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ÜBUNGEN AUS HYGIENE UND

MIKROBIOLOGIE

JULI 2019

Verhalten im Labor

n Rauch-, Ess- und Trinkverbot

n Äußerste Sauberkeit und Ordnung im Raum und am

Arbeitsplatz

n Nach Beendigung der Arbeit Hände desinfizieren

n Schutzkleidung (weißer Arbeitsmantel)

n Arbeitsfläche nach Beendigung der Arbeit desinfizieren

n Nicht mit dem Mund pipettieren.

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n Bunsenbrenner nicht unbeaufsichtigt lassen (nur bei Bedarf

anzünden). Bei Gasgeruch sofort Gaszufuhr abdrehen.

n Lange Haare nicht offen tragen (Haare zusammenbinden!

Kontaminations- und Verletzungsgefahr)

n Sachgemäße Entsorgung der kontaminierten Gegenstände

GRAMFÄRBUNG

ENTSORGUNG !

OBJEKTTRÄGER/AMPULLEN

(Agarplatten, Plastikpipette, Handschuhe) KEIN GLAS

Papier

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Grundlagen des sterilen Arbeitens

n Sterile Geräte und Materialien nicht durch Kontakt

mit unsterilen Oberflächen (Hände, Mantel, etc.)

kontaminieren

n Wir verwenden Einweg Pipetten und Spatel, diese

in Desinfektionslösung geben (Eimer).

n Glas, Plastik, Papier getrennt entsorgen

n Bei Kontamination oder Verletzung: immer melden

n Brandwunden sofort und lange unter Wasser halten

n bei Augenkontamination reichlich mit Wasser spülen

(Klinik)

n kommt kontaminiertes Material in den Mund: nicht

schlucken! Ausspucken und dann mit 0,1% KMnO4

spülen

Grundlagen des sterilen Arbeitens

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• Mikrobiologisches Arbeiten setzt voraus, dass die

Arbeitsflächen leicht zu reinigen und zu desinfizieren

sind.

• Fußbodenbelag und Oberflächen der Tische, bevorzugt

aus Kunststoff, müssen feucht abzuwischen sein.

• Es müssen entsprechende Einrichtungen wie

Wasserhähne, Gasanschlüsse, Waschbecken usw.

vorhanden sein.

BAKTERIOLOGISCHES LABOR UND LABORAUSSTATTUNG

n Mikroskop, Objektträger, Farbstoffe

n Brutschrank (22°C, 30°C, 37°C, 44°C)

n Trockenschrank (180°C, 30min und höher)

n Autoklav (121°C, 20min)

n Kühlschrank, Wasserbad, Laborwaage

n Mischgeräte wie, Magnetrühr, Vortexer, Stomacher,

n pH-meter, Photometer, Zentrifuge

n UV-Lampe (254nm und 365nm)

n Impfgeräte (Nadel,Öse, Drigalskispatel)

n Glasgefäße wie Flaschen, Eprouvetten, Pipetten usw.

n Sterilpetrischalen

n Abfalleimer, Desinfektionsmittel

n Pipettierhilfen, Bunsenbrenner

BAKTERIOLOGISCHES LABOR UND LABORAUSSTATTUNG

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UV-Lampe (254nm und 365nm)Wasserbad

Trockenschrank (180°C, 30min und höher)

VORTEXER

Behandlung mit trockener Heißluft

STOMACHER

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DRIGALSKISPATEL

ÖSEVERDÜNNUNGSMEDIUM

PASTEUR PIPETTE

TUPFER

Sterilisation durch feuchte Hitze (Autoklavieren)

REINIGUNG UND STERILISATION IM LABORATORIUM

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Der zeitliche Ablauf einer Sterilisation

lässt sich in vier Abschnitte gliedern:

n Anheizzeit: Zeit für das Anheizen des Sterilisators,

n Ausgleichszeit: Zeitspanne, bis das Gut die

Sterilisiertemperatur angenommen hat,

n Abtötungszeit: Einwirkungszeit, die für das Abtöten

erforderlich ist,

n Abkühlzeit: die für die Abkühlung des Gutes notwendige

Zeit.

Der zeitliche Ablauf einer Sterilisation lässt sich in vier Abschnitte gliedern:

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Sterilisation durch Filtration

n Die hitzelabilen Lösungen

(Zucker usw.) werden

sterilfiltriert (Porenweite 0,2

µm).

n Mittels dieser Methode

können Lösungen

„endotoxinfrei“ gemacht

werden

Endotoxin (LPS)

NÄHRMEDIEN

n ausreichende Feuchtigkeitn ausreichende Mengen entsprechender Nahrungsstoffen optimale Temperaturn optimaler pH-Wert n optimaler osmotischer Wertn entsprechendes Redox-Potential

• Bakteriologische Nährböden dienen der Kultivierung, d.h. der Vermehrung von Mikroorganismen außerhalb ihres natürlichen Standortes.

• Die Nährböden müssen bestimmte Grundeigenschaften aufweisen, die den Mikroorganismen Wachstum und Entwicklung ermöglichen.

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NÄHRMEDIEN

n Trägersubstanzen (Agar-Agar, Gelatine, Kieselgel)

n Nährstoffe (chemisch nicht definierte Nährstoffe wie Pepton;

chemisch definierte Nährstoffe wie Vitamine oder Kohlenhydrate)

n Puffersubstanzen

n Selektive Hemmstoffe (Farbstoffe, Antibiotika, Detergentien)

n Selektierende Faktoren wie Mangelmedien, Sauerstoff, pH-Wert,

Temperatur

Nährböden bestehen, abgesehen vom Gehalt an Wasser, aus

einer Reihe verschiedener Substanzen, die sich bezüglich ihrer

Funktion folgendermaßen einteilen lassen:

Nährmedien-Zusammensetzung

n Fleischwasser od. Hefe-Extrakt (Coenzyme, anorganische

Ionen)

n Pepton (Aminosäuren)

n Glucose (Energie)

n Feste Nährmedien enthalten zusätzlich ein

Verfestigungsmittel, z.B. Agar-Agar (aus Rotalgen

gewonnen)

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Nährmedien

n flüssig

Nährmedien

n fest

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Nährmedien

n Minimalmedium: enthält nur essentielle

Bestandteile

n Optimalmedium: komplexes

Naturprodukt, ermöglicht optimales

Wachstum

Streptococcus pneumoniaeauf Blutagar

Nährmedien

n Minimalmedium

n Optimalmedium

n Selektivmedium: enthält Nährstoffe, die nur von

bestimmten Bakterien verwertet werden können oder

Wirkstoffe, die gezielt das Wachstum mancher Arten

unterdrücken

n Differenzierungsmedium: Unterscheidung zwischen

Bakterien auf Basis von Stoffwechselleistungen

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S. epidermidis und E. coliauf Blut- und Endo-Agar

E. coli und P. mirabilis auf CLED-Agar

E. coli

P. mirabilis

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AGARPLATTEN

Zubereitung mikrobiologischer Nährböden:

n Einwaage: Trockennährboden einwiegen, Wassermenge abmessen.

n Suspendieren: Ca. halbe Wassermenge ins Ansatzgefäß geben,

abgewogenen Trockennährboden zufügen, umschütteln bis dieser

vollständig suspendiert ist, mit restlichem Wasser Trockennährboden

restlos lösen.

n Auflösen: Ansatz im siedenden Wasserbad oder strömenden Dampf

erhitzen.

n pH-Wert Einstellung

n Sterilisation (15 Minuten bei 121°C)

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§ Nach dem Sterilisieren des

Nährmediums bei 121°C,

lässt man dieses auf

ungefähr 45°C abkühlen.

§ Dann wird es in der

Sterilbank (reine Werkbank)

in sterile Petrischalen

gegossen.

Zubereitung mikrobiologischer Nährböden:

Stichkultur

Schrägagarkultur

Nährböden in Kulturröhrchen

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Überführen von Mikroorganismen aus einem

Kulturgefäß in ein anderes mit Impföse, -

nadel oder Pipette unter sterilen

Bedingungen zum Zwecke ihrer

Anreicherung, Isolierung oder Fortzüchtung.

PRINZIPIEN DES STERILEN ARBEITENS

GRUNDPRINZIPIEN

n Für die diagnostische Erfassung,

Merkmalfeststellung und Resistenzbestimmung

sind Reinkulturen oder zumindest gut getrennte

Einzelkolonien erforderlich!

n Durch das fraktionierte Ausstreichen gelingt es, aus

Bakterienmischungen Einzelkolonien zu isolieren!

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Fraktionierter Ausstrich

(Drei- Ösen- Ausstrich)

1. ÖSE

Der Primärstrich wird durch Sekundärstriche verdünnt, diese

wieder durch Tertiärstriche.

2. ÖSE

3. ÖSE

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n Fraktionierter Ausstrich auf vier verschiedenen

Nährböden: o BLUTAGARPLATTE, o CHROMOGENE COLIFORMEN AGAR, o MCCONKEY AGAR,o CLED AGAR

n Bakterien: 1: Staph, 2: Strep, 3: Proteus, 4: E. coli

n Bebrütung: 37° C / 24h

1 12 21 2IMPFTECHNIKEN (EINZELBEISPIEL,

AUSSTREICHEN AUF NÄHRBÖDEN)MO

Ü1

Rachenabstrich (Einzelbeispiel)

– Zunge mit Spatel herunterdrücken oder mit

Papierhandtuch greifen und nach vorne

ziehen

– Tupfer einführen ohne dabei Lippen und

Mundschleimhaut zu berühren

– Tupfer unter Druck von oben nach unten

über die Tonsillen sowie horizontal über die

Rachenwand streichen

MO

Ü2

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Rachenabstrich

n Gewonnenes Material als Primärstrich auf

Blutagarplatte sowie (mit Bleistift) beschrifteten

Objektträger aufbringen (Rachenabstrich, Nr.1)

n Nährbodenplatte zugedeckt beiseite legen und

später weiterverarbeiten; Objektträger nach einer

kurzen Lufttrocknungsphase hitzefixieren und nach

Gram färben

Rachenabstrich auf Blutagarplatte

Der Primärstrich wird durch Sekundärstriche verdünnt, diese

wieder durch Tertiärstriche.

ÖSE

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Entnahme einer Bakterienkolonie

Fraktionierte Ausstrich nach Bebrütung

MK

RK

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(Pipettierhilfen benutzen)

KULTURVERFAHREN

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Kulturverfahren

n Verfahren, das Bakterien außerhalb des natürlichen

Standortes zur Vermehrung bringt (unbelebte Substrate

oder Zellkulturen)

n Verlässlichste Sicherung einer Verdachtsdiagnose

n Voraussetzung für die Empfindlichkeitsprüfung

n Ermöglicht Analyse der Klonalität von

Isolaten → Infektionsepidemiologie

Bakterienwachstum durch binäre

Teilung

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Mikroskopie

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Mikroskopie

n Verfahren (Hellfeld, Dunkelfeld, Phasenkontrast,

Fluoreszenz)

n Bakterien sind im Lichtmikroskop bei 1000facher

Vergrößerung gerade noch sichtbar

n Immersionsöl zur Verbesserung der Auflösung erforderlich

n Pilze und Protozoen sind bereits bei 400facher

Vergrößerung erkennbar

Mikroskopie

n Wichtige Schnellmethode zum Nachweis von Bakterien in

primär sterilen Materialien (Harn, Liquor, Gewebe) oder

Erregern mit typischer Morphologie/Färbeverhalten

(Treponemen, Vibrionen, Mykobakterien)

n Begrenzte Sensitivität (Nachweisgrenze 104 Keime/ml)

n Wichtig auch für vorläufige Bestimmung und systematische

Einordnung von Bakterien

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Lichtmikroskopie

n Nativpräparat– Lebende Keime– Ungefärbt– Beweglichkeit

n Gefärbte Präparate– Hitzefixierung– Monochrome

Färbungenn Methylenblaun Fuchsin

– Polychrome Färbungenn Gramn Ziehl Neelsen

Nativpräparat

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Methylenblau-Färbung

Gram-Färbung

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Ziehl-Neelsen Färbung

FÄRBUNGEN

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Gramfärbung

n Färben sie den eben hergestellten

Rachenabstrich ( Nr.1) und das

vorgefundene Laborpräparat (Nr.2) und

Hefe mit Hilfe der Tutoren nach Gram und

mikroskopieren sie die Präparate.

n Immersionsöl verwenden

MO

Ü3

GRAMFÄRBUNG

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Vorbereiten des Präparates

n Objektträger beschriften n Aqua dest. aufbringen

Vorbereiten des Präparates

n Kolonie entnehmen n Kolonie in A. dest. einrühren

Präparat LUFTTROCKNEN dann hitzefixieren

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GRAMFÄRBUNG

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Färbung nach Gram

1. Präparat LUFTTROCKNEN dann hitzefixieren

2. Den Ausstrich mit Kristallviolett (R1) bedecken (2 Min.)

3. Abspülen mit Aqua dest. (kurz)

4. Differenzieren mit Lugolscher Lösung (R2) (2 Min.)

5. Abtropfen lassen, vorsichtig mit Aqua dest. abspülen

6. Entfärben mit Alkohol (95%) (R3)

7. Abspülen mit Aqua dest. (kurz)

8. Gegenfärben mit Safranin (R4) (30 sek.)

9. Abspülen mit Aqua dest., lufttrocknenn und unter dem Immersionsobjektiv untersuchen (Immersionsöl)

Vorbereiten des Präparates

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Lufttrocknen und Hitzefixieren

Färbung mit Kristallviolett (R1)

n Kristallviolett auftropfenn Nach 2 min abgießen

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Beizung mit Lugol´scher Lösung (R2)

n Lugol´sche Lösung auftropfenn Nach 2 min abgießen

Entfärbung mit Alkohol (R3)

n Entfärben mit 96% Alkohol bis keine Farbwolken mehr abgehen

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Gegenfärbung mit Safranin (R4)

n Safranin auftropfenn Nach 30 sec mit Leitungswasser abspülenn Vorsichtig abtupfen und lufttrocknen

Färbeverhalten und Morphologie

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Bei Betrachtung in stärkster Vergrößerung

(100X), muss auf das Präparat ein Tropfen

Immersionsöl aufgebracht und die

Außenlinse des Immersionsobjektivs darin

eingetaucht werden.

n Farbstoffe entsorgenn Färbewanne putzenn Mikroskopierenn Ergebnis notieren

Vergrößerung (100X) Immersionsöl

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Bacillus cereus

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C. bifermentans

C. difficile

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Staphylococcus aureus

Enterococcus faecalis

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HEFEMO

Ü3