Untersuchungen zum Stoffwechsel von Aminen und Polyaminen ... · Spm. Spermin SPMS Spermin-Synthase SSAT Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase TF Testfermenter TFA Trifluoressigsäure

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zum Stoffwechsel von Aminen und

Polyaminen bei Einsatz von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißgehalten unter Zulage

von Soja im Pansen in vitro

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Anna Thomsen

Itzehoe

Hannover 2018

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Dr. M. Höltershinken Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker

2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. S. Leonhard-Marek

Tag der mündlichen Prüfung: 07.05.2018

Gefördert durch den Milchförderungsfonds Hannover-Braunschweig

Du bist ewig für das

verantwortlich, was du dir vertraut gemacht hast. Du bist für deine Rose

verantwortlich.

Antoine de Saint-Exupéry aus „Der kleine Prinz“

Meiner Familie

Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgender Tagung präsentiert: 70. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie – Hannover, 08.–10.03.2016, Posterbeitrag Nr. 42 GÖRES, N., K. GLÖCKL, C. HUNSCHE, M. ILLE, C. SCHULTE, A. THOMSEN M. HOEDEMAKER und M. HÖLTERSHINKEN (2016): Impact of soybean protein on ruminal phenolic content by feeding grass silages containing different levels of true protein in vitro. Proceedings of the Society of Nutrition Physiology 25, S. 58 Vortragsbeitrag Nr. 21 HÖLTERSHINKEN, M., M. COENEN, K. GLÖCKL, N. GÖRES, W. HEIMBECK, M. HOEDEMAKER, C. HUNSCHE, M. ILLE, C. PARYS, C. SCHULTE, A. THOMSEN, P. WOLF und K. EICKEN (20016): Amino acid Composition of grass silages containing different levels of true protein in total crude protein. Proceedings of the Society of Nutrition Physiology 25, S. 37 Posterbeitrag Nr. 43 THOMSEN, A., K. GLÖCKL, N. GÖRES, C. HUNSCHE, M. ILLE, C. SCHULTE, M. HOEDEMAKER und M. HÖLTERSHINKEN (2016): Studies on the metabolism of amines when feeding grass silage containing different levels of true protein and the influence of soybean meal using the RUSITEC-System. Proceedings ot the Society of Nutrition Physiology 25, S. 59

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ............................................................................................................ 1 2 Schrifttum ........................................................................................................... 3

2.1 Amine und Polyamine – Bezug zu vorherigen Untersuchungen ................... 3 2.2 Eigenschaften der Polyamine und Amine ..................................................... 5

2.2.1 Amin- und Polyaminmetabolismus in der Pflanze .................................. 6 2.2.2 Amin- und Polyaminmetabolismus im Pansen ....................................... 9 2.2.3 Amine und Bakterien ............................................................................ 14 2.2.4 Enzymsysteme..................................................................................... 16 2.2.5 Polyamine und Phenole ....................................................................... 20 2.2.6 Transglutaminasen .............................................................................. 21 2.2.7 Bedeutung der biologischen Wirkung und möglichen Toxizität

von Aminen .......................................................................................... 22 2.3 Zusammenfassende Wertung ..................................................................... 27 2.4 Zielsetzung der Arbeit ................................................................................. 28

3 Material und Methodik ..................................................................................... 29 3.1 Ziel der Methodik ........................................................................................ 29 3.2 Material und Methoden ............................................................................... 29

3.2.1 Herkunft der Proben ............................................................................. 30 3.2.2 RUSITEC ............................................................................................. 31 3.2.3 Dauerbetrieb des RUSITEC ................................................................. 36 3.2.4 Analytik ................................................................................................ 37 3.2.4.1 Analyse der flüchtigen Fettsäuren (i-Säuren) ................................. 37 3.2.4.2 Bestimmung des Ammoniakgehaltes .............................................. 38 3.2.4.3 Bestimmung der Überstandsvolumina ............................................ 38 3.2.4.4 Datenverarbeitung der Aminosäureanalyse von Grassilagen

(EVONIK Nutrition & Care GmbH) .................................................. 38 3.2.4.5 Analyse der Amine, Polyamine und Aminosäuren (LC-MS/MS) ..... 39

3.2.4.5.1 Entwicklung der Methode zur Messung von Aminen ................. 39 3.2.4.5.2 Auswahl der erfassten Amine .................................................... 40 3.2.4.5.3 Probenmaterial zur Methodenentwicklung ................................ 44 3.2.4.5.4 Auswahl des Extraktionsverfahrens .......................................... 44 3.2.4.5.5 Derivatisierung von Standards mit FMOC-Chlorid als Ansatz ... 45 3.2.4.5.6 Gewinnung und Aufbereitung der Fermenterproben ................. 46 3.2.4.5.7 Aufbereitung der gefriergetrockneten Grassilagen .................... 48 3.2.4.5.8 Laufbedingungen der LC-MS/MS .............................................. 48 3.2.4.5.9 Bestimmung der Wiederfindungsrate ........................................ 49 3.2.4.5.10 Mögliche Polyaminverbindungen ............................................ 52 3.2.4.5.11 Standardlösungen ................................................................... 53 3.2.4.5.12 Interne Standards .................................................................... 54 3.2.4.5.13 Externer Standard ................................................................... 54 3.2.4.5.14 Kalibration ............................................................................... 54 3.2.4.5.15 Messroutine der LC-MS/MS .................................................... 62 3.2.4.5.16 Überprüfung der Messgenauigkeit der LC-MS/MS .................. 62 3.2.4.5.17 Art der Auswertung.................................................................. 63

Inhaltsverzeichnis

II

3.2.4.5.18 Zusammenfassende Wertung der Methode ............................ 65 3.2.5 Statistische Auswertung ....................................................................... 66 3.2.5.1 Verteilungsanalyse ......................................................................... 66

4 Ergebnisse ........................................................................................................ 67 4.1 Vorkommen von flüchtigen Fettsäuren (i-Säuren) ...................................... 67

4.1.1 Vorkommen von i-Buttersäure ............................................................. 68 4.1.2 Vorkommen von i-Valeriansäure .......................................................... 72

4.2 Vorkommen von Ammoniak ........................................................................ 76 4.3 Ergebnisse der Aminosäureanalyse (EVONIK Nutrition & Care GmbH)..... 78 4.4 Beziehung zwischen g-Aminobuttersäure und Glutamat ............................. 81 4.5 Vorkommen von Polyaminen und Aminosäuren im RUSITEC ................... 81

4.5.1 Vorkommen von Cadaverin im flüssigen Fermenterinhalt .................... 82 4.5.2 Vorkommen von L-Lysin im flüssigen Fermenterinhalt ........................ 84 4.5.3 Vorkommen von Putrescin im flüssigen Fermenterinhalt ..................... 86 4.5.4 Vorkommen von Spermidin im flüssigen Fermenterinhalt .................... 88 4.5.5 Vorkommen von Spermin im flüssigen Fermenterinhalt ....................... 90 4.5.6 Summe der Polyamingehalte von Putrescin, Spermidin und

Spermin im flüssigen Fermenterinhalt .................................................. 92 4.5.7 Vorkommen von m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) im

flüssigen Fermenterinhalt ..................................................................... 94 4.5.8 Vorkommen von L-Arginin im flüssigen Fermenterinhalt ...................... 94 4.5.9 Vorkommen von L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt .................... 96 4.5.10 Vorkommen von L-Methionin im flüssigen Fermenterinhalt ................. 98 4.5.11 Summe der Aminosäuregehalte von L-Arginin, L-Methionin und

L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt ............................................. 100 4.5.12 Vorkommen von β-Alanin im flüssigen Fermenterinhalt ..................... 102 4.5.13 Vorkommen von γ-Aminobuttersäure im flüssigen

Fermenterinhalt .................................................................................. 104 4.5.14 Vorkommen von gelöstem Cadaverin im festen Fermenterinhalt....... 106 4.5.15 Vorkommen von gelöstem L-Lysin im festen Fermenterinhalt ........... 108 4.5.16 Vorkommen von gelöstem Putrescin im festen Fermenterinhalt ........ 110 4.5.17 Vorkommen von gelöstem Spermidin im festen Fermenterinhalt ....... 112 4.5.18 Vorkommen von gelöstem Spermin im festen Fermenterinhalt.......... 114 4.5.19 Summe der gelösten Polyamine Putrescin, Spermidin und

Spermin im festen Fermenterinhalt .................................................... 116 4.5.20 Vorkommen von gelöstem m/z 173 (möglicherweise

Thermospermin) im festen Fermenterinhalt ....................................... 118 4.5.21 Vorkommen von gelöstem L-Arginin im festen Fermenterinhalt......... 120 4.5.22 Vorkommen von gelöstem L-Ornithin im festen Fermenterinhalt ....... 122 4.5.23 Vorkommen von gelöstem L-Methionin im festen

Fermenterinhalt .................................................................................. 124 4.5.24 Summe der löslichen Aminosäuren L-Arginin, L-Methionin und

L-Ornithin im festen Fermenterinhalt .................................................. 126 4.5.25 Vorkommen von gelöstem β-Alanin im festen Fermenterinhalt .......... 128 4.5.26 Vorkommen von gelöstem GABA im festen Fermenterinhalt ............. 130

4.6 Zusammenfassung der erhobenen Ergebnisse ........................................ 132

Inhaltsverzeichnis

III

4.7 Vergleich der Amin- und Aminosäuregehalte im RUSITEC und in den eingesetzten Grassilagen ........................................................... 135

5 Diskussion ...................................................................................................... 139 5.1 Intention der Arbeit ................................................................................... 139 5.2 Kritische Betrachtung des Versuchsaufbaus ............................................ 139

5.2.1 RUSITEC-System .............................................................................. 139 5.2.2 Eingesetzte Futtermittel ..................................................................... 140

5.3 Ausgewertete Parameter .......................................................................... 141 5.3.1 Probenbearbeitung ............................................................................ 141 5.3.2 Methode der LC-MS/MS .................................................................... 142 5.3.3 Auswahl der Standards ...................................................................... 143 5.3.4 Statistik .............................................................................................. 144

5.4 Auswirkungen der Schadsilagen auf den ruminalen Stoffwechsel von Aminen, Polyaminen und Aminosäuren ...................................... 145

5.4.1 Cadaverin und L-Lysin ....................................................................... 145 5.4.2 Putrescin, Spermidin und Spermin sowie L-Arginin, L-Methionin

und L-Orntihin .................................................................................... 148 5.4.3 m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) ........................................ 154 5.4.4 β-Alanin .............................................................................................. 155 5.4.5 γ-Aminobuttersäure ............................................................................ 156 5.4.6 Evaluation der Polyamine und Aminosäuren im festen

Fermenterinhalt .................................................................................. 159 5.4.7 Ammoniak .......................................................................................... 160 5.4.8 Flüchtige Fettsäuren: i-Butter- und i-Valeriansäure............................ 164 5.4.9 Zusammenhang zwischen i-Buttersäure, i-Valeriansäure und

Ammoniak .......................................................................................... 166 5.5 Schlussfolgerung und Ausblick ................................................................. 168

6 Zusammenfassung ........................................................................................ 170 7 Summary ......................................................................................................... 172 8 Schrifttumsverzeichnis .................................................................................. 174 9 Anhang ............................................................................................................ 198

9.1 Informationen zu Material und Methodik ................................................... 198 9.1.1 Eingesetzte Standards, Lösungsmittel und Reagenzien .................... 198 9.1.2 Probenentnahme während der RUSITEC-Läufe ................................ 200 9.1.3 Ergebnisse aus der Derivatisierung mit FMOC-Chlorid ..................... 201

9.2 Futtermittelanalysen ................................................................................. 202 9.2.1 Futtermittelanalysen der Grassilagen ................................................ 202 9.2.2 Futtermittelanalyse des Sojaproteins ................................................. 203 9.2.3 Inhaltsstoffe des Kraftfutters .............................................................. 203

9.3 Messungen von Aminosäure- und Polyaminstandards und 1,7 Diaminoheptan ............................................................................ 204

9.3.1 Bestimmung der Messgenauigkeit an der LC-M/MS durch Wiederholungsmessungen von 1,7 Diaminoheptan ........................... 205

Inhaltsverzeichnis

IV

9.3.2 Untere Nachweisgrenze der bestimmten Polyamine und Aminosäuren ...................................................................................... 205

9.3.3 Variationskoeffizient des internen Standards während der Probenanalytik an der LC-MS/MS...................................................... 206

9.3.4 Konzentrationen des externen Standards während der Probenanalytik ................................................................................... 207

9.3.5 Retentionszeiten des externen Standards während der Probenanalytik ................................................................................... 208

9.4 Grafiken der Ergebnisse und Tabellen der Statistik .................................. 209 9.4.1 Überstände, flüchtige Fettsäuren und Ammoniak .............................. 209 9.4.2 Ergebnisse der Grassilageanalysen an der LC-MS/MS ..................... 209 9.4.3 Cadaverin .......................................................................................... 218 9.4.4 L-Lysin ............................................................................................... 220 9.4.5 Putrescin ............................................................................................ 222 9.4.6 Spermidin ........................................................................................... 224 9.4.7 Spermin ............................................................................................. 226 9.4.8 Summe der Polyamingehalte Putrescin, Spermidin und Spermin ...... 228 9.4.9 m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) ........................................ 230 9.4.10 L-Arginin ............................................................................................ 231 9.4.11 L-Ornithin ........................................................................................... 233 9.4.12 L-Methionin ........................................................................................ 235 9.4.13 Summe der Aminosäuregehalte L-Arginin, L-Methionin und

L-Ornithin ........................................................................................... 237 9.4.14 β-Alanin .............................................................................................. 239 9.4.15 γ-Aminobuttersäure ............................................................................ 241

9.5 Grafiken und Tabellen der Diskussion ...................................................... 243 9.5.1 Literaturübersicht zu Aminosäuregehalten in Grassilagen ................. 243 9.5.2 Beziehung zwischen Polyaminen und GABA im RUSITEC ............... 244

10 Danksagung .................................................................................................... 245

Abkürzungsverzeichnis

V


1,7 DAH 1,7 Diaminoheptan AA Aminosäure AAHDL N-Acetyl-β-Alanin-

Amidohydrolase ADAM Amantadinhydrochlorid ADC Arginin-Decarboxylase AMADH Aminoaldehyd-

Dehydrogenase APAO N1-Acetylpolyamin-

Oxydase Appl. Applikation AS-Gehalte

Summe der Aminosäuren L-Arginin, LOrnithin und L-Methionin

Bov. bovin BSCFA branched short chain

fatty acids c Konzentration CaCl2 Calciumchlorid Cad. Cadaverin Cl. Clostridium CP crude protein CuAO Kupfer-Amin-Oxydase FA Ameisensäure fAA Freie Aminosäuren FlFS Flüchtige Fettsäuren FMOC-Chlorid

9-Fluorenylmethyloxy-carbonylchlorid

GABA γ-Aminobuttersäure ges. AS Gesamte Aminosäuren ggr. geringgradig Glc. Glukose h Stunde HAP-Spezies

Hyperammonium-produzierende Bakterien

HCl Salzsäure HClO4 Perchlorsäure Hist. Histamin HSS Homospermin-Synthase i. rum. intra ruminal Kb-Werte Basenkonstante KCl Kaliumchlorid KF Kontrollfermenter kg Kilogramm

KM Körpermasse LC-ESI-MS/MS

liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry

LC-MS/MS

liquid chromatography-mass spectrometry

LDC Lysin-Decarboxylase LOD limit of detection LPS Lipopolysaccharide M. Megasphaera m/z Masse-zu-Ladung MAT Methionin-Adenosyl-

Transferase mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid Methylam. Methylamin Min. Minute N Stickstoff n.d. Nicht näher definiert n.n. Nicht nachweisbar Na2HPO4 Di-Natriumhydrogen-

phosphat NaCl Natriumchlorid NaHCO3 Natriumhydrogen-

carbonat NaOH Natronlauge NH3 Ammoniak nmol Nanomol NPN Non-Protein-Stickstoff NSpd. Norspermidin NSPDS Norspermidin-Synthase NSpm. Norspermin NSPMS Norspermin-Synthase ODC Ornithin-Decarboxylase Ov. ovin p. os Fütterung per os p.p. post partum PA Polyamine PA-Gehalte

Summe der Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin

PAO Polyamin-Oxydase Put. Putrescin RC-Filter regenerierte Cellulose-

Filter


VI

RE Reineiweiß Rp Rohprotein RP-HPLC Reversed Phase-High

Performance Liquid Chromatography

rpm rounds per minute RSA Rinderserum Albumin Rt Retentionszeit s. siehe S. Selenomonas Sc. Streptococcus Spd. Spermidin SPDS Spermidin-Synthase SPE Solidphase extraction SOP Standard operation

procedure Spm. Spermin SPMS Spermin-Synthase SSAT Spermidin/Spermin-N1-

Acetyltransferase TF Testfermenter TFA Trifluoressigsäure TFmS Testfermenter mit Soja ThSpm. Thermospermin TP true protein TS Trockensubstanz TSPMS Thermospermin-

Synthase Tyr. Tyramin uS Ursprüngliche Substanz V. Veillonella VDLUFA Verband Deutscher

landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten

VK Variationskoeffizient vs. versus WFR Wiederfindungsrate

Einleitung

1

1 Einleitung

In der heute zunehmend leistungsorientierten Rinderhaltung und Milchproduktion ist die Versorgung der Tiere mit Grundfutter von guter Qualität essentiell. Dennoch gibt es auch bei Verwendung von hochwertigem Pflanzenmaterial und sorgsamer Einsilierung desselbigen immer wieder gesundheitliche Probleme in den Milchvieh-herden, die mit der Verfütterung von grassilagebetonten Rationen mit mehr als 50 % Grassilageanteil am Grobfutter in Zusammenhang gebracht werden konnten (EICKEN 2005b; LEIFERT 2014; VEAUTHIER 2014). Aufgrund dessen wird eine nutritive Genese der gesundheitlichen Probleme vermutet. Schon vor zwölf Jahren konnte EICKEN (2005b) eine Verbindung zwischen der Mehrfütterung von Grassilagen und einem unspezifischen Krankheitsgeschehen in Milchviehherden darstellen. Der Abbau des Proteins im Futter wird nach neuesten Erkenntnissen in den ersten Stunden nach dem Schnitt des Grünfutters vorrangig durch pflanzliche Proteasen katalysiert. Es konnte herausgestellt werden, dass dieser Vorgang in der Pflanze beginnt und nicht, wie zuvor angenommen, durch die Pansenflora initiiert wird (McDONALD et al. 1981; SEYFARTH et al. 1989; ZHU et al. 1999; BUXTON u. MUCK 2003; HOEDTKE et al. 2010). Witterungseinflüsse und Management bestimmen die Anwelkzeit der geernteten Gräser und beeinflussen somit in erheblichem Umfang die Proteinfraktionen in der fütterungsfertigen Silage (EDMUNDS et al. 2012). Dabei können, je nach Aufwuchs- und Witterungsbedingungen zum Erntezeitpunkt, unterschiedliche Proteine, Peptide, NPN-Verbindungen, Aminosäuren, Amine und auch Polyamine entstehen (DAWSON et al. 1999; OWENS et al. 1999; HOEDTKE et al. 2010; HOEDTKE et al. 2011; EDMUNDS et al. 2012). Da das Erkrankungsbild vermutlich durch mehrere Faktoren entsteht, wurde es als „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ bezeichnet (EICKEN 2005b). Zu den vielfältigen Symptomen des Krankheitskomplexes gehören unter anderem schwerste Verdauungsstörungen, wie das vermehrte Auftreten einer Dislocatio abomasi, Erkrankungen des Reproduktionssystems, wie Retentio secundinarum und Sterilität, erhöhte Zellgehalte in der Milch, Lahmheiten, Stoffwechselerkrankungen, Festliegen (Downer Cow Syndrom) und plötzliche Todesfälle. Die Fütterung von Grassilagen von verminderter Qualität, das heißt einem Reineiweißgehalt am Rohprotein RE/Rp < 50 % führt darüber hinaus zu Immunsuppressionen, die sich durch das gehäufte Auftreten von infektiösen Erkrankungen äußern (EICKEN 2005b). Im Allgemeinen kommt es zu einer verringerten Futteraufnahme und zur Leistungsreduktion der Tiere. In der Praxis konnte gezeigt werden, dass die negativen Auswirkungen der veränderten Grassilagen sich insbesondere durch die Ergänzung der Ration mit Sojaextraktionsschrot als alternative Proteinquelle abfangen lassen (EICKEN 2005a; LEIFERT 2014). Diese Annahme wird gestützt durch die Beobachtung, dass erkrankte Tiere sich erholen können, wenn eine weitere Fütterung der schadhaften Grassilage unterbleibt und die Erkrankung noch nicht zu lange (d.h. weniger als zwei Monate) andauert. Somit bestätigt sich die Vermutung, dass ursächlich eine nutritive Genese der Pathogenese der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ zu Grunde liegt. Dieses Forschungsprojekt liefert als Teil eines Gruppenprojektes (GÖRES 2016; EBHARDT (in Arbeit); HUNSCHE (2017); ILLE 2017; SCHULTE (in Arbeit))

Einleitung

2

Erkenntnisse zur Hypothese, inwieweit der verminderte Reineiweißgehalt einer Grassilage den Gehalt der Amine ß-Alanin und Tyramin sowie der Polyamine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin und Thermospermin im Pansen in vitro beeinflusst bzw. erhöht. Es gibt Hinweise darauf, dass Amine bzw. Aminverbindungen in Pflanzen akkumulieren (HEGARTY u. PETERSON 1973). Die Funktion und Wirkung sowie mögliche Toxizität dieser Moleküle in den Organismen Pflanze, Tier und Bakterium wird im Literaturteil erläutert. So ist aus pharmakologischen Studien bekannt, dass verschiedene Amine und ihre Derivate auch eine zentralnervöse Wirkung haben (BLAGBROUGH u. USHERWOOD 1992; MASUKO et al. 2010). Aber auch im physiologischen Zellzyklus haben gerade Polyamine vielfältige Funktionen und damit Auswirkungen auf den Organismus (RAMANI et al. 2014). In größeren Mengen sind auch toxische Wirkungen der Amine und Polyamine auf den Organismus entdeckt worden (TIL et al. 1997; PEGG 2013). Einen weiteren Schwerpunkt bilden der Einfluss von Sojazulagen (EICKEN 2005a) zu den verschiedenen Grassilagen und die Auswirkung dieser im Hinblick auf das Vorkommen der Amine und ihrer Verbindungen im Pansensaft in vitro. Für die Analyse der Amine war die Entwicklung einer entsprechenden Methode an der LC-MS/MS notwendig.

Schrifttum

3

2 Schrifttum

2.1 Amine und Polyamine – Bezug zu vorherigen Untersuchungen

In der Praxis stellte sich heraus, dass Grassilagen, die nach den DLG-Richtlinien eine gute Qualität haben, teilweise einen geringen Gehalt an Reinweiß aufweisen. Daher wird ab einem nasschemisch bestimmten Quotienten von RE/Rp < 50 % der Protein-gehalt in Grassilagen als qualitativ vermindert angesehen (EICKEN 2005b). Da Rinder nach Verfütterung von Grassilagen mit diesem geringen RE/Rp-Quotienten erkranken können, wird selbige auch als Schadsilage bezeichnet (GAST 2010). In zurück-liegenden Untersuchungen wurde bereits intensiv an den möglichen Hintergründen des Krankheitsgeschehens gearbeitet (s. Tab. 2.1). Tab. 2.1: Forschungsergebnisse zu RUSITEC-Versuchen mit Grassilagen mit geringen Rein-

eiweißgehalten (RE/Rp < 50 %) aus dem Pansenlabor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Thema Ergebnis Literatur

Einfluss auf die Zahl der Bakterien und Protozoen

Es konnte eine Verschiebung der Protozoen- und Bakterienanzahl im RUSITEC-Inhalt beobachtet werden. Der erhöhte Bakteriengehalt bei Einsatz von Silagen mit geringem Reineiweißgehalt wurde aufgrund der höheren Nukleobasenkonzentration unterstellt. Die Protozoenanzahl sank unter Einfluss von Schadsilagen.

GAST 2010

Einfluss auf den Eiweißstoff-wechsel

Die Ammoniakgehalte in den Fermentern mit Schadsilagen waren erhöht, wobei die Gesamt-konzentration der freien Aminosäuren und das bakterielle Protein nur geringe Abweichungen zeigten. Es wurde ein erhöhter Stickstoff-Turnover vermutet. Eine höhere Aktivität von aminosäure-fermentierenden Bakterien wurde beobachtet.

GRESNER 2011

Einfluss auf den Kohlenhydrat-stoffwechsel

Die Gehalte der flüchtigen n- und i-Butter- bzw. Valeriansäure sowie der Hexansäure stiegen im Vergleich zur Fermentation von Kontrollsilagen in den Schadsilagefermentern deutlich an. Die energetisch wichtige Essig- und Propionsäure waren jedoch nur wenig erhöht. Es konnte eine Verschiebung des Fettsäurefermentationsmusters aufgezeigt werden. Die Essig- und Propionsäureergebnisse ließen vermuten, dass die beschriebene Abmagerung der Rinder (EICKEN, 2005b) nicht Ursache eines Energiemangels ist.

LUMPP 2011

Schrifttum

4

Fortsetzung Tab. 2.1 Thema Ergebnis Literatur

Einfluss auf Aminosäuren und biogene Amine

Beobachtet wurde eine Veränderung der Amino-säuremuster bei der Fermentation von Schadsilagen gegenüber der Kontrollsilagen (Analyse mittels FMOC-Chlorid-Derivatisierung). Die Gehalte von γ-Aminobuttersäure (GABA) waren sowohl in den Futterproben der Schadsilagen (Analyse durch EVONIK Nutrition & Care GmbH), als auch in der Fermenterflüssigkeit im RUSITEC deutlich erhöht gegenüber den jeweiligen Kontrollen. Die biogenen Amine (Agmatin, Citrullin, Indolessigsäure, Histamin, und Serotonin) unterschieden sich nur gering zwischen Kontroll- und Schadsilagezusatz in den Fermentern.

THEERMANN 2011

Einfluss auf den Gehalt bislang nicht identifizierter Substanzen

Sechs verschiedene, unbekannte Substanzen, die sich durch die Fermentation von auffälligen Gras-silagen im RUSITEC anreicherten, wurden charak-terisiert. Substanz 6 konnte ÖZMEN (2014) als 3-Phenylpropionsäure identifizieren.

WICHERN 2011

Einfluss von Clostridien-zugaben auf die Fermentation von Grassilagen

In vitro konnten proteolytische Clostridien durch eine Verschiebung des Pansenmilieus und der Bakterien-flora bei Einsatz von Grassilagen mit niedrigem Rein-eiweißgehalt im Pansen länger verweilen. Die Am-moniakkonzentration war während der Clostridien-zulage in der Fermenterflüssigkeit erhöht.

IRLE 2011

Erkenntnisse aus den vorherigen Studien lassen folgendes annehmen: Eine Populationsverschiebung der Bakterien (Näheres s. GAST 2010) könnte sich aufgrund der Symbiose von Wiederkäuer und Pansenflora in vivo negativ auf die Gesundheit des Tieres auswirken und vermutlich durch einen erhöhten Stickstoff-turnover (GRESNER 2011; IRLE 2011; GRESNER et al. 2015) zu einer Beein-trächtigung der proteo- und peptidolytisch aktiven Spezies im Pansen führen. Auch die festgestellte Verschiebung der flüchtigen n- bzw. i-Fettsäuren (LUMPP 2011; GÖRES 2016) – letztere entstehen durch die Desaminierung von freien Aminosäuren und waren in den Schadsilagen erhöht – sowie die Verschiebung des Aminosäuremusters (THEERMANN 2011; GRESNER et al. 2015) könnten somit erklärt werden. Diese Verschiebungen werden als mögliche Ursachen des Krankheitsbildes angesehen. ÖZMEN (2014) veröffentlichte in ihrer Dissertation neue Erkenntnisse zur Biosynthese und Degradation sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe in der Rinderernährung. In ihren Untersuchungen wurden in Grassilagen vor allem Flavone, Flavonole, Isoflavone, Phenolsäuren, Aminosäuren und ein biogenes Amin (Histamin) mittels Auftrennung durch RP-HPLC und LC-ESI-MS/MS identifiziert. Von den zuvor bei WICHERN (2011) untersuchten unbekannten Substanzen konnte Substanz 6 als 3-Phenylpropionsäure identifiziert werden (ÖZMEN 2014). Die Stoffwechselwege der Flavonoide wurden für die unterschiedlichen Zusammensetzungen der verschiedenen Grassilagen ausgearbeitet und es konnte ein Zusammenhang zwischen den Grassilagen, ihren Reineiweißgehalten und sekundären Pflanzeninhaltsstoffen hergestellt werden (ÖZMEN 2014).

Schrifttum

5

2.2 Eigenschaften der Polyamine und Amine

Polyamine und Amine sind in erster Linie Ammoniumverbindungen, die eine oder mehrere Ammoniumgruppen enthalten und deren Rest eine unterschiedliche Struktur haben kann. Polyamine sind langkettige polyvalente Kationen (pH-abhängig), die aufgrund ihrer Ladung sehr reaktiv sind und unter anderem durch Bindung an Proteine und Nukleinsäuren vielfältige Funktionen im Zellstoffwechsel einnehmen. Neben der aliphatischen Kettenstruktur können auch aromatische Ringstrukturen bei Aminen (z.B. Tyramin) oder Alkoholgruppen (z.B. Ethanolamin) auftreten. Monoamine besitzen nur eine Ammoniumgruppe, die anhängig von der Grundstruktur unterschiedlich reaktiv sein kann. Je nach Anzahl der Ammoniumgruppen werden bei den aliphatischen Polyaminen Di-, Tri-, Tetra,- Penta- und Hexamine unterschieden (COHEN 1998a). Für die in dieser Dissertation betrachteten aliphatischen Polyamine gilt folgende Einteilung:

• Diamine 1. Cadaverin H2N(CH2)5NH2 2. Putrescin H2N(CH2)4NH2

• Triamine 3. Spermidin H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2 4. Norspermidin H2N(CH2)3NH(CH2)3NH2

• Tetraamine 5. Spermin H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 6. Norspermin H2N(CH2)3NH(CH2)3NH(CH2)3NH2 7. Thermospermin H2N(CH2)3NH(CH2)3NH(CH2)4NH2

Aufgrund der Ionisierbarkeit von Aminen, welche durch die Ammoniumgruppen bedingt ist, besteht eine pH-Abhängigkeit für die Wasserlöslichkeit dieser Stoffe. Im Pansen liegt der physiologische pH-Wert bei 5,5–7,5 (VON ENGELHARDT et al. 2015). Die meisten aliphatischen Polyamine sind wasserlöslich (s. Tab. 3.9). Die Eigenschaften der am Polyaminmetabolismus beteiligten Enzymsysteme zeigen eine breite pH-Toleranz mit Aktivität bei pH-Werten von pH 1,4–11 (s. Tab. 2.7). Zudem bedingen die Ammoniumgruppen eine hohe Alkalität der Stoffe. Die Kb-Werte (Kb = Basenkonstante bzw. Maß der alkalischen Reaktion von Stoffen) von aliphatischen Polyaminen liegen bei 10-3 bis 10-4 mol/l und sind damit 50–100fach stärker als der von Ammoniak (Kb 1,8 x 10-5 mol/l). So neigen gerade Polyamine im alkalischen Milieu zur Abgabe von Protonen, was zur Bildung von freien Aminen führt, während sie im sauren Milieu als reaktive Kationen vorliegen (COHEN 1998a). Es ist also anzunehmen, dass die im Pansen vorkommenden Amine bei gut angepasster Fütterung als wasserlösliche Kationen auftreten. Zudem ist eine Proteinbindung im Pansen wahrscheinlich. Durch die oben genannten Eigenschaften, die gegebene Stereochemie und die schnelle Veränderung des Pansenmillieus ist eine entsprechend hohe Reaktivität der Amine im Pansen denkbar. Bekannte Reaktionen von Aminen sind die Alkylierung, die Bildung von salpetriger Säure und die Bildung von Amiden durch Acetylierung. Darüber hinaus ist die Oxidation im Polyaminstoffwechsel eine der relevantesten

Schrifttum

6

Reaktionen, die einerseits zu toxischen Abbauprodukten führt, andererseits auch eine antioxidative Schutzfunktion für Proteine darstellt (BOUCHEREAU et al. 1999; KUSANO et al. 2008; TAVLADORAKI et al. 2012).

2.2.1 Amin- und Polyaminmetabolismus in der Pflanze

Amine und Polyamine haben Kernfunktionen in der Regulation von Wachstum und Entwicklung, in der Stressantwort bei biotischem und abiotischem Stress, beim Schutz vor freien Radikalen, bei der Stomatabewegung und in der Signalkaskade von Pflanzen (s. Tab. 2.2). Tab. 2.2: Zusammenfassende Literatur zum Polyaminstoffwechsel in der Pflanze

Polyamine Thema Literatur

Cadaverin Putrescin Spermidin Spermin

Polyaminbiosynthese, -katabolismus und -regulation in höheren Pflanzen unter

Stresseinwirkung – osmotischer Stress,

Salzstress, Hypoxie, Schadstoffbelastung und Funktion der Enzyme ADC und ODC1

BOUCHEREAU et al. 1999


Polyaminbiosynthese und -oxidation in Pflanzen, Vorkommen von ungewöhnlichen

Polyaminen, Alkaloidbildung und Konjugation von Polyaminen an Amide, Hydroxyzimtsäuren

und Proteine

BAGNI u. TASSONI 2001


Polyamine in der Regulation von pflanzlichem Stress (oxidativer u. osmotischer Stress),

Stresstoleranz und Adaptation, sowie Funktion als Second Messenger

KUZNETSOV et al. 2006

Norspermidin Norspermin Putrescin Spermidin Spermin

Funktionen von Aminoxidasen während der Entwicklung und bei Pathogenabwehr in

Pflanzen, Signalkaskaden zur Bildung von H2O2 und Polyaminregulation durch

Lichteinfluss

CONA et al. 2006


Thermospermin

Essentielle Polyamine für Pflanzenwachstum und Überlebensstrategien bei Stresseinflüssen (Säuren, oxidativer Stress, osmotischer Stress, neuronaler Stress und Pathogenbefall) sowie

Regulation von Ionenkanälen

KUSANO et al. 2008

Putrescin Spermidin

Bildung von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus Polyaminen (Putrescin u. Spermidin),

Darstellung der beteiligten Enzyme (u.a. HSS)2

OBER u. KALTENEGGER

2009

Putrescin Spermidin Spermin

Transgen erreichte biotische und abiotische Stresstoleranz in Pflanzen sowie

Mechanismen der Stresstoleranz induziert durch Polyamine

HUSSAIN et al. 2011

1 Arginin- bzw. Ornithin-Decarboxylase 2 Homospermidin-Synthase

Schrifttum

7

Fortsetzung Tab. 2.2 Polyamine Thema Literatur Cadaverin Putrescin Spermidin Spermin

Thermospermin

Pflanzliche Abwehr bei biotischem Stress durch Mikroorganismen –

Proteinstabilität durch Polyamine sowie Signalkaskaden durch Polyaminabbau

(Jasmonsäure, H2O2)

JIMÉNEZ-BREMONT et al.

2014


Thermospermin

Polyamine im Lebenszyklus der Pflanzenentwicklung und bei Stress,

Genmodulation, Alkaloidbildung (Pyrrolizidin- und Tropanalkaloide) und Zellspezialisierung

TIBURCIO et al. 2014


Thermospermin

Polyamine und ihre Enzyme in der Pflanze sowie beteiligte Gene –

Signaltransduktion und Induktion von H2O2 bei Wachstum und abiotischem Stress

(osmotischer Stress, Trockenheit, Frost, Hitze, Oxidation)

MATTOO et al. 2015

Norspermidin Norspermin Putrescin Spermidin Spermin

Übersicht zur Toleranz von abiotischem Stress in Pflanzen, beteiligte Enzymsysteme und

Funktionswege der Polyamine in transgenen Pflanzen

PATHAK et al. 2015

Pflanzen reagieren auf Stress innerhalb von drei Stunden mit einem Anstieg der zur Polyaminsynthese relevanten Aminosäuredecarboxylasen (ADC = EC 4.1.1.19 und ODC = EC 4.1.1.17; YOUNG u. GALSTON 1983; GALSTON u. SAWHNEY 1990). Ein Überschuss an Kalium kann mit einer Akkumulation von Spermidin in Verbindung gebracht werden, während ein Kaliummangel zu instabilem Protein und infolgedessen zu einem Anstieg der freien Aminosäuren und Akkumulation von N-Verbindungen und Putrescin in den pflanzlichen Zellen führt (COHEN 1998b). Exogen zugeführtes Ammonium führt ebenfalls zu einem Anstieg der freien Polyamine (COHEN 1998b). Auch unter Sauerstoffmangel tritt eine Akkumulation von Putrescin auf (REGGIANI et al. 1989). Zudem kommt es bei physiologischen Wachstumsprozessen in Pflanzen zu einem Anstieg der Polyamine (RAMAKKISHNA u. ADIGA 1975; TAKAHASHI u. KAKEHI 2010). Zunehmend werden längerkettige, sogenannte ungewöhnliche Polyamine (Thermospermin, Homospermidin) in Pflanzen identifiziert, die ebenfalls mit in die Funktion von Wachstum und Entwicklung in Pflanzen eingebunden sind (RODRIGUEZ-GARAY et al. 1989; GALSTON u. SAWHNEY 1990; HAMANA 1992; BAGNI u. TASSONI 2001; NAKA et al. 2010; TAKAHASHI u. KAKEHI 2010). OSHIMA (1979) beschrieb die Substanz Thermospermin zum ersten Mal in extrem thermophilen Bakterien der Gattung Thermus thermophilus in einer heißen Quelle. Später konnten BAGGA et al. (1997) in stresstoleranter Luzerne (Medicago sativa) unter anderem verschiedene komplexe Polyamine und Thermospermin nachweisen. Zudem konnten unterschiedliche Gene für die Thermosperminsynthase in der Schotenkresse (Arabidopsis thaliana) identifiziert werden und es wurde entdeckt, dass der Stoff für das Längenwachstum vonnöten ist (KNOTT et al. 2007; KAKEHI et al. 2008).

Schrifttum

8

Gerade pflanzlicher Stress induziert die Bildung von Polyaminen (MATTOO et al. 2015). Diese Stressinduktion kann auch beim Silierungsprozess durch den Gras-schnitt, den Wasserentzug und die Erwärmung während der Milchsäuregärung entstehen. Bei Verletzung der pflanzlichen Kutikula werden die Gene zur Polyaminsynthese innerhalb einer Zeit von 30 Minuten bis zwei Stunden hochreguliert und infolgedessen steigen die Polyamingehalte innerhalb von zwei bis zehn Stunden deutlich an, was die schnelle Reaktion in der Stoffwechselkaskade von Aminen verdeutlicht (PEREZ-AMADOR et al. 2014). Entsprechend sind auch in den auf Ertrag gezüchteten Futterpflanzen (u.a. Gras und Mais) Wirkungen der Polyamine bei pflanzlichem Stress und Wachstum zu erwarten. Bisher sind Amingehalte in Mais und Gras vornehmlich zum Vergleich mit in Silagen bestimmten Gehalten ermittelt worden (s. Tab. 2.3). So analysierten KRÍŽEK (1993), GERENDÁS (1995), WINTERS et al. (2001), PIETRZAK et al. (2002), STEIDLOVÁ und KALAČ (2003), KRIZSAN und RANDBY (2007) sowie SCHERER et al. (2015) die Gehalte von Aminen in Gras-, Mais- und Grünhafersilagen. Dabei konnte heraus-gestellt werden, dass Amine auch in qualitativ hochwertigen Grassilagen vorkommen (KRÍŽEK 1993; KRIZSAN u. RANDBY 2007). Zudem könnte nach SCHERER et al. (2015) ein Zusammenhang zwischen dem TS-Gehalt von Silagen und dem Vorkommen von Aminen vermutet werden. Die unterschiedliche Messtechnik und Probenaufbereitung jedoch macht den Vergleich der Amingehalte in Abhängigkeit von der Trockensubstanz schwierig (s. Tab. 2.4). Heu weist zum Vergleich Polyamingehalte von etwa 38 mg/kg TS Cadaverin, 20 mg/kg TS Putrescin und 2 mg/kg TS Spermin auf (PHUNTSOK et al. 1998). Tab. 2.3: Amingehalte in Futterpflanzen bzw. Silagen [mg/kg TS bzw. *nmol/l]

Pflanze Cadaverin Putrescin Spermidin Spermin Tyramin Literatur Zea

mays – 150–480* 180–230* 50* – GERENDÁS 1995

Lolium perenne 6 80 42 15 – VAN OS

et al. 1996

Festolium 1260 4610 – – 1670 NISHINO et al. 2007

Zea mays 4180 1100 – – 7430 NISHINO et

al. 2007 * Angabe in nmol/l

Tab. 2.4: Amingehalte in Grassilagen [g/kg TS] bei unterschiedlichen TS-Gehalten

TS [g/kg]

Cada-verin Putrescin Sper-

midin Sper-min

Tyra-min

γ-Amino-butter-säure

Literatur

178 5410 3730 – – 2680 – KRIZSAN u.

RANDBY 2007

200 2559 2138 – 1 2115 – VAN OS et al. 1996

206 1190 880 – – 1380 70 DAWSON u. MAYNE 1996

Schrifttum

9

Fortsetzung Tab. 2.4

TS [g/kg]

Cada-verin Putrescin Sper-

midin Sper-min

Tyra-min

γ-Amino-butter-säure

Literatur

213 1210 950 – – 1760 – KRIZSAN u.

RANDBY 2007

213 1400 1400 – – 1500 – KRIZSAN et al. 2012

256 2320 860 – – 2000 OLT et al. 2004

500 220 83 1 1 99 – VAN OS et al. 1996

n.d. 3987 2953 0 12 – – PHUNTSOK et al. 1998

n.d.* 591 551 26,8 15,7 – – KRÍŽEK 1993

n.d. 21,7–148 18,2–71,4 – – 36,8–

155 131– >200 COLE 1992

n.d.** 338 199 26,7 6,6 – – KRÍŽEK 1993

n. d. = nicht näher definiert * Grassilage unter Laborbedingungen ** Silage aus Kleegras unter Laborbedingungen siliert

Schließlich kann aus der Literatur gefolgert werden, dass vor allem Polyamine essentiell für das Wachstum und die Initiation verschiedenster Mechanismen, wie Stressresistenz, Abwehr von Herbivoren und Initiation von Signalkaskaden in Pflanzen sind. Ihre schnelle Regulation kann erhebliche Akkumulationsmöglichkeiten von Polyaminen in der Pflanze hervorrufen. Darüber hinaus gelangen die Stoffe durch die Futteraufnahme in entsprechenden Mengen in den Pansen. Unter bestimmten Bedingungen sind somit negative Effekte durch die Polyaminaufnahme auf Herbivoren denkbar.

2.2.2 Amin- und Polyaminmetabolismus im Pansen

Die Entwicklung der Untersuchung von Aminen und Polyaminen im Pansen ist stark mit der zunehmenden Technik zur Konservierung von Futtermitteln assoziiert. Zu Beginn konzentrierten sich die Untersuchungen auf Histamin als potentielles Agens in der Pathogenese der Pansentympanie (SHINOZAKI 1957). In folgenden ruminalen

Schrifttum

10

Infusions- und Fütterungsstudien konnten verschiedene Effekte des Aminzusatzes herausgestellt werden (s. Tab. 2.5). Tab. 2.5: Effekte von Amin- und Polyaminzusätzen und Futtermitteln bzw. der physiologischen

Pansenentwicklung auf den ruminalen Amingehalt, die Pansenfermentation und das Tier

Amin Ration bzw. Menge Appl. Tier Effekt Literatur

Histamin Tyramin

Tryptamin

Induzierte Azidose durch Glukose

11 g/kg KM Glukose

(Glc.:Casein 90:10)

i. rum. Schaf

Induzierte Azidose Anstieg der Amine erst während der Regeneration des

pH-Wertes (> 8 h nach

Azidoseinduktion)

IRWIN et al. 1979

Putrescin GABA

6 g/kg KM 24 g/kg KM i. rum. Rind

ggr. reduzierte Futteraufnahme bei

Kombination von Putrescin und

GABA

COLE 1992

Putrescin 100 g/Tier/Tag i. rum. Rind Reduzierte Futteraufnahme

LINGAAS u. TVEIT 1992

Putrescin Tyramin GABA

Je 2, 4 bzw. 6 g/kg TS im Futter

i. rum. Rind

Futteraufnahme unbeeinflusst, pH-Anstieg im

Pansen durch Tyr., Propionsäuregehalt reduziert bei GABA-

Infusion, Valeriansäure-

produktion gesteigert durch

Tyr.

DAWSON u. MAYNE 1996

Cadaverin Putrescin Tyramin

0,3–1,9 g/kg TS 0,3–1,9 g/kg TS 0,7–3,7 g/kg TS

im Futter

p. os Schaf

Adaptation der Futteraufnahme

und Pansenflora an Amingehalte durch

Vorbereitungs fütterung (erhöhter Abbau der Amine,

bessere Futteraufnahme)

VAN OS et al. 1997

Cadaverin Putrescin Spermin

2,95 g/kg TS 3,99 g/kg TS 0,012 g/kg TS

im Futter

p. os Rind

reduzierte Motilität im Pansen und infolgedessen

reduzierte Futteraufnahme

mikrobielle Nutzung der Amine

PHUNTSOK et al. 1998

Schrifttum

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Amin Ration bzw. Menge Appl. Tier Effekt Literatur


Analyse der Gehalte während

der Pansen-entwicklung

Tag 0–160 p.p. (Epithel u. Lumen)

– Schaf Ziege

Verletzung der Pansenwand

steigert die ODC, trotzdem wenig

ruminale Absorption der PA

ELIASSEN u. SJAASTAD

2000

Histamin

Induzierte Azidose durch HCL-Zusatz 80 µmol/l Hist. in Pansenflüssigkeit

in vitro

Ov. Pan-sen-epi-thel

Induzierte Azidose Azidose erhöht die

Absorption von Histamin

ASCHENBACH u. GÄBEL 2000

Cadaverin Putrescin Spermidin

1,4 g/Tier/Tag (Reindosis vs. Futterzusatz)

p. os Ziege

Reindosis führte zu Reduktion d. Körpermasse,

erhöhten Tropf- und Farbverlusten

des Fleisches, entzündliche

Veränderungen im GI-Trakt*

FUSI et al. 2004

Histamin Methylamin Putrescin Tryptamin Tyramin

Induzierte Azidose durch 40 vs. 70 % Konzentrat in der

TS im Futter

p. os Rind

Induzierte Azidose Anstieg der Amin-konzentrationen

2–6 h nach Azidoseinduktion (Hist.< Methylam., Put., Trypt. < Tyr.)

WANG et al. 2013b

Methylamin Putrescin

Gerstezusatz 0, 15, 30 bzw.

45 % der TS im Futter

p. os Rind Anstieg der Amine

durch höhere Konzentratgehalte

SALEEM et al. 2012

Cadaverin Putrescin Tyramin

Sojaproteinzusatz je 2 g Mischung

Sojaprotein/Stärke 0:0, 10:0, 7:3, 3:7,

10:0

in vitro Rind

Nachweis von Put. und Cad. bei

Sojazusatz 10:0 u. 7:3 in vitro

(48 h Inkubation)

JEONG et al. 2015


Azidosepufferung: Natriumbicarbonat

0 vs. 70 mg/kg Substrat

in vitro Rind

Reduktion der Aminbildung nach

12 bis 16 h Inkubation in vitro durch NaHCO3-

Zusatz (Methylam. nach

8 h reduziert) kein Effekt bei Hist. In 24 h

MAO et al. 2016

* Gastro-Intestinal-Trakt

Schrifttum

12

Die Aufklärung der Pansentympanie war der Beginn der Untersuchungen zu Aminen im Pansen. Für Histamin konnte keine Verbindung zur Pansentympanie hergestellt werden; vielmehr wurde entdeckt, dass neben Histamin auch Methylamin und Tyramin im Pansen durch mikrobielle Fermentationsvorgänge bzw. Aminosäuredecarboxy-lierung entstehen und dass Histamin bei intaktem Pansenepithel nicht gut absorbiert wird (SHINOZAKI 1957). Aus der vorliegenden Literatur ist ersichtlich, dass Amine mehrfach mit einer Reduktion der Futteraufnahme in Verbindung gebracht werden (COLE 1992; LINGAAS u. TVEIT 1992; VAN OS et al. 1997; PHUNTSOK et al. 1998). Bei Induktion von akuten und subakuten Pansenazidosen kommt es nachweislich zu einem Anstieg der Amingehalte im Pansen bzw. in der Pansenflüssigkeit in vitro (IRWIN et al. 1979; WANG et al. 2013b). MAO et al. (2016) konnten zudem zeigen, dass die Pufferung des ruminalen pH-Wertes in vitro zu einem geringeren Anstieg der Amingehalte führt, im Vergleich mit pH-Werten im Bereich von subakuten Pansen-azidosen (pH 5,2–5,8). Auch die mikrobielle Metabolisierung von Aminen im Pansen konnte durch VAN OS et al. (1997) sowie PHUNTSOK et al. (1998) bestätigt werden. Dies lässt eine entsprechende Verschiebung bzw. Erhöhung des Amin- und Polyamin-stoffwechsels bei der Fermentation von Grassilagen mit reduziertem Reineiweißgehalt vermuten, die durch konzentratreiche Fütterung und Proteinzusatz bzw. Beeinflussung des Proteinstoffwechsels der Mikroflora noch gesteigert werden könnte. Zudem ist bekannt geworden, dass eine Absorption von Aminen aus dem Pansen nur in sehr geringem Umfang stattfindet, die Pansenwand jedoch durch die vorkom-menden Aminosäuredecarboxylasen in der Lage ist, Polyamine zu synthetisieren (ELIASSEN u. SJAASTAD 2000). Eine Synthese der Amine findet vor allem bei Schädigung des Epithels und bei physiologischen Entwicklungsprozessen statt (ASCHENBACH u. GÄBEL 2000; ELIASSEN u. SJAASTAD 2000). Auch konnten in der Literatur für Amine in hohen Dosen (> 1,4 g pro Tier und Tag) bei Ziegen toxische Effekte nachgewiesen werden (FUSI et al. 2004, s. Tab. 2.5), deren potentielle Dosis es im Folgenden zu bewerten gilt. In Abbildung 2.1 ist die Beeinflussung der Polyamine im Pansenstoffwechsel durch zugeführte Futtermittel, ruminale Mikroorganismen, Passage und in geringem Umfang Absorption dargestellt.

Schrifttum

13

CadaverinPutrescinSpermidinSpermin

FutterProteolyseAminosäurenPolyamine

AbsorptionEpithelintegrität

pH

Passage

Biosynthese

Amino-säuren

Protein

Katabolismus

Abb. 2.1: Einflüsse auf den Polyamingehalt im Pansen

Schrifttum

14

2.2.3 Amine und Bakterien

In einem Milliliter Pansensaft kommen rund 10–50 x 1012 Bakterien, 106 Protozoen und etwa 100.000 Hefen und Pilze vor (SALEEM et al. 2013). Diese Zahlen und die Vielfalt der Organismen und ihrer Relation zueinander verdeutlichen die enormen Möglich-keiten des Pansens, sich an unterschiedlichste Futtermittel anzupassen und erklären, warum bisher nur Bruchteile über die mikrobielle Pansenflora bekannt sind. Im Zusammenhang mit verschiedenen Studien zu Aminen im Pansen konnte die Mikroflora bereits als wichtige Komponente des Aminmetabolismus bestätigt werden (COLE 1992; DAWSON u. MAYNE 1996; PHUNTSOK et al. 1998; WANG et al. 2013b; GRESNER et al. 2014). In den Untersuchungen von KUSANO et al. (2008) zur Relevanz von Polyaminen für das Wachstum in Mikroorganismen, Pflanzen und Säugetieren sind die betreffenden Stoffwechselwege für Mikroorganismen beschrieben und es wird aufgezeigt, dass im Unterschied zu pflanzlichen oder Säugetierzellen keine direkte Synthese von Spermidin zu Spermin und umgekehrt möglich ist. Demnach kann ein entsprechender Polyaminmetabolismus auch in der ruminalen Mikroflora angenommen werden. Eine Zusammenfassung der bisherigen Erkenntnisse zum Stoffwechsel von Aminen durch die ruminalen und intestinalen Mikroorganismen findet sich in Tabelle 2.6. Tab. 2.6: Nachweis und Wirkung des Aminmetabolismus in ruminalen Bakterien

Amin Bakterium Nachweis bzw. Wirkung Literatur

Putrescin Cadaverin Bov. Bakterien

Arginin und Ornithin werden zu Polyaminen abgebaut, LDC ist bei saurem pH aktiver als ODC

LEWIS u. EMERY 1962

Putrescin

Aerobacter Enterobacter

Chromobacterium Serratia

Pseudomonas

Abbau von Putrescin durch mikrobielle Transaminase und

Diaminoxidase

MICHAELS u. KIM 1966

Histamin Bov. Bakterien Decarboxylierung von L-Histidin im Pansen

IRWIN et al. 1979

Cadaverin Putrescin S. ruminantium

PA sind essentielle Bestandteile der Peptidoglycanwand und

damit relevant für das Wachstum

KAMIO et al. 1986

Putrescin GABA Bov. Bakterien

Erste Bestätigung, dass ruminale Bakterien infundierte

Amine abbauen COLE 1992

Glutamin Methylamin Cadaverin

S. ruminantium Stoffwechselwege von Aminen

in Selenomonas und genetische Aufschlüsselung des Bakteriums

RICKE et al. 1996

Cadaverin Histamin Putrescin

Ov. Bakterien

Adaptierte ruminale Mikroflora baut bis zu 70 % der zugelegten

Amine in vitro in präferierter Reihenfolge ab:

Histamin > Tyramin > Putrescin > Cadaverin

VAN OS 1997

Schrifttum

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Amin Bakterium Nachweis bzw. Wirkung Literatur

Cadaverin S. ruminantium

Identifikation der LDC zur Synthese von Cadaverin im

Peptidoglycan sowie Darlegung der Kinetik des Enzyms

TAKATSUKA u. KAMIO 2004

Agmatin Putrescin Spermidin Spermin

Cl. sporogenes Cl. sticklandii

Sc. bovis Peptostreptococcus

spp. S. ruminantium Veillonella spp.

Decarboxylierung von Aminosäuren führt zur Bildung

von Aminen im Gastrointestinaltrakt und Pansen

DAI et al. 2011

Cadaverin Putrescin Spermidin

V. alcalescens V. parvula

S. ruminantium M. elsdenii A. lipolytica

Funktion und Bedeutung von Polyaminen für die

Zellwandintegrität von ruminalen Bakterien

KOJIMA u. KAMIO 2012

Cadaverin Methylamin Putrescin

Bov. Bakterien

Decarboxylierung von Arginin, Ornithin und Lysin und

Freisetzung von Aminen unter konzentratreicher Fütterung

SALEEM et al. 2012


Lactobacillus spp. Sc. bovis

Induzierte, subakute Pansenazidose erhöht den

Gehalt an Aminen im Pansen, der Gesamtgehalt an Bakterien

ist nicht beeinflusst

WANG et al. 2013b

Cadaverin Putrescin

Bov. Bakterien Ov. Bakterien HAP-Spezies

Erkenntnisse zu Abbauprodukten (Polyamine) aus dem Proteinstoffwechsel

durch ruminale Bakterien

GRESNER et al. 2014


S. ruminantium Prevotella spp.

Durch Rationen minimal reduzierter ruminaler pH-Wert führt zu einer Steigerung der

Amingehalte im Pansen

ZHANG et al. 2014

Cadaverin Ethylamin Histamin

Methylamin Phenylethyl-

amin Putrescin Tyramin

S. ruminantium Selenomonas spp.

Bov. Bakterien

Zusatz von Sojamehl führt zu höheren Amingehalten im

Pansensaft in vitro

JEONG et al. 2015


Streptococcus spp. Butyrivibrio spp. Clostridien spp.

Ruminococcus spp.

Zusatz von Natriumbicarbonat zu Pansenflüssigkeit in vitro

führt zu reduzierter Bildung von Aminen und verringert die Streptococcus-Population

MAO et al. 2016

Schrifttum

16

Aus der erhobenen Literatur ergibt sich ein noch unzureichender Überblick zum mikrobiellen Metabolismus von Aminen und Polyaminen im Pansen. Bisher ist lediglich die Bedeutung von Polyaminen in der Peptidoglycanwand einzelner Bakterienspezies geklärt. Dass Mikroorganismen an der Biosynthese und am Katabolismus von Aminen im Pansen beteiligt sind, konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Darüber hinaus begünstigt ein azidotischer pH-Wert die Bildung von Aminen durch ruminale Mikroorganismen. Um weitere Erkenntnisse zu gewinnen, müssen die Bakterien-spezies im Pansen vorerst genauer charakterisiert werden, wobei der starke Einfluss der Futterzusammensetzung bedacht werden sollte.

2.2.4 Enzymsysteme

Der Metabolismus von Aminen und Polyaminen in Pflanzen und Tieren ist sehr komplex und durch eine Kette von Enzymsystemen eng reguliert. Neben der Regulation der freien Polyamine durch die Biosynthese und den Katabolismus (s. Abb. 2.2 u. Abb. 2.3) wird der Gehalt auch durch Konjugation sowie Bindung an Ionenkanäle und nachfolgende Modulation selbiger zur Induktion von Stoffwechsel-kaskaden reguliert (CAI et al. 2014). Vielfältige Untersuchungen zu den Enzym-systemen existieren bereits in Pflanzen (s. Kap. 2.2.1), während beim Säugetier in erster Instanz Informationen zu den Enzymsystemen des Polyaminmetabolismus in verschiedensten Geweben herausgearbeitet wurden. Für Pansenmikroorganismen konnte bisher nur bei Selenomonas ruminantium ein Stoffwechselweg zum Einbau von Polyaminen in der Peptidoglycanwand herausgearbeitet werden (KAMIO et al. 1986; KOJIMA u. KAMIO 2012; LIAO et al. 2014). Die wichtigsten Enzymsysteme zur Polyaminsynthese und zum -katabolismus sind:

• Arginin-/Ornithindecarboxylase (ADC/ODC: EC 4.1.1.19/ EC 4.1.1.17) • Spermidin-Synthase (SPDS: EC 2.5.1.16) • Spermin-Synthase (SPMS: EC 2.5.1.22) • Thermospermin-Synthase (TSPMS: EC 2.5.1.79) • Norsperminsynthase (NSPMS: EC 2.5.1.126) • Kupfer-Amin-Oxydase (CuAO: EC 1.4.3.21) • Polyaminoxydase (PAO: EC 1.5.3.17) • Spermin/Spermidin-N1-Adenosyltransferase (SSAT: EC 2.3.1.57)

Aus der Enzymdatenbank BRENDA (BRaunschweig ENzyme DAtabase) wurden Informationen zu pH-Wert, Temperaturbereich und Vorkommen der Enzyme zusammengetragen (s. Tab. 2.7).

Schrifttum

17

Tab. 2.7: Aktivitätsbereich der Hauptenzyme des Polyaminstoffwechsels

Enzym pH-Bereich Temperatur [°C] Vorkommen

ADC (EC 4.1.1.19) 1,4–11 25–75*

Maus, Ratte Pseudomonas spp.

S. ruminantium E. coli

Bacillus subtilis Nicotiana tabacum

Oryza sativa

ODC (EC 4.1.1.17) 4–9,5 22–65

Ratte, Maus, Mensch Lactobacillus spp.

Pseudomonas spp. Saccharomyces spp. Entamoeba histolytica Arabidopsis thaliana

SPDS (EC 2.5.1.16) 6,5–10,6 22–50**

Rind E. coli

Brassica spp. Senecio spp.

SPMS (EC 2.5.1.22) 7–8,1 37

Gehirn, Rind Diverse Organe, Mensch

Brassica spp.

TSPMS (EC 2.5.1.79) 9,4–9,6 55

E. coli Thalassiosira spp.

Arabidopsis thaliana NSPMS (EC 2.5.1.126) 7,5 95 Pyrubaculum aerophilum

CuAO (EC 1.4.3.21) 5,6–10,2 25–40*** Leber (Schwein, Ratte)

Arthrobacter aurescens PAO (EC 1.5.3.17) 7–10 25–37 Maus

Arabidopsis thaliana SSAT (EC 2.3.1.57) 6–9,1 25–45 Maus, Ratte, Mensch

Bacteroides subtilis [Internet: URL: http://www.brenda-enzymes.org/] abgerufen am 02.08.2016 * Weitere thermophile Bakterien tolerieren bis zu 100°C ** In Thermotoga maritima bis 90°C (WU et al. 2007) *** In Arthrobacter aurescens bis 55°C (LEE et al. 2002) Allen Enzymen gemeinsam ist eine Umsetzung von Substrat in einem breiten Toleranzbereich der Temperatur und des pH-Wertes. Zudem wurden die Enzyme in verschiedensten Organsystemen nachgewiesen, sodass unterstellt werden kann, dass sie auch in der mikrobiellen Pansenflora sowie in der Pansenwand vorkommen. Erste Erkenntnisse konnten ELIASSEN und SJAASTAD (2000) für die Enzyme ADC und ODC in der Pansenwand darlegen. Das erstlimitierende Enzym für den Polyaminmetabolismus in Pflanzen ist die ADC, während in Tieren und Pilzen die Limitation durch die ODC gegeben ist (TAKAHASHI u. KAKEHI 2010).

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Vielfach wurde in Pflanzen bereits nachgewiesen, dass es zu einer schnellen Erhöhung der Genaktivität für die Polyaminbiosynthese bei Stresseinfluss oder bei Verletzung kommt. So konnten GALSTON und SAWHNEY (1990) einen Anstieg der ADC bei Sorbitolzusatz zu Weizenblättern innerhalb von ein bis zwei Stunden verzeichnen, der zu einem entsprechenden 50fachen Anstieg von Putrescin führte. Auf Verletzung der äußeren Kutikula von Arabidopsis thaliana reagierte die Genregulation innerhalb von 30 Minuten, was einen entsprechenden Polyaminanstieg nach weiteren zwei Stunden zur Folge hatte (PEREZ-AMADOR et al. 2014). Studien zu genetisch veränderten Pflanzen konnten einen höheren Polyamingehalt und eine Stresstoleranz in den entsprechenden Mutanten nachweisen (MOHAPATRA et al. 2010;

Putrescin

Arginin

Cadaverin

Thermospermin(m/z 173)

Spermin

Spermidin

β-Alanin

AgmatinOrnithin

Homoagmatin

Homoarginin

3-AminopropanalS-Adenosyl-Methionin

N-Acetyl-β-Alanin

3-Acetamino-propanal

Norspermidin/Norspermin

N-Acetyl-β-Alanin

S-Adenosyl-Methionin

Lysin

Methionin3-Acetamino-propanal 1,3 Diaminopropan

ADC

ODC

SPDS

SPMS

TSPMS

MAT

MAT

LDC

NSPDS/NSPMS

AMADH

AAHDL

AAHDL

APAO

PAO

APAO

Abb. 2.2: Biosynthese der Polyamine Darlegung der Stoffwechselwege der Polyaminbiosynthese inklusive Enzyme Commission numbers (EC) modifiziert nach BAGNI und TASSONI (2001), KUZNETSOV et al. (2006), KUSANO et al. (2008) sowie TAVLADORAKI et al. (2012): ADC: Arginin-Decarboxylase (EC 4.1.1.19), LDC: Lysin-Decarboxylase (EC 4.1.1.18), ODC: Ornithin-Decarboxylase (EC 4.1.1.17), PAO: Polyamin-Oxydase (EC 1.5.3.17), SPDS: Spermidin-Synthase (EC 2.5.1.16), SPMS: Spermin-Synthase (EC 2.5.1.22), TSPMS: Thermospermin-Synthase (EC 2.5.1.79), NSPDS/NSPMS: Norspermidin/ Norspermin-Synthase (EC 2.5.1.123/126), APAO: N1-Acetylpolyamin-Oxydase (EC 1.5.3.13), CuAO: Kupfer-Amin-Oxydase (EC 1.4.3.21), MAT: Methionin-Adenosyl-Transferase (EC 2.5.1.6); AAHDL: N-Acetyl-β-Alanin-Amidohydrolase (EC 3.5.1.21), AMADH*: Aminoaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.21.19) (in dieser Arbeit nachgewiesene Amine sind fett hervorgehoben; - - Messung nicht reproduzierbar)

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FELLENBERG et al. 2012). Eine Übersicht zur Enzymregulation bei pflanzlichem Stress und zur Funktion der Enzyme ist bei MATTOO et al. (2015) sowie PATHAK et al. (2015) gegeben.

Der Polyaminkatabolismus dient in erster Linie der Regulation der Polyamingehalte in den Zellen, führt jedoch auch durch Freisetzung von weiteren Abbauprodukten zur Induktion neuer Signalkaskaden. So konnten OBER und KALTENEGGER (2009) die Homospermidin-Synthase (HSS) nachweisen, die aus Putrescin und Spermidin das

Putrescin

Arginin

Cadaverin

Thermospermin(m/z 173)

Spermin

Spermidin

β-Alanin

AgmatinOrnithin

Homoagmatin

Homoarginin

3-Aminopropanal

N-Acetyl-β-Alanin

3-Acetamino-propanal

Norspermidin/Norspermin

4-Aminobutanal

β-Alanin-Betain

N-Acetyl-β-Alanin

Lysin

N1-Acetyl-Spermin

3-Acetamino-propanal 1,3 Diaminopropan

GABA

Zitratzyklus

ADC

ODC

PAO

PAO

TSPMS

SSAT

LDC

NSPDS/NSPMS

AMADH

AAHDL

AAHDL

APAO

PAO

APAO

CuAO5-Aminovaleraldehyd

CuAO

Alkaloide

N1-Acetyl-Spermidin

APAO

SSAT

APAO

Glutamat

Abb. 2.3: Katabolismus der Polyamine Darlegung der Stoffwechselwege des Polyaminkatabolismus inklusive Enzyme Commission numbers (EC) modifiziert nach BAGNI und TASSONI (2001), KUZNETSOV et al. (2006), KUSANO et al. (2008) sowie TAVLADORAKI et al. (2012): ADC: Arginin-Decarboxylase (EC 4.1.1.19), LDC: Lysin-Decarboxylase (EC 4.1.1.18), ODC: Ornithin-Decarboxylase (EC 4.1.1.17), PAO: Polyamin-Oxydase (EC 1.5.3.17), SSAT: Spermidin/Spermin N1-acetyltransferase (EC 2.3.1.57), TSPMS: Thermo spermin-Synthase (EC 2.5.1.79), NSPDS/NSPMS: Norspermidin/Norspermin-Syn- thase (EC 2.5.1.123/126), APAO: N1-Acetylpolyamin-Oxydase (EC 1.5.3.13), CuAO: Kupfer-Amin-Oxydase (EC 1.4.3.21), MAT: Methionin-Adenosyl-Transferase (EC 2.5.1.6); AAHDL: N-Acetyl-β-Alanin-Amidohydrolase (EC 3.5.1.21), AMADH*: Aminoaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.21.19)

(in dieser Arbeit nachgewiesene Amine sind fett hervorgehoben; - - Messung nicht reproduzierbar)

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langkettige Homospermidin synthetisiert, welches dann in die Bildung von Pyrrolizidinalkaloiden bei Senecia spp. einfließt. MOSCHOU und ROUBELAKIS-ANGELAKIS (2014) diskutieren in ihrer Studie eine Funktion des Polyaminabbaus im programmierten Zelltod von Pflanzen und Tieren. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass Spermidin die Autophagie in der tierischen Zelle reguliert, jedoch ist wenig über die Mechanismen bekannt. Hingegen scheint Thermospermin bei der Apoptose eine Schlüsselrolle in Pflanzen zu übernehmen. Vor allem das aus dem Polyaminabbau entstehende H2O2 induziert Kaskaden, die zum Zelltod führen können. Zudem führt der Abbau von Polyaminen auch zur Bildung von GABA (s. Abb. 2.3), welches wiederum weitreichende Funktionen bei der Reaktion auf pflanzlichem Stress übernimmt (BITRIÁN et al. 2012).

2.2.5 Polyamine und Phenole

Speziell bei Polyaminen ist aufgrund der hohen, stereochemisch bedingten Aktivität und der Signalfunktion eine enge Regulation im Organismus entscheidend. Neben dem in Kapitel 2.2.4 beschriebenen ineinandergreifenden schnellen Auf- und Abbau der Polyamine ist die Bindung an phenolische Gruppen beschrieben (FLORES u. FILNER 1985). MARTIN-TANGUY (1997) vermutet durch die Konjugation von Polyaminen an Phenolsäuren (Hydroxyzimtsäuren) eine Membranstabilisierung durch Modulation von Kalziumkanälen sowie eine Detoxifizierung von phenolischen Komponenten. Gleichzeitig kommt es durch die Bindung zu einer Regulation der freien Polyamingehalte (FINCATO et al. 2011; FELLENBERG et al. 2012). Außerdem wird durch die Konjugation von phenolischen Komponenten die beschriebene Wachstumshemmung außer Kraft gesetzt und ein Wachstum ermöglicht (MARTIN-TANGUY 1997). Neben den Funktionen im Wachstum und an Ionenkanälen ist eine Bindung von Polyaminen an Proteine, Nukleinsäuren und Phospholipide der Zellwand beschrieben, wobei letzteres als Induktion der zellulären Seneszenz verstanden wird (BOUCHEREAU et al. 1999). Phenolische Hydroxyzimtsäure-Konjugate beschreiben auch BAGNI und TASSONI (2001) und sie erfassten die Strukturen dieser Konjugate. Die Wissenschaftler konnten herausarbeiten, dass die Anteile an freien und konjugierten Polyaminen je nach Pflanzenspezies sehr stark variieren. Zudem vermuteten sie eine Funktion der Konjugate als Radikalfänger. MOSCHOU et al. (2008) unterteilten die konjugierten Polyaminverbindungen in lösliche Verbindungen mit Hydroxyzimtsäuren und unlös-liche Komplexe, die durch Bindung von Polyaminen an Hemizellulose, Lignin und Proteine entstehen. Der Polyaminmetabolismus wird unter anderem durch die als Botenstoff fungierende Jasmonsäure reguliert (BIONDI et al. 2001). In ihren Untersuchungen konnten BIONDI et al. (2001) nachweisen, dass Methyl-Jasmonat die Enzyme ADC und ODC hochreguliert und damit die Polyaminbiosynthese, -oxidation und -konjugation erhöht. ONKOKESUNG (2010) erklärte die Bildung von Hydroxyzimtsäure-Amiden durch Acetylierung von Polyaminen (Putrescin, Spermidin u. Spermin) an Hydroxyzimt-säuren (Cinnamoyl-, Coumaroyl-, Caffeoyl-, Feruloyl- und Sinapoyl-CoA). Induziert wird dieser Prozess ebenfalls durch die als Botenstoff dienende Jasmonsäure. BASSARD et al. (2010) beschreiben die durch Acetylierung entstehenden Phenolamide als akkumulierende Endprodukte, deren Funktion sich im Wesentlichen

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auf die Stabilität der Zellwand und die Abwehr von Herbivoren und Pathogenen in der Pflanze durch die Toxizität der Phenolverbindungen konzentriert. FELLENBERG et al. 2012 konnten in einer Knockout-Mutante von Arabidopsis thaliana, die keine Hydroxyzimtsäure bildet, weniger Hydroxyzimtsäure-Konjugate feststellen. Da es jedoch in der Folge nicht zur Akkumulation vom Konjugationspartner Spermidin kam, wurde angenommen, dass die eng regulierte Polyaminhomöostase neben der Steuerung durch Konjugation, Biosynthese und Katabolismus auch durch Transportsysteme beeinflusst wird. McLEAN und DUNCAN (2006) beschrieben die Konjugation von sekundären Pflanzenstoffen als essentielle Schutzmaßnahme zur Entgiftung selbiger in Herbivoren. Auch FINK-GREMMELS (2010) beschreibt die Konjugation von Phenolen und Aminen zur Bildung von Exkretionsprodukten in Pflanzen als Schutzmechanismus (sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe) gegen Herbivoren. JIMÉNEZ-BREMONT et al. (2014) stellten ebenfalls die Zusammenhänge des Polyaminstoffwechsels und den Einfluss der Jasmonsäure für die Interaktion von Pflanzen und Mikroorganismen (biotischer Stress) dar und verdeutlichen dabei die Verbindung von Polyaminen zu Phenolsäuren. Die Bedeutung der Konjugation von Polyaminen ist bereits als wichtige Funktion für die Homöostase der freien Polyamine bestätigt worden, gleichwohl bleiben viele Fragen zur genauen Regulation offen. Auch die mögliche Toxizität von entsprechenden Polyaminverbindungen ist noch unzureichend erfasst.

2.2.6 Transglutaminasen

Als Funktion von Aminen und speziell Polyaminen wird in der Literatur die Bindung an Proteine und die damit verbundene Konformationsänderung selbiger beschrieben. Das für diese Bindungen verantwortliche bekannte Enzym ist die Transglutaminase (EC 2.3.2.13). FOLK et al. (1980) beschrieben die Bindung von Polyaminen durch Transglutaminasen in humanen Lymphozyten zuerst. In Pflanzen gelangen erste Nachweise SERAFINI-FRACASSINI et al. (1988). Es folgte die Identifizierung von Transglutaminasen in isolierten Chloroplasten durch DEL DUCA et al. (1995). Zudem konnte bei DEL DUCA et al. (1995) trotz der Bindung an Proteine eine Umwandlung von Putrescin in Spermidin und anders herum beobachtet werden, was eine angepasste Biosynthese annehmen lässt. SERAFININI-FRACASSINI et al. (1995) stellten die funktionale Bindung von Polyaminen an die große Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase (RuBisCO) durch Transgluta-minasen zum Schutz des pflanzlichen Proteins heraus. Sie beschrieben eine Steigerung der Photosynthese-Effizienz durch den Schutz von RuBisCO. Auch eine Reihung der bevorzugten Substrate konnte erarbeitet werden. Demnach wird Spermidin > Spermin > Putrescin durch Transglutaminasen gebunden (SERAFININI-FRACASSINI et al. (1995). Diese Ergebnisse sind analog zu den Beschreibungen von APELBAUM et al. (1988), die ebenfalls Spermidin als das präferierte Substrat identifizierten. Weitere Eigenschaften durch die Funktion von Transglutaminasen fassten BOUCHEREAU et al. (1999) zusammen. Danach führt die Bindung von Polyaminen an Proteine sowohl extra- als auch intrazellulär zu deren Konformationsänderung und einer Aktivierung weiterer Kaskaden. So wurden unter Hitzestress hohe Gehalte von gebundenen Polyaminen nachgewiesen und auch

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Reparationsprozesse lassen diese gebundenen Polyamine akkumulieren (BOUCHEREAU et al. 1999). Signaltransduktionen durch Membranen werden, ebenso wie die Induktion von Exozytosen durch eine via Transglutaminasen katalysierte Bindung von Polyaminen an Proteine bedingt (BOUCHEREAU et al. 1999; RAMANI et al. 2014;). In Säugetieren führen Transglutaminasen zu Polyamin-Proteinkomplexen mit hoher Molekularmasse, die durch ihre Ladung zu einer posttranslationalen Protein-modifikation führen. Die so gebildeten Komplexe akkumulieren vor allem während der Blutgerinnung und bei Wundheilung (GRIFFIN et al. 2002). In ihren umfangreichen Arbeiten konnten SERAFINI-FRACASSINI et al. (2009) weitere Eigenschaften von Transglutaminasen aufdecken:

• optimaler pH-Wert: 7,5–8,5 • Temperaturoptimum: 40–45°C • kalziumabhängige Funktion

Neben dieser Charakterisierung konnten SERAFINI-FRACASSINI et al. (2009) auch eine Verbindung zum programmierten Zelltod in Pflanzen herstellen, die mit der induzierten Konformationsänderung des Zytoskeletts zusammenhängt. Letztere Entdeckung bestätigt sich in den neuesten Untersuchungen zur Funktion von Polyaminen während des programmierten Zelltods in Pflanzen von CAI et al. (2014). Es wird angenommen, dass die durch Transglutaminase-Bindung entstehende Konjugation von Putrescin und/oder Spermidin an pflanzliche Proteine eine Konformationsänderung zur Folge hat, die die Proteine und damit die Zellen entweder stabilisiert oder den programmierten Zelltod induziert. Unter welchen Bedingungen die Konformation des programmierten Zelltodes zustande kommt, konnte noch nicht genau belegt werden. Abschließend ist hervorzuheben, dass die Kenntnisse der genauen Funktionen von Transglutaminasen und deren Produkten noch sehr rudimentär erforscht sind. Die durch die Polyamin-Protein-Bindung induzierten Reaktionen sind essentielle Signalkaskaden im zellulären Stoffwechsel und Wachstum sowie der Abwehr von Stressoren und dem programmierten Zelltod. Dabei kommt den Transglutaminasen auch in der Regulation der freien Polyamine eine wichtige Bedeutung zu.

2.2.7 Bedeutung der biologischen Wirkung und möglichen Toxizität von Aminen

Amine haben sowohl in der Pflanze als auch in Mikroorganismen und im Säugetier vorrangig auf zellulärer Ebene weitreichende Funktionen, die in ihrer Komplexität noch nicht vollständig erfasst sind (Näheres s. MILLER-FLEMING et al. 2015). In pflanzlichen Zellen werden vor allem Polyamine als Wachstums- und Botenstoffe beschrieben, die bei genetisch stressresistenten Pflanzen in höheren Gehalten vorkommen oder bei Verletzung der Kutikula anfluten (s. Kap. 2.2.1). Dabei reagieren die Pflanzen auf Stressreize mit einem Anstieg der Aminosäure-decarboxylasen (ADC = EC 4.1.1.19 und ODC = EC 4.1.1.17) innerhalb von wenigen Stunden (GALSTON u. SAWHNEY 1990; MOHAPATRA et al. 2010), was wiederum einen entsprechenden Anstieg der Polyamine nach sich zieht. Zudem führt die

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Bereitstellung von Polyaminen als Folge eines Stressreizes zu einer Akkumulation von Kohlenstoff und Stickstoff in den Zellen. Die Aminosäuren Arginin, Lysin, Methionin und Ornithin sinken infolgedessen, während Alanin und GABA als Stoffwechselprodukte aus dem Polyaminkatabolismus ansteigen (MOHAPATRA et al. 2010). Die Reaktionen des Polyaminstoffwechsels in Nutzpflanzen auf Schwermetalle, Hitze, Salz und osmotische Stressreize sind aktuell bei PATHAK et al. (2015) zusammengefasst. GALSTON und SAWHNEY (1990) konnten einen Anstieg der ADC auf verschiedene Stressreize im Getreide bereits nach wenigen Stunden beobachten. In der Schotenkresse konnte die Hochregulation der RNA für ADC2 (EC 4.1.1.19) nach lokal gesetzter Verletzung innerhalb von 30 Minuten beobachtet werden. Dieser Effekt blieb für 4 Stunden erhalten und führte sekundär zu einem messbaren Anstieg der Putrescingehalte in der Zeit von 2–10 Stunden nach der Induktion. Die Gehalte von Spermin sanken hier kurzfristig ab, während Spermidin keine Veränderung zeigte (PEREZ-AMADOR et al. 2014). Eine solche Reaktion im Aminmetabolismus ist auch bei der Grasernte für die Silagegewinnung denkbar und könnte unter anderem zu den bekannten Amingehalten in Grassilagen führen (s. Tab. 2.4; KRIZSAN u. RANDBY 2007). Polyamine werden außerdem als Signalmoleküle verstanden, die eine Freisetzung von weiteren Botenstoffen wie Stickstoffmonoxid unter biotischen oder abiotischen Stressreizen zu Folge haben (WIMALASEKERA et al. 2011). Darüber hinaus ist die Konjugation von Polyaminen durch ihre kleine, polykationische Struktur begünstigt. Auf diese Weise fungieren sie an Hydroxyzimtsäuren gekoppelt als Radikalfänger (BAGNI u. TASSONI 2001). Auch der durch Polyamine vermittelte Schutz vor Proteasen ist bei RuBisCO zur Steigerung der Photosyntheseeffizienz beschrieben (DEL DUCA et al. 1995). Zudem fungieren Polyamine als toxische Endprodukte zur Abwehr von Herbivoren und Pathogenen (Näheres s. BASSARD et al. 2010). Die hohe Reaktivität von Polyaminen führt also zu vielerlei Reaktionen im Pflanzenstoffwechsel, die bei der Silagegewinnung wiederum eine denkbare Akkumulation von Polyaminen, deren Verbindungen oder Stoffwechselprodukten verursachen können und folglich über die Silage in den Pansenstoffwechsel gelangen. Auch KŘÍŽEK (1991) nimmt für die in der Silage vorkommenden Polyamine toxisches Potential an. Über die Toxizität und pharmakologische Auswirkung von Aminen im Säugetier sind inzwischen einige Informationen bekannt geworden. PEGG (2013) beschreiben die Wirkung von Aminen auf Versuchstiere und nennen in erster Linie das hohe zytotoxische Potential der aus dem Polyaminstoffwechsel stammendem Abbau-produkte H2O2 und Acrolein. In Studien zur akuten und chronischen Toxizität der Amine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin und Tyramin wiesen TIL et al. (1997) unter anderem in Ratten innerhalb von Stunden eine Inhibition der Blutgerinnung und einen Blutdruckabfall (bzw. bei Tyramin einen Anstieg des Blutdrucks) nach. Hingegen entstanden als Langzeiteffekte neurologische Symptome in Form von Paralysen, Konvulsionen und Aggression sowie renale Insuffizienz. Auch vermindertes Wachstum und reduzierte Futteraufnahme sowie eine histologisch nachgewiesene Myokard-degeneration konnte in den Studien von TIL et al. (1997) beobachtet werden. Die meisten untersuchten Organe zeigten, mit Ausnahme der Lebern, ein erhöhtes relatives Gewicht. Zudem kam es zu einer Verschiebung der Kalium-, Calcium- und

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Phosphorhomöostase, die sich teilweise in einer Reduktion von Kalium und Calcium sowie anorganischem Phosphor im Plasma zeigte. Zur Überprüfung der Toxizität beim Wiederkäuer verabreichten FUSI et al. (2004) eine Mischung aus Cadaverin, Putrescin und Spermidin (1,4 g/Tier/Tag) in reiner Form oral und in der Vergleichsgruppe als Futterzusatz an Ziegenlämmer. Sie beobachteten vor allem bei der Gruppe der Tiere mit oraler Reindosis Veränderungen. Zum einen wurde in jener Gruppe eine um ~11 % reduzierte Körpermasse festgestellt, zum anderen konnten nach der Schlachtung erhöhte Tropfverluste im Fleisch beobachtet werden (+15 %), wobei hier eine Muskeldegeneration vermutet wurde. Der gesamte Gastro-intestinaltrakt wies entzündliche Veränderungen in Form von Epitheldesquamation, Zellschwellung und Infiltration von Entzündungszellen auf. In der Histologie wurden gesteigerte Mitoseraten in den Epithelzellen nachgewiesen. FUSI et al. (2004) schließen aus ihren Untersuchungen eine Toxizität von Polyaminen durch intestinale und nach Epithelschädigung auch ruminale Absorption bei einer täglichen Dosis von ≥ 1,4 g pro Tier. In vorherigen ruminalen Infusions- und Fütterungsstudien bei Rindern, Schafen und Ziegen konnten verschiedene Effekte des Amin- und Polyaminzusatzes herausgestellt werden. COLE (1992) startete die ersten Versuche zu Aminen und infundierte Putrescin (6 g/kg TS) und GABA (24 g/kg TS) in den Pansen. Ein geringer Effekt auf die Futteraufnahme wurde beobachtet. Zudem ließ die geringe Wiederfindungsrate im Pansen annehmen, dass die Stoffe durch die ruminale Mikroflora abgebaut wurden. Bei LINGAAS und TVEIT (1992) wurde in Grassilagen mit ketotischem Potential ein hoher Putrescin, Butter- und Valeriansäuregehalt nachgewiesen. Sie beschrieben, dass eine Dosis von 100 g Putrescin pro Tier und Tag im Vorversuch toleriert wurde, jedoch höhere Gehalte zu anorektischen Veränderungen führten. DAWSON und MAYNE (1996) stellten bei der direkten Infusion von Aminen in drei Konzentrationen (2,0, 4,0 u. 6,0 g/kg TS GABA, Putrescin u. Tyramin) in den Pansen keinerlei Veränderungen in der Futteraufnahme fest, konnten aber eine durch Tyramin verursachte Steigerung von i-Valeriat und einen ebenso verursachten Anstieg des pH-Wertes im Pansen feststellen. Bei VAN OS (1997) wurde bei Fütterung einer Grassilage mit drei zugesetzten Aminen (Cadaverin und Putrescin je max. 1,9 g/kg TS sowie Tyramin max. 3,7 g/kg TS) eine Adaptation bei den eingesetzten Schafen und der ruminalen Mikroflora durch vorherige Fütterung einer Silage mit moderaten Gehalten (Cadaverin: 1,4 g/kg TS, Putrescin: 1,0 g/kg TS und Tyramin: 2,1 g/kg TS) erreicht. Die Pansenmikroben der adaptierten Schafe waren in der Lage einen höheren Gehalt von Polyaminen in Ammoniak umzusetzen und die Tiere zeigten im Vergleich mit den nicht adaptierten Tieren keinen Einbruch in der Futteraufnahme während der Versuchsphase mit Aminzusatz. Ebenfalls in Fütterungsversuchen setzten PHUNTSOK et al. (1998) 2,95 g/kg TS Putrescin, 3,99 g/kg TS Cadaverin und 12 g/kg TS Spermin in Grassilagen ein. Es gelang zum einen aufgrund der abomasal im Vergleich zum Input um ca. –20 % reduzierten Gehalte von Cadaverin, Putrescin und Spermin der Nachweis einer mikrobiellen Umsetzung, zum anderen führte der Zusatz von Polyaminen zu einer reduzierten Passage und Verdaulichkeit der Trockensubstanz und im Umkehrschluss zu einer vermuteten sekundär reduzierten Futteraufnahme.

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Eine ruminale Absorption von Histamin durch mittels Azidose geschädigtes Pansenepithel gelang bei ASCHENBACH und GÄBEL (2000). ELIASSEN und SJAASTAD (2000) hingegen konnten keine signifikante ruminale Absorption von radioaktiv markierten Polyaminen (Putrescin, Spermidin und Spermin) bei intaktem Epithel nachweisen. Lediglich die gezielte lokale Schädigung des Pansenepithels führte zu einem schnellen Anstieg der ODC-Aktivität (innerhalb von 5 h) und damit zu einer erhöhten Produktion der Polyamine im Pansenepithel. ELIASSEN und SJAASTAD (2000) erfassten im Verlauf der physiologischen Pansenentwicklung von heranwachsenden Ziegen ruminale Gehalte von etwa 30–700 µmol/l Putrescin, 20–300 µmol/l Spermidin und 0–180 µmol/l Spermin. Neben einer beschriebenen Histaminresorption in Zusammenhang mit Pansen-azidosen durch eine Schädigung der Pansenwand, könnten auch andere Amine bei geschädigter Pansenwand resorbiert werden. Unter anderem wird Laminitis als Folge einer Histaminresorption angesehen (DIRKSEN 2002). Aufgrund der Hypothese der Histaminresorption induzierten IRWIN et al. (1979) eine Pansenazidose mit Glucose und L-Histidin bei Schafen. Sie beobachteten bei abfallendem ruminalen pH-Wert einen Anstieg von Tyramin (und Histamin) in der Pansenflüssigkeit. Zudem wurde weiterhin ein Anstieg von Tyramin, Tryptamin und Histamin 48 Stunden nach Beendigung der Azidose während der Regeneration des pH-Wertes festgestellt. Dies wurde unter anderem auf eine Verschiebung der Mikroflora zurückgeführt. WANG et al. (2013b) beobachteten bei über konzentratreiche Fütterung induzierter subakuter Pansenazidose einen Anstieg von Putrescin auf Gehalte von 39,4 µmol/l und Tyramin auf 148 µmol/l in der Pansenflüssigkeit bereits 4 Stunden nach Einleiten der ruminalen Azidose. Auch im Plasma konnte der Anstieg der Amine nachvollzogen werden (Putrescin von 1,40 auf 8,25 µmol/l und Tyramin von 2,44 auf 9,02 µmol/l). Diese Ergebnisse sprechen für die schnelle Reaktion des Polyaminmetabolismus im Tier und eine mögliche Resorption unter azidotischen pH-Werten im Pansen. MAO et al. (2016) gelang es, bei einer in vitro induzierten Azidose die Amingehalte von Putrescin und Tyramin durch Zusatz von Natriumbicarbonat deutlich zu senken, wenngleich die Amingehalte generell während der Versuche anstiegen. Diese Studien verdeutlichen, dass der Metabolismus von Aminen auch wesentlich vom ruminalen pH-Wert abhängt. Jedoch konnten in allen oben genannten Untersuchungen Amine ebenfalls in den jeweiligen Kontrollen nachgewiesen werden, sodass die Amingehalte im Pansen auch wesentlich durch den nutritiven Eintrag und die mikrobielle Synthese beeinflusst sind. Zur Funktion der Pansenmikroben im Aminstoffwechsel ist bisher sehr wenig bekannt. Dass die Mikroorganismen eine wichtige Brücke im Metabolismus von Aminen im Pansen bilden, wurde bereits nachgewiesen (COLE 1992; DAWSON u. MAYNE 1996; PHUNTSOK et al. 1998; WANG et al. 2013b; GRESNER et al. 2014). Welche Aufgabe sie aber genau erfüllen, ist bisher nicht hinreichend nachvollziehbar. Cadaverin, Putrescin und Spermidin wurden als Bestandteil der bakteriellen Peptidoglycanwand in grampositiven und gramnegativen Spezies identifiziert (KAMIO et al. 1986; TAKATSUKA u. KAMIO 2004; KOJIMA u. KAMIO 2012). Damit besteht für diese drei Polyamine eine essentielle Funktion in den Spezies Veillonella spp. und Selenomonas ruminantium. LIAO et al. (2014) entdeckten einen Agmatin-Weg zur Synthese von Putrescin in Selenomonas ruminantium. In den Bakterien Megasphaera elsdenii und

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Anaerovibrio lipolytica wurden ebenfalls Cadaverin und Putrescin nachgewiesen (LEWIS u. EMERY 1962; KAMIO u. NAKAMURA 1987). Darüber hinaus konnten GRESNER et al. (2014) Putrescin und Cadaverin als Abbauprodukte von verschiedenen bovinen und ovinen Pansenbakterien, sowie HAP-Spezies identifizieren. ATASOGLU et al. (1998) bestätigten, dass die ruminalen Bakterien Prevotella bryantii, Selenomonas ruminantium und Streptococcus bovis selbst in der Lage sind, Aminosäuren zu synthetisieren. Dass diese wiederum zu Polyaminen decarboxyliert werden können, zeigen die Studien von IRWIN et al. (1979), BARKER (1981), DAI et al. (2011) sowie ROMANO et al. (2012). Bei der Erhebung des ruminalen Metaboloms durch SALEEM et al. (2012) wurden erstmalig Polyamine und korrespondierende Aminosäuren gleichermaßen unter physiologischen Bedingungen im Pansen untersucht, was das gemeinsame Vorkommen bestätigt. Ein Hinweis auf die Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber Polyaminen ist bei TABOR und TABOR (1985) zu finden. Danach ist ein Gehalt von > 500 µg/ml Spermin bakterizid für Escherichia coli, dabei erhöhte sich in den Studien die Toxizität von Spermin mit steigendem pH-Wert und ein synergistischer Effekt bei Zusatz von Spermidin wurde auch beobachtet. Beim Abbau von Polyaminen entsteht unter anderem GABA. DHAKAL et al. (2012) untersuchten die Produktion von GABA durch verschiedene Mikroorganismen. RACKWITZ und GÄBEL (2016) zeigten kürzlich die Resorption von GABA durch überwiegend passive Diffusion im Pansenepithel auf. THEERMANN konnte (2011) einen nahezu vollständigen Abbau von 10 bzw. 20 g/l GABA im RUSITEC in 48 Stunden belegen. Hier bleibt zu klären, inwiefern GABA im Pansen akkumuliert und durch Resorption im Tier aufgenommen werden kann. Erste Studien zum Einsatz von GABA als Futtermittelzusatz bei Rindern bestätigen, dass vorrangig kein toxisches Potential vorliegt, sondern vielmehr eine gesundheits- und leistungsfördernde Wirkung auch bei höheren Dosen von bis zu 7,6 g GABA pro Tier und Tag (MATSUMOTO et al. 2009; KU et al. 2013; WANG et al. 2013c; WANG et al. 2013d) postuliert werden kann. Neben der Bildung von toxischen Abbauprodukten kann auch die Verbindung von Aminen mit phenolischen Substanzen oder Proteinen möglicherweise einen Risikofaktor für die Tiergesundheit darstellen. So wies ÖZMEN (2014) neben der Bildung von Tyramin aus L-Tyrosin auch eine Verbindung dieser Aminosäure zum Polyphenolstoffwechsel nach. Das Amin Tyramin wird außerdem mit der Bildung von toxischen Alkaloiden in Verbindung gebracht (ALDEN et al. 2014). Beide letztgenannten Aspekte machen die Reaktivität und damit auch das unter Umständen hohe toxische Potential von Aminen deutlich. BODE et al. (2010) sowie VAN ELST et al. (2013) konnten Pavettamin als toxische Polyaminverbindung aus Rubiaceae nachweisen. Der Stoff wird für ein Vergiftungsgeschehen in Wiederkäuern in Südafrika verantwortlich gemacht. OBER und KALTENEGGER (2009) beschreiben das Enzym Homospermidin-Synthase in verschiedenen Pflanzen. Homospermidin wird weiter zu toxischen Pyrrolizidinalkaloiden umgesetzt. Außerdem kann aus dem Polyaminabbau Wasserstoffperoxid entstehen (CONA et al. 2006; JIMÉNEZ-BREMONT et al. 2014; MATTOO et al. 2015). Im Wiederkäuer wurde eine toxische Wirkung von Wasserstoffperoxid bei WILLARD und KODRAS (1967) in Studien zur Vermeidung von Pansentympanie nachgewiesen. Es bleibt also weiterhin

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27

fraglich, welchen Einfluss mögliche Aminverbindungen und Stoffwechselprodukte von Aminen auf die Toxizität im Organismus haben.

2.3 Zusammenfassende Wertung

Die Ergebnisse der vorherigen Untersuchungen am RUSITEC haben einen Zusammenhang zwischen der Fermentation von Grassilagen mit einem RE/Rp < 50 % und dem Proteinstoffwechsel aufzeigen können (GRESNER 2011; THEERMANN 2011; GRESNER et al. 2015). Daher sind der Amin- bzw. Polyaminstoffwechsel und seine Auswirkungen von entsprechender Relevanz. Die Eigenschaften von Polyaminen führen zu einer Vielfalt an Funktionen im Organismus. Dabei sind die kationische Ladung, die Löslichkeit und die langkettige Struktur, sowie die breite Toleranz der am Metabolismus beteiligten Enzyme hervorzuheben (COHEN 1998a; TAVLADORAKI et al. 2012; s. Tab. 2.7). In Pflanzen fungieren Polyamine als Regulatoren von Wachstum und Entwicklung, bei abiotischen und biotischen Stresseinflüssen sowie in der Signaltransduktion und sie beeinflussen durch Bindung die Proteinstabilität (s. Tab. 2.2). Hier führt der Anstieg von Polyaminen zur Modulation von Ionenkanälen oder die Bindung an Proteine bzw. Nukleinsäuren zur Induktion einer Reaktion. Zudem ruft die Metabolisierung von Polyaminen die Bildung entsprechender Botenstoffe und Abwehrprodukte hervor (KUZNETSOV et al. 2006; TAKAHASHI u. KAKEHI 2010; PATHAK et al. 2015). Diese Einflüsse auf den Metabolismus in Pflanzen sind also für die Beurteilung der Polyamingehalte in Futtermitteln von Bedeutung und erklären zudem die Streuung der erhobenen Gehalte (s. Tab. 2.3 u. Tab. 2.4). Im Pansen bzw. im Tier konnten einige Effekte von Aminen und Polyaminen herausgestellt werden (s. Tab. 2.5). So wird die Futteraufnahme durch erhöhte Amingehalte reduziert, was unter Umständen entsprechende Folgen in Form von Entgleisungen des Stoffwechsels bedingen kann (COLE 1992; LINGAAS u. TVEIT 1992; VAN OS et al. 1997; PHUNTSOK et al. 1998). Deutlich wird jedoch auch, dass eine Adaptation an Amine im Pansen möglich ist (VAN OS et al. 1997). Daher müssen entsprechende Um- und Abbauvorgänge in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus kann der Absorption von Aminen direkt aus dem Pansen unter physiologischen Bedingungen nur eine untergeordnete Relevanz beigemessen werden (ELIASSEN u. SJAASTAD 2000). Schließlich wurden auch toxische Effekte im Wiederkäuer durch orale Verabreichung von Aminen nachgewiesen (FUSI et al. 2004). Bei der Betrachtung des Amin- und Polyaminmetabolismus von Mikroorganismen wird deutlich, dass Polyamine durch ruminale Mikroorganismen sowohl synthetisiert als auch ab- und umgebaut werden. Eine Gewichtung der Präferenz bestimmter Amine konnten VAN OS et al. (1997) in vitro aufzeigen. Zusätzlich wurde in tiefergehenden Untersuchungen die Funktion von Polyaminen für die Integrität der Peptidoglycanwand von Selenomonas ruminantium nachgewiesen (s. Tab. 2.6). Dieser Aspekt bedeutet unter anderem einen durch Polyamine bedingten Wachstumsvorteil bestimmter Mikroorganismen im Pansen und hat eine entsprechende Bedeutung in der Fütterung von Rindern. Wie komplex dabei die Stoffwechselwege der einzelnen Mikroorganismen im Pansen ineinander greifen, verdeutlicht die Studie von EDWARDS et al. (2008).

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Die am Polyaminstoffwechsel beteiligten Enzyme sind sehr eng reguliert. Das zeigt sich in der äußerst kurzen Zeit von mehreren Minuten bis wenigen Stunden, die zu einem Anstieg von Polyaminen führen kann. So konnte im Pflanzenstoffwechsel bereits mehrfach dargestellt werden, dass eine erhöhte Genexpression bzw. nachfolgend eine Steigerung der Enzymaktivität zur Polyaminbildung bereits innerhalb von wenigen Stunden nach Induktion des jeweiligen Prozesses sowohl in der Pflanze als auch im Pansen und im Pansenepithel stattfindet (GALSTON u. SAWHNEY 1990; ELIASSEN u. SJAASTAD 2000; WANG et al. 2013b; PEREZ-AMADOR et al. 2014). Dabei ist auch der erstaunlich weite Toleranzbereich für pH-Wert und Temperatur der Enzyme beachtlich (s. Tab. 2.7). In erster Linie werden die Enzymsysteme durch Veränderungen des Milieus im Pansen oder durch Stresseinflüsse bzw. Verletzungen der pflanzlichen Kutikula oder des Pansenepithels induziert. Die einzelnen Enzyme im Wiederkäuer können dabei aufgrund der schnellen Regulation nicht unabhängig voneinander betrachtet werden, sondern sollten als ineinandergreifendes dynamisches System der Pflanzen, Mikroorganismen und Pansenwand verstanden werden (s. Abb. 2.2 u. Abb. 2.3). Polyamine haben die Eigenschaft, Bindungen mit Proteinen und phenolischen Gruppen einzugehen. In Pflanzen sind Phenolsäuren in das Grundgerüst der Lignozellulose eingebaut (RIBEIRO et al. 2016). Eine Polyamin-Phenolsäure-Bindung in Pflanzen kann angenommen werden. An der Bindung von Polyaminen an Proteine sind maßgeblich die in vielen Organismen nachgewiesenen Transglutaminasen beteiligt (GRIFFIN et al. 2002). In erster Linie dient die Konjugation von frei vorkommenden Polyaminen ihrer Regulation und Entgiftung, dem Schutz von Proteinen und der Induktion verschiedener Kaskaden, wie beispielsweise dem programmierten Zelltod (SERAFINI-FRACASSINI et al. 2009). So ist denkbar, dass Amine und Polyamine im Pansen in Komplexen akkumulieren, die für den Gesamtorganismus schädlich sein könnten. Gleichermaßen könnten im Pansen auch vermehrt freie Amine anfluten, wenn die Homöostase der Mikroflora durch die Fütterung gestört ist. Es wird angenommen, dass das pflanzliche Gerüst der Schadsilagen leichter verdaulich ist, daher könnten möglicherweise Phenolsäuren zur Komplexbildung vermehrt zur Verfügung stehen (s. GÖRES 2016).

2.4 Zielsetzung der Arbeit

In den folgenden Untersuchungen soll der Stoffwechsel einzelner Amine und Poly-amine mit Hilfe einer ruminalen Verdauungsstudie am RUSITEC analysiert werden. Ziel ist es, die Stoffe in den Grassilagen und im RUSITEC nachzuweisen und den Zusammenhang zwischen Polyaminen und korrespondierenden Aminosäuren aufzuzeigen. Dabei bilden Grassilagen mit unterschiedlichen RE/Rp-Quotienten (> 50 % bzw. < 50 %) und der Zusatz von Soja die Fütterungsgrundlage. Bei Fütterung von Grassilagen mit geringen Reineiweißgehalten wird ein verändertes Stoff-wechselgeschehen in der Pansenfermentation vermutet, das hypothetisch mit der von EICKEN (2005b) beschriebenen „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ in Verbindung gebracht wird und in der Praxis durch eine Sojazulage ausgeglichen werden konnte (EICKEN 2005a).

Material und Methodik

29

3 Material und Methodik

3.1 Ziel der Methodik

In Anlehnung an die Untersuchungen von GRESNER (2011), THEERMANN (2011) und ÖZMEN (2014) sollten die Gehalte von Aminen und Polyaminen sowie deren Aminosäurevorstufen in den dem RUSITEC zugeführten Grassilagen sowie im flüssigen und im festen Fermenterinhalt des RUSITES mit der LC-MS/MS bestimmt werden (s. Kap. 3.2.4.5). Die Bestimmung der Stoffe im festen Fermenterinhalt fand nach bisherigem Kenntnistand erstmalig im RUSITEC in vitro statt und ergab sich aus der Literaturrecherche, da Polyamine oftmals in gebundener Form vorliegen.

3.2 Material und Methoden

Alle im Verlauf dieses Kapitels beschriebenen Chemikalien und Verbrauchsmaterialien sind in Tabelle 9.1 detailliert aufgeführt. Die vorliegenden Untersuchungen sind Teil eines gemeinsamen RUSITEC-Verdauungsprojektes aus dem sechs Dissertationen hervorgehen (s. Tab. 3.1). Tab. 3.1: Übersicht über Literaturschwerpunkte und Autoren der gemeinsamen

RUSITEC-Versuche aus dem Pansenlabor der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Literaturschwerpunkt Autor/Jahr

Eigenschaften von Proteinen in Soja, Gras und Raps GÖRES 2016

Abbau und Toxizität von Schadsubstanzen im Pansen EBHARDT (in Vorbereitung)

Vorkommen von phenolhaltigen Substanzen in Pansen und Labmagen HUNSCHE 2017

Auswirkungen von Grassilagen auf den ruminalen Peptidstoffwechsel und die Bedeutung von Prevotella spp. sowie des Mikrobioms

ILLE 2017

Vorkommen, Wirkung und Stoffwechsel von nicht-proteinogenen Aminosäuren SCHULTE (in Vorbereitung)


30

3.2.1 Herkunft der Proben

Die zu untersuchenden Proben setzen sich zum einen aus den Proben der verwendeten Kontroll- bzw. Schadsilagen (s. Tab. 3.2 u. Tab. 9.3) und zum anderen aus den Proben der RUSITEC-Fermenter nach der Inkubation zusammen, wobei flüssiger und fester Inhalt gleichermaßen gewonnen wurden. Die Probenanalyse der Grassilagen erfolgte aus Lagerungsgründen aus gefriergetrocknetem Material. Eine Schadsilage wurde nach GAST 2010 als solche definiert, wenn der Quotient aus RE/Rp < 50 % beträgt und bei Fütterung derselben Tiere die beschriebene Krankheits-symptomatik (s. Kap. 1) zeigten. Eine Kontrollsilage hatte einen RE/Rp Quotienten > 50 % und kann nicht mit Erkrankungen in Zusammenhang gebracht werden (GAST 2010). Um den Einfluss der Vegetation und des Standortes gering zu halten, wurden im Gegensatz zu den Forschungsprojekten von GAST (2010), GRESNER (2011), LUMPP (2011), THEERMANN (2011) und WICHERN (2011) zwei Betriebe ausgewählt, die sowohl eine Kontroll- als auch eine Schadsilage von den gleichen Nutzflächen bereitstellen konnten (s. Tab. 3.2). Aufgrund der vorherigen Unter-suchungen wurde die Nummerierung der Läufe und analog der eingesetzten Grassilagen bei Nummer 30 fortgesetzt, wobei ungerade Zahlen die Schadsilagen beziffern. Die Futtermittelanalysen der Grassilagen wurden mit anerkannter nasschemischer Analysemethode nach VDLUFA-Richtlinien im Institut für Tier-ernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die Bestimmung des Reineiweißgehaltes nach der BARNSTEIN-Methode (1900) gelegt. Um die Qualität der in den Versuchen eingesetzten Grassilagen möglichst wenig zu beeinflussen, wurden diese bis zum Fütterungseinsatz im RUSITEC tiefgefroren gelagert. Tab. 3.2: Übersicht zur Bezifferung der eingesetzten Kontroll- bzw. Schadsilagen

(Nährstoffgehalte s. Tab. 9.3) Bezeichnung Einheit Kontrollsilage Schadsilage

Laufblock I L31–L34

Laufblock II L35–L38

Laufblock I L31–L34

Laufblock II L35–L38

Betrieb A Betrieb B Betrieb A Betrieb B K-30 K-32 S-31 S-33

RE / Rp % 60,6 59,5 42,9 40,3


31

3.2.2 RUSITEC

Der RUSITEC (RUmen SImulation TEChnique) ist ein von CZERKAWSKI und BRECKENRIDGE (1977) entwickeltes Langzeitinkubationssystem zur Durchführung von Verdauungsstudien im Pansenmilieu (s. Abb. 3.1 u. Abb. 3.2).

Im Rahmen des Projektes wurden acht Läufe zu je 28 Tagen in zwei Laufblöcken (L31–L34 und L35–L38) durchgeführt. In jedem Lauf wurden gleichzeitig sechs Fermenter eingesetzt. Dabei gliederte sich der Lauf in eine Einlauf-, eine Kontroll-, eine Zulage- und eine Erholungsphase (s. Tab. 3.4). Gestartet wurde der RUSITEC an Tag null mit Kontrollsilage (s. Tab. 9.3) im ersten Futterbeutel sowie festem Panseninhalt (Futterbeutel 2) und Pansenflüssigkeit von einem kontrolliert gehaltenen, fistulierten Rind. Das Spendertier wurde täglich zweimal mit 5 kg (uS) Kontrollsilage und 800 g (uS) Kraftfutter (s. Tab. 9.5) sowie Heu ad libitum gefüttert. Tiefergehende Informationen zum Spendertier sind bei GÖRES (2016) beschrieben. In der sechstägigen Einlaufphase und der sich anschließenden Kontrollphase (über zwei Tage) wurden alle sechs Fermenter mit Kontrollsilage und Maisstärke als Kohlenhydratquelle (Fa. Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld, Deutschland, Art.-Nr. 03402) „gefüttert“. Jeder Futterbeutel blieb während des Laufes für 48 Stunden im Fermenter, sodass pro Versuchstag je nur ein Futterbeutel ausgewechselt wurde.

Puffervorrats-behälter

Gas-beutel

Gas

Überstandsgefäß

AbsperrhahnFlüssigkeits- undGasentweichung

Schlauchpumpe

Elektromotor

Wasserbad 39 °C

Fermenter

Innenbehälter mit Nylon-Futtersäcken

Hubgestänge

Abb. 3.1: Schematischer Aufbau des RUSITEC nach BLANCHART et al. (1989) ergänzt


32

Nur der feste Panseninhalt von Tag null wurde bereits nach 24 h Fermentation ausge-wechselt. Bis zur Kontrollphase an Tag sieben und acht stellte sich ein steady state im Fermentationssystem ein (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977). Während der sich anschließenden Zulagephase (zehn Tage) wurde die Schadsilage mit einem RE/Rp < 50 % (s. Tab. 9.3) anstelle der Kontrollsilage in den vier Testfermentern (TF) eingesetzt. Eine Zulage von Sojaprotein erfolgte entsprechend des Reineiweißdefizites in zwei der vier Testfermenter (TFmS; s. Abb. 3.2). Die zwei verbliebenen Fermenter liefen als Kontrollen weiterhin mit Kontrollsilage (KF; s. Abb. 3.2). Am Ende des RUSITEC-Laufes folgte eine zehntägige Erholungsphase, in der wieder Kontrollsilage und Maisstärke inkubiert wurden. In dieser Phase wurde anhand von Stoffwechselparametern (flüchtige Fettsäuren, Ammoniak, Gasvolumen und Gaskonzentration, pH-Werte und bakterielles Protein nach BRADFORD (1976)) überprüft, ob das System in der Lage ist, seinen Ausgangszustand wieder zu erlangen. Die Bezeichnung und Nummerierung der Fermenter erfolgte analog zu ihrer Funktion und der Bezeichnung der eingesetzten Grassilage (s. Abb. 3.2 u. Tab. 3.4). Um die Stoffwechselprodukte aus der Fermentation unter in-vitro-Bedingungen zu puffern wurde dem RUSITEC kontinuierlich eine Pufferlösung als Speichelersatz zugeführt. Die Pufferzusammensetzung des RUSITEC-Puffers (s. Tab. 3.3 u. Tab. 9.1) orientierte sich an den Untersuchungen zum Speichel von Wiederkäuern von McDougall (1948). Über 24 Stunden förderte eine Sechskanalschlauchpumpe (Type 103 29.41.BA, Fa. OLE DICH, Hvidovre, Dänemark) kontinuierlich 400 ml RUSITEC-Puffer in die RUSITEC-Fermenter. Ein Hubmotor (Type DM 90-60 Fa. Eickelbaum Elektromaschinen GmbH) sorgte mit acht Hüben pro Minute für die nötige „Motilität“ im RUSITEC-System. Tab. 3.3: Zusammensetzung und Herstellung des RUSITEC-Puffers nach McDOUGALL (1948)

Lösung Zusammensetzung

A 49,0 g NaHCO3 46,5 g Na2HPO4 12•H2O Ad 4950 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)

B

47,0 g NaCl 57,0 g KCl 12,8 g MgCl2 6•H2O 5,3 g CaCl2 2•H2O Ad 1000 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)

Zu 4950 ml Lösung A werden 50 ml Lösung B mittels Pipette unter kontinuierlichem Rühren eingetropft.


33

Foto: GÖRES 2016 Abb. 3.2: Beladung und Betrieb des RUSITECS in der Zulagephase Kontrolle (Fermenter 1 u. 2) = KF-30 bzw. KF-32 enthaltene Kontrollsilage

(K-30 bzw. K-32) und Maisstärke; Test 1 (Fermenter 3 u. 4) = TF-31 bzw. TF-33 enthaltene Schadsilage (S-31 bzw. S-33) und Maisstärke; Test 2 (Fermenter 5 u. 6) = TF-31mS bzw. TF-33mS enthaltene Schadsilage (S-31 bzw. S-33), Maisstärke und Sojaprotein.


34

Tab. 3.4: Übersicht der Versuchsphasen und eingesetzten Futtermittel im RUSITEC Fermenter

Phase KF-30 bzw. KF-32

2 Kontrollfermenter TF-31 bzw. TF-33 2 Testfermenter

TF-31mS bzw. TF-33mS

2 Testfermenter

Beladung Tag 0

500 ml flüssiger Panseninhalt + 200 ml RUSITEC-Puffer + 100 ml ionenfreies Wasser (Seradest®)

Futterbeutel 1: 80 g (uS) fester Panseninhalt + 2,6 g (uS) Maisstärke Futterbeutel 2: 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke

Einlaufphase Tag 1–6 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke

Kontrollphase Tag 7–8 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke

Zulagephase Tag 9–18

10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke

+10,5 g (TS) Schadsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke

+10,5 g (TS) Schadsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke

+ 0,33 g (uS) Sojaprotein

Erholungsphase Tag 19–28 10,5 g (TS) Kontrollsilage + 2,6 g (uS) Maisstärke

Bei diesem angewendeten Versuchsaufbau muss die Verschiebung des messbaren Zulageeffektes beachtet werden, d.h. der Einfluss der zugelegten Schadsilage vom Versuchstag neun ist in den gewonnenen Proben erst ab Versuchstag zehn messbar (s. Tab. 3.5).

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35

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36

3.2.3 Dauerbetrieb des RUSITEC

Die Reihenfolge der täglichen Arbeitsschritte am RUSITEC und ihr Zeitaufwand sind in Tabelle 3.6 erfasst. Tab. 3.6: Zeitlicher Ablauf eines Versuchstages (modifiziert nach GAST 2010 u. LUMPP 2011)

Abschnitt Zeit [Min.] Arbeitsschritt

Vor-

be-

rei-

tung

-40 - Eichung des Gaschromatographen GC-8A (GÖRES 2016) 0 - Abschalten des RUSITEC-Systems (Pufferzufuhr, Hubmotor) 1 - Abkoppeln der Gasbeutel

Bel

adun

g

2–45

- Entnahme des ersten Fermenters aus dem Wasserbad und Öffnung

- Entnahme von 6 ml Fermenterprobe zur Bestimmung der FlFS-Konzentrationen

- Entnahme von 10 ml Fermenterprobe zur Polyamin- und Aminosäureanalyse

- Entnahme von 26 ml Fermenterinhalt für weitere Untersuchungen des Gesamtprojektes (s. GÖRES 2016; s. Tab. 9.2)

- Entnahme des seit 48 h im Fermenter inkubierten Futterbeutels - Einsetzen eines neuen Futterbeutels in den RUSITEC-

Innenbehälter - Entleerung und Spülung des entnommenen Futterbeutels mit

50 ml vorgewärmtem RUSITEC-Puffer - Rückführung der Spülflüssigkeit in den Fermenter - Verschluss des Fermenters und Arretierung im Wasserbad - Wiederholung des Beladungsvorgangs an den Fermentern 2–6

Dire

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ung

2–122

- Bestimmung des Überstandsvolumens und Entnahme von 10 ml Überstandsflüssigkeit zur Bestimmung der FlFS-Produktion

- Vorlegen von 40 ml verdünnter Salzsäure (18,5 %) (s. Tab. 9.1) in die Überstandsgefäße

- Messung des Gasvolumens in den Gasbeuteln (GÖRES 2016) - Entnahme von 1 ml Gasprobe und Messung der

Gaszusammensetzung am Gaschromatographen (GC-8A) (GÖRES 2016)

Star

t

45 - Einschalten der Pufferzufuhr

45–60

- Begasung der Fermenter (je 1 Min.) mit CO2 (s. Tab. 9.1) - Anschließen eines leeren Gasbeutels direkt nach dem Begasen

des jeweiligen Fermenters - Einschalten des Hubmotors

Nac

hbe-

reitu

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60–210

- Probenaufbereitung und Probenanalytik bzw. -asservierung (s. Kap. 3.2.4.5.6)

- Vorbereitung der Futtermittel und Bedarfsgegenstände für den folgenden Versuchstag

- Reinigungs- und Aufräumarbeiten


37

3.2.4 Analytik

Der RUSITEC ist ein semikontinuierliches in-vitro-System des Pansens, dass biologischen Schwankungen unterliegt. Daher müssen während der jeweiligen Versuchsläufe verschiedene Parameter zur Kontrolle und Überwachung des Systems erhoben werden, deren Messmethodik sich bereits in diversen Untersuchungen als geeignet erwiesen hat (s. Tab. 3.7). Teil dieser Arbeit war neben der Analyse von Aminen und Aminosäuren die Erfassung des Ammoniakgehaltes, der Überstands-menge und der Gehalte der flüchtigen i-Fettsäuren. Zudem wurden der pH-Wert, der Gehalt des bakteriellen Proteins (bestimmt nach BRADFORD 1976), das Gasvolumen und die Gaszusammensetzung gemessen (Parametereinteilung s. a. Tab. 9.2). Die beobachteten Parameter sind sowohl Überwachungsparameter als auch beeinflusste Größen, die sich je nach Versuchsansatz verändern können. Zur Über-prüfung der Genauigkeit der Analyseverfahren wurde jeweils eigens der Variations-koeffizient (VK) bestimmt (s. Tab. 3.7). Tab. 3.7: Literaturübersicht zu den Messverfahren der untersuchten Parameter im RUSITEC

und ihre Evaluation

Parameter Messverfahren Einheit Literatur der Messverfahren VK [%]

pH-Wert Elektrode pH ZIPORI 1989 0,59 Gasproduktion volumetrisch ml SCHIRMER 1990 Methan gaschromatogr. Vol.-% HÖLTERSHINKEN 1990

GÖRES 2016 0,30

Sauerstoff gaschromatogr. Vol.-% 3,59 Kohlenstoffdioxid gaschromatogr. Vol.-% 0,22 Stickstoff gaschromatogr. Vol.-% 2,57 Essigsäure gaschromatogr. mmol/l JENSEN 1973

RANFFT 1973 GEISSLER et al. 1976

2,261/0,512 Propionsäure gaschromatogr. mmol/l 0,851/0,442 i-Buttersäure gaschromatogr. mmol/l 1,121/0,472 n-Buttersäure gaschromatogr. mmol/l 1,001/0,562 i-Valeriansäure gaschromatogr. mmol/l 0,731/0,612 n-Valeriansäure gaschromatogr. mmol/l 0,781/0,632 Hexansäure gaschromatogr. mmol/l MAIWORM 1994 0,931/0,912 FlFS-Gesamt rechnerisch mmol/l 1,091/0,532 Überstand volumetrisch ml s. SCHIRMER 1990 Bakterielles Protein

photometrisch µg RSA/ml

BRADFORD 1976 MAIWORM 1994

4,98

Ammoniak Elektrode mmol/l ZIPORI 1989 DEHARENG u. GODEAU 1988

1,9–2,0

Polyamine Aminosäuren

LC-MS/MS LC-MS/MS

µmol/l µmol/l

3,58

VK: Variationskoeffizient der Analysepräzision bestimmt in einer Serie von Standardmessungen (n=10) 1 in der Fermenterflüssigkeit; 2 im Überstand; Messtechnik s. Literaturstelle

3.2.4.1 Analyse der flüchtigen Fettsäuren (i-Säuren)

Die Analyse der flüchtigen Fettsäuren gliederte sich in flüchtige n-Fettsäuren, die vornehmlich aus dem Kohlenhydratstoffwechsel stammen (HÖLTERSHINKEN 1990;


38

GÖRES 2016) und flüchtige i-Fettsäuren, welche dem Proteinstoffwechsel zugeordnet werden (CARRO u. MILLER 1999; LUMPP 2011). Im Weiteren wird nur auf die flüchtigen i-Fettsäuren eingegangen, die übrigen, gemessenen flüchtigen Fettsäuren sind detailliert bei GÖRES (2016) beschrieben. Die Analyse aus dem Fermenterinhalt und aus dem Überstand wurde am Zweikanalgaschromatographen mit Flammen-ionisationsdetektor (Typ GC-9AM Fa. Shimadzu, Kyoto, Japan) durchgeführt (GEISSLER et al. 1976). Dabei wurde im Überstand die Produktion der flüchtigen i-Fettsäuren in 24 Stunden aus der gemessenen Konzentration [mmol/l] multipliziert mit dem Überstandsvolumen [l] (abzüglich der zugesetzten 40 ml 18,5 %ige Salz-säure) berechnet. Weitere Informationen zur Probenaufbereitung sind in den Dissertationen von GÖRES (2016) und LUMPP (2011) beschrieben. Die Ergebnisse beinhalten die Messwerte der einzelnen flüchtigen Fettsäuren und die rechnerisch aus den Einzelwerten bestimmte Summe der flüchtigen Fettsäuren (Näheres s. GÖRES 2016 bzw. Kap. 4.1).

3.2.4.2 Bestimmung des Ammoniakgehaltes

Die Ammoniakgehalte in den flüssigen Fermenterproben wurden mittels gassensitiver Ammoniakmesselektrode (Ammoniak-Analyzer 290A Fa. Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA, vormals Orion®) bestimmt. Dafür wurde das Gerät täglich direkt vor der Messung mit einer Ammoniumchloridlösung, aus der zwei verschiedene Standardlösungen in Konzentrationen von 10-2 bzw. 10-3 mol/l hergestellt wurden, geeicht (Näheres s. GRESNER 2011). Die Stammlösung (10-1 mol/l) für die Eich-lösungen wurde aus 2,67 g Ammoniumchlorid (s. Tab. 9.1) ad 500 ml Aqua bidestillata hergestellt und lichtgeschützt aufbewahrt. Näheres ist in der Dissertation von ZIPORI (1989) beschrieben. Zur Messung der Ammoniakgehalte wurden 5 ml flüssiger Fermenterinhalt gewonnen und mit 50 µl NaOH (10 mol/l) versetzt, um alle Ammoniumionen in neutrale Ammoniakmoleküle zu überführen. Anschließend konnte der Ammoniakgehalt mittels Elektrode erfasst werden.

3.2.4.3 Bestimmung der Überstandsvolumina

Die Überstandsvolumina wurden mit einem 1000 ml Standzylinder, in den die jeweiligen Fermenterüberstände überführt wurden, gemessen (LUMPP 2011). Die in den Überstandsgefäßen zum Stoppen der Fermentation zugesetzten 40 ml verdünnte Salzsäure (18,5 %) wurden abgezogen.

3.2.4.4 Datenverarbeitung der Aminosäureanalyse von gefriergetrockneten Grassilagen (EVONIK Nutrition & Care GmbH)

Um die Verteilung der Aminosäuregehalte von Grassilagen mit unterschiedlichen RE/Rp-Quotienten zu ermitteln, wurden die Daten der Aminosäureanalyse von 315 gefriergetrockneten Grassilagen (inkl. der im RUSITEC eingesetzten Grassilagen K-30, K-32, S-31 und S-33) grafisch mit Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft®) ausgewertet. Dabei wurden aufgrund der Beziehung zu Aminen in der Literatur die Gehalte der Aminosäuren Arginin, Glutamat, Lysin und Methionin sowie der Gehalt


39

des Abbauproduktes GABA erfasst. Die Ergebnisse zur Aminosäureverteilung in Grassilagen in Abhängigkeit vom RE/Rp-Quotienten wurden in der vorliegenden Dissertation erstmalig ausgewertet (s. Kap. 4.3 u. Kap. 4.4). Eine Varianz wurde nicht mitgeteilt. Die Analyse der Grassilageproben wurde von EVONIK Nutrition & Care GmbH, Hanau, Deutschland mittels Totalaufschluss und Ninhydrin post-column Derivatisierung durch Ionenaustausch Chromatographie nach VDLUFA III, Methode 4.11.1 (ANON. 2009) durchgeführt.

3.2.4.5 Analyse der Amine, Polyamine und Aminosäuren mittels LC-MS/MS

Die Analyse der Amine, Polyamine und Aminosäuren in den flüssigen und den Feststoffproben des RUSITEC sowie in den eingesetzten gefriergetrockneten Gras-silagen fand in Anlehnung an die Dissertationen von GRESNER (2011), THEERMANN (2011), WICHERN (2011) und ÖZMEN (2014) an der LC-MS/MS statt. Bei der LC-MS/MS handelt es sich um eine Form der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit mehrfacher Massenspektrometrie, über die die stoffspezifischen Molekülmassen und ihre Teilfragmente genau charakterisiert werden können. Sie eignet sich zur Auftrennung und anschließenden qualitativen und quantitativen Analytik komplexer Substanzgemische (AL-HADITHI u. SAAD 2011). Die mobile Phase des genutzten Systems setzte sich aus einem Gradienten mit zwei verschiedenen Laufmitteln zusammen, der zuerst die polaren und später die unpolaren Substanzen aus der stationären Phase löste. Eluent A für polare Stoffe bestand aus destilliertem Wasser + 0,1 % Ameisensäure (FA) und Eluent B für unpolare Substanzen aus Acetonitril + 0,1 % FA (HÄKKINEN et al. 2007; s.Tab. 9.1). Die Vermessung von Standards (s. Kap. 3.2.4.5.14 u. Kap. 3.2.4.5.17 sowie Tab. 9.1) wurde zur Charakterisierung der Chromatogramme und Identifizierung der klassischen Fragmente und der Retentionszeiten (Rt) der gesuchten Stoffe genutzt. Dabei beschreibt die Retentionszeit die Dauer von der Probeninjektion bis zum Erfassen der Einzelkomponenten im Detektor. Je nach chemischer Eigenschaft (Größe, Ladung) der gelösten Substanzen im Probenmaterial kommt es zu unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial, die in stoffspezifischen Retentionszeiten resultiert. Danach wird die durch die Chromatographie aufgetrennte Probe im Massenspektrometer mit Elektronen aus einem Heizdraht beschossen. Dabei ionisieren die Elektronen die Probenmoleküle und brechen Bindungen auf. Im MS-Detektor werden die Massen der entsprechenden Fragment-Ionen detektiert. Die Funktionsweise der genutzten LC-MS-Anlage ist auch in den Arbeiten von GRESNER (2011), WICHERN (2011) und ÖZMEN (2014) detailliert beschrieben.

3.2.4.5.1 Entwicklung der Methode zur Messung von Aminen

Für die Bestimmung von Aminen und Polyaminen aus Panseninhalt, Pflanzen oder fermentierten Lebensmitteln sind zahlreiche Methoden beschrieben (DAWSON u. MAYNE 1996; BOUCHEREAU et al. 2000; MAYR u. SCHIEBERLE 2012). Da es sich bei Aminen bzw. Polyaminen um kleine, polykationische, wasserlösliche Moleküle handelt, neigen sie zur Bindung an negativ geladene Proteinmoleküle sowie an DNA und RNA (BERWANGER et al. 2010).


40

Für die Extraktion der Amine aus dem Probenmaterial wurden verschiedene Methoden aus der Literatur untersucht. Eine Übersicht zu den verschiedenen in der Literatur analysierten Matrizes, den erfassten Aminen und der Messtechnik enthält Tabelle 3.8. Tab. 3.8: Literaturrecherche zu Extraktionsmethoden für Amine, Polyamine und

Phenolverbindungen Analyse-methode

Extraktions-methode Matrix Analyten Literatur

LC-MS/MS

Zentrifugation 20.000 x g, Filtration 0,2 µm RC-Sterilfilter1

Flüssiger Fermenterinhalt

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WICHERN 2011

LC-MS/MS

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FLORES u. GALSTON 1982

HPLC 0,6 mol/l HClO4 (1 h) Silage u. a. Putrescin, Spermidin, Ornithin, Lysin

KŘÍŽEK 1991

LC-ESI-MS/MS

5 % HClO4 (1 h) Pflanzenmaterial

u. a. Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin, 1,7-Diaminoheptan, L-Ornithin

LOZANOV et al. 2004

UHPLC-MS

80 % v/v Ethanol in Aqua bidestillata

Kartoffeln Phenolamine CHONG et al. 2013

UV-HPLC Pufferextraktion im Ultraschallbad

Pflanzenmaterial u. a. Putrescin, Spermidin, Spermin, Diaminoheptan

FELLEN-BERG et al. 2012

HPLC-MS/MS

0,1 mol/l HCl SPE-Aufreinigung

Käse u. a. Cadaverin, Spermidin, Spermin, Tyramin

GOSETTI et al. 2007

1 0,2 µm Sterilfilter (Art. Nr. KC 90.1, Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Deutschland) 2 Homogenisator MICCRA D9 40643 (MICCRA GmbH, Müllheim, Deutschland) HPLC: High Performance Liquid Chromatography; MS: Mass Spectrometry; ESI: Electrospray-Ionisation; UHPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography; UV-HPLC: Ultraviolet-Detection High Performance Liquid Chromatography

3.2.4.5.2 Auswahl der erfassten Amine

Die Auswahl der als relevant erachteten Amine ergab sich aus der intensiven Literaturrecherche und beinhaltete sowohl Mono- als auch Polyamine (s. Kap. 2.1), die in Pflanzen und damit potentiell in Futtermitteln vorkommen. Die alphabetische Auflistung der recherchierten und messtechnisch in diversen Vorversuchen untersuchten Stoffe findet sich in Tabelle 3.9 (Homospermin wurde aufgrund von Lieferungsschwierigkeiten messtechnisch nicht analysiert).

41


Tab.

3.9

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44

3.2.4.5.3 Probenmaterial zur Methodenentwicklung

Für die Entwicklung der Extraktionsmethode für Amine bzw. Polyamine wurde Grassilage frisch vom neuen Silageanschnitt und ebenso frisch gewonnener Panseninhalt vom fistulierten Rind (Spendertier s. Kap. 3.2.2) verwendet.

3.2.4.5.4 Auswahl des Extraktionsverfahrens

Unterschiedliche Extraktionsverfahren der Proben (s. Tab. 3.8) wurden geprüft, um ein optimales Analyseergebnis der Amine, Polyamine und Aminosäuren an der LC-MS/MS zu erreichen. Folgende Extraktionsmethoden wurden aus der Literatur entnommen und an Grassilagen mit geringen Modifizierungen getestet (KŘÍŽEK 1991; GOSETTI et al. 2007; CHONG et al. 2013 u. ÖZMEN 2014):

1) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml HClO4 (0,6 mol/l)

2) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml HCl (0,1 mol/l)

3) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml 50 %igem Ethanol

4) Homogenisierung (25.000 rpm/2 Min.) von 150 mg frischer Grassilage in 10 ml Eluent A [H2O mit FA (0,1 %)]

5) Inkubation von 150 mg frischer Grassilage mittels 100 ml Aqua bidestillata für 20 Min. bei 50°C und nachfolgende Abkühlung (ohne Homogenisierung)

Alle Proben wurden nach der Homogenisierung bzw. Extraktion und Abkühlung (Raumtemperatur) bei 4°C und 20.000 x g für 20 Minuten zentrifugiert (Sorvall RC 5C Plus, Du Pont) und die Probenüberstände durch einen 0,2 µm RC-Sterilfilter (Art. Nr. KC 90.1, Carl Roth® GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland) filtriert. Analysiert wurde jeweils eine Probe. In Abbildung 3.3 sind die Ergebnisse für Polyamine aus den Extraktionsversuchen zu entnehmen. Die gefundenen Stoffe Agmatin, Ethanolamin, Histamin, Serotonin und Tryptamin konnten in den Proben aus den Vorversuchen unter den gegebenen Bedingungen der vorhandenen Messtechnik nicht sicher reproduzierbar nachgewiesen werden. Aufgrund dessen sind sie in den folgenden Abbildungen nicht erfasst.


45

Die Polyamine Cadaverin, Norspermidin, Spermidin, Norspermin und Spermin waren mit den ausgewählten Extraktionsmethoden detektierbar. Putrescin (m/z 89) konnte aufgrund der vorerst genutzten Einstellung des Massendetektionsbereiches von 100–2000 m/z am Detektor nicht detektiert werden. Diese Einstellung wurde in den späteren Versuchen auf einen Bereich von m/z 50–2000 erweitert und ermöglichte im Folgenden auch die Detektion von Putrescin. Die Extraktionsverfahren 1 bis 5 zeigten bei den Polyaminen durchgängig detektier-bare Flächenintegrale (Counts x Min.). Dabei wies die Extraktion mit Aqua bidestillata bei 50°C die höchsten Integrale bei Norspermidin, Spermidin und Spermin auf. Die Extraktion mit 0,6 molarer HClO4 führte bei zwei der fünf Polyamine (Cadaverin und Spermidin) zu sehr geringen Ergebnissen, während die Extraktion mit 0,1 molarer HCl bzw. 50 %igem Ethanol jeweils gut messbare Flächenintegrale zeigte, wobei die Salzsäure-Extraktion für Norspermin und Spermin höhere Countwerte aufwies. Ebenfalls gute Ergebnisse waren nach der Extraktion mit Eluent A zu beobachten.

3.2.4.5.5 Derivatisierung von Standards mit FMOC-Chlorid als Ansatz

Der Derivatisierungsprozess mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (FMOC-Chlorid) erhöht die Massezahl von Stickstoffverbindungen, was zu einer verbesserten Detektierbarkeit von Aminen, Polyaminen und Aminosäuren an der LC-MS/MS führt (BOUCHEREAU et al. 2000). Dadurch kann eine höhere Sensitivität bei der Messung dieser Stoffe erreicht werden. Die Derivatisierung mit FMOC-Chlorid wurde mit geringen Modifizierungen nach THEERMANN (2011) durchgeführt. Aufgrund der ungenügenden Ergebnisse, die die

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46

Messtechnik in keiner Weise verbesserten sondern stark variierten, wurde dieser Ansatz nicht weiter verfolgt (s. Kap. 9.1.3 u. Abb. 9.1).

3.2.4.5.6 Gewinnung und Aufbereitung der Fermenterproben

Die in der Literatur beschriebenen Bindungseigenschaften der Amine und Polyamine (v. a. Proteinbindung, s. Kap. 2.2), machte die Aufbereitung von festem und flüssigem Fermenterinhalt aus dem RUSITEC notwendig. Aufgrund der in den Vorversuchen erzielten Ergebnisse (s. Abb. 3.3 u. Abb. 9.1) und der Erfahrungen aus vorherigen Studien erfolgte die Aufbereitung der Proben zur Analyse der Polyamine und der korrespondierenden Aminosäuren an der LC-MS/MS mit geringen Modifizierungen nach der Methode von THEERMANN (2011), WICHERN (2011) und ÖZMEN (2014). Bei ÖZMEN (2014) hat sich die Aufbereitung der verwendeten und zur Lagerung gefriergetrockneten Grassilagen mit Eluent A (H2O + 0,1 % FA) bewährt. Auf eine Derivatisierung mit FMOC-Chlorid wurde angesichts der unzureichenden Ergebnisse aus den Vorversuchen (s. Kap. 3.2.4.5.5) verzichtet. Die Proben in Form von je 10 ml Fermenterflüssigkeit bzw. je 1 g uS festem Fermenterinhalt wurden täglich beim Beladen aus dem RUSITEC-System gewonnen (Feststoffprobe nach 48 Stunden Inkubation). Dabei wurde der feste Fermenterinhalt der zwei gleich beladenen Fermenter (KF = F1 u. F2 bzw. TF = F3 und F4 bzw. TFmS = F5 und F6) durch Homogenisierung gepoolt (s. Abb. 3.2 u. Abb. 3.4). Die weitere Aufbereitung von flüssigem Fermenterinhalt erfolgte nach der modifizierten Methode von THEERMANN (2011). Dafür wurden je 10 ml flüssige Fermenterprobe nach der Entnahme für 2 Minuten einer Ultraschallbehandlung im Eisbad bei 20 kHz (60 % Geräteleistung, Cycle 90) unterzogen (Ultraschall-Desintegrator Sonopuls HD 60, BANDELIN elektronic GmbH & Co KG, Berlin, Deutschland).Danach erfolgte der Zusatz von 1000 µl 1,7 DAH (10 mmol/l) und 10 µl salzsaurer D-Norvalinlösung (1 mmol/l) als interne Standards für die Polyamine bzw. die Aminosäuren. Zur Proteinfällung wurden 100 µl 30 %ige 5-Sulfosalicylsäure dazu gegeben und die Proben 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Zentrifugation bei 4°C und 20.000 x g für 20 Minuten (Zentrifuge Sorvall RC 50 Plus, Du Pont). Bis zur weiteren Analyse wurden die Proben in 2 ml Reagiergefäßen bei -18°C tiefgefroren (Näheres s. Abb. 3.4). Zur Gewinnung der Feststoffproben wurde je 1 Gramm uS fermentierte Silage aus den Futterbeuteln von den beiden gleich bestückten Fermentern (s.o.) abgewogen und nach dem Homogenisieren bei 26 000 rpm (Homogenisator MICRA D9 40643, MICCRA GmbH, Müllheim, Deutschland) in 20 ml Eluent A in ein Reagenzglas abgefüllt. Die weitere Aufbereitung erfolgte in gleicher Weise, wie die der flüssigen Fermenterproben. Nach dem Auftauen bei Zimmertemperatur wurden die Proben zum Schutz der Messtechnik nach der Methode von WICHERN (2011) und ÖZMEN (2014) mit sterilen Spritzenfiltern (0,2 µm) gefiltert, da sich diese Vorgehensweise vor der Analyse von Peptiden und phenolischen Verbindungen an der LC-MS/MS bewährt hat. Die aufbereiteten Proben wurden zur Messung in Rollrandflaschen mit Snapverschluss


47

und einem Volumen von 500 µl (Art. Nr. FLK 101.247 Techlab GmbH, Braunschweig) überführt.

Abb. 3.4: Übersicht zur Probenaufbereitung von festen und flüssigen Fermenterproben KF = Kontrollfermenter bzw. TF = Testfermenter bzw. TFmS = Testfermenter mit Soja SOP = Standard operation procedure 1 Homogenisator MICRA D9 40643 2 Ultraschall-Desintegrator Sonopuls HD 60, Bandelin 3 Sorvall RC 5C Plus, Du Pont

Ultraschallbehandlung2

2 Min. 20 kHz im Eisbad (60 % Geräteleistung, Cycle 90)dafür 10 ml Probe mit dem Trichter abfüllen

Interne Standards:9 ml Probe pipettieren+ 1 ml 1,7 Diaminoheptan (10 mmol/l)+ 10 µl salzsaure Norvalinlösung (1 mmol/l)

Proteinfällung:+ 100 µl Sulfosalicylsäure (30 %ig)45 Min. bei 4°C inkubieren

Zentrifugation3 20 Min. 20.000 x g 4°C

Je 1,7 ml Überstand in5 Reagiergefäße abfüllen und einfrieren (-18°C)

Je 10 ml Probe pro Fermenter gewinnen

SOP Polyamine: Flüssiger Fermenterinhalt

Je 1 g uS aus KF (F1+F2) bzw. TF (F3+F4)

bzw. TFmS (F5+F6) abwiegen

SOP Polyamine: Fester Fermenterinhalt

Homogenisieren1 in je 20 ml Eluent A 26.000 rpm (Stufe E) 2 Min.


48

3.2.4.5.7 Aufbereitung der gefriergetrockneten Grassilagen

Das Ausgangsmaterial der im RUSITEC eingesetzten Grassilageproben (K-30, K-32, S-31 und S-33) lag aus Gründen der Lagerungstechnik gefriergetrocknet vor. Die Aufbereitung der Grassilagen zur Messung an der LC-MS/MS erfolgte aus 100 mg TS. Alle weiteren Aufbereitungsschritte wurden in gleicher Weise vorgenommen, wie im festen Fermenterinhalt (s. Kap. 3.2.4.5.6).

3.2.4.5.8 Laufbedingungen der LC-MS/MS

Die LC-MS/MS-Anlage bestand aus den folgenden Komponenten: Autosampler mit Säulenofen: Typ Pro Star Modell 410 (Varian®, Palo Alto, CA, USA) Pumpensystem: Typ Pro Star 210 Solvent Delivery-Module (Varian®, Palo Alto, CA, USA) Vorsäule: 4,00 x 3,00 mm, Security Guard Cartridge (Filter, Schutzfunktion) C12 (Art.-Nr. AJ-6074-S) (Phenomenex®, Torrace, CA, USA) Hauptsäule: 150 x 4,6 mm, Partikelgröße 4 µm (im Säulenofen bei 40°C) Jupiter 4u Proteo 90 Å

(Art.-Nr. 00F-4396-E0) (Phenomenex®, Torrace, CA, USA)

Detektor: 500-MS IT quadrupole Mass-Spectrometer (Varian®, Palo Alto, CA, USA) Integration: MS Work-Station

(Varian®, Palo Alto, CA, USA) Injektionsvolumen: 20 µl (full loop) Die Eluenten A und B bildeten in einem Gradienten die mobile Phase (s. Tab. 3.10 u. Abb. 3.5). Die Flussrate betrug entsprechend der technischen Empfehlungen von Phenomenex® 0,8–1,1 ml/Min., jedoch musste die Flüssigkeitsmenge durch einen nach der Säule eingebauten Splitter (IDEX®, Art.-Nr. UPO P-451; Techlab GmbH, Braunschweig, Deutschland) reduziert werden, um den Detektor nicht zu überlasten: Eluent A: Aqua bidest + 0,1 % FA (v/v) (s. Tab. 9.1) Eluent B: Acetonitril + 0,1 % FA (v/v) (s. Tab. 9.1) Spülflüssigkeit: 50 % Aqua bidest + 50 % Methanol (v/v) (s. Tab. 9.1)


49

Tab. 3.10: Flussrate und Gradient der Eluenten A und B während der Analysen an der

LC-MS/MS Messzeit [h] Eluent A [%] Eluent B [%] Flussrate [ml/Min.]

00:00:00 95 5 0,8 00:00:06 95 5 0,8 00:45:06 25 75 1,1 00:55:00 25 75 1,1 00:55:06 5 95 1,1 01:05:00 5 95 1,1 01:05:06 5 95 1,1 01:10:00 95 5 1,1 01:10:06 95 5 0,8

Die Messungen wurden im Full-Scan Modus mit einer erfassten Massenbreite von Masse-zu-Ladung (m/z) 50–2000 durchgeführt. Die Elektronenspray-Ionisation (ESI) verlief im positiven Modus mit einer Kapillarspannung von 80 Volt bei einer Temperatur des Trocknungsgases von 350°C und einem Druck des Zerstäubergases von 50 psi. Der Säulenofen hatte eine Temperatur von 40°C und die Proben im Sample-Tray des Autosamplers wurden auf 8°C temperiert.

3.2.4.5.9 Bestimmung der Wiederfindungsrate

Zur genaueren Charakterisierung der Messbarkeit der Polyamine im Fermenterinhalt wurde ein Versuch zur Bestimmung der Wiederfindungsrate (WFR) durchgeführt. Dafür wurde Pansensaft im Additionsverfahren zum einen nativ und zum anderen mit Zusatz eines Polyaminstandards (s. Tab. 9.1), bestehend aus Putrescin, Cadaverin, Norspermidin, Spermidin, Norspermin und Spermin mit einer Konzentration von je

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0102030405060708090

100

00:00:00

00:00:06

00:45:06

00:55:00

00:55:06

01:05:00

01:05:06

01:10:00

01:10:06

Flus

srat

e[m

l/min

]

Elue

nt A

bzw

. B [%

]

Messzeit [h]

Abb. 3.5: Flussrate und Gradient der Eluenten A bzw. B während der Analysen der LC-MS/MS - - Eluent A; ¾ Eluent B; … Flussrate


50

500 µmol/l in Eluent A nach ÖZMEN (2014) zentrifugiert, mittels 0,2 µm RC-Sterilfilter gefiltert und an der LC-MS/MS gemessen.

Im diesem Additionsverfahren konnten nur die Zulagen von Putrescin und Spermidin wiedergefunden werden. Für Cadaverin, Norspermidin, Norspermin und Spermin wurden deutlich geringere Countwerte im mit Standard versetzten Pansensaft gegenüber der nativen Probe gemessen, sodass der Zusatz vom Polyaminstandard nicht wiedergefunden wurde (Abb. 3.6). Eine denkbare Erklärung hierfür wäre, dass die Polyamine entweder umgesetzt wurden oder maskiert in der biologischen Matrix vorlagen (VAN EECKHAUT et al. 2009). In weiteren Vorversuchen wurde eine gefriergetrocknete Grassilage nach ÖZMEN (2014) aufbereitet und erneut untersucht, wie sich der Zusatz des Polyaminstandards auf die WFR auswirkt. Um die Auswirkung der Eluenten A und B auf das Mess-verhalten der Polyamine in der biologischen Matrix besser evaluieren zu können, wurde der Polyaminstandard (c = 750 µmol/l) zum Vergleich mit den beiden Eluenten (Eluent A: H2O + FA 0,1 % bzw. Eluent B: Acetonitril + 0,1% FA; s. Kap. 3.2.4.5.7) in gleicher Konzentration wie in der Grassilage gemessen (s. Abb. 3.7).

0100000200000300000400000500000600000700000800000900000

1000000

Putrescin Cadaverin Norspermidin Spermidin Norspermin Spermin

[Cou

nts

x M

in.]

Polyamine

Abb. 3.6: Vergleich der Polyamine im Pansensaft bei Zusatz eines Polyaminstandards (s. Tab. 9.1; LC-MS/MS) ■ Pansensaft nativ ■ Pansensaft + Polyaminstandard (500 µmol/l)


51

Nach Zulage des Polyaminstandards (c = 750 µmol/l) zur Grassilageprobe konnten alle zugelegten Polyamine detektiert werden, dabei zeigten die Stoffe Putrescin und Cadaverin die höchsten Messergebnisse, während selbige für Norspermidin, Spermidin, Norspermin und Spermin deutlich geringer ausfielen. Zudem unterschieden sich die Ergebnisse nicht wesentlich von denen der nativ gemessenen Grassilageprobe, sodass auch diese Zulage nicht entsprechend wiedergefunden wurde. Der in Eluent A bzw. B verdünnte Polyaminstandard zeigte außerdem wesentlich höhere Countwerte pro Minute (exkl. Cadaverin und Putrescin), sodass auch hier die mögliche Reaktion der Polyamine mit Stoffen aus der Grassilage eine Erklärung sein könnte. Aufgrund der inhomogenen Ergebnisse und der starken Variation in den Zulageversuchen wurde darauf verzichtet eine WFR zu berechnen. Durch die Bindungseigenschaften der Amine (Ionenbindung, Wasserstoffbrücken-bindung, Van-der-Waals-Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen (SERAFININ-FRACASSINI et al. 1988; BERWANGER et al. 2010; GILL u. TUTEJA 2010; THEERMANN 2011; RAMANI et al. 2014)) ist eine Elimination dieser Störfaktoren vermutlich nur durch Zerstörung der Grundmatrix (Grassilage) und Deproteinisierung möglich. Für die Vorversuche zur WFR in Abbildung 3.6 und 3.7 besteht nur eine einge-schränkte Vergleichbarkeit der Ergebnisse der absoluten Flächenintegrale, da die ein-gesetzte HPLC-Säule durch eine Einstellung der Lieferung einen unterschiedlichen Durchmesser aufwies (150 x 3,0 mm vs. 150 x 4,6 mm). Die Flussraten wurden

Abb. 3.7: Vergleich von Polyamingehalten nach Verdünnung mit Eluent A bzw. Eluent B mit zur Grassilage zugelegtem Polyaminstandard und den Polyamingehalten in der Grassilage (LC-MS/MS):

■ Grassilage ■ Grassilage + Polyaminstandard (750 µmol/l) ■ Polyaminstandard (750 µmol/l) verdünnt mit Eluent A (H2O + 0,1 % FA) ■ Polyaminstandard (750 µmol/l) verdünnt mit Eluent B (Acetonitril + 0,1 % FA)

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

Putrescin Cadaverin Norspermidin Spermidin Norspermin Spermin

[Cou

nts

x M

in.]

Polyamine

7510000

4700000


52

entsprechend angepasst. Nachfolgend in der Kalibration wurden ausschließlich die in Kapitel 3.2.4.5.8 beschriebenen Laufbedingungen verwendet.

3.2.4.5.10 Mögliche Polyaminverbindungen

Angesichts der Ergebnisse aus den Zulageversuchen nach der Addition des Polyaminstandards zum Pansensaft bzw. zur Grassilage, wurde die Grassilageprobe nach Anwendung der fünf Extraktionsverfahren (s. Kap. 3.2.4.5.4) zusätzlich auf einzelne Phenolamine untersucht (s. Abb. 3.8). Polyamine können Verbindungen mit Phenolsäuren eingehen. Vor diesem Hintergrund interessante Phenolsäuren aus der Literaturrecherche sind die Caffeic acid, 3,4 Dimethoxycinnamic acid und Jasmonic acid sowie die Phenolaminverbindungen Caffeoylputrescine, Dicaffeoylspermidine, Bis-(dihydrocaffeoyl)-spermidine, Caffeoyl-spermine und NŃ4N12-tris(dihyodrocaffeoyl)-spermine (FIXON-OWOO et al. 2003; BASSARD et al. 2010; ONKOKESUNG 2010).

Bei der Extraktion der Grassilage mit Eluent A und der Extraktion mit 0,1 molarer HCl lassen sich alle vier Phenolamine und die Caffeic acid an der LC-MS/MS unter den in Kapitel 3.2.4.5.7 beschriebenen Laufbedingungen detektieren. Bei der Extraktion mit 0,6 molarer HClO4 (s. Abb. 3.8) ergaben sich keine Countwerte für drei der vier Phenolamine (exkl. Caffeoyl-Spermine). Hingegen zeigt die Extraktion mit 50 %igem Ethanol wieder Ergebnisse für alle vier untersuchten Stoffe und die Caffeic acid. In der Inkubationsmethode mit 50°C heißem Aqua bidestillata fielen bei den zwei

Abb. 3.8: Phenolamingehalte nach Aufbereitung der Grassilage mit fünf verschiedenen Extraktionsmethoden (s. Kap. 3.2.4.5.4; LC-MS/MS)

■ 1) Grassilage + Eluent A ■ 2) Grassilage + 0,1 mol/l HCl ■ 3) Grassilage + 0,6 mol/l HClO4 ■ 4) Grassilage + 50 % Ethanol ■ 5) Grassilage + H2O 50°C

0100000200000300000400000500000600000700000

[Cou

nts

x M

in.]

Phenolamine


53

Phenolaminen Caffeoylputrescine und Bis-(dihydrocaffeoyl)-spermidine im Vergleich mit den anderen Methoden extrem hohe Werte auf. Da sich im Laufe der Vorversuche die Vermutung herausgestellt hat, dass sich Polyamine mit Phenolsäuren verbinden können, wurde unter einfachen Bedingungen ein Folgeversuch durchgeführt. Für diesen Versuch wurde ein Gemisch aus Caffeic acid als Vertreter der Phenolsäuren und den einzelnen Polyaminstandards Cadaverin, Putrescin, Norspermidin, Norspermin, Spermidin und Spermin gelöst in Eluent A (1:1; je 500 µmol/l) bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert und anschließend an der LC-MS/MS gemessen. In der Auswertung zeigte sich für drei der sechs getesteten Standardgemische, dass die in der Literatur beschriebenen Verbindungen Caffeoylputrescine, Dicaffeoyl-spermidine, Bis(dihydrocaffeoyl)spermidine, Caffeoylspermine und NŃ4N12tris-(dihyodrocaffeoyl)spermine durch die einfache Zusammenführung von Phenolsäuren und Polyaminen bereits bei Raumtemperatur entstehen können und dass die Verbindungen an der LC-MS/MS detektierbar sind (s. Tab. 3.11). Tab. 3.11: Nachweis von Phenolaminen nach Inkubation von Polyaminstandards mit

Caffeic acid: Phenolamin nachweisbar (+); Phenolamin nicht nachweisbar (-) Probe

Phenol- amin

Put. + Caffeic acid

Cad. + Caffeic acid

NSpd. + Caffeic acid

Spd. + Caffeic acid

NSpm. + Caffeic acid

Spm. + Caffeic acid

Caffeic acid + + + + + + Caffeoyl-putrescine - - - + - -

Caffeoyl-spermine - + - + - -

Bis(dihydro-caffeoyl)-spermidine

+ + - + - -

NŃ4N12-tris(dihydro-caffeoyl)-spermine

+ + - + - -

3.2.4.5.11 Standardlösungen

Zur Entwicklung der Messmethode an der LC-MS/MS war die Herstellung von verschiedenen Standard-Stammlösungen der Polyamine und Aminosäuren nötig (s. Tab. 9.1). Alle Standard-Stammlösungen wurden vor der Messung jeweils neu mit Eluent A (Aqua bidestillata + 0,1 % FA) hergestellt und im Anschluss bei +8°C für maximal 14 Tage im Kühlschrank gelagert. Mit den Standardlösungen wurden die Kalibrationsreihen (s. Kap. 3.2.4.5.14) zur späteren Berechnung der Polyamin- und Aminosäuregehalte in den Proben hergestellt.


54

3.2.4.5.12 Interne Standards

Für die Überwachung der Probenanalyse der LC-MS/MS wurde 1,7 Diaminoheptan (1,7 DAH) als interner Standard in einer Konzentration von 1 mmol/l in die Proben gegeben. Aus den Analyseergebnissen des internen Standards jeder einzelnen Probe wurde zusätzlich der Variationskoeffizient getrennt nach Lauf und Probenmaterial (Feststoff- und Flüssigproben) berechnet (s. Tab. 9.9). 1,7 DAH eignet sich sehr gut als interner Standard sowohl für Polyamine als auch für Aminosäuren (LOZANOV et al. 2004; HÄKKINEN et al. 2007). Die Eigenschaften eines internen Standards sollten den gesuchten Stoffen im Messverhalten ähneln, jedoch sollte der interne Standard in der biologischen Matrix nicht ab- oder umgebaut werden. Als zweiter interner Standard für die Aminosäuren wurde aus Gründen der Vergleich-barkeit salzsaure D-Norvalinlösung verwendet (THEERMANN 2011).

3.2.4.5.13 Externer Standard

Um die Präzision der Messergebnisse zu erfassen, wurde 1,7 DAH in einer Konzentration von 10 mmol/l auch als externer Standard je nach Probenanzahl zwei bzw. dreimal während eines zwei bzw. dreitägig andauernden Messblockes gemessen. Der Standard wurde dabei jeweils am Anfang und am Ende eines Messblockes bzw. bei mehr als 27 Proben auch nach der Hälfte des Messblockes gemessen. Ein Messblock umfasste 27–45 Proben des flüssigen und festen Fermenterinhaltes in der Reihenfolge 6 Flüssigproben, 3 Feststoffproben, 6 Flüssigproben, 3 Feststoffproben etc. von drei bis fünf RUSITEC-Lauftagen. Jeweils vor der Analyse von 1,7 DAH wurde eine Systemspülung im Gradientenverlauf (s. Abb. 3.5) durchgeführt. Aus den Ergebnissen des externen Standards wurde die Genauigkeit der Chromatographie über die Analyseergebnisse von 1,7 DAH und die Verschiebung der Retentionszeit von 1,7 DAH abgeleitet (s. Abb. 9.2 u. Abb. 9.3).

3.2.4.5.14 Kalibration

Für die Ermittlung der Polyamin- und Aminosäuregehalte in den Proben wurden Kalibrationskurven durch die Messung von Standardkonzentrationsreihen erstellt. Dabei wurden alle Polyaminstandards (Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin, und ß-Alanin sowie GABA (s. Tab. 9.1 u. Abb. 3.9–Abb. 3.15)) einzeln in zehn verschiedenen Konzentrationen von 0,5 (GABA) bzw. 1–1000 µmol/l gemessen. Thermospermin-Tetrahydrochlorid konnte aufgrund des hohen Anschaffungspreises nur in zwei Konzentrationen hergestellt werden Die jeweilige untere Nachweisgrenze der Stoffe (Limit of Detection) ist in Kapitel 9.3.2 aufgeführt. Da in den Proben aus den Vorversuchen (s. Kap. 3.2.4.5) die Stoffe Ethanolamin, Histamin, Norspermidin, Norspermin, Serotonin und Tryptamin unter den gegebenen Bedingungen der vorhandenen Messtechnik nicht reproduzierbar nachgewiesen werden konnten, wurde darauf verzichtet hierfür eine Konzentrationsreihe zu erstellen. Die Aminosäure L-Ornithin und das Stoffwechselprodukt γ-Aminobuttersäure (GABA) wurden einzeln in Konzentrationsreihen gemessen, während die übrigen Aminosäuren in einer erhältlichen Aminosäure-Standardmischung aus 18 Aminosäuren von SIGMA-ALDRICH® (AA-S-18) enthalten waren und entsprechend verdünnt wurden. Für die Messungen wurden die in Kapitel 3.2.4.5.8 beschriebenen Einstellungen der LC-MS/MS genutzt.


55

1

3

2

Abb. 3.9: Beispiel für die Standard-Chromatogramme der Aminosäuren und GABA (LC-MS/MS)

1) Aminosäurestandardmischung von SIGMA-ALDRICH (Art.-Nr. AA-S-18) (c = 100 µmol/l)

2) L-Ornithin (c = 25 µmol/l) 3) GABA (c = 25 µmol/l)


56

1

2

3

4

5

6

7

Abb. 3.10: Beispiel für die Standard-Chromatogramme der Polyamine sowie β-Alanin und Tyramin je 500 µmol/l* (LC-MS/MS)

1) β-Alanin; 2) Cadaverin; 3) Putrescin; 4) Spermidin; 5) Spermin; 6) Tyramin; 7) Thermospermin-Tetrahydrochlorid (*c = 95 µmol/l)


57

Abb. 3.11: Kalibrationsreihen der Polyamine Spermin (▲), Cadaverin (●) Spermidin (■) und Putrescin (♦); R2 = Bestimmtheitsmaß

0200000400000600000800000100000012000001400000

0 5 10 15 20 25

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]

0200000400000600000800000100000012000001400000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]

y = 1316,7xR² = 0,990

y = 3217,4xR² = 0,986

y = 14284xR² = 0,974

y = 5885,2xR² = 0,982

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

0 200 400 600 800 1000

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]


58

02500005000007500001000000125000015000001750000200000022500002500000

0 5 10 15 20 25

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]

Abb. 3.12: Kalibrationsreihen der Aminosäuren L-Ornithin (♦), L-Arginin (■),L-Lysin (●) und L-Methionin (▲); R2 = Bestimmtheitsmaß

y = 12946xR² = 0,948

y = 33812xR² = 0,993

y = 451,26xR² = 0,910

y = 995,96xR² = 0,970

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

0 200 400 600 800 1000

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]


59

Abb. 3.13: Kalibrationsreihen der Stoffe ß-Alanin (▲) und 1,7 Diaminoheptan (♦); R2 = Bestimmtheitsmaß

y = 3291xR² = 0,995

y = 91819xR² = 0,995

0

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

60000000

70000000

80000000

90000000

100000000

0 200 400 600 800 1000

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]

01000002000003000004000005000006000007000008000009000001000000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]

0200000400000600000800000100000012000001400000160000018000002000000

0 10 20 30 40 50

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]


60

Abb. 3.14: Kalibrationsreihen von GABA(■); R2 = Bestimmtheitsmaß

y = 515239xR² = 0,987

0

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

0 200 400 600 800 1000

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]

05000000100000001500000020000000250000003000000035000000400000004500000050000000

0 5 10 15

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]


61

Abb. 3.15: Kalibrationsreihe von Polyamin Thermospermin-Tetrahydrochlorid (♦); R2 = Bestimmtheitsmaß

y = 168,99xR² = 0,999

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 20 40 60 80 100

[Cou

nts

x M

in.]

[µmol/l]


62

3.2.4.5.15 Messroutine der LC-MS/MS

Die Proben wurden wie in Kapitel 3.2.4.5.6 beschrieben gewonnen und aufbereitet. Ein Messblock an der LC-MS/MS bestand aus den Proben von drei bis fünf RUSITEC-Versuchstagen (s. Kap. 3.2.4.5.13). Jedem Messblock wurde eine dreistündige Systemspülung an der LC-MS/MS mit Methanol-Aqua bidestillata (50 %:50 % v/v) voraus bzw. zur Reinigung hinterher geschoben. Während der eigentlichen Analyse wurde jeweils nach acht Analysen eine Systemspülung mit dem Gradienten (Abb. 3.5) durchgeführt, um mögliche Verunreinigungen zu vermeiden. Zusätzlich wurde nach 76 Analysen (entspricht der Hälfte der Proben eines RUSITEC-Laufes) die Vorsäule (4,00 x 3,00 mm, Security Guard Cartridge C12; s. Kap. 3.2.4.5.8) ausgetauscht. Zur Kontrolle der Messgenauigkeit wurde der Standard 1,7 Diaminoheptan (1,7 DAH) intern in jeder Probe (1 mmol/l) und extern dreimal (10 mmol/l) in jedem Messblock gemessen und für den internen Standard der VK berechnet (s. Tab. 9.9). Alle Messdaten wurden in Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft®) aufgenommen und ausgewertet. Die Konzentrationen der Polyamine und Aminosäuren in den Proben wurden mit der aus der jeweiligen Kalibrationskurve des Stoffes ermittelten Formel berechnet.

3.2.4.5.16 Überprüfung der Messgenauigkeit der LC-MS/MS

In einer Messreihe über insgesamt mehr als 3530 Minuten im Dauerbetrieb wurde zur Überprüfung der Messgenauigkeit der LC-MS/MS der Standard 1,7 Diaminoheptan (100 µmol/l) in 18 unabhängigen Wiederholungen (n = 18) gemessen und der Variationskoeffizient (VK) der Analysen-Präzision von 1,7 DAH in Prozent bestimmt. Nach jeder fünften Messung wurde eine Spülung durchgeführt, sodass der VK auch in Blöcke à fünf Messungen unterteilt werden konnte. Während dieser Langzeit-messanalyse an der LC-MS/MS wurden auch Analysen aus anderen Versuchen (u. a. ILLE 2017) gemessen (s. Abb. 3.16 bzw. Tab. 9.6).

Abb. 3.16: Messergebnisse der 18 Wiederholungsmessungen von 1,7 DAH an der

LC-MS/MS [Counts x Min.] (1,7 DAH c = 100 µmol/l)

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

[Cou

nts

x M

in.]

Analysezeitpunkt [Min.]


63

3.2.4.5.17 Art der Auswertung

Zur Auswertung der Chromatogramme der LC-MS/MS wurden zunächst die Flächenintegrale der gesuchten Stoffe bei ihrem spezifischen Masse-zu-Ladungs- Fragment (m/z) und ihrer individuellen Retentionszeit im Programm MS Work-Station (Varian®, Palo Alto, CA, USA) erfasst. Dafür wurde das Basischromatogramm (ungefilterter Output der LC-MS/MS) nach den Fragmenten des jeweiligen Stoffes gefiltert und die Flächen der herausgefilterten Peaks wurden integriert. Die Basislinie der Flächenintegrale wurde dabei vom Programm automatisch bestimmt. Bei der Integration der Flächen wurden folgende Kriterien berücksichtigt (s. Abb. 3.17 u. Abb. 3.18):

1. Der auszuwertende Peak muss mindestens doppelt so hoch sein wie das Grundrauschen der Basislinie im Chromatogramm (die Basislinie wird automatisiert durch das Programm MS Work Station festgelegt, auch bei Überschneidung von Peaks).

2. Die Zahl der Counts muss mindestens vierstellig sein. 3. Die Retentionszeit (Rt) muss der des jeweiligen Standards entsprechen. 4. Eine Verschiebung der Retentionszeit nach hinten wird entsprechend der

Verschiebung des internen bzw. externen Standards toleriert. 5. Die m/z der Fragmentionen des Stoffes (Bsp. Putrescin m/z 89/72/55)

müssen entsprechend der Datenbanken https://www.mzcloud.org/ bzw. http://massbank.eu/MassBank/ nachweisbar sein.

Die ermittelten Flächenintegrale sind vorerst in der Methodenentwicklung in Counts mal Minute angegeben, um die Empfindlichkeit der Analyse zu erfassen. Nach der vollständigen Methodenentwicklung und der Anfertigung von Kalibrationsreihen wurden aus letzteren die Gehalte in Mikromol pro Liter im flüssigen Fermenterinhalt bzw. in Milligramm pro Gramm Ursprungssubstanz im festen Fermenterinhalt für den Ergebnisteil berechnet.


64

Retentionszeit

Counts des Integrals

1

3

2

Abb. 3.17: Beispiel für die Integration von Putrescin aus einer RUSITEC-Feststoffprobe 1. Basischromatogramm des MS-Detektors 2. Chromatogramm gefiltert nach der m/z 89 (Ellipse) von Putrescin 3. Chromatogramm gefiltert nach Fragment m/z 72 (Ellipse) von Putrescin


65

3.2.4.5.18 Zusammenfassende Wertung der Methode

Die Qualität der in der Flussrate und im Gradienten angepassten Messmethode mit einem VK von 3,58 % in der Serienmessung des Standards 1,7 DAH (s. Tab. 9.6 u. Tab. 9.7) und den hohen Bestimmtheitsmaßen der Standardkalibrationsreihen mit Werten von 0,910 bis 0,993 (s. Abb. 3.11–Abb. 3.15) wird mit den technischen Möglichkeiten als tolerierbar angesehen. Der Stoff Thermospermin-Tetrahydrochlorid konnte aufgrund des finanziellen Aufwandes nur in zwei Konzentrationen in den Vorversuchen gemessen werden. Dabei zeichnete sich in der Analytik des Reinstoffes das Masse zu Ladungsverhältnis m/z 173 (neben den Teilfragmenten m/z 206 und m/z 191) aufgrund des klar abgegrenzten Peaks als bestes aus. Um Thermospermin mit höchstmöglicher Sicherheit bestimmen zu können, hätten sowohl mehr Konzentrationen als auch unterschiedliche Zulageversuche an der LC MS analysiert werden müssen. Daher wird auf Grund dieser Unsicherheit fortan von m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) gesprochen (s. a. Kap. 5.3.3). Die Derivatisierung der Proben mittels FMOC-Chlorid hingegen eignete sich nicht als Methode zur Messung der Amine und Aminosäuren an der LC-MS/MS (s. Kap. 3.2.4.5.5).

72

Abb. 3.18: Beispiel für die Retentionszeit von zwei Putrescinfragmenten in einer RUSITEC-Feststoffprobe Die Pfeile deuten auf die drei detektierbaren Fragmente von Putrescin, die alle zur gleichen Retentionszeit (s. Ellipse) auftreten.


66

3.2.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Daten wurde mit Hilfe des Instituts für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und dem Programm SAS Enterprise Guide 7.1 vorgenommen (SAS Institute Inc.). Dabei orientierte sich die Vorgehensweise an den vorigen Dissertationen des Pansenlabors (GRESNER 2011; THEERMANN 2011; WICHERN 2011). Analog zur Dissertation von GÖRES (2016) und ILLE (2017) wurde auf die Darstellung der Ergebnisse in Box-Whisker Plots aufgrund des Versuchsaufbaus verzichtet. Zunächst wurden durch deskriptive Statistik mit der SAS-Prozedur [PROC MEANS] für alle Stoffe die Mittelwerte (x̅) und die Standardabweichungen (s) bestimmt. Mit dem t-Test für verbundene Stichproben wurden die p-Werte jeweils für die Differenzen zwischen den Fermentergruppen folgendermaßen bestimmt:

• KF (Kontrollfermenter) – TF (Testfermenter) • KF – TFmS (Testfermenter mit Soja) • TF – TFmS

Dafür wurde die Signifikanzgrenze der Irrtumswahrscheinlichkeit der Daten auf p < 0,05 festgelegt. Unterschieden wurde dabei eine geringe Signifikanz bei p-Werten von p < 0,05, eine mittlere Signifikanz bei p-Werten von p < 0,01 und eine hohe Signifikanz für p-Werte von p < 0,001. Die genauen Signifikanzen sind in den Tabellen (s. Tab. 9.10–Tab. 9.70) im Anhang aufgeführt und in den Diagrammen im Ergebnisteil (s. Abb. 4.1–Abb. 4.35) grafisch dargestellt.

3.2.5.1 Verteilungsanalyse

Nach der Erfassung der Countwerte und Berechnung der Konzentrationen der Messergebnisse wurden die Daten mittels Shapiro-Wilk-Test (PROC UNIVARIATE) auf Normalverteilung getestet. Im weiteren Verlauf der statistischen Aufarbeitung der Daten wurden für alle Stoffe die Differenzsignifikanzen von KF – TF bzw. KF – TFmS und TF – TFmS mittels 2-Stichproben-t-Test (PROC UNIVARIATE) ermittelt.

Ergebnisse

67

4 Ergebnisse

Die Ergebnisse aus den RUSITEC-Läufen L31–L38 wurden grafisch und statistisch ausgewertet. Erfasst wurden die verzweigtkettigen flüchtigen Fettsäuren (i-Butter- und i-Valeriansäure), die Ammoniakgehalte und die Amine bzw. Polyamine (Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin und das Masse zu Ladungsverhältnis m/z 173 (aufgrund der Vorversuche vermutlich Thermospermin)) sowie die dazu korrespondierenden Aminosäuren (L-Arginin, L-Lysin, L-Ornithin und L-Methionin) einschließlich der Polyaminabbauprodukte ß-Alanin und GABA. Dabei wurden die signifikanten p-Werte der Differenzen zwischen den Fermentergruppen folgender-maßen gekennzeichnet und unterschieden: KF vs. TF: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 KF vs. TFms: # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001 TF vs. TFms: ° p < 0,05; °° p < 0,01; °°° p < 0,001 Analog zu den Untersuchungen von GÖRES (2016) und ILLE (2017) wurden für die Messungen aus dem flüssigen Fermenterinhalt die Mittelwerte je Laufblock aus jeweils acht Messungen gebildet (4 Läufe à 2 identisch beladene Fermenter entspricht n = 8). Die Feststoffproben aus den gleich beladenen Fermentern wurden durch Homo-genisierung gepoolt, sodass sich hier n = 4 ergab (s. Abb. 3.2). Die Mittelwerte (x̅) und ihre Standardabweichung (s) sowie die entsprechenden p-Werte der Vergleiche zwischen KF und TF, KF und TFmS bzw. TF und TFmS sind im Anhang aufgelistet (s. Tab. 9.10 bis Tab. 9.70). Weitere Ergebnisse zu den erhobenen Parametern flüchtige Fettsäuren, Gasproduktion und Gaszusammen-setzung sowie Phenol- und o-Diphenolgehalte der RUSITEC-Läufe sind in der Dissertation von GÖRES (2016) aufgeführt. Die Bestimmung des mikrobiellen Proteins nach BRADFORD (1976), der pH-Werte und Enzymaktivität sind gemäß Tabelle 9.2 bei ILLE (2017) erhoben worden. Darüber hinaus wurden Arginin, Glutamat, Lysin, Methionin und GABA in den eingesetzten Grassilagen durch EVONIK Nutrition & Care GmbH bestimmt, um die Relation zum RE/Rp-Quotienten und zu GABA zu erfassen.

4.1 Vorkommen von flüchtigen Fettsäuren (i-Säuren)

Die Gehalte der flüchtigen Fettsäuren Essigsäure, Propionsäure, Hexansäure, n-Buttersäure und n-Valeriansäure können der Dissertation von GÖRES (2016) entnommen werden. Nachfolgend sind die flüchtigen Fettsäuren i-Buttersäure und i-Valeriansäure als Vertreter des N-Stoffwechsels dargestellt (s. Abb. 4.1–4.4). Erfasst wurden zum einen die täglichen Konzentrationen in der Fermenterflüssigkeit als Parameter vor der „Fütterung“ und zum anderen die in 24 Stunden produzierten Gehalte, deren Fermentation in der Flüssigkeit des Überstandes gestoppt wurde.

Ergebnisse

68

4.1.1 Vorkommen von i-Buttersäure (s. Abb. 4.1 u. 4.2 sowie Tab. 9.12–9.15)

Abb. 4.1: Konzentration der i-Buttersäure in der Fermenterflüssigkeit [mmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen KF vs. TF: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 KF vs. TFms: # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001 TF vs. TFms: ° p < 0,05; °° p < 0,01; °°° p < 0,001

0,00,51,01,52,02,53,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/l]

Tag

KF-32TF-33TF-33mS

Lauf 35–38

*** **

*

***

****

** *** * °°°* °°°* °°°* °°°

* °°°

* °°°

* °

###

############### #0,00,51,01,52,02,53,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/l]

Tag

KF-30TF-31TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34**

*##

###

#

##### ## ##

# # # # # # # # # # #

***

**

* °°°

**

***

****** °°°* °°° * °°°

* °°°

* °°

* °°

* °

*

**

*# # #

Ergebnisse

69

L31–L34 Konzentration von i-Buttersäure Die Gehalte der i-Buttersäure in der Fermenterflüssigkeit stiegen in den ersten Tagen der Einlaufphase geringfügig an und pendelten in der Kontrollphase bei 1,2 mmol/l ein. Mit Beginn der Zulagephase an Tag 10 stiegen die Gehalte der i-Buttersäure in den Testfermentern im Vergleich zu den Kontrollfermentern deutlich an (+38 bis +82 %) und erreichten Spitzenwerte von 2,1 mmol/l in TF-31mS an Tag 19 (+84 %). Die Werte der Kontrollfermenter blieben stabil bei 1,1–1,2 mmol/l. Die Zulage von Sojaprotein in TF-31mS führte zu höheren i-Buttersäuregehalten (+5 % bis +8 %; p = <0,001–0,002) im Vergleich zu TF-31. Während der gesamten Zulagephase und bis in die Erholungsphase hinein unterschieden sich die Gehalte der i-Buttersäure in den Testfermentern signifikant von denen der Kontrollfermenter. In der Erholungsphase sanken die Gehalte der i-Buttersäure von Tag 19 bis Tag 26 zuerst deutlich und ab Tag 22 langsamer ab, sodass an Tag 27 keine Unterschiede mehr zwischen den Kontroll- und den Testfermentern feststellbar waren. L35–L38 Konzentration von i-Buttersäure Im zweiten Laufblock war ebenfalls ein leichter Anstieg der i-Buttersäuregehalte in der Fermenterflüssigkeit während der Einlaufphase zu beobachten. Die Werte pendelten in der Kontrollphase bei 0,8 mmol/l ein. Analog zum ersten Laufblock folgte ein signifikanter Anstieg der i-Buttersäuregehalte in den Testfermentern im Vergleich zu den Kontrollfermentern während der Zulagephase auf 1,4–1,8 mmol/l (+84 % bis +120 %). Die höchsten Werte erreichte TF-33mS an Tag 16 mit 1,8 mmol/l (+126 %). Auch zeigten die Fermenter TF-33mS höhere i-Buttersäuregehalte (+2 % bis +8 %; p = 0,001–0,047) als TF-33. Die Kontrollfermenter hatten während der gesamten Zulagephase stabile Werte von rund 0,8 mmol/l. Ab Tag 26 der Erholungsphase waren keine wesentlichen Unterschiede mehr zwischen Kontroll- und Testfermentern zu beobachten, wobei sich die Reduktion der Werte in den Testfermentern wie in L31–L34 ab Tag 22 verlangsamte. Die Werte pendelten sich am Tag 27 bei den Ausgangswerten von 0,8 mmol/l ein.

Ergebnisse

70

Abb. 4.2: Produktion der i-Buttersäure [mmol/24h] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/2

4h]

Tag

KF-32TF-33TF-33mS

Lauf 35–38

**

****

*

****

°

*

* °°

* °°°* °°°

* °°°

* °°°

* °°°

###

### ### # # # # # # # # # # # #

°°° * **

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/2

4h]

Tag

KF-30TF-31TF-31mS

Lauf 31–34

#####

###

###

***

******

** #### #

*

*

* °°°

* °°

* °°° * °°°

** °°

****

### ##

####

Ergebnisse

71

L31–L34 Produktion von i-Buttersäure Im ersten Laufblock wurden in den Kontrollfermentern i-Buttersäuremengen von 0,3–0,4 mmol in 24 Stunden produziert. In den Testfermentern stiegen die Werte während der Zulagephase auf 0,6–0,8 mmol/24 h an (im Vergleich zur Kontrolle +56 % bis +89 %). Dabei unterschieden sich TF-31 und TF-31mS, wobei die Sojazulage die höheren i-Buttersäuremengen aufwies (+3 % bis +8 %; p = 0,009–0,010). Analog zu den gemessenen Werten in der Fermenterflüssigkeit des ersten Laufblockes waren die Werte der Testfermenter über die Dauer der Zulagephase und die ersten Tage der Erholungsphase hinweg signifikant unterschiedlich zu denen der Kontrollfermenter und pendelten sich am Ende der Erholungsphase an Tag 27 wieder im Bereich der letzteren bei 0,4 mmol/24 h ein, wobei die Reduktion der Gehalte von Tag 20 bis 22 deutlich schneller ablief als an den folgenden drei Tagen. L35–L38 Produktion von i-Buttersäure Die in 24 Stunden produzierten Mengen der i-Buttersäure im zweiten Laufblock verhielten sich im Verlauf des RUSITEC-Versuches gleichermaßen, wie die des ersten Laufblockes. Die Kontrollfermenter produzierten in der Einlaufphase geringfügig geringere i-Buttersäuremengen mit 0,3 mmol/24 h. In den Testfermentern stiegen die Werte auf 0,6–0,7 mmol/24h (+97 % bis +149 %) an, wobei die Sojazulage in TF-33mS im Vergleich zu TF-33 erneut die höheren Mengen produzierte (+3 % bis +7 %; p = 0,010–0,043). Auch hier unterschieden sich die Testfermenter signifikant von den Kontrollfermentern während der gesamten Zulagephase und bis in die Erholungsphase hinein. In diesem Laufblock verhielt sich die Reduktion der in 24 Stunden produzierten i-Buttersäuremengen analog zu dem im Fermenter beobachteten Verlauf. Zuerst fielen die Werte schneller und ab Tag 22 langsamer ab, um sich am Ende der Erholungsphase (Tag 26) wie im ersten Laufblock im Bereich der Kontrollfermenter bei Ausgangswerten von etwa 0,3 mmol/24 h einzupendeln.

Ergebnisse

72

4.1.2 Vorkommen von i-Valeriansäure (s. Abb. 4.3 u. 4.4 sowie Tab. 9.15–9.19)

Abb. 4.3: Konzentration der i-Valeriansäure in der Fermenterflüssigkeit [mmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

02468

101214

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/l]

Tag

KF-32TF-33TF-33mS

Lauf 35–38

###

########## # # # # # # # # # # #

*********

****

* ** *** **

*** * °°°

* °°°

##

02468

101214

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/l]

Tag

KF-30TF-31TF-31

Lauf 31-34

##

##

#

***

*** **

* ***

** ******

# # # # # ## #

***

**°°°

°°

**

**

***

####### #### #

Ergebnisse

73

L31–L34 Konzentration von i-Valeriansäure Die Gehalte der i-Valeriansäure stiegen in allen Fermentern in den ersten drei Tagen der Einlaufphase von 1,3 auf 3,0 mmol/l an und enthielten in den Kontrollfermentern KF-30 Konzentrationen von 3,1–4,2 mmol/l. Mit Beginn der Zulagephase stiegen die i-Valeriansäuregehalte in den Testfermentern auf 8,5–11,2 mmol/l (+77 % bis +185 %). Die höchsten Gehalte wurden an Tag 18 und 19 mit 10,9 bzw. 11,2 mmol/l gemessen (+73 % bis +186 %), dabei zeigte die Sojazulage in den Testfermentern TF-31mS keine signifikanten Unterschiede zu TF-31. Hingegen war die Signifikanz der i-Valeriansäuregehalte von KF-30 gegenüber TF-31 bzw. TF-31mS in der gesamten Zulage- und Erholungsphase gegeben (p = <0,001). Die Gehalte der Testfermenter pendelten sich an Tag 27 wieder im Bereich der Kontrollfermenter bei etwa 4,3 mmol/l ein, wobei sie in den ersten drei Tagen deutlich schneller abfielen, als in den folgenden fünf Tagen. L35–L38 Konzentration von i-Valeriansäure Wie im ersten Laufblock, stiegen auch im zweiten Laufblock die i-Valeriansäuregehalte an den ersten drei Tagen von 1,6 um fast das doppelte auf 3,1 mmol/l an. Die Kontroll-fermenter pendelten sich bei 2,8–3,5 mmol/l in der Kontrollphase ein. In der Zulage-phase erhöhten sich die i-Valeriansäuregehalte der Testfermenter auf 4,4–6,9 mmol/l (+103 % bis +200 %). Die höchsten Werte hatten TF-33 und TF-33mS an Tag 16 (6,6 bzw. 6,9 mmol/l; +186 % bzw. +200 % gegenüber KF-32), dabei erzeugte die Sojazulage nur an Tag 14 und 15 signifikante Unterschiede zwischen den Testfermentern TF-33 und TF-33mS (jeweils +5 %; p = 0,028 bzw. 0,045). Die Signifikanz der Gehalte in TF-33 und TF-33mS gegenüber KF-32 blieb vollständig über die Zulage- und die Erholungsphase bestehen. Dabei befanden sich die i-Valerian-säurespiegel von TF-33 und TF-33mS mit 3,0–3,2 mmol/l im Gegensatz zum ersten Laufblock am Ende der Erholungsphase nicht gänzlich wieder im Bereich von KF-32 (2,1 mmol/l), dennoch erfolgte auch hier bis Tag 22 eine weitaus schnellere Reduktion der i-Valeriansäuregehalte als in den folgenden Tagen.

Ergebnisse

74

Abb. 4.4: Produktion der i-Valeriansäure [mmol/24h] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/2

4h]

Tag

KF-32TF-33TF-33mS

Lauf 35–38

***

*** ** ** ** °°°

* °°°

* °°°

* °°°

*

***

****

* *

*## ################ ####

##

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/2

4h]

Tag

KF-30TF-31TF-31mS

Lauf 31–34

***

#

****

***

*

***

### # # #

***

*

**

*# # # ## #

*

****

# ##

* *## # #

Ergebnisse

75

L31–L34 Produktion von i-Valeriansäure In der Einlaufphase produzierten alle Fermenter i-Valeriansäuremengen von 0,6–1,0 mmol/24 h, die sich bei 1,3 mmol/24 h in der Kontrollphase einpendelten. Mit der Zulagephase stiegen die produzierten Mengen in den Überläufen der Testfermenter auf 1,8–4,5 mmol/24 h (+123 % bis +219 %) an. Dabei konnte, wie zuvor in der Fermenterflüssigkeit, kein signifikanter Unterschied zwischen Test-fermentern mit bzw. ohne Sojazulage festgestellt werden. Die Spitzenwerte erzielten die Testfermenter an Tag 18 und 19 mit im Mittel 4,5 mmol/24 h (+219 %). Dabei waren die Unterschiede der produzierten i-Valeriansäuregehalten zwischen KF-30 und TF-31 bzw. TF-31mS über die Zulage- und die Erholungsphase bis zum Tag 25 bzw. 26 signifikant. In der Erholungsphase näherten sich die Werte der Testfermenter mit 1,8 mmol/24 h wieder stark denen der Kontrollfermenter (1,6 mmol/24 h) an, erreichten diese jedoch nicht vollständig bis zum Tag 28. Von Tag 19 bis Tag 22 fielen die Werte deutlich schneller als in den folgenden Tagen der Erholungsphase ab. L35–L38 Produktion von i-Valeriansäure Auch im zweiten Laufblock stiegen die in 24 Stunden produzierten i-Valerian-säuremengen in den ersten Tagen der Einlaufphase von 0,5 auf 1,2 mmol/24 h an und pendelten sich bei 1,1 mmol/24 h ein. In der Zulagephase erhöhten sich die produzierten Mengen in den Testfermentern auf 1,3–2,6 mmol/24 h (+105 % bis +209 %). Dabei hatte die Sojazulage von TF-33mS an Tag 11 und 14 einen signifikanten Einfluss gegenüber TF-33 (jeweils +4 %; p = 0,012 bzw. 0,027). Die höchsten Werte ergaben sich hier ebenfalls an den letzten Zulagetagen in den Testfermentern mit je 2,5 mmol/24 h (+209 %). In der Erholungsphase sanken die produzierten i-Valeriansäurewerte auf 1,3 mmol/24 h ab, erreichten aber wie im ersten Laufblock nicht den Level der Kontrolle (KF-32: 0,8–0,9 mmol/24 h). Analog zu den vorherigen Beobachtungen im ersten Laufblock sanken die produzierten Mengen auch hier von Tag 19–22 deutlich schneller als in den folgenden Tagen der Erholungsphase. Die signifikanten Unterschiede zwischen KF-32 und den Testfermentern TF-33 bzw. TF-33mS erstreckten sich über die gesamte Zulage- und Erholungsphase.

Ergebnisse

76

4.2 Vorkommen von Ammoniak (s. Abb. 4.5 sowie Tab. 9.19 u. 9.20)

Abb. 4.5: Ammoniakgehalte in der Fermenterflüssigkeit [mmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31–34

***

#

***

###

***

###

***

###

***

###

***

###

***

###

°

###

°#

*** °°

*** °°

*** °

*** °

*** °

** * **

###

###

###

###

#####

###

### #

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35–38*** °°

*** °

*** °

*** **

* **

* **

* **

* ***

***

***

* * ####

###

###

###

###

###

###

###

#

###° **

* ***

###

###

###

###

Ergebnisse

77

L31–L34 Konzentration im flüssigen Fermenterinhalt Die Ammoniakgehalte pendelten sich in der Einlaufphase im ersten Laufblock bei 4,5–6,0 mmol/l in der Fermenterflüssigkeit ein. Mit Beginn der Zulagephase stiegen die Gehalte in TF-31 und TF31-mS auf 9,6–14,2 mmol/l (+106 % bis +215 % im Vergleich zur Kontrolle) an und bildeten einen plateauähnlichen Kurvenverlauf. Die Sojazulage in TF-31mS ergab zudem höhere Ammoniakgehalte von TF-31mS gegenüber TF-31 (+14 %; p = 0,003–0,043), dabei erreichte TF-31mS an Tag 17 einen Spitzenwert von 16,9 mmol/l (+220 %). In der Erholungsphase sanken die Gehalte von TF-31 und TF-31mS bis zum Tag 21 schnell ab und erreichten bis Tag 26 wieder den Level der Kontrollfermenter (4,0–5,3 mmol/l). Die Gehalte von KF-30 unterschieden sich von TF-31 bzw. TF-31mS in der Zulagephase hochsignifikant und auch in der Erholungsphase waren bis zum Tag 22 bzw. 23 noch Signifikanzen zu verzeichnen. L35–L38 Konzentration im flüssigen Fermenterinhalt Im zweiten Laufblock sanken die Ammoniakgehalte im Gegensatz zum ersten Laufblock in der Einlaufphase von 4,6 mmol/l in den ersten Tagen auf 1,6 mmol/l an Tag 7 in der Kontrollphase ab. In der Zulagephase stiegen die Gehalte in TF-33 bzw. TF-33mS um mehr als das 10fache der Kontrolle auf 6,5–18,6 mmol/l (+468 % bis +1010 %) an. Ein plateauähnlicher Verlauf war auch hier zu beobachten, jedoch schwankten die Werte im Plateau stärker in einem Bereich von rund 11–19 mmol/l. Die Sojazulage spiegelte sich vergleichbar zum ersten Laufblock in höheren Ammoniakgehalten von TF-33mS gegenüber TF-33 wieder (+16 %; p = 0,004–0,027). Den höchsten Gehalt wies TF-33 an Tag 16 mit 19,4 mmol/l (+1035 %) auf. In der Erholungsphase sanken die Ammoniakgehalte in den Testfermentern auf Werte von 1,3–1,6 mmol/l ab und pendelten sich damit im Bereich der Kontrollfermenter ein. Wie im ersten Laufblock sanken die Ammoniakgehalte bis zum Tag 22 erheblich schneller als in den folgenden Tagen der Erholungsphase. Analog zum ersten Laufblock waren auch im zweiten Laufblock hochsignifikante Unterschiede zwischen KF-32 und TF-33 bzw. TF-33mS in der gesamten Zulagephase zu beobachten, die sich bis Tag 22 in die Erholungsphase hineinzogen.

Ergebnisse

78

4.3 Ergebnisse der Aminosäureanalyse (EVONIK Nutrition & Care GmbH)

Im Folgenden sind die ausgewerteten Daten der Aminosäureanalyse von EVONIK Nutrition & Care GmbH aus 315 gefriergetrockneten Grassilagen im Totalaufschluss dargestellt (s. Abb. 4.6 bis Abb. 4.10). Arginin, Lysin und Methionin sowie GABA sind jeweils in Abhängigkeit vom RE/Rp Quotienten aufgeführt. Da die grafische Darstellung der Ergebnisse im Mittelpunkt stehen sollte, wurden keine weiteren statistischen Auswertungen vorgenommen. Aufgrund der Datenübermittlung von EVONIK Nutrition & Care GmbH wurde der Aminosäuregehalt jeweils prozentual anteilig an den gesamten Aminosäuren der TS erfasst, während der GABA-Gehalt in mg/kg TS ermittelt werden konnte.

Arginin zeigte eine deutliche Abhängigkeit vom RE/Rp-Quotienten in den Grassilagen. Dabei wiesen die im RUSITEC eingesetzten Schadsilagen S-31 und S-33 einen RE/Rp-Quotienten von 42,9 % bzw. 40,3 % und die Kontrollsilagen K-30 und K-32 einen entsprechenden Quotienten von 59,5 % bzw. 60,6 % auf (s. Tab. 3.2). Die Arginingehalte in den Schadsilagen S-31 und S-33 lagen bei 1,9 bzw. 2,7 % der gesamten Aminosäuren. Die Kontrollsilagen K-30 und K-32 lagen bei deutlich höheren Arginingehalten von 5,1 bzw. 4,0 % der gesamten Aminosäuren.

R² = 0,54398

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

10,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Arg

inin

[% g

es. A

S]

[RE/Rp]

Abb. 4.6: Abhängigkeit der Arginin-Gehalte [% der gesamten AS] vom Quotienten RE/Rp in 315 Grassilagen

■ eingesetzte Kontrollsilagen (K-30 und K-32) RUSITEC-Läufe L31- L38 ▲eingesetzte Schadsilagen (S-31 und S-33) RUSITEC-Läufe L31- L38 ♦ Silagen aus der Datenbank

Ergebnisse

79

Bei Lysin war kein deutlicher Unterschied zwischen den Schad- und Kontrollsilagen zu verzeichnen. Die Lysingehalte beliefen sich in K-30 und K-32 auf 5,2 % bzw. 6,1 % der gesamten Aminosäuren und in S-31 und S-33 auf 6,0 % bzw. 6,5 %.

R² = 0,00347

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

10,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Lysi

n [%

ges

. AS]

[RE/Rp]

R² = 0,06796

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

0 20 40 60 80 100

Met

hion

in[%

ges

. AS]

[RE/Rp]

Abb. 4.7: Abhängigkeit der Lysin-Gehalte [% der gesamten AS] vom Quotienten RE/Rp in 315 Grassilagen

■ eingesetzte Kontrollsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ▲eingesetzte Schadsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ♦ Silagen aus der Datenbank

Abb. 4.8: Abhängigkeit der Methionin-Gehalte [% der gesamten AS] vom Quotienten RE/Rp in 315 Grassilagen

■ eingesetzte Kontrollsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ▲eingesetzte Schadsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ♦ Silagen aus der Datenbank

Ergebnisse

80

Analog zu den Gegebenheiten von Lysin zeigten auch die Methioninwerte mit 2,0 % bzw. 2,1 % der gesamten Aminosäuren in den Kontrollsilagen und 2,2 % bzw. 2,1 % der gesamten Aminosäuren in den Schadsilagen S-31 bzw. S-33 wenig Unterschiede.

Die Ergebnisse von GABA können aus Gründen der Datenübermittlung in g/kg TS angegeben werden. Die Verteilung der GABA-Gehalte war spiegelverkehrt wie beim Arginin durch den RE/Rp-Quotienten beeinflusst. Zudem wurden in den Schadsilagen (S-31 bzw. S-33) mit 7,6 und 9,6 g/kg TS deutlich höhere Gehalte gemessen als in den Kontrollsilagen (K-30 bzw. K-32 je 3,8 g/kg TS).

R² = 0,2461

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

GAB

A [g

/kg

TS]

[RE/Rp]

Abb. 4.9: Abhängigkeit der GABA-Gehalte [g/kg TS] vom Quotienten aus RE/Rp in 315 Grassilagen ■ eingesetzte Kontrollsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ▲eingesetzte Schadsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ♦ Silagen aus der Datenbank

Ergebnisse

81

4.4 Beziehung zwischen g-Aminobuttersäure und Glutamat

Da GABA in pflanzlichen Zellen neben einem Stoffwechselweg aus Polyaminen auch aus Glutamat gebildet wird (s. Abb. 2.3), sollte dieser Stoffwechselweg im Rahmen der Aminosäureanalysen aus den Grassilagen ebenfalls betrachtet werden. Dabei muss beachtet werden, dass der GABA-Gehalt durch den Glutamatshunt (THEERMANN 2011) entsprechend beeinflusst werden kann.

Bei der Auswertung der Daten zeigte sich, dass die prozentualen Werte von Glutamat an den gesamten Aminosäuren mit zunehmendem GABA-Gehalt absinken. Die Kontrollsilagen K-30 und K-32 wiesen dabei einen Glutamatgehalt von 11,0 % bzw. 10,7 % an den gesamten Aminosäuren auf. Bei der Schadsilage S-31 zeigt sich ein geringerer Glutamatgehalt von 8,1 % an den gesamten Aminosäuren während S-33 mit 10,6 % der gesamten Aminosäuren einen ähnlichen Glutamatgehalt aufwies, wie die Kontrollsilagen.

4.5 Vorkommen von Polyaminen und Aminosäuren im RUSITEC

Im Folgenden sind die an der LC-MS/MS gemessenen Gehalte der Polyamine und ihrer korrespondierenden Aminosäuren im flüssigen sowie die löslichen Gehalte aus dem festen Fermenterinhalt dargestellt. Aufgrund der Methodik wurde im flüssigen Fermenterinhalt die Stoffmengenkonzentration der Polyamine und Aminosäuren erfasst.

R² = 0,5227

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

GAB

A [g

/kg

TS]

Glutamat [% ges. AS]

Abb. 4.10: Abhängigkeit der GABA-Gehalte [g/kg TS] von Glutamat [% der ges. AS] in n = 315 Grassilagen ■ eingesetzte Kontrollsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ▲eingesetzte Schadsilagen RUSITEC-Läufe L31- L38 ♦ Silagen aus der Datenbank

Ergebnisse

82

Da die Beutelinhalte der Einwaage aus dem RUSITEC nach 48 h Verdau zur Analyse aus dem festen Fermenterinhalt nicht gefriergetrocknet werden konnten, sind diese Gehalte getrennt im zweiten Abschnitt in mg/g uS erfasst. Die Ergebnisse der eingesetzten Grassilagen wurden in gleicher Weise ermittelt, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Analyse aus lagerungstechnischen Gründen aus gefriergetrocknetem Material erfolgen musste. Weil im RUSITEC erst in der Kontrollphase ein steady state erreicht wird, wurden entsprechend ab dem achten Tag in der Kontrollphase sowie in der gesamten Zulage- und Erholungsphase Proben gewonnen und analysiert.

4.5.1 Vorkommen von Cadaverin im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.11 sowie Tab. 9.21–9.22)

Abb. 4.11: Cadaveringehalte im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

20

40

60

80

100

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34

°

0

20

40

60

80

100

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

* °°°

Ergebnisse

83

L31–L34 Die Gehalte von Cadaverin im flüssigen Fermenterinhalt lagen in der Kontrollphase bei 73,1–83,4 µmol/l. Über die Dauer des ersten Laufblockes sanken die Werte in allen Fermentern auf 24,0–35,6 µmol/l ab und blieben dann stabil in diesem Bereich, sowohl in der Zulage als auch in der Erholungsphase. Die Testfermenter zeigten von Tag 11 bis Tag 15 geringere Gehalte von Cadaverin in der Zulagephase als die Kontroll-fermenter (-11 % bis -15 %). L35–L38 Im zweiten Laufblock wurden kontinuierlich in allen Phasen Cadaveringehalte von 29,5–40,2 µmol/l gemessen. Dabei lagen die Werte der Testfermenter von Tag 14 bis Tag 18 der Zulagephase geringgradig über denen der Kontrollen (+11 % bzw. +8 %). Statistisch zeigten sich zwischen den TF-33 und TF-33mS an Tag 11 und 18 signifikante Unterschiede (p = 0,004 bzw. 0,032). Darüber hinaus wurde ein signifikanter Unterschied zwischen KF-32 und TF-33 sporadisch an Tag 12 (p = 0,016) beobachtet. Im Vergleich zum ersten Laufblock sanken die Cadaveringehalte des zweiten Laufblockes am Beginn des Versuchs nicht ab, verhielten sich jedoch ansonsten analog mit kaum ersichtlichen Unterschieden der zwischen Test- und Kontrollfermentern.

Ergebnisse

84

4.5.2 Vorkommen von L-Lysin im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.12 sowie Tab. 9.25–9.26)

Abb. 4.12: L-Lysingehalte im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

050

100150200250300350400

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34**

*##

#

** **# #

** **##

*****

*

***

***

***

###

###

###

###

##

**# #

* ° **# # # #

°°

#05

10152025303540

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

#*** ° *

*

# #

Ergebnisse

85

L31–L34 Die Gehalte von L-Lysin lagen in der Kontrollphase bei 306–396 µmol/l. In der Zulagephase sanken die L-Lysinspiegel in den Testfermentern gegenüber der Kontrolle deutlich ab (-65 %). Die geringsten Werte erreichten TF-31 und TF-31mS zwischen den Tagen 14 und 16 mit 43,5 bzw. 45,3 µmol/l. In der Erholungsphase erreichte TF-31 erst an Tag 23 wieder Werte im Bereich von KF-30. TF-31mS zeigte bis zum Ende des Versuchs mit 141–168 µmol/l geringere Werte als KF-30. Im gesamten ersten RUSITEC-Laufblock sanken auch die L-Lysingehalte der Kontrollen in der Zulagephase ab und blieben bis Tag 22 in der Erholungsphase niedriger, stiegen aber zum Ende wieder an. Dennoch waren die Werte von KF-30 immer deutlich höher als die der Testfermenter. Die signifikanten Unterschiede zwischen Kontrollen und Testfermentern erstreckten sich dabei nahezu über den gesamten Laufblock von Tag 10 bis Tag 26. Die Sojazulage in TF-31mS ergab nur an den Tagen 19, 24 und 25 einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu TF-31. L35–L38 Die Kontrollphase im zweiten Laufblock im flüssigen Fermenterinhalt zeigte L-Lysin-werte von 7,3–11,9 µmol/l. Mit Beginn der Zulage stiegen hier die Gehalte in den Testfermentern auf 14,1–22,3 µmol/l an (+48 % bis +51 %). Zum Ende der Zulage-phase sanken die Gehalte von L-Lysin in TF-33 und TF-33mS jedoch wieder ab, um sich in der Erholungsphase an Tag 23 erneut auf dem Level von KF-32 einzupendeln. Geringgradig signifikante Unterschiede waren nur sporadisch von Tag 12–19 zu beobachten (p = 0,009–0,049). Im Vergleich zum ersten Laufblock verhielten sich hier Test- und Kontrollfermenter entgegengesetzt. So lagen die Werte der Kontrollen in der Zulagephase im ersten Laufblock unter denen der Testfermenter und im zweiten Laufblock lagen letztere über den Kontrollen. Darüber hinaus waren die Gehalte mit 100–400 µmol/l im ersten Laufblock z. T. 10fach höher als im zweiten Laufblock.

Ergebnisse

86

4.5.3 Vorkommen von Putrescin im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.13 sowie Tab. 9.29–9.30)

Abb. 4.13: Putrescin im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

020406080

100120140

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34*

**** *

*

* °

** *

# # # # #**

# #####

###

###

*

***

020406080

100120140

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

*

** °

*

###

###

###

###

###

###

###

### ##

#

#

**

** **

**

**

**

***

***

###

#

Ergebnisse

87

L31–L34 Die Gehalte von Putrescin pendelten sich in der Kontrollphase des ersten Laufblockes bei 93,6–98,7 µmol/l im flüssigen Fermenterinhalt ein. Mit der Zulagephase sanken die Gehalte in den Testfermentern auf 19,6–77,3 µmol/l, wobei TF-31mS noch geringere Werte aufwies als TF-31 (-46 % bzw. -36 %). Die Kontrollfermenter blieben in der Zulagephase und bis Tag 22 der Erholungsphase höher in den Putrescingehalten als die Testfermenter. Zum Ende der Erholungsphase glichen sich die Werte auch in TF-31 und TF-31mS wieder denen von KF-30 an und erreichten Gehalte von 24,6–36,9 µmol/l. Geringgradig bis hochgradig signifikante Unterschiede ergaben sich für beide Testfermenter gegenüber der Kontrolle während der gesamten Zulagephase (p = 0,001–0,046; exkl. Tag 15). Die Sojazulage in TF-31 ergab nur an Tag 18 einen signifikanten Unterschied gegenüber TF-31mS (p = 0,043). In summa sanken die Putrescinwerte über die Dauer des ersten Laufblockes zum Ende hin ab. L35–L38 Alle Fermenter zeigten in der Kontrollphase im flüssigen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes Werte von 71,4–87,0 µmol/l. Mit der Zulagephase sanken die Putrescin-gehalte von TF-33 bzw. TF-33mS auf 14,5–25,8 µmol/l bzw. 22,1–32,6 µmol/l deutlich ab, wobei TF-33mS wie im ersten Laufblock ebenfalls niedrigere Werte aufwies (-66 % bzw. -59 %). Mit Beginn der Erholungsphase pendelten sich die Gehalte in den Testfermentern wieder im Bereich der Kontrollfermenter bei ~80 µmol/l ein und erreichten vergleichbare Gehalte am Tag 22. Die Unterschiede der Gehalte in den Testfermentern gegenüber KF-32 waren von Tag 9 bis Tag 22 überwiegend mittel- bis hochgradig signifikant (p = <0,001–0,049). An Tag 13 ergab sich darüber hinaus ein signifikanter Unterschied von TF-33 gegenüber TF-33mS. Im zweiten Laufblock verhielt sich Putrescin generell wie im ersten Laufblock, jedoch nahmen die Werte zum Ende hin nicht ab, sondern pendelten sich im Bereich der Werte aus der Kontrollphase von KF-32 ein.

Ergebnisse

88

4.5.4 Vorkommen von Spermidin im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.14 sowie Tab. 9.33–9.34)

Abb. 4.14: Spermidin im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

5

10

15

20

25

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


**

** °

*

*** ****

*** °

####

#

# # ###

###

#####

°

0

5

10

15

20

25

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38##

#

#* * * °**

**

** **

** *** ***

#### ###### ###

###

##

##

Ergebnisse

89

L31–L34 Spermidin lag in der Kontrollphase im flüssigen Fermenterinhalt bei Gehalten von 14,2–20,3 µmol/l. Über den gesamten Laufblock sanken die Werte in allen Fermentern ab. Dabei lagen TF-31 und TF-31mS mit 4,9–12,9 µmol/l in der Zulagephase deutlich unter KF-30, wobei in TF-31mS noch geringere Gehalte zu beobachten waren als in TF-31 (-34 % bzw. -47 %). Bis zum Tag 23 in der Erholungsphase unterschieden sich die Testfermenter von den Kontrollen, pendelten sich dann aber bei ähnlichen Werten ein. Statistisch konnten mit Ausnahme von Tag 16 an allen Tagen der Zulagephase und an Tag 20–22 der Erholungsphase signifikante Unterschiede zwischen TF-31 bzw. TF-31mS und KF-30 berechnet werden (p = <0,001–0,049). Generell verhielt sich der Verlauf von Spermidin im flüssigen Fermenterinhalt des ersten Laufblockes ähnlich wie Putrescin im selbigen. L35–L38 Die Kontrollphase von Spermidin im zweiten Laufblock ergab Werte im Bereich von 5,5–8,0 µmol/l in allen Fermentern. Mit der Zulagephase sanken die Gehalte in den Testfermentern gegenüber den Kontrollen wie im ersten Laufblock deutlich auf 1,1–2,2 µmol/l ab (-60 % bis -66 %). Die Sojazulage ergab keinen Unterschied in den Testfermentern. An Tag 22 der Erholungsphase erreichten TF-33 und TF-33mS wieder Werte im Bereich von KF-32 (~6,2 µmol/l). Während der gesamten Zulagephase konnten überwiegend mittel- bis hochgradig signifikante Unterschiede der Testfermenter gegenüber den Kontrollfermentern beobachtet werden (p = <0,001–0,024). Insgesamt waren die Spermidinwerte im zweiten Laufblock niedriger als im ersten, jedoch war generell ein vergleichbarer Verlauf zu beobachten. Analog zu Putrescin konnte auch für Spermidin nur im ersten Laufblock ein genereller Abfall der Werte über die gesamte Versuchsdauer beobachtet werden.

Ergebnisse

90

4.5.5 Vorkommen von Spermin im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.15 sowie Tab. 9.37–9.38)

Abb. 4.15: Spermin im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,000,250,500,751,001,251,501,752,00

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

** *

#

°*

*

0,000,250,500,751,001,251,501,752,00

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


#

Ergebnisse

91

L31–L34 Spermin zeichnete sich in den Kontrollfermentern im flüssigen Fermenterinhalt im ersten Laufblock durch Gehalte von 0,2–1,6 µmol/l aus. In der Zulagephase lagen die Werte in allen Fermentern bei 0,2–1,2 µmol/l (-4 %), dabei bestand kein Unterschied zwischen Kontroll- und Testfermentern. Ebenso wenig hatte die Sojazulage in TF-31mS einen Einfluss. Auch die Erholungsphase zeigte keine greifbaren Unter-schiede zwischen den Fermentern (0,1–0,5 µmol/l). L35–L38 Analog zum ersten Laufblock ergab die Kontrollphase des zweiten Laufblockes ebenfalls Spermingehalte auf niedrigem Niveau von 1,0–1,3 µmol/l. Mit der Zulagephase sank der Gehalt in den Testfermentern wie zuvor bei Putrescin und Spermidin ab. Für Spermin ergab die Messung in TF-33 und TF-33mS 0,3–0,9 µmol/l (-24 %). In der Erholungsphase konnte an Tag 22 wieder ein Angleichen der Testfermenter an die Kontrollfermenter beobachtet werden. Vereinzelt wurden von Tag 14 bis Tag 17 signifikante Unterschiede zwischen allen drei Fermentergruppen beobachtet (p = 0,006–0,034). Im zweiten Laufblock konnte im Gegensatz zum ersten Laufblock ein deutlicher Unterschied zwischen Kontroll- und Testfermentern festgestellt werden. Darüber hinaus fielen die Werte nicht in allen Fermentern über die Zeit der Zulage- und Erholungsphase ab, sondern pendelten sich in der letzten Phase wieder im Bereich von KF-32 ein, ähnlich wie es auch schon bei Putrescin und Spermidin im zweiten Laufblock zu beobachten war.

Ergebnisse

92

4.5.6 Summe der Polyamingehalte von Putrescin, Spermidin und Spermin im flüssigen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.16 sowie Tab. 9.41–9.42)

Abb. 4.16: Summe von Putrescin, Spermidin und Spermin (Summe der PA Gehalte) im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

020406080

100120140160

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34*

*** **

*##

#

##

##

***

** *

* ° *

###

####

###

020406080

100120140160

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

** °* **

*** ** ** ***** ***

#

##

# ##

###

###

###

###

###

###

###

###

Ergebnisse

93

L31–L34 Die Summe der Konzentrationen der Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin wird im Folgenden als Summe der PA-Gehalte bezeichnet. In der Kontrollphase pendelten sich die PA-Gehalte im flüssigen Fermenterinhalt bei 113–142 µmol/l ein. Mit der Zulagephase sanken die Gehalte in den Testfermentern auf 24,7–90,1 µmol/l, wobei TF-31 gegenüber der Kontrolle etwas höhere Werte zeigte als TF-31mS (-36 % bzw. -47 %). Die Summe der PA-Gehalte in den Testfermentern erreichte in der Erholungsphase bis zum Tag 28 nicht die Werte der Kontrollfermenter. Gering- bis hochgradig signifikante Unterschiede ergaben sich für beide Testfermenter gegenüber der Kontrolle während der gesamten Zulagephase (p = 0,001–0,044; exkl. Tag 16). Dabei konnte für die Sojazulage in TF-31 nur an Tag 20 ein signifikanter Unterschied gegenüber TF-31mS beobachtet werden (p = 0,036). Insgesamt sanken die Polyaminwerte über die Dauer des ersten Laufblockes zum Ende hin ab, jedoch führte das Aufsummieren der einzelnen Polyamingehalte zu einem deutlicher abgegrenzten Kurvenverlauf der Fermentergruppen (Kontroll- und Testfermenter mit bzw. ohne Sojazulage). L35–L38 Die Summe der PA-Gehalte zeigte in der Kontrollphase im flüssigen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes Werte von 68,2–96,6 µmol/l. Die Zulagephase führte zu deutlich geringeren Polyamingehalten in den Testfermentern gegenüber der Kontrolle, wobei TF-33mS noch geringere Werte aufwies als TF-33 (17,4–33,4 bzw. 21,1–38,8 µmol/l; -66 % bzw. -58 %). Mittel- bis hochgradig signifikante Unterschiede der Gehalte in den Testfermentern gegenüber KF-32 waren von Tag 9 bis Tag 22 zu beobachten (p = <0,001–0,038). Zwischen TF-33 und TF-33mS ergab sich an Tag 12 und 13 ein signifikanter Unterschied (p = 0,030 bzw. 0,048). Die Tendenz der Polyamingehalte verhielt sich im zweiten Laufblock vergleichbar wie im ersten, jedoch sanken die Werte nur im ersten Laufblock über die gesamte Dauer des Versuchs ab.

Ergebnisse

94

4.5.7 Vorkommen von m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) im flüssigen Fermenterinhalt

Der Stoff mit dem Masse zu Ladungsverhältnis m/z 173 (möglicherweise Thermo-spermin, s. Kap. 3.2.4.5.18) konnte im flüssigen Fermenterinhalt in beiden Laufblöcken nicht nachgewiesen werden.

4.5.8 Vorkommen von L-Arginin im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.17 sowie Tab. 9.47–9.48)

Abb. 4.17: L-Arginingehalte im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

#

°°

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


*

°

°°

Ergebnisse

95

L31–L34 L-Arginin zeigte sich in der Kontrollphase mit Gehalten von 2,1–4,6 µmol/l in allen Fermentern des ersten Laufblockes. Die Zulagephase ergab keine wesentlichen Unterschiede in den verschiedenen Fermentern. L-Arginingehalte von 1,4–3,3 µmol/l wurden gemessen. Auch die Erholungsphase ergab Werte von 1,2–2,9 µmol/l. Insgesamt unterschieden sich die gemessenen Werte der Fermentergruppen je nach Tag um 1,5–7,1 %. Signifikante Unterschiede ergaben sich sporadisch zwischen TF-31 und TF-31mS an Tag 9 und Tag 11. Die Kontrolle KF-30 und TF-31 unterschieden sich an Tag 18 signifikant. L35–L38 Der zweite Laufblock zeigte vergleichbare Verhältnisse für L-Arginin in den Fer-mentern. Die Kontrollphase ergab geringere Werte von 1,2–1,6 µmol/l. Die Zulage-phase zeigte nur geringe Unterschiede zwischen TF-33 bzw. TF-33mS und KF-32. Mit Werten zwischen 1,4 und 2,3 µmol/l wurden in den Testfermentern in geringem Maße höhere Gehalte als in den Kontrollen gemessen (+14 % bis +25 %). Die Erholungs-phase verhielt sich entsprechend mit Werten von 1,1–2,0 µmol/l; es war hier kein Unterschied zwischen den Fermentergruppen feststellbar. Signifikante Unterschiede zwischen TF-33 und TF-33mS traten sporadisch an Tag 13 und 26 auf. TF-33mS und KF-32 unterschieden sich an Tag 20 signifikant. Im Vergleich zum ersten Laufblock konnte in geringem Umfang ein Unterschied zwischen Test- und Kontrollfermentern in der Zulagephase beobachtet werden.

Ergebnisse

96

4.5.9 Vorkommen von L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.18 sowie Tab. 9.51–9.52)

Abb. 4.18: L-Ornithingehalte im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,01,02,03,04,05,06,07,0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34##

*° °

0,01,02,03,04,05,06,07,0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

*#

**###

°*

Ergebnisse

97

L31–L34 Für L-Ornithin wurden in der Kontrollphase Gehalte von 3,6–4,9 µmol/l in allen Fermentern gemessen. Mit der Zulagephase sanken die Gehalte in den Kontroll-fermentern leicht ab (2,2–3,0 µmol/l), während die Testfermenter Konzentrationen im Bereich von 2,7–4,6 µmol/l enthielten (+23 % bzw. +25 %). In der Erholungsphase erreichten alle Fermenter an Tag 24 wieder vergleichbare L-Ornithingehalte. Signifikante Unterschiede traten sporadisch nur an den Tagen 12, 20 und 23 auf und betrafen alle Fermentergruppen. L35–L38 Der Verlauf von L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes war analog zum ersten Laufblock. Die Kontrollphase ergab L-Ornithingehalte von 2,2–2,8 µmol/l. In der anschließenden Zulagephase wurden in den Testfermentern 2,1–3,1 µmol/l gemessen, während die Kontrollen leicht absanken und Gehalte von 1,8–2,4 µmol/l aufwiesen. Die Werte von TF-33 und TF-33mS lagen somit um 19 % bzw. 24 % über denen von KF-32. In der Erholungsphase pendelten sich alle Fermenter an Tag 22 wieder mit vergleichbaren Werten von 1,8–2,7 µmol/l ein. Signifikante Unterschiede traten sporadisch an den Tagen 13, 15–17, 21 und 24 in allen Fermentergruppen auf.

Ergebnisse

98

4.5.10 Vorkommen von L-Methionin im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.19 sowie Tab. 9.55–9.56)

Abb. 4.19: L-Methioningehalte im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,01,02,03,04,05,06,07,08,0

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

[µmol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


0,04,08,012,016,020,024,028,032,0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

#

Ergebnisse

99

L31–L34 Im ersten Laufblock konnten nur vereinzelt L-Methiongehalte gemessen werden. Die Werte in der Kontroll- und Zulagephase lagen zwischen 2,7–7,1 µmol/l in allen Fermentern. In der Erholungsphase konnte kein L-Methionin nachgewiesen werden. L35–L38 L-Methionin war kontinuierlich im zweiten Laufblock messbar. In der Kontrollphase lagen die Werte bei 8,9–20,5 µmol/l. Mit der Zulagephase sanken die Gehalte in den Kontrollfermentern mit Tag 13 deutlich unter die der Testfermenter (5,9–12,8 µmol/l vs. 9,2–30,3 µmol/l; TF: +81 % bzw. +67 %). KF-32 blieb auch bis zum Ende der Erholungsphase geringer in den Gehalten als die Testfermenter (4,8–11,8 µmol/l vs. 10,0–25,1 µmol/l). Nur ein signifikanter Unterschied zwischen KF-32 und TF-33mS konnte an Tag 27 beobachtet werden. Im Vergleich fiel auf, dass im ersten Laufblock L-Methionin nur sporadisch gemessen werden konnte und sich keine unterschiedliche Tendenz zwischen KF-30 und TF-31 bzw. TF31mS abzeichnete.

Ergebnisse

100

4.5.11 Summe der Aminosäuregehalte von L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.20 sowie Tab. 9.59–9.60)

Abb. 4.20: Summe von L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin (Summe der AS-Gehalte) Vorkommen im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,05,010,015,020,025,030,035,0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38°

0,05,010,015,020,025,030,035,0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


°

Ergebnisse

101

L31–L34 Im Folgenden wird die Summe der korrespondierenden Aminosäuren L-Arginin, L-Ornithin und L-Methionin als AS-Gehalt bezeichnet. In der Kontrollphase wurden AS-Gehalte von 9,7–16,4 µmol/l in den Fermentern des ersten Laufblockes ermittelt. Die Zulagephase ergab keine wesentlichen Unterschiede in den verschiedenen Fermentern. Hier lagen die Werte bei 3,8–14,0 µmol/l. Auch die in der Erholungsphase ermittelten Werte lagen bei 3,6–8,4 µmol/l in allen drei Fermentergruppen. Insgesamt unterschieden sich die gemessenen Werte je nach Tag um -4 % bis +2 % in allen Fermentern. Signifikante Unterschiede ergaben sich sporadisch zwischen den TF-31 und TF-31mS an Tag 14 und 22. L35–L38 Der Verlauf der AS-Gehalte im flüssigen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes stellte sich anders dar, als im ersten Laufblock. In der Kontrollphase wurden höhere Gehalte der Aminosäuren von 13,3–26,6 µmol/l ermittelt. In der anschließenden Zulagephase stiegen die AS-Gehalte in den Testfermentern auf 16,9–33,5 µmol/l, während die Kontrollen ab Tag 13 leicht absanken und Gehalte von 8,7–11,8 µmol/l aufwiesen. Die Werte von TF-33 und TF-33mS lagen somit um +55 % bzw. +47 % über denen von KF-32. Bis zum Ende der Erholungsphase pendelten sich die Fermentergruppen nicht mehr bei Werten im Bereich der Kontrollen ein. Signifikante Unterschiede traten nicht auf.

Ergebnisse

102

4.5.12 Vorkommen von β-Alanin im flüssigen Fermenterinhalt

(Abb. 4.21 sowie Tab. 9.63–9.64)

Abb. 4.21: b-Alanin im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34*

##

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

#

#

* **

Ergebnisse

103

L31–L34 b-Alanin konnte in der Kontrollphase im flüssigen Fermenterinhalt mit 0,7–0,9 µmol/l nachgewiesen werden. Die Zulagephase ergab Werte zwischen 0,3–0,6 µmol/l in den Testfermentern, die unterhalb derer der Kontrollen lagen (-20 %). Dabei hatte das Sojaprotein keinen Einfluss. Mit dem letzten Tag der Zulagephase (Tag 19) begannen sich TF-31 und TF-31-mS wieder im Bereich von KF-30 einzupendeln. Statistisch konnten an Tag 9–11 signifikante Unterschiede zwischen TF-31 bzw. TF-31mS und KF-30 berechnet werden (p = 0,034–0,040). Allgemein sanken die Werte von b-Alanin im gesamten ersten Laufblock, wie es zuvor bei Putrescin, Spermidin und in geringem Maß auch bei Spermin beobachtet werden konnte. L35–L38 Im zweiten Laufblock wurden in der Kontrollphase b-Alanin-Gehalte von 0,4–0,6 µmol/l gemessen. Mit der Zulagephase sanken die Testfermenter ab und hielten sich bis zum Tag 17 bei 0,1–0,4 µmol/l unterhalb der Kontrollen (-27 %). In der Erholungsphase glichen sich die Werte aller Fermenter wieder an. Der zweite Laufblock ergab signifikante Unterschiede zwischen TF-33 bzw. TF-33mS an Tag 9 bzw. 11–14. Auch hier ähnelten sich die Verläufe der Werte im ersten und im zweiten Laufblock, obwohl die Gehalte im ersten Laufblock tendenziell über die Dauer des RUSITEC-Versuchs absanken. Die Sojazulage ergab in beiden Laufblöcken keine erkennbaren Unterschiede.

Ergebnisse

104

4.5.13 Vorkommen von γ-Aminobuttersäure im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.22 sowie Tab. 9.67–9.68)

Abb. 4.22: GABA-Gehalte im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µm

ol/l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

***

***

***

*******

**

**

###

###

###

###

####

# # ##

###

*

Ergebnisse

105

L31–L34 GABA zeigte sich im flüssigen Fermenterinhalt in der Kontrollphase mit sehr geringen Werten von 0,1 µmol/l. In der Zulagephase war erst ab Tag 14 ein Unterschied zwischen Test und Kontrollfermentern feststellbar. In KF-30 konnten durchweg GABA-Gehalte von 0,1 µmol/l gemessen werden. TF-31 und TF-31mS enthielten zum Teil kein GABA und ihre Werte waren ansonsten mit -38 % bzw. -34 % deutlich niedriger als die der Testfermenter. In der Erholungsphase pendelten sich Kontroll- und Testfermenter ab Tag 21 wieder mit ähnlichen Werten ein. Signifikante Unterschiede wurden nicht beobachtet. L35–L38 Der zweite Laufblock verhielt sich grundsätzlich spiegelverkehrt zum ersten Laufblock. Die Kontrollphase ergab GABA-Gehalte von 0,1 µmol/l. Mit der Zulage stiegen die Gehalte in den Testfermentern auf 0,2 µmol/l an (+127 % im Vergleich zur Kontrolle). Zum Ende der Zulagephase an Tag 19 sanken die GABA-Gehalte in TF-33 und TF-33mS bis zum Tag 23 schnell ab. Von Tag 23 bis Tag 26 näherten sich die Werte der Testfermenter langsam denen in den Kontrollfermentern an, um sich dann bei 0,1 µmol/l in allen Fermentern einzupendeln. Zwischen KF-32 und TF-33 bzw. TF-33mS konnten dabei gering- bis hochgradig signifikante Unterschiede in der Zulage und bis zum Tag 24 in der Erholungsphase beobachtet werden. Im Vergleich mit dem ersten Laufblock sind die deutlich höheren GABA-Gehalte und der spiegelverkehrte Verlauf hervorzuheben. Ebenso sind die signifikanten Unterschiede zwischen Test- und Kontrollfermentern während der Zulagephase im zweiten Laufblock auffällig (p = <0,001–0,036).

Ergebnisse

106

4.5.14 Vorkommen von gelöstem Cadaverin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.23 sowie Tab. 9.23Tab. 9.67–9.24)

Abb. 4.23: Lösliches Cadaverin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

10

20

30

40

50

60

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34#

0

10

20

30

40

50

60

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

Ergebnisse

107

L31–L34 Wie im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.11) konnten ebenfalls kaum unter-schiedliche Cadaveringehalte zwischen den drei Fermentergruppen im festen Fermenterinhalt des ersten Laufblockes festgestellt werden. Die Werte von Kontroll- und Testfermentern lagen zwischen 25,8 und 41,2 mg/g uS, wobei die der Test-fermenter in der Zulagephase etwas höher waren (+3,6 %). Nur an Tag 10 wurde ein geringgradig signifikanter Unterschied zwischen KF-30 und TF-31 festgestellt (p = 0,036). Zu Beginn und am Ende des ersten Laufblockes wurden in allen Fermentern etwas höhere Werte beobachtet (~40,2 mg/g uS), als in der Zulagephase (~33,9 mg/g uS). L35–L38 Cadaverin im festen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes verhielt sich analog zum ersten Laufblock, zeigte jedoch mit 19,5–24,9 mg/g uS insgesamt niedrigere Werte. Die Testfermenter (TF-33 und TF-33mS) wiesen ebenfalls geringgradig höhere Werte als die Kontrollfermenter in der Zulagephase auf (+1,8 % bis +3,1 %). Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen KF-32 und TF-33 bzw. TF-33mS festgestellt werden.

Ergebnisse

108

4.5.15 Vorkommen von gelöstem L-Lysin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.24 sowie Tab. 9.27–9.28)

Abb. 4.24: Lösliches L-Lysin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

5

10

15

20

25

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


#* * * ##

0

5

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20

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8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 35-38

#

* °*#

Ergebnisse

109

L31–L34 Im festen Fermenterinhalt zeigten sich L-Lysingehalte von 7,3–19,9 mg/g uS in der Kontrollphase. Dabei lagen die Werte der Kontrollen an den Tagen acht und neun der Einlaufphase deutlich über denen der Testfermenter (~18 mg/g uS vs. ~7,5 mg/g uS bzw. +56 %). Am ersten Tag der Zulagephase sanken die Gehalte in den Test-fermentern auf ~5,8 mg/g uS ab und bewegten sich bis Tag 14 gen null. Mit Ende der Zulage von Schadsilagen an Tag 20 konnten wieder L-Lysingehalte in den Testfermentern gemessen werden, die sich in der Phase der Erholung erst an Tag 25 wieder im Bereich der Kontrollfermenter einpendelten. Signifikante Unterschiede ergaben sich nur zwischen den Kontroll- und den Testfermentern von Tag 12, 13, 20 und 23 (p = 0,008–0,045). L35–L38 Der zweite Laufblock ergab in seiner Kontrollphase L-Lysinspiegel von 5,6–7,8 mg/g uS. Hier lagen keine unterschiedlich hohen Werte in der Kontrollphase bei KF-32, TF-33 und TF-33mS vor. Die Testfermenter stiegen mit Beginn der Zulage-phase analog zum flüssigen Fermenterinhalt des zweiten Laufblocks an (+72 % bzw. +90 %) und erreichten Werte von 11,6–13,0 mg/g uS. Mit der Erholungsphase pendelten sich alle Fermenter mit vergleichbaren Werten ein, sodass TF-33 und TF-33mS an Tag 21 wieder Werte von ~2,2–4,0 mg/g uS aufwiesen. Geringe, signifikante Unterschiede ergaben sich zwischen Test- und Kontrollfermentern von Tag 11 bis Tag 13 (p = 0,017–0,042). Die Sojazulage bedingte nur an Tag 13 einen signifikanten Unterschied zwischen den Testfermentern. Im Vergleich der beiden Laufblöcke verhielt sich die Datenlage von L-Lysin im festen Fermenterinhalt ähnlich wie im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.12). Der zweite Laufblock zeigte höhere L-Lysingehalte im festen Fermenterinhalt der Testfermenter, wohingegen im ersten Laufblock die Gehalte der Testfermenter in der Zulagephase auf null zurückgingen.

Ergebnisse

110

4.5.16 Vorkommen von gelöstem Putrescin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.25 sowie Tab. 9.31Tab. 9.67–9.32)

Abb. 4.25: Lösliches Putrescin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

5

10

15

20

25

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

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KF-30

TF-31

TF-31mS

Lauf 31-34Lauf 31-34* **##

***#

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5

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8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

l]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

° ***

*** * * **

## ######

Ergebnisse

111

L31–L34 Im festen Fermenterinhalt konnten ähnliche Verhältnisse für Putrescin beobachtet werden wie im flüssigen Fermenterinhalt. Dabei wurden in der Kontrollphase 17,3–21,4 mg/g uS gemessen. Mit Beginn der Zulagephase sanken die Werte der Testfermenter auf 8,7–10,9 mg/g uS ab (-30,4 % bis -27,5 % gegenüber der Kontrolle). Es ergab sich kein Unterschied zwischen TF-31 und TF-31mS. Schon an Tag 21 der Erholungsphase erreichten die Testfermenter wieder Werte im Bereich der Kontrollen (~12 mg/g uS). Vereinzelt waren statistisch signifikante Unterschiede von TF-31 bzw. TF-31mS gegenüber KF-30 an Tag 9,11 und 12 bzw. 16–18 zu beobachten (p = 0,006–0,044). Die Sojazulage zeigte keinen Einfluss auf die Putrescingehalte. L35–L38 In der Kontrollphase des zweiten Laufblockes pendelte sich Putrescin bei 6,8–7,1 mg/g uS ein. Die Gehalte von TF-33 und TF-33mS fielen in der Zulagephase deutlich unter die von KF-32 auf 5,1–6,4 mg/g uS (-19 %). Analog zum ersten Laufblock unterschieden sich die Testfermenter mit bzw. ohne Sojazulage nicht von-einander. Mit Beginn der Erholungsphase an Tag 20 erreichten TF-33 und TF-33mS wieder Werte im Bereich von KF-32 (6,8–7,2 mg/g uS). Signifikante Unterschiede ergaben sich jeweils zwischen TF-33 und KF-32 an den Tagen 12–17 und zwischen TF-33mS und KF-32 an den Tagen 12–19 (exkl. Tag 17; p = 0,007–0,031). Die Putrescingehalte im festen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes zeigten einen ähnlichen Verlauf wie im ersten Laufblock, waren aber generell geringer.

Ergebnisse

112

4.5.17 Vorkommen von gelöstem Spermidin im festen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.26 sowie Tab. 9.35–9.36)

Abb. 4.26: Lösliches Spermidin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

Tag

KF-30

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** *

°

#

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8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

*** ****### ## ##

**

Ergebnisse

113

L31–L34 Im festen Fermenterinhalt lagen die Spermidinwerte der Kontrollphase bei 1,6–2,1 mg/g uS. Von Tag 12 bis Tag 20 der Zulagephase fielen die Spermidingehalte in den Testfermentern unter die der Kontrollfermenter auf 1,2–1,4 mg/g uS (-7 % bis -15 %). TF-31mS hatte dabei bis in die Erholungsphase hinein höhere Werte als TF-31. In der Erholungsphase erreichten die Testfermenter an Tag 22 wieder Werte im Bereich von KF-30. Vereinzelt traten statistische Signifikanzen zwischen den Kontroll- und den Testfermentern an Tag 9, 10 und 27 auf (p = 0,007–0,046). Außerdem konnte an Tag 18 ein signifikanter Unterschied zwischen TF-31 und TF-31mS beobachtet werden (p = 0,034). L35–L38 Im zweiten Laufblock pendelten sich die Spermidingehalte in der Kontrollphase bei 0,7–0,9 mg/g uS im festen Fermenterinhalt ein. Mit der Zulagephase sanken die Werte der Testfermenter im Vergleich zur Kontrolle auf 0,3–0,6 mg/g uS ab (-33 %), jedoch war kein Unterschied zwischen TF-33 und TF-33mS zu beobachten. Die anschließende Erholungsphase ergab an Tag 22 wieder Spermidingehalte im Bereich der Kontrollfermenter (0,9–1,0 mg/g uS). Die ermittelten signifikanten Unterschiede zwischen TF-33 bzw. TF-33mS und KF-31 lagen in der Zulagephase zwischen Tag 11 und 19 vor (p = 0,001–0,028). Die Sojazulage hatte keinen signifikanten Einfluss. Auch hier verhielt sich der zweite Laufblock analog zum ersten Laufblock, wenngleich die Werte allgemein etwas niedriger waren.

Ergebnisse

114

4.5.18 Vorkommen von gelöstem Spermin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.27 sowie Tab. 9.39–9.40)

Abb. 4.27: Lösliches Spermin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

g uS

]

Tag

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]

Tag

KF-32

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Lauf 35-38

°

#

°

Ergebnisse

115

L31–L34 Im festen Fermenterinhalt des ersten Laufblockes lag Spermin unter Kontrollfütterung mit 0,1–0,2 mg/g uS vor. Die folgende Zulagephase ergab kontinuierlich messbare Spermingehalte für KF-30, während in TF-31 an den Tagen 13,14 und 17 und in TF-31mS an den Tagen 16 und 18 kein Spermin nachgewiesen wurde. Dabei lagen die Gehalte der Testfermenter unter denen der Kontrollen (-40 %). Mit der messbaren Erholungsphase pendelten sich alle Fermenter wieder bei 0,1–0,2 mg/g uS an Tag 20 ein. Lediglich an Tag 12 hatte die Sojazulage einen signifikanten Einfluss. L35–L38 Die Kontrollphase des zweiten Laufblockes ergab im festen Fermenterinhalt Spermin-gehalte von 0,7–0,9 mg/g uS. Mit der Zulagephase sanken die Gehalte in TF-33 und TF-33mS unter die von KF-32 (0,4–0,6 mg/g uS; -32 %), um sich in der Erholungs-phase an Tag 21 wieder im Bereich der Kontrollen bei 0,8–1,0 mg/g uS einzupendeln. Ein signifikanter Einfluss der Sojazulage konnte an Tag 10 und 26 beobachtet werden. Außerdem unterschied sich TF-33 an Tag 18 signifikant von KF-32. Im zweiten Laufblock konnte im Vergleich zum ersten Laufblock an jedem Tag Spermin nachgewiesen werden. Darüber hinaus verhielt sich der Kurvenverlauf überwiegend ähnlich wie der von Putrescin und Spermidin.

Ergebnisse

116

4.5.19 Summe der gelösten Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin im festen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.28 sowie Tab. 9.43–9.44)

Abb. 4.28: Summe von löslichem Putrescin, Spermidin und Spermin

(Summe der PA-Gehalte) im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

5

10

15

20

25

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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Tag

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***

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###

0

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]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

# # # # # ##

** **********

°

#

Ergebnisse

117

L31–L34 Der Kurvenverlauf der Summe der PA-Gehalte im festen Fermenterinhalt war mit dem im flüssigen Fermenterinhalt vergleichbar (s. Abb. 4.16). Gesamtgehalte von 18,6–23,7 mg/g uS wurden in der Kontrollphase gemessen. Die Zulagephase führte zu einem Absinken der Werte in den Testfermentern auf 10,4–13,7 mg/g uS (ca. -27 % im Vergleich zur Kontrolle). Die Sojazulage in TF-31mS ergab keinen Unterschied. Am Tag 22 der Erholungsphase erreichten die Testfermenter wieder Werte im Bereich der Kontrollen. Vereinzelt waren statistisch signifikante Unterschiede der Testfermenter gegenüber KF-30 an Tag 10, 12 und 13 bzw. Tag 17–19 zu beobachten (p = 0,001–0,043). Die Sojazulage zeigte keinen Einfluss auf die Summe der PA-Gehalte. L35–L38 Allgemein war die Summe der PA-Gehalte im zweiten Laufblock niedriger, zeigte aber einen ähnlichen Verlauf wie im ersten Laufblock. In der Kontrollphase des zweiten Laufblockes wurden summierte PA-Gehalte von 7,1–8,3 mg/g uS erfasst. Die Test-fermenter fielen in der Zulagephase deutlich unter die Kontrollfermenter auf 5,3–7,0 mg/g uS (-19 %). Wie im ersten Laufblock unterschieden sich TF-33 und TF-33mS nicht voneinander. Mit Beginn der Erholungsphase an Tag 20 erreichten die Testfermenter wieder Werte im Bereich von KF-32. Vom Tag 10–18 ergaben sich signifikante Unterschiede in den PA-Gehalten jeweils zwischen den Test- und den Kontrollfermentern (p = 0,005–0,044). Zwischen den Testfermentern mit bzw. ohne Sojazulage konnte am Tag 10 sporadisch ein signifikanter Unterschied beobachtet werden. Betrachtete man die Summe der PA-Gehalte im festen und im flüssigen Fermenterinhalt, so zeigte sich in beiden Gruppen ein deutlicher Einfluss der Putrescinwerte.

Ergebnisse

118

4.5.20 Vorkommen von gelöstem m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) im festen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.29 sowie Tab. 9.45 u. 9.46; s. Kap. 3.2.4.5.18 )

Abb. 4.29: Lösliches m/z 173 (möglicherweise Thermospermin; s. Kap. 3.2.4.5.18) im festen

Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

050

100150200250300350

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[mg/

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Tag

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* °

###

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050

100150200250300350

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

#*°

Ergebnisse

119

L31–L34 Das Masse-zu-Ladungsverhältnis m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) war nur im festen Fermenterinhalt nachweisbar. Zu Beginn der Kontrollphase wurden Gehalte von 154–211 mg/g uS gemessen. Die Zulagephase verringerte die Gehalte der Testfermenter auf 76,8–120 mg/g uS, das entspricht einem Verlust von -48 % gegenüber der Kontrolle. An Tag 21 der Erholungs-phase pendelten sich Kontroll- und Testfermenter wieder auf einem Level ein. Signifikante Unterschiede konnten von Tag 12 bis 19 vorrangig zwischen KF-30 und TF-31 beobachtet werden (p = 0,001–0,042), jedoch ergaben sich auch an Tag 12, 22 und 25 noch signifikante Unterschiede durch die Sojazulagen zwischen TF-31 und TF-31mS. L35–L38 In der Kontrollphase des zweiten Laufblockes wurden deutlich geringere Gehalte von 85,1–91,2 mg/g uS gemessen. In der Zulagephase lagen die Gehalte der Testfer-menter über denen der Kontrollen bei 58,3–74,9 mg/g uS (+14 %). Mit Tag 20 in der Erholungsphase glichen sich Test- und Kontrollfermenter wieder einander an. Sporadisch konnten an Tag 17 und 18 signifikante Unterschiede in den Fermentern beobachtet werden (p = 0,024–0,044). Die Sojazulage ergab weder im ersten noch im zweiten Laufblock deutliche Unterschiede in den Testfermentern. Im Vergleich hatte der erste Laufblock etwa 10fach höhere Werte von m/z 173 in allen Fermentern und auch einen sehr viel deutlicheren Unterschied zwischen den Kontroll- und den Testfermentern. Zudem lagen die Werte von TF-31 und TF-31mS über denen von KF-30, während sich das Verhältnis im zweiten Laufblock umgekehrt darstellte.

Ergebnisse

120

4.5.21 Vorkommen von gelöstem L-Arginin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.30 sowie Tab. 9.49–9.50)

Abb. 4.30: Lösliches L-Arginin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,00

0,20

0,40

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0,80

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8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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0,00

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g uS

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Tag

KF-32

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Lauf 35-38

°#°

Ergebnisse

121

L31–L34 Im ersten Laufblock zeigte sich L-Arginin mit Gehalten von 0,3–0,5 mg/g uS im festen Fermenterinhalt in der Kontrollphase. Von Tag 10 bis Tag 16 konnten in der Zulage-phase mit 0,2–0,4 mg/g uS geringfügig höhere L-Argininwerte in den Testfermentern im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt werden (+46 %). Von Tag 16 bis in die Erholungsphase waren keine Unterschiede mehr zwischen TF-31 bzw. TF-31mS und KF-30 erkennbar. Sporadisch waren signifikante Unterschiede zwischen TF-31 und TF-31mS an Tag 28 sowie zwischen KF-30 und TF-31mS an Tag 12 und 23 zu verzeichnen. L35–L38 Im zweiten Laufblock ergaben die Kontrollphase Werte von 0,2–0,3 mg/g uS in allen Fermentern. Auch hier unterschieden sich die Testfermenter am Beginn der Zulage-phase mit 0,2–0,4 mg/g uS in geringem Maß von den Kontrollen (+14 % bis +25 %). Ab Tag 15 und in der Erholungsphase waren keine Unterschiede mehr zu verzeichnen. Die Werte der Erholungsphase lagen bei 0,3 mg/g uS in allen Fermentern. Signifikante Unterschiede konnten vereinzelt an den Tag an 13, 20 und 26 nur zwischen Test- und Kontrollfermentern beobachtet werden. Im Vergleich zum ersten Laufblock war bemerkenswert, dass der Beginn der Zulagephase in letzterem deutlich unter-schiedliche Gehalte zwischen den Fermentergruppen erzeugte

Ergebnisse

122

4.5.22 Vorkommen von gelöstem L-Ornithin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.31 sowie Tab. 9.53–9.54)

Abb. 4.31: Lösliches L-Ornithin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

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Tag

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TF-31mS


Ergebnisse

123

L31–L34 Im festen Fermenterinhalt konnte über die Versuchsdauer des ersten Laufblockes generell ein leichter Abfall der L-Ornithingehalte festgestellt werden. Dabei unter-schieden sich die Fermentergruppen nicht wesentlich. In der Kontrollphase lagen die Werte zwischen 0,6–0,8 mg/g uS. Die Zulagephase ergab zu Beginn bis Tag 14 geringgradig höhere Werte in den Testfermentern im Vergleich zur Kontrolle (0,5 mg/g uS; +9 % bis +17 %). Die weiteren Tage der Zulagephase ergaben keine Unterschiede mehr zwischen Test- und Kontrollfermentern. In der Erholungsphase lagen die Gehalte von L-Ornithin bei 0,3–0,5 mg/g uS. Signifikante Unterschiede konnten nicht festgestellt werden. L35–L38 Die L-Ornithingehalte zwischen den Fermentergruppen zeigten im zweiten Laufblock keine Unterschiede. Durchweg konnten in der Kontroll-, Zulage- und Erholungsphase Werte von 0,4–0,5 mg/g uS gemessen werden. Die Testfermenter zeigten dabei gemittelt keine prozentuale Abweichung der Gehalte von L-Ornithin. Nur an Tag 24 trat eine geringe Signifikanz zwischen TF-32mS und KF-32 auf. Im Vergleich der Laufblöcke ist hier hervorzuheben, dass sich Kontroll- und Testfermenter im ersten Laufblock von Tag 10 bis Tag 14 in der Zulagephase in geringem Maß unterschieden, während im zweiten Laufblock kein Unterschied zu beobachten war.

Ergebnisse

124

4.5.23 Vorkommen von gelöstem L-Methionin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.32 sowie Tab. 9.57–9.58)

Abb. 4.32: Lösliches L-Methionin im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

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8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

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g uS

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Tag

KF-30

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TF-31mS

Lauf 35-38*

**

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8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

[mg/

g uS

]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


Ergebnisse

125

L31–L34 Analog zu den Gegebenheiten im flüssigen Fermenterinhalt konnte auch im festen Fermenterinhalt L-Methionin im ersten Laufblock nur sporadisch gemessen werden. In der Kontrollphase war L-Methionin nicht nachweisbar. In der Zulagephase erstreckten sich die Gehalte von 1,0–2,9 mg/g uS. Die Erholungsphase ergab mit 1,2–1,6 mg/g uS ähnlich gestreute Werte. Zum Ende des Laufblockes trat in allen Fermentern mehr L-Methionin auf. L35–L38 Im zweiten Laufblock konnte L-Methionin, ähnlich wie im flüssigen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.19), durchgängig gemessen werden. Die Kontrollphase ergab Gehalte von 1,9–3,8 mg/g uS in allen Fermentern. Mit der Zulagephase stiegen die Gehalte in den Testfermentern erst ab Tag 12 auf 2,7–8,5 mg/g uS an (+53 % bzw. +47 % gegenüber der Kontrolle). In der Erholungs-phase erreichten TF-33 und TF-33mS an Tag 23 wieder ähnliche L-Methioningehalte wie KF-32 (2,0–3,6 mg/g uS). Sporadisch konnten an den Tagen 16 und 26 sig-nifikante Unterschiede zwischen KF-32 und TF-33 festgestellt werden. Wie schon im flüssigen Fermenterinhalt ist auch im festen Fermenterinhalt bei Vergleich der beiden Laufblöcke auffällig, dass im ersten Laufblock nur vereinzelt L-Methionin nachweisbar war, während L-Methionin im zweiten Laufblock kontinuierlich gemessen werden konnte. Auch im festen Fermenterinhalt lagen die L-Methioningehalte von TF-33 und TF-33mS in der Zulagephase über denen von KF-32.

Ergebnisse

126

4.5.24 Summe der löslichen Aminosäuren L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin im festen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.33 sowie Tab. 9.61–9.62)

Abb. 4.33: Summe von löslichem L-Arginin, L-Ornithin und L-Methionin

(Summe der AS-Gehalte) im festen Fermenterinhalt [mg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0,0

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4,0

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8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

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KF-30

TF-31

TF-31mS


°## *

Ergebnisse

127

L31–L34 Im festen Fermenterinhalt zeigten sich analog zum flüssigen Fermenterinhalt des ersten Laufblockes (s. Abb. 4.20) keine wesentlichen Unterschiede in den AS-Gehalten der Fermentergruppen. In der Kontrollphase wurden Konzentrationen im Bereich von 1,0–1,2 mg/g uS ermittelt. In der Zulagephase lagen die Werte mit breiterer Schwankung zwischen 0,7–2,4 mg/g uS. Die Testfermenter hatten dabei gemittelt keine Abweichungen AS-Gehalte gegenüber den Kontrollen. Auch in der Erholungsphase bewegten sich die Werte zwischen 0,8–2,0 mg/g uS. Vereinzelt traten an den Tagen 12 und 13 Signifikanzen zwischen Test- und Kontrollfermentern auf. L35–L38 Im festen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes spiegelte sich ein ähnlicher Verlauf wie im flüssigen Fermenterinhalt des zweiten Laufblockes wider (s. Abb. 4.20). Die AS-Gehalte der Kontrollphase erstreckten sich von 2,5–3,7 mg/g uS. Die Gehalte in den Testfermentern stiegen in der Zulagephase auf 3,4–9,2 mg/g uS, während die Kontrollen Gehalte von 2,7–3,8 mg/g uS aufwiesen. TF-33 und TF-33mS hatten im Mittel um +34 % höhere Aminosäuregehalte als KF-32. Ab Tag 22 der Erholungsphase pendelten sich die Fermentergruppen wieder mit vergleichbaren Werten ein. Zwischen TF-33 und KF-32 konnten vereinzelt an Tag 17 und 26 signifikante Unterschiede festgestellt werden. Im Vergleich zum ersten Laufblock ist hier hervorzuheben, dass sich Kontroll- und Testfermenter nur im zweiten Laufblock in der Zulagephase unterschieden. Allgemein wurden auch höhere Werte im zweiten Laufblock gemessen. Die Summe der Aminosäuren ist maßgeblich durch die gemessenen Gehalte von L-Arginin und L-Ornithin beeinflusst.

Ergebnisse

128

4.5.25 Vorkommen von gelöstem β-Alanin im festen Fermenterinhalt (s. Abb. 4.34 sowie Tab. 9.65–9.66)

Abb. 4.34: Lösliches b-Alanin im festen Fermenterinhalt [µg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

50

100

150

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]

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50

100

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8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µg/

g uS

]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

**

#

*#

°

Ergebnisse

129

L31–L34 Konzentrationen von 64,4–80,2 µg/g uS für b-Alanin wurden in der Kontrollphase im festen Fermenterinhalt gemessen. Die Zulage ergab keine erkennbaren Unterschiede zwischen Kontroll- und Testfermentern im ersten Laufblock, sodass auch statistisch nur an Tag 14 und 17 sporadisch ein signifikanter Unterschied zwischen TF-31 bzw. TF-31mS und KF-30 nachweisbar war. Insgesamt sanken die Werte über die Dauer des Versuchs ab. Dabei ergaben sich am Ende in der Erholungsphase Gehalte von 45,2–81,2 µg/g uS. L35–L38 Analog zum ersten Laufblock stiegen die Gehalte von b-Alanin in der Kontrollphase mit 44,6–58,3 µg/g uS ein. Wie im flüssigen Fermenterinhalt konnte während der Zulagephase von Tag 10–17 ein Unterschied zwischen Kontroll- und Testfermentern beobachtet werden, jedoch wiesen diesmal die Testfermenter im zweiten Laufblock mit 52,7–77,2 µg/g uS die höheren Werte auf (+45 %). Mit Tag 19 begannen die Werte sich wieder auf einem ähnlichen Level in allen Fermentern einzufinden. Statistisch konnten signifikante Unterschiede zwischen Test- und Kontrollfermentern an Tag 12, 13 und 18 nachgewiesen werden (p = 0,005–0,024) und zwischen den Testfermentern mit bzw. ohne Sojazulage wurde eine Signifikanz an Tag 27 festgestellt. Zusammenfassend war feststellbar, dass sich der Verlauf von b-Alanin im zweiten Laufblock durch die höheren Gehalte in den Testfermentern im Vergleich zur Kontrolle unterschied. Generell wurde jedoch im flüssigen und im festen Fermenterinhalt kein wesentlicher Einfluss der Sojazulage beobachtet. Auch die gezackten Kurvenverläufe waren allen Messungen von b-Alanin gemein.

Ergebnisse

130

4.5.26 Vorkommen von gelöstem GABA im festen Fermenterinhalt

(s. Abb. 4.35 sowie Tab. 9.69–9.70)

Abb. 4.35: Lösliches GABA-Gehalte im festen Fermenterinhalt [µg/g uS] 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

0

10

20

30

40

50

60

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µg/

g uS

]

Tag

KF-30

TF-31

TF-31mS


°°°

°°°

°* °°

0

20

40

60

80

100

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[µg/

g uS

]

Tag

KF-32

TF-33

TF-33mS

Lauf 35-38

°° °°

° * °* °°

* °**

°°°

###

#####

°

°°

°°

##

* °

°°

Ergebnisse

131

L31–L34 Die Kontrollphase im festen Fermenterinhalt zeigte GABA-Gehalte von 20,4–31,5 µg/g uS in allen Fermentern. Mit der Zulage von Schadsilage stiegen die Gehalte in den Testfermentern auf 26,3–35,3 µg/g uS an (jeweils +33 % gegenüber der Kontrolle). TF-31 hatte dabei um rund 3 % höhere Gehalte als TF-31mS. Sobald die Erholungsphase einsetzte, sanken die GABA-Gehalte bis Tag 21 schnell ab, um sich an Tag 22 wieder im Bereich der Kontrollen bei 18,2–22,7 µg/g uS einzupendeln. Auffällig waren die signifikanten Unterschiede zwischen TF-31 und TF-31mS an Tag 10, 12 und 21–23 sowie 25 und 26. Außerdem ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen KF-30 und TF-31 an Tag 12. L35–L38 Im zweiten Laufblock pendelten sich die GABA-Gehalte in der Kontrollphase bei 29,8–33,1 µg/g uS ein. Analog zum ersten Laufblock stiegen die Gehalte mit der Zulage von Schadsilage in den Testfermentern auf 44,5–71,7 µg/g uS an (+75 % bzw. +101 %) und fanden ein plateauähnliches Gleichgewicht. Auch hier unterschieden sich die Gehalte in den Testfermentern, sodass TF-33 und TF-33mS im Mittel um 10 % höhere GABA-Gehalte aufwiesen als KF-32. Mit dem Ende der Zulagephase sanken die GABA-Gehalte bis Tag 20 schnell ab und pendelten an Tag 21 wieder im Bereich der Kontrollen bei 21,6–23,9 µg/g uS ein. Über die Zulagephase und auch an jedem zweiten Tag der Erholungsphase zeigten sich gering- bis hochgradig signifikante Unterschiede sowohl zwischen KF-32 und TF-33 bzw. TF-33mS als auch zwischen TF-33 und TF-33mS. Im Vergleich konnte festgestellt werden, dass sich der Verlauf der GABA-Gehalte in beiden Laufblöcken ähnelte, die absoluten Werte jedoch im zweiten Laufblock deutlich höher waren. Außerdem hatte die Sojazulage von TF-33mS im zweiten Laufblock öfter einen signifikanten Einfluss als selbige in TF-31mS im ersten Laufblock (p = <0,001–0,049).

Ergebnisse

132

4.6 Zusammenfassung der erhobenen Ergebnisse

Aufgrund der Vielzahl der Ergebnisse soll an dieser Stelle eine Übersicht gegeben werden. Dafür wurde für alle gemessenen Polyamine und Aminosäuren sowie für Ammoniak und für die i-Butter- bzw. die i-Valeriansäure zum einen die mittlere prozentuale Abweichung der Testfermenter im Vergleich zur Kontrolle während der Zulagephase (Tag 10–19) berechnet (s. Tab. 4.1). In einer zweiten Darstellung wurde die Richtung der prozentualen Abweichungen optisch mit Pfeilen aufgearbeitet. Dabei wurde die quantitative Abweichung der Ergebnisse der Testfermenter von den Kontroll-fermentern nach oben bzw. nach unten prozentual unterschieden (Abstufung: < 10 % (↑); 10–30 % ↑, 30–60 % ↑↑; > 60 % ↑↑↑). Es konnte beobachtet werden, dass die Ammoniakgehalte und die Gehalte der flüchtigen i-Fettsäuren in den Testfermentern gegenüber den Kontrollfermentern deutlich anstiegen. Bei den Polyaminen war auffällig, dass alle Polyamine im flüssigen und im festen Fermenterinhalt mit Ausnahme von Cadaverin und dem Polyaminabbauprodukt GABA während der Zulagephase geringere Werte in den Testfermentern aufwiesen (-7,8 % bis -66 %). Cadaverin zeigte keinen nennenswerten Unterschied zwischen Test- und Kontroll-fermentern. GABA hingegen verhielt sich gegensätzlich in den verschiedenen Lauf-blöcken (s. Tab. 4.1) Die Aminosäuren stiegen in summa in den Testfermentern während der Zulagephase um +1,5 % bis +25 % im flüssigen und um +2,2 % bis +54,3 % im festen Fermenter-inhalt an (exkl. L-Lysin, L-Methionin und L-Arginin im festen Fermenterinhalt, s. Tab. 4.1). Der L-Lysinspiegel zeigte in den Laufblöcken ähnlich wie GABA entgegengesetzte Entwicklungen gegenüber der Kontrolle. L-Methionin stieg zwar überwiegend, wie alle anderen Aminosäuren in den Testfermentern gegenüber der Kontrolle an, konnte aber im ersten Laufblock nur lückenhaft nachgewiesen werden, was z.T. hohe prozentualen Abweichungen von -2,5 % bis +81 % verursachte. L-Arginin zeigte in den Ergebnissen des festen Fermenterinhaltes unterschiedliche Ausrichtungen in den Laufblöcken (rund +38,5 bis +55 % bzw. -9,3,3 bis -14,3 %), während es im flüssigen Fermenterinhalt analog zu den anderen Aminosäuren anstieg (s. Tab. 4.1).

Ergebnisse

133

Tab. 4.1: Tägliche mittlere prozentuale Abweichungen der gemessenen Parameter in den Testfermentern im Vergleich zur Kontrolle während der Zulagephase Tag 11–19

Fermenter Parameter TF-31 TF-33 TF-31mS TF-33mS

Überstandsvolumina +5,5 +4,5 +5,2 +4,4 Ammoniakgehalt +168 +953 +200 +1041

Konzentrationen der FlFS

i-Buttersäure +54,7 +88,8 +66,8 +96,7 i-Valeriansäure +131 +133 +136 +141

Produktionen der FlFS

i-Buttersäure +60,0 +108 +68,5 +115 i-Valeriansäure +155 +146 +156 +151

Konzentrationen der Polyamine und Aminosäuren im flüssigen Fermenterinhalt

Cadaveringehalt -15,1 +11,2 -11,3 +8,3 Putrescingehalt -36,1 -58,8 -46,2 -66,3 Spermidingehalt -34,1 -60,3 -46,9 -66,4 Spermingehalt -13,5 -21,6 +5,4 -25,6 Summe PA-Gehalte -35,8 -58,4 -46,6 -65,9 Gehalt von m/z 173 (mögl. Thermospermin) n.n. n.n. n.n. n.n.

β-Alaningehalt -14,6 -27,7 -25,8 -26,2 L-Lysingehalt -65,3 +48,4 -64,4 +51,3 L-Arginingehalt +1,6 +14,3 +7,1 +25,1 L-Ornithingehalt +25,4 +19,2 +23,2 +24,8 L-Methioningehalt -2,51 +81,4 +70,41 +67,4

Summe AS-Gehalte -4,61 +55,9 +2,81 +47,3

GABA-Gehalt -38,11 +127,8 -33,91 +126,2 Konzentrationen der Polyamine und Aminosäuren im festen Fermenterinhalt

Cadaverin +3,7 +1,8 +3,0 +3,1 Putrescingehalt -30,4 -19,3 -27,5 -19,4 Spermidingehalt -15,8 -34,1 -7,8 -31,7 Spermingehalt -43,91 -31,1 -37,91 -22,5 Summe PA-Gehalte -29,8 -19,2 -24,2 -19,4 Gehalt von m/z 173 (mögl. Thermospermin) -51,7 +15,8 -44,8 +13,4

β-Alaningehalt +14,0 -49,3 +4,6 -42,1 L-Lysingehalt -85,7 +72,7 -88,0 +90,4 L-Arginingehalt +54,3 -14,3 +38,5 -9,3 L-Ornithingehalt +9,14 +2,21 +17,7 -1,93 L-Methioningehalt +12,11 +36,8 -17,91 +10,5

Summe AS-Gehalte +13,51 +35,8 +10,81 +32,9

GABA-Gehalt +34,9 +75,4 +31,7 +102 1 keine kontinuierlichen, täglichen Messergebnisse bei L-Methionin und GABA im ersten Laufblock

Ergebnisse

134

Tab. 4.2: Tendenz der mittleren täglichen Abweichung der Messergebnisse der Zulage im Vergleich zur Kontrolle in L31–L34 bzw. L35–L38 in vier Abstufungen [%; s.u.]

Polyamin L31–L34 L35–L38 Aminosäure L31–L34 L35–L38

Polyamine und korrespondierende Aminosäuren im flüssigen Fermenterinhalt

Cadaverin ↓ ↑ L-Lysin ↓↓↓ ↑↑

Putrescin ↓↓ ↓↓ L-Arginin (↑) ↑ L-Methionin (↓)1 ↑↑↑ L-Ornithin ↑ ↑

Spermidin ↓↓ ↓↓↓ L-Arginin (↑) ↑ L-Methionin (↓)1 ↑↑↑ L-Ornithin ↑ ↑

Spermin ↓ ↓ L-Arginin (↑) ↑ L-Methionin (↓)1 ↑↑↑ L-Ornithin ↑ ↑

Summe PA ↓↓ ↓↓ Summe AS (↑)1 ↑↑ m/z 173 (mögl. Thermo-spermin)

n.n. n.n. L-Arginin (↑) ↑ L-Methionin (↓)1 ↑↑↑ L-Ornithin ↑ ↑

β-Alanin ↓ ↓ L-Asparaginsäure n.n. n.n. GABA ↓↓1 ↑↑↑

Polyamine und korrespondierende Aminosäuren im festen Fermenterinhalt

Cadaverin (↑) (↑) L-Lysin ↓↓↓ ↑↑↑

Putrescin ↓↓ ↓ L-Arginin ↑↑ ↓ L-Methionin ↑1 ↑↑ L-Ornithin (↑) (↑)

Spermidin ↓ ↓↓ L-Arginin ↑↑ ↓ L-Methionin ↑1 ↑↑ L-Ornithin (↑) (↑)

Spermin ↓↓1 ↓↓ L-Arginin ↑↑ ↓ L-Methionin ↑1 ↑↑ L-Ornithin (↑) (↑)

Summe PA ↓ ↓ Summe AS ↑1 ↑↑ m/z 173 (mögl. Thermo-spermin)

↓↓ ↑ L-Arginin ↑↑ ↓ L-Methionin ↑1 ↑↑ L-Ornithin (↑) (↑)

β-Alanin ↑1 ↓↓ L-Asparaginsäure n.n. n.n. GABA ↑↑ ↑↑↑

TF > KF (↑); TF < KF (↓); keine Unterschiede zwischen TF und KF ↔; n.n. nicht nachweisbar Abstufung: < 10 % (↑); 10 – 30 % ↑, 30 – 60 % ↑↑; <60 % ↑↑↑ 1 keine kontinuierlichen, täglichen Messergebnisse; * fragliche Messergebnisse s. Kap. 4.59

Ergebnisse

135

4.7 Vergleich der Amin- und Aminosäuregehalte im RUSITEC und in den eingesetzten Grassilagen

Um die Ergebnisse der Polyamine und der Aminosäuren aus den RUSITEC-Fermentern entsprechend evaluieren zu können und den Input in den RUSITEC mit dem Output aus selbigem in Form von löslichen Stoffen aus dem festen Fermenter-inhalt und Konzentrationen der Stoffe im flüssigem Fermenterinhalt zu vergleichen, wurden auch jeweils 100 mg der im RUSITEC eingesetzten und zur Lagerung gefrier-getrockneten Grassilagen mit der in Kapitel 3.2.4.5.6 beschriebenen Methode aufbereitet und gemessen. Die Ergebnisse der Polyamine und Aminosäuren aus den Grassilagen wurden für den Vergleich mit den Fermenterergebnissen entsprechend in mg/g uS für den festen Fermenterinhalt und in µmol Gesamtmenge (totale tägliche Eingabe in den RUSITEC) für den flüssigen Fermenterinhalt umgerechnet. Dabei wurden die Messwerte aus den eingesetzten Grassilagen den gemittelten Messwerten aus den Fermentern während der Zulagephase (Tag 10–19) gegenübergestellt (s. Tab. 4.3). Weitere Messwerte zu den Grassilagen sind in Tabelle 9.3 und Abb. 9.5–Abb. 9.7 aufgeführt.

Ergebnisse

136

Tab. 4.3: Vergleich der gelösten Amin- und Aminosäuregehalte im festen Fermenterinhalt des RUSITECS in den Kontroll- bzw. Testfermentern während der Zulagephase (Mittelwerte) mit den gelösten Gehalten aus 100 mg TS gefriergetrockneter Grassilage [umgerechnet in mg/g uS]

Parameter Fer-menter

L31–L34 KF-30 TF-31

L35–L38 KF-32 TF-33

K-30 S-31

K-32/ S-33

Fester Fermenterinhalt [mg/g uS]

Grassilagen [mg/g uS]

Cadaverin KF 32,9 23,1 89,3 99,8 TF 33,9 23,7 197 200

Putrescin KF 15,5 7,6 14,9 16,2 TF 11,0 6,1 36,4 42,5

Spermidin KF 1,7 0,8 2,4 1,5 TF 1,5 0,6 6,1 22,3

Spermin KF 0,1 0,2 4,6 4,8 TF 0,1 0,2 2,2 3,4

Summe PA KF 17,3 8,6 21,8 22,5 TF 12,5 6,8 44,1 68,3

m/z 173 (mögl. Thermospermin)

KF 215 61,7 0,03 0,03

TF 115 70,6 0,10 0,14

β-Alanin KF 0,1 0,1 1,5 1,2 TF 0,1 0,1 4,3 5,2

GABA KF 0,02 0,03 0,2 0,2 TF 0,03 0,05 0,6 0,7

L-Lysin KF 6,4 5,2 30,7 43,8 TF 2,7 9,6 56,4 156

L-Arginin KF 0,3 0,3 7,8 3,5 TF 0,3 0,3 2,2 2,8

L-Methionin KF 1,1* 2,9 5,9 12,3 TF 1,2* 4,2 26,5 38,3

L-Ornithin KF 0,4 0,5 1,8 1,8 TF 0,5 0,5 4,1 3,9

Summe AS KF 1,8 3,6 15,5 17,5 TF 2,0 4,9 32,8 45,0

n.n nicht nachweisbar, * breitere Schwankung, da keine kontinuierlichen, täglichen Messergebnisse

Ergebnisse

137

Fortsetzung Tab. 4.3: Vergleich der Amin- und Aminosäuregehalte im flüssigen Fermenterinhalt des RUSITECS in den Kontroll- bzw. Testfermentern während der Zulagephase (Mittelwerte) mit der Gesamtmenge der löslichen Amine und Aminosäuren aus den täglich zugegebenen Grassilagen (Analyse an der LC-MS/MS aus 100 mg TS gefriergetrockneter Grassilage [µmol])

Parameter Fer-menter

L31–L34 KF-30 TF-31

L35–L38 KF-32 TF-33

K-30/ S-31

K-32/ S-33

Flüssiger Fermenterinhalt [µmol]

Grassilagen [µmol]

Cadaverin KF 29,8 26,3 3749 3644 TF 25,1 28,5 3854 3896

Putrescin KF 39,5 51,4 650,0 761,3 TF 31,4 19,3 827,4 963,9

Spermidin KF 10,8 4,2 62,6 43,5 TF 6,4 1,5 84,1 306,6

Spermin KF 0,4 0,8 87,5 98,3 TF 0,4 0,6 21,3 33,8

Summe PA KF 61,5 56,4 926,1 902 TF 43,8 21,4 932,4 1302

m/z 173 (mögl. Thermospermin)

KF n.n. n.n. 12926 14595 TF n.n. n.n. 8337 7056

β-Alanin KF 0,4 0,3 64,6 57,4 TF 0,3 0,2 97,7 117,6

GABA KF 0,03* 0,1 14,4 16,9 TF 0,02* 0,1 29,4 40,0

L-Lysin KF 176 9,2 811,7 1250 TF 66,2 12,9 773,9 2142

L-Arginin KF 1,7 1,1 172,2 82,6 TF 1,7 1,3 25,4 32,2

L-Methionin KF 3,1* 10,2 153,3 341,3 TF 4,5* 13,7 354,9 513,5

L-Ornithin KF 2,2 1,7 53,9 55,3 TF 2,7 2,0 61,7 59,3

Summe AS KF 5,1 13,3 379,1 479,9 TF 4,8 16,9 422,1 604,8

n.n. nicht nachweisbar; * breitere Schwankung, da keine kontinuierlichen, täglichen Messergebnisse Im Vergleich der Polyaminergebnisse aus dem festen bzw. flüssigen Fermenterinhalt des RUSITECS mit den Ergebnissen der eingesetzten Grassilagen zeigte sich, ungeachtet der Form des Fermenterinhaltes, ein niedrigerer Gehalt im RUSITEC (exkl. m/z 173). Deutlich hingegen war der höhere Gehalt von m/z 173 (möglicherweise Thermo-spermin) im festen Fermenterinhalt des RUSITECS gegenüber den Gehalten in der Grassilage im Input. Bei dieser Gegenüberstellung muss jedoch das gemessene Probenausgangsmaterial berücksichtigt werden, denn die Analyse wurde aus gefrier-getrockneter Grassilage durchgeführt, wohingegen die Messung der RUSITEC-

Ergebnisse

138

Proben aus dem flüssigen Fermenterinhalt bzw. der Ursprungssubstanz des festen Fermenterinhaltes erfolgte. Um diese Ergebnisse genauer zu beurteilen, muss auch das Verhältnis der Amin- und Aminosäureergebnisse der Kontroll- und der Schadsilagen im Trockensubstanzgehalt zueinander betrachtet werden. Dazu wurden die an der LC-MS/MS aus 100 mg gefriergetrocknetem Probenmaterial analysierten Ergebnisse der Grassilagen (s. Tab. 4.3) in mg/g TS umgerechnet und daraus der prozentuale Gehalt bzw. Mehrgehalt der Stoffe in den Schadsilagen im Vergleich mit den Kontrollsilagen berechnet (s. Tab. 4.4). Tab. 4.4: Prozentualer Gehalt/Mehrgehalt der löslichen Amine bzw. Aminosäuren der

eingesetzten Schadsilage S-31 bzw. S-33 im Vergleich mit den entsprechenden Kontrollsilage K-30 bzw. K-32 [% der TS] (Analyseergebnisse der LC-MS/MS)

Parameter S-31 S-33

Konzentrationen der löslichen Polyamine in den Grassilagen

Cadaveringehalt 425,0 419,9 Putrescingehalt 470,6 544,4 Spermidingehalt 489,6 3085 Spermingehalt 92,1 147,0 Gehalt von m/z 173 (mögl. Thermospermin) 642,2 968,4 β-Alaningehalt 552,3 899,2

Konzentrationen der löslichen Aminosäuren und GABA in den Grassilagen

L-Lysingehalt 353,9 739,1 L-Arginingehalt 54,3 166,0 L-Ornithingehalt 438,8 449,6 L-Methioningehalt 856,3 646,1 GABA-Gehalt 577,9 726,3

Beim Vergleich der Polyamin- bzw. Aminosäuregehalte in der Trockensubstanz der eingesetzten Kontroll- und Schadsilagen wurden für Spermin und L-Arginin in S-31 geringere Konzentrationen als in K-30 bestimmt, während beim Vergleich von K-32 und S-33 höhere Gehalte letztgenannter Stoffe in der Schadsilage gemessen wurden. Bei den übrigen Stoffen Cadaverin, Putrescin, Spermidin, m/z 173 (möglicherweise Thermospermin), β-Alanin, L-Lysin, L-Ornithin, L-Methionin und GABA konnten höhere Gehalte in den Schadsilagen S-31 und S-33 im Vergleich mit den Kontrollsilagen K-30 und K-32 beobachtet werden (s. Tab. 4.4). Aufgrund der geringen Anzahl der vergleichbaren Grassilagen (n = 2) wurden diese Ergebnisse statistisch nicht weiter ausgearbeitet.

Diskussion

139

5 Diskussion

5.1 Intention der Arbeit

Im Rahmen der vorliegenden Verdauungsversuche am RUSITEC sollte die Hypothese untersucht werden, inwieweit die Fütterung von Grassilagen mit einem Reineiweiß-anteil am Rohprotein RE/Rp < 50 % den Gehalt von Polyaminen im Pansen erhöht und welchen Einfluss der Zusatz von Sojaprotein auf letzteren hat. Dabei lag der Fokus auf der Messung der löslichen Polyamine, der korrespondierenden Aminosäuren, des GABA-Gehaltes, des Ammoniakgehaltes und der flüchtigen Fettsäuren i-Buttersäure bzw. i-Valeriansäure, da diese Parameter in den Polyamin- und Proteinstoffwechsel einfließen. Den Hintergrund dieser Untersuchungen bilden das von EICKEN (2005) beschriebene Krankheitsbild bei Milchkühen, das als „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ bezeichnet wird und die Ergebnisse der Datenauswertung einer Aminosäureanalyse von 315 gefriergetrockneten Grassilagen, die eine Reduktion von Arginin in Abhängigkeit vom RE/Rp-Quotienten aufzeigte (s. Kap. 4.3 u. Kap. 4.4). Aufbauend auf den Untersuchungen von GRESNER (2011) und THEERMANN (2011) wurde in der vorliegenden Arbeit der Polyaminstoffwechsel unter vergleichbaren Versuchsbedingungen betrachtet.

5.2 Kritische Betrachtung des Versuchsaufbaus

5.2.1 RUSITEC-System

Die in-vitro-Untersuchungen zur Pansenfermentation wurden im Langzeitinkubations-system RUSITEC modifiziert nach CZERKAWSKI und BRECKENRIDGE (1977) durchgeführt. In den Dissertationen von GAST (2010), GRESNER (2011) und LUMPP (2011) konnte das System bereits erfolgreich zur Untersuchung von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißgehalten eingesetzt werden. Hier wurde das System bereits ausführlich evaluiert und in der Dissertation von GÖRES (2016) befindet sich eine Zusammenfassung der wesentlichen Kritikpunkte. Vor dem Hintergrund des vorliegenden Versuchsansatzes soll daher nur auf ausgewählte Punkte eingegangen werden. Eine Adaptationszeit von mindestens 48 Stunden für ein in-vitro-System des Pansens ist auch bei LENGOWSKI (2016) beschrieben. Aufgrund dessen wurde in den eigenen Versuchen mit der Einlauf- und Kontrollphase von insgesamt acht Tagen ein entsprechendes steady state des Systems generiert (CZERKAWSKI u. BRECKEN-RIDGE 1977). Zur Überprüfung des RUSITEC-Systems auf Dichtigkeit wurden täglich das Gas-volumen, die Kohlendioxid- und die Stickstoffkonzentration in den Fermentern gemessen. Alle drei Parameter befanden sich durchweg im erwarteten Bereich und ließen nicht auf ein undichtes System oder den Einfluss von atmosphärischer Luft während der Fermentation schließen (GÖRES 2016). Die Volumina in den

Diskussion

140

Überlaufgefäßen lagen kontinuierlich bei 338–396 ml/24 h, wobei die Überlaufgefäße der Testfermenter in der Zulagephase die erwarteten höheren Werte durch den höheren Wassergehalt der Schadsilagen erreichten (s. Abb. 9.4 u. Tab. 9.3). Daher kann von einer gleichmäßigen Pufferzufuhr ausgegangen werden. Für die Kontrolle der stabilen Fermentationsleistung wurde die Produktion der flüchtigen Fettsäuren und Gase sowie deren Zusammensetzung in der Arbeit von GÖRES (2016) analysiert. Weiterhin wurden die pH-Werte und die Gehalte an bakteriellem Protein (ILLE 2017) sowie die Bildung von Ammoniak in der vorliegenden Arbeit überprüft. Auch diese Parameter ließen auf eine vitale Pansenflora und Fermentation schließen.

5.2.2 Eingesetzte Futtermittel

Der Schwerpunkt der vorliegenden Untersuchungen orientierte sich durch den Einsatz von Grassilagen mit einem Verhältnis von RE/Rp < 50 % an GAST (2010), GRESNER (2011) und LUMPP (2011). Der Einfluss der botanischen Diversität wurde möglichst geringgehalten (s. Kap. 3.2.1). Alle Grassilagen wurden 2014 geerntet und im Fahrsilo gelagert. Sie waren grob-sinnlich von unauffälliger Beschaffenheit und wurden vom tagesfrischen Anschnitt gewonnen. Zur Lagerung wurden sie unmittelbar nach Entnahme bis zu ihrem Fütterungseinsatz im RUSITEC bei -20°C tiefgefroren. Trotz aller Vorkehrungen kann nicht ganz ausgeschlossen werden, dass die Grassilagen einem weiteren Abbauprozess unterlegen haben könnten (WARD 2000; GRESNER et al. 2015). Die nasschemischen Analysen der Grassilagen am Institut für Tierernährung bestätigten die entsprechende Klassifizierung in Schad- und Kontrollsilagen (S-31 bzw. S-33 und K-30 bzw. K-32) mit einem RE/Rp < 50 % bzw. > 50 % (s. Tab. 3.2). Erhebliche Unterschiede bestanden in den TS-Gehalten zwischen Schad- und Kontrollsilagen (s. Tab. 9.3). Dies könnte einen geringen Einfluss auf die Ergebnisse aus dem festen Fermenterinhalt gehabt haben, da bei der Probengewinnung je 1 g uS aus dem jeweiligen Futterbeutel nach 48 Stunden Inkubation gewonnen wurde. Die Datenauswertung von 315 Grassilagen, bei denen durch EVONIK Nutrition & Care GmbH die Aminosäuregehalte von Arginin, Lysin und Methionin sowie der GABA-Gehalt ermittelt wurden, zeigte für Arginin geringere bzw. bei GABA höhere Gehalte in den im RUSITEC eingesetzten Schadsilagen, während sich bei Lysin und Methionin keine Tendenz einstellte (s. Kap. 4.3). Danach wird Arginin als wichtiger Vorläuferstoff für die Polyaminbildung angenommen (s.a. PIETRZAK et al. 2002). Die Abhängigkeit der GABA-Bildung von der Aminosäure Glutamat konnte für die Schadsilage S-31 und die Kontrollsilagen K-30 und K-32 nachvollzogen werden. Die Schadsilage S-33 hingegen hatte zwar einen hohen GABA-Gehalt, aber gleichzeitig auch einen relativ hohen prozentualen Gehalt von Glutamat an den gesamten Aminosäuren, weshalb annehmbar ist, dass der GABA-Gehalt nicht allein vom Glutamat abhängt, sondern auch der Polyaminkatabolismus den Gehalt mit beeinflusst (THEERMANN 2011; JIMÉNEZ-BREMONT et al. 2014, s. Abb. 2.3 u. Abb. 4.10). Potentielle Faktoren, die Einfluss auf die Ergebnisse der Grassilagen gehabt haben können, sind unter anderem die Methodik der Aminosäureanalyse mittels Total-aufschluss, der schnelle Proteinstoffwechsel vor und während der Silierung (Beeinflussung des intrazellulären Wasserdrucks z.B. durch Witterung, Licht und

Diskussion

141

Temperaturwirkung auf die Enzymaktivität, s. THEERMANN 2011) und aufgrund dieser Dynamik auch der Zeitpunkt der Probengewinnung. Die eingesetzte Maisstärke (Fa. Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld, Deutschland, Art.-Nr. 03402) und das eingesetzte Sojaprotein SUPRO® 670 IP (Futtermittelanalyse des Sojaproteins s. Tab. 9.4) wurden täglich abgewogen und trocken und lichtgeschützt gelagert, um mögliche Einflüsse und Stoffwechselprozesse gering zu halten.

5.3 Ausgewertete Parameter

In vorangegangenen Versuchen mit dem RUSITEC-System wurden die folgenden Parameter als Fermentationskontrollparameter diskutiert und für geeignet befunden:

• Gasvolumen s. SCHIRMER (1990) • Gaszusammensetzung s. HÖLTERSHINKEN (1990) • Konzentration der flüchtigen Fettsäuren s. MAIWORM (1994)

Die Auswirkungen des Kohlenhydratstoffwechsels auf die flüchtigen Fettsäuren und die Gasproduktion sind, ebenso wie der Einfluss der Schadsilagen auf den ruminalen Gesamtphenol- und o-Diphenolgehalt bei GÖRES (2016) diskutiert. Eine kritische Betrachtung der pH-Werte, des bakteriellen Proteins nach BRADFORD (1976) und der Enzymaktivität erfolgte bei ILLE (2017). In dieser Arbeit werden die Wirkungen von Schadsilagen auf die folgenden Parameter im RUSITEC beurteilt:

• Polyamine und GABA • Aminosäuren • Ammoniak • i-Butter- und i-Valeriansäure

5.3.1 Probenbearbeitung

Zur Messung der Polyamine und der Aminosäuren wurde flüssiger Fermenterinhalt mittels Einwegspritze nach Durchmischung der Fermenterflüssigkeit während der Beladung gewonnen. Je 1 g uS fester Fermenterinhalt wurde aus beiden identisch beladenen Fermentern aus den Futtersäcken nach Abpressen der Fermentations-flüssigkeit mit einer Pinzette entnommen und durch Homogenisieren gepoolt. Eine Beeinflussung der Analyseergebnisse durch die Entnahme der Feststoffproben aus der Ursprungssubstanz kann nicht ausgeschlossen werden, zumal die Grassilagen sich vor der Inkubation erheblich in den TS-Gehalten unterschieden. Allerdings ist dieser Einfluss durch die lange Inkubation der Grassilagen von 48 Stunden und aufgrund von nicht veröffentlichten, vorherigen Untersuchungen aus dem Pansenlabor und dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover als relativ gering einzuschätzen3. Zur Denaturierung und Mikroextraktion der Proben wurde die Aufbereitung mit dem Ultraschallbad verwendet (FELLENBERG et al. 2012; MAYR u. SCHIEBERLE 2012; 3 Laut persönlicher Mitteilung von Dr. M. Höltershinken, Hannover am 10.12.2016

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ÖZMEN 2014). Da sich die Deproteinisierung der Proben mit 30 %iger 5-Sulfosalicyl-säure bei GRESNER (2011) und THEERMANN (2011) bewährt hat und um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse sowie ein Aufbrechen der möglichen Polyamin-verbindungen (s. Kap. 3.2.4.5.10) zu erreichen, wurde dieser Aufarbeitungsschritt beibehalten. Der interne Standard 1,7 Diaminoheptan (1,7 DAH) wurde in der Literatur bereits als stabiler Standard für Polyamine und Aminosäuren sowohl mit als auch ohne Derivatisierung eingesetzt (LOZANOV et al. 2004; HÄKKINEN et al. 2007; SÁNCHEZ-LÓPEZ et al. 2009). Die Variationskoeffizienten des internen Standard 1,7 DAH während der Proben-analytik waren mit 5,2–28 % relativ weit gestreut (s. Tab. 9.9). Ursachen dafür könnten unter anderem Verschmutzungen durch das Probenmaterial und der sogenannte Matrixeffekt sein (AL-HADITHI u. SAAD 2011; s. Kap. 5.3.2), da in den Vorversuchen mit Reinstoffen ein sehr guter VK von 3,58 % in 18 unabhängigen Messungen erreicht wurde (s. Tab. 3.7 u. Abb. 3.16). Der interne Standard für die Aminosäuren Norvalin-HCL trat nur sporadisch als Peak auf und wurde somit nicht weiter ausgewertet. Da 1,7 DAH jedoch auch als Standard für die Aminosäureanalyse erfolgreich eingesetzt wurde (LOZANOV et al. 2004), sind die Ergebnisse annehmbar. Möglicherweise hat das geringe Masse-zu-Ladungs-verhältnis von Norvalin-HCL (m/z 55) bei der Auftrennung mit der LC-MS/MS dazu geführt, dass derart kleine Fragmente (m/z < 55) gebildet wurden, dass diese aufgrund der technischen Bedingungen der Anlage nicht mehr detektierbar waren (s. Kap. 3.2.4.5.8). Bei THEERMANN (2011) hatte die Lagerungszeit der Proben einen Einfluss auf die Ergebnisse des Standards Norvalin-HCL. Analog zu WICHERN (2011) wurde die Zentrifugation der Proben durchgeführt, bevor selbige in Reagiergefäßen eingefroren wurden. Dieses Verfahren hat sich ebenso als geeignet erwiesen, wie die Filtration der Proben nach dem Auftauen und vor der Analyse durch 0,2 µm RC-Sterilfilter (s. Kap. 3.2.4.5.6; WICHERN 2011; ÖZMEN 2014).

5.3.2 Methode der LC-MS/MS

Bei der LC-MS/MS handelt es sich um eine Form der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit mehrfacher Massenspektrometrie, durch die die Molekülmasse der gesuchten Stoffe und ihre Teilfragmente genau charakterisiert werden können. Die verwendete Methode nach WICHERN (2011), HUNGER (2014) und ÖZMEN (2014) wurde aufgrund der größeren Säulenmaße (150 x 3,0 mm vs. 150 x 4,6 mm) optimiert. Die Wahl der Eluenten A und B (destilliertes Wasser + 0,1 % FA bzw. Acetonitril + 0,1 % FA) orientierte sich an HÄKKINEN et al. (2007) und eignete sich für die Messung der Amine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin, Thermospermin bzw. dessen Teilfragment m/z 173 sowie b-Alanin und der Aminosäuren L-Arginin, L-Lysin, L-Methionin, L-Ornithin sowie des Abbauproduktes GABA. In Vorversuchen konnten die Stoffe Ethanolamin, Histamin, Norspermidin, Norspermin, Serotonin, Tryptamin und Tyramin mit der vorhandenen Messtechnik nicht mit befriedigendem Resultat nachgewiesen werden (s. Kap. 3.2.4.5.14). Die Ringstruktur bzw. das geringe Molekulargewicht dieser Stoffe, sowie die unbekannte Fragmentbildung der langkettigen Polyamine könnte hier ausschlaggebend für die Schwierigkeiten in der Analytik sein (s. Tab. 3.9). Die absoluten Counts x Min. der Flächenintegrale in den Vorversuchen sind aufgrund des anfangs verwendeten kleineren Säulendurchmessers

Diskussion

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nicht vergleichbar mit den Werten der Kalibration (s. Kap. 3.2.4.5.9). Der interne Standard 1,7 DAH lag mit einer Konzentration von 10 µmol/l in den Proben vor. Er eignet sich der Literatur nach gleichermaßen gut als interner Standard für Polyamine und Aminosäuren (LOZANOV et al. 2004; MINOCHA u. LONG 2004; HÄKKINEN et al. 2007) und wurde entsprechend ausgewertet. Die Electrospray-Ionisation (ESI) erfolgte im positiven Modus analog zu HÄKKINEN et al. (2007). Diese Form der Ionisation hat sich auch bei WICHERN (2011), HUNGER (2014) und ÖZMEN (2014) als sinnvoll erwiesen. Dennoch muss bei der LC-MS/MS auf die Problematik der Ionensupression, des Carry-Overs und eine mögliche Kontamination der MS-Quelle hingewiesen werden (AL-HADITHI u. SAAD 2011). Um das daraus entstehende Grundrauschen und die Verschiebung der Retentionszeiten zu minimieren, wurden regelmäßige System-spülungen nach jeweils acht Analysen vorgenommen und die Vorsäule nach je 76 Analysen gewechselt (WICHERN 2011; s. Kap. 3.2.4.5.15). Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels MS Work-Station (Varian®, Palo Alto, CA, USA) nach den in Kapitel 3.2.4.5.17 beschriebenen Kriterien. Die Gehalte der einzelnen Stoffe wurden mittels der in den Kalibrationen bestimmten Gleichungen im Anschluss an die Erhebung der Flächenintegrale umgerechnet (s. Kap. 3.2.4.5.14). Durch die Vielzahl der Proben und ausgewerteten Stoffe war dieser Schritt arbeitsintensiv, jedoch mittels der zur Verfügung stehenden Software zielorientiert durchführbar. Um den personenbezogenen Fehler gering zu halten, wurden die Auswertungen nur von zwei Personen durchgeführt. Die Präzision der Mess-ergebnisse zeigt sich zum einen im mittleren VK von 17,5 % im internen Standard der Proben und in der Wiederholungsmessung von 1,7 DAH (VK: 3,58 %; s. Kap. 3.2.4.5.16 bzw. Tab. 9.6) sowie zum anderen in den Ergebnissen des extern gemessenen Standards 1,7 DAH und seiner bestimmten Retentionszeiten (s. Abb. 9.2 u. Abb. 9.3).

5.3.3 Auswahl der Standards

Die für die Kalibration, die Bestimmung des „Limits of Detektion“ (LOD; s. Kap. 9.3.2) und der Wiederfindungsrate genutzten Polyamin- und Aminosäurestandards stammten alle aus industrieller Herstellung (s. Tab. 9.1). Die Auswahl der Standards ergab sich aus den Stoffen, die in der Literaturrecherche als relevant erachtet wurden (s. Kap. 3.2.4.5.2) und aus den Analysen der Vorversuche (s. Kap. 3.2.4.5.14). In den Vorversuchen zur Wiederfindungsrate wurde ein Polyaminstandardgemisch aus verschiedenen Polyaminen zum einen nativem Pansensaft und zum anderen einer aufbereiteten Grassilageprobe zugesetzt. Die Ergebnisse waren sehr heterogen und ergaben nicht die erwarteten höheren Polyaminwerte in den zugelegten Proben (s. Kap. 3.2.4.5.9). Hier wird aufgrund der biologischen Aktivität der Polyamine eine Konjugation bzw. ein Um- oder Abbau der Stoffe vermutet. So beschreiben SERAFINI-FRACASSINI und DEL DUCA (2008) die Polyaminbindung an Proteine mittels Transglutaminasen. Denkbar wäre, dass die zugelegten Polyamine in den Vorversuchen einer derartigen Bindung unterlegen haben. Auch die Bindung von Polyaminen an Phenole ist beschrieben und könnte zu einem ähnlichen Effekt führen (FIXON-OWOO et al. 2003; BASSARD et al. 2010; ONKOKESUNG 2010). Aufgrund dieser ersten Messergebnisse an der LC-MS/MS erfolgte in der späteren Proben-

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aufbereitung während der Versuche der Zusatz von 5-Sulfosalicylsäure zur Deproteinisierung (s. Kap. 3.2.4.5.6). Da die Polyamine und Amine in den durchgeführten RUSITEC-Proben ebenso konstant nachgewiesen werden konnten wie der interne Standard, wird angenommen, dass die freien Amine mittels der verwendeten Extraktionsmethose ausreichend erfasst werden konnten. Speziell der Standard Thermospermin war aufgrund der geringen zur Verfügung stehenden Menge eine Herausforderung in der Präanalytik. In den für diese RUSITEC-Läufe unternommenen Vorversuchen wurde bei der Vermessung neben der Masse-zu-Ladungszahl m/z 206 und m/z 191, die Masse-zu-Ladungszahl m/z 173 detektiert. Dabei zeigte m/z 173 die am besten abgegrenzten Peaks im Chromatogramm. Bei der Methodenentwicklung zur Messung von aliphatischen, langkettigen Polyaminen mittels LC-MS/MS konnten vergleichbare Teilfragmente von BRIDOUX et al. (2011) bestätigt werden. Daraus wurde abgeleitet, dass mit m/z 173 möglicherweise Thermospermin nachgewiesen werden konnte (s. Kap. 5.3.2). Im Rahmen der Kalibration wurden auch die „Limits of Detektion“ (LOD) der Polyamine bestimmt (s. Tab. 9.8). Diese lagen mit < 0,05 bis 25 µmol/l zwar deutlich höher als die von HÄKKINEN et al. (2008) und STEVENS et al. (2010) bestimmten LODs, jedoch sind die Leistungsfähigkeit und die Komponenten der hier genutzten LC-MS/MS als limitierende Faktoren zu beachten (s. Kap. 3.2.4.5.8; HUNGER 2014). Zudem konnten die Proben aufgrund der technischen Ausstattung nicht weiter verdünnt werden als in Tabelle 9.8 erfasst. War die kleinste Verdünnung jedoch gut detektierbar, wurde die Stufe mit < x gekennzeichnet. Danach befanden sich lediglich die Analyseergebnisse von Spermin, b-Alanin und GABA zum Teil unterhalb der für diese Stoffe festgestellten LOD und sind infolgedessen vorsichtig zu bewerten.

5.3.4 Statistik

Die in Kapitel 4 aufgeführten berechneten statistischen Signifikanzen (s. a. Kap. 9.4) sind aufgrund der geringen Wiederholungszahl (n = 8 im flüssigen Fermenterinhalt bzw. n = 4 im festen Fermenterinhalt) nur als eingeschränkt aussagekräftig anzusehen. Als Wiederholungen wurden im flüssigen Fermenterinhalt analog zu den Untersuchungen von GÖRES (2016) die Messwerte der zwei Fermenter mit gleicher Beladung am selbigen Messtag je Lauf angesehen. Die Betrachtung des ersten bzw. zweiten Laufblockes (L31–L34 bzw. L35–L38) erfolgte aufgrund des Einsatzes unterschiedlicher Grassilagen getrennt. Durch die Gewinnung von Poolproben im festen Fermenterinhalt reduzierte sich die n-Anzahl (s.o.). Die einzelnen Tage eines RUSITEC-Laufes sind durch das Stoffwechselgeschehen voneinander abhängig. Alle Daten wurden vor der weiteren statistischen Auswertung auf Normalverteilung getestet. Auch hier ist die geringe n-Anzahl zu berücksichtigen, jedoch konnte weitestgehend von einer Normalverteilung ausgegangen werden. Der t-Test für verbundene Stichproben wurde nach Rücksprache mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover analog zu den vorherigen Untersuchungen gewählt, da alle RUSITEC-Fermenter entsprechend gleich behandelt wurden und jeweils nur zwei Behandlungsformen (Kontrollsilage bzw. Schadsilage oder Schadsilage mit Sojazusatz) zum Messzeitpunkt verglichen werden sollten.

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5.4 Auswirkungen der Schadsilagen auf den ruminalen Stoffwechsel von Aminen, Polyaminen und Aminosäuren

Die Auswirkungen der Schadsilagen auf den ruminalen Stoffwechsel der Amine und Polyamine sowie ihrer korrespondierenden Aminosäuren waren in den vorliegenden Untersuchungen sehr unterschiedlich. In dieser Arbeit wurden die Amine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin und β-Alanin, sowie ihre aufgrund der Stoffwechselzusammenhänge korrespondierenden Aminosäuren L-Lysin, L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin sowie GABA mittels LC-MS/MS analysiert (s. Kap. 3.2.4.5). Grundlage der Messung von Aminen und Polyaminen ist neben ihrer möglichen Beteiligung an der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ die in Kapitel 4.3 ermittelte Verschiebung der Aminosäure Arginin, die bei der Datenauswertung in Grassilagen mit einem RE/Rp-Quotienten < 50 % in deutlich geringeren Gehalten auftrat und somit eine Bildung von Polyaminen vermuten lässt (s. Abb. 4.6 u. Abb. 2.2). Betrachtet werden jeweils zuerst die Polyamin- und Aminosäuregehalte in den Gras-silagen und im Folgenden die Ergebnisse aus dem flüssigen und festen Inhalt der RUSTIEC-Fermenter. Bei der Gegenüberstellung der Ergebnisse ist die Probenaufbereitung zu berück-sichtigen. Es wurden je Fermenter 1 g uS des festen RUSITEC-Inhaltes (gepoolt aus den gleich beladenen Fermentern) bzw. 10 ml flüssigem Fermenterinhalt gewonnen, während die Analyse der Grassilagen aus technischen und aus Lagerungsgründen analog zu ÖZMEN 2014 aus 100 mg gefriergetrockneter Grassilage durchgeführt wurde (s. Kap. 3.2.4.5.7). Damit besteht nur eine eingeschränkte Vergleichbarkeit der Ergebnisse des Polyamingehaltes in den Grassilagen und im RUSITEC. Zudem erfasst die Analytik aufgrund der Methodik lediglich die durch die Probenaufbereitung in Lösung gegangenen Anteile der jeweiligen Stoffe.

5.4.1 Cadaverin und L-Lysin

Cadaverin wird zu einem wesentlichen Anteil aus L-Lysin decarboxyliert. Somit ist letzteres ein wichtiges Ausgangssubstrat (s. Abb. 2.2; BAGNI u. TASSONI 2001). Beide Stoffe werden nachfolgend gemeinsam betrachtet. Sowohl Cadaverin als auch L-Lysin konnten in den eingesetzten Grassilagen und im RUSITEC detektiert werden. In den Schadsilagen S-31 und S-33 wurden im Vergleich zu den Kontrollsilagen K-30 und K-32 höhere Cadaveringehalte an der LC-MS/MS gemessen (s. Tab. 4.3 u. Tab. 4.4). Diese Cadaveringehalte sind vermutlich durch die Proteolyse bei der Grassilagegewinnung bedingt. Denn die Proteolyse läuft bei höherem Wassergehalt (z.B. durch Witterung und Schnittzeitpunkt) durch den für die beteiligten Enzyme wichtigen intrazellulären Wasserdruck länger ab und es entstehen vermehrt Abbauprodukte (KIRCHGESSNER et al. 1960; McDONALD et al. 1981; SEYFARTH et al. 1989; BUXTON u. MUCK 2003). In Grassilagen kommt L-Lysin in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vor. Die im Rahmen dieser Dissertation ausgewerteten Aminosäureanalysen von 315 Gras-silagen (Analytik durch EVONIK Nutrition & Care GmbH) bestätigen die Streuung der Lysingehalte (s. Tab. 9.71 u. Abb. 4.7). Dabei haben sowohl die Proteolyse und der

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Gehalt an Trockensubstanz während der Grasernte als auch die Bakterienflora und der pH-Wert während des eigentlichen Silierprozesses der Grassilagen einen entscheidenden Einfluss (MACPHERSON u. VIOLANTE 1966; GAST 2010). Folglich erscheinen die in den eingesetzten Grassilagen an der LC-MS/MS ermittelten Unterschiede der Gehalte von Cadaverin und L-Lysin (s. Tab. 4.3) nachvollziehbar. Im RUSITEC lagen die Cadaveringehalte im flüssigen Fermenterinhalt während der Zulagephase in allen Fermentern mit 31,4–53,6 µmol/l im Bereich der bei DAWSON und MAYNE (1996), AMETAJ et al. (2010) sowie SALEEM et al. (2012) beschriebenen Werte in vivo beim Rind. DAWSON und MAYNE (1996) ermittelten Cadaveringehalte von rund 25,7 µmol/l in ihrer Kontrollgruppe bei Versuchen zum Effekt von intraruminaler Amininfusion. Die Cadaveringehalte wurden hier innerhalb von 24 h in regelmäßigen (anfangs stündlichen) Abständen erfasst. Den Effekt von unter-schiedlich konzentrierten Getreidediäten auf die Pansengesundheit in vivo unter-suchten AMETAJ et al. (2010) und SALEEM et al. (2012). Die hier bestimmten Cadaveringehalte im Pansen lagen mit 50,4 bis 124 µmol/l etwas höher als die der eigenen Untersuchungen und sie stiegen mit höherem Getreideanteil an. Als Ursache für diese etwas höheren Gehalte wurde die durch den Versuchsaufbau bedingte Verschiebung der Mikroflora der Pansenfermentation vermutet. Im festen Fermenterinhalt wurden Cadaverinkonzentrationen von 19,9–47,1 mg/g uS gemessen (s. Abb. 4.23). Derzeit sind keine Studien in der Literatur verfügbar, die Cadaverin im festen Panseninhalt beschreiben. Im Vergleich mit dem Input durch die Grassilagen, können die erhobenen Gehalte jedoch unter Vorbehalt als realistisch angesehen werden (s. Tab. 4.3). Die Sojazulage hatte in den eigenen Untersuchungen keinen Einfluss auf die Bildung von Cadaverin. In einem in-vitro-Kurzzeitsystem wurde von JEONG et al. (2015) Pansenflüssigkeit von Holstein Friesian Kühen für 48 Stunden mit einem Gemisch von löslicher Stärke und Soja in unterschiedlichem Verhältnis versetzt und auf Polyamine untersucht. Hier konnten Cadaveringehalte von 71,0 bis 343 µmol/l bei soja-gewichteter Inkubation mit einem Verhältnis von Soja zu Stärke von 7:3 bzw. 10:0 bestimmt werden. Demnach könnte Soja den Gehalt von Cadaverin beeinflussen. In den eigenen Untersuchungen wurde dies nicht bestätigt, wobei durch den anderen Probenentnahmezeitpunkt (nach 24 Stunden im RUSITEC vs. 48 h bei JEONG et al. (2015)) eine Auswirkung auf die Cadaveringehalte verdeckt worden sein kann. Kritisch zu hinterfragen bleibt bei letztgenannter Studie, warum zum großen Teil keine Gehalte der flüchtigen Fettsäuren Propionat und Butyrat nachweisbar waren, denn beide Stoffe kommen physiologischer Weise immer bei einer funktionalen Pansenfermentation vor (GIESECKE 1966; VON ENGELHARDT et al. 2015). Cadaverin ist zudem ein essentieller Baustoff für Pansenbakterien. Bei Selenomonas ruminantium und Veillonella spp. konnten KAMIO und NAKAMURA (1987) sowie KOJIMA und KAMIO (2012) nachweisen, dass Cadaverin in die Peptidoglycanwand eingebaut wird. Die Inhibition der Cadaverinbildung durch Blockade der Lysin- bzw. Ornithindecarboxylase (LDC/ODC) mit DL-α-Diuoromethyllysin führte bei Selenomonas ruminantium zu einer deutlichen Wachstumshemmung (KAMIO et al. 1986). Weiterhin wurde Cadaverin neben Putrescin auch in den Pansenbakterien Megasphaera elsdenii und Anaerovibrio lipolytica nachgewiesen (LEWIS u. EMERY 1962; KAMIO u. NAKAMURA 1987).

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Somit lassen die geringgradigen Verschiebungen, die im ersten Laufblock zwischen Tag 11 und 15 zu höheren Gehalten in KF-30 und im zweiten Laufblock zwischen Tag 14 und 18 zu niedrigeren Gehalten in KF-32 im flüssigen Fermenterinhalt führten vermuten, dass Cadaverin von den ruminalen Mikroorganismen entsprechend unterschiedlich verwertet werden konnte oder eine Populationsverschiebung dazu führte, dass sich der Gehalt an Cadaverin in den jeweiligen Fermentern (unabhängig von der Beladung als Kontroll- oder Testfermenter) kurzfristig reduzierte. Das Absinken der Cadaveringehalte in der Kontrollphase aller Fermenter des ersten Laufblockes spricht ebenfalls für eine Metabolisierung bzw. Populationsverschiebung. Im zweiten Laufblock ist kein solcher Effekt in der Kontrollphase zu sehen. Das könnte unter anderem darin begründet sein, dass erst ab Tag sieben Proben gewonnen wurden (s. Kap. 3.2.4.5.6) und sich der Gehalt zu diesem Zeitpunkt möglicherweise bereits eingependelt hat. Hinweise auf eine geringe bakterielle Verschiebung im RUSITEC konnten also beobachtet werden. Zudem lässt sich ein Wachstumsvorteil für Selenomonas ruminantium auch aufgrund der gesteigerten Propionsäuregehalte in den Testfermentern (GÖRES 2016) in beiden Laufblöcken annehmen. Dieser fiel jedoch im ersten Laufblock besser aus (GÖRES 2016). Denkbar ist aufgrund der Unter-schiede in der Propionsäureproduktion, dass auch Unterschiede bezüglich des nutzbaren Cadaverins zwischen den eingesetzten Grassilagen der beiden Laufblöcke bestehen und Cadaverin im zweiten Laufblock vermehrt verstoffwechselt wird. Zudem lag der Input von Cadaverin durch die Grassilagen (Analyse von gefriergetrocknetem Material) deutlich über den Ergebnissen des RUSITECS sowohl im festen, als auch im flüssigen Fermenterinhalt und bestätigt damit die Annahme der Nutzung von Cadaverin (s. Tab. 4.3). Der L-Lysingehalt im RUSITEC ergibt sich im Wesentlichen aus den Gehalten in den zugefügten Grassilagen sowie Futtermitteln, dem Gehalt in der Bakterien- und Protozoenpopulation (THEERMANN 2011) und aus dem mikrobiellen Abbau bzw. der Synthese. Die Bakterien- und Protozoenpopulation unterliegt dabei den Einflüssen des Versuchsaufbaus (z.B. fehlende Pansenwand) und nutritiven Eigenschaften der zuge-setzten Futterkomponenten. Es wurden unterschiedlich gerichtete Ergebnisse in den jeweiligen Laufblöcken L-31–L34 bzw. L35–L38 für L-Lysin festgestellt (s. Tab. 4.1). Dabei waren die Messwerte von L-Lysin im flüssigen Fermenterinhalt des ersten Laufblockes von einer Differenz zwischen KF-30 und TF-31 bzw. TF-31mS von rund -65 % gekennzeichnet, während sich selbige Messwerte im zweiten Laufblock umgekehrt darstellten (ca. +50 %). In der Literatur sind intraruminale Lysingehalte von 0 bis ca. 270 µmol/l bei den Lysinfütterungsversuchen von ROBINSON et al. (2005, 2006) in der Kontrollgruppe beschrieben. In vorherigen Versuchen von THEERMANN (2011) am RUSITEC wurden Lysingehalte von 5–70 µmol/l mittels FMOC-Chlorid-Derivatisierung im flüssigen Fermenterinhalt bestimmt, die trotz der anderen Methodik mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit (mit Ausnahme der höheren L-Lysingehalte im flüssigen Fermenterinhalt des ersten Laufblockes von im Mittel KF-30: 221 µmol/l und TF-31 bzw. TF-31mS: 82,7 µmol/l) übereinstimmten. Die unterschiedlich ausgerichteten Ergebnisse in den eigenen Untersuchungen könnten durch die Bakterienpopulation und ihre potentielle Verschiebung verursacht

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worden sein (GÖRES 2016; LENGOWSKI et al. 2016; ILLE 2017). In den Studien von ROBINSON et al. (2005, 2006) konnte bei Zusatz von verschiedenen Lysingehalten im Futter eine schnelle Reduktion der Lysingehalte im Pansen innerhalb von drei Stunden beobachtet werden. Zusätzlich muss bedacht werden, dass die Proben im RUSITEC nur alle 24 Stunden gewonnen wurden und daher eine mögliche vorher stattgefundene L-Lysinverschiebung nicht erfasst wurde. Veränderungen der Pansen-fermentation und der Leistung der eingesetzten Tiere wurden bei ROBINSON et al. (2005, 2006) in den Versuchsgruppen mit bis zu 85,4 g Lysinzusatz je Tier am Tag nicht beobachtet, woraus wiederum auf eine hohe Toleranz der Tiere gegenüber L-Lysin schließen lässt. Obwohl getoastete Sojabohnen einen deutlich höheren Lysingehalt haben als Grassilagen (>20 g/kg TS vs. 1–2 g/kg TS; KAMPHUES et al. 2014), konnte in den Ergebnissen der Fermenterproben kein Einfluss der Sojazulage auf den L-Lysingehalt beobachtet werden. Daher wird eine mikrobielle Umsetzung dieses L-Lysins während der 24 stündigen Fermentationszeit im RUSITEC, wie sie auch bei ROBINSON et al. (2005, 2006) gesehen wurde, vermutet. So lassen die unterschiedlichen L-Lysingehalte in den Fermentern und der nicht darstellbare Einfluss der Sojazulage darauf schließen, dass L-Lysin auch in den eigenen RUSITEC-Versuchen mehr oder weniger stark verstoffwechselt wird und unterstützten die Hypothese der Entstehung von Cadaverin. Da Cadaverin neben L-Lysin auch über einen Stoffwechselweg aus Homoarginin via Homoagmatin gebildet werden kann (BAGNI u. TASSONI 2001; s. Abb. 2.2), könnten die Gehalte beider Stoffe im RUSITEC möglicherweise auch aus diesem Stoffwechselweg resultieren (s. Abb. 4.11, Abb. 4.12, Abb. 4.23, Abb. 4.24 u. Tab. 4.2).

5.4.2 Putrescin, Spermidin und Spermin sowie L-Arginin, L-Methionin und L-Orntihin

Die Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin werden vornehmlich aus den drei Aminosäuren L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin gebildet (s. Abb. 2.2). Im Folgenden werden die Ergebnisse der drei Polyamine und ihrer korrespon-dierenden Aminosäuren zuerst in den Grassilagen betrachtet. Danach erfolgt die Begutachtung im flüssigen und festen Fermenterinhalt des RUSITECS und anschließend werden die möglichen Einflüsse evaluiert. Zur Orientierung dient Abbildung 5.1.

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In den Schadsilagen S-31 und S-33 wurden für Putrescin und Spermidin höhere Werte gemessen als in den Kontrollsilagen K-30 und K-32, während sich bei Spermin eine umgekehrte Situation darstellte (s. Tab. 4.3). Die höheren Gehalte von Putrescin und Spermidin entstehen vermutlich in erster Linie bei der Proteolyse während der Grasernte (s. Kap. 5.4.1). Die geringeren Gehalte von Spermin hingegen sind möglicherweise in der schnellen Aktivierung der Polyaminstoffwechselkaskade bei pflanzlichem Stress begründet (GALSTON u. SAWHNEY 1990; MOHAPATRA et al. 2010). Eine Nutzung von Spermin für die Resynthese von Spermidin ist denkbar, denn letzteres kann vielseitig weiter umgesetzt werden (s. Kap. 2.2.1 sowie Abb. 2.2 u. Abb. 2.3). Für den Stoff-wechselweg von Spermin in Nutzpflanzen stehen bisher aber nur lückenhaft Informationen in der Literatur zur Verfügung. In verschiedenen Studien von KRÍŽEK (1993), VAN OS et al. (1996) sowie KRIZSAN und RANDBY (2007) wurden Gehalte für Amine und Polyamine in Grassilagen ermittelt (s. Tab. 2.4.). Dabei scheint der Trockensubstanzgehalt einen Einfluss auf die Aminbildung zu haben, dies konnte zumindest in Grünhafersilagen nachgewiesen werden (SCHERER et al. 2015). Die eigenen Analysen der drei Polyamine in den Grassilagen (s. Tab. 4.3) lagen teilweise unterhalb der Gehalte, die in der Literatur beschrieben sind (s. Tab. 2.4), wobei dies auch durch die Unterschiede der Probenaufbereitung und die Messanalytik bedingt sein kann.

Putrescin

Spermin

Spermidin

Arginin/Ornithin

Methionin

m/z 173Thermospermin

Abb. 5.1: Übersicht zu den Zusammenhängen des Stoffwechsels von Putrescin, Spermidin, Spermin sowie m/z 173 bzw. Thermospermin und den korrespondierenden Aminosäuren Arginin, Ornithin und Methionin

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Die Aminosäuren L-Arginin, L-Methionin und L-Ornithin wurden zum einen durch eigene Analysen mit der LC-MS/MS Technik bestimmt und zum anderen wurden die Daten der Analyse von EVONIK Nutrition & Care GmbH mit Ausnahme von Ornithin, ausgewertet. Ornithin wurde bei EVONIK Nutrition & Care GmbH nicht bestimmt. Ein direkter Vergleich der extern gemessenen Aminosäureanalysen in den Gras-silagen (EVONIK Nutrition & Care GmbH; s. Abb. 4.6 u. Abb. 4.8) mit den Ergebnissen der LC-MS/MS ist aufgrund der sehr unterschiedlichen Aufbereitung und Messtechnik der Proben nicht möglich (s. Tab. 4.3 bzw. Tab. 9.3). Im RUSITEC wurden für die drei Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin in allen Testfermentern beider Laufblöcke geringere Gehalte nachgewiesen als in den Kontrollfermentern (s. Tab. 4.1). Die Konzentrationen von Putrescin im flüssigen Fermenterinhalt lagen im Mittel bei 24,1–64,2 µmol/l. DAWSON und MAYNE (1996) ermittelten vergleichbare Putrescin-gehalte von 46,2 µmol/l in der Pansenflüssigkeit in vivo in ihrer Kontrollgruppe. In den Untersuchungen zum Einfluss von Polyaminen auf die Entwicklung des Gastro-intestinaltraktes von heranwachsenden und adulten Ziegen und Schafen stellten ELIASSEN und SJAASTAD (2000) höhere Putrescinkonzentrationen von 50–750 µmol/l in der Pansenflüssigkeit der Ziegenlämmer fest, die sich mit zu-nehmender Pansenentwicklung steigerten. SALEEM et al. (2012) analysierten Putrescingehalte von 26,4–315 µmol/l in der Pansenflüssigkeit in vivo. Sie beobachteten, dass die Werte sich mit steigendem Konzentratanteil im Futter erhöhten. Somit waren die im RUSITEC gemessenen Gehalte von Putrescin mit diesen Versuchen in vivo vergleichbar. Entsprechende in-vitro-Untersuchungen sind bisher nicht bekannt. Bezüglich der Sojazulage bestand kein Unterschied in den Putrescingehalten der eigenen Untersuchungen zwischen den Testfermentern. Im in-vitro-Versuch von JEONG et al. (2015) wurden jedoch höhere Putrescingehalte von 222 bzw. 863 µmol/l durch Sojazusatz gemessen. Dabei konnte Putrescin bei einer vorgenommenen Soja-Stärke Inkubation nur bei einem Verhältnis von Soja zu löslicher Stärke von 10:0 bzw. 7:3 nachgewiesen werden, nicht jedoch in den Fermentern mit einem Verhältnis von < 5:5. An dieser Stelle sei wiederholt darauf verwiesen, dass Propionat und Butyrat in dieser Studie nicht nachgewiesen wurden, weshalb die Ergebnisse kritisch betrachtet werden müssen (s. Kap. 5.4.1). Zudem könnte die zeitlich frühere Probenentnahme in den eigenen Versuchen (nach 24 Stunden Verdau vs. 48 h bei JEONG et al. (2015)) einen möglichen Effekt der Sojazulage auf die Putrescingehalte kaschiert haben. Putrescin wurde im festen Fermenterinhalt im Mittel mit 6,1–15,5 mg/g uS nach-gewiesen (s. Tab. 4.3). Vergleichswerte bestehen auch hier nicht in der Literatur. Jedoch erscheinen die Gehalte im Hinblick auf die in den eingesetzten Grassilagen aus gefriergetrocknetem Material an der LC-MS/MS bestimmten Werte in einem plausiblen Bereich zu liegen (s. Tab. 4.3). Spermidin wurde im flüssigen Fermenterinhalt des RUSITECS in mittleren Konzen-trationen zwischen 1,9 und 13,5 µmol/l gemessen (s. Abb. 4.14). Bei ELIASSEN und SJAASTAD (2000) wurden höhere Gehalte von 80–240 µmol/l in vivo bei Ziegenlämmern gemessen. Demnach produziert die Pansenflora im RUSITEC unter

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den Versuchsbedingungen vermutlich weniger Spermidin oder der Stoff wird unter den gegebenen Bedingungen in vitro schneller umgesetzt. Im festen Fermenterinhalt wurden mittlere Spermidingehalte von 0,55–1,71 mg/g uS gemessen, die bisher nicht weiter bestätigt werden können. Auch hier konnte ein Einfluss der Sojazulage nicht festgestellt werden. Dies ist eventuell, wie bei Cadaverin und Putrescin, durch den Zeitpunkt der Probenentnahme zu begründen. Die Gehalte von Spermin im flüssigen Fermenterinhalt lagen im Mittel zwischen 0,5 und 1,0 µmol/l im RUSITEC (s. Abb. 4.15) und deckten sich wiederum überwiegend mit den gemessenen Werten von ELIASSEN und SJAASTAD (2000) bei Ziegenlämmern in vivo, die nur vereinzelt höhere Werte von maximal rund 100 µmol/l Spermin nachweisen konnten. Da in den eigenen Vorversuchen zur Kalibration von Spermin der Stoff bis zur Verdünnungsstufe von 1 µmol/l nachgewiesen werden konnte, wurde ein LOD von < 1 µmol/l festgelegt und die z.T. niedrigeren analysierten Werte mit einem annehmbaren Restrisiko als realistisch eingestuft (s. Tab. 9.8). Im festen Fermenterinhalt wurden Spermingehalte von 0,1–0,2 mg/g uS gemessen, die ebenso hingenommen werden müssen, wie bei Putrescin und Spermidin. Die Sojazulage verhielt sich analog und hatte keinen Einfluss auf die Spermingehalte. Auch hier ist der zeitliche Aspekt der Probengewinnnung möglicherweise von Bedeutung. Putrescin, Spermidin und Spermin werden von der Pansenflora produziert und gleichermaßen auch genutzt (GRESNER et al. 2015). So bauen Selenomonas ruminantium und Veillonella spp. auch Putrescin neben Cadaverin in die Peptidoglycanwand ein (KAMIO u. NAKAMURA 1987; LIAO et al. 2014). Megasphaera elsdenii ist am Stoffwechsel von Putrescin beteiligt, indem es Aminosäuren zu Putrescin abbaut (KAMIO u. NAKAMURA 1987). Das Bakterium nutzt zudem Aminosäuren (L-Threonin, L-Serin und L-Cystein) sowie Ammoniak als Energiequelle für sein Wachstum und ist daher gewissermaßen abhängig von der Verfügbarkeit letztgenannter Substanzen (RYCHLIK et al. 2002). Spermidin ist ebenfalls als Teil des Peptidoglycans von Selenomonas ruminantium in nicht kovalenter Bindung nachgewiesen worden (HAMANA et al. 2002). Eventuell besteht für die Nutzung von Spermidin eine bessere Zugänglichkeit für diese Pansenbakterien. Womöglich könnte das zu den geringeren Spermidinkonzen-trationen im RUSITEC im Vergleich zur Literatur geführt haben. Ein resultierender Wachstumsvorteil für Selenomonas ruminantium müsste in weiteren Untersuchungen bestätigt werden. Darüber hinaus könnte eine Maskierung von Spermidin durch Bindung an phenolische Stoffe oder Proteine einen Einfluss auf die Verhältnisse haben (GALSTON u. SAWHNEY 1990; MARTIN-TANGUY 1997; KUSANO et al. 2008; BASSARD et al. 2010). Spermin konnte im Pansenlumen in vivo bei LINGAAS und TVEIT (1992) im Rind sowie ELIASSEN und SJAASTAD (2000) im Ziegenlamm in geringen Mengen nachgewiesen werden (0,01 bis 120 µmol/l). Zur Metabolisierung von Spermin durch Pansenbakterien ist bisher jedoch nichts Genaueres bekannt. Da die Biosynthese und der Katabolismus von Spermin sehr eng mit dem Stoffwechselweg von Putrescin und

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Spermidin verknüpft sind (s. Abb. 2.2 u. Abb. 2.3), ist ein Metabolismus ähnlich wie bei Selenomonas ruminantium und Megasphaera elsdenii durchaus denkbar. Ferner kann aus den gesteigerten Gehalten der i-Valerian- und der i-Buttersäure in den Testfermentern (s. Kap. 4.1.1 u. 4.1.2) zumindest für Megasphaera elsdenii und Prevotella ssp. ein vermehrtes Wachstum unter Schadsilagezulage im RUSITEC vermutet werden (Näheres s. GÖRES 2016; ILLE 2017). Denn die i-Valerian- und i-Buttersäure stammen nachweislich aus dem N-Stoffwechsel (BLADEN et al. 1961; CARRO u. MILLER 1999) und werden durch ruminale Bakterien wie Megasphaera elsdenii und Prevotella spp. gebildet (WEIMER u. MOEN 2013; ILLE 2017). Weiterhin können auch die HAP-Spezies diese flüchtigen i-Fettsäuren (GRESNER 2011) produzieren. Möglicherweise kommt es also durch den Schadsilageeinsatz zu einer vermehrten bakteriellen Nutzung der Polyamine, die sich in einem Wachtumsvorteil letztgenannter Spezies äußert. Die Aminosäuren Arginin, Ornithin und Methionin sind in Pflanzen, Säugern und Bakterien die Hauptsubstrate für die Synthese von Putrescin, Spermidin und Spermin (MILLER-FLEMING et al. 2015). Im RUSITEC konnten mittlere Gehalte von 1,4–2,1 µmol/l für L-Arginin, 3,9–17,1 µmol/l für L-Methionin und 2,1–3,4 µmol/l für L-Ornithin im flüssigen Fermenterinhalt an der LC-MS/MS gemessen werden. Dabei wurden in den Testfermentern während der Zulagephase tendenziell geringgradig höhere Konzentrationen gemessen als in den Kontrollfermentern (s. Tab. 4.1). Dies lässt vermuten, dass der Stoffwechsel in den Kontrollfermentern des RUSITECS zugunsten der Polyamine ablief und weniger Aminosäuren vorlagen, während in den Testfermentern eine umgekehrte Beobachtung gemacht wurde. Dabei werden die Ergebnisse dieser drei Aminosäuren im Hinblick auf die festgestellten LODS (s. Tab. 9.8) als nachvollziehbar eingestuft. THEERMANN (2011) konnte in ihren Versuchen am RUSITEC mit der FMOC-Chlorid-Methode ähnliche Werte von 2,5–13,8 µmol/l für Arginin im flüssigen Inhalt ermitteln. OLTJEN et al. (1971) konnten Methionin und Arginin aus Pansenmikroorganismen isolieren und damit nachweisen, dass die Aminosäuren Bestandteil der Bakterien sind. Bei SALEEM et al. (2013) wurden für alle drei Aminosäuren Gehalte von rund 19,0 µmol/l mit Abweichungen von +/- 10–14 % im Panseninhalt gemessen. Vor diesem Hintergrund sind die analysierten Ergebnisse der Aminosäuren im RUSITEC schlüssig, wobei der feste Panseninhalt in der Literatur bisher nicht erfasst ist. Die in letzterem bestimmten Werte von 0,25–4,15 mg/g uS liegen beim Vergleich mit dem Input unter Berücksichtigung des Probenausgangsmaterials in realistischen Bereichen. Schließlich lässt sich ein metabolischer Zusammenhang zwischen Polyaminen und Aminosäuren im RUSITEC, analog zu den Untersuchungen von SALEEM et al. (2013), folgendermaßen unterstellen: Die Polyamine zeigten bei Verdauung der Schadsilagen in den Testfermentern geringere Gehalte im RUSITEC als bei Verdau der Kontrollsilagen in den Kontrollfermentern. Mit einer Ausnahme waren für die korrespondierenden Aminosäuren in den Testfermentern hingegen höhere Konzentrationen zu verzeichnen als in den Kontrollfermentern (s. Tab. 4.1). Dieser Sachverhalt lässt zuerst einmal

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darauf schließen, dass ein Zusammenhang zwischen der Biosynthese von Polyaminen und Aminosäuren auch im RUSITEC besteht. Dass Amine und Polyamine im Pansen entstehen können und ihre Bildung maßgeblich durch die Mikroorganismen bedingt ist, ist bereits vielfach untersucht worden (PHUNTSOK et al. 1998; ZHANG et al. 2014; JEONG et al. 2015). Die eigenen Ergebnisse der Aminosäuren im RUSITEC lassen daher annehmen, dass die frei zur Verfügung stehenden Aminosäuren bei Fermentation der Kontrollsilagen schneller in Polyamine umgewandelt werden und daher höhere Polyamingehalte in den Kontrollfermentern nachgewiesen werden konnten (s.o.). Das kann sowohl an der Verschiebung der mikrobiellen Flora im RUSITEC liegen (s. GÖRES 2016; ILLE 2017), als auch durch eine leichtere Verfügbarkeit der Aminosäuren in den Kontrollfermentern als Ausgangsstoffe für die Polyaminsynthese begünstigt werden. WANG et al. (2013b) stellten bei Untersuchungen zur subakuten Pansenazidose fest, dass sich der Gehalt von Aminen innerhalb von acht Stunden (u. a. Putrescin und Tyramin) im Pansen erhöht. Diese Untersuchungen verdeutlichen die Geschwin-digkeit, mit der die Polyaminbiosynthese durch die Pansenflora an die Bedingungen im Pansen angepasst wird. Die Forscher schließen aus ihren Ergebnissen, dass vor allem die Laktatbildner maßgeblich an der Steigerung der Polyamingehalte beteiligt sind, weisen aber auch darauf hin, dass andere Mikroorganismen (nicht weiter definiert) ebenfalls involviert sind, da auch bei Kontrollfütterung Polyamine nachgewiesen werden konnten. Der Einfluss der Laktatbildner kann aufgrund der stabilen pH-Werte (ILLE 2017) in den eigenen Untersuchungen als gering eingeschätzt werden. Zusätzlich bedacht werden sollte der Einfluss der Pansenwand in vivo auf die Polyamingehalte durch die enthaltene ODC (bewirkt die Decarboxylierung von Aminosäuren zu Polyaminen) und in geringem Umfang die mögliche Absorption von Polyaminen. Die Untersuchungen von ELIASSEN und SJAASTAD (2000) an heranwachsenden Schaflämmern zeigen, dass durch gezielt gesetzte Verletzungen die Aktivität der Decarboxylasen in der Pansenwand innerhalb von 5 Stunden etwa um das Vierfache ansteigt und vermehrt Putrescin und Spermidin und in geringerem Maße auch Spermin gebildet werden. Da jedoch die ODC-Aktivität in der Pansenflüssigkeit zeitlich nicht von dem Anstieg der Polyaminkonzentrationen in der Pansenflüssigkeit oder der ODC-Aktivität im Pansenepithel begleitet wurde, wurde in der Studie angenommen, dass die Pansenwand nur einen geringen Anteil an der Polyamin-konzentration im Pansenlumen hat (ELIASSEN u. SJAASTAD 2000). Auch PHUNTSOK et al. (1998) schlossen aus ihrer Studie, dass Amine in erster Linie durch die mikrobielle Pansenflora metabolisiert werden. Dabei stellten sie zusätzlich einen negativen Effekt der Amine auf die Futteraufnahme fest und unterstellten, dass durch die geringere Futteraufnahme eine geringere Motilität des Pansens sich negativ auf die Verdaulichkeit der Grassilagen auswirkt. Es konnte also in den hier vorliegenden Untersuchungen festgestellt werden, dass die Polyamine im Fermenterinhalt allgemein deutlich niedriger waren als in der Ausgangssilage (s. Tab. 4.3). Dieser Sachverhalt spricht für die in der Literatur angenommene Hypothese des vorrangig mikrobiell bedingten Metabolismus, zumal durch das genutzte RUSITEC-System kein Einfluss der Pansenwand oder der Blutbahn besteht. Darüber hinaus führte der Einsatz von Schadsilage tendenziell zu

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höheren Aminosäuregehalten im RUSITEC, während die Zugabe von Kontrollsilage die Bildung von Polyaminen begünstigte.

5.4.3 m/z 173 (möglicherweise Thermospermin)

Da in der Literatur zunehmend ungewöhnliche Polyamine in Pflanzen und Bakterien beschrieben werden, lag der Verdacht nahe, dass auch in Grassilagen und damit im Pansen entsprechende Polyamine vorkommen können (s. Kap. 2.2.1). Wenn im Folgenden die Begrifflichkeit m/z 173 fällt, ist diese mit dem Stoff Thermospermin gleichzusetzen (s. Kap. 3.2.4.5.18). Die Verhältnisse von m/z 173 in den Schad- bzw. Kontrollsilagen (Analyse aus gefriergetrocknetem Material) sind grundsätzlich mit denen von Putrescin und Spermidin vergleichbar, d.h. in den Schadsilagen wurden höhere Gehalte detektiert (s. Tab. 4.3). Dieser Umstand ergibt sich vermutlich aus der Abhängigkeit im Stoffwechselweg (s. Abb. 5.1). Dabei ist der höhere Gehalt in den Schadsilagen angesichts des Ablaufes des Polyaminkatabolismus durchaus annehmbar und funktionell eng an den Stoffwechselweg von Spermidin gekoppelt (s. Abb. 2.2 u. Abb. 2.3). Derzeit sind jedoch keine Ergebnisse zum Vorkommen von Thermospermin in Grassilagen bekannt. Nur im festen Fermenterinhalt des RUSITECS konnte m/z 173 nachgewiesen werden. Die Gehalte von m/z 173 lagen im Mittel in den Kontrollfermentern bei 215 mg/g uS im ersten und bei 61,7 mg/g uS im zweiten Laufblock. In den Testfermentern wurden Gehalte 115 mg/g uS bzw. 70,6 mg/g uS detektiert (s. Tab. 4.3). Im ersten Laufblock lagen folglich die Gehalte der Kontrollfermenter über denen der Testfermenter, während sich der Sachverhalt im zweiten Laufblock umgekehrt darstellte (s. Abb. 4.29). Vergleiche zur Literatur können aufgrund der mangelnden Datenlage nicht gezogen werden. Die unterschiedlichen Ergebnisse für m/z 173 im festen Fermenterinhalt der verschiedenen RUSITEC-Läufe könnten unter Berücksichtigung der schnellen Reaktionen des Polyaminstoffwechsels (BAGGA et al. 1997; WANG et al. 2013b), analog zu Cadaverin, Putrescin, Spermidin und Spermin durch die Momentaufnahme der Probenziehung entstanden sein (s. Abb. 5.1). Die insgesamt im Vergleich zu den Gehalten in den Grassilagen bzw. zu den anderen Polyaminen sehr viel höheren Konzentration von m/z 173 im festen Fermenterinhalt lassen eine Akkumulation vermuten. Diese könnte einerseits durch die lange kettenartige chemische Struktur des Stoffes Thermospermin bzw. m/z 173 bedingt sein (s. Tab. 3.9), die womöglich schlechter weiter metabolisiert werden kann oder andererseits durch Bindung an phenolische Substanzen oder Proteine zu einer Maskierung geführt haben (GALSTON u. SAWHNEY 1990; MARTIN-TANGUY 1997; KUSANO et al. 2008; BASSARD et al. 2010), die sich im Analyseprozess durch die Probenaufbereitung wieder auftrennt und zur entsprechenden Detektion geführt haben könnte. Schließlich bleibt zu sagen, dass aufgrund der sich im Zusammenhang darstellenden Messergebnisse mit m/z 173 möglicherweise eine Masse von Thermospermin aus

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dem Polyaminstoffwechsel nachgewiesen wurde (s. Kap. 5.3.3), die jedoch in Zukunft noch weiter charakterisiert werden muss.

5.4.4 β-Alanin

Der Stoff β-Alanin ist im Polyaminstoffwechsel insofern von Bedeutung, weil er beim Abbau von Polyaminen entsteht (s. Abb. 2.3). Im Folgenden ist der Begriff β-Alanin mit Alanin aufgrund der Literatur gleichzusetzen. Alanin wurde sowohl im RUSITEC-Inhalt als auch in den zugelegten Grassilagen nachgewiesen. In Kontrollsilagen konnten Alaninwerte von 1,5 bzw. 1,2 mg/g uS und in den Schad-silagen höhere Werte von 4,3 bzw. 5,2 mg/g uS gemessen werden (s. Tab. 4.3). Bei den Versuchen von WINTERS et al. (2001) wurden nach 14 Tagen Silierung Gehalte von 12,5 mmol/l in Grassilagen gemessen. Beim Vergleich dieser mehr als 1000fach höheren Werte (s. Tab. 4.3) sind die unterschiedliche Durchführung der Messung, der Silierzeitpunkt und das Probenausgangsmaterial zu beachten. WINTERS et al. (2001) erklären ihre Alaninergebnisse in den Grassilagen damit, dass Pflanzen nachweislich unter anaerobem Stress mit einem Anstieg der Alanin- und GABA-Gehalte reagieren. WHITTENBURY et al. (1967) beschrieb die Bildung von Alanin in Grassilagen als eine Folge der Desaminierung durch Clostridien durch eine Sticklandreaktion. Letztere beschreibt eine gleichzeitige gekoppelte Gärung zweier Aminosäuren durch Oxidation bzw. Reduktion selbiger mit dem Ergebnis der Desaminierung. Die höheren Gehalte von Alanin in den eigenen Untersuchungen der Schadsilagen lassen sich also zum einen durch die nach dem Schnitt länger ablaufende Proteolyse (GAST 2010; THEERMANN 2011) und zum anderen mit dem anaeroben Silierungsprozess erklären. Dabei spiegelt sich die angenommene Proteolyse auch in den geringeren RE-Gehalten der Schadsilagen wider (s. Tab. 9.3). Die Gehalte des flüssigen Fermenterinhaltes lagen im Mittel bei 0,2 bis 0,4 µmol/l Gesamtgehalt, wobei hier die Werte der Kontrollfermenter geringfügig über denen der Testfermenter lagen (s. Tab. 4.3). In den vorangegangenen Analysen von GRESNER (2011) und THEERMANN (2011) konnten mit den entsprechenden Derivatisierungen (FMOC-Chlorid bzw. OPA) Alaningehalte von 3,5–18,0 µmol/l in der Fermenter-flüssigkeit gemessen werden. Demnach befinden sich die eigenen analysierten Alaninergebnisse des flüssigen RUSITEC-Inhaltes unterhalb der vorherigen Ergebnisse. Im festen Fermenterinhalt lagen die Alanin-Werte bei rund 0,1 µg/g uS in allen Fermentern. Dabei hatten die Testfermenter teilweise etwas höhere Gehalte. Die Ergebnisse des festen Fermenterinhaltes können mangels Datenlage jedoch nicht weiter bestätigt werden. Auch die Bestimmung des relativ hohen LOD von 25 µmol/l in den Vorversuchen erschwert die Bewertung der Ergebnisse (s. Tab. 9.8). Die Analyse-ergebnisse können aufgrund der geringen Gehalte in den Fermenterproben nur ungenügend bestätigt werden. Dennoch sollen die folgenden, möglichen Zusammenhänge aufgezeigt werden:

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Bei GRESNER (2011) und THEERMANN (2011) sind bereits Aspekte des Vorkom-mens von Alanin im Pansen besprochen. Danach wird der Stoff sowohl synthetisiert, als auch metabolisiert. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten Alanin zudem als Bestandteil der Peptidoglycanwand von grampositiven und gramnegativen Pansenbakterien wie Selenomonas ruminantium, Veillonella spp. und Bacteroides spp. identifizieren (KAMIO et al. 1986; TAKATSUKA u. KAMIO 2004; AMETAJ et al. 2010). Aufgrund des Vorkommens von Alanin in der Zellwand von ruminalen Bakterien wurde der Stoff bereits für die Beurteilung einer funktionalen ruminalen Bakterienflora in Betracht gezogen, weil er bei Zelllyse (z.B. durch erhöhte Konzentratanteile in der Futterration) beträchtlich ansteigt (AMETAJ et al. 2010). In letzteren Untersuchungen konnten AMETAJ et al. (2010) bei Versuchen zu erhöhter Stärkezufuhr in einer Adaptationsphase von 11 Tagen und einer anschließenden Versuchsdauer von 10 Tagen keine negativen Effekte von Alaninkonzentrationen bis zu 415 µmol/l in der Pansenflüssigkeit auf die Tiergesundheit feststellen. In den eigenen Untersuchungen konnten zu Beginn der Zulagephase im festen Fermenterinhalt nur sehr geringe, nicht signifikante Unterschiede von Alanin zwischen den Fermentergruppen detektiert werden, sodass hier eine solche Zelllyse (AMETAJ et al. 2010) durch den Wechsel der Grassilage nicht vermutet wird. Bei BARKER (1981) wird der Umbau von Alanin zu GABA unter anaeroben Bedingungen durch verschiedene Clostridienspezies beschrieben. Danach ist der Stoffwechsel von Alanin unter ruminalen Bedingungen möglich. Zudem konnten RICKE et al. (1996) nachweisen, dass ruminale Mikroorganismen in der Lage sind, die Kohlenstoffgerüste der flüchtigen Fettsäuren zur Synthese von Alanin zu nutzen. ATASOGLU et al. (1998) konnten für Selenomonas ruminantium und Streptococcus bovis eine Transaminasereaktion nachweisen, die zur Bildung von Alanin führt. Im flüssigen Fermenterinhalt der Testfermenter wurde Alanin nur in geringeren Konzentrationen gefunden, obwohl der Input durch die Schadsilagen deutlich höher war (s. Tab. 4.3). Die Untersuchungen am RUSITEC lassen also vermuten, dass der Stoff zu einem wesentlichen Anteil von der Pansenpopulation genutzt wird (s.o.). Zusätzlich ist bekannt, dass bei der Metabolisierung von Alanin Ammoniak und GABA entstehen können (s. Abb. 2.3). Beide Stoffe wurden im RUSITEC nachgewiesen (s. Kap. 4.2, Kap. 4.5.25 u. Kap. 4.5.13) und ergaben in den Testfermentern (exkl. GABA des flüssigen Fermenterinhaltes im ersten Laufblock) höhere Konzentrationen, was die mögliche weitere Umsetzung von Alanin entsprechend des Inputs vermuten lässt. Die geringen Gehalte des Stoffes im RUSITEC lassen außerdem vermuten, dass Alanin von kurzer Halbwertszeit ist und in die Synthese von Ammoniak und GABA einfließt. Gleichzeitig können auch flüchtige Fettsäuren (z.B. Butyrat) in die Alanin-synthese eingehen (AMETAJ et al. 2010). Somit ist ein stetiger Wechsel zwischen Auf- und Abbau von Alanin unter ruminalen Bedingungen annehmbar. Hier besteht weiterer Forschungsbedarf, um den Stoffwechsel von Alanin im Pansen aufzuklären.

5.4.5 γ-Aminobuttersäure

Die nichtproteinogene Aminosäure GABA ist, wie das β-Alanin, ein Stoff, der beim Abbau von Polyaminen entsteht. Der Umfang dieses Stoffwechselweges wird bisher als gering eingeschätzt (SLOCUM et al. 1984; THEERMANN 2011).

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Vorkommen und Bedeutung von GABA in Gräsern, während der Grasernte (Gras-schnitt) und bei der Einsilierung sowie im Pansen sind in der Arbeit von THEERMANN (2011) detailliert aufgeführt. GABA wird vorrangig durch den GABA-Shunt, einen alternativen Weg zur Succinatsynthese in der Pflanzenzelle bereitgestellt. Es wird angenommen, dass die Synthese von GABA durch den Protonenverbrauch den Abfall des pH-Wertes in der Zelle verhindert, sodass die lebenswichtigen Enzymaktivitäten durch den sinkenden pH-Wert nicht gehemmt werden können (SNEDDEN et al. 1996; SHELP et al. 1999). Weiterhin kann GABA auch bei der anaeroben Glykolyse während der Silierung oder beim Abbau von Polyaminen entstehen (s. Abb. 2.3). GABA konnte in den eigenen Untersuchungen im RUSITEC ebenso nachgewiesen werden, wie in den eingesetzten Grassilagen (s. Tab. 4.3). In den verwendeten Kontrollsilagen wurden an der LC-MS/MS in 100 mg TS gefriergetrocknetem Material geringere GABA-Gehalte gemessen als in den Schad-silagen (K-30 bzw. K-32 je 0,2 mg/g uS vs. S-31:0,6 bzw. S-33:0,7 mg/g uS). Die durch EVONIK Nutrition & Care GmbH bestimmten GABA-Gehalte in den gefrier-getrockneten Grassilagen lagen bei den Kontrollsilagen ebenfalls bei geringeren 3,8 g/kg TS und in den Schadsilagen bei 9,6 bzw. 7,6 g/kg TS (s. Abb. 4.9). Die Ergebnisse waren somit vergleichbar mit den Werten in den Grassilagen, die THEERMANN (2011) in ihren Versuchen einsetzte. GABA entsteht in Pflanzen und damit in Grassilagen im Wesentlichen aus Glutamat. Daher wurde die Abhängigkeit der GABA-Gehalte vom Glutamat in den Auswertungen der Analyseergebnisse von 315 gefriergetrockneten Grassilagen betrachtet (s. Abb. 4.10). Die eingesetzten Schadsilagen wiesen höhere GABA-Gehalte auf, als die Kontrollsilagen. Zudem konnte in der Datenauswertung der Grassilagen die Abhängigkeit des GABA-Gehaltes vom Glutamat gezeigt werden. Danach führt ein hoher Anteil an Glutamat zu einem entsprechenden hohen Gehalt an GABA (s. Abb. 4.10). Darüber hinaus konnte analog zu THEERMANN (2011) eine Abhängigkeit von GABA vom RE/Rp-Quotienten festgestellt werden. Grassilagen mit einem geringen RE/Rp < 50 % wiesen einen höheren GABA-Gehalt auf, als Grassilagen mit einem RE/Rp > 50 %. Diese Ergebnisse verdeutlichen das angenommene Proteinabbaugeschehen, dessen Problematik die Grundlage für die vorgenommenen Versuche darstellt (s. Abb. 4.9). Im flüssigen Fermenterinhalt des RUSITECS im ersten Laufblock wurden im Vergleich mit dem zweiten Laufblock entgegen gerichtete Ergebnisse zwischen Test- und Kontrollfermentern gemessen (s. Tab. 5.1). Möglicherweise war das Mikrobiom der beiden Laufblöcke unterschiedlich zusammengestellt (GÖRES 2016; ILLE 2017), sodass GABA unter den Bedingungen des ersten Laufblockes schnell abgebaut werden konnte, während dies im zweiten Laufblock nicht der Fall war. THEERMANN (2011) stellte mit der FMOC-Chlorid-Derivatisierung Konzentrationen von 0,02–42,2 µmol/l in der flüssigen Phase der RUSITEC-Fermenter fest, die sich nur tendenziell durch höhere GABA-Gehalte während des Schadsilagezusatzes auszeichneten. Da die Messungen bei THEERMANN (2011) an einer HPLC-Anlage mittels FMOC-Chlorid-Derivatisierung erfolgte, ist der Vergleich nur eingeschränkt möglich, belegt aber die Ergebnisse der eigenen Analysen. Darüber hinaus wurden in diesen Unter-suchungen sehr heterogene Grassilagen als Schadsilagen eingesetzt, die

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entsprechend höhere Schwankungen verursachten. Den beobachteten Abbau von GABA im RUSITEC verdeutlicht Tab. 5.1. Tab. 5.1: GABA-Gehalte aus dem RUSITEC

Input (A–D) vs. Output (E & F) in Mikromol (Analysewerte der EVONIK Nutrition & Care GmbH (A & B) und der LC-MS/MS (C–F))

Grassilage bzw.

Fermenter

GABA in der Grassilage,

tgl. Einwaage

GABA je g uS in der

Grassilage, tgl.

Einwaage

Lösliches GABA in der Grassilage,

tgl. Einwaage

Lösliches GABA je g uS

Grassilage, tgl.

Einwaage

Lösliches GABA je g uS

im festen Fermenter-

inhalt*

GABA in flüssigem

Fermenter-inhalt*

Analytik je Spalte

A (EVONIK)

B (EVONIK)

C (LC-MS/MS)

D (LC-MS/MS)

E (LC-MS/MS)

F (LC-MS/MS)

Einheit je Spalte µmol/Tag µmol/Tag

je g uS µmol/Tag µmol/Tag je g uS

µmol total nach 48 h je g uS

µmol/l nach 48 h

K-30/KF-30 418,9 20,9 61,4 3,06 0,21 0,037

S-31/TF-31 977,5 25,3 124,0 3,21 0,28 0,024 S-31/ TF-31mS 977,5 25,3 124,0 3,21 0,28 0,019

K-32/KF-32 386,9 19,3 64,2 3,21 0,28 0,082 S-33/TF-33 733,8 17,7 136,0 3,28 0,50 0,168 S-33/ TF-33mS 733,8 17,7 136,0 3,28 0,56 0,166

Tägliche Einwaage je Futterbeutel in uS: K-30: 20,04 g; S-31: 38,6 g; K-32: 20,0 g; S-33: 41,5 g * Tägliche Messung im festen Fermenterinhalt nach 48 h Inkubationszeit (s. Kap. 3.2.3) Beim Vergleich des löslichen GABA-Gehaltes gemessen an der LC MS/MS in einem Gramm Grassilage (uS) fallen die unterschiedlichen Abbauraten zwischen den beiden Laufgruppen besonders auf (s. Tab. 5.1). In der Einwaage der eigenen Untersuchungen wurden in die Testfermenter des RUSITECS mit 3,21 bzw. 3,28 µmol/g uS löslichem GABA lediglich geringgradig höhere GABA-Gehalte gegeben als in die Kontrollfermenter (3,06 bzw. 3,21 µmol/g uS; s. Tab. 5.1 Spalte D u. Tab. 4.3). Geht man davon aus, dass lösliches GABA vollständig aus den Grassilagen freigesetzt wird, kann man bei einem flüssigen Fermenterinhalt von rund 600 ml einen totalen Input von bis zu 136 µmol GABA am Tag (entsprechend rund 227 µmol/l) aus den Grassilagen rechnen (s. Tab. 5.1 Spalte C). Wieviel vom festen, in den pflanzlichen Zellen der Grassilage gebundenen GABA nach 48 stündiger Inkubation aus dem RUSITEC mittels Futterbeutelaustausch entfernt wurde, fehlt bei dieser Abschätzung und bedarf weiterer Untersuchungen, denn die dargestellten löslichen GABA-Gehalte im festen Fermenterinhalt nach dem Verdau (s. Tab. 5.1, Spalte E) konnten aufgrund fehlender TS-Bestimmungen nicht genauer als Output umgerechnet werden.

Diskussion

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Da aber nur Maximalwerte von 0,17 µmol/l im flüssigen Fermenterinhalt gemessen wurden (s. Tab. 5.1 Spalte F), ist vermutlich ein messbarer GABA-Abbau von nahezu 100 % im Fermenter vollzogen worden. Die höheren GABA-Gehalte der Testfermenter (exkl. des flüssigen Fermenterinhaltes im ersten Laufblock) bestätigen also in unterschiedlichem Maß den bei THEERMANN (2011) angenommenen Einfluss des Inputs in beiden Laufblöcken. Auch in den eigenen Untersuchungen stieg der GABA-Gehalt mit Einsatz der Schadsilagen in den Testfermentern vorerst (mit oben genannter Ausnahme) an und fand dann in einer plateauähnlichen Phase ein Gleichgewicht zwischen Input und Abbaurate durch die Mikroorganismen, bevor der Einsatz von Kontrollsilage in der Erholungsphase wieder zur Reduktion der GABA-Gehalte führte (s. Abb. 4.22 u. Abb. 4.35). Aufgrund dieser Ergebnisse wird in den RUSITEC-Fermentern ein entsprechender mikrobieller Umsatz unterstellt. So konnten DAI et al. (2011) u. a. GABA als bevor-zugtes Substrat von Clostridium perfringens und Bacteroides fragilis nachweisen. COLE (1992) vermutete in seinen Studien einen mikrobiellen Abbau von GABA durch den Zusammenhang mit dem Ammoniak-Anstieg nach 24 Stunden. Auch bei DAWSON und MAYNE (1996) stieg bei zunehmender intraruminaler Infusion von GABA der Ammoniak-Gehalt an, was die mikrobielle Umsetzung annehmen lässt. Allerdings konnten RACKWITZ und GÄBEL (2016) eine passive Diffusion von GABA durch das Pansenepithel nachweisen, die aufgrund des technischen Aufbaus und der deutlichen Differenz zum Input nicht für die geringeren GABA-Gehalte im RUSITEC verantwortlich sein kann. So bleibt schlussendlich nachzuweisen, welche ruminalen Mikroorganismen in der Lage sind GABA abzubauen. Weitere Anhaltspunkte geben die Untersuchungen von THEERMANN (2011), die dem RUSITEC-System 0,10 bzw. 20 g/l GABA zuführte, was in beiden Fällen in 48 Stunden weitestgehend abgebaut wurde. Auch bei WANG et al. (2013c) konnte beim Vergleich der Zulage von 0,6 g/Tier/Tag pansengeschütztem bzw nicht geschütztem GABA ein deutlicher Unterschied im ruminalen Abbau zugunsten der nicht geschützten Formulierung festgestellt werden. Im Serum der Versuchsrinder wurden zudem entsprechend um 25 % gesteigerte GABA-Gehalte bei Fütterung von ungeschütztem GABA festgestellt. Die entgegen gerichteten Ergebnisse der Kontroll- und Schadsilagefermentern im flüssigen Fermenterinhalt können damit nur partiell im zweiten Laufblock erklärt werden (s. Abb. 4.22). Da in den Testfermentern in der Zulagephase des ersten Laufblockes nur wenig GABA nachgewiesen werden konnte, ergibt sich ein vermeintlich höherer GABA-Gehalt in den Kontrollfermentern. Eine Kaschierung der Gehalte durch mögliche Bindungsreaktionen kann hierbei nicht ausgeschlossen werden (THEERMANN 2011).

5.4.6 Evaluation der Polyamine und Aminosäuren im festen Fermenterinhalt

Im RUSITEC wurden Grassilagen (s. Tab. 9.3) über 48 Stunden in den Futterbeuteln abgebaut (fester Fermenterinhalt). Von Interesse war der Gehalt an Polyaminen und Aminosäuren nach dieser Zeit der Fermentation. Derartige Untersuchungen wurden in der Vergangenheit in vivo und in vitro vor allem zur Beurteilung des Futterwertes vorgenommen (TEJIDO et al. 2002; CARRO et al. 2004 u. OLT et al. 2004; DE JONGE 2015). Ergebnisse zum Gehalt von Polyaminen in der festen Phase liegen jedoch nicht vor.

Diskussion

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In der Literatur ist beschrieben, dass Polyamine wasserlöslich sind (s. Tab. 3.9) und dass sie in Pflanzen an phenolische Gruppen und an Proteine gebunden vorkommen können (FIXON-OWOO et al. 2003; BASSARD et al. 2010; ONKOKESUNG 2010; MARTIN-TANGUY 1997 u. SERAFININI-FRACASSINI et al. 1995). Daher wurde in den eigenen Untersuchungen geprüft, inwieweit die löslichen Polyamine und ihre korrespondierenden Aminosäuren im festen Fermenterinhalt und in den eingesetzten Grassilagen erfasst werden können. Denkbar ist, dass die Polyamine durch ihre Löslichkeit im Pansen freigesetzt werden. Dabei muss berücksichtigt werden, dass nicht unerhebliche Bakterienmengen am Ende des Verdaus an den restlichen Pflanzenfasern verbleiben und so die erhobenen Messwerte beeinflussen können (GRESNER 2011). Sowohl die Polyamine, als auch ihre korrespondierenden Aminosäuren konnten in den Analysematerialien nachgewiesen werden (s. Kap. 4.5). Die Methode wurde durch Berechnung der Variationskoeffizienten und Auswertung der internen und externen Standards überprüft (s. Tab. 9.7 u. Kap. 3.2.4.5.18). Damit sind die Untersuchungen diesbezüglich als Erfolg zu werten. Da bisher keine anderen Untersuchungen bekannt sind, die einen derartigen Nachweis von Polyaminen oder Aminosäuren im festen Panseninhalt unternommen haben, kann eine entsprechende Bewertung der Ergebnisse nicht vorgenommen werden. Daher sollte in zukünftigen Untersuchungen berücksichtigt werden, inwiefern sich die gebundenen Gehalte von Polyaminen oder Aminosäuren in Pflanzen verändern, um eine bisher nicht kalkulierte mögliche Wirkung durch Freisetzung dieser Stoffe folgerichtig einzuschätzen.

5.4.7 Ammoniak

Ammoniak ist das Hauptabbauprodukt aus dem Proteinkatabolismus und gleicher-maßen das wichtigste Substrat zur Protein- und Aminosäuresynthese durch die Mikro-organismen im Pansen. Es wird maßgeblich durch die HAP-Spezies (Hyper-ammonium-produzierende Bakterien) bereitgestellt (WALLACE et al. 2004). Bei GRESNER (2011) und IRLE (2011) sind die Zusammenhänge und Einflüsse auf den Ammoniakgehalt im RUSITEC detailliert aufgeführt. Die Messung von Ammoniak mittels Elektrode hat sich als eine geeignete Methode erwiesen, um die Fermentation im RUSITEC zu beurteilen und Rückschlüsse auf eine funktionale Flora zu ziehen (HÖLTERSHINKEN 1990; SCHIRMER 1990; BRÖKER 1996). Die im Vorfeld der eigenen Untersuchungen ermittelten Variationskoeffizienten (1,9–2,0 %) belegen die Funktionalität der Ammoniakmessung mit Ammoniakelektrode im Pansensaft (s. Tab. 3.7). In den vorliegenden RUSITEC-Versuchen wurden unter Schadsilagefermentation deutlich höhere Ammoniakgehalte gemessen (11,0–16,5 mmol/l), als bei Zuführung von Kontrollsilage (1,2–5,6 mmol/l). Dabei fiel der niedrige durchschnittliche Ammoniakgehalt (1,3 mmol/l) der Kontrollfermenter (KF-32) im zweiten Laufblock auf. Dieser war deutlich geringer als der in den vorherigen Studien (s. Tab. 2.1). Auffällig größer waren im zweiten Laufblock auch die Schwankungen der Messergebnisse unter Schadsilagezusatz, was möglicherweise auf den längeren Einsatz der Membran4 und die Empfindlichkeit der Messelektrode zurück zu führen ist (s. Abb. 4.5). 4 Laut persönlicher Mitteilung von Dr. M. Höltershinken am 08.06.2015

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Der von SATTER und SLYTER (1974) in in-vitro-Studien ermittelte Ammoniakgehalt von 2,0 mmol/l im Pansen wurde lange als Untergrenze für eine maximale bakterielle Proteinproduktion angesehen. In einer späteren Stellungnahme dazu wurde jedoch erklärt, dass Ammoniak im Pansen von sehr geringen Gehalten, die kaum detektierbar sind, bis 20 mmol/l vorkommen kann (SATTER u. SLYTER 1989). In der Folge bestimmten SCHAEFER et al. (1980) Ammoniak-Sättigungskonstanten für dominierende ruminale Bakterienspezies (Bacteroides amylophilus, Prevotella ruminicola, Selenomonas ruminantium, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens, Butyrivibrio fibrisolvens und Megasphaera elsdenii) in vitro. Sie konnten Sättigungskonstanten von 0,006–0,045 mmol/l feststellen und schlossen daraus, dass eine Ammoniakkonzentration von 1,0 mmol/l im Pansen für ein maximales spezifisches Bakterienwachstum von 95 % erforderlich ist. Hingegen konnte DIXON (1999) im Panseninhalt von Schafen bei reiner Heufütterung Ammoniakgehalte von umgerechnet weniger als 0,59 mmol/l unter physiologischen Bedingungen ermitteln. Mit diesen Erkenntnissen wird der gemessene Ammoniakgehalt in KF-32 von rund 1,3 mmol/l als annehmbar gewertet. Zudem belegen die Ergebnisse der flüchtigen Fettsäuren (Essig-, Propion-, Hexan-, n-Valerian- und n-Buttersäure) und die der produzierten Gase (Gasvolumen sowie Methan- und Kohlenstoffdioxidkonzen-trationen; s. GÖRES 2016) sowie die pH-Werte und das gemessene bakterielle Protein (ILLE 2017) eine aktive Fermentation im RUSITEC. Die Resultate der i-Butter- und der i-Valeriansäure, sowie deren Produktion über 24 Stunden bestätigen einen erhöhten Proteinstoffwechsel bzw. gesteigerten Aminosäureabbau in den Testfermentern während der Zulagephase im RUSITEC (s. Abb. 4.1–4.4). Betrachtet man die in den eigenen Untersuchungen ermittelten Ammoniakgehalte im Vergleich zu den von GRESNER (2011) und IRLE (2011) im RUSITEC unter Schadsilagezusatz ermittelten NH3-Gehalten, so stimmen die Streuungen der Mess-werte überein. Dabei lagen die ermittelten Ammoniakgehalte deutlich unterhalb der für den Pansen in der Literatur beschriebenen Toxizitätsgrenzen von > 58,7 mmol/l (PATRA 2015). Die Sojazulage führte erwartungsgemäß zu den höchsten Ammoniakgehalten, obwohl sich die Testfermenter mit und ohne Sojazusatz letztendlich in ihren absoluten Gehalten vergleichsweise wenig unterschieden (s. Abb. 4.5 u. Tab. 9.19 sowie Tab. 9.20). Es wird angenommen, dass die Proteinzulage durch Soja zu einer höheren Metabolisierung selbiger durch die Pansenflora im RUSITEC führte, die sich in höherer Ammoniakanflutung wiederspiegelte. Eine entsprechende Erhöhung der Ammoniakgehalte durch Sojapeptidfermentation wurde auch bei WANG et al. (2013a) vorgefunden. Die Forscher schließen aus ihrer Studie, dass die intraruminale Infusion von Sojapeptiden den Abbau letzterer steigert und damit erhöhte Ammoniakgehalte entstehen. Darüber hinaus wurde eine verbesserte mikrobielle Proteinsynthese beobachtet und die Bakterienflora im Pansen verschob sich zugunsten von Butyrivibrio fibrisolvens. Eine Verschiebung der Bakterienflora und vor allem der HAP-Spezies ist durch den hohen Gehalt an freien Aminosäuren in den Schadsilagen der vorherigen Untersuchungen ebenfalls anzunehmen (GAST 2010; GRESNER 2011; IRLE 2011; LUMPP 2011). Nachweislich können Bakteriozine von Butyrivibrio fibrisolvens und Streptococcus bovis die Population der HAP-Spezies regulieren und ein überschießendes Wachstum

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eindämmen (RYCHLIK u. RUSSELL 2000; LIMA et al. 2009). Auch phenolische Komponenten, wie α- und b-Säuren (z.B. im Hopfen) können die HAP-Spezies hemmen (FLYTHE u. KAGAN 2010; KAGAN u. FLYTHE 2012; HARLOW et al. 2016). Die geringeren Ammoniakgehalte in den Kontrollfermentern könnten somit durch den Einfluss von Bakteriozinen oder phenolischen Säuren zustande gekommen sein (s. a. GÖRES 2016). In den Testfermentern hingegen scheint die Fermentation der ruminalen Bakterien nicht gehemmt worden zu sein bzw. ist vermutlich eine erhöhte Verfügbarkeit von freien Aminosäuren (s. Kap. 4.3) und Protein durch den Silage-Input für die Ammoniakgehalte verantwortlich und dem Abbau bzw. der Synthesehemmung überlegen (s. Abb. 5.2). Denkbar ist auch, dass sich die ruminale Mikroflora im RUSITEC dahingehend verschob, dass die proteo- und peptidolytischen Spezies weniger aktiv waren. Damit stünde den HAP-Spezies zu wenig Substrat in Form von freien Aminosäuren zur Ammoniakbildung zur Verfügung bzw. nur die bereits zur Verfügung stehenden freien Aminosäuren direkt aus den Grassilagen (s. Abb. 5.2). Die Rohproteingehalte von K-30 und K-32 unterscheiden sich mit 170 bzw. 152 g/kg TS nur gering und lassen wenig Rückschlüsse auf die Verfügbarkeit der freien Aminosäuren zu (s. Tab. 9.3). Warum die Kontrollsilage K-32 per se eine so geringe Ammoniakkonzentration im RUSITEC bewirkte, kann letztendlich derzeit nicht erklärt werden. Möglicherweise sind die wenigen freien Aminosäuren (s. Tab. 5.2) in K-32 so eingebunden, dass diese den HAP-Spezies nicht zur Verfügung stehen. Folglich ist die genaue Regulation der HAP-Spezies im Pansen ein wichtiger Aspekt, der stark von der Verfügbarkeit von freien Aminosäuren abhängt und in Zukunft genauer in Betracht gezogen werden sollte. Es bedarf also weiterer Untersuchungen, um die Zusammenhänge zu klären.

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163

Versuchs- phase L31–L38

Einl

aufp

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bzw

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(Kon

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Zula

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Abb. 5.2: Möglicher Einfluss der freien Aminosäuren sowie Phenolsäuren (GÖRES 2016) und

der ruminalen Bakterienspezies (ILLE 2017) auf die HAP-Spezies und die absolute Ammoniakproduktion in beiden RUSITEC-Laufblöcken; fAS: freie Aminosäuren (mikrobiell freigesetzt und frei im Futter vorkommend), grau hinterlegte Pfeile zeigen die Zunahme der Stoffströme an.

fAS ⇡

NH3 ⇡

+-

MaisstärkeGrassilageK-30/K-32

MaisstärkeGrassilageK-30/K-32

B. fibrisolvens, Sc. Bovis u.a.

Proteo- und peptidolytischeSpezies

HAP-Spezies

Bakteriozine ⇡

-

Phenol-Säuren ?

fAS ⇡

fAS ⇡

fAS ⇡⇡⇡

NH3 ⇡⇡⇡

+-

MaisstärkeGrassilageS-31/S-33Soja

MaisstärkeGrassilageS-31/S-33Soja

B. fibrisolvens, Sc. Bovis u.a.

Proteo- und peptidolytischeSpezies

HAP-Spezies

Bakteriozine ⇡

-

Phenol-Säuren ?

fAS ⇡⇡⇡

fAS ⇡⇡⇡

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164

5.4.8 Flüchtige Fettsäuren: i-Butter- und i-Valeriansäure

Aufgrund des Bezugs zum Proteinstoffwechsel werden an dieser Stelle nur die verzweigtkettigen i-Fettsäuren (i-Valerian- und i-Buttersäure) besprochen, alle übrigen erfassten Fettsäuren sind bei GÖRES (2016) diskutiert. Die verzweigtkettigen i-Säuren entstehen in erster Linie durch den Abbau von freien Aminosäuren und Peptiden in der Pansenflüssigkeit (BLADEN et al. 1961; CARRO u. MILLER 1999). Erhoben wurde jeweils die Konzentration im Fermenter vor der Beladung und die in 24 Stunden produzierten Gehalte der flüchtigen i-Fettsäuren in der Überstands-flüssigkeit, um die bakterielle Synthese im RUSITEC nachzuweisen (s. Kap. 3.2.4.1). Die im RUSITEC gemessenen Gehalte der i-Buttersäure lagen in den Kontrollsilagen unter denen der Schadsilagen mit 0,8–1,0 vs. 1,5–2,0 mmol/l. Gleiches war auch bei den über 24 Stunden produzierten Gehalten in der Überstandsflüssigkeit zu beobachten (0,3–0,4 vs. 0,6–0,7 mmol/24 h; s. Abb. 4.1 u. Abb. 4.2). Diese Ergebnisse liegen im Bereich der von LUMPP (2011) analysierten Werte im RUSITEC bei Einsatz von Schad- und Kontrollsilagen und lassen somit ein intaktes RUSITEC-System vermuten. Auch die i-Valeriansäure zeigte deutliche Unterschiede zwischen den Kontroll- und Testfermentern. Unter Kontrollsilage wurden 2,3–4,1 mmol/l in der Fermenter-flüssigkeit gemessen, während der Zusatz von Schadsilage im RUSITEC zu Werten von 3,4–11,3 mmol/l führte. Die über 24 Stunden produzierten Gehalte in der Überstandsflüssigkeit verhielten sich analog (0,9–1,4 vs. 2,2–4,6 mmol/24 h). Auch diese Ergebnisse sind mit denen von LUMPP (2011) vergleichbar. Als Ausgangssubstanzen der verzweigtkettigen Fettsäuren sind die Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Prolin und Valin beschrieben (BLADEN et al. 1961; ANDRIES et al. 1987). Gleichzeitig bedeutet der mikrobielle Abbau dieser N-Stoffwechselprodukte im Umkehrschluss auch einen Anstieg von Ammoniak, der sich in den eignen Ergebnissen widerspiegelt und diese Vorgänge belegt (s. Abb. 4.5). LUMPP (2011) postulierte daher, dass eine Fortsetzung der Proteolyse im RUSITEC während der Schadsilagefermentation zu höheren Mengen frei vorkommender Aminosäuren und kleinen Proteinabbauprodukten führt und einen entsprechenden Anstieg von Ammoniak und flüchtigen i-Fettsäuren zur Folge hat. Eine Anreicherung der flüchtigen i-Fettsäuren durch eine geringere mikrobielle Nutzung wird in den vorliegenden Untersuchungen nicht angenommen, denn das würde sich möglicherweise hemmend auf die mikrobielle Population und die Produktion ihrer Stoffwechselparameter auswirken. Eine Hemmung der Mikroflora kann jedoch durch die anderen erfassten Parameter (NH3 und flüchtige Fettsäuren s. Kap. 5.4.7 u. Kap. 5.4.8) ausgeschlossen werden. Auch die Gehalte an bakteriellem Protein (ILLE 2017) sowie die Gasproduktion (GÖRES 2016) sprechen für eine aktive Pansenflora im RUSITEC. Es wird vermutet, dass die Fermentation von Schadsilagen eine Populationsverschiebung in Richtung übermäßig Ammoniak produzierender HAP-Spezies zu Folge hat (GRESNER 2011; GRESNER et al. 2015; s. Kap. 5.4.7). Dafür ist das Vorliegen freier Aminosäuren essentiell, was die Annahme der Proteolyse von LUMPP (2011) belegt.

Diskussion

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WANG et al. (2015) konnten durch Supplementierung von Isobutyrat in den Pansen einen Anstieg der gesamten Bakterienpopulation sowie eine Verschiebung zugunsten der zelluloseabbauenden Bakterien nachweisen. Aufgrund dessen ist eine ent-sprechende Verschiebung der Population in den eigenen Untersuchungen durch den Einsatz der Schadsilagen annehmbar. Auch GÖRES (2016) postulierte eine Verschiebung des Pansenmikrobioms, die sich im ersten Laufblock in einer erhöhten Propionat- und im zweiten Laufblock in einer vermehrten Butyratbildung zeigte. Dabei bestehen in den hier vorliegenden Untersuchungen ebenfalls Unterschiede zwischen beiden Laufblöcken. So führte der Zusatz von Schadsilage in den RUSITEC-Fermentern zu einer Steigerung der i-Buttersäuregehalte in den Testfermentern von +60 % im ersten bzw. +108 % im zweiten Laufblock und verhielt sich damit ähnlich wie die Ammoniakproduktion, die auch im zweiten Laufblock deutlich mehr gesteigert war. Für die i-Valeriansäure konnte eine Steigerung von +154 % im ersten und eine geringere Steigerung von +145 % im zweiten Laufblock beobachtet werden (s. Tab. 4.1). Gestützt wird die Populationsverschiebungstheorie durch die höheren Gehalte an mikrobiellem Protein während des Schadsilagezusatzes, obwohl die Methodik zur Bestimmung des Proteins Schwierigkeiten barg (ILLE 2017). DEHORITY et al. (1967) stellten bei der Untersuchung des Einflusses von i-Säuren auf Pansenbakterien je nach Stamm einen Wachstumsvorteil bei verschiedenen Bacteroides- und Ruminococcus-Spezies fest. LI et al. (2012) konnten in ihren Studien feststellen, dass erhöhte Butyratgehalte die Butyratbildner stimulieren. Bei GÖRES (2016) ist beschrieben, dass bei hohen Rohfasergehalten in der Ration Butyrivibrio fibrisolvens unter Butyratzulage ansteigt, während Prevotella ruminicola absinkt. Bei Fütterung von Grassilage konnte VAN GYLSWYK (1990) speziell bei den Bakterienspezies Megasphaera elsdenii, Selenomonas ruminantium und Prevotella ruminicola die Bildung von Isovaleriat und Isobutyrat nachweisen. Für beide erstgenannten Bakterienspezies werden in den eigenen Untersuchungen am RUSITEC Wachstumsvorteile vermutet (s. Kap. 5.4.1). Dass die verzweigtkettigen Fettsäuren auch retrograd zur Bildung von freien Aminosäuren durch Megasphaera elsdenii und Prevotella ruminicola genutzt werden, konnten ALLISON und PEEL (1971) nachweisen. So ist anzunehmen, dass auch Megasphaera elsdenii und Prevotella ruminicola im RUSITEC für die Bereitstellung der Aminosäuren von Bedeutung sind. OLTJEN et al. (1971) konnten bei reiner Sojazulage im Pansen höhere Gehalte von i-Säuren nachweisen und vermuteten ebenfalls eine Verschiebung zugunsten von zelluloseabbauenden Bakterienspezies. Sie nahmen eine bessere Aminosäure-verfügbarkeit durch die Sojazulage an. Diese Annahme erklärt die zum großen Teil signifikant höheren i-Butter- und i-Valeriansäuregehalte der Testfermenter mit Soja-zulage in den eigenen Untersuchungen. Schließlich komplettieren auch die gemessenen Ammoniakgehalte bezüglich der Sojazulage eine entsprechende Hypo-these (WANG et al. 2013a). So zeigt sich ein dynamischer und vielseitig beeinflusster Auf- und Abbau der flüchtigen i-Fettsäuren, dessen Gleichgewicht vor allem durch die vorkommende Mikroflora und die durch die Fütterung der zur Verfügung stehenden Substrate im RUSITEC gesteuert wird.

Diskussion

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5.4.9 Zusammenhang zwischen i-Buttersäure, i-Valeriansäure und Ammoniak

Die i-Valerian- und die i-Buttersäure werden im Pansen in erster Linie aus den drei Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Prolin und Valin gebildet (s. HÖLTERSHINKEN 1990 sowie BLADEN et al. 1961; ANDRIES et al. 1987). Hypothetisch sollte in einer Input-Output-Bilanz aus einem Mol freie Aminosäuren je ein Mol Ammoniak und ein Mol flüchtige i-Fettsäuren entstehen. Der Vergleich des In- und Outputs ist in Tabelle 5.2 und 5.3 wiedergegeben. Tab. 5.2: Täglicher Input der freien Aminosäuren (fAS) durch die Grassilagen je Fermenter vs.

täglicher Output von flüchtigen i-Fettsäuren und Ammoniak (Analyseergebnisse von EVONIK Nutrition & Care GmbH vs. eigene HPLC- und Messelektroden-Analysen [mmol/l])

Futter Parameter Einheit K-30 S-31 K-32 S-33

Input Ʃ fAS pro Fermenter mmol/l

pro Tag

0,01 0,03 0,01 0,02

Isoleucin 0,003 0,008 0,003 0,006 Leucin 0,006 0,014 0,004 0,008 Valin 0,005 0,012 0,004 0,010

Fermenter Parameter Einheit KF-30 TF-31 TF-

31mS KF-32 TF-33 TF-33mS

Output NH3

mmol/l pro Tag

4,69 12,6 14,1 1,33 14,0 15,2 i-Buttersäure-produktion 0,42 0,67 0,70 0,29 0,60 0,62

i-Valeriansäure-produktion 1,42 3,63 3,66 0,90 2,18 2,23

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Tab. 5.3: Mittlere tägliche prozentuale Abweichung des Inputs der freien Aminosäuren (fAS; Analyseergebnisse von EVONIK Nutrition & Care GmbH) in den Schadsilagen bzw. Testfermentern von den Kontrollsilagen bzw. Kontrollfermentern vs. Output der flüchtigen i-Fettsäuren und Ammoniak (eigene Analysen) [%]

Futter Parameter S-31 S-33

Input Ʃ fAS pro Fermenter +425,8 +451,0 Isoleucin +125,4 +139,8 Leucin +163,9 +171,0 Valin +136,5 +140,2

Fermenter Parameter TF-31 TF-31mS TF-33 TF-33mS

Output NH3 +167,7 +199,8 +952,9 +1041 i-Buttersäureproduktion +60,0 +68,5 +109,7 +115,2 i-Valeriansäure-produktion +154,5 +156,2 +145,7 +150,8

Am Abbau der freien Aminosäuren sind nur wenige Mikroorganismen beteiligt. Dazu zählen Megasphaera elsdenii und Allisonella spp. und vor allem die HAP-Spezies (Clostridium aminophilum, Clostridium sticklandii, Peptostreptococcus anaerobians und Eubacterium pyruvativorans; PUNIYA et al. 2015; WALLACE et al. 2004). Letztere machen nur ein bis fünf Prozent der gesamten ruminalen Flora aus und besitzen die Fähigkeit, übermäßig viel Ammoniak zu bilden (GRESNER 2011). Die HAP-Spezies nutzen die Desaminierung gleichermaßen zur Proteinsynthese und Energie-gewinnung, sind aber selbst nicht, wie die meisten anderen Pansenbakterien, mit proteolytischen Enzymsystemen ausgestattet und daher auf diese anderen Spezies angewiesen (s. GRESNER et al. 2014). Vor dem Hintergrund, dass in den vorliegenden Studien nur die i-Valerian- und die i-Buttersäure als Vertreter der freien Fettsäuren gemessen werden konnten, ist die anfangs dargestellte hypothetische Gleichung ungenau, verdeutlicht jedoch die hohe Aktivität der an der Desaminierung beteiligten Mikroorganismen bei der Fermentation der Schadsilagen. Auch die hohen Ammoniakgehalte im zweiten Laufblock in TF-33 und TF-33mS bestätigen dieses Fermentationsgeschehen. Die vermutlich hohen Gehalte der freien Aminosäuren im Sojaschrot konnten nicht bestimmt werden und treten daher als Unbekannte Größe in den Testfermentern mit Sojazulage auf, die den Output von i-Butter- und i-Valeriansäure sowie Ammoniak erhöht (s. Tab. 5.3). Aus dem Produkt Ammoniak kann auch wiederum bakterielles Protein gebildet werden. Für die Bildung von bakteriellem Protein sind die Verfügbarkeit von Energie sowie das Vorhandensein der Glutamin-Synthase bedeutend (SCHAEFER et al. 1980). Aus energetischer Sicht sind zwischen den Fermentern beider Laufblöcke und innerhalb der Fermentergruppen nur marginale Unterschiede festgestellt worden, sodass dieser Einflussfaktor als gering eingestuft werden kann (GÖRES 2016). Die Studien von ERDMAN et al. (1986) zeigen auf, dass abhängig von der Futter-

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zusammensetzung sehr unterschiedliche minimale Ammoniakgehalte im Pansen zur maximalen Verdaulichkeit erforderlich sind. DING et al. (2015) untersuchten die Auswirkungen der Futterqualität auf die ruminale Verdaulichkeit von Protein. In ihren Studien stieg der Gehalt der i-Valeriansäure deutlich an, wenn Futtermittel von hoher Verdaulichkeit eingesetzt wurden. Bei der i-Buttersäure hingegen wurde ein so deutlicher Unterschied in diesen Studien nicht beobachtet. Die Ammoniakgehalte schwankten bei DING et al. (2015) in Abhängigkeit der Zeit nach der Fütterung zwischen umgerechnet 0,59–9,43 mmol/l. Bei Einsatz von Futtermitteln minderer Qualität mit höheren Hemizellulosegehalten in der letzt-genannten Studie wurde eine geringere Verdaulichkeit festgestellt und die i-Valerian-säure fiel ebenfalls geringer aus. Auch GÖRES (2016) konnte einen Einfluss der Gerüststrukturen in den eingesetzten Grassilagen feststellen, welche die Gehalte an flüchtigen i-Fettsäuren und Ammoniak der eigenen Untersuchungen bestätigen. HACKMANN und FIRKINS (2015) konnten in ihren Untersuchungen zur Optimierung der mikrobiellen Proteinproduktion herausstellen, dass die Verfügbarkeit der Kohlenhydratquelle und die verfügbare Stickstoff-Form einen wesentlichen Beitrag zur Nutzung von ruminalem Ammoniak leisten. So bildet die ruminale Flora die Aminosäuren L-Alanin, L-Glutamin und L-Glycin aus Ammoniak (SALEEM et al. 2013). Besteht ein Ammoniaküberschuss, kommt es zu Energieverlusten. Am schnellsten wachsen ruminale Mikroorganismen bei zur Verfügung stehenden freien Peptiden, gefolgt von freien Aminosäuren und am langsamsten ist ihr Wachstum, wenn die Stickstoffquelle aus Ammoniak gebildet wird. Liegen zudem Kohlenhydratquellen von geringerer Verdaulichkeit vor, so reduziert sich die mikrobielle Synthese ebenfalls (RICKE et al. 1996). Somit wird deutlich, dass sich die eingangs angenommene Gleichung, dass ein Mol freie Aminosäuren je ein Mol Ammoniak und ein Mol flüchtige i-Fettsäuren ergeben, in den RUSITEC-Versuchen nicht bestätigt (s. Tab. 5.2 u. Tab. 5.3). Danach könnte zum einen eine Verschiebung der mikrobiellen Flora im RUSITEC, bedingt durch die Gehalte an freien Aminosäuren bzw. die leichter abbaubare Rohfaser als Ursache für entsprechend hohe Abweichungen in den Ammoniakgehalten in Frage kommen (GRESNER et al. 2015). Zum anderen ist auch ein Unterschied in der Aufschließbarkeit der Faserbestandteile der eingesetzten Grassilagen denkbar (GÖRES 2016), der entsprechend weniger freie Aminosäuren bereitstellt, was sich auch in den Ergebnissen der Aminosäureanalysen der Grassilagen durch EVONIK Nutrition & Care GmbH wiederfindet. (s. Kap. 3.2.4.4 u. Tab. 9.3).

5.5 Schlussfolgerung und Ausblick

Der Fokus dieser Dissertation lag auf dem Stoffwechsel von Aminen im Pansen in vitro bei Einsatz von Grassilagen mit einem nasschemisch bestimmten RE/Rp-Quotienten von < 50 % vs. > 50 %. Zum ersten Mal wurden Polyamine und ihre entsprechenden Aminosäuren aufgrund ihrer Bindungseigenschaften auch im festen Fermenterinhalt bestimmt und nachgewiesen. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass in bisherigen Untersuchungen zu Polyaminen und Aminosäuren im Pansen der Anteil an gebundenen Stoffen nicht berücksichtigt wurde. Darüber hinaus wurde nach unserem

Diskussion

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Wissen der direkte Bezug zwischen den Aminen bzw. Polyaminen und ihren korres-pondierenden Aminosäuren im Pansen und in den eingesetzten Grassilagen hergestellt, der nicht nur einzelne Stoffe analysiert, sondern die Komplexität des Zusammenhangs zwischen der Polyaminsynthese und dem Polyaminkatabolismus mit ihren weitreichenden Verknüpfungen im Organismus veranschaulicht. Der Einsatz von Grassilagen mit einem geringen Reineiweißanteil am Rohproptein im RUSITEC führte zu nahezu unbeeinflussten (Cadaverin) oder geringeren Amin- bzw. Polyamingehalten im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen (Putresin, Spermidin, Spermin und b-Alanin). Das Masse-zu Ladungsverhältnis m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) zeigte unterschiedliche Ergebnisse in beiden Laufblöcken und GABA wies höhere Gehalte bei Einsatz oben genannter Grassilagen auf. Dabei sind die gemessenen Werte im RUSITEC primär als nicht toxisch anzusehen (s. Kap. 2.2.7 bzw. THEERMANN 2011). Dass der pH-Wert nicht der alleinige Faktor für die Bildung von Aminen und Polyaminen ist, sei an dieser Stelle noch einmal hervorgehoben. So wurden bei VAN OS et al. (1997) sowohl unter Einsatz von Kontroll- als auch mit Aminen versetzter Grassilage pH-Werte von ≥ 6,5 im Pansen nachgewiesen und Amine sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Versuchsgruppe und in beiden Grassilagen detektiert. Der bei EICKEN (2005a) beschriebene positive Effekt der Sojazulage konnte nicht mit dem Gehalt von Polyaminen im RUSITEC in Verbindung gebracht werden. Lediglich die Fermentation der Bakterien wurde durch die Sojazulage beeinflusst, was sich in der Produktion der höheren Ammoniak- und flüchtigen i-Fettsäuregehalte zeigte. In Zukunft sollte das Augenmerk auf die mögliche biologische Wirksamkeit von weiteren Abbauprodukten und reaktiven Verbindungen aus dem Polyaminstoffwechsel gelegt werden. Darüber hinaus werden zunehmend sogenannte ungewöhnliche Polyamine vor allem in stressresistenten Pflanzen nachgewiesen, die möglicherweise akkumulieren und sekundär toxisches Potential entwickeln können (OBER u. KALTENEGGER 2009; BASSARD et al. 2010; MAYR u. SCHIEBERLE 2012). Letzteres könnte im Hinblick auf die Pflanzenzucht eine mögliche Ursache für die Faktorenerkrankung Milchviehherde darstellen. Es bleibt also in Zukunft Folgendes zu untersuchen:

• Mit welchen enzymatischen Mechanismen werden Amine und Polyamine durch die mikrobielle Pansenflora bereitgestellt bzw. abgebaut?

• Welche Pansenbakterien sind vorrangig am Stoffwechsel von Aminen beteiligt? • Welche Stoffwechselprodukte können aus Aminen und Polyaminen im Pansen

entstehen und wie toxisch sind diese für den Organismus? • Welche Aminverbindungen werden im Pansen generiert? • Kommen ungewöhnliche Polyamine in Grassilagen und im Pansen vor?

Betrachtet man den Zusammenhang zwischen ruminalen Stickstoff- und Kohlenhydratquellen, so wird deutlich, dass sowohl die Form der Stickstoff- als auch die Form der Kohlenhydratquellen erhebliche Schwankungen in der Produktion von Ammoniak und flüchtigen Fettsäuren sowie mikrobiell synthetisiertem Protein im Pansen verursachen können (BRODERICK 2003; HRISTOV u. ROPP 2003; DING et al. 2015; HACKMANN u. FIRKINS 2015; MERTZ u. WOSKOW 2015). Vor diesem Hintergrund erscheint es sinnvoll, Futtermittelanalysen entsprechend aufzugliedern, um ein eventuell technisch- oder witterungsbedingtes Defizit in der Ration präziser ausgleichen zu können und einen möglichen Energieverlust zu vermeiden.

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Thomsen, A. (2018): Untersuchungen zum Stoffwechsel von Aminen und Polyaminen bei Einsatz von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißgehalten unter Zulage von Soja im Pansen in vitro

Seit dem Jahr 2005 besteht Grund zur Annahme, dass die Fütterung von Grassilagen mit einem prozentual niedrigen Reineiweißanteil am Rohprotein von RE/Rp < 50 % die nutritive Ursache für das unspezifische Krankheitsbild der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ in norddeutschen Milchviehbetrieben ist. Eine frühzeitige Ergänzung der Ration mit Sojaextraktionsschrot als alternative Proteinquelle konnte das Krankheitsgeschehen abfangen. Vorangegangene Untersuchungen zum Einfluss von entsprechenden Schadsilagen auf die Fermentation im Langzeitinkubationssystem RUSITEC konnten einen Anstieg von sekundären Pflanzenstoffen, freien Aminosäuren sowie eine Verschiebung der Fermentationsprodukte Ammoniak, flüchtige Fettsäuren und des Gasvolumens und der Gaszusammensetzung durch eine Veränderung der mikrobiellen Flora aufzeigen. Der Schwerpunkt dieser Dissertation lag auf dem Stoffwechsel von potentiell schädlichen Aminen und Polyaminen im RUSITEC bei Fermentation von Grassilagen mit einem Quotienten von RE/Rp < 50 % und dem Einfluss einer Sojazulage. Als in-vitro-Modell des Pansens wurde der RUSITEC mit sechs Fermentern in acht Läufen à 28 Tage verwendet. Die eingesetzten Futtermittel bestanden aus zwei Kontroll- und zwei Schadsilagen (RE/Rp >50 % bzw. RE/Rp < 50 %), jeweils von derselben landwirtschaftlichen Nutzfläche, sodass Laufblock I (L31–L34) Schad- und Kontrollsilage von Betrieb A und Laufblock II (L35–L38) entsprechend Schad- und Kontrollsilage von Betrieb B enthielten. In allen sechs Fermentern wurde Maisstärke als Energiequelle hinzugegeben. Nach achttägiger Einlauf- und Kontrollphase wurde in die vier Testfermenter Schadsilage gegeben und zwei dieser Fermenter wurden mit Sojaprotein supplementiert (zehntägige Zulagephase). Zwei Fermenter blieben über die gesamte Dauer als Kontrollfermenter mit unveränderter Fütterung bestehen. Am Ende schloss sich eine zehntägige Erholungsphase unter Kontrollsilagezusatz an. Die Analyse der Polyamine erfolgte mit der LC-MS/MS (Flüssigchromatographie gekoppelt mit mehrfacher Massenspektrometrie). Dafür wurde auf Basis der Untersuchungen von HÄKKINEN et al. (2007) eine geeignete modifizierte Methode entwickelt, um die löslichen Amine und Polyamine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin, β-Alanin, GABA und m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) sowie die korrespondierenden Aminosäuren ohne Derivatisierung im flüssigen und im festen Fermenterinhalt zu detektieren. Zudem wurde Ammoniak mittels Ammoniakelektrode und die flüchtigen i-Fettsäuren i-Butter- und i-Valeriansäure gaschromatografisch bestimmt. In den Ergebnissen zeigte sich, dass die Fermentation von Schadsilagen im flüssigen Fermenterinhalt des RUSITECs während der Zulagephase (Tag 10–19) mit Ausnahme von Cadaverin und GABA zu geringeren Polyamingehalten von -13,5 bis -60,3 % im Vergleich zur Kontrolle führte. Cadaverin und GABA zeigten im ersten Laufblock ebenfalls geringere Gehalte in den Testfermentern gegenüber der Kontrollfermenter

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(-13,2 bzw. -36,1 %), im zweiten Laufblock hingegen war die Abweichung zu den Kontrollen positiv (+9,8 bzw. 127 %). Die korrespondierenden Aminosäuren waren unter Schadsilagezulage im flüssigen Fermenterinhalt erhöht (+1,6 bis +25,4 %). Auch im festen Fermenterinhalt aus den Futtersäcken (nach 48 Stunden Inkubation) wurden unter Schadsilagefermentation im Vergleich zur Kontrollsilagefermentation während der Zulagephase geringere Amingehalte detektiert (-7,8 bis -43,9 %). Ausnahmen bildeten hier Cadaverin mit geringgradig positiven Abweichungen der Testfermenter von +1,8 bis +3,7 %, β-Alanin und m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) mit entgegen gerichteten Abweichungen in den Laufblöcken (L31–L34: +9,3 % bzw. -48,2 % und L35–L38: -44,3 % bzw. +14,6 %) und GABA mit positiven Abweichungen von den Kontrollfermentern, die im zweiten Laufblock deutlich höher waren (L31–L34: +33,3 % bzw. L35–L38: +88,7 %). Mit Ausnahme von L-Arginin, welches im zweiten Laufblock negative Abweichungen in den Testfermentern gegenüber der Kontrollfermenter von -11,8 % aufwies, waren die korrespondierenden Aminosäuren unter Schadsilagezusatz im festen Fermenterinhalt des RUSITECS erhöht (+4,6 bis +54,3 %). L-Lysin verhielt sich wieder entgegengesetzt mit Abweichungen von -86,6 % im ersten Laufblock und +82,1 % im zweiten Laufblock gegenüber der jeweiligen Kontrolle. Die Sojazulage konnte in allen acht Läufen keinen signifikanten Unterschied im Amingehalt der Testfermenter hervorrufen. Die flüchtigen i-Fettsäuren und Ammoniak hingegen wurden durch die Schadsilage in beiden Laufblöcken deutlich erhöht und die Sojazulage führte zu einer weiteren Steigerung dieser Parameter im Vergleich zu den Kontrollen. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wird ersichtlich, dass die Fütterung von Schadsilagen mit einem RE/Rp < 50 % im RUSITEC zu reduzierten Amin- und erhöhten freien Aminosäuregehalten führte. Es konnte ein Zusammenhang zwischen den Aminen bzw. Polyaminen und ihren korrespondierenden Aminosäuren im RUSITEC hergestellt werden und es wurde versucht die Komplexität und den zeitlichen Ablauf der Aminsynthese und des Aminkatabolismus aufzuzeigen. Zudem spiegelte sich eine deutliche Verschiebung der Mikroflora in den Ergebnissen von Ammoniak- und den flüchtigen i-Fettsäuren des in-vitro-Systems wider. Der in der Praxis beschriebene positive Effekt der Sojazulage hingegen konnte nicht hinreichend erklärt werden. Allerdings deuten die Ammoniak- und i-Butter- bzw. i-Valeriansäure-ergebnisse darauf hin, dass die Sojazulage in den mit Schadsilage bestückten Fermentern möglicherweise die Desaminierung durch die HAP-Spezies und Megasphaera elsdenii fördert. Dies müsste in weiteren Untersuchungen überprüft werden. Der Fokus der Arbeit lag auf der Reaktivität und möglichen Toxizität der längerkettigen Amine für den Wiederkäuer. Da die Amine in sehr geringen Gehalten nachgewiesen wurden, ist eine toxische Wirkung der Amine per se durch den Einsatz von Grassilagen mit geringen Reineiweißgehalten am Rohprotein nicht anzunehmen. Offen hingegen bleibt, inwiefern speziell Polyamine im Pansen Komplexe bilden und dadurch schädliches Potential entwickeln können.

Summary

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Thomsen, A. (2018): Studies on the metabolism of amines and polyamines when feeding grass silage containing different levels of true protein and the influence of soybean meal using the RUSITEC-System

Evidences suggest that feeding grass silages low in the ratio of true protein in total crude protein (< 50 % TP/CP) is a nutrient factor of an unspecific health threatening disease called “Faktorenerkrankung Milchviehherde” in dairy cows since 2005. The early addition of soy protein helped to prevent severe propagation of the disease. Previous investigations about the fermentation of grass silages low in true protein in the in vitro system of the rumen called RUSITEC led to increased levels of secondary plant metabolites and free amino acids. In these investigations they could also determine a shift in ammonia, in branched short chain fatty acids (BSCFA), in gaseous volumina and composition as well as in the rumen microbiome. This study was conducted to investigate the metabolism of amines and especially polyamines in the RUSITEC-system when feeding grass silages of a TP/CP ratio less than 50 % and the influence of the addition of soy protein. Therefore, eight digestive experiments lasting 28 days each in the RUSITEC-system containing six fermenters were completed. Both types of grass silages (low: < 50 % vs. high: > 50 % in TP/CP ratio) were collected from the same cultivated pastureland of two different dairy farms in northern Germany, minimizing the botanical influence. Two blocks of digestive experiments were performed (L31–L34: dairy farm A and L35–L38: dairy farm B). Corn starch was added for energy to all six fermenters of the RUSITEC. After the first eight days to initiate a balanced fermentation while feeding control grass silage, four fermenters were replaced with test grass silage (< 50 % TP/CP) of which two were supplemented with soy protein. This experimental stage lasted for ten days. In the final recovery stage from day 20–28 control grass silage was added again to all fermenters. Amines and polyamines and corresponding amino acids were analyzed using a liquid chromatography system linked to a mass spectrometry detector (LC-MS/MS). A new method without derivatization was developed on basis of HÄKKINEN et al. (2007) to determine the soluble amines and polyamines cadaverine, putrescine, spermidine, spermine, β-Alanine, GABA and m/z 173 (possibly thermospermine) as well as the corresponding amino acids in the liquid and solid phase of the RUSITEC samples. Ammonia was measured via ammonia electrode and BSCFA were detected by gas chromatography. The results of the experimental stage in the liquid fermentation samples of the RUSITEC showed lower levels of amines in test fermenters compared to the control fermenters (-13.5 % to -60.3 %) except for cadaverine and GABA. In the first block cadaverine and GABA had also lower levels (-13.2 % and -36.1 %, resp.) whereas the second block had positive deviations in test fermenters vs. control fermenters (+9.8 %

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and +127 %, resp.). The corresponding amino acids had higher amounts in fermenters fed with test grass silage compared to control (between +1.6 % and +25.4 %). The solid RUSITEC samples were collected from the feeding bags after 48 hours of incubation. Lower analogous amine levels were noted as well during the experimental period (-7.8 % to -43.9 %). A different result was found for cadaverine in test fermenters leading to very little positive deviations from control fermenters (+1.8 % to +3.7 %), whereas β-Alanine and m/z 173 (possibly thermospermine) had contrary results. The first block (L31–L34) had +9.3 % and -48.2 % for β-Alanine and m/z 173 in test fermenters in comparison to control fermenters and the second block (L35–L38) had -44.3 % and +14.6 % respectively. Another exclusion was notable in the results of GABA which were positive throughout both blocks in solid samples, but in the second block even higher (L31–L34: +33.3 % and L35–L38: +88.7 % resp.). The corresponding amino acids tended to have negative deviations (-11.8 %), except for L-arginine (+4.6 to +54.3 %). L-lysine in test fermenters had contrary results again noting -86,6 % in the first and +82,1 % in the second run compared to control fermenters. The addition of soy protein did not reveal significantly different results in amines and polyamines. Ammonia and BSCFA were higher in test fermenters compared to control fermenters and soy protein addition resulted in significantly higher levels for those parameters. Summarizing all findings, it is obvious that feeding grass silages of TP/CP ratios < 50 % results basically in lower levels of amines and polyamines and higher amounts of free amino acids. We were able to show a connection between amino acids and amines and especially polyamines in the RUSITEC system with regard to their fast and complex metabolism and the wide range of influences. The results of ammonia and BSCFA could be explained by a shift in the rumen microbiome. The positive effect of the addition of soy protein in dairy herds could not be explained, but increased BSCFA and ammonia in test fermenters added with soy protein are supposed to be promotional to the deaminating bacteria Megasphaera elsdenii and HAP-Species. This still needs to be confirmed in further investigations. Main point of the investigations was to evaluate the reactivity and toxicity of long chained amines in cattle. Since the amounts of polyamines analyzed in the RUSITEC system were relatively small, a toxic potential of polyamines when feeding grass silages low in true protein is not assumed. Still pending is the potential feature of polyamines to build harmful complexes in the rumen and their influence on the dairy herd health.

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Anhang

198

9 Anhang

9.1 Informationen zu Material und Methodik

9.1.1 Eingesetzte Standards, Lösungsmittel und Reagenzien

In Tabelle 9.1 sind die im Laufe der Vorversuche und in der Analytik bzw. im RUSITEC eingesetzten Chemikalien, Lösungsmittel und Salze sowie die Gase aufgeführt. Tab. 9.1: Eingesetzte Standards, Lösungsmittel und Reagenzien

Reagenz Hersteller CAS-Nr. Artikelnummer Standards der LC-MS/MS

1,7 Diaminoheptan Alfa Aeser® GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 646-19-5 D17408-25G

3,4 Dimethoxycinnamic acid Aldrich®, St. Louis, MO, USA 2316-26-9 D133809-25G 3-Phenylpropionsäure Aldrich®, St. Louis, MO, USA 501-52-0 W288918-Sample K Agmatinsulfat Sigma®, St. Louis, MO, USA 2482-00-0 A7127-1G

Aminosäurestandard Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA

EC 231-791-2 AAS-18

Ammoniumchlorid Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland 12125-02-9 101145

Cadaverin Aldrich®, St. Louis, MO, USA 462-94-2 D22606-5G Caffeic acid Sigma®, St. Louis, MO, USA 331-39-5 C0625-2G D - Norvalin (salzsaure Norvalinlösung) Sigma®, St. Louis, MO, USA 2013-12-9 851620-5G

Ethanolamin Aldrich®, St. Louis, MO, USA 141-43-5 398136-500ML Histamin-Dihydrochlorid Sigma®, St. Louis, MO, USA 56-92-8 H7250-5G

Natriumhydroxid Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland 1310-73-2 106467

Norspermidin Aldrich®, St. Louis, MO, USA 56-18-8 I1006-250ML

Norspermin Alfa Aeser® GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 4605-4-5 A18133-5G

Putrescin Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA 110-60-1 D13208-25G

Serotonin–Hydrochlorid Sigma®, St. Louis, MO, USA 153-98-0 H9523-25G Spermidin Sigma®, St. Louis, MO, USA 124-20-9 85561-5G Spermin Sigma®, St. Louis, MO, USA 71-44-3 85590-5G Thermospermin-Tetra-hydrochlorid Biozol®, Eching, Germany N/A T343890-10MG

Tryptamin–Hydrochlorid Aldrich®, St. Louis, MO, USA 343-94-2 246557-5G Tyramin–Hydrochlorid Sigma®, St. Louis, MO, USA 60-19-5 T2879-5G

β-Alanin Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA 107-95-9 A9920-100G

Anhang

199

Fortsetzung Tab. 9.1 Lösungsmittel und Reagenzien der LC-MS/MS

Aceton Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA 67-64-1 34850-2,5L

Acetonitril

Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA Honeywell Speciality Chemicals Seelze GmbH

75-05-8 34967 10299298

Amantadinhydrochlorid Sigma®, St. Louis, MO, USA 665-66-7 A 1260-5G

Ameisensäure 98-100% Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland 64-18-6 1002632500

Aqua bidestillata Bicin Sigma®, St. Louis, MO, USA 150-25-4 B3876-250G

Ethanol 99,5%, vergällt LAT ®Labor- und Analysen –technik GmbH, Garbsen, Deutschland

64-17-5 H

FMOC-Chlorid Aldrich®, St. Louis, MO, USA 28920-43-6 160512-5G

Methanol Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA 67-56-1 14262-2L

Natriumhydroxid 97% Grüssing® GmbH, Filsum, Deutschland 1310-73-2 12158

Perchlorsäure 70% Fischer Scientific ®, Loughborough, UK 7601-90-3 10548820

Perfluorbuttersäure Sigma®, St. Louis, MO, USA 375-22-4 77249-50ML Pufferlösung (Kaliumborat-Puffer, Borsäure, Kaliumchlorid, Natriumhydroxid, pH 11)

Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland 7732-18-5 HC 827346

Salzsäure 37% Grüssing GmbH, Filsum, Deutschland 7647-01-0 13069

Trifluoressigsäure Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA 76-05-1 T6508-100ML

RUSITEC-Puffer und Begasung

Calciumchlorid Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland 10043-52-4 1.02382

Di-Natriumhydrogen-phosphat

VWR® International, Hannover, Deutschland 10039-32-4 28020.361

Kaliumchlorid Alfa Aeser ® GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland 7447-40-7 A11662

Kohlenstoffdioxid AIR LIQUIDE® Deutschland GmbH, Düsseldorf 124-38-9 I5100L40ROA001

Magnesiumchlorid Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland 7786-30-3 1.05833

Natriumhydrogencarbonat Grüssing®, Filsum, Deutschland 144-55-8 121435000

Natriumchlorid Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland 7647-14-5 1.06404.5000

Anhang

200

9.1.2 Probenentnahme während der RUSITEC-Läufe

Tab. 9.2: Probenaufkommen in L31–L38 Versuchsläufen und Information zur Bearbeitung der Ergebnisse

Tag Phase pH Proteine Enzym- aktivität

Phenole/ o-Diphenole Gas FlFS Überstand NH3 Polyamine

1 Einlauf x x x x x x 2 Einlauf x x x x x x 3 Einlauf x x x x x x 4 Einlauf x x x x x x 5 Einlauf x x x x x x 6 Einlauf x x x x x x 7 Einlauf x x x x x x x x x 8 Einlauf x x x x x x x x x 9 Zulage x x x x x x x x x

10 Zulage x x x x x x x x x 11 Zulage x x x x x x x x 12 Zulage x x x x x x x x x 13 Zulage x x x x x x x x 14 Zulage x x x x x x x x x 15 Zulage x x x x x x x x 16 Zulage x x x x x x x x x 17 Zulage x x x x x x x x 18 Zulage x x x x x x x x x 19 Regeneration x x x x x x x x 20 Regeneration x x x x x x x x x 21 Regeneration x x x x x x x x 22 Regeneration x x x x x x x x x 23 Regeneration x x x x x x x x 24 Regeneration x x x x x x x x x 25 Regeneration x x x x x x x x 26 Regeneration x x x x x x x x x 27 Regeneration x x x x x x x x 28 Regeneration x x x x x x x x x

Siehe Ille Ille Ille Göres Göres Thomsen

Göres, Thomsen Thomsen Thomsen Thomsen

Anhang

201

9.1.3 Ergebnisse aus der Derivatisierung mit FMOC-Chlorid

Der modifizierte Derivatisierungsprozess an der LC-MS/MS lief folgendermaßen ab:

• Zu Beginn wurden 80 µl Aminstandardmischung (Agmatin, Cadaverin, Ethanol-amin, Histamin, Norspermidin, Norspermin, Putresin, Spermidin, Spermin, Tryptamin und Tyramin sowie 1,7 DAH jeweils c = 500 µmol/l) mit 75 µl Bicine-Puffer (0,5 mol/l, pH 7) und 5 µl NaOH (2,5 mol/l) manuell versetzt und in den Autosampler der LC-MS/MS verbracht. Die eigentliche Derivatisierung wurde vom Autosampler (s. Kapitel 3.2.4.5.7) nach Programmierung vorgenommen.

• Der Autosampler gab 160 µl FMOC-Chlorid-Reagenzlösung (2,5 mmol/l) zur vorbereiteten Probe und initiierte den Derivatisierungsprozess.

• Nach 60 Sekunden Inkubationszeit wurden 200 µl ADAM-Lösung (Amantadinhydrochlorid, 40 mmol/l) zum Abschluss der Derivatisierung der Probe hinzugegeben.

• Nach weiteren 60 Sekunden wurden 280 µl Eluent A zur Probe pipettiert, um eine Verdünnung der Probe zu erreichen.

• Das Gemisch wurde nach einer Aufbereitungszeit von insgesamt 5 Minuten in das LC-MS/MS-System injiziert (s. a. THEERMANN 2011).

Für die Evaluierung der Derivatisierung wurde der Polyaminstandard im Vergleich mit nicht derivatisierten Proben gemessen (s. Abb. 9.1).

Abb. 9.1: Vergleich der derivatisierten mit den reinen Aminstandards (LC-MS/MS) ■ Polyaminstandard (500 µmol/l) ■ Polyaminstandard (500 µmol/l) + FMOC-Chlorid

Anhang

202

9.2 Futtermittelanalysen

9.2.1 Futtermittelanalysen der Grassilagen

Tab. 9.3: Nährstoffgehalte der eingesetzten Schad- und Kontrollsilagen (Analysenergebnisse aus dem Institut für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bzw. von EVONIK Nutrition & Care GmbH)

Bezeichnung Einheit

Kontrollsilage Schadsilage Lauf 31–34

Lauf 35–38

Lauf 31–34

Lauf 35–38

K-30 K-32 S-31 S-33 Betrieb A Betrieb B Betrieb A Betrieb B

TS g/kg uS 524 525 272 253 Ra g/kg TS 112 80,6 120 84,7 Rp g/kg TS 170 152 221 213 RE g/kg TS 103 90,4 94,9 85,8 RE % vom Rp % 60,6 59,5 42,9 40,3 Rfe g/kg TS 37,7 27,7 39,4 37,7 Rfa g/kg TS 271 279 274 281 NfE1 g/kg TS 409 461 346 384 NDF g/kg TS 540 623 501 569 ADF g/kg TS 328 320 320 301 ME2 MJ/kg TS 9,6 9,9 10,2 10,5 NEL1 MJ/kg TS 5,7 6,2 6,1 6,3 pH-Wert 5,1 4,5 4,7 4,0 Gesamtphenole3 mmol/kg TS 98,0 78,6 94,2 86,9 o-Diphenole3 g/kg TS 33,5 42,0 39,6 53,6 GABA4 g/kg TS 3,1 3,3 3,8 9,0 Arginin4 g/kg TS 5,8 4,3 2,7 3,5 Arginin4 % an ges. AS 5,1 4,0 1,9 2,5 Asparaginsäure4 g/kg TS 4,4 5,0 9,7 7,4 Asparaginsäure4 % an ges. AS 10,9 12,6 11,4 11,4 Lysin4 g/kg TS 1,9 2,4 5,2 5,5 Lysin4 % an ges. AS 5,2 6,1 6,0 6,5 Methionin4 g/kg TS 0,1 0,3 0,5 1,1 Methionin4 % an ges. AS5 2,3 2,2 2,9 3,0 1 Rechenwert; 2 Rechenwert (Regressionsgleichung s. KAMPHUES et al. 2014); 3 Methode s. GÖRES 2016 4 Aminosäuren bzw. GABA von EVONIK Nutrition & Care GmbH;5 gesamte Aminosäuren

Anhang

203

9.2.2 Futtermittelanalyse des Sojaproteins

Tab. 9.4: Nährstoffgehalte (Herstellerangaben) des eingesetzten Sojaproteins SUPRO® 670 IP (Fa. Danisco, Niebüll, Deutschland)

Bezeichnung Einheit Gehalt TS g/kg uS ≥ 945 Ra % 3,90 Rp % 87,0 Rfe % 4,60 Rfa % k. A. Kalzium % 0,20 Phosphor % 0,80 Natrium % 1,40 Brennwert MJ/kg 15,8 pH-Wert 7,3–7,7

9.2.3 Inhaltsstoffe des Kraftfutters

Tab. 9.5: Nährstoffgehalte (Herstellerangaben) des eingesetzten Kraftfutters [Prima 18 III pe, Milchleistungsfutter II (Ergänzungsfuttermittel für Milchkühe), Fa. ForFarmers Langförden GmbH, Vechta-Langförden, Deutschland, Art.-Nr. 810066]

Bezeichnung Einheit Gehalt Ra % 6,0 Rp % 18,0 Rfe % 4,0 Rfa % 10,5 Kalzium % 0,8 Phosphor % 0,55 Natrium % 0,25 NEL MJ/kg 6,7 Vitamin A I.E./kg 8750 Vitamin D3 I.E./kg 875 Vitamin E mg/kg 13,0 Jod als Kalziumjodat mg/kg 0,7 Mangan(II)-oxid mg/kg 26,0 Zinkoxid mg/kg 35,0 Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat mg/kg 9,0 Cobalt(II)-carbonathydroxid mg/kg 0,28 Natriumselenit mg/kg 0,35

Anhang

204

9.3 Messungen von Aminosäure- und Polyaminstandards und 1,7 Diamino-heptan

Nachfolgend sind die Variationskoeffizienten des Polyamin-Standards 1,7 DAH in einer Wiederholungsmessung über einen Messblock von rund 2,5 Tagen, sowie die VK´s und die Retentionszeiten des internen Standards während der Probenanalytik und die zur Kalibration bestimmten unteren Nachweisgrenzen (LOD) der Polyamin- und Aminosäurestandards aufgeführt.

Anhang

205

9.3.1 Bestimmung der Messgenauigkeit an der LC-M/MS durch Wiederholungsmessungen von 1,7 Diaminoheptan

Tab. 9.6: Ergebnisse der Wiederholungsmessung (n = 18) von 1,7 Diaminoheptan in Counts (c = 1 mmol/l) (Gesamtmesszeit 58.85 h)

Messung Messzeit [Min.] 1,7 Diaminoheptan [Counts x Min.] 1 2100 1148000 2 2171 1119000 3 2242 1188000 4 2324 1214000 5 2466 1157000 6 2537 1184000 7 2608 1137000 8 2679 1191000 9 2750 1152000 10 2892 1113000 11 2963 1083000 12 3034 1124000 13 3105 1107000 14 3176 1129000 15 3318 1085000 16 3389 1066000 17 3460 1105000 18 3531 1127000

Tab. 9.7: Variationskoeffizienten [%] der Wiederholungsmessung von 1,7 DAH (n = 18) Variationskoeffizient (n=18) 3,58% Variationskoeffizient (n=5) 3,15% Variationskoeffizient (n=5) 2,82% Variationskoeffizient (n=5) 1,93% Variationskoeffizient (n=3) 2,81%

9.3.2 Untere Nachweisgrenze der bestimmten Polyamine und Aminosäuren

Tab. 9.8: LOD der Polyamin und Aminosäurestandards an der LC-MS/MS Standard LOD (µmol/l) 1,7 Diaminoheptan 5 Cadaverin 5 GABA <0,5 L-Arginin <1 L-Lysin <5 L-Methionin <5 L-Ornithin <0,5 Putrescin 5 Spermidin <1 Spermin <1 ß-Alanin 25

Hinweis: LOD-Werte, die mit < angegeben sind, konnten aufgrund der Technischen Ausstattung nicht weiter verdünnt werden, waren aber bis zum jeweiligen Wert problemlos an der LC-MS/MS analysierbar.

Anhang

206

9.3.3 Variationskoeffizient des internen Standards während der Proben-analytik an der LC-MS/MS

Tab. 9.9: Variationskoeffizient vom internen Standard 1,7 Diaminoheptan während der Messungen an der LC-MS/MS [%]

Messblock Mittelwert [Counts x Min.]

Standardabweichung [Counts x Min.] VK [%]

L31 Flüssigproben 166796 41420 24,84 L31 Feststoffproben 1130863 219780 20,15 L32 Flüssigproben 213740 69790 32,63 L32 Feststoffproben 1722450 428197 24,86 L33 Flüssigproben 215294 59283 27,61 L33 Feststoffproben 1476236 410614 27,78 L34 Flüssigproben 211739 53929 25,47 L34 Feststoffproben 1199779 83216 6,94 L35 Flüssigproben 240083 35524 14,78 L35 Feststoffproben 989438 124899 12,62 L36 Flüssigproben 216279 17028 7,86 L36 Feststoffproben 947402 79973 8,43 L37 Flüssigproben 1792734 24810 13,9 L37 Feststoffproben 865883 117959 13,62 L38 Flüssigproben 170789 24036 13,99 L38 Feststoffproben 841984 43999 5,23

Anhang

207

9.3.4 Konzentrationen des externen Standards während der Probenanalytik

Der externe Standard 1,7 DAH wurde in allen Messblöcken 2- bzw. 3-mal gemessen. Ein Messblock beinhaltet die Proben aus dem festen und flüssigen Fermenterinhalt von 3 bis 5 RUSITEC-Lauftagen (entspricht 27–45 RUSITEC-Proben) und die 2–3 dazugehörigen Messungen des externen Standards 1,7 DAH sowie die ent-sprechenden Systemspülungen (s. Kap. 3.2.4.5.13 u. Kap. 3.2.4.5.15). Daraus ergaben sich für Lauf 31–34 aufgrund des Analysemanagements durch kleinere Probenanzahlen (bedingt durch technische Fehler und Ersatzteilaustausch) 7 Mess-blöcke, während für Lauf 35–38 insgesamt nur 6 Messblöcke nötig waren.

Anhang

208

9.3.5 Retentionszeiten des externen Standards während der Probenanalytik

0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,50

1 2 3 4 5 6 7

Rt [

Min

.]

Messblock [Nr.]

1. Messung2. Messung3. Messung

Lauf 31-34

0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,50

1 2 3 4 5 6

Rt [

Min

.]

Messblock [Nr.]

1. Messung2. Messung3. Messung

Lauf 35-38

Abb. 9.2: Verschiebung der Retentionszeit: Standard 1,7 Diamioheptan (extern) [10 mmol/l] im ersten bzw. zweiten Laufblock je nach Probenanzahl innerhalb eines Messblockes 2 bzw. 3 malige Messung

Anhang

209

9.4 Grafiken der Ergebnisse und Tabellen der Statistik

9.4.1 Überstände, flüchtige Fettsäuren und Ammoniak

9.4.2 Ergebnisse der Grassilageanalysen an der LC-MS/MS

300,00

325,00

350,00

375,00

400,00

425,00

450,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

[ml/2

4h]

Tag

KF

TF

TFmS

Lauf 31–38

***

***

*** ***

*** ***

**

**

** **

* *

##

##

##

##

#

##

# #######

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

ß-Alanin Putrescin Spermidin Spermin GABA

[mg/

g uS

]

Abb. 9.3: Überstandsmengen in den Überlaufgefäßen 28–tägige Versuchsphase, Inkubation der Fermenter mit Kontrollsilage (KF-30/32) bzw. in der Zulagephase ( ) mit Schadsilage (TF-31/33) und Sojaprotein (TF-31/33mS): / / entsprechende Fermentergruppen Weitere Legende s. Abb. 4.1

Abb. 9.4: Lösliche Polyamine und GABA bestimmt in 100 mg TS gefriergetrockneter Grassilage der RUSITEC-Läufe L31-L38 [umgerechnet in mg/g uS]

■ Kontrollsilage Laufblock I (K-30) ■ Kontrollsilage Laufblock II (K-32) ■ Schadsilage Laufblock I (S-31) ■ Schadsilage Laufblock II (S-33)

Anhang

210

020406080

100120140160180200220

Cadaverin Tyramin

[mg/

g uS

]

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

m/z 173 (Thermospermin)

[mg/

g uS

]

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

L-Arginin L-Lysin L-Methionin L-Ornithin L-Tyrosin

[mg/

g uS

]

236,2

Abb. 9.5: Lösliche Polyamine und m/z 173 (mögl. Thermospermin) bestimmt in 100 mg TS gefriergetrockneter Grassilage der RUSITEC-Läufe L31-L38

[umgerechnet in mg/g uS] ■ Kontrollsilage Laufblock I (K-30) ■ Kontrollsilage Laufblock II (K-32) ■ Schadsilage Laufblock I (S-31) ■ Schadsilage Laufblock II (S-33)

Abb. 9.6: Lösliche Aminosäuren bestimmt in 100 mg TS gefriergetrockneter Grassilage der RUSITEC-Läufe L31-L38 [umgerechnet in mg/g uS]

■ Kontrollsilage Laufblock I (K-30) ■ Kontrollsilage Laufblock II (K-32) ■ Schadsilage Laufblock I (S-31) ■ Schadsilage Laufblock II (S-33)

Anhang

211

Die folgenden Abkürzungen wurden in den statistischen Tabellen der Ergebnisse verwendet:

n Anzahl der eingerechneten Mittelwerte x̅ Mittelwert s Standardabweichung K-30 Kontrollsilage K-30 S-31 Schadsilage S-31 S-31mS Schadsilage S-31 mit Sojazulage K-30/S-31 Differenzsignifikanz zwischen K-30 und S-31 K-30/S-31mS Differenzsignifikanz zwischen K-30 und S-31mS S-31/S-31mS Differenzsignifikanz zwischen S-31 und S-31mS K-32 Kontrollsilage K-32 S-33 Schadsilage S-33 S-33mS Schadsilage S-33 mit Sojazulage K-32/S-33 Differenzsignifikanz zwischen K-32 und S-33 K-32/S-33mS Differenzsignifikanz zwischen K-32 und S-33mS S-33/S-33mS Differenzsignifikanz zwischen S-33 und S-33mS

Anhang

212

Tab.

9.1

0:

Erge

bnis

se d

er Ü

bers

tanv

olum

ina

[ml/2

4h]

L31–

L38

Tag

n K

F TF

TF

mS

p-W

erte

x̅ s

x̅ s

x̅ s

KF/

TF

K

F/

TF

TF/

TFm

S 1

16

411,

25

13,4

8 41

1,25

13

,10

406,

25 2

7,42

1,

000

0,54

1 0,

454

2 16

34

2,19

12

,64

338,

44

12,0

7 34

0,94

15,

08

0,39

1 0,

603

0,56

8 3

16

361,

88

11,6

7 36

1,56

19

,98

359,

06 1

1,86

0,

962

0,53

2 0,

542

4 16

36

3,75

12

,32

361,

88

12,7

6 37

0,94

9,

17

0,44

9 0,

042

0,00

9 5

16

365,

31

12,8

4 37

3,13

17

,21

367,

19 1

3,41

0,

119

0,60

6 0,

186

6 16

36

5,00

13

,29

368,

13

10,6

3 36

7,50

15,

38

0,38

6 0,

510

0,87

5 7

16

362,

19

14,4

9 36

7,81

9,

66

357,

81 3

2,40

0,

188

0,49

6 0,

246

8 16

36

6,88

15

,04

373,

13

13,7

7 36

7,50

12,

38

0,17

3 0,

902

0,12

0 9

16

366,

25

12,3

2 36

4,38

10

,78

369,

38

9,29

0,

628

0,34

3 0,

204

10

16

367,

81

12,3

8 38

3,44

11

,36

373,

44 2

2,56

<0,

001

0,43

8 0,

175

11

16

371,

88

16,1

1 38

7,81

18

,25

390,

63 1

3,52

0,

018

0,00

1 0,

530

12

16

366,

88

11,0

9 38

8,44

6,

76

385,

00 1

0,65

<0,

001

<0,0

01 0

,214

13

16

37

4,06

12

,94

395,

94

15,4

1 38

7,81

18,

79 <

0,00

1 0,

017

0,09

8 14

16

36

8,44

25

,99

386,

56

15,5

7 39

0,00

12,

91

0,03

2 0,

010

0,51

7 15

16

37

0,31

21

,56

391,

25

10,7

2 38

3,75

12,

32

0,00

2 0,

024

0,09

8 16

16

36

9,06

14

,40

387,

50

9,49

39

0,00

13,

29 <

0,00

1 <0

,001

0,3

48

17

16

375,

31

11,7

6 38

8,44

15

,24

387,

50 1

4,61

0,

008

0,00

7 0,

793

18

16

372,

81

8,94

39

3,44

11

,21

390,

00 1

4,02

<0,

001

<0,0

01 0

,316

19

16

37

0,31

10

,56

390,

94

10,2

0 39

6,88

17,

78 <

0,00

1 <0

,001

0,2

22

20

16

378,

13

10,9

4 37

5,94

12

,14

380,

63 1

3,02

0,

531

0,53

1 0,

092

21

16

373,

44

11,0

6 37

7,50

11

,69

373,

13 1

3,77

0,

361

0,94

9 0,

173

22

16

365,

31

14,7

7 37

5,31

11

,32

372,

50 1

1,11

0,

006

0,05

1 0,

419

23

16

370,

63

13,6

5 37

3,44

15

,35

373,

75 1

3,96

0,

493

0,40

5 0,

937

24

16

368,

75

16,3

8 37

8,75

13

,60

373,

75 1

5,11

0,

052

0,35

2 0,

030

25

16

365,

94

10,0

4 37

5,94

9,

53

375,

94

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0,

002

0,00

4 1,

000

26

16

372,

81

11,4

0 37

9,06

10

,52

377,

19

6,57

0,

086

0,24

9 0,

540

27

16

373,

75

13,9

6 37

6,88

14

,13

370,

94 1

2,28

0,

333

0,40

2 0,

053

28

16

373,

75

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37

6,88

13

,89

378,

13

7,27

0,

370

0,15

9 0,

751

Tab.

9.1

1:

i-But

ters

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L3

1-L3

4

Tag

n K

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TF

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74

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77

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495

0,11

2 0,

462

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05

1,12

0,

07

0,02

2 0,

011

0,21

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12

0,07

1,

21

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22

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041

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9 0,

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10

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08

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141

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9 5

8 1,

21

0,10

1,

21

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966

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0,

11

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0,

06

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0 0,

974

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17

0,08

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19

0,07

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19

0,05

0,

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1,16

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14

0,03

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16

0,07

1,

18

0,08

0,

350

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9 0,

517

10

8 1,

12

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1,

40

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1,

43

0,04

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,001

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0,

142

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06

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0,

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0,

09

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01

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0,00

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07

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0,

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0,

14

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01

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0,13

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08

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11

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15

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01

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01

0,19

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0,

07

1,87

0,

11

2,04

0,

08

<0,0

01

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213

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214

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254

0,73

6

Tab.

9.1

5:

i-Val

eria

nsäu

rege

halte

im F

erm

ente

r [m

mol

/l]

L31–

L34

Tag

n K

F TF

TF

mS

p-W

erte

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x̅ s

x̅ s

KF-

30/

TF-3

1 K

F-30

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TF

-31m

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182

0,12

3 0,

582

Anhang

215

Tab.

9.1

6:

i-Val

eria

nsäu

rege

halte

im F

erm

ente

r [m

mol

/l]

L35–

L38

Tag

n K

F TF

TF

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01

0,35

7

Tab.

9.1

7:

i-Val

eria

nsäu

repr

oduk

tion

im Ü

bers

tand

[m

mol

/24h

] L31

–L34

Tag

n K

F TF

TF

mS

p-W

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KF-

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TF-3

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-31m

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-31/

TF

-31m

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8

Anhang

216

Tab.

9.1

8:

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Tab.

9.1

9:

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L31–

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Anhang

217

Tab.

9.2

0:

Amm

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mol

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L35–

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18

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22

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180

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22

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22

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713

0,81

2 0,

026

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Anhang

243

9.5 Grafiken und Tabellen der Diskussion

9.5.1 Literaturübersicht zu Aminosäuregehalten in Grassilagen

Tab. 9.71: Aminosäuregehalte in Grassilagen

Literatur Einheit Arginin Lysin Methio-nin Ornithin Tyrosin

ARRIGO 2006 [g/RE] 20 – 42 41 – 44 14 – 16 – 19 – 30

GRESNER 2011

fAA/ges. AA [g/kg TS]5 0,7 – 3,1 – 0,2 – 0,9 – –

GRESNER 2011

fAA/ges, AA [g/kg TS]6 0,1-1,52 – 0,5 –

12,3 – –

HEIMBECK 2004

[% AA im RE] 2,52 3,42 1,28

KAMPHUES et al. 2014 [g/kg uS] – 1,9 – – –

PHUNTSOK et al. 1998 [% der TS] 0,27 0,32 0,21 – 0,25

VANHATALO et al. 2009 [g/100 g RE] 3,5 – 4,1 4,8 1,6 – 1,7 – –

WINTERS et al. 2001 [mol/kg N] 0,88 1,37 0,65 0,48 0,77

Analysen in n=315 Gras-silagen*

[g/kg TS] 2,00 – 8,70

2,77 – 11,2

1,00 – 4,00 – –

*EVONIK Nutrition & Care GmbH

5 Kontrollsilagen 6 Schadsilagen

Anhang

244

9.5.2 Beziehung zwischen Polyaminen und GABA im RUSITEC

R² = 0,0495

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0 20 40 60 80 100 120 140

GAB

A [µ

mol

/l]

Summe PA [µmol/l]

R² = 0,154

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0 50 100 150 200 250 300

GAB

A [µ

mol

/l]

Summe PA [µmol/l]

Abb. 9.7: Korrelation der Polyamine mit GABA im flüssigen Fermenterinhalt [µmol/l] (n = 60) ■ eingesetzte Kontrollsilagen RUSITEC-Läufe L31- L42 ♦ eingesetzte Schadsilagen RUSITEC-Läufe L31- L42

Abb. 9.8: Korrelation der Polyamine mit GABA im festen Fermenterinhalt [µmol/l] (n = 60) ■ eingesetzte Kontrollsilagen RUSITEC-Läufe L31- L42 ♦ eingesetzte Schadsilagen RUSITEC-Läufe L31- L42

245

10 Danksagung

Mein persönlicher Dank gilt all den Menschen, die mich im Rahmen dieser Doktorarbeit unterstützt und begleitet und damit zum Gelingen beigetragen haben: Für die Überlassung des Themas und die freundliche Unterstützung zu allen Fragen bei der Anfertigung der Arbeit danke ich Frau Univ.-Prof. Dr. M. Hoedemaker. Ich bedanke mich im Besonderen für die Betreuung und die beratende und motivierende Unterstützung bei Herrn Dr. M. Höltershinken. Mein Dank für die Aufklärung etwaiger messtechnischer Fragen geht an Herrn Dr. C. V. Duong der Phenomenex LDT, an Herrn Dr. G. Dräger des Instituts für Organische Chemie und Zentrum für Biomolekulare Wirkstoffe der Leibniz Universität Hannover und an Frau Dr. Dipl.-Chem. S. Özmen. Dr. M. Beyerbach vom Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsver-arbeitung danke ich für die Hilfe und Beratung bei der statistischen Auswertung. Beim Milchförderungsfonds Hannover-Braunschweig bedanke ich mich herzlich für die gewährte finanzielle Unterstützung zur Durchführung der Untersuchungen. Den Mitarbeitern des Pansenlabors und des klinischen Labors der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und meinen Kollegen TÄ K. Ebhardt (geb. Glöckl), TA Dr. N. Göres, TÄ C. Hunsche, TÄ Dr. M. Ille, TÄ S. Kallmeyer und TA C. Schulte danke ich für die Unterstützung bei der Versuchsdurchführung, den Messungen und die unermüdliche Motivation, die so manche schwere Stunde erleichtert hat. Bei den Mitarbeitern aus dem Institut für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover möchte ich mich für die Bereitstellung der Futtermittelanalysen bedanken. Ganz besonders möchte ich mich bei meinen Freunden aus Hannover und meinen Eltern und Geschwistern für die Unterstützung und unermüdliche Ermutigung zu jeder Zeit auf diesem langen Weg bedanken.

Documents

Untersuchungen zum Stoffwechsel von Aminen und Polyaminen ... · Spm. Spermin SPMS Spermin-Synthase SSAT Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase TF Testfermenter TFA Trifluoressigsäure