entspreehenden Kontrolltieren waren nieht testzustellen.

Auch beim Weehsel der Applikationsart (tag- ]iehe Verabreichung von ],6 mg INH/Tier subcu- tan, intraperitoneal und

Tubelle 1. Ein/lu/3 der INH-Dosis au/ dab Wachstum von Ehrlichs

INtI-Dosis Applika- (mg/Tier) tionsart

0,1 i.p. tgl. 0,8 i.p. tgL 1,0 i.p. tgL 1,6 i.p. tgl.

~hem Ascitescarcinom der Mau~

Go- ZeI1- wichts- Ascites volu-

ZllIlahl:flo ]3]O]~

g ml ml

12,0 10,1 2,9 14,2 10,3 2,3 11,5 9,5 3,0 13,0 11,0 3,4 11,4 10,0 3,1

Trypan- blau-

f~rbung %

13 13

Zahl 4er

Tiere

18 9 7

12 6

Tabelle 2. Ein/lufi der Applikationsart des I N H au] das Wachs- turn von Ehrlichschem Ascitescarcinom der Maus

INtt-Dosis Applika- (mg/Tier) tionsart

1,6 oral tgl. 1,6 s.c. tgl. 1,6 i.p. tgl

e e - wiehfss- Asc i t es

z ~ a h m e

g ml

8,8 8,5 16,1 11,9 13,1 11,0 14,1 10,7

Zell- v o l u - m e n

2,46 2,72 2,88 2,14

Trypan- blau-

fiir~/ng

16 12

Z a h l d e r

T i e r e

7 8

12 38

oral) waren die Ergebnisse unter Beriicksiehtigung der biologisehen Streubreite ohne signifikante Unterschiede (vgl. Tabelle 2).

Ein angesiehts der aus Tabelle 1 und 2 nieht zu erwartender Effekt zeigte sieh bei den Iolgenden Versuehsreihen. Hier wurde die Zeitspanne zwisehen Transplan- tation und INH-Verabreichung vari- iert. Die INH-Dosis betrug wieder 1,6 rag/Tier. Es wurde subeutan un- ter die t~iiekenhaut injiziert. Beider Versuehsreihe a wurde INH bereits seit dem 8. Tag vor der Transplan- tation injiziert. Beginn der INH- Verabreichung und Transplantation erfolgten bei der Versuehsreihe b am gleichen Tag. Be ide r Versuehsreihe c setzte die INH-Behand]ung erst 6 Tage nach der Transplantation ein. Die Ergebnisse sind in Abb. 1 und Tabelle 3 dargestellt.

W/~hrend sieh bei den Reihen b u n d e kein Untersehied zu der ent- spreehenden Kontrollreihe ergab,

g

@

o

o o

o o

o

s

s co

oo �9 o �9

o $ $$ c~

cc~ ~ --- "~ "Z �9

O Z q 6 8 70 72 /4 ~ ~ge nach fPan~oZ/anta//an

Abb. 1. Einflu2 der INIt-Vorbehandlung auf das Wachstum yon Ehrlichschem Asoitescarcinom. O I~on- trollg1"uppe. �9 INII-Verabreichung seit dem 8. Tag Yor Transplantation, u a (Gewichts~inde- rung Yore Tage 4or Transplantation als Kriterium fiir

das Wachstum des Carcinoms)

zeigte sich be ide r Versuchsreihe a in allen vier untersuchten Merkmalen eine zu den entsprechenden Kontrollwerten signifikante Differenz im Sinne einer Waehs- tnmsverzSgerung.

19"

266 D. SIEOEL und H. IWAINSKY:

Tabelle 3. Ein/lu[3 der Zeitspanne zwischen Transplantation und INH-Verabreichung au] das Wachstum yon Ehrlichschem Ascitescarcinom der Maus

Versnchs- I N N - Gewich t s - ,, Zell- Trypanblau- Zah l reihe Dosier tmg Appl ika- Asoites vo lumen i~.rbung der

t ionsar t zunahme mI ml Tiere m g g %

s.c. tgl. 5,0 4,5 1,37 3 9 s.c. tgl. 11,3 8,6 2,68 5 14 s.c. tgl. 16,1 11,9 2,72 7 8

- - 12,0 9,8 2,64 6 15

statistische Sicherung P a/Kontrollgruppe p < 0,00I < 0,001 p < 0,001 p < 0,01

Tabelle 4. Ein/lufl der Zeitspanne zwischen Tra~splantation und INH-Behandlung au] die AngehMiu]igkeit yon Ehrlichschem Ascitescaricnom der Maus

a 1,6 b 1,6 c 1,6

Kontroll- gruppe . -- .

Versuchsgruppe

d) INH-Gabe 6 Tage nach Transplantation (Dosisabh~ngigkeit)

e) INH-Gabe 6 Tage nach Transplantation (Abh~ngigkei~ yon Applikationsform)

f) INH-Gabe 8 Tage vor Transplantation

g) INtt-Gabe und Trans- plantation gleichzeitig

INH-Dos i s mg

0,1 0,8 1,0 1,6

Kontrollen

1,6 1,6

Kontrollen

1,6 Kontrollen

1,6 Kon~rollen

Appli- kat ions-

a r t

1. p . 1. p . 1.p. 1. p.

S.C. 9ral

8. C.

Tumor nieht an- gegangen (Z~hl der

Tiere)

11 3

i 2

Zahl der

Tiere (Ge-

s ~m t )

20 20 20 20 79

20 20 40

19 19

21 17

Die g M c h e n Unterseh iede deu t en sich auch bei den Versuehsreihen fiber die An- gehhguf igkei t der Tumoren an. Die Ergebnisse s ind in Tabel]e r zusammengefM~t.

~TZ

~ q B 8 70 7Z 7q 78 78 ZOZ2Z t/ TaS, e

Abb. 2.1~Tberlebenszeit der Tiere nach Transplan- tation yon Etu, lichschem Ascitesearcinom und gleichzeitiger subcutaner INH-Verabreichung

(1,6 mg INH/Tier und Tag)

Wiede r zeigt sieh bei den Re ihen d, e und g ke in Unte r seh ied zu den entspre- ehenden Kont ro l lg ruppen . Bei der g e i h e f i s t dagegen eine deut l iehe Dif/erenz zu den en t spreehenden Kont ro l l en festzu- stellen. Bei de r s ta t i s t i schen Sicherung erg ib t sieh, daft de r Unte r seh ied zu e twa 68% ree]l ist .

Um die ursprf ingl iche Frages te l lung wel ter kl/~ren zu k6nnen, wurde die lJber- lebensze i t der Tiere e rmi t te l t . Diese Gr6ft e s te l l t bekann t l i ch eines der wicht igs ten Kr i t e r i en ffir d ie Beur te i lung der Wirk- s amke i t einer eare inolyt isehen Subs tanz dar. Obwoh] im al lgemeinen die Zahl

der hierfiir ve rwende ten Tiere m6gl ichst groft sein soll, erschien angesichts der bisher e rha l tenen nega t iven Ergebnisse (vgl. Tabel le 1- -4) eine E inschrankung

~ber die Beeinflussung von Ehrlichsehem Aseitesearcinom 267

der Tierzahl vertretbar. Abb. 2 zeigt die Ergebnisse der entsprechenden Ver- suchsreihen. Demnach sind keine wesentlichen Unterschiede an der ~berlebens- zeit der einzelncn Versuchsgruppen festzustellen.

Die Verh//ltnisse bei einer INH-Vorbehandlung bediirfen noch weiterer K1/i- rung. Entsprechende Versuche sind bereits eingeleitet.

A uswertung der Ergebnisse

Weder bei Variation der INH-Dosis noch bei Wechsel der Applikationsart zeigt sich bei kurativer Verabreichung ein EinfluB des INH auf das Wachstum von Ehr]ichschem Ascitestumor. Die Uberlebenszeit der mit INIt behandelten M~use ist im Vergleich zu den unbehandelten Tieren nicht wesentlich unterschied- lieh. Bei der Beurteilung des Kurvenverlaufs (Abb. 2) ist die toxikologische Be- lastung durch die relativ hohe INH-Dosis mit zu berficksichtigen. Damit werden praktisch die experimentellen Ergebnisse yon BEI~ENCSI und Mitarbeiter (2) be- sts die keine Beeinflussung des Teer-Carcinoms durch INH feststellten.

Bei prophylaktischer Verabreichung 1/~Bt sich dagegen eine signifikante Beein- flussung im Sinne einer Wachstumshemmung des Ascitestumors nachweisen. Da- mit ergeben sich zu der yon HELLRIEGELund KttAUS nachgewiesenen cytostatischen Wirkung des INH bemerkenswerte Parallelen. Die Ursaehe dieses anscheinend aul prophylaktische Verabreichung beschr//nkten Effektes muB in weiteren Unter- suchungen gekl/~rt werden.

Zusammenfassung Der Einflug yon Isonicotins~urehydrazid auf das Ehrlichsche Ascitescarcinom

der ~aus wird unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Setzt die INH-Be- handlung bei oder nach der Transplantation ein, dann zeigt sich bei einem Ver- gleich mit den entsprechenden Kontrollgruppen kein Unterschied. Bei prophylak- tischer Verabreichung des INI-I ist ein signifikanter EinfluB im Sinne einer Waehs- tumshemmung festzustellen.

Summary The effect of isonicotinic acid hydrazide (INH)on the Ehrlich ascites carcinoma

of the mouse was studied under varying conditions. When the INH therapy was given during or after the tumor transplantation, then no differences from the con- trols were observed. With a prophylactic administration ot INH a significant effect was demonstrable in the sense of an inhibition of growth.

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:Dr. D. SI~O~L und Dr. I t . Iw~Ns~::~, Tuberkulose-Forsehungsinst i tut Berlin-Buch