IS1 TO3 in Mo//l- Bild 1 Ermittlung dcr Rcnlttionsgeschwindigkeiten in Abli~ngigkeit von stratkonzcntration nnd dem pH-Wert. Ansata: 2 ml Univcrsalpuffcr nach Britton und Robinson + 1 nil + 1 ml Naiskeimhomogenat (EW = 77,l pg/ml): Inkub~rtion 2 5 T ; - 1 ml 40%ige ( U J / V ) Triehlorcssigsiiurr

der Sob-

Substrat 00 min,

[Sl.103 in MOM- Bild 2 araphiaohe Ermittlung der thcorctischen MaximalgeschWindigkeit und der Michaelis-Konstante in Abhangigkcit vom pH-Wcrt nach einer Modifika- tion dcr Mcthode yon Lineweaver und Rurk [7] nnter Verwendung der in Bild 1 damestellten Ergcbnisse

Bild 3 Graphisehe Ermittlung der Sttichio- metric der Reaktion zwischen Enzym und Substrat nach Hofmann und G4intherberg. Ansata: 2 ml Borsilurepuffer, pH 9,4, + 1 ml Substrat + 1 ml Maiskeim- homogenat;Inkubation30min, 37°C; + 1 ml 40%ige (w /v ) Trichlorcsslg- sllurc. Anstieg tg a = 1,08

AUS diesen Tatsachen liiBt sich fur die Spaltung von ~ - A l a - PAP-amid durch proteolytische Enzyme der Maiskeimhomo- genate vorerst eine Zwei-Schritt-Reaktion im Sinne des Michaelis-Henten-Schemas postulieren, also mit der mutmal3- lichen Bildung einer Enzym-Substrat-Zwischenverbindung, deren Zerfall in Enzym und Spaltprodukte die Geschwindig- keit der Gesamtreaktion bestimmt. Es gilt die Bedingung k3 4 k,, k,. Denientsprechend ist die Michaelis-Konstante die Gleichgewichtskonstante des Arrheniusschen Zwischen- komplexes. Ihr niedriger Wert spricht fur eine groBe Affinitiit zwischen Enzym und Substrat. Die Geschwindigkeitskon- stanten k, fur den Bereich der Reaktion nullter Ordnung, also rnit der Voraussetzung der SubstratsLttigung des En- zyms, Bind faktisch rnit den ermittelten theoretischen Maxi- malgeschwindigkeiten identisch. Die Werte dieser Spaltungsgeschwindigkeit von L-Ala-PAP- amid entsprechen groBenordnungsmlBig denjenigen, die Ha- segawa [6] fur Naphthylamidasen (Substrate Aminosiiure-j3- naphthylamide) aus Weizenkeimlingen ermittelte. In der Michaelis-Menten-Gleichung (1) wird ein molarer Um- satz von 1: 1 zwischen Enzym und Substrat vorausgesetzt. GemiiB der Auflosung der Michaelis-Menten-Funktion nach

Hofmnn und aiintherberg [8] wurde mit lg - - = f ( - 1g [S]) die Stochiometrie n der Zwischenkomplexbil- dung aus Enzym und substrat ermittelt (Bild 3). Mit dem Anstieg von tg (Y = 1,08 ist n = 1. Damit wird der Enzym-Substrat-Komplex aus je einem Molekul Enzym und Substrat gebildet, SO daB fur die durch das proteolytische Enzymsystem der Maiskeimhomogenate katalysierte Hydro- iyse von L-Ala-PAP-amid bezuglich der Zwischenkomplex- bildung das einfache Nichaelis-Menten-Schema (1) gilt.

Lltcratur

c

[ I ] Barth, 8.. Hoffmann, K.-H., u. I . Pilch: Acta biol. med. german. 16,

[2] Barth, A . , Hoffmann, K.-H., U. I . Pilch: Biol. Zhl., im Druck. [31 MiChadis, L., u. M . L. Menten: Biochem. Z. 49,333 (1913). [4] HaZdane, J. S . B. , u. X. (7. Stem: Allgcmeine Chcmie der Enzyme,

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A. Barth und K.-H. Hoffmann, Institut fur Naturwissen- schaften der Hochschule fur Landwirtschaft Bernburg, Bern- burg (Saale).

ZCM 1738 Eingegangen am 26. August 1966

575 (1966).

(1964).

uber die BesMmmung des Wassergehaltos von Carbonylverbindungon mit &rl-Fischer-Liisung Die direkte Titration des Wassers nach Karl Fischer ist in Gegenwart sehr vieler Carbonylverbindungen nicht moglich, da diese mehr oder weniger schnell mit dem Methanol der Karl-Fischer-Losung bzw. mit dem ,,Losungsmethanol" un- ter Wasserabspaltung zu Acetalen bzw. Ketalen reagieren und deshalb kein ausreichend stabiler Endpunkt ermittelt werden kann [l]. I n Gegenwart von Aldehyden lLuft auch eine wasserverbrauchende Reaktion, wahrscheinlich die Bil- dung von den Aldehyd-Biaulfit-Anlagerungsverbindungen analonen Produkten rlal eemiil3

Die storenden Nebenreaktionen werden durch Uberfuhrung der Carbonylverbindungen in Cyanhydrine umgangen [23. Diese allgemein anwendbare Methode erfordert aber einen groneren Arbeitsaufwand, SO daB in bestimmten Fiillen modi- fizierte Methoden zur direkten Titration des Wassers in Car- bonylverbindungen vorzuziehen sind. Die beschriebenen Mo- difizierungen sind: 1. Ersatz des LPsungsmethanols durch Pyridin [ l b ] bzw. ein Athylenglykol-Pyridin-Gemisch [3] und

470 2. Cheni., 6. .Jg. ( 1 9 6 6 ) Heft 12

Tabelle 1

Zeit (min) fur Umsats van 1 ml

bei H.0-Gehalt iihcrschtissiger Karl-Fischer-Losung

in mg/inl + 23 "C 0 "C - 1 7 ° C

- Aceton 2,43 4,5 35 5.53 1 11 40

Cyclohexanon 3,47 1 12 40 6,47 0 3 6,s 25

n-Butyraldehyd 12,94 0.5' 9 50 17,94 0,5* 9 50

* Bei diesen Verauchen stieg die Temperatur durch freiwerdcnde Reaktions- warme iiber die Zinunertemperatur van 23°C an.

2. Ersatz des Methanols der Karl-Fischer-Losung durch Me- thylcellosolve [3], [4] oder des groBten Teils durch Pyridin

Mit diesen Abiinderungen sind aber im allgemeinen nur bei einigen Ketonen genugend stabile Endpunkte zu erreichen und der Farbumschlag ist weniger scharf [l], [lb], [5]. Bei Titration rnit der Methylcellosolve enthaltenden Losung wer- den stabile Endpunkte erhalten, jedoch nicht fur aliphatische Aldehyde unter C, [3]. I m Rahmen von Untersuchungen uber die Trocknung von organischen Losungsmitteln mit Molekularsieben haben wir den Wassergehalt von Aceton, Cyclohexanon und n-Butyr- aldehyd mit einer gewohnlichen Karl-Fischer-Losung (Titer 2,6 mg H,O/ml) mit gutem Erfolg bestimmt, indem wir die zu titrierende Probe (den Ketonen wurde Pyridin - 0, l mg H,O/ml - im Volumverhiiltnis 1 : 1 zugesetzt) vor der Titra- tion auf etwa - 40 "C abgekiihlt und notigenfalls durch wie- derholte Abkuhlung wiihrend der Titration Vorsorge getrof- fen haben, daB die Temperatur in der Vorlage -10°C nicht iibersteigt. Der Unischlagspunkt war visuell gut zu erltennen und in allen Fiillen iiber genugend lange Zeit hinweg stabil. Um ein ungefiihres Bild iiber den EinfluB der Temperatur auf die Endpunktstabilitiit zu erhalten, haben wir bei + 23 "C, 0 "C und 17 "C mit 1 ml iibertitriert und die Zeiten bis zum Verbrauch der uberschussigen Karl-Fischer-Liisung durch das bei der Acetal- bzw. Ketalbildung entstehende Wasser ermittelt. Diese in Tab. 1 angegebenen Zeiten liel3en sich na- tiirlich wegen des allmiihlich erfolgenden Farbumschlages nicht sehr genau bestimmen. Aus Tab. 1 ist ohne weiteres zu ersehen, daB unter unseren Titrationsbedingungen und bei normalen Titrationszeiten von etwa 1 Minute die Acetal- bzw. Ketalbildung praktisch ohne EinfluB auf die Analysenergebnisse ist. ubereinstim- mend damit liegen die titrierten Werte bei der Wasserbe- stimmung in Aceton, Cyclohexanon und n-Butyraldehyd im normalen Fehlerbereich von etwa 0,576. Die Titrationen bei Zimmertemperatur ergaben (bei mog- lichst schneller Ausfuhrung nach vorangegangener Festle- gung des ungefiihren Verbrauches) fur den Wassergehalt des Cyclohexanons stets bis zu 3% zu hohe und fur den des n- Butyraldehydes um etwa 4 bis 5% zu niedrige Werte. Nur im Falle des Acetons konnten bei nicht zu hohen Wassergehalten die Bestimmungen auf etwa 1% genau ausgefuhrt werden. Die Genauigkeit, mit cler bei tieferen Temperaturen der Was- sergehalt von n-Butyraldehyd bestimmt werden kann, zeigt, daB unter unseren Titrationsbedingungen auch die oben for- mulierte, wasserverbrauchende Reaktion so langsam verliiuft, daB sie zu keiner Verfiilschung der Analysenergebnisse fiihrt. Es ist anzunehmen, daB durch die vorgeschlagene Modifizie- rung der Titrationsbedingungen die Wasserbestimmung mit der gewohnlichen Karl-Fischer-Losung auch in Gegenwart anderer Ketone und Aldehyde innerhalb des normalen Feh- lerbereichs der Methode moglich ist.

Literatur

111, [51.

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H . Beyer und K . Varga, Zentralforschungsinstitut fur Che- mie der Ungarischen Akademie der Wissenschaften, Buda- pest.

Eingegangen am 22. August 1966 ZCM 1733

B-Chlorvinylaldehyde nach dem Vilsmeier-Prhzip Substituierte p-Chlorvinylaldehyde sind durch ubertragung der Vilsmeier-Reaktion auf Ketone des Typs R-CO-CH, bzw. R-CO-CH,-R leicht zugiinglich geworden [1]-[3]. Eigene Untersuchungen iiber die Reaktivitiit der /3-Chlor- vinylaldehyde veranlaBten uns, neben den bereits beschrie- benen Verbindungen weitere /3-Chlorvinylaldehyde nach die- sem Verfahren herzustellen. p-Chlor-, p-Brom- und p-Methoxyacetophenon, p-Acetyl-bi- phenyl, Desoxybenzoin, Acenaphthenon, Chromanon-(4), Thiochromanon-(4), Tetrahydrobenzoxepinon- (5) und Tetra- hydrobenzothiepinon-( 5) werden durch Vilsmeier-Reagenz in Dimethylformamid oder Trichloriithylen bei unterschiedli- chen Reaktionstemperaturen und -zeiten in die Verbindun- Sen Ia-e und 11-VI ubergefiihrt:

R R'

H

R,/'\CHO C : (P) CH,O-C,H. H d: (P) C&-CJL H

Ia-e e : CeHs CeHs

\ C P a: (p) CI-C,H, II b: (p) Br-C,H, H

Cl CHO

c1 CHO \ / c1

V : X = O IV: x = s VI: x = s

I1 111: x = 0

I a , I b , Ie, 11, V und V I sind stabile kristalline Substanzen. I c , I d , I11 und IV sind weniger bestiindig und miissen unter Tiefkiihlung aufbewahrt werden. I11 und IV weisen aul3er- dem starke haut- und schleimhautreizende Wirkung auf. Die IR-Spektren (KBr-PreBling) zeigen charakteristische Banden

im Bereich 1658 bis 1674 cm-l und fur /C=Okon,~ \

>=c< im Bereich 1584 bis 1592 cm-l.

Die gefundenen Analysenwerte stimmen innerhalb der Feh- lergrenze mit den berechneten Werten iiberein. I-VI sind geeignete Ausgangastoffe fur die Synthese entapre- chend substituierter bzw. kondensierter 1,5-Benzodiazepine (vgl. [4]). Dariiber wird an anderer Stelle ausfuhrlich berich- te t werden.

Experlmontelles

Die priiparative Darstellung der Verbindungen I-VI erfolgt nach zwei unterschiedlichen Methoden, die sich als besonders vorteilhaft erwiesen : Methode A : Zu einer Mischung von 400 mMol DMF und 100 ml Trichloriithylen werden unter Ruhren und Eiskiihlung zuerst 300 mMol POCl,, dann 200 mMol Keton in 100 ml Tri- chloriithylen zugetropft. Die Mischung wird 3 Stunden bei der in Tab. 1 angegebenen Temperatur geruhrt. Unter Kuh- lung hydrolysiert man mit Natriumacetatlosung und extra- hiert die wiiBrige Schicht nach Abtrennung mit Trichlor-

konl.

2. Chem., 6. Jg. (1966) Heft 12 471