This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Über Zwischenprodukte der Riboflavin-Biosynthese bei Saccharomyces cerevisiae*

F . LINGENS, 0 . OLTMANNS u n d A . BACHER

Biochemische Abteilung des Chemischen Institutes der Universität Tübingen

(Z. Naturforschg. 22 b, 755—758 [1967] ; eingegangen am 16. Dezember 1966)

Using various riboflavin deficient mutants of S. cerevisiae, we have found two intermediates of the riboflavin biosynthesis. 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazine was isolated from the culture fluid of two mutants. The formation of 4-ribitylamino-5-amino-uracil by two other mutants was proved by trapping the product with glyoxal or diacetyl, leading to the formation of 8-ribityl-lumazine or 6,7-dimethyl-8-ribityl-lumazine and riboflavin respectively. These mutants were able to grow in ribo-flavin free medium supplemented with diacetyl.

6,7-Dimethyl-8-ribityl-lumazine promoted the growth of adequately blocked mutants.

Zur Untersuchung der Biosynthese des Ribo-flavins wurden bisher bevorzugt Eremothecium ash-byii und Ashbya gossypii herangezogen, da diese Mikroorganismen Riboflavin überschießend ans Me-dium abgeben. Mit Hilfe von Isotopen ließ sich fest-stellen, daß die Biosynthese von einem Purin aus-geht Da Xanthin, Adenin und Guanin in etwa glei-chem Umfang die Flavinbildung fördern2 , konnte noch nicht ermittelt werden, welches Purin als eigent-liches Ausgangsmaterial dient. Dabei muß auch noch geklärt werden, ob nicht an Stelle eines Purins ein Nucleosid oder ein Nucleotid als erstes Glied der Riboflavin-Biosynthese auftritt3. Im Verlauf der Synthese wird das C-Atom 8 des Puringerüstes eli-miniert 4 . GOODWIN hat in Eremothecium ashbyii 4.5-Diamino-uracil nachgewiesen5. Es ist fraglich, ob diese Verbindung ein Zwischenprodukt der Bio-synthesekette ist. GOODWIN weist darauf hin, daß sie sekundär aus einem Glykosid entstanden sein könnte6. 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin wurde von MASUDA in Eremothecium ashbyii e n t d e c k t M e h -rere Autoren haben daraus durch enzymatische Um-setzung in vitro Riboflavin erhalten3. PLAUT et al. haben gezeigt, daß aus zwei Molekülen 6.7-Dime-thyl-8-ribityl-lumazin ein Molekül Riboflavin ent-steht. Bei dieser Reaktion werden 4 C-Atome über-tragen. Als Nebenprodukt entsteht 4-Ribitylamino-5-amino-uracil 8.

* Auszug aus der Diplomarbeit A. BACHER, Tübingen, 1 9 6 6 . 1 G . W . E . P L A U T , Ann. Rev. Biochem. 30, 4 0 9 [ 1 9 6 1 ] . 2 E . G . B R O W N , T . W . GOODWIN U. 0 . T . G . JONES, Biochem. J .

6 8 , 4 0 [ 1 9 5 8 ] . 3 T . W . GOODWIN U. A . A . HORTON, Nature [London] 1 9 1 ,

7 7 2 [ 1 9 6 1 ] . 4 W . S . M C N U T T , J . biol. Chemistry 2 1 0 , 5 1 1 [ 1 9 5 4 ] , 5 T . W . GOODWIN U. D. H . T R E B L E , Biochem. J . 6 7 , 1 0 P [ 1 9 5 7 ] . 6 T. W . GOODWIN, The biosynthesis of vitamins and related

compounds, Academic Press 1963, S. 46.

Da mit Hilfe der genannten Methoden die Bio-synthese des Riboflavins bisher nicht vollständig ge-klärt werden konnte, haben wir unter Verwendung von Saccharomyces cerevisiae auf die Mutantentech-nik zurückgegriffen, die sich bei der Untersuchung der Biosynthese von Aminosäuren vielfach bewährt hat.

Material und Methoden

Geräte: Die Spektren im Sichtbaren und UV wurden mit dem Spektrometer RPQ 20 A V der Firma Carl Zeiss, Oberkochen, aufgenommen. Die Auswertung der Wachstumsversuche erfolgte durch Trübungsmessung mit dem Photometer Eppendorf.

Reagenzien: Zur Dünnschichtchromatographie wur-den Zellulose MN 300 von Macherey, Nagel u. Co. und Kieselgel H der Merck AG benutzt.

Die Säulenchromatographie erfolgte an Dowex 50 W x 8 (200 — 400 mesh) und an Aluminiumoxid sauer Woelm.

8-Ribityl-lumazin und 6.7-Dimethyl-8-ribityl-luma-zin wurden synthetisiert 9. Die mikrobielle Riboflavin-bestimmung wurde mit dem Riboflavin Assay Medium (Difco) durchgeführt.

Stämme: Die biochemischen Untersuchungen wurden mit Riboflavin-Mangelmutanten von Saccharomyces cerevisiae S 288 C ausgeführt10. Die mikrobielle Ribo-flavinbestimmung erfolgte mit Lactobacillus casei ATCC 7469

Züchtung: Sämtliche Mutanten wurden in Ribo-flavin-Komplettmedium 10 2 Tage angezüchtet. Sie wur-

7 T. M A S U D A , Pharmac. Bull. [Tokyo] 5, 2 8 [ 1 9 5 7 ] ; C. A. 5 2 , 3 9 9 g [ 1 9 5 8 ] .

8 A . W A C K E R , R . A . H A R V E Y , C . H . WINESTOCK U . G . W . E . P L A U T , J . biol. Chemistry 239, 3 4 9 3 [ 1 9 6 4 ] .

9 G. F . M A L E Y U. G. W . E. P L A U T , J . biol. Chemistry 2 3 4 , 6 4 1 [ 1 9 5 9 ] .

1 0 O . OLTMANN U . F . LINGENS, Z . Naturforschg. 2 2 b, 7 5 1 [ 1 9 6 7 ] .

11 Difco manual (9TH edition) 214.

den dann abzentrifugiert, 2-mal mit Salzlösung 10 ge-waschen und zur Akkumulation im selben Volumen Riboflavin-freiem Minimalmedium 10 suspendiert. Züch-tung und Akkumulation erfolgten bei 30 c C ohne Be-lüftung.

Akkumulation: Die Mutanten HK 750 und HK 793 wurden 12 Stdn. in Minimalmedium inkubiert. Ent-sprechende Versuche mit HK 645 und HK 693 wurden unter verschiedenen Bedingungen vorgenommen:

A. Die Mutanten wurden in Minimalmedium 4-0,3 g/Z Glyoxal 12 Stdn. inkubiert.

B. Die Mutanten wurden 8 Stdn. in Minimalmedium inkubiert und abzentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde mit 0,6 g/Z Diacetyl versetzt und 12 Stdn. bei 30 °C inkubiert.

C. Die Mutanten wurden in Minimalmedium + 0,6 g/Z Diacetyl 12 Stdn. inkubiert.

Aufarbeitung der Akkumulatlösungen: 21 Minimal-medium wurden durch Zentrifugation von Zellen be-freit. Der Überstand wurde bei 30 °C im Vakuum auf ca. 20 ml eingeengt. Die sirupöse Flüssigkeit wurde auf eine Säule aus Dowex 5 0 W x 8 (H®-Form, 1,7-22 cm) gebracht und mit Wasser eluiert. 8-Ribityl-lumazin er-schien nach 30 ml, 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin nach ca. 300 ml im Eluat. Riboflavin wurde anschließend mit 0,05-rc-HCl eluiert.

Die einzelnen Fraktionen wurden auf 1 ml eingeengt und mit 5 ml Äthanol versetzt. Diese Lösungen wurden auf Säulen aus Aluminiumoxid (1-20 cm, 80-proz. wäßriges Äthanol) gegeben. Es wurde mit 70-proz. Äthanol eluiert.

Die Eluate wurden erneut eingeengt und an Dowex 50 W x 8 (1-15 cm) nochmals chromatographiert, wie oben beschrieben. Die Eluate wurden im Vakuum zur Trockne eingeengt.

Alle Operationen wurden unter weitgehendem Licht-ausschluß ausgeführt.

Wachstumsversuche: Die Mutanten wurden über Nacht in Riboflavin-Komplettmedium angezogen, 2-mal mit Salzlösung gewaschen und in 5 ml Salzlösung sus-pendiert. Die Suspension wurde mit Salzlösung im Ver-hältnis 1:10 verdünnt. Röhrchen mit 10 ml Minimal-medium, das die zu prüfende Substanz enthielt, wurden mit je 1 Tropfen der Zellsuspension beimpft und 3 bis 5 Tage bei 30 °C bebrütet. Diacetyl und 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin wurden nicht mitautoklaviert, sondern in sterilem Minimalmedium gelöst.

Ergebnisse

Die Mutanten HK 750 und HK 793 produzieren in Minimalmedium ein im UV-Licht grün fluores-zierendes Akkumulat10. Die fluoreszierende Sub-stanz wurde wie oben beschrieben isoliert. Sie zeigte bei der Dünnschichtchromatographie dieselben Rf-Werte wie synthetisches 6.7-Dimethyl-8-ribityl-luma-zin (III) und übereinstimmende Absorptionsmaxima in neutraler und alkalischer Lösung (Tab. 1, I — V, Tab. 2 ) . Pro Liter Medium wurden 0,3 mg 6.7-Di-methyl-8-ribityl-lumazin erhalten.

Schema 1

Die Mutanten HK 645 und HK 693 akkumulieren 4-Ribitylamino-5-amino-uracil ( I ) , wie durch Um-setzung mit Glyoxal und Diacetyl bewiesen wurde (Schema 1) . Die beiden Mutanten verhalten sich gleichartig. Die nachstehenden Untersuchungen wur-den im wesentlichen an HK 645 ausgeführt.

Bei der Inkubation der Mutante HK 645 nach Me-thode A in Minimalmedium + Glyoxal erhielten wir eine im UV-Licht rein grün fluoreszierende Lö-sung, aus der sich 8-Ribityllumazin (II) isolieren ließ. Die Substanz wurde durch UV-Spektren und durch vergleichende Dünnschichtchromatographie identifiziert (Tab. 1, I —V) .

Wurde die Mutante HK645 nach Methode B in Minimalmedium ohne Zusatz 8 Stdn. inkubiert und anschließend das zellfreie Zentrifugat mit Diacetyl

I I I I I I IV V

6.7-Dimethvl-8-ribityl-lumazin 0,78 0,31 0,29 0,67 0,60 8-Ribityl-lumazin 0,84 0,25 0,22 0,60 0,86 Riboflavin 0,36 0,48 0,47 0,42 0,31

I Zellulose MN 300 NH4C1 3 % II Zellulose MN 300 n-Butanol /Äthanol /H 2 0 50 : 20 : 30

I I I Zellulose MN 300 n-Butanol /Eisessig/H 20 60 : 15 : 25 I V Zellulose MN 300 iso-Propanol/NH3 conc. /HoO 60 : 2 : 38

V Kieselgel H NH4CI 3%

Tab. 1. Rf-Werte.

H 2 0 0,1-n • NaOH

6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin 406, 257 313, 279, 229 Akkumulat aus HK 750 405, 257 312, 279, 227 grün fluoreszierendes Akkumulat aus HK 645/Diacetyl 405, 255 308*, 279, 227 8-Ribityl-lumazin 398, 258 308, 280, 236 grün fluoreszierendes Akkumulat aus H K 645/Glyoxal 398, 258 313,* 279, 234 Riboflavin 445, 372, 267, 223 gelb fluoreszierendes Akkumulat aus H K 645/Diacetyl 445, 372, 267, 222

Tab. 2. Absorptionsmaxima. * Das langwellige Maximum im Alkalischen ist ziemlich flach und deshalb schlecht meßbar.

inkubiert, so erhielten wir eine im UV-Licht rein grün fluoresziende Lösung, aus der wir 6.7-Dime-thyl-8-ribityl-lumazin (III) isolieren konnten. Nach 12-stdg. Inkubation der Mutante HK 645 in Mini-malmedium + Diacetyl nach Methode C zeigt das Medium unter der UV-Lampe eine gelbgrüne Fluo-reszenz. Bei der Chromatographie an Dowex 50 W X 8 erhielten wir eine mit Wasser eluierbare, grün fluo-reszierende und eine mit 0,05-n-HCl eluierbare, gelb fluoreszierende Verbindung. Die grün fluores-zierende Verbindung war identisch mit 6.7-Dime-thyl-8-ribityl-lumazin (III) , wie durch die UV-Spek-tren und durch vergleichende Dünnschichtchromato-graphie in 4 Laufmittelgemischen (Tab. 1,1 — IV) ge-zeigt wurde. Die gelb fluoreszierende Verbindung er-wies sich zu unserer Überraschung als Riboflavin ( IV) . Sie besaß dasselbe Spektrum im sichtbaren und UV-Bereich und dieselben Rf-Werte wie authen-tisches Riboflavin (Tab. 1, I — V ) . Sie förderte das Wachstum von Lactobacillus casei auf riboflavin-freiem Medium. Die akkumulierte Riboflavinmenge wurde photometrisch aus der Extinktion bei 445 m (« und biologisch mit Lactobacillus casei bestimmt. Es ergab sich in guter Übereinstimmung 50 y/Z bzw. 41 y/Z Minimalmedium.

Der Wildstamm S 288 C lieferte kein fluoreszieren-des Akkumulat, wenn er nach der Methode C behan-delt wurde. Auch die Mutante HK 859, deren geneti-scher Block vermutlich vor dem 4-Ribitylamino-5-amino-uracil liegt, gab unter diesen Versuchsbedin-gungen keine nachweisbaren Riboflavinmengen ab.

Die bei den Akkumulationsversuchen angewandte Diacetylkonzentration (600 y/ml) hemmt das Wachs-tum von Saccharomyces cerevisiae vollständig. Die Mutanten HK 645, HK 693 und HK 829 wach-sen jedoch ausgezeichnet in B2-freiem Minimal-medium in Gegenwart kleiner Diacetylmengen ( < 5 0 y / m l ) . 5 y/ml Diacetyl bewirken bei H K 6 4 5 in 3 Tagen dasselbe Wachstum wie 3,5 y/ml Ribo-flavin. Daraus ist zu folgern, daß die genannten

Mutanten durch das Diacetyl zur Riboflavin-Biosyn-these befähigt werden. Die Mutanten HK 750 und HK 793 wachsen nicht mit Diacetyl.

I HK 693 j j HK793

R- Ribityl Schema 2

6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin (III) wurde bei 5 Mutanten auf Wachstumswirksamkeit geprüft. Es ist bekannt, daß man beim Erhitzen dieser Substanz in Pufferlösung in guter Ausbeute Riboflavin erhalten kann 12. Es wurde zunächst durch Wachstumsversuche mit Lactobacillus casei festgestellt, daß unser syn-thetisches 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin 0,13%Ribo-flavin enthält und daß dieser Anteil bei 9-tägiger Inkubation in sterilem Minimalmedium nur gering-fügig ansteigt (0 ,16%). Die Substanz förderte das Wachstum von HK 645 und von HK 843 (Wirksam-keit 2 — 3 bzw. 4 — 5% bezogen auf Riboflavin). Die Mutanten HK 750 und HK 793 wuchsen nicht mit 6.7-Dimethyl-8-ribityI-lumazin, wie auf Grund der Akkumulationsversuche zu erwarten war. Das Wachstum der Mutante HK 829 wurde nur gering-fügig gefördert, obwohl sie mit Diacetyl wächst. Wir nehmen deshalb an, daß diese Mutante 6.7-Dime-thyl-8-ribityl-lumazin nicht aus dem Medium aufneh-men kann.

Diskussion

Es wurde gezeigt, daß die primären Akkumulate Der Mutanten HK 645 und HK 693 mit Glyoxal bzw. Diacetyl zu 8-Ribityl-lumazin (II) bzw. 6.7-Dime-thyl-8-ribityl-lumazin (III) umgesetzt werden. Dar-

12 T. R O W A N U. H. C . S. W O O D , Proc. chem. Soc. [London] 1963, 21.

aus ist zu folgern, daß diese Mutanten das seit lan-gem als Zwischenprodukt vermutete 4-Ribityl-amino-5-amino-uracil (I) akkumulieren (Schema 1 ) . Die Umsetzung mit zugesetztem Diacetyl kann intrazellu-lär ablaufen. HK 645 und HK 693 können intra-zellulär gebildetes 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin auf enzymatischem Wege in Riboflavin umwandeln. Diese Mutanten können daher in Riboflavin-freiem Minimalmedium mit Diacetyl wachsen. Die bei den Akkumulationsversuchen verwendeten Diacetylmen-gen hemmen das Wachstum vollständig. Unter die-sen Bedingungen geben HK 645 und HK 693 grö-ßere Mengen Riboflavin ans Medium ab. Weder der Wildstamm noch die Mutante HK 859 zeigen ent-sprechendes Verhalten. Es kann sich demnach bei dem akkumulierten Riboflavin nicht um Reserven handeln, die unter den Versuchsbedingungen frei-gesetzt würden. Wir müssen vielmehr annehmen, daß das von HK 645 und HK 693 ausgeschiedene Riboflavin während der Akkumulation gebildet wird.

Auf Grund der vorliegenden Untersuchungen sind die 2 letzten Schritte der Riboflavin-Biosynthese im Schema 2 dargestellt. KATAGIRI et al .1 3 und KISHI et a l . 1 4 haben 1959 mitgeteilt, daß sich 4-Ribitylamino-5-amino-uracil durch Enzymextrakte aus Eremothe-cium ashbyii und Aerobacter aerogenes mit Acetoin zu 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin umsetzen läßt. Diese Versuche konnten von GOODWIN et a l . 3 an Candida flareri nicht reproduziert werden. PLAUT

hat angenommen, daß die Enzympräparate von KATAGIRI und von KISHI Acetoin in Diacetyl umwan-delten, und daß sich diese Verbindung mit 4-Ribityl-amino-5-amino-uracil auf nichtenzymatischem Wege zu 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin kondensiert1.

Unsere Versuche erlauben keine Aussage darüber, ob 4-Ribitylamino-5-amino-uracil selbst oder ein Phosphorsäureester dieser Verbindung als Zwischen-produkt dient. Zum Beispiel ist bekannt, daß die Biosynthese des Tryptophans über 3-Indolyl - (3) -

1 3 H . K A T A G I R I , I . T A K E D A U. K. I M A I , J . Vitaminol. [Kyoto] 5 . 287 [1959] ; C. A. 54, 17541b [I960].

14 T. K I S H I , M . A S A I , T. M A S U D A U. S . K U W A D A , Chem. phar-mac. Bull. [Tokyo] 7,515 [1959].

1 5 C . Y A N O F S K Y , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 2 0 , 438 [1956].

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1 7 F . K Ö R T E U. G. L U D W I G , Liebigs Ann. Chem. 648. 131 [1961].

1 8 R . A. H A R V E Y U .G. W. E. P L A U T , J . biol. Chemistry 2 4 1 . 2120 [1966].

glycerin-l-phosphat verläuft13 . Im Medium entspre-chend blockierter Mutanten findet man jedoch nur 3-Indolyl- (3) -glycerin 16.

KÖRTE und LUDWIG haben auf Grund von kineti-schen Versuchen an Candida guilliermondii darauf hingewiesen, daß die Riboflavin-Biosynthese bei die-sem Organismus möglicherweise direkt zum FAD führt1 7 . Andererseits ist durch die Untersuchungen von PLAUT eindeutig bewiesen, daß Riboflavin-Syn-thetase aus Hefe freies 6.7-Dimethyl-8-ribityl-luma-zin umsetzen kann und dazu keiner organischen Co-faktoren bedarf 18. Möglicherweise kehrt das bei die-ser Reaktion freigesetzte 4-Ribitylamino-5-amino-uracil in den Syntheseprozeß zurück.

In jüngster Zeit haben SADIQUE et al. in einer Reihe von Kurzmitteilungen über die Identifizierung von 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin19, 6-Methyl-7-hydroxy - 8 - ribityl-lumazin 20, 4.5-Diamino-uracil 21

und 4 - Ribitylamino - 5 - amino - uracil 22 bei Ribo-flavin~-Mutanten von Aspergillus nidulans berichtet. Leider bleiben uns einige Angaben der Autoren un-verständlich. Zum Beispiel sollen 6.7-Dimethyl-luma-zin und 6.7.8-Trimethyl-lumazin aus 4.5-Diamino-uracil durch Umsetzung mit Glyoxal hervorgehen21.

Es ist bekannt, daß lebende Zellen von Eremothe-dum ashbyii und Ashbya gossypii 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin nicht in Riboflavin umwandeln23 , obwohl dieser Umsatz im zellfreien System gelingt. Wir konnten zeigen, daß diese Verbindung das Wachstum der Mutanten HK 645 und HK 843 för-dert, wenn sie in hoher Konzentration ( > 3 0 y/ml) angeboten wird. Der Effekt wird nicht durch Ver-unreinigung mit B2 hervorgerufen. Wir nehmen an, daß 6.7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin von Saccharo-myces cerevisiae ebenso wie von anderen Organis-men schlecht aufgenommen wird.

Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und dem F o n d s d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e danken wir für Unterstützung dieser Arbeit.

1 9 J . SADIQUE, R . SHANMUGASUNDARAM U. E . R . B . SHANMUGASUN-DARAM, Experientia [Basel] 2 2 , 32 [1966].

2 0 J . SADIQUE, R . SHANMUGASUNDARAM U. E . R . B . SHANMUGASUN-DARAM, Naturwissenschaften 53, 179 [1966].

2 1 J . SADIQUE, R . SHANMUGASUNDARAM U. E . R . B . SHANMUGASUN-DARAM, Naturwissenschaften 53, 282 [1966].

2 2 J . SADIQUE, R . SHANMUGASUNDARAM U. E . R . B . SHANMUGASUN-DARAM, Biochem. J. 10L, 2 C [1966].

2 3 F . K Ö R T E U. H . U . A L D A G , Liebigs Ann. Chem. 6 2 8 . 1 4 4 [1959].