Archiv fiir Mikrobiologie 40, 205--211 (1961)

Aus dem Tuberkulose-Forschungsinstitut Berlin-Buch

~ber die Resistenzentwicklung gegeniiber Isonicotinsiiurehydrazid und damit verbundene Stoffwechselveriinderungen bei Mycobacterium smegmatis

Von H. IWAINSKY und W. KAPPLER

Mit 6 Textabbildungen

(Eingegangen am 15. Mai 1961)

Bei Mycobakterien hat die Entwicklung dor INH-Resis~enz 1 sehr deu~licho Vorgnderungen dos Stoffwechsels und des Fermenthaushal~es zur Folge (ICaEIS 1958; MOLLER et al. 1960~, b; WINDER 1960). Die fest- gestellten Un~ersehiedo sind zum Toil sehr betr~iehtlich und spezifiseh. Die darauf aufbauenden diagnostischen Methoden sind yon soiten der Bakteriologie in hervorragender Weise ausgebaut~ worden (]351~IOKE 1957; VISOtlEI~ et al. 1959). Die t~rage der Riickmutation yon Keimen in einer INH-resistenten Mycobakterien-Popula~ion und der INtt-Wirkung auf INH-resistente Keime ist dagegen bisher nur wenig bearbeite~ worden, obwohl diese Problemo fiir die Chemotherapie und -prophylaxe yon grunds~tzlicher Bedeutung sind nnd bei den KIinikern lebhafte Diskus- sionen ausgolSst~ haben. In der vorliegenden Arbeit wird daher versueh~, an Hand yon 1Viodellansii~zen Aufschliisse tiber diese Fragen zu erhalten.

Durchfiihrung der Versuche

]3ekanntlieh sind Stoffweehseluntersuchungen bei Tuberkelbakterien sehr sehwierig und vor allem sehr zeitraubend. Es war daher naheliegend, die Untersuchungen mi~ s~urefesten Saprophyten, bei denen die raschero Generationsfolge gleichsam als Zeitraffer wirkt, durehzuftihren. Fiir die vorliegenden Experimente wurde Mycobacterium smegmatls verwendet. Die Anziich~ung der INI-I-resistenben Population erfolgte dutch 55 Passa- gen auf festen, steigende Dosen INK en~haltenden NghrbSden (I{ohn IV in der Modifikation yon Gottsacker mit 2~ Glycerin).

Als Arbeitsme~hode f'lir die Feststellung der Stoffwechselveri~nderun- gen wurde die bestens eingefiihrte Messung dor Sauerstoffaufnahme nach WAI~BVl~G (vgl. hI~GEL:~II~ 1956) herangezogen. Das proportionalo Ver- halten yon Sauerstoffaufnahme und Bakterieneinsaat bei ruhenden bzw.

1 Isonicotins~urehydrazid ~ INH.

206 H. lw~ms~Y und W. K-~2P~E~:

yon Sauerstoffaufnahme und Zunahme der Bakterienmasso bei sieh ver- mehrenden Bakterien ist durch Bestimmung yon Zellvolumen im II/~ma- tokrit-R6hrehen unter definierten Bedingungen und Bakterientrocken- gewieht sowie dureh Markierung mit 831) hinreichend naehgewiesen worden (IwAINSKY U. MSLLER I960). Durch makroskopische Vergleiche wurde die Zunahme der Bakterienmasse am Ende der Versuche erhartet (vgl. Bl~V~ u. LEBEN 1958).

For tz i ichtung der einzelnen Passagen. Der gegen 3000#g INH/ml resistente Stature wurde ffir die anlaufendert Versnche in unterschiedlicher Weise subkultiviert. Die b~berimpfung eines Teiles der Bakterienpopulation (Stature Bs~) erfolgte abwechselnd auf INH-freien and 3000 #g INH/ml enth~ltenden Nghrb6den (immer Itohn IV mi~ 20/, Glycerin). Der zweite Teil (Stature Bss) wurde nur ant INH-freien NghrbSden gezfichtet, w~hrend der Rest (Stature B~R) fiber Ni~hr- bSden mit steigendem INH-Gehal~ subkultiviert wurde (14 Passagen 4000 l~g INI-I/ml und 28 Passagen 5000/~g INH/ml). Die jewefligen Subkulturen erfolgten im Abstand yon 7 Tagen.

Vorberei tung und I)urchffihrung der Warburgversuche. Im Abstand yon etwa 4 Woehen wurden ffir diese Versuche yon jedem Stature (bei Bse yon einer INH-freien Passage ausgehend) zusgtzlich Kulturen auf INtI-freien NEhr- bSden tiberimpft. Damit war eine Verf~lschung der Ergebnisse durch gegebenen- falls an den Bak~erien haftendes odor aus Ni~hrbodenresten stammendes INH weitgehend ausgesehlossen. Die Vorbereitung fiir die Warburgversuche ist bereits frfiher eingehend beschrieben worden ( Iw~sKu u. K2(VPLEg 1956, 1958). Als Niihrstoff wurden bei den Versuchen mit ruhenden Bakterien Glycerin, n-Propanol, 1,2-Propylenglykol, n-Butanol, BernsteinsEnre und Arabinose eingesetzg. Bei sich vermehrenden Bakterien warden Athanol, n-Propanol, Glycerin un4 Bernstein- s~ure verwendet. Zur Kontrolle der t~esistenzverh~ltnisse erfolg~e mi~ Glycerin Ms Kohlenstoffquelle eine Testung mit INH in Konzentrationen yon 230 #g und 2300 #g/ml. Alle Versuche mit sich vermehrenden Keimen wurden nach der so- genannten ,,Kurzzeit"-Methode durehgefiihrg (KAiF]~LEE 1960).

Ergebnisse Die Versuehe mit ruhenden Bakterien zeigen zuni~ehst die bekannten

Unterschiede in der Substratoxydation (KiieFLEE u. I W ~ S K u 1959). Mit znnehmender Zahl yon Snbkultnren ist bei der Verwendung yon n-Butanol beim Stamm B~2 eine Steigerung der Sauerstoffaufnahme, beim Stature Bss ein Absinken festzustellen. Das gleiche VerhMten 1/~gt sieh auch beim Einsatz yon n-Propanol erkennen, w/~hrend der Zusatz der iibrigen N/~hrstoffe eine signifikante Ver/~nderung nicht zur Folge hat.

Bei sieh vermehrenden Keimen erfolgt generell die Sauerstoffauf- nahme und die Vermehrung der resistenten St/imme langsamer a]s beim sensiblen Vergleichsstamm (3Ii)LLEn et al. 1960a, b; IW~ZNSKY u. K/iEPLE~ 1959). Im Vergleich zum sensiblen Ausgangsstamm (A) sinkt z. B. die Sauerstoffaufnahme des Stammes Bsl~ bei einer Versuchsdauer yon 11 Std auf folgende Werte : N/~hrstoff~thano150o]0, Nghrstoffn-Propanol 330/o, N/ihrstoff Glycerin 36~ und Ni~hrstoff Bernsteins/~ure 46~ Damit hat der Stamm im Vergleieh zu den frfiher ermittelten Werten

2OO %

I00

Resis~enzentwicklung bei ~ycobacterium smegmatis 207

-t-

+ 0

200 %

I00

(IWAINSKu U. KXI~PLER 1959) durch die for~l~ufende Ziichtung ~uf IhTtt- h~ltigen N~hrbSden vor Beginn dieser Versuche eine deutliche Minderung

+

�9 + 4- + 4- 4- +

200 %

4- �9 + 4-

+

+

r L L J ~ ' f , zo ~ i~0 210 eTo ~ 0 ~0 ~0 150 210 2-70

Abb, 1 Abb. 2

Abb. 1. Ver~inderung der Sauerstoffaufnahme im Verlauf der Fortziichtung der Stdmme J~sz und ~RR (N~hrstoff Glycerin, Sauers toffaufnahme des Stamraes .8sR in 11 Std = 100). § + + Sauerstoffauf-

nahme des S tammes ~ss; " " " Sauers~offaufnahme des S tammes ~ R a

Abb .2 . Ver~nderung der Saueqstoffaufnahme im Verlauf der ]Fortziichtu~tg der St~mme .BzX und B~z (~Nahrstoff n-Propanol , Sauers tof faufnahme des S tammes 2 s ~ in 11 S td = 100). + + + Sauerstoff-

au fnahme des S tammes Ass ; " " " Sauers toffaufnahme des S tammes BRR

7o

+

+ + 4- + + + +

+ + + + +

�9 + -k

/00 -+

[ I I [ ' I ! I 30 90 150 210 ~ 270 0 20 ~0 150 210 270

Abb. 3 Abb. 4

Abb. 3. Ver~inderung der Sauerstoffaufnahme im Verlauf der t~ortziichtung der Stdimme Bzs und BRR (N~hrstoff ~ thano l , Sauers tof faufnahme des S tammes /~SR in 11 Std ~ 100). + + § Sauerstoff-

aufnahme des S tammes BSs; �9 �9 �9 Sauers tof f~f fnahme des S tammes ~RR

Abb. 4. Vergnderung der Sauerstoffaufnahme im Verlauf der Fortziichtung der Stgimme Bss und BRR (/7~hrstoff]3ernsteins~iure, Sauers toffaufnahme des Sta~nmes BSR in 11 Std = 100). + § + Sauerstoff-

au fnahme des S tammes ~sS; " " " Sauers tof faufnahme des S~ammes ~RR

der Sauerstoffaufnahme und der Vermehrung bei der Oxyda~ion yon J~thanol und Bernsteins~ure erf~hren.

208 H . I w A r : ~ s K r u n d W . ~PL]~R:

Die bei ruhenden Bak~erien mit zunehmender Zahl der Subkulturen nur sehwer erfal~baren Ver~nderungen sind bei sieh vermehrenden Bakterien wesentlich deutlicher. Wird die im Verlauf der Untersuchungen konstante Sauerstoffaufnahme des S~ammes Bsa gleich 100~ gesetzt, dann steigt mit zunehmender Zahl der Subkulturen die Sauerstoffaufnahme und die

1500 111.m, 3

1000

500 - -

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i i I I O g ~ g 8 0 2 g 8 8 /Oh.

Abb. 5 Abb. 6

Abb. 5. SauerstoffauJnahme laroliferierender Zellen versehiedener Stgmme yon M. smegmatis (34. Passage) (N~hrs tof f Glycerin). a - - , S t a m m A ; . . . . . S t a m m Bss; o - - - -* Stature BsR;

- - - - - - S t a m m B a R

Abb. 6. Beeinflussung der Sauerstoffaufnahme verschiedener Stdmme yon M. smegmatis dutch unter- schiedliche I~H-Dosen (50. Passage). (NAhrstoff Glycerin). * �9 S t a m m A ohne Inh ib i to r ; �9 - - - - � 9 S t a m m A m i t 230 ~g I N H / m l ; . . . . . S t a m m A m i t 2300 ~g I N H / m l ; o - - o - - o S t a m m •RR ohne Inh ib i to r ; o . . . . o S t a m m BR~ mi~ 230 ~g I N H / m l ; o - - - o - - - c Stature BRR m i t

2300 ~g INH/ml

Vermehrung des Stammes Bss bei allen untersuehten ~qghrstoffen, wiihrend beim Stamm Ban das Gegenteil der Fall ist (vgl. Abb. 1--4). Das Wachstum des Stammes BaR wird letzten Endes so weir beeintri~ch- tigt, d~l~ gegen Ende der Versuche eine Weiterziichtung auf festem N~hr- boden Sehwierigkeiten bereitet.

Aus Abb. 5 ist der Verlauf der unterschiedliehen Sauerstoffaufnahme, insbesondere der exponentielle Anstieg am Beispiel eines Versuehes wiedergegeben, da die summarische Wiedergabe der Abb. 1--4 natur- gemi~l~ eine Aussage hinsiehtlich der Dynamik nicht erlaubt.

Die S~mme werden durch INH in unterschiedlicher Weise beein- s Die Sauerstoffaufnahme des sensiblen Stammes A wird erwartungs- gem~l~ durch 230 #g INH in gleichbleibendem AusmaB auf 27 ~ der nicht gehemmten Atmung reduziert. Die Sti~mme Bsa und BRn werden dutch diese INH-Dosis nieht beeinfluB~. Der Stature Bss wird dagegen mit steigender Zahl der Subkulturen in zunehmendem MaSe durch INH

Resistenzentwicklung bei Mycobacterium smegmatis 209

gehemmt. So betrug z. B. die Sauerstoffaufnahme bei den zuletzt durch- gefiihrten Versuchen nur 50 ~ des entsprechenden Ansatzes ohne In- hibitor.

Die ErhShung der INtI-Dosis auf dad Zehnfache (2300 r hat eine weitere Verst/irkung der Hemmwirkung zur Folge. Wird die bei Zusatz yon 230/zg INH/ml erreichte Sauerstoffaufnahme gleieh 100 gesetzt, dann sinkt bei einer INH-Dosis yon 2300/~g/ml die Atmung des sensiblen Stammes A auf ~ 86~ die der St/~mme BsR und Bss a~uf

63~ Selbst der auf festem N/ihrboden gegen 5000/zg INH/ml resistente Stamm BRR wird noch beeinflugt, denn seine Sauerstoff- aufnahme ist auf 90~ erniedrigt.

Auswertung der Ergebnisse Der Stoffwechsel ruhender Bakterien scheint, wie die ann~thernd

gleichbleibenden Versuchsergebnisse zeigen, re]ativ schwer beeinflugbar zu sein. Lediglich der Stature B~R maeht eine Ausnahme. Hier ist die Steigerung des l~esistenzgrades mit einer weiteren Zunahme des Sauer- stoffverbrauches verkniipft, wenn n-Propanol bzw. n-Butanol als N/~hr- stoff verwendet werden. Oieser sehr eharakteristische Unterschied in der Oxydation prim/irer Alkohole kann auf eine Ver/~nderung des Perme- ationsvermSgens zurtickgefiihrt werden und zeigt, wie bereits friiher diskutiert (KJiPrL]~ u. IWAI~SKY 1959), m6glicherweise eine durch die fortlaufende Behandlung mit steigenden INtLDosen verursachte Ver- /tnderung der lipoidhal~igen Zellwand an.

Die Messung der Vermehrungsatmung ist fiir die vorliegende Pro- blemstellung die empfindlichere Methode, wie die relativ raseh naeh- weisbaren Unterschiede gegenfiber der Ausgangssituation zeigen. Im Gegensatz zum sensiblen Ausgangsstamm und zum Stamm BsR ver- /~ndert der Stamm Bss sein Stoffwechselverhalten -- wie aus den Ver- suehsergebnissen ersichtlieh ist -- und nimmt gegen Ende der Experi- mente etwa eine Mittelstellung zwischen den beiden genannten St/immen ein. Damit geht parallel eine Erh6hung der Sensibilit/~t gegentiber INI-I. In analoger Weise ist beim Stamm BRR die Verminderung der Vermeh- rungsgeschwindigkeit mit einer Resistenzsteigerung verkniipft. Die bei der Weiterfiihrung des Stammes gemaehten Erfahrungen lassen fiir die bioehemiseh fal?baren Ver/~nderungen den Ausdruek ,,Vitalit/itsminde- rung" im Sinne yon Hnn~ANN (1958) fiir gereehtfertigt erscheinen. An Hand der vorliegenden Versuche l/~l~t sieh naturgem/~g nicht ent- seheiden, ob diese Ver/~nderungen vorwiegend dureh Mutation oder Adaptation bedingt sind. Die Auswirkungen sind in jedem Falle die gleiehen.

Die Versuehe mit INH lassen erkennen, dab es je nach der Dosis eine makroskopisch erkennbare Vermehrungshemmung oder eine nur mit

210 H. IwAr~sKx und W. Ki~PL]m:

empfmdlichen Me~hoden sieher nachzuweisende VermehrungsverzSgerung bewirkt. Damit zeigt sich auch hier die yon L]]B]~K (1960) kiirzlich eingehend diskutierte Problematik des Resistenzbegriffes in aller Deut- liehkeit. Wenn aueh die Ergebnisse nicht ohne Vorbehalt auf die patho- genen Myeobakteriensts fibertragen werden kSnnen, so sind doeh die MSglichkeiten zu erkennen, die sich der Chemotherapie auch beim Vorliegen INH-resistenter St~mme bieten. Gleichzeitig sind die Gefahren eines zu frfihen Absetzens des rNH beim Auftreten INH-resistenter St~mme aufgezeigt. LEBEK (1960) kam bei seinen Untersuehungen zu gleichen Ergebnissen. Bereits nach zehn Passagen fiber INI~-freien N~hrboden konnte er ein NaehIassen der l~H-I~esistenz feststellen. Bei anderen Tubereulostaticis war eine solehe Resistenzminderung nicht festzusteUen.

Die Versuchsergebnisse geben darfiber hinaus wertvolle I:[inweise f'dr den Wirkungsmechanismus des INH. Die Beeinflussung INI~-resistenter Sts durch ,,untersehwellige" IN}I-Dosen sowie der verhs rasehe Verlust der INH-Resistenz sprechen sehr ffir die Existenz eines die Stoffweehseleigensehaften bestimmenden Gleiehgewiehtes Nicotin- siiure -~ Isonieotinss Damit gewinnen die ersten Teilreaktionen der l~ypothese yon K~ff(~T~I~Mn~ (1957), wonach INH naeh Permeation der Zellwand zur Isonieotins~ure umgesetzt und diese wahrseheinlieh an Stelle der/~ieotinss in ein dann inaktives Diphosphopyridinnueleotid (ZAT~AN et al. 1954) eingebaut wird, sehr an Wahrseheinliehkeit. Ver- suche zum sicheren Naehweis dieses Gleichgewiehtes und seiner Beein- flussung sind im Gange.

Zusammenfassung 1. Von einem unter definierten Bedingungen gezfiehteten INH-

resistenten Ausgangsstamm yon Mycobacterium smegmatis wird die Frage der Rfickmutation und der Vitalits der Bakterien untersucht. Dazu werden die jeweiligen Populationen auf N~hrbSden fortgezfiehtet, die sich im INH-Gehalt unterseheiden.

2. In regelm/i~igen Zeitabsti~nden wird die Verwertung verschiedener ~s bei ruhenden und sich vermehrenden Keimen untersucht. Unter Bedingungen der Ruheatmung steigt die Sauerstoffaufnahme der Bakterienpopulation, die fiber Ns mit steigendem INI-LGehalt gezfiehtet werden, wenn n-Propanol und n-Butanol als N/~hrsubstrat eingesetzt werden.

3. Bei sieh vermehrenden Keimen sind in Abhs yon der Passagenzahl deutliehe Ver~nderungen festzustellen. Die fiber INI~- freie ~hrbSden gezfiehtete Population gleieht sich in zunehmendem Mal~e dem Verhalten des sensiblen Vergleiehsstammes an. Der fiber NahrbSden mit steigendem INH-Gehalt gezfiehtete Anteil zeigt generell

Resistenzentwicklung bei lVIycobacterium smegmatis 211

eine for~laufende Beeintr /~cht igung seiner Vermehrungsvorg/~nge. Die ku l tu re l l e Wei t e r z i i ch tung is~ schlieBlich in F r a g e gestel l t .

4. I N t t wirk~ auch in Dosierungen, die u n t e r denen der Resis tenz- grenze liegen, au f I N t t - r e s i s t e n t e K e i m e wachs tumsverzSgernd .

5. Die Ergebnisse werden im t t i n b l i c k au f ihre B e d e u t u n g fiir die Chemothe rap ie und fiir den W i r k u n g s m e c h a n i s m u s des I N H diskutier~.

Frau I. STESn~AS und tIerrn G. tIon~Kis sei aueh an dieser Stelle far ihre eifrige und gewissenhaf~e Mitsrbei~ gedank~.

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Dr. H. IWAI~SKr und Dr. W. KXFrLE~ Tuberkulose-Forschungsinstitu~ Berlin-Buch, Karower S~ra~e 11