Unterlagen zum Übungsbeispiel - boku.ac.at · Eine enzym-katalysierte Reaktion, die der Michaelis-Menten-Theorie folgt, lässt sich darstellen wie folgt: Die Reaktionskonstante des

BIOCHEMISCHEÜBUNGENI

UnterlagenzumÜbungsbeispiel

ENZYMKINETIK

FürdenInhaltverantwortlich:KlaraSoukup,Bakk.techn.

Wien,Juli2012(ergänztOktober2018)

SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________

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INHALTSÜBERSICHT

EINLEITUNG 3

ZIELDESBEISPIELS 3DIEVERWENDETENENZYMEUNDAKTIVITÄTSASSAYS 3

THEORETISCHERHINTERGRUND 6

MICHAELIS-MENTEN-KINETIK 6MÖGLICHKEITENDERLINEARISIERUNGVONDATEN(PLOTS) 7

PRAKTISCHERTEIL 10

1–ERMITTLUNGDERENZYMVERDÜNNUNG 112–ZEITABHÄNGIGKEITSEXPERIMENT(VARIIERENDERINKUBATIONSZEIT) 113–MICHAELIS-MENTEN-EXPERIMENT/KM-WERTBESTIMMUNG(VARIIERENDERSUBSTRATKONZENTRATION) 134–TEMPERATURABHÄNGIGKEITSEXPERIMENT/TEMPERATUR-OPTIMUM(VARIIERENDERINKUBATIONSTEMPERATUR) 155–LAGERSTABILITÄTSEXPERIMENT/TEMPERATUR-STABILITÄT(VARIIERENDERLAGERBEDINGUNGEN) 18

ZEITPLAN 21


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Einleitung

ZieldesBeispielsImRahmendiesesÜbungsbeispielssolleineEnzymkinetik-Bestimmungdurchgeführtwerden.Dabeisollermitteltwerden,wiesichdieAktivitäteinesEnzymsdurchverschiedeneParameterbeeinflussenlässt.DiedafürzurVerfügungstehendenParametersind:

ü dieInkubationszeit–d.h.waspassiert,jelängerdasEnzymZeithat,mitseinemSubstratzuinteragieren?WirddieReaktionsgeschwindigkeithöher,jelängerdasEnzymSubstratinProduktumwandelt?

ü dieSubstratkonzentration–d.h.waspassiert,jemehrSubstratdemEnzymzurVerfügungsteht?WirddieReaktionsgeschwindigkeithöher,jemehrSubstratimAnsatzvorhandenist?

ü dieInkubationstemperatur–d.h.waspassiert,jehöherdieTemperaturist,unterderdasEnzymdieSubstratumwandlungdurchführt?NimmtdieGeschwindigkeitgemäßthermodynamischerPrinzipienzu?

ü dieBedingungen,unterdenendasEnzymgelagertwird–d.h.waspassiert,wenndasEnzymnichtaufEissondernbeiRaumtemperaturaufbewahrtwird?BeeinträchtigtdieLagerungdieEnzymaktivität?

DieseParametersollenimLaufederÜbungenvariiertwerden,umanschließenddieeintretendenVeränderungenzuinterpretieren.

Dassogenannte„Herzstück“desBeispielsstelltdabeidieErmittlungderKinetikdar,d.h.inwelcherFormdieAktivitätdesEnzymsvonderihmzurVerfügungstehendenKonzentrationanSubstratabhängt.DabeisolluntergeeignetenVersuchsbedingungenüberprüftwerden,obessichumeineMichaelis-Menten-Kinetikhandelt.

DieverwendetenEnzymeundAktivitätsassaysDieuntersuchtenEnzymestammenausdemvorangegangenenBeispiel„Proteinaktivität“(beiProf.Altmann)undwurdenausverschiedenenQuellengereinigt.DabeisollteimmerimHinterkopfbehaltenwerden,dassdieReinigungnichtspezifischdurchgeführtwurdeunddaherimverwendetenProteinextraktnebendemzuuntersuchendenEnzymauchzahlreicheandereProteinevorhandensind,dieeventuellEinflussaufdieAktivitätsbestimmungnehmen.MancheErgebnissekönnendaherandersausfallen,alsmanesbeiUntersuchungeineshochreinenEnzymextrakteserwartenwürde.

BereitsimBeispiel„Proteinaktivität“wurdeeineAktivitätsbestimmungdurchgeführt,umdieEnzymaktivitätimgereinigtenExtraktzuermitteln(Units/mL).Dabeiwurdenacheinemangegebenen„Kochrezept“vorgegangen–einemsog.Aktivitätsassay(z.B.pipettiere100µLEnzym+100µLSubstratzusammen,inkubiere15minbei37°CundbeendedieReaktiondurchZugabevon1mLStopplösung).DerinkubierteAnsatzwurdeanschließendphotometrischgemessen.


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DieangegebeneneWellenlängerepräsentiertdasAbsorptionsmaximumdesgebildetetenProduktes.Dasbedeutet,dassdieAktivitätsbestimmungaufderMessungdesentstandenenProduktesberuht.DabeikanndieZunahmeanProduktmitderZeit(d.h.dieZunahmederAbsorption)alsMaßfürdieAktivität(d.h.eigentlichdie„Arbeitsgeschwindigkeit“)desEnzymsangenommenwerden.

v = dPdt

≅ A

UmeineandereFormdesAktivitätsassayskennenzulernen,sollenindiesemBeispieldieProteinextraktegetauschtwerden.DieentsprechendenAngabenwerdenvondenTutorenausgegeben.

EinigeBeispielefürverwendeteEnzyme:

ü SaurePhosphataseü Pyrophosphataseü Polyphenoloxidaseü Galactosidaseü Glucosidaseü Mannosidaseü Hexosaminidasenz.B.Glucosaminidase(„β-Hex“)ü Peroxidase

DabeiberuhensämtlicheAktivitätsassaysaufeinemähnlichenPrinzip:diekatalysierteReaktionresultiertdurchAbspaltungeinerbestimmtenGruppeinderBildungeineschromogenenProdukts,dessenFärbungphotometrischgemessenwird.AlsBeispielseihierdieReaktionsgleichungderPhosphataseangegeben,beideresdurchAbspaltungderPhosphatgruppevonpara-NitrophenylphosphatzurBildungvonpara-Nitrophenol(4-Nitrophenol)kommt.DiesesProduktliegtunterbasischenBedingungen(wirddurchZugabederStopplösungerreicht)indeprotonierterFormvor(Phenolat)undweisteineintensiveGelbfärbungauf.DiedeprotonierteFormkanndabeiinzweiGrenzformenvorliegen(benzoidevs.chinoideStruktur).DieAbsorptionwirdbei403nmgemessen.

Abbildung1DurchPhosphatasekatalysierteReaktion(Bildungvon4-Nitrophenol)


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BeidenmeistenAktivitätsassaysbeträgtdieInkubationszeit15minbei37°CundanschließendwirddieProduktbildungphotometrischbestimmt.Ausnahmenstellenz.B.PolyphenoloxidaseundPeroxidasedar.BeidenvondiesenEnzymenkatalysiertenReaktionenerfolgtdieProduktbildungsorasch,dasseinenach15mingemesseneAbsorptionnichtmehrrepräsentativfürdieEnzymaktivitätwäre.DahererfolgtdieAktivitätsmessung„real-time“–d.h.laufendvomerstenKontaktdesEnzymsmitseinemSubstratanüber2min.DieseAssayswerdendirektimPhotometerdurchgeführt,wobeidasGerätalle20secdenentsprechendenAbsorptionswertaufzeichnet.

Abbildung2DieBildungvonTetraguaiacolausH2O2undGuaiacolalsBeispielfüreinevonPeroxidasekatalysierteReaktion


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TheoretischerHintergrund

Michaelis-Menten-KinetikDiesesKapitelsollnurderkurzenWiederholungderGrundlagenderEnzymkinetikdienen,umdiewichtigstenGrundbegriffewiederinErinnerungzurufen.GenauereswurdebereitsinanderenLehrveranstaltungendurchgenommen.

Eineenzym-katalysierteReaktion,diederMichaelis-Menten-Theoriefolgt,lässtsichdarstellenwiefolgt:

DieReaktionskonstantedeserstenReaktionsschritts(BildungeinesEnzym-Substrat-KomplexesausfreiemEnzymEundSubstratS)istk1,diederRückreaktiondementsprechendk-1,unddiedeszweitenSchritts(ZerfalldesKomplexesinfreiesEnzymundProdukt)k2.

NachMichaelis-MentenlässtsichdieReaktionsgeschwindigkeitnachfolgenderGleichungermitteln:

BeieinerenzymatischkatalysiertenReaktionnachdemMichaelis-Menten-ModellherrschteinhyperbolischerZusammenhangzwischenderReaktionsgeschwindigkeitundderzurVerfügungstehendenSubstratkonzentration.ImAnfangsbereichnimmtdieGeschwindigkeitlinearmitderSubstratkonzentrationzu.AbeinergewissenKonzentrationbeginntdieKurveabzuflachenunderreichtschließlicheinPlateau–d.h.estrittSättigungauf.IndiesemBereichnimmtdieKonzentrationkeinenweiterenEinflussaufdieGeschwindigkeit–diesehatihrMaximumerreicht.

DiewichtigenParameterimZusammenhangmitderCharakterisierungderKinetikeinesEnzymssinddiemaximaleReaktionsgeschwindigkeit(vmax)unddieMichaelis-Konstante(KM-Wert),welchejeneSubstratkonzentrationdarstellt,beiderdasEnzymmithalb-maximalerGeschwindigkeitarbeitet.DerKM-WertbeschreibtdieAffinitätdesEnzymszumSubstrat–jeniedrigerderKMeinesEnzymsfüreinSubstratist,destospezifischererfolgtdieReaktiond.h.esgenügenbereitsniedrigeSubstratkonzentrationen,umdasEnzymmithalbmaximalerGeschwindigkeitarbeitenzulassen.

Abbildung3Michaelis-Menten-KurveZusammenhangReaktionsgeschwindigkeitundSubstratkonzentrationbeieinerenzymatischkatalysiertenReaktion

DieMichaelis-Konstanteistdefiniertals:


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MöglichkeitenderLinearisierungvonDaten(Plots)UmanhandeinerKinetik-KurvecharakteristischeWertewieKModervmaxzuermitteln,mussdieaufgenommeneKurvemittelskompliziertermathematischerProzesseexaktangepasstwerden.DavmaxeinenWertdarstellt,demsichdieKurvenurasymptotischnähert,isteinesolcheAuswertungkeineswegstrivial.EsstehendazudiverseSoftware-ToolszurVerfügung.

ImFalleunseresBeispielssolleineeinfacheAuswertungmittelsMSExceldurchgeführtwerden.ZudiesemZweckkönnendiegemessenenDatenlinearisiertwerden,d.h.eserfolgteinerechnerischeUmformung,welchedieAuswertungerleichtert.DieseVorgangsweisewirdauchindertäglichenLaborpraxisoftgewählt,damansoraschzuziemlichgenauenErgebnissenkommt.

Lineweaver-BurkPlotAmbekanntestenistdiedoppeltreziprokeLinearisierungmittelsLineweaver-BurkPlot.DabeiwirdderKehrwertdergemessenenArbeitsgeschwindigkeitinAbhängigkeitvomKehrwertdereingesetztenSubstratkonzentrationaufgetragen.KMundvmaxkönnenwiedargestelltabgelesenwerden.

Abbildung4Lineweaver-BurkPlot

DerLineweaver-BurkPlothatjedocheinensignifikantenNachteil:aufgrundderdoppeltreziprokenUmformungderDatenkommteszueinerimmergrößerenFehlerzunahme,jekleinerdieMesswertesind.AußerdemistdieVerteilungderMesspunkteimPlotnichtmehräquidistant,wasauchzugroßenUngenauigkeitenführenkann.

AusdiesenGründensolltebevorzugteineandereMethodederDatenlinearisierunggewähltwerden.

HanesPlotEineguteAlternativestelltderHanesPlotdar,beidemdieeingesetztenSubstratkonzentrationendirektaufderx-Achseaufgetragenwerden.Fürdiey-AchsewerdendieSubstratkonzentrationendurchdiejeweilsgemessenenGeschwindigkeitendividiert.

Abbildung5HanesPlot

DanureinemathematischeUmformungderDatenerfolgt,bleibtderAbstandzwischendenMesspunktengleich(wenndieeingesetztenSubstratkonzentrationenäquidistantgewähltwurden)


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undauchdieGrößedesFehlersverändertsichnichtmitderGrößedergemessenenDaten.EinNachteildieserDarstellungliegtinderTatsache,dassdieeingesetzteSubstratkonzentrationaufbeidenAchsenauftritt.DadurchfließenFehler,diedurchPipettierungenauigkeitenentstehen,doppeltindieBerechnungein.

DerHanesPlotgiltalsdiebevorzugteLinearisierungs-Methode.AuchimRahmendiesesÜbungs-BeispielssolldieKM-WertBerechnunganhandeinesHanesPlotdurchgeführtwerden.

Eadie-HofsteePlotAuchbeimEadie-HofsteePlotwirddasProblemderunregelmäßigenVerteilungderMesspunkteundderFehlervergrößerungüberwunden,indemaufdery-AchsedirektdieArbeitsgeschwindigkeitaufgetragenwird.Fürdiex-AchsewirddieArbeitsgeschwindigkeitdurchdieeingesetzteSubstratkonzentrationdividiert.

Abbildung6Eadie-HofsteePlot

DerNachteildesEadie-HofsteePlotsliegtdarin,dassdieGeschwindigkeitaufbeidenAchsenverwendetwirdundsichdaherbeiderAuswertungUngenauigkeitenderGeschwindigkeits-Bestimmung(Messung)vergrößern.DadurchsinktdieGenauigkeitdervmaxundKM-Berechnung.

BeiderErstellungvonPlotsdieserArtisteswichtigzubedenken,dasseineerfolgreicheDaten-Linearisierungnurdannmöglichist,wenndiegemesseneKinetik-KurvetatsächlichdemMichaelis-Menten-Verlauffolgt.BeimanchenEnzymenbzw.ProteinlösungenkanneszuAbweichungenkommenundeskanndaherschwierigsein,eine„schöne“Michaelis-Menten-Kurvezuerhalten.AußerdemfolgennichtalleEnzymederMichaelis-Menten-Kinetik.

BeiEnzymen,dieeinenextremgroßenKM-Wertaufweisen,kannessein,dassbeimerstenVersuchdasvmax-Plateaunochnichterreichtwurde,weildieeingesetzteSubstratkonzentrationnochnichthochgenugwar.DieaufgenommeneKurvezeigtdanneinenlinearenVerlauf,ohnedie„Abknick-Phase“zuerreichen.IndiesemFallmüssenhöhereSubstratkonzentrationenhergestelltwerden,umauchdenEndbereichderMichaelis-Menten-Kurvezuerreichen.NursokanneineerfolgreicheAuswertungmittelsPlot-Berechnungerfolgen.

Abbildung7HoherKM:eingesetzteSubstratkonzentrationensindzuniedrig,umdiegesamteKurvezuerfassen


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UmgekehrtkannesbeiEnzymenmitsehrkleinemKM-Wertpassieren,dassdieniedrigstegemesseneSubstratkonzentrationnochzuhochist,umindenlinearenBereichderMichaelis-Menten-Kurvezufallen.Dannmussdiesenochweiterverdünntwerden,damitauchdieserKurvenbereichaufgezeichnetwerdenkann.

Abbildung8NiedrigerKM:eingesetzteSubstratkonzentrationensindzuhoch,umdiegesamteKurvezuerfassen

Quellen:

BERGJM,TYMOCZKOJL,STRYERL:Biochemie.5.Auflage.SpektrumAkademischerVerlag,HeidelbergBerlin(2003);S.222-228

http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzass/substrate.htm(vom15.6.2012)


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PraktischerTeilIndiesemKapitelsollGenauereszudeneinzelnenExperimentenerläutertwerden,dieimLaufederbeidenÜbungstagedurchgeführtwerden.

Ø Besonderswichtigistes,dieReihenfolgedieserExperimentezuverstehen,dameistdasErgebniseinesExperimentsdieweitereVorgangsweisebestimmtbzw.dieVoraussetzungfürweitereVersuchedarstellt.DaheristeswährendderÜbungenauchbesonderswichtig,nachjedemExperimentsofortdieAuswertungdurchzuführenunddiesemitdenTutorenzubesprechen,umgemeinsamdienächstenSchrittezuüberlegen.

Ø JederStudentführtseineeigeneVersuchsreihedurch.Dabeikannnatürlichzusammengearbeitetwerden–wichtigistjedoch,dassjederseineeigenenErgebnisseprotokolliertundinterpretiert.DieErfahrungzeigt,dassesempfehlenswertist,seineeigenenVersucheauchselbstzupipettieren.UnbedingtvermiedenwerdensolltenOperatorwechselzwischendurch–dasschlägtsichmeistinderQualitätdergemessenenErgebnissenieder.

Ø BevormitdenExperimentenbegonnenwirdsolltensämtlichebenötigtenLösungen(PufferzurEnzymverdünnung,Substrat-Stocklösung,Stopplösung,evtl.weitereFarbreagenzien)hergestelltwerden.Dazumussberechnetwerden,wievielvonjederLösungproExperimentbenötigtwird.FürdieseBerechnungisteinesbesonderswichtig:

>SämtlicheVersuchewerdeninDoppelbestimmungdurchgeführt!<

Ø DieHerstellungderLösungenkannimTeamzuvierterfolgen.BeiderAufrundungdererrechnetenMengensollteimmerbeachtetwerden,wieteuerdiejeweiligeSubstanzist–daherbittenachderBerechnungmitdenTutorenabsprechen,wievielvonwelcherLösungtatsächlichhergestelltwerdensoll.

Ø Außerdemsollteberücksichtigtwerden,dassjedesExperimenteinenBlindwertverlangt.DieserwirdnichtbeijedemExperimentaufdieselbeWeiseermittelt!DerBlindwertunterscheidetsichvom„Leerwert“dadurch,dassalleLösungendarinenthaltensind,währendbeimLeerwertdieuntersuchteLösungweggelassenwird.BeimBlindwertmusssichergestelltwerden,dassdieLösungenkeineMöglichkeithaben,miteinanderzureagieren(z.B.EnzymundSubstrat–diesemüssendaherdurchStopplösungvoneinandergetrenntwerden!).AnsonstenwirdderBlindwertgenausobehandeltwiedieVersuchsansätzeunddaherimmerinDoppelbestimmunggemessen.DerBlindwertwirdbeiderAuswertungvonallenMesswertenabgezogen–auchvonsichselbst,wodurcheinNullpunktermitteltwird(„Absorption0“).

Ø WICHTIG:bittesämtlicheEnzymlösungen(auchVerdünnungen)immeraufEisaufbewahren!DieAktivitätnimmtsonstimLaufedesTagesab.Substratlösungen,PufferundStopplösungkönnenbeiRaumtemperaturaufbewahrtwerden.DieeigeneEnzymverdünnungmussamzweitenÜbungstagfrischhergestelltwerden,daüberNachtdieAktivitätstarkabnehmenkann.Wichtigdabeiist,dassdieVerdünnungaufdieselbeWeisewieamVortaghergestelltwird.

Ø ImProtokollunbedingtangeben,mitwelchemEnzymbeimKinetik-Praktikumgearbeitetwurde!DiesesistunterschiedlichjenachBeispiel(Proteinaktivität/Proteinbestimmung/Enzymkinetik).


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1–ErmittlungderEnzymverdünnungé Ziel:

ErmittlungeinerEnzymverdünnung,umimlinearenMessbereichdesPhotometerszuarbeiten

JenachdenErgebnissendesBeispiels„Proteinaktivität“werdenverschiedeneEnzymverdünnungengetestet(vondenTutorenangegeben).DamitwirdjeweilsderAktivitätsassayausgeführtundanschließendüberprüft,inwelchemBereichdiegemesseneAbsorptionliegt.Zielistes,eineAbsorptionzuerreichen,diezwischenca.0.4–0.6liegt,daindiesemBereichgemesseneWertelinearunddamiteinigermaßenverlässlichreproduzierbarsind.

DiesesExperimentistsozusagenein„Vor-Experiment“,daesdieGrundlagefüralleweiterenSchritteist.HierkannausnahmsweiseinEinfach-Bestimmunggearbeitetwerden.

NachAbschlussdiesesExperimentserhältjederStudentseine„eigene“Verdünnung,mitdereralleweiterenVersuchedurchführt.DazubittediegemessenenWertemitdenTutorenbesprechen.DieTutorenlegenanschließendeineentsprechendeVerdünnungproStudentfest,d.h.vondaanmussjederseineeigeneVersuchsreihedurchführen.

F Durchführung:

1. EnzymverdünnungenvondenTutorenerfragenundherstellen(inPuffer!)

2. Aktivitätsassayslt.Angabemitdiesendurchführen(Einfachbestimmung)

3. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen

4. ErgebnissemitTutorenbesprechen–eigeneVerdünnungerfragen

à Blindwert:einenBWfürjedeEnzymverdünnungerstellen,wobeialleLösungenenthaltenseinmüssenohnemiteinanderzureagieren,d.h.manpipettiertz.B.Enzym-Stopplösung-Substrat(Reihenfolgeistegal,solangedieStopplösungzugesetztwird,bevorEnzymundSubstratmiteinanderreagierenkönnen).

! Für’sProtokoll:

WichtigistdieAngabedergewähltenVerdünnung,mitderweitergearbeitetwirdundeineErklärung,warumdieseVerdünnunggewähltwurde.AußerdemsindsämtlicheOriginal-Messdatenanzugeben.DieMethodensindindeneigenenWortenzubeschreiben(könnenauchgraphischergänztwerden):WennSiealsMethodenur„sieheUnterlagen“angeben,müssenSieeinkorrigiertesProtokollnachreichen.DasverwendeteEnzymmüssenSieauchnennen.

2–Zeitabhängigkeitsexperiment(VariierenderInkubationszeit)é Ziel:

ErmittlungeinerInkubationszeit,umimlinearenAktivitätsbereichdesEnzymszuliegen

BeidiesemExperimentstehtderParameterInkubationszeitimVordergrund.EinegeeigneteInkubationszeitfürdenAktivitätsassayzuermittelnisteinewichtigeVoraussetzungfüralleweiterenVersuche–vorallemfürdasMichaelis-Menten-Experiment(ErmittlungderEnzymkinetik).

EineVorbedingung,umKinetikmessungendurchzuführen,istdieArbeitimlinearenAktivitätsbereichdesEnzyms.GemessenwerdensollenAnfangsgeschwindigkeiten(v0),dasonstkeineKinetikkurve


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aufgenommenwerdenkann.JedeEnzymaktivität(gemessenalsGeschwindigkeitderProduktbildungoder„Arbeitsgeschwindigkeit“)flachtnacheinergewissenZeitabunderreichtirgendwanneinPlateau.Dahermusssichergestelltwerden,dassdieimAktivitätsassayangegebeneInkubationszeitnochimlinearenGeschwindigkeitsbereichdesEnzymsliegt.AusdiesemGrundwirdnundieInkubationszeitvariiertundeineZeitabhängigkeitskurveaufgenommen.

NachAbschlussdiesesExperimentswirddieInkubationszeitangepasst,daheristeswiederwichtig,dieErgebnisseauszuwertenundmitdenTutorenzubesprechen,bevorweitergearbeitetwerdenkann.DieTutorenlegendanneineInkubationszeitfest,dieeinengutenKompromisszwischengutemAbsorptionswert(0.4–0.6)undlinearerEnzymgeschwindigkeitdarstellt.

F Durchführung:

1. AktivitätsassaymitdereigenenVerdünnungdurchführenundjeweilsinDoppelbestimmunginkubieren:

a. 5Minutenb. 10Minutenc. 15Minutend. 20Minuten

DabeikönnenalleAnsätzeparallelangesetztundgestartetwerden.In5-Minuten-AbständenwirddannjeweilseinDoppel-Ansatzgestoppt.DieStopplösungsolltedirektnachAblaufderZeitimWasserbadzugegebenwerden,dasonsteinezeitlicheUngenauigkeithinzukommt.

à WICHTIG:ZeitGENAUeinhalten!Stoppuhrverwenden!

2. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen(diegestopptenAnsätzekönnenbeiRaumtemperaturaufgehobenundanschließendzusammengemessenwerden)

3. InExceleineZeitabhängigkeitskurveerstellen(sieheunten)

4. ErgebnissemitTutorenbesprechen–gemeinsamInkubationszeitanpassen

à Blindwert:istindiesemFallein„0-Minuten“-Blank,d.h.EnzymundSubstratdürfenkeineZeithaben,miteinanderzureagieren.DieDurchführungerfolgtalsogenausowiezuvor(z.B.Enzym-Stopplösung-Substrat).FürdieAuswertungwerdenalleMesswerteumdenBlindwertkorrigiert(d.h.subtrahieren).Wichtigistes,denBlindwertauch„vonsichselbst“zusubtrahieren,umeinenNullpunktfürdieGrafikzuerhalten.

à WICHTIG:EnzymundSubstratwerdenbeiverschiedenenTemperaturenaufbewahrt(Enzym:Eis,Substrat:RT).DieReaktionsollbei37°C(Ausnahme:real-timeMessungen)stattfinden.WennEnzymundSubstratsofortzusammenpipettiertwerden,dauerteseinegewisseZeit,bisbeidedieReaktionstemperaturerreichthaben.Dabeikommteszueinersog.„Lag-Phase“,welchevoralleminderZeitabhängigkeitskurvesofortsichtbarwird.

DieseLag-Phasemussunbedingtverhindertwerden,indemEnzymundSubstratgetrenntvoneinandervorgewärmtwerden.DazuindenReaktionsröhrchendasbenötigteVolumenanEnzymvorlegen,ineinextraRöhrcheneinAliquotanSubstratlösung(Menge,diefüralleAnsätzederVersuchsreihebenötigtwird+einbisschenmehr)pipettierenundallesimWasserbadfür1-2minvorwärmen.DanndieReaktiondurchZugabedesentsprechendenVolumensSubstratlösungzudenvorbereitetenRöhrchenstarten.DieseVorgangsweisegiltfüralleVersuche!


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AnzugebensinddieOriginalmesswerte(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieZeitabhängigkeitskurvefürdieeigeneVerdünnung.AußerdemistdieKurvezuinterpretierenunddieangepassteInkubationszeitanzugeben(inkl.Erklärung,warumbzw.wiedieseangepasstwurde).

Abbildung9Zeitabhängigkeitskurve–nach20MinutentrittmeistschoneineAbflachungderKurveauf,manchmalkanndieAbflachungaberauchbereitsnach15Minutensichtbarwerden

3–Michaelis-Menten-Experiment/KM-WertBestimmung(VariierenderSubstratkonzentration)

é Ziel:

ErmittlungdesKM-WertsdeseigenenEnzyms

DiesesExperimentstelltdas„Herzstück“unseresBeispielsdar.UnterdenzuvorermitteltenBedingungen(eigeneEnzymverdünnungsowieangepassteInkubationszeit)werdennunzurBestimmmungdesKM-WertsAktivitätsassaysmitunterschiedlichenSubstratkonzentrationendurchgeführt.

DabeiwirdvonderursprünglichangegebenenSubstrat-Stockkonzentration(laut„Rezept“–meist5mM)alshöchsterKonzentrationsstufeausgegangenundinäquidistantenSchrittenverdünnt.DazumussnichtunbedingteineeigeneSubstrat-LösungproVerdünnunghergestelltwerden,sondernessollteeinPipettierschemaüberlegtwerden,beidemvonderursprünglichenStocklösungausgegangenwirdunddieeingesetztenVoluminavariiertwerden.

à Beispiel:dieursprünglicheSubstrat-StocklösunghateineKonzentrationvon5mM,d.h.äquidistanteSchrittewären5mM–4mM–3mM–2mM–1mMund0mM(Blindwert).

DavonderSubstrat-Stocklösungimmer100µLeingesetztwerden,kanndiesesVolumenentsprechendderVerdünnungunterschiedlichzusammengesetztwerden–sieheTab.1.

Konzentration 5mM-Stock H2O Gesamtvolumen

5mM 100µL 0µL 100µL4mM 80µL 20µL 100µL3mM 60µL 40µL 100µL2mM 40µL 60µL 100µL1mM 20µL 80µL 100µL0mM 0µL 100µL 100µL

Tabelle1PipettierschemafürMichaelis-Menten-ExperimentamBeispielSubstratstocklsg.5mM


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Wichtigist,dassdasSubstrat-GesamtvolumenimmergleichbleibtunddenursprünglichenAssay-Bedingungen(laut„Rezept“)entspricht,dasonstunterschiedlicheVerdünnungseffekteeintretenunddiegemessenenAbsorptionennichtvergleichbarsind.

NachdemdieMessungenbeidiesenSubstratkonzentrationen(wiederinDoppelbestimmung!)abgeschlossensind,mussunbedingtsofortdieAuswertungerfolgen.Dabeikannessein,dassdergewählteKonzentrationsbereichnichtdengesamtenVerlaufderMichaelis-Menten-Kurveabdeckt.DaswirdausdergraphischenAuswertungschnelldeutlichundsollteunbedingtmitdenTutorenbesprochenwerden.

Dabeikönnen2Fälleeintreten:

1. DieKonzentrationenliegenbereitsimvmax-BereichderKinetik(Plateau),d.h.esmüssenstärkereVerdünnungengemessenwerden,umauchdenAnfangsbereichzuerfassen

2. DieKonzentrationenliegenimextremenAnfangsbereichderKinetik(lineareSteigungohneAbflachung),d.h.esmüssenhöherkonzentrierteSubstrat-Stocklösungenhergestelltwerden,umauchdenEndbereichzuerfassen.

DieweitereVorgangsweisewirdmitdenTutorenbesprochen.FürdieAuswertungsollteninjedemFalldieKinetik-KurveUNDderHanes-Ploterstelltwerden,danurbeideGrafikeninVerbindungeineverlässlicheAussageermöglichen.

BeidiesemExperimentwirktsichaucheineungenaueArbeitsweisestarkaufdieErgebnisseaus.InvielenFällenmussdiegesamteMessungwiederholtwerden,dadieerstenErgebnissezukeinerAussageführen.In99%derFällefälltder2.VersuchdeutlichgenauerausJBittemitdenTutorenabsprechenundnichtwundern,wenndasExperimentwiederholtwerdenmuss.

F Durchführung:

1. SubstratverdünnungenundPipettierschemaüberlegenundmitTutorenabklären(!)

2. AktivitätsassaysunterermitteltenBedingungen(eigeneEnzymverdünnungundangepassteInkubationszeit)mitdiesenVerdünnungendurchführen(inDoppelbestimmung)

3. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen

4. InExceldieDatenauswerten:eineGeschwindigkeitskurveUNDdenHanes-Ploterstellen(sieheunten)

5. ErgebnissemitTutorenbesprechen–eventuellweitereSubstratverdünnungenmessenbzw.gesamtesExperimentwiederholen

à Blindwert:derBlindwertistbeidiesemExperimentdie„0-Substrat-Konzentration“–dieseauchinDoppelbestimmungmessen(genausowiedieanderenAnsätzebehandelnd.h.mit-inkubieren)undfürdieAuswertungvonallenMesswertensubtrahieren.Wichtigistwieder,denBlindwertauch„vonsichselbst“zusubtrahieren,umeinenNullpunktzuerhalten.


AnzugebensinddieOriginalmesswerte(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieMichaelis-Menten-Kurve(=Geschwindigkeitskurve,Substratabhängigkeitskurve)undderHanes-PlotfürdieeigeneVerdünnung.Außerdemistder


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KM-WertinbeidenGrafikeneinzuzeichnenundmittelsHanes-Plotauszurechnen.DabeisollenauchdieKM-WertederGruppenkollegen(selberEnzymextrakt)angegebenwerdenundeventuelleAbweichungenkommentiertwerden.Einheiten(mMbzw.mmol/L)nichtvergessen!

à ACHTUNG:beiderErstellungderGrafiken(undsomitauchfürdieBerechnungdesKM)istdiefinaleSubstratkonzentrationimAnsatzzuverwenden!DieseistnichtidentmitdereingesetztenSubstrat-Stocklösung(z.B.5mM–4mM–usw.)!Esmussberechnetwerden,wiedieSubstratlösungimAnsatzweiterverdünntwurde,z.B.durchZugabevonPufferbzw.Enzymlösung.FürdieMichaelis-Menten-KinetikistdieKonzentrationanSubstratimAnsatz,d.h.währendderReaktion,relevant.SobalddieReaktiondurchZugabevonStopplösungbeendetwird,kanndasEnzymnichtweiterarbeiten–daheristdasStopplösungsvolumenfürdieBerechnungnichteinzubeziehen.Wichtigistlediglich,welcheSubstratkonzentrationdemEnzymwährendderReaktionzurVerfügungsteht.

4–Temperaturabhängigkeitsexperiment/Temperatur-Optimum(VariierenderInkubationstemperatur)é Ziel:

ErmittlungderTemperatur,beiwelcherdiehöchsteEnzymaktivitätvorliegt

NunwirdderParameter„Temperatur“variiert.Dabeisollherausgefundenwerden,wiesichunterschiedlicheInkubationstemperaturenaufdieEnzymaktivitätbzw.dieReaktionsgeschwindigkeitauswirken.

Abbildung10Michaelis-Menten-Kurve

Abbildung11Hanes-Plot


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DabeiistesbesonderswichtigimHinterkopfzubehalten,dassessichbeideruntersuchtenReaktionumeineenzymatischkatalysiertehandelt.Dasbedeutet,dassnebendesthermodynamischenEffekts(höhereTemperaturàhöhereEnergieàchemischeReaktionläuftschnellerab)einegegenläufigesPhänomenauftritt,welchessichumgekehrtauswirkt.BeihohenTemperaturenkommteszurDenaturierungdesEnzyms–dadurchnimmtdieAktivitätimProteinextraktab.

ErmitteltwerdensolldahereinTemperatur-Optimum,beidemdieAktivitätnochpositivbeeinflusstwird,bevorsieaufgrundderkonkurrierendenDenaturierungs-Reaktionbeginntabzunehmen.

WenneszurDenaturierungdesEnzymskommt,wirddiesinFormeinesPräzipitatsimReaktionsröhrchensichtbar.EinsolchesPräzipitatkanndeutlichausfallen,kannabermanchmalauchnurinFormeinerleichtenTrübungderLösungerkennbarsein.DaeineLösung,diePräzipitatenthält,wederverlässlichpipettiertwerdenkann,nochderenAbsorptionreproduzierbargemessenwerdenkann(aufgrundvonStreuung,dieinderKüvettedurchdiePartikelauftritt),mussjedetrübeLösungvorderMessungabzentrifugiertwerden.DazuüberführtmandieMesslösungineinEppendorf-HütchenundzentrifugiertinderEppendorf-Zentrifugefür1Minutebei13200rpm(Tutorfragen!).

DieMessungenerfolgenanhanddesAktivitätsassay-Rezepts,wobeiwiederumdieeigeneVerdünnungunddieselbstermittelteInkubationszeiteingehaltenwerden.DieAuswertungsollgleichanschließendinExceldurchgeführt(sieheunten)undmitdenTutorenbesprochenwerden.

F Durchführung:

1. AktivitätsassaymitdereigenenVerdünnungdurchführenundjeweilsinDoppelbestimmunginkubierenbei:

a. 0°Cbzw.4°C(aufEis,amPlatz)b. Raumtemperatur(amPlatz)c. 37°C(imWasserbad)d. 55°C(imWasserbad)e. 75°C(imWasserbad)

à WICHTIG:Timingüberlegen,daessonsthektischwerdenkann,dieverschiedenenWasserbäderimAugezubehalten!


3. InExceleineTemperaturabhängigkeitskurveerstellen(sieheunten)

4. ErgebnissemitTutorenbesprechen

à Blindwerte:gibtesbeidiesemExperimentverschiedene.Daesbei55°Cund75°CzueinemrelativgroßenEnergieeintragdurchWärmezufuhrkommt,musssichergestelltwerden,dassdiebeobachtbareProduktbildungtatsächlichaufArbeitdesEnzymszurückzuführenist.DieAbspaltungeinerGruppevomSubstratmolekül,dieanschließendzurFärbungführt,kannbereitsdurchdiehoheTemperaturselbstpassieren(thermischerZerfall).

DahermussbeidenbeidenhöchstenTemperaturenein„Substrat-Blank“gemessenwerden,beidemnurdasSubstratfürdieermittelteInkubationszeitinkubiertwird(MengenachAngabeimAktivitätsassay,z.B.100µL).NachAblaufderZeitwirddemBlankgenauwiedenanderenAnsätzenStopplösungzugesetzt.AbschließendmussaberauchnochdieEnzymlösungzugefügtwerden,damitwiederalleLösungenimAnsatzvorhandensind(Gesamtvolumenmussstimmen!).


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FürdieTemperaturenzwischen0°Cund37°Ckannwiederder„0-Minuten“-Blank(z.B.Enzym-Stopplösung-Substrat)verwendetwerden.DaderursprünglicheAktivitätsassayjabei37°C(bzw.RTbeidenreal-timeBeispielen)durchgeführtwurde,kanndavonausgegangenwerden,dassesbeidieserTemperaturnochzukeinerthermischenZerfallsreaktionkommt.

FürdieAuswertungwerdenalleMesswerteumdenjeweiligenBlindwertkorrigiert(d.h.subtrahieren).

à WICHTIG:Esgiltwiederzubeachten,dassEnzymundSubstratbeiverschiedenenTemperaturenaufbewahrtwerden.DieReaktionsollbeiverschiedenenTemperaturenstattfinden.Umeine„Lag-Phase“zuverhindern,müssenbeideLösungenwiedergetrenntvoneinandervorgewärmtwerden.DieVorgangsweisekanngenauwievorhererfolgen,egalbeiwelcherTemperaturgemessenwird.

Vorsichtistallerdingsbei75°Cgeboten,daeshierschonbeieinerInkubationdesEnzymsvonwenigenMinutenzurDenaturierungkommenkann.DahersolltedieVor-Inkubationhiermax.30secbetragen!


AnzugebensinddieOriginalmesswerte(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieTemperaturabhängigkeitskurvefürdieeigeneVerdünnung.AußerdemistdieKurvezuinterpretierenunddasermittelteTemperaturoptimumanzugeben.

Abbildung12Temperaturabhängigkeitskurve–beiEnzymenauspflanzlichenQuellenistmeisteinTemperaturoptimumbei55°Czubeobachten,wobeidieGründedafürunklarsind

SONDERFALLReal-TimeMessungen:

WieinderEinleitungbeschrieben,müssenmancheAktivitätsassays(z.B.Peroxidase)direktimPhotometerdurchgeführtwerden,wobeidieProduktmessungübereinenZeitraumvonzweiMinutenlaufenderfolgt(AbsorptionwirddirektvomGerätalle20secgemessen).Daesnichtmöglichist,dasPhotometeraufverschiedeneTemperaturenzubringenundderAktivitätsassaydahernichtbeiverschiedenenTemperaturendurchgeführtwerdenkann,wirdjenachEnzymeinAlternativexperimentdurchgeführt.GenaueresdazuwirdvondenTutorenerläutert.


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5–Lagerstabilitätsexperiment/Temperatur-Stabilität(VariierenderLagerbedingungen)é Ziel:

ErmittlungdesEinflussesvonLager-Temperaturund-VerdünnungaufdieEnzymstabilität

ZumSchlusswerdenineinemweiterenExperimentverschiedeneEinflussfaktorenderEnzymlagerunguntersucht.DazugehöreneinerseitsdieTemperatursowieandererseitsdieVerdünnung,inwelcherdasEnzymaufbewahrtwird.

Wichtigistzuverstehen,dassbeidiesemExperimenteineunterschiedlicheVorbehandlungdesEnzymsnotwendigist–undzwarsolldasEnzymalleinevorbehandeltwerden,d.h.eserfolgteineArt„VorinkubationohneSubstrat“.ÄhnlicheStudienmüsseninUnternehmendurchgeführtwerden,wennesdarumgehtzuermitteln,unterwelchenBedingungenz.B.reineEnzymextrakteeingelagertbzw.versendetwerdenmüssen.DieseBedingungenvariierenvonExtraktzuExtrakt.NatürlichkönnendieProben,dieindiesemPraktikumverwendetwerden,keinesfallsalsreineEnzymextrakteangesehenwerden,daessichumkomplexeProteinlösungenhandelt.IndiesemZusammenhangistesaberwiederuminteressantzubeobachten,wiesichdieLagerstabilitätverändert,daz.B.Proteasen,die„unser“Enzymabbauen,unterbestimmtenBedingungenaktiversindalsunteranderen.

UmdenEinflussderLagertemperaturzuermittlen,wirdjeweilseinAliquotdesEnzymextraktsbeiverschiedenenTemperaturen(sieheunten)fürmindestens1Stundeeingelagert.DieZeitkannselbstgewähltwerden–esistempfehlenswert,den2.ÜbungstagmitderEinlagerungzubeginnenundinderLagerzeitdasTemperatur-Optimum-Experimentdurchzuführen,damitkeineunnötigeWartezeitentsteht.GenaueresdazuwirdamÜbungstagvondenTutorenerklärt.DiegenaueLagerzeitkanndaherjenachArbeitsgeschwindigkeitderGruppenmitgliedervariieren–wichtigist,dasssie:

• mindestens1Stundebeträgt• undbeiallenGruppenmitgliederngleichist.

D.h.dassderersteStudenteinerGruppe,dermitdenMessungendesLager-Experimentsbeginnt,dieeingelagertenAliquoteallerGruppenmitgliederzusammensammelt.DiegenaueLagerzeitwirdnotiert.InderZwischenzeitzwischen„einsammeln“undbisdieanderenGruppenmitgliederzumessenbeginnen,könnensämtlicheAliquoteaufEisaufbewahrtwerden(wiebeidenanderenExperimenten).DieZeitbiszurMessungistdannirrelevant.

ZurUntersuchungdesVerdünnungs-EffektswirdjedemStudenteneinerGruppe(meistzuviert)eineEnzym-Verdünnungzugeteilt,diedieserherstelltundinAliquotenbeidenjeweiligenTemperatureneinlagert.DieseVerdünnungistnichtidentmitderjenigenVerdünnung,diebeiallenvorigenExperimentenverwendetwurde!Eshandeltsichdabeilediglichumeine„Vor-Verdünnung“.

NachAblaufderLagerzeitmussdieeingelagerteVerdünnungsinnvollweiterverdünntwerden.DabeiwirdvondenTutoreneine„Ziel-Verdünnung“proGruppefestgelegt,beiwelcherletztendlichdieMessungerfolgensoll.Diese„Ziel-Verdünnung“wirdanhanddervorherigenExperimentegewähltundsollteeineAbsorptionvonca.0.5liefern(mitdenTutorenabsprechen!).UmdieVorgangsweisezuverdeutlichen,seieinBeispielangegeben.

à Beispiel:dieZiel-Verdünnungeiner4er-Gruppesoll1:150betragen.DieTutorenlegenfolgendeVor-VerdünnungenfürdieLagerungfest:unverdünnt,1:10,1:50,1:100.JederStudentwählteineVor-Verdünnungundmusssichnunüberlegen,wieeramEndederLagerzeitdieseweiterverdünnenmuss,umaufdieZiel-Verdünnung1:150zukommen(Tab.2).


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Vor-Verdünnung

Ziel-Verdünnung

notwendigerweiterer

Verdünnungs-schritt

Volumenteile

unverdünnt 1:150 1:150 1(unv)+149Puffer1:10 1:150 1:15 1(1:10)+14Puffer

1:50 1:150 1:3 1(1:50)+2Puffer

1:100 1:150 1:1.5 1(1:100)+0.5PufferTabelle2VerdünnungstabellefürdasLager-Experiment(Beispiel)

Umzuberechnen,welchesVolumenderVor-Verdünnungeingelagertwerdenmuss,solltesichjederStudentbereitseineigenesPipettierschemaüberlegen.ProTemperaturmusseinAliquoteingelagertwerden.ProTemperaturerfolgt1MessunginDoppelbestimmung–d.h.eswerden2x100µLEnzymverdünnungbenötigt(Ausnahme:real-timeMessungen!).UmalsoamEndeproTemperatur(d.h.proAliquot)mindestens200µLderZiel-Verdünnungzuerhalten,mussüberlegtwerden,wiedieVor-Verdünnungweiterverdünntwerdenkann.

Z.B.wenndieVor-Verdünnung1:50beträgt,mussdiese1:3weiterverdünntwerden–d.h.ummind.200µLzuerhalten,können100µLderVorverdünnung+200µLPufferpipettiertwerden.DasGesamtvolumenbeträgtdann300µL–alsogenug,umdieDoppelbestimmungdurchzuführen.

DiessollnuralsBeispieldienen–jederStudentsolltesicheineigenesSchemaüberlegen,wiederweitereVerdünnungsschrittdurchgeführtwerdenkann.

à WICHTIG:essolltenniemals<40µLpipettiertwerden(UngenauigkeitderPipetten)!

Weitersgiltzubeachten,dasseswährendderLagerungdesEnzymszurDenaturierungkommenkann(wiezuvorbeschrieben).DabeikanndurchauseinegroßeProteinmengeausfallen–dasPräzipitatmusswiederunbedingtabzentrifugiertwerden(Eppi-Zentrifuge),bevorweitergearbeitetwird.AusdiesemGrundsollteunbedingtmehrVolumenanVor-VerdünnungproTemperatureingelagertwerden,alsfürdenweiterenVerdünnungsschrittbenötigtwird.InunseremBeispielbenötigtderStudent100µLseinerVor-VerdünnungzumWeiterarbeiten–ersolltedaherzurSicherheit300µLeinlagern,umausreichendLösungzurVerfügungzuhaben,wenngroßeProteinmengenpräzipitieren.BitteunbedingtvordemEinlagernmitdenTutorenabklären!

DieMessungenerfolgenanschließendwiederanhanddesursprünglichenAktivitätsassay-Rezepts.DieAuswertungwirdinExceldurchgeführt(sieheunten)undmitdenTutorenbesprochen.

F Durchführung:

1. Ziel-VerdünnungundVor-VerdünnungenmitTutorenbesprechen

2. Vor-Verdünnungwählen,Pipettierschemaüberlegen,notwendigesVolumenproAliquotberechnenundvonTutorenüberprüfenlassen

3. Vor-VerdünnungfüralleAliquotsherstellen,in6EppisaliquotierenundbeifolgendenTemperaturenjeeinEppifürmind.1Stundeeinlagern:

a. -20°C(imGefrierschrank#2)b. 0°Cbzw.4°C(aufEis,amPlatz)c. Raumtemperatur(amPlatz)d. 37°C(imWasserbad)e. 55°C(imWasserbad)f. 75°C(imWasserbad)


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Für’sEinlagernimWasserbadstehenStyropor-SchwimmerzurVerfügung(Tutoren/Thomasfragen).

4. derersteStudent,dermitdemTemperatur-OptimumfertigistunddieLager-Messungbeginnt,holtalleAliquotsderGruppevondenverschiedenenTemperaturenundlagertsiebisallefertigsindaufEis

5. Ziel-VerdünnungproTemperaturanhanddeseigenenPipettierschemasherstellen

6. AktivitätsassayjeweilsinDoppelbestimmungdurchführenundbei37°Cinkubieren(Ausnahme:real-time)


8. InExceleineLagerstabilitätskurveerstellen(sieheunten)

9. ErgebnissemitTutorenbesprechen

à Blindwert:DaderAktivitätsassaywieschonbeimZeitabhängigkeits-undbeimMichaelis-Menten-ExperimentwieimursprünglichenRezeptangegebenbei37°Cdurchgeführtwird(Ausnahme:real-time),musslediglichder„0-Minuten“-Blank(z.B.Enzym-Stopplösung-Substrat)gemessenwerden.Dabeiistesegal,welchedereingelagertenEnzymlösungendafürverwendetwird,daeshierkeinegroßenUnterschiedegibt.Wichtigistaberzubeachten,dassdieverwendeteEnzymverdünnungmitderZiel-Verdünnungübereinstimmt.


AnzugebensinddieOriginalmesswerteallerGruppenmitglieder(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieLagerstabilitätskurvefüralleVor-Verdünnungen(alleGruppenmitglieder–in1Diagramm).AußerdemistdieKurvehinsichtlichderEinflussfaktorenzuinterpretieren.

Abbildung13Lagerstabilitätskurve–beidiesemBeispiellässtsichanhandderKurvekeinsignifikanterEinflussderVerdünnungableiten


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ZEITPLAN(ungefähr)fürEnzymkinetik-Beispiel

Zeit(ca.) 1.ÜBUNGSTAG 2.ÜBUNGSTAG

9:30–10:00

9:30–VorbesprechungimSeminarraum(mitProf.Wilson)

9:30–KurzeVorbesprechungimLabor(mitTutoren)

10:00–

11:00

EinlagerungderEnzymverdünnungenfürLagerstabilitätsexperiment

11:00–

12:00HerstellungsämtlicherbenötigterPufferundLösungenundErmittlungderArbeitsverdünnung

Temperaturoptimum-ExperimentErmittlungdesTemperaturoptimums

12:00–

13:00

Lagerstabilitätsexperiment(Messungen)ErmittlungdesEinflussesvonLagertemperaturundVerdünnung

13:00–

14:00

ZeitabhängigkeitsexperimentErmittlungdeslinearenArbeitsbereichs -PAUSE-

14:00–

15:00

Michaelis-Menten-ExperimentErmittlungdesKm-Wertes

Zwischen14:00und16:30–NachbesprechungfürEnzymkinetikundProteinbestimmungimSeminarraum(mitProf.Wilson)

15:00–

16:00

16:00–

17:00

Documents

Unterlagen zum Übungsbeispiel - boku.ac.at · Eine enzym-katalysierte Reaktion, die der Michaelis-Menten-Theorie folgt, lässt sich darstellen wie folgt: Die Reaktionskonstante des