Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur ... · 2.5.1 Möglichkeiten und Grenzen eines Screening-Verfahrens für Proteasen und Amylasen als ergänzende Methode 29

Aus dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

___________________________________________________________________

Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung substituierter Lipasen

im Modell pankreasgangligiertes Miniaturschwein

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Sonka Tieneke Zantz aus Leer

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. J. Kamphues

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Kamphues

2. Gutachter: Prof. Dr. B. Schröder

Tag der mündlichen Prüfung: 21. November 2006

Meiner Familie

INHALTSVERZEICHNIS

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1 2 SCHRIFTTUM 3 2.1 Vorbemerkung 3 2.1.1 Beteiligung von Verdauungsenzymen verschiedenen

Ursprungs an der Nährstoffspaltung 3 2.2 Die exokrine Pankreasinsuffizienz 4 2.2.1 Vorkommen und Entstehung 4 2.2.2 Folgen des Mangels pankreatischer Verdauungsenzyme 6 2.2.3 Auswirkungen der EPI auf die Verdaulichkeit der Fette 7 2.3 Therapie der EPI 9 2.3.1 Enzymatische Substitutionstherapie in der EPI-Therapie 9 2.3.2 Indikationen für den Einsatz von Enzymen bei Vorliegen einer EPI 10 2.3.3 Diätetik 10 2.3.4 Einsatz von Multi- und Monoenzympräparaten in der Therapie der

EPI 11 2.3.4.1 Multienzympräparate 11 2.3.4.2 Monoenzympräparate 14 2.4 Entwicklung neuer Enzymprodukte 17 2.4.1 Wirkstoffneuentwicklung in der pharmazeutischen Industrie 17 2.4.2 Ablauf bzw. Phasen einer Wirkstoffneuentwicklung 18 2.4.2.1 Anfangsphase 18 2.4.2.2 Die vorklinische Entwicklungsphase 19 2.4.3 In-vivo-Studien am pankreasgangligierten Miniaturschwein als

Modell für den an EPI erkrankten Menschen 20 2.4.3.1 Methoden der Verdaulichkeitsbestimmung zur Bewertung der

Wirksamkeit von Enzympräparaten 21 2.4.3.2 Vor- und Nachteile der Überprüfung der Wirksamkeit substituierter

lipolytischer Enzyme anhand der Bestimmung der Fettverdaulichkeit mittels herkömmlicher Methoden im pankreasgangligierten Miniaturschwein 24

2.4.3.3 Nachteile herkömmlicher Verdaulichkeitsstudien (Bestimmung von praecaecaler und totaler Verdaulichkeit) in der Produktentwicklung von Enzymen zur Substitutionstherapie 25

INHALTSVERZEICHNIS

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.4.4 Die klinische Entwicklungsphase von Enzymen zur

Substitutionstherapie 25 2.4.5 Zulassung und Markteinführung einer pharmazeutischen

Neuentwicklung 27 2.5 Vorteile durch den Einsatz von Screening-Verfahren 28 2.5.1 Möglichkeiten und Grenzen eines Screening-Verfahrens für

Proteasen und Amylasen als ergänzende Methode 29 2.5.2 Überlegungen zur Entwicklung eines Lipase-Screenings 30 3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 32 3.1 Material und Methoden 32 3.1.1 Versuchsziel 32 3.1.2 Versuchstiere 33 3.1.3 Aufstallung und Haltung 35 3.1.4 Statistische Methoden 35 3.2 Versuchsdurchführung 36 3.2.1 Übersicht über die durchgeführten Versuche 36 3.2.2 Methodik der Chymuskollektion 38 3.2.2.1 Exkurs: Begriffsbestimmung „Verschwindensrate“ 39 3.2.3 Enzymprodukte und -substitution 40 3.2.4 Versuchsfutter 41 3.2.5 Versuchsablauf 42 3.2.6 Probengewinnung und -entnahme 45 3.2.7 Analytik und angewandte Untersuchungsparameter 46 3.2.8 Verwendete Berechnungsansätze zur Einschätzung der

praecaecalen Fettverdaulichkeit 54 3.2.9 Entwicklung eines In-vivo-Screening-Tests zur Einschätzung der

Wirksamkeit von Lipasen anhand eines bekannten Multienzymproduktes 57

3.2.10 Anforderungen an eine Testmahlzeit für ein Lipase-Screening 58 3.2.11 Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit 61 3.2.11.1 1. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit 62 3.2.11.2 2. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit 65 3.2.11.3 3. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit 68 3.2.11.4 4. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit 72 3.2.11.5 5. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit 77 3.2.11.6 6. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit 80 3.2.11.7 7. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit 84 3.2 Ergebnisse 91 3.2.1 Screening-Test für Lipasen 91 3.2.2 Allgemeine Beobachtungen 92 3.2.3 Untersuchte Parameter im Rahmen des Screening-Tests 92

INHALTSVERZEICHNIS

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.2.3.1 Absolute Anflutung von Chymus (Trockensubstanz) 92 3.2.3.2 Rohfettkonzentration im Chymus 97 3.2.3.3 Absolute Anflutung von Rohfett 101 3.2.3.4 Chromoxid-Konzentration im Chymus 105 3.2.3.5 Chromoxid-Wiederfindung 106 3.2.3.6 Verhältnis der Konzentrationen von Rohfett und Chromoxid 108 3.2.3.7 Trockensubstanz-Verschwindensrate (TS-VR) 112 3.2.3.8 Rohfett-Verschwindensrate (Rfe-VR) 116 3.2.3.9 Relative Anflutung von Trockensubstanz 120 3.2.3.10 Relative Anflutung von Rohfett 121 3.2.3.11 Relative Trockensubstanz-Verschwindensrate 123 3.2.3.12 Relative Rohfett-Verschwindensrate 126 4 DISKUSSION 128 4.1 Kritik der Methoden 128 4.1.1 Anzahl der Tiere 128 4.1.2 Validierung des Schnelltests 130 4.1.3 Eignung der erstmalig angewandten Methode zur Fettbestimmung

(AnkomHCl Hydrolysis System®) 130 4.2 Erörterung der eigenen Ergebnisse 132 4.2.1 Wie muss eine Testmahlzeit beschaffen sein, um In-vivo die

Wirksamkeit von Lipasen in einem Schnelltest überprüfen zu können? 132

4.2.1.1 Modifikation des Trockensubstanz- und Rohfasergehaltes 133 4.2.1.2 Verwendung von Chromoxid als Marker 134 4.2.1.3 Einsatz eines flüssigen Markers am Vorabend des Screening-Tests 135 4.2.1.4 Stabilisierung der Testmahlzeit (Homogenisierung) 136 4.2.2 Ist es möglich, neu entwickelte Lipasen mit einer optimierten

Testmahlzeit vergleichend zu prüfen und hinsichtlich ihrer Effektivität zu rangieren? 137

4.2.2.1 Vorteile eines Screening-Verfahrens 137 4.2.2.2 Bedeutung der relativen Flussrate für die Berechnung der

„Verschwindensrate“ 138 4.2.2.3 Beurteilung der Parameter 139 4.2.3 Korrelieren die Ergebnisse aus dem Schnelltest mit denen aus

etablierten Verdaulichkeitsversuchen? 142 4.2.3.1 Vergleich der Ergebnisse des Screening-Tests mit denen

herkömmlicher Gesamtverdaulichkeitsstudien 143 4.2.3.2 Vergleich der im Screening-Verfahren aufgestellten Rangierung mit

In-vitro-Ergebnissen 147 4.2.3.3 Kombinationsversuch 149 4.3 Ausblick 151

INHALTSVERZEICHNIS

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

4.4 Schlussfolgerungen 152 5 ZUSAMMENFASSUNG 153 6 SUMMARY 156 7 LITERATURVERZEICHNIS 159 8 TABELLENANHANG 176

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Abkürzungsverzeichnis ® eingetragenes Warenzeichen % Prozent °C Grad Celsius BfArM Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie ca crude ash (= Rohasche) cfa crude fat (= Rohfett) CF cystische Fibrose cfi crude fibre (= Rohfaser) cp crude protein (= Rohprotein) Cr2O3 Chromoxid d Tag D1 niedrigste Dosierung = 500 IE D2 mittlere Dosierung = 5 000 IE D3 höchste Dosierung = 75 000 IE E1 Testlipase Nr.1 E2 Testlipase Nr.2 E3 Testlipase Nr.3 E4 Testlipase Nr.4 E5 Testlipase Nr.5 EMEA European Medicine Evaluation Agency EPI exokrine Pankreasinsuffizienz FDA Federation of Drug Administration F&E Forschung und Entwicklung FS Fettsäure g Gramm Ges. Gesamt GIT Gastrointestinaltrakt h Stunde HF Haltungsfutter IE Internationale Einheit (hier: pancreatic FIP Pharm. Eur. Unit) IND Investigational New Drug Application kcal Kilokalorien kg Kilogramm KH Kohlenhydrat KJ Kilojoule KT Kontrolltier LCFA long chain fatty acids LFS langkettige Fettsäuren

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

LPS Lipopolysaccharide min Minuten MJ Megajoule ml Milliliter ML Mikrolipid MW arithmetischer Mittelwert n. F. nach Farbwechsel NfE Stickstoff-freie Extraktstoffe OL Olivenöl oS organische Substanz p Irrtumswahrscheinlichkeit PEI pancreatic exocrine insufficiency (= Exokrine Pankreasinsuffizienz) DM dry matter (= Trockensubstanz) DR disappearence rate (= Verschwindensrate) H2O water (= Wasser) IU international unit (= Internationale Einheit) mM Millimolar pH potentia hydrogenii PK Pankreon® PL-Tier pankreasgangligiertes Tier ppr. postprandial Ra Rohasche Rfa Rohfaser Rfe Rohfett Rp Rohprotein SCFA short chain fatty acids STABW Standardabweichung sV scheinbare Verdaulichkeit TS Trockensubstanz uS ursprüngliche Substanz VDLUFA Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten VFA Verband Forschender Arzneimittelhersteller e. V. VR Verschwindensrate vs versus

EINLEITUNG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1

1. Einleitung

Ein Mangel an pankreatischen Verdauungsenzymen führt -zumeist infolge chronischer

Pankreatitis- zum Bild der exokrinen Pankreasinsuffizienz (EPI). Folgen sind eine

Malabsorption und Maldigestion der Kohlenhydrate, Proteine und besonders der Fette,

wodurch das klinische Leitsymptom der EPI, die Steatorrhoe, ausgelöst wird (DIMAGNO

et al. 1977). Die aktuellen Behandlungsempfehlungen basieren auf der oralen Substitution von

Verdauungsenzymen zumeist porcinen Ursprungs. Bestrebungen, Produkte mikrobiellen

(fungalen bzw. bakteriellen) und biotechnologischen Ursprungs zur Marktreife

weiterzuentwickeln (LAYER u. KELLER 2003), erhöhen die Vielzahl zu untersuchender

Substanzen. Als Vorteile mikrobieller Präparate werden eine höhere Effizienz, ein

verbesserter Verbraucherschutz sowie die Möglichkeit einer gezielten Weiterentwicklung

erachtet. Mikrobiell bzw. biotechnologisch gewonnene Substanzen können im Gegensatz

zu Produkten tierischen Ursprungs durch genetische Veränderung den Anforderungen

entsprechend modifiziert und optimiert werden.

Zur In-vivo-Prüfung der Wirksamkeit substituierter Verdauungsenzyme wurde in

zahlreichen Studien (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER

2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004; BECKER 2005) das

„pankreasgangligierte, ileocaecal-fistulierte Miniaturschwein“ als geeignetes Modell

etabliert. Die dazu vorgenommenen Verdaulichkeitsuntersuchungen erfordern neben

einem hohen Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand größere Mengen der zu prüfenden

Enzyme, die allerdings erst zu einem relativ späten Zeitpunkt der Entwicklung zur

Verfügung stehen, woraus bei ungenügender In-vivo-Wirksamkeit erhebliche zeitliche und

finanzielle Verluste resultieren können. Im Gegensatz dazu erfordern In-vitro-Tests zwar

einen relativ geringen Aufwand, die Ergebnisse korrelieren jedoch oftmals nur

unzureichend mit den Ergebnissen aus In-vivo-Untersuchungen. Daher besteht ein Bedarf

an zeit- und kostengünstigen In-vivo-Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit

substituierter Enzyme unter Verwendung geringer Enzymmengen. BECKER (2005) gelang

die Etablierung eines Schnelltests für Amylasen und Proteasen gemäß diesen

Anforderungen.

EINLEITUNG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2

Im Rahmen der hier vorliegenden Studie sollte ein Screening-Verfahren für Lipasen

entwickelt werden, welches den oben genannten Anforderungen genügt (Einsparung von

Zeit und Kosten sowie insbesondere geringer Verbrauch an dem zu prüfenden Enzym)

und eine erste Einschätzung und Rangierung der In-vivo-Effizienz bisher ungeprüfter

Lipasen erlaubt. Etablierte Verdaulichkeitsstudien, die deutlich aufwändiger sind und einen

sehr viel höheren Enzymverbrauch bedingen, wären dann lediglich für die aufgrund der

Rangierung ausgewählten, vielversprechenden Enzyme zur näheren Quantifizierung der

Wirksamkeit notwendig.

Vor diesem Hintergrund sollten in der vorliegenden Arbeit folgende Fragen geklärt

werden:

• Wie muss eine Testmahlzeit beschaffen sein, um In-vivo die Wirksamkeit von

Lipasen in einem Schnelltest überprüfen zu können?

• Ist es möglich, neu entwickelte Lipasen mit einer optimierten Testmahlzeit

vergleichend zu prüfen und entsprechend ihrer Effektivität zu rangieren?

• Korrelieren die Ergebnisse des Schnelltests für Lipasen mit denen aus etablierten

Verdaulichkeitsuntersuchungen?

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3

2 Schrifttum

2.1 Vorbemerkung

Die vorliegende Studie entstand in Fortsetzung einer Reihe von Untersuchungen

(TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-

DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004; BECKER 2005) am

pankreasgangligierten Miniaturschwein, welches als Modell für den an exokriner

Pankreasinsuffizienz erkrankten Menschen dient. Während in früheren Arbeiten dieses

Projektes insbesondere die Effekte der Pankreasgangligatur auf die Verdauung der

Nährstoffe und die Milieubedingungen im Gastrointestinaltrakt untersucht wurden,

fokussierten sich die späteren Arbeiten vorwiegend auf methodische Fragestellungen und

alternative Untersuchungsmethoden zur Beurteilung der Effizienz substituierter Enzyme.

Neben etablierten Verdauungsversuchen kamen beispielsweise Tests unter Verwendung

verschiedener Blutparameter (KARTHOFF 2004) sowie ein neu entwickelter Screening-

Test (BECKER 2005) zur Überprüfung der Wirksamkeit von Proteasen und Amylasen zur

Anwendung.

Im Folgenden wird auf einige Aspekte der Fettverdauung sowie die Substitutionstherapie

des an EPI erkrankten Menschen eingegangen, da diese die Symptome bzw. den

Behandlungserfolg entscheidend mitbestimmen.

2.1.1 Beteiligung von Verdauungsenzymen verschiedenen Ursprungs an der Nährstoffspaltung

An der Digestion und Absorption der Nahrung sind bei Mensch und Tier verschiedene

Organsysteme beteiligt. Neben dem Verdauungskanal selbst tragen auch die

Darmanhangsdrüsen (Pankreas und Leber) entscheidend zu Abbau und Resorption der

Nahrungsbestandteile bei. Für die enzymatische Spaltung der Nährstoffe sezerniert der

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

4

exokrine Anteil des Pankreas in erheblichem Umfang Verdauungsenzyme, die in den

Azinizellen gebildet werden und über den Ausführungsgang der Bauchspeicheldrüse ins

Duodenum gelangen (RINDERKNECHT 1993). Des Weiteren produziert das Pankreas in

seinen Gangzellen eine natriumbikarbonatreiche Flüssigkeit (SCHARRER u. WOLFFRAM

2000), welche die in der Ingesta enthaltene Magensäure neutralisiert und die Viskosität

des Chymus herabsetzt. Die Neutralisation stellt sicher, dass die pankreatischen Enzyme

nicht durch die im Chymus enthaltene Säure gastralen Ursprungs denaturiert werden und

im Dünndarm ein für die Aktivität der sezernierten Enzyme optimales Milieu entsteht. Es

sind jedoch auch Enzyme am Abbau der Nahrung beteiligt, die nicht körpereigener

Herkunft sind, sondern der intestinalen Mikroflora des Dünn- und Dickdarms entstammen

(EHRLEIN 2000a, b). Der Umfang der Fermentationsvorgänge der Intestinalflora ist unter

anderem abhängig von der Lokalisation (SCHARRER u. WOLFFRAM 2000), der

Substratverfügbarkeit sowie der Passagerate des Substrates im Gastrointestinaltrakt

(READ et al. 1984; LAYER et al. 1990; KELLER et al. 1997a; KELLER et al. 1997b;

LAYER et al. 1997). Nicht zuletzt ist auch die Dauer der Adaptation an das jeweilige

Substrat für die Intensität der mikrobiellen Fermentation bedeutsam (SCHÜRCH 1969;

KIRCHGESSNER 2004).

Bei AuSCFAll einzelner Funktionen oder Organe kommt es zu teilweise schwerwiegenden

Einschränkungen in der Verdauungsleistung. Infolge von Erkrankungen des Pankreas

kann der Mangel pankreatischer Verdauungsenzyme zur Ausbildung einer exokrinen

Pankreasinsuffizienz (EPI) führen.

2.2 Die exokrine Pankreasinsuffizienz

2.2.1 Vorkommen und Entstehung Die exokrine Pankreasinsuffizienz (EPI) entsteht beim Menschen zumeist aus einer akuten

Entzündung des Pankreasparenchyms (MAYERLE u. LERCH 2001). Die Ursachen für die

akute Pankreatitis sind nach LAYER und KELLER (2003) dabei vielfältig.

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

5

Mögliche Auslöser der akuten Pankreatitis sind nach DIMAGNO et al. 1977; PEREZ et al.

1983; LAYER et al. 1994; LEIDINGER 1997; DIMAGNO et al. 1999; KELLER et al. 2000;

DEGEN et al. 2001; FRIESS et al. 2001; DIMAGNO 2003; LAYER u. KELLER 2003:

• exzessiver Alkoholkonsum

• Mukoviszidose (Cystische Fibrose)

• infektiöse Genese

• Traumata des Pankreas

• Adenokarzinom des Ausführungsganges der Bauchspeicheldrüse

(Pankreasgangobstruktionen)

• Autoimmune Genese

• Morbus Crohn

• postoperative Zustände nach gastrointestinalen Operationen, z.B.

Gastroektomien und intestinale Ektomien

• duodenale Hyperacidierungen, z.B. beim Zollinger-Ellison-Syndrom

In Deutschland erkranken jährlich 0,01- 0,046% der Bevölkerung an dieser akuten

Entzündung. In ca. 1% der Fälle verläuft die Erkrankung letal, während sich aus 13-27%

der akuten Fälle eine chronische EPI entwickelt, die bei ca. 80% der Patienten durch

Gallensteine oder exzessiven Alkoholkonsum ausgelöst wird (MAYERLE u. LERCH). Des

Weiteren scheint die Prävalenz mit zunehmendem Alter anzusteigen (ROTHENBACHER

et al. 2005). Zudem tritt die EPI bei Männern tendenziell häufiger auf als bei Frauen

(ROTHENBACHER et al. 2005). In vielen Regionen der Welt stellt jedoch übermäßiger

Alkoholkonsum die häufigste Ursache dar (SINGER u. MÜLLER 1995). Bei der EPI infolge

eines Alkohol-Abusus tritt im Vergleich zu der idiopathischen Form (DIMAGNO 2001;

STEINBERG et al. 2003) verstärkt Schmerzhaftigkeit (AMMAN et al. 1987), Kalzifikation

(HAYAKAWA et al. 1989), progressiver FunktionsauSCFAll (LAYER u. DIMAGNO 1999),

Diabetes mellitus (WILLIAMS u. MINNICH 1990; RADUN et al. 1997) sowie eine erhöhte

Todesrate auf (HAYAKAWA et al. 1989).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

6

Aber auch beim Tier sind Fälle von EPI beschrieben: So kommt beispielsweise beim

Deutschen Schäferhund und beim rauhaarigen Collie eine autoimmune lymphozytäre

Pankreatitis (PAA) vor (RIMAILA-PÄRÄNEN u. WESTERMARCK 1982; LEIDINGER 1997;

WIBERG 2004), die eine Atrophie der enzymproduzierenden Pankreasazini nach sich

zieht. Es existieren auch Fallberichte (HASHOLT 1972; WESTERMARCK 1980; WATSON

et al. 1981, LECHOWSKI et al.1991; RITCHEY et al. 1997; BROWNING 1998) über das

Auftreten einer EPI bei weiteren Tierarten (Katze, Giraffe, Wellensittich und

Gelbnackenamazone).

2.2.2 Folgen des Mangels pankreatischer Verdauungsenzyme

Das Fehlen pankreatischer Verdauungsenzyme infolge einer exokrinen

Pankreasinsuffizienz kann nur zum Teil durch extrapankreatische Enzyme (Speichel,

Magen, Dünndarmmukosa sowie Intestinalflora) kompensiert werden. Daher treten beim

Krankheitsbild der exokrinen Pankreasinsuffizienz (EPI) Maldigestion und Malabsorption

auf (FREUDIGER 1991). Das Ausmaß der bei einer EPI auftretenden Symptome hängt

dabei erheblich von der Nährstoffzusammensetzung der aufgenommenen Nahrung ab.

Während die Verdaulichkeit der Kohlenhydrate und Proteine in wesentlich geringerem

Maße reduziert ist, werden die Folgen der EPI insbesondere in einer dramatisch

eingeschränkten Fettverdaulichkeit deutlich (ABRAMS et al. 1987; MÖSSELER et al.

2006a). Daraus können Steatorrhoe, Abmagerung, Konditionsverlust, Meteorismus

(LÖSER u. FÖLSCH 1995), im Endstadium zusätzlich Beeinträchtigung des

Glukosestoffwechsels (RADUN et al. 1997), Motilitätsstörungen des GIT (MALLINSON

1968; KNOX u. MALLINSON 1971) sowie Mangelerscheinungen an Spurenelementen und

fettlöslichen Vitaminen resultieren (FREUDIGER 1971; DUTTA et al. 1982; ROBERTS

1989; WESTERMARCK et al. 1993; NAKAMURA et al. 1996; LAYER et al. 1997; RUTZ et

al. 2000; LARK et al 2001; LAYER u. KELLER 2003). Die Intensität der Steatorrhoe, dem

Leitsymptom der EPI, ist dabei zum einen abhängig von der Fettquantität (Relation

aufgenommene Fettmenge zu residualer Lipaseaktivität), zum anderen von der

Fettqualität: kurzkettige und mittelkettige Fettsäuren können beispielsweise auch in

Abwesenheit pankreatischer Lipasen aufgrund ihrer hydrophileren Eigenschaften direkt

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

7

von den Enterocyten des Dünndarms resorbiert werden (SHIAU 1987; BEITZ u. ALLEN

1993). Bei Ferkeln erreicht die Fettverdaulichkeit von Sauenmilch post natum

beispielsweise Werte von bis zu 96 %, obgleich die lipolytische Aktivität des Pankreas zu

diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig ausgeprägt ist. Die hohe Fettverdaulichkeit ist

nach CRANWELL und MOUGHAN (1989) sowie JENSEN et al. (1997) neben der

gastrischen Lipaseaktivität vor allem durch den hohen Anteil kurzkettiger Fettsäuren im

Milchfett zu erklären.

2.2.3 Auswirkungen der EPI auf die Verdaulichkeit der Fette

Klinische Symptome einer EPI treten erst bei einem AuSCFAll von über 90% des

sekretorisch aktiven Gewebes auf (DIMAGNO et al. 1973; FREUDIGER 1991). Bisher

wurde angenommen, dass die physiologische Sekretionsleistung des Pankreas den

Bedarf an Verdauungsenzymen um ein VieLCFAches übersteigt und daher die

Verringerung der Sekretmenge lange ohne klinische Symptome bleibt (DIMAGNO et al.

1973). Neuerdings wird jedoch diskutiert, ob die hohe Sekretionsleistung eine Folge der

niedrigen spezifischen Aktivität der humanen pankreatische Lipase ist (CARRIERE et al.

2005).

Physiologischerweise sind Spaltung und Resorption der meisten Nährstoffe am Ende des

Dünndarms abgeschlossen (PAYNE et al. 1968; KEYS u. DEBARTHE 1974; BRAUDE et

al. 1976; ZEBROWSKA et al. 1980; LEIBOLZ et al. 1986; KIES et al. 1986). Bei AuSCFAll

des exokrinen Pankreas und einem daraus resultierenden Mangel pankreatischer

Verdauungsenzyme sind die Kompensationsmechanismen für die Verdauung der

einzelnen Nährstofffraktionen unterschiedlich ausgeprägt: Die praecaecal existierenden

extrapankreatischen Enzyme (Speichel-, Magen- und Dünndarmenzyme) können das

Fehlen der pankreatischen Enzyme teilweise kompensieren. Dieses gilt insbesondere

bezüglich der Kohlenhydratfraktion (MÖSSELER et al. 2005), aber in gewissen Umfang

auch für Proteine. Der Umfang der kompensatorischen Fettverdauung durch

extrapankreatische lipolytische Enzyme ist jedoch deutlich geringer (ABRAMS et al. 1987).

Durch die beträchtliche Einschränkung der Fettverdaulichkeit manifestiert sich die EPI

zuerst in der Ausbildung einer Steatorrhoe als Ausdruck der Fettmalabsorption (DIMAGNO

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

8

et al. 1977). Die vergleichsweise frühe Beeinträchtigung der Fettverdauung und das

Einsetzen der Steatorrhoe wird vor allem der Empfindlichkeit der Lipasen, insbesondere

gegenüber reduzierten pH-Werten infolge der EPI (DIMAGNO et al. 1977; REGAN et al.

1977; STERNBY et al. 1992; LAYER et al. 2001) und gegenüber vorzeitiger Zerstörung

durch endogene Proteasen zugeordnet (THIRUVENGADAM u. DIMAGNO 1988; LAYER

et al. 1990). Bei den an EPI erkrankten Menschen ist dennoch eine Fettverdaulichkeit von

bis zu 30% beschrieben, die durch die kompensatorisch gesteigerte Aktivität der

gastrischen Lipase erklärt wird (MOREAU et al. 1988; STERNBY et al. 1992; CARRIERE

et al. 1993; CARRIERE et al. 2005). Dennoch ist durch die extrapankreatischen Lipasen

(weder durch linguale noch gastrische Lipasen) keine vollständige Kompensation des

AuSCFAlls der pankreatischen Lipasen möglich. Nach STERNBY et al. (1992) existiert

zudem kein triglyceridspaltendes Enzymsystem an der Bürstensaummembran. Der

niedrige luminale pH-Wert infolge des Bicarbonatmangels bei Vorliegen einer EPI

begünstigt durch Ausfällung der Gallensalze zusätzlich die Fettmalabsorption (REGAN et

al. 1977; NAKAMURA et al. 1994).

Die bei einer EPI auftretenden Maldigestion und Malabsorption führen zu einem Anstieg

der Nährstoffkonzentrationen im Chymus, die am Ileumende in den Dickdarm übertreten

und damit einen erhöhten Nährstoffeinstrom im Dickdarm nach sich ziehen (TABELING

1998; MÖSSELER et al. 2006a,b). Dieser bedingt eine forcierte mikrobielle Fermentation,

die – verglichen mit dem Abbau durch körpereigene Enzyme - zu energetischen Verlusten

führt (KAMPHUES et al. 2004). Der erhöhte Nährstoffeinstrom bedingt Veränderungen der

Zusammensetzung der mikrobiellen Flora, insbesondere im Dickdarm (LAYER et al. 1986;

LADAS et al. 1993; LÖSER u. FÖLSCH 1995; LAYER u. KELLER 1999). Die

entstehenden Fermentationsprodukte können dabei einerseits von Nutzen (FFS),

andererseits (z.B. Ammoniak) aber auch eine Belastung für den Stoffwechsel des Tieres

darstellen (TABELING 1998).

Oben genannte Veränderungen konnten wiederholt auch an Schweinen mit experimentell

ausgelöster EPI bestätigt werden (TABELING 1998; HELDT 2001; FUENTE-DEGE 2003).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

9

2.3 Therapie der EPI

2.3.1 Enzymatische Substitutionstherapie in der EPI-Therapie

Da unabhängig von der Ätiologie bei Vorliegen einer EPI ein absoluter Mangel an

Verdauungsenzymen vorliegt, besteht die Behandlung der Wahl, sowohl in der Human- als

auch in der Veterinärmedizin, seit Jahrzehnten in der oralen Substitution von

Verdauungsenzymen. Der Therapieansatz verfolgt vor allem den Ersatz bzw. die

Ergänzung der fehlenden Enzyme, insbesondere die Erzielung einer ausreichenden

Lipaseaktivität im Dünndarm (LÖSER u. FÖLSCH 1995). Besonders die deutliche

Einschränkung der Fettverdaulichkeit kann in den meisten Fällen durch entsprechenden

Enzymeinsatz korrigiert werden. Folglich bildet sich auch das klinische Bild der

Steatorrhoe zurück (PAP et al. 1990; LAYER u. KELLER 2003). Durch die empfohlene

Verabreichung eines porcinen Multienzympräparates mit 25.000 - 40.000 IE lipolytischer

Aktivität, 1.700-2.700 IE proteolytische Aktivität sowie 25.000 - 40.000 IE amylolytische

Aktivität pro Mahlzeit (LAYER u. HOLTMANN 1994; LAYER et al. 2001) wird eine

signifikante Verbesserung der Fett-, Protein- und Stärkeverdaulichkeit erreicht (RADUN et

al. 1997; LAYER u. KELLER 2003). Trotz deutlicher Steigerung der Fettverdaulichkeit

kann jedoch nicht von einer Normalisierung der Fettverdaulichkeit gesprochen werden, da

auch nach Enzymsubstitution die Fettverdaulichkeit die bei gesunden Individuen

ermittelten Werte von ca. 95% (KOLBEL et al. 1986) nicht erreicht. Die Supplementierung

beeinflusst zusätzlich die Verdaulichkeit fettlöslicher Vitamine (KARTHOFF 2004) und

zahlreicher Mineralstoffe (KAMMLOTT 2003) durch Verminderung der Seifenbildung sowie

Verbesserung der Micellenbildung positiv. Dadurch wird ein Anstieg der Resorptionsraten

erzielt, die aber meist weiterhin unter dem Niveau gesunder Individuen bleiben

(KARTHOFF 2004).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

10

2.3.2 Indikationen für den Einsatz von Enzymen bei Vorliegen einer EPI

Ein therapeutisches Eingreifen ist nach LANKISCH (1993), MÖSSNER (1994), LÖSER u.

FÖLSCH (1995) stets dann erforderlich, wenn klinische Symptome einer EPI,

insbesondere Steatorrhoe, auftreten. Auch in der postoperativen Phase nach Eingriffen

am GIT werden Enzyme zur Entlastung supplementiert, da exogen zugeführte

Pankreasenzyme die Sekretion des Pankreas reduzieren (WALKOWIAK et al. 2003). Bei

schmerzhaften Zuständen des Pankreas, die vorwiegend in Zusammenhang mit

Entzündungsreaktionen auftreten, ist eine Enzymsubstitution im Sinne einer

„Schmerztherapie“ angezeigt (SLAFF et al. 1984), da infolge von Feedback-Mechanismen

die endogene Enzymsekretionsrate sinkt, wodurch eine Druckverminderung im Pankreas

entsteht (DOBRILLA 1989; LEBENSTHAL et al. 1994).

2.3.3 Diätetik

Unterstützend zur Substitutionstherapie werden Diäten mit leichtverdaulichen Fetten

(kurzkettige und mittelkettige Fettsäuren; BRUNO et al. 1995; RADUN u.

MALFERTHEINER 1996; SOMMER 1997) und die Aufnahme zahlreicher kleinerer

Mahlzeiten empfohlen (READ et al. 1984). Die Substitution fettlöslicher Vitamine ist

ebenfalls angezeigt (GOODCHILD u. DODGE 1986; DODGE et al. 1990). Zusätzlich wird

empfohlen, die Fettmenge zugunsten des Kohlenhydratanteils in der Diät zu reduzieren

(BOIVIN et al. 1990); ausgenommen davon sind Patienten mit Cystischer Fibrose

(Mukoviszidose), für die bei reduziertem Fettgehalt der Nahrung eine ausreichende

Energieversorgung oftmals nicht sichergestellt werden kann (HEYMANS 1989; KAWCHAK

et al. 1996).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

11

2.3.4 Einsatz von Multi- und Monoenzympräparaten in der Therapie der EPI

Die Enzympräparate in der Substitutionstherapie zur Behandlung der EPI werden in Multi-

und Monoenzympräparate eingeteilt. Multienzympräparate enthalten mindestens zwei

Enzyme, zumeist jedoch alle drei Gruppen von Verdauungsenzymen (Lipasen, Proteasen

und Amylasen), während Monoenzympräparate nur eine Enzymgruppe (z.B. Lipasen)

beinhalten. Für die Bewertung von Enzympräparaten für die Substitutionstherapie bei EPI

ist vor allem die lipolytische Aktivität maßgebend (SHAW u. BARBEZAT 1982).

Des Weiteren ist eine Differenzierung bezüglich der Herkunft möglich: Es wird

unterschieden zwischen Produkten tierischen (porcinen und bovinen) und mikrobiellen

(fungal und bakteriell) Ursprungs. Es ist davon auszugehen, dass in Zukunft die

Entwicklung und Herstellung von Enzymen unter Verwendung der Gentechnik an

Bedeutung gewinnt, so dass diese zukünftig in der EPI-Behandlung an Bedeutung

gewinnen dürften (LAYER u. KELLER 1999; LANKISCH 2001).

2.3.4.1 Multienzympräparate

In neueren Behandlungsempfehlungen (LAYER u. KELLER 2003) wird eine orale

Supplementationstherapie unter Verwendung eines Multienzymproduktes, einer

Kombination proteolytisch, amylolytisch und lipolytisch wirksamer Substanzen,

befürwortet. In der Therapie der EPI ist der Einsatz pankreatischer Multienzymprodukte

eine etablierte und bewährte Vorgehensweise, wobei bislang fast ausschließlich Produkte

porciner Herkunft eingesetzt werden.

Enzyme porcinen Ursprungs:

Die überwiegende Zahl der Multienzymprodukte zur Substitutionstherapie bei EPI besteht

aus einem aufgereinigtem Extrakt von Pankreasgewebe porcinen Ursprungs. Das porcine

Pankreassekret ist dem des Menschen in seiner Zusammensetzung sehr ähnlich

(MOUGHAN et al. 1994) und eignet sich somit in besonderem Maße. Daher sind auf dem

Markt eine Vielzahl verschiedener Produkte aus porcinem Pankreasextrakt in

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

12

unterschiedlichen galenischen Zubereitungen und Dosierungen erhältlich wie

beispielsweise Cotazym®, Pankrease®, Ultrase®, Viokase®, Panzyat®, Enzym-Lefax®, Ku-

Zymase®, Ilozymase®, Panokase®, Kreon® und Pankreon®. Multienzymprodukte gehören

zu den derzeit am weitesten verbreiteten Enzympräparaten der Substitutionstherapie. Die

Einnahme der Präparate führt zumeist zur Verminderung der Steatorrhoe (GRAHAM 1977;

SCHNEIDER et al. 1985; KOLBEL et al. 1986). Die Enzyme werden nach Denaturierung

durch Verdauungssäfte oder nach bakteriellem Abbau mit den Faeces ausgeschieden

(GRAHAM 1977; LÖSER u. FÖLSCH 1991; LAYER u. KELLER 2003). Die Kombination

porciner Pankreasextrakte mit H2-Blockern oder Protonen-Pumpen-Hemmern verbessert

bei zusätzlich vorliegender Hyperacidierung des Magens den Therapieerfolg aufgrund der

pH-Wert-Erhöhung (DOBRILLA 1989; LAYER u. KELLER 2003; PROESMANS u. DE

BOECK 2003). Zum Schutz der Enzyme vor Denaturierung im Magen wird auch der

Einsatz gecoateter Enzyme empfohlen, die erst bei einem pH-Wert von > 6 freigesetzt

werden (LAYER u. KELLER 2003).

Enzyme bovinen Ursprungs:

In bestimmten Bevölkerungsgruppen ist die Akzeptanz von Produkten porcinen Ursprungs

aus religiösen Gründen (z.B. im Islam und im Judentum) sehr gering. Eine potentielle

Alternative in der Therapie der EPI bietet der Einsatz boviner Pankreasenzyme (LAYER u.

KELLER 2003). Die Zusammensetzung des Pankreassaftes der Wiederkäuer (als

Herbivor) ist jedoch sehr divergent zu der des Menschen. Studien ergaben eine

lipolytische Aktivität boviner pankreatischer Enzymextrakte von nur 25% im Vergleich zu

porcinen (LAYER u. KELLER 2003). Demzufolge müssen wesentlich höhere

Enzymmengen zugeführt werden, um vergleichbare Wirkungen zu erreichen. Daher ist der

therapeutische Nutzen boviner Pankreasprodukte limitiert. Zusätzlich tragen insbesondere

in der westlichen Welt Bedenken über Kontamination mit übertragbaren Pathogenen (z.B.

BSE) zur geringen Verbreitung boviner Multienzympräparate bei (LAYER u. KELLER

2003).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

13

Nachteile der Substitutionstherapie eingesetzter Multienzymprodukte:

Obgleich porcine Multienzymprodukte heute die Therapie der Wahl darstellen, werden

zukünftig vermutlich vermehrt „alternative Enzymquellen“ zum Einsatz kommen. Denn

trotz der marktbeherrschenden Stellung der porcinen Multienzymprodukte bestehen

Nachteile in der Gewinnung und Zubereitung aus Schlachtkörpern:

Einerseits besteht aufgrund des möglichen Auftretens von Zoonosen bzw. aus

seuchenhygienischer Sicht das Bestreben, alternative Therapieansätze zu Medikamenten

tierischen Ursprungs zu verfolgen. In den letzten Jahren standen wiederholt Tierseuchen,

wie beispielsweise BSE und MKS, im Interesse der Öffentlichkeit, woraufhin die

Verbrauchereinstellung und die öffentliche Meinung gegenüber Produkten tierischer

Herkunft insgesamt kritischer wurden (Zwischenruf: Leibniz Gemeinschaft,

Umweltforschung für politische Praxis, Heft 2/2005). So wird vermutet, dass die

Zurückhaltung der Bevölkerung gegenüber Produkten tierischer Herkunft nicht nur

Lebensmittel, sondern auch Medikamente betrifft. Des Weiteren ist es trotz erheblicher

technologischer Fortschritte weiterhin nicht gelungen, eine standardisierte Produktion, die

eine gleichbleibende Qualität und Aktivität der Enzyme sicherstellt, zu garantieren

(LEBENTHAL et al. 1994). Mängel in der Qualitätssicherung ergeben sich durch die

eingeschränkte Lagerstabilität tierischer Produkte sowie durch große

Chargenunterschiede bezüglich der Enzymaktivitäten (pers. Mitteilung GREGORY 2006).

Vermutlich abhängig von der letzten Fütterung, eventuell auch von der

Futterzusammensetzung und tierindividuellen Unterschieden ist der Gehalt an Enzymen,

der aus dem Pankreas von Schlachttieren gewonnen werden kann, großen

Schwankungen unterworfen (PEKAS et al. 1964; ZABIELSKI et al. 1993, 1997). Um

dennoch möglichst gleichbleibende Enzymaktivitäten sicherzustellen (LEBENTHAL et al.

1994), müssen große Pankreasextraktmengen miteinander vermengt werden (pers.

Mitteilung GREGORY 2006). Dabei ergibt sich die Schwierigkeit, die Kontamination großer

Pankreasmengen durch einzelne verunreinigte Proben bzw. Chargen (z.B. Parvoviren)

auszuschließen. Dieser Ausschluss wird jedoch von den Zulassungsbehörden in

zunehmendem Maße gefordert, sogar für bisher unbekannte Krankheitserreger (z.B.

Tansmissible-spongiforme-Enzephalopathie-Erreger). Bei den sich verschärfenden

Zulassungskriterien könnten sich in der Zukunft als Folge dieser Nachweislücke

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

14

argumentatorische Probleme in Zulassungsverfahren ergeben. Hinzu kommt, dass

Enzyme tierischen Ursprung, im Gegensatz zu gentechnisch veränderbaren mikrobiellen

Produkten, keine bzw. in deutlich geringerem Umfang Modifikationsmöglichkeiten bieten

(z.B. die Veränderung des pH-Wert-Toleranzbereiches) und somit einer erwünschten

Steigerung der Wirksamkeit Grenzen gesetzt sind. Letztlich ist es auch wegen ethischer

Vorbehalte bestimmter religiöser Gruppierungen gegenüber der Einnahme von

Medikamenten porcinen Ursprungs wünschenswert, alternative Enzymquellen zu

erschließen, zu nutzen und auf dem Weltmarkt anzubieten.

2.3.4.2 Monoenzympräparate

Im Folgenden sollen zum Teil neue Ansätze zur Behandlung der EPI vorgestellt werden,

die sich in unterschiedlichem Stadien der Entwicklung bzw. Ausreifung befinden und in der

Zukunft Ergänzungen bzw. Alternativen zu Enzymprodukten tierischer Herkunft darstellen

könnten. Enzyme biotechnologischen Ursprungs weisen aufgrund der Produktion unter

standardisierten Bedingungen vor allem Vorteile in Bezug auf die Homogenität des

Produktes, der standardisierten Aktivität aber auch bezüglich Hygiene und

Verbraucherschutz auf. Außerdem werden durch diese Präparate auch für Gruppen mit

ethischen Ressentiments gegenüber porcinen Produkten (s. o.) therapeutische

Möglichkeiten mit entsprechender Akzeptanz geschaffen. Sie werden bisher als

Monoenzymprodukte verwendet.

An dieser Stelle soll lediglich auf Lipasen näher eingegangen werden. Nach LAYER u.

KELLER (2003) können die Enzyme entsprechend ihrem Ursprung unterteilt werden in:

Enzyme fungalen Ursprungs

Enzyme bakteriellen Ursprungs

Enzyme humanen Ursprungs

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

15

Enzyme fungalen Ursprungs:

Verschiedene Pilze (z.B. Rhizopus arrhizus und Aspergillus niger) produzieren lipolytisch

wirksame Enzyme. Ein wesentlicher Vorteil fungaler Lipasen gegenüber den Enzymen

tierischer Herkunft ist ihre zumeist beachtliche Säurestabilität und hohe Aktivität in einem

weiten pH-Wert-Bereich (z.B. Rhizopus arrhizus: pH-Optimum nach MOREAU et al.

(1988) zwischen 3,5-7,4), die eine Magenpassage ohne wesentlichen Aktivitätsverlust

ermöglicht (POINTER u. FLEGEL 1975), so dass auf ein Coating verzichtet werden könnte

(SUZUKI et al. 1997; LAYER u. KELLER 2003). Des Weiteren ist zur Entfaltung der

lipolytischen Aktivität keine Aktivierung durch Colipasen notwendig (LAYER u. KELLER

2003). Ein Nachteil besteht bisher jedoch in der sehr schnellen Inhibition fungaler Enzyme

durch Gallensalze (MOREAU et al. 1988; RAIMONDO u. DIMAGNO 1994) und Proteasen

(MOREAU et al. 1988; THIRUVENGADAM u. DIMAGNO 1988). Infolgedessen können die

Lipasen ihre Wirksamkeit im Duodenum, wo die Absorption der Lipolyseprodukte maximal

ausgeprägt ist (LAYER u. KELLER 2003), nicht optimal entfalten. Fungale Lipasen wirken

also hauptsächlich im Magen und konnten infolge ihrer geringen In-vivo-Aktivität bisher

nicht als Alternative zu porcinen Präparaten etabliert werden (SCHNEIDER et al. 1985;

MOREAU et al. 1988; ZENTER-MUNRO et al. 1992; FASSMANN 2001; MANDISCHER

2002; FUENTE-DEGE 2003; HELDT 2003). Sollte die Produktion gallensalzstabiler

Mutanten gelingen, könnten fungale Lipasen eine größere Rolle in der EPI-Behandlung

erlangen (pers. Mitteilung GREGORY 2006).

Enzyme bakteriellen Ursprungs:

Bakterien wie Burkholderia plantarii bilden Enzyme mit lipolytischer Aktivität. Diese weisen

eine um 100-fache höhere spezifische Aktivität auf als porcines Pankreasextrakt, so dass

die Menge des verabreichten Enzyms um 99% reduziert werden könnte (SUZUKI et al.

1997, 1999). Um vergleichbare Effekte zu erlangen, müssten Patienten nur noch wenige

Milligramm statt wie bisher mehrere Gramm des Enzymproduktes bzw. -präparates zu sich

nehmen. Dieses würde beispielsweise Mukoviszidosepatienten entlasten, die sich infolge

des generalisierten Leidens einer Vielzahl von Behandlungen gleichzeitig und dauerhaft

unterziehen müssen. Demzufolge ist gerade für CF-Patienten eine geringere Tablettenzahl

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

16

bei gleicher Wirksamkeit (GRIFFIN et al. 1989; MORRISON et al. 1992; SANTINI et al.

2000) von größtem Interesse.

Zudem gelten bakterielle Enzyme sowohl als säurestabil gegenüber einer Denaturierung

im Magen (großer pH-Wert-Toleranzbereich) und durch Proteasen, als auch als stabil

gegenüber Gallensalzen (RAIMONDO u. DIMAGNO 1994). Sowohl in In-vitro-, als auch in

ersten In-vivo-Experimenten mit Hunden erwiesen sie sich den porcinen Enzymen in

Bezug auf ihre lipolytische Wirksamkeit überlegen (SUZUKI et al. 1999). Daraus leitet sich

die Hoffnung ab, in näherer Zukunft potente Alternativen zu den Enzymen tierischer

Herkunft entwickeln zu können (MÖSSNER 1994; LÖSER u. FÖLSCH 1995; LAYER u.

KELLER 2003).

Enzyme humanen Ursprungs:

• Gentransfer:

In der Zukunft könnte eine Expression der pankreatischen Lipase im hepatobiliären

System von EPI-Patienten möglich werden. Die pankreatischen Lipasegene sind

bereits In-vitro in einer menschlichen Gallenblasenzellinie expremiert worden, indem

ein rekombiniertes Adenovirus als Carrier benutzt wurde (KUHEL et al. 2000). Auch ex

vivo gelang die Expression in der Gallenblase eines Schafes, In-vivo erfolgte sie

zudem in den Gallengängen von Ratten (MAEDA et al. 1994, KUHEL et al. 2000). Bei

allen diesen Versuchen gelang eine Produktion von humaner pankreatischer Lipase,

ohne dass sie im Serum nachgewiesen werden konnte, also keine unerwünschte

Sekretion der Enzyme ins Blut stattfand.

• biotechnologisch hergestellte Enzyme:

Nach LÜTHEN u. NIEDERAU (1994) und VILLE et al. (2002) stellt der Einsatz einer

gastrischen Lipase als EPI-Therapeutikum einen interessanten Aspekt dar. Die

ektopische, synthetische Herstellung einer säurestabilen humanen gastrischen Lipase

könnte deren Einsatz in der Substitutionstherapie ermöglichen und damit eine weitere

Alternative zu Enzymprodukten tierischer Herkunft darstellen (LÖSER u. FÖLSCH

1995; LAYER u. KELLER 1999; LANKISCH 2001).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

17

2.4 Entwicklung neuer Enzymprodukte

2.4.1 Wirkstoffneuentwicklung in der Pharmazeutischen Industrie

Die Entwicklung eines neuen Medikamentes bedeutet für ein pharmazeutisches

Unternehmen ein immer zeit- und kostenintensiver werdendes Unterfangen (GRABOWSKI

2004). Die mittleren Kosten einer Neuentwicklung für den humanmedizinischen Markt

belaufen sich auf ca. 500-800 Millionen US-Dollar für einen neuen Wirkstoff (KUMAR et al.

2001; VFA-Statistics 2005). Dabei entfallen ca. 70% der Gesamtsumme auf abgebrochene

Entwicklungsprojekte (HINZE et al. 2001). Der Entwicklungszeitraum beträgt ab dem

Zeitpunkt der Entdeckung einer Substanz im Mittel 12 Jahre (VFA-Statistics 2005). In

Europa wurden 2002 16 % des Umsatzes der Pharmazeutischen Industrie in Forschung

und Entwicklung (F&E) re-investiert. Die F&E-Ausgaben der Pharmazeutischen Industrie

der USA, Japans und Europas belaufen sich zusammen auf insgesamt 58 Milliarden US

Dollar (VFA-Statistics 2005). Während seit den siebziger Jahren die F&E-Aufwendungen

der OECD von 5 % auf 10 % anstiegen, sanken die Forschungsinvestionen der

Pharmazeutischen Industrie in Deutschland im gleichen Zeitraum von 6,5 % auf unter 5 %

(OECD, ANBERD DATABASE; VFA-Statistics 2005).

Forschung und Entwicklung Nachfolgend soll die Vorgehensweise in der Pharmazeutischen Industrie während einer

Produktneuentwicklung dargestellt werden, um den Nutzen beschleunigter und

vereinfachter Verfahren besonders in der In-vivo-Phase zu verdeutlichen.

Vorbemerkung: Notwendigkeit der Entwicklung eines In-vivo-Verfahrens zur Testung von Lipasen Während sich die Entwicklung von pankreatischen Enzymprodukten in den vergangenen

Jahrzehnten fast ausschließlich auf die Optimierung der galenischen Zubereitung von

porcinen Pankreaspräparationen bzw. Extrakten beschränkte, werden in jüngster

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

18

Vergangenheit neue Ansätze erkennbar, die als Alternativen erforscht und weiter

entwickelt werden (s. o.: fungale und bakterielle sowie gentechnisch oder biotechnologisch

hergestellte humane Lipase). Infolge der VieLCFAlt der Enzyme unterschiedlicher

Herkunft und der Möglichkeit der Entwicklung verschiedener biotechnologischer Varianten

entsteht in Zukunft eine Vielzahl zu testender Enzyme. Daher besteht mehr denn je das

Interesse und der Bedarf nach einem zeit- und materialsparendem In-vivo Verfahren zur

Testung einer Vielzahl von Substanzen, beispielsweise durch die Entwicklung von In-vivo

Screening-Verfahren, wie sie bereits für Amylasen und Proteasen entwickelt wurden

(BECKER 2005). Ein In-vivo Screening-Verfahren zur Testung von Lipasen steht bisher

jedoch noch nicht zur Verfügung.

2.4.2 Ablauf bzw. Phasen einer Wirkstoffneuentwicklung

2.4.2.1 Anfangsphase

Am Anfang eines neuen Entwicklungsprozesses steht im Allgemeinen die Suche nach

einem so genannten „Target“, dem Angriffspunkt im Krankheitsgeschehen, an dem ein

Medikament ansetzen könnte. Im Fall der EPI bedeutet dieses die Suche nach Enzymen,

die möglichst wirkungsvoll die Spaltung der Nährstoffe anstelle der fehlenden

körpereigenen Pankreasenzyme übernehmen.

Eine Vielzahl grundsätzlich bzw. theoretisch in Betracht kommender Substanzen wird

zunächst mittels In-vitro-Testsystemen getestet. In den letzten zehn Jahren wurden für

diese Aufgabe hocheffiziente, z.T. vollautomatische In-vitro-Hochdurchsatz-Verfahren

(„High-throughput Screenings“) entwickelt. Bei den hochtechnologisierten Verfahren

werden Roboter eingesetzt, die bis zu zwei Millionen chemischer Stoffe pro „Target“ testen

(HINZE et al. 2001). Jede Substanz, die einen gewünschten Effekt erzielt, wird daraufhin

als „Hit“ bzw. „Treffer“ bezeichnet (LÖSCHER 2006, Vortrag).

Für einen „Hit“ gibt es auf dem Weg zur Markteinführung jedoch neben der Effektivität sehr

viele weitere Bedingungen, von deren Erfüllung eine Weiterentwicklung abhängt,

beispielsweise möglichst geringe bzw. fehlende Toxizität, Teratogenität und Genotoxität.

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

19

Von den ca. 5 000-10 000 Substanzen mit positiven Effekten werden in zunehmendem

Maße durch molekularbiologische und gentechnische Verfahren verschiedene Varianten

erzeugt, um ihre Eigenschaften gezielt zu verbessern; Computerprogramme werden

unterstützend eingesetzt, um diese Eigenschaften vorherzusagen. Die optimierten

Varianten, auch als Leitstrukturen oder „leads“ bezeichnet (HINZE et al. 2001; LÖSCHER

2006, Vortrag), werden erneut getestet und gegebenenfalls weiter verbessert. Nach

mehreren „Optimierungsrunden“ steht im bestmöglichen Fall eine Substanz zu Verfügung,

die als Wirkstoffkandidat zum Patent angemeldet wird (VFA-Statistics 2005).

2.4.2.2 Die vorklinische Entwicklungsphase

In der nun folgenden, ca. 3-5 Jahre dauernden vorklinischen Entwicklungsphase (JONES

1999) wird die Metabolisierung der Substanz im Gesamtorganismus erforscht. Unter

anderem wird geprüft, ob die Substanz den Krankheitsverlauf im Körper, d.h. In-vivo,

tatsächlich positiv beeinflusst. Daher erfolgen in dieser Phase In-vivo-Untersuchungen zur

Wirksamkeit an Versuchstieren, wobei parallel auch toxikologische Studien, ebenfalls In-

vivo, durchgeführt werden. Bisher werden zur Überprüfung der Wirksamkeit substituierter

Enzyme mittels In-vivo-Verdaulichkeitsstudien im Modelltier Schwein (mit experimentell

ausgelöster EPI) mehrere Kilogramm des zu prüfenden, neuen Enzyms benötigt. Für die

In-vitro-Verfahren werden hingegen lediglich wenige Milligramm bis Gramm pro Test

benötigt. In der Gesamtheit der notwendigen Analysen liegt der In-vitro-Bedarf je nach

Enzym in einem Bereich einiger Kilogramm (POTTHOFF 2006, persönliche Mitteilung).

Allerdings ist die Herstellung entsprechender Mengen in der vorklinischen Phase

schwierig, da zumeist weder industrielle Produktionsverfahren noch großtechnische

Produktionseinheiten zu Verfügung stehen.

Dennoch wird der möglichst frühe Einsatz von Substanzen – in diesem Falle Enzymen – in

In-vivo-Testsystemen aus folgenden Gründen angestrebt:

Zwischen In-vitro- und In-vivo-Ergebnissen bestehen zum Teil erhebliche Unterschiede in

der Bewertung der Wirksamkeit verschiedener „potentieller Wirkstoff-Kandidaten“.

Demzufolge ist die Übertragung der Ergebnisse von In-vitro-Tests auf In-vivo-Tests nicht

unproblematisch. Um also die Wirksamkeit der zu testenden Enzyme frühzeitig

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

20

einschätzen zu können, ist es notwendig, die Korrelation der In-vivo- und In-vitro-

Ergebnisse zu verbessern. Vorteilhaft wäre es, In-vitro-Verfahren zu etablieren, die schon

vor Einsatz des Testenzyms im Tier zu vergleichbaren Bewertungen gelangen. Infolge

mangelhafter Simulationsmöglichkeit der Resorptionsvorgänge im Darm konnten mit

bisher eingesetzten In-vitro-Methoden, wie z.B. TIM®, Rustitec®, Cositec®, Daisy® oder

HFT®, nur teilweise zufrieden stellende Ergebnisse erzielt werden (SCHÜRCH 1969,

DREYER 1989). In jüngster Vergangenheit sind allerdings Fortschritte bei der In-vitro / In-

vivo-Korrelation bezüglich vergleichender Untersuchungen zur Effektivität von

Monoenzymen gelungen (BECKER 2005). Dennoch wird es auch in Zukunft nicht möglich

sein, auf Tierversuche zu verzichten (KIRCHGESSNER 1992; KAMPHUES 2004). Durch

einen möglichst frühzeitigen Einsatz im Tier während des Entwicklungsprozesses können

ungeeignete Präparate von der weiteren Entwicklung ausgeschlossen werden, so dass

eine gezielte und selektive Weiterentwicklung Erfolg versprechender Substanzen

ermöglicht wird.

2.4.3 In-vivo-Studien am pankreasgangligierten Miniaturschwein als Modell für den an EPI erkrankten Menschen

Das Schwein ist nach Einschätzung vieler Autoren das am Besten geeignete Modelltier für

den Menschen zur Durchführung von ernährungsphysiologischen Studien (POND u.

HOUPT 1978; RERAT 1983; FLEMING u. WALEWSKI 1984 und FLORES et al. 1988).

Grund dafür ist die Ähnlichkeit mit dem Menschen im Bezug auf anatomische Verhältnisse

im Gastrointestinaltrakt (GIT), Verdauungsphysiologie sowie Nährstoffbedarf (BOOK u.

BUSTAD 1974; POND u. HOUPT 1978). Hinzu kommen Übereinstimmungen bezüglich

der omnivoren Ernährungsweise, der Nahrungsaufnahmerhythmik und der Körpermasse

(STEVENS 1977; PARRA 1978; ABELLO et al. 1989; DESPORT et al. 1997).

Zur Untersuchung der Auswirkungen von Erkrankungen bzw. FunktionsauSCFAll des

exokrinen Pankreas wurde das In-vivo-Modell „pankreasgangligiertes Miniaturschwein“

etabliert. Dieses Modell wurde bereits in zahlreichen Studien zu Untersuchungen der

Effekte der EPI auf die Verdaulichkeit von Nährstoffen und der Überprüfung der Effekte

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

21

einer Enzymsubstitution eingesetzt (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001;

MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004;

BECKER 2005). Die Ligatur des Ausführungsganges des Pankreas bedingt eine Atrophie

und bindegewebige Durchsetzung des Parenchyms (RAHKO et al. 1987), in deren Folge

die Produktion und Sekretion von pankreatischen Verdauungsenzymen zum Erliegen

kommt; bemerkenswerter Weise bleibt jedoch die endokrine Funktion (Insulinproduktion)

des Pankreas beim Schwein bestehen (PITÄRANTA et al. 1989). Im Gegensatz zu

anderen Spezies (z.B. Mensch und Hund) wird bei Pankreasgangligatur beim Schwein

kein Diabetes mellitus provoziert (ANDERSON u. ASH 1971; RAHKO et al. 1987;

BERKHOFF et al. 1988; PITÄRANTA et al. 1989), so dass die Versuchsergebnisse nicht

von einer diabetischen Stoffwechsellage beeinflusst werden. Unter Verwendung von

pankreasgangligierten Minischweinen mit ileo-caecaler Umleitungsfistel besteht folglich die

Möglichkeit, den Einfluss der EPI sowohl auf praecaecale als auch auf postileale

Verdauungsprozesse zu quantifizieren (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT

2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004;

BECKER 2005). Durch Bestimmung der Verdaulichkeit der Nährstoffe bei

supplementierten und unsupplementierten Individuen kann unter Verwendung dieses

Modells die Wirksamkeit verschiedener Enzympräparate bzw. verschiedener galenischer

Zubereitungen vergleichend untersucht werden (TABELING 1998; FASSMANN 2001;

HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003;

KARTHOFF 2004; BECKER 2005). Da es sich hierbei zumeist um Studien handelte, in

denen das Schwein als Modelltier für den Menschen eingesetzt wurde, orientierte sich die

verwendete Nahrung (d.h. das Futter) oftmals an der Humanernährung (MANDISCHER

2002; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004).

2.4.3.1 Methoden der Verdaulichkeitsbestimmung zur Bewertung der Wirksamkeit von Enzympräparaten

In vorangegangenen Studien des Projektes pankreasgangligiertes Minischwein wurde die

Effektivität verschiedener Enzymprodukte durch Untersuchungen zur Verdaulichkeit von

Nährstoffen im pankreasgangligierten Tier geprüft (TABELING 1998; FASSMANN 2001;

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

22

HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003;

KARTHOFF 2004; BECKER 2005). Dabei wurde die Effektivität eines Enzyms danach

bewertet, inwieweit durch dessen Substitution die bei pankreasgangligierten Tieren

reduzierte Verdaulichkeit der Nährstoffe (bzw. des entspr. Nährstoffes) verbessert bzw.

evtl. sogar auf das Niveau von Kontrolltieren angehoben werden konnte.

Grundsätzlich stehen zur Bestimmung der Verdaulichkeit verschiedene Verfahren zur

Verfügung:

Kollektionsmethoden:

quantitativ vollständige Sammlung von Chymus einer gewählten Lokalisation im GIT

/ Faeces über einen definierten Zeitraum

Indikatormethoden:

durch Einsatz eines nicht resorbierbaren Markers kann aufgrund von

Konzentrationsänderungen zwischen resorbierbaren Nährstoffen und nicht

resorbierbarem Marker an gewählter Lokalisation im GIT die bis zur

entsprechenden Lokalisation erreichte Verdaulichkeit kalkuliert werden („Spot-

Sampling“)

Die Verdaulichkeit einer Ration bzw. eines Nährstoffes kann - unabhängig von der

verwendeten Methode - in verschiedenen Abschnitten des GIT bestimmt werden. Dafür

wird, je nach Fragestellung, Probenmaterial aus verschiedenen Lokalisationen des GIT

gewonnen (z.B. über Fisteln).

Die am weitesten verbreiteten Methoden der Verdaulichkeitsbestimmung beim Schwein

(bezogen auf die Lokalisation der Kollektion des Probenmaterials) sind:

1. Bestimmung der Gesamtverdaulichkeit

2. Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit

Die Bestimmung der Verdaulichkeit eines Nährstoffes über den gesamten

Verdauungstrakt („Gesamtverdaulichkeit“) eignet sich nur eingeschränkt für die

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

23

Untersuchung der Wirksamkeit substituierter pankreatischer Enzyme. Die Verdauung von

Proteinen, Fetten und den meisten Kohlenhydraten durch körpereigene Enzyme ist bei

gesunden Individuen am Ende des Dünndarms nahezu vollständig abgeschlossen

(DROCHNER 1984). Bei ausschließlicher Betrachtung der Gesamtverdaulichkeit kann es

jedoch infolge mikrobieller Fermentationsprozesse im Dickdarm zu Fehleinschätzungen

kommen, besonders im Bezug auf die Kohlenhydrat- und Proteinverdauung (OELFKE

1978; DROCHNER 1987; KAMPHUES 1987), da Kohlenhydrate und Proteine, die infolge

von Maldigestion und –absorption den Dickdarm erreichen, dort einem bakteriellen Abbau

unterliegen. Es ist also unmöglich zwischen Effekten der eingesetzten Enzyme und denen

einer mikrobiellen Umsetzung zu unterscheiden. Durch das gesteigerte Substratangebot

im Dünndarm entsteht bei einem Teil der pankreasgangligierten Schweine und der an EPI

erkrankten Menschen (ca. 30%) ein „bacterial overgrowth“, welcher unter anderem anhand

der im Vergleich zu Kontrolltieren deutlich erhöhten LPS-Werte im Chymus diagnostiziert

werden kann (Anstieg der LPS-Werte bei dem Modelltier „PL-Schwein“ rationsabhängig

um den Faktor 7,6 bis 20 im Vergleich zu Kontrolltieren; MANDISCHER 2002; TABELING

1998). Die Bestimmung des LPS-Gehaltes wird dabei als Indikator für die Masse von

gramnegativen Keimen genutzt (KAMPHUES 1987). Für die grampositive Flora wird

hingegen l-Laktat als Indikator eingesetzt. Bei PL-Tieren wurden im Vergleich zu

Kontrolltieren, z.B. bei einer stärkereichen Diät, um den Faktor 48 erhöhte l-Laktat-Werte

ermittelt (MANDISCHER 2002). Um die Effizienz ergänzter pankreatischer

Verdauungsenzyme unter Ausschluss der Dickdarmfermentation einzuschätzen, ist es

daher zwingend notwendig, die Verdaulichkeit der Nährstoffe vor Eintritt in den mikrobiell

stark besiedelten Dickdarm (also praecaecal) zu bestimmen (KARTHOFF 2004).

Vorstehendes gilt vor allem für die Kohlenhydrat- und Proteinverdauung; Fette hingegen

werden im Dickdarm lediglich in geringem Maße fermentativ umgesetzt (FUENTE-DEGE

2003), so dass praecaecale Verdaulichkeiten und Gesamtverdaulichkeiten oft sehr

ähnlicher Werte ergeben.

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

24

2.4.3.2 Vor- und Nachteile der Überprüfung der Wirksamkeit substituierter lipolytischer Enzyme anhand der Bestimmung der Fettverdaulichkeit mittels herkömmlicher Methoden im pankreasgangligierten Miniaturschwein

In zahlreichen vorangegangenen Studien des Projektes „pankreasgangligiertes

Miniaturschwein“ (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER

2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004) wurde die

Fettverdaulichkeit sowohl bei gesunden, als auch bei Tieren mit experimentell ausgelöster

EPI vergleichend praecaecal und über den gesamten Verdauungstrakt quantifiziert. Die

Ergebnisse zeigten hohe praecaecale Fettverdaulichkeiten (88,2-97,6 %) bei den

Kontrolltieren und deutlich geringere Verdaulichkeitswerte bei den pankreasgangligierten

Tieren (9,3-43 %) (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER

2002; FUENTE-DEGE 2003). Da postileal praktisch keine Verdauung bzw. Absorption von

Rohfett stattfindet (FUENTE-DEGE 2003), wird nahezu die gesamte ileal angeflutete

Menge faecal ausgeschieden (MÖSSELER et al. 2006a). Demzufolge ist es zulässig,

anhand der Fettverdaulichkeit über den gesamten Verdauungstrakt

(Gesamtverdaulichkeit) auf die praecaecale Verdaulichkeit zu schließen (FUENTE-DEGE

2003). Einschränkend muss jedoch erwähnt werden, dass bei Bestimmung der

Gesamtverdaulichkeit eine Fehleinschätzung im Sinne einer geringgradigen

Unterschätzung der Fettverdaulichkeit infolge einer mikrobiellen Fettsynthese und

endogener Ausscheidungen der Mukosa (Zellabschilferungen) im Dickdarm möglich ist

(HERTEL et al. 1970; DROCHNER u. MEIER 1991; TABELING 1998; FASSMANN 2001;

HELDT 2001; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003). Beide Verfahren sind jedoch für

die Überprüfung der Wirkung lipolytischer Enzyme prinzipiell geeignet und in zahlreichen

Arbeiten (TABELING 1998; HELDT 2001; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003;

KARTHOFF 2004) erfolgreich genutzt worden.

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

25

2.4.3.3 Nachteile herkömmlicher Verdaulichkeitsstudien (Bestimmung von praecaecaler und totaler Verdaulichkeit) in der Produktentwicklung von Enzymen zur Substitutionstherapie

Bei herkömmlichen Verdaulichkeitsstudien am pankreasgangligierten Miniaturschwein zur

Überprüfung der Effizienz von in ihrer In-vivo-Wirksamkeit unbekannten Enzymen entsteht

ein immens hoher Zeit- und Enzymbedarf durch die mehrtägige Anfütterungsphase auf die

eine mehrtägige Kot- und Chymussammlung folgt. Auf diese Art und Weise kann innerhalb

von 13 Tagen lediglich ein Enzym bzw. eine Dosierung getestet werden.

Dementsprechend sind im Gegensatz zu In-vitro-Verfahren für die In-vivo-Testung

vergleichsweise große Enzymmengen nötig. In frühen Entwicklungsstadien sind jedoch die

verfügbaren Mengen des zu testenden Enzyms allgemein sehr begrenzt, so dass

üblicherweise nur relativ geringe Enzymmengen (ca. 5-10 g) zur Verfügung stehen

(LÖSCHER 2006, Vortrag). Demzufolge sind In-vivo-Versuche, insbesondere wenn diese

mit Schweinen durchgeführt werden, erst zu einem relativ späten Zeitpunkt der

vorklinischen Phase durchführbar, in der die Enzymproduktion entsprechend

fortgeschritten ist. Da Ergebnisse zur Wirksamkeit aus In-vivo-Verfahren jedoch als

Entscheidungsgrundlage für die Weiterentwicklung eines Enzyms dienen und als

richtungsweisend für die Wirksamkeit im Menschen gewertet werden, entstehen bei

Misserfolg / Entwicklungsabbrüchen kosten- und zeitintensive Verzögerungen.

2.4.4 Die klinische Entwicklungsphase von Enzymen zur Substitutionstherapie

Die Testung der in Frage kommenden Substanzen am Menschen ist in Deutschland bei

der Zulassungsbehörde BfArM (= Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte)

anzumelden und benötigt zusätzlich die Zustimmung der lokalen Ethikkommission (HINZE

et al. 2001). In den USA ist ein Antrag (IND= Investigational New Drug Application) bei der

FDA (Federation of Drug Administration) zu stellen. Dafür müssen die bisherigen

Ergebnisse aus der vorklinischen Phase offen gelegt und weitreichende

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

26

pharmakodynamische und –kinetische sowie den Herstellungsprozess betreffende

Informationen über die Substanz präsentiert werden (VFA-Statistics 2005). Spätestens zu

diesem Zeitpunkt sollten Möglichkeiten zur Produktion des Enzyms in größeren Mengen

und in hohem Reinheitsgrad bestehen, da in den folgenden, mehrjährigen klinischen

Testphasen bereits große Mengen (mehrere hundert Kilogramm) des Enzyms verbraucht

werden.

Der klinische Teil der Neuentwicklung wird in drei Unterbereiche gegliedert:

Phase I (Dauer ca. 1 Jahr):

Die Substanz wird erstmalig an eine kleine Gruppe (20-100) gesunder Probanden

verabreicht, um mögliche Nebenwirkungen erkennen zu können, den „safe dosage range“,

die Dosierungsrichtlinien, festzulegen und um Metabolisierung und Distribution zu

beobachten. Es wird also überprüft, ob die am Tier gewonnenen Erkenntnisse über den

Wirkstoff auf den gesunden Menschen zu übertragen sind (VFA-Statistics 2005).

Phase II (Dauer ca. 2 Jahre):

In dieser Phase erhält erstmals eine Gruppe von 100-500 Patienten, die an der

entsprechenden Krankheit (z.B. EPI) leiden, die neue Substanz. Ihre Effektivität,

Sicherheit und Nebenwirkungen werden näher untersucht. Weiterhin erfolgt die Auswahl

optimaler Dosierungen (HINZE et al. 2001).

Phase III (Dauer ca. 3 Jahre):

Eine Gruppe von 1000-3000 Patienten erhält unter ärztlicher Begutachtung die Substanz

unter Klinik- und Praxisbedingungen. Hierbei soll die Unbedenklichkeit des Wirkstoffes

auch bei Langzeiteinnahme an einer hinreichend großen Patientenzahl überprüft werden

(HINZE et al. 2001). Der Wirkstoff wird möglichst in Doppeltblind-Studien gegen Placebo

und Konkurrenzprodukte getestet (LÖSCHER 2006, Vortrag).

Die Phase III der klinischen Entwicklung ist mit einem Anteil von über 20% der

Gesamtkosten zusammen mit der vorklinischen Entwicklung (> 30% der Gesamtkosten)

der kostenintensivste Bereich einer Neuentwicklung. Deshalb ist vor jedem Eintritt in eine

neue Entwicklungsphase, besonders aber vor der Phase II sowie III genau abzuwägen, ob

eine Weiterentwicklung aussichtsreich ist (s. Tabelle 1).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

27

Tabelle 1: Verteilung der Gesamtkosten einer pharmazeutischen Neuentwicklung (%) auf die verschiedenen Phasen der Entwicklung (HINZE et al. 2001)

Vorklinik Phase I Phase II Phase III Zulassung Phase IV Sonstiges

31,9 6,8 11,1 23,3 12,0 10,7 4,2

2.4.5 Zulassung und Markteinführung einer pharmazeutischen Neuentwicklung

Insgesamt werden nur ca. 10 % der Substanzen, die in die klinische Phase kommen,

weiter entwickelt. Diese gelangen dann in das offizielle Zulassungsverfahren (NDA= New

Drug Application) der EMEA (European Medicines Evaluation Agency) in London

(zentrales Verfahren) oder alternativ dezentral zum BfArM bzw. zum Paul-Ehrlich-Institut.

In den USA ist die FDA zuständig. Ein solches Zulassungsverfahren nimmt ca. 1-1,5 Jahre

in Anspruch (TUFTS CENTER FOR THE STUDY OF DRUG DEVELOPMENT 1999).

International arbeitende Pharmazeutische Firmen bemühen sich im Allgemeinen um

Zulassungen für den US-amerikanischen, europäischen und japanischen Markt, da hier

der Großteil des Umsatzes erwirtschaftet wird (s. Tabelle 2).

Tabelle 2: Erwirtschafteter Umsatz aus Medikamenten in % (VFA STATISTICS 2005)

USA Europa Japan Rest der Welt

70 19 4 7

Phase IV:

Nach erfolgreicher Zulassung, die im Mittel ca. 12 Jahren nach Patentierung des

Wirkstoffes erfolgt (s. Abbildung 1), wird das neue Medikament auf dem Markt eingeführt.

Dennoch wird das neue Produkt weiterhin kritisch überwacht, um seltene Nebenwirkungen

und Langzeiteffekte zu überwachen (ALLIANCE PHARMACEUTICAL CORP.- PHASES

OF PRODUCT DEVELOPMENT 2006).

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

28

20 Jahre nach Patentanmeldung verfällt das Patent, bzw. kann maximal um weitere 5

Jahre verlängert werden. Damit verbleiben nach Markteinführung in der Regel nur noch 8

Jahre Patentschutz. Nach Ablauf des Patentschutzes ist Generikern die Nachahmung

erlaubt (VFA-Statistics 2005). Beim Originalhersteller verbleiben nach Ablauf des

Patentschutzes schließlich lediglich ca. 30% des Marktanteils (pers. Mitteilung

IFFLÄNDER 2006).

Abbildung 1: Organigramm zur Entwicklung eines neuen Medikamentes (modifiziert nach LÖSCHER 2006, Vortrag)

2.5 Vorteile durch den Einsatz von Screening-Verfahren

Der Prozess vom Beginn der F&E bis zur Markteinführung eines neuen Produktes ist

durch gesetzliche Vorgaben klar in die oben genannten Phasen eingeteilt. Es existiert nur

wenig Spielraum zur Reduzierung der langen Entwicklungsdauer. Eine der Möglichkeiten

Substanz „Treffer“ LeitstrukturKandidaten

f. klin. Studie

Kandidaten f. vorklin.

Studie

100 000 100 10 3 - 4 1 -2

Erstes Screening

Zweites Screening

Optimierung d. Leitstruktur

Vorklinische Prüfung

Klinische Prüfung

Synthese Isolierung /

Aufreinigung Charakterisier-

ung

In vivoPharmakologie

Toxikologie/ Toxikokinetik

Pharmakokinetik

Phase I: Sicherheit und

Toleranz

Phase II: Dosisfindung

Phase III: Effektivität

In vitro:Pharmakologie Metabolisierung

In vivo:

erste Pharmakokinetik erste Toxikologiestudien

Hoch-Durchsatz-Verfahren:

Rezeptor-bindung

Enzymatische und funktionale

Tests

Funktionelle Suche nach dem Angriffspunkt:

Identifikation Funktionale Analyse

Testentwicklung

1-2 Jahre 3-4 Jahre

5-6 Jahre

Zielsetzung Angriffspunkt

Pharmakologie Toxikologie

Toxikokinetik Pharmakokinetik

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

29

besteht in einer zunehmenden Rationalisierung der Forschungs- und Entwicklungsphase

selbst. Insbesondere im Rahmen von In-vivo-Verfahren ermöglicht der Einsatz von

Screening-Verfahren relevante Zeiteinsparungen, die im IdeaLCFAll eine frühere

Zulassung und Markteinführung erlauben. Dadurch ergibt sich die von der

Pharmazeutischen Industrie angestrebte längere Vermarktungszeit innerhalb der

Patentschutzfrist.

2.5.1 Möglichkeiten und Grenzen eines Screening-Verfahrens für Proteasen und Amylasen als ergänzende Methode

In dem Projekt „pankreasgangligiertes Miniaturschwein“ wurden in vorangegangenen

Studien mittels oben genannter etablierter Methoden der Verdaulichkeitsbestimmung

verlässliche Ergebnisse zur Quantifizierung der Wirksamkeit substituierter

Verdauungsenzyme gewonnen. Um sowohl Zeit- und Arbeitsaufwand als auch

Materialverbrauch zu minimieren, wurde im Rahmen dieses Projektes von BECKER

(2005) ein Screening-Test entwickelt, welcher als ergänzende Methode eine erste

Einschätzung der Wirkung von Amylasen bzw. Proteasen auf die Stärke- bzw.

Proteinverdaulichkeit ermöglicht. Bei diesem Verfahren wird auf eine Anfütterungsphase

(sonst ca. 7-10 Tage) gänzlich verzichtet: die enzymhaltige Testmahlzeit wird nur einmalig

verabreicht. Hierdurch gelingt eine erhebliche Zeit- und Materialersparnis (BECKER 2005).

Bedeutendster Vorteil ist jedoch, dass in diesem Testverfahren aufgrund des Verzichtes

auf eine Anfütterungsphase sowie längere Chymussammlung (3-5 Tage) nur sehr geringe

Mengen des zu testenden Enzyms notwendig sind. Somit kann schon früh mit

Wirksamkeitsstudien am Tier begonnen werden so dass ein Einsatz der Enzyme bereits in

einer sehr frühen Phase der Entwicklung möglich ist, wenn allgemein noch keine großen

Enzymmengen vorhanden sind.

Mit diesem Screening-Verfahren entstand die Option, die In-vivo-Effizienz einer Dosierung

einer Protease oder Amylase innerhalb eines Versuchstages zumindest tendenziell

einschätzen zu können. Nachdem mehrere Testenzyme in üblicherweise jeweils drei

Dosierungen im Screening eingesetzt worden sind, können die Ergebnisse der

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

30

verschiedenen Enzyme (z.B. einer Gruppe von Test-Amylasen) vergleichend bewertet

werden. Über die sich ergebene Beurteilung wird eine Rangierung der zu prüfenden

Enzyme der Testenzyme ermöglicht.

Um zu verdeutlichen, dass die gewonnenen Ergebnisse nicht den allgemeinen

Bedingungen von „Verdaulichkeitswerten“ entsprechen, verwendete BECKER (2005) den

Terminus „Verschwindensrate“.

2.5.2 Überlegungen zur Entwicklung eines Lipase-Screenings

Die Entwicklung eines Screening-Tests für Lipasen ist von besonderem Interesse, da

Lipasen in der Substitutionstherapie eine bedeutende Rolle innehaben und daher einen

wichtigen Baustein in der Entwicklung eines neuen Präparates zur Substitutionstherapie in

der Behandlung der EPI darstellen.

Vor diesem Hintergrund ist zu prüfen, inwieweit das von BECKER (2005) entwickelte

Versuchsdesign (einmalige Fütterung der Testmahlzeit ohne Anfütterungsperiode, Beginn

der Kollektion mit dem erstem Erscheinen von markerhaltigem Chymus an der Ileumfistel,

Kollektionsdauer) für ein Lipase-Screening anwendbar ist. Ergebnisse bereits vorhandener

Versuche (BECKER 2006, persönliche Mitteilung) zeigten, dass beim Einsatz der

Standard-Fett-Diät des Projektes (70 g Rfe / 225 g TS pro Mahlzeit) das Fett dem Chymus

aus der entsprechenden Testmahlzeit zum Teil voraus floss. Dadurch entstand ein

inhomogener Fluss von Marker, Fett und restlichen Bestandteilen der Testmahlzeit. Der

Verzicht auf eine Anfütterungsphase ist jedoch nur bei parallelem Fluss der

Rationsbestandteile sinnvoll bzw. möglich. Für eine optimale Enzymwirkung ist ein

homogener Chymus zur Bereitstellung einer möglichst hohen Substratverfügbarkeit, hier

Fett, erforderlich, um die Aktivität der zu prüfenden Lipasen nicht durch mangelnde

Substratverfügbarkeit zu limitieren und um eine gleichmäßige Verteilung des Enzyms in

der Testmahlzeit zu gewährleisten. Außerdem wird durch einen homogenen Chymusfluss

ausgeschlossen, dass Futter vorheriger Mahlzeiten zusammen mit der Testmahlzeit

anflutet. Die Homogenität des Chymus ist Voraussetzung für eine Kalkulation der Rohfett-

Verschwindensrate anhand des gleichzeitig anflutenden Markers der Testmahlzeit.

SCHRIFTUM ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

31

Der für die Testung von Lipasen notwendige hohe Fettgehalt in der Testmahlzeit kann

Störungen bzw. Verzögerungen der Magenentleerung bedingen (HUNT u. STUBBS 1975;

READ 1984), die durch Rückkopplungsmechanismen des Dünndarms als Reaktion auf

nicht hydrolysierte Triglyceride (so genannte „Duodenum-, Jejunum-, und Ileumbremse“)

entstehen. Die Entleerung des Magens wird laut BRAUDE et al. (1970), HUNT u. STUBBS

(1975), READ (1984) und DECUYPERE et al. (1985) durch die Verabreichung einer

flüssigen Diät positiv beeinflusst, d.h. beschleunigt. In einer flüssigen Mahlzeit erhöht sich

jedoch die Gefahr für eine Entmischung des Markers von der Testmahlzeit, insbesondere

wenn ein Marker mit relativ hohem spezifischem Gewicht (Chromoxid) eingesetzt wird. Um

der Separation entgegen zu wirken, ist es zu erwägen, die Diät als „stabile Suspension“

mit partikulären Strukturen bzw. Rohfaser anzureichern, obwohl durch einen erhöhten Rfa-

Anteil praecaecal mit einer Retention der Passage zu rechnen ist (DROCHNER 1984).

EIGENE UNTERSUCHUNGEN ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

32

3 Eigene Untersuchungen

3.1 Material und Methoden

3.1.1 Versuchsziel

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte ein In-vivo-Screening-Test zur

vergleichenden Untersuchung der Effizienz von Lipasen entwickelt werden. Hierzu wurde

die etablierte Methode einer Verdaulichkeitsuntersuchung modifiziert. Dabei konnte auf

Erfahrungen einer vorangegangenen Arbeit (BECKER 2005) dieses Projektes aufgebaut

werden, in der mittels eines „Schnelltests“ eine erste Einschätzung der Wirksamkeit von

Amylasen und Proteasen erfolgte.

Ein entsprechender Schnelltest oder Screening-Test für Lipasen sollte folgende

Anforderungen erfüllen:

• kurzfristige Durchführung (= Zeitersparnis),

• geringster Verbrauch des zu prüfenden Enzyms,

• eine vergleichende Bewertung der zu prüfenden Enzyme ermöglichen.

Gleichzeitig sollte das neu zu entwickelnde Screening-Verfahren eine In-vivo-Simulation

(Magenpassage, Einwirkungen von Restaktivitäten von Enzymen und Mikroflora) im

Dünndarm ermöglichen.

Aufgrund des geringen Enzymaufwandes wäre es möglich, In-vivo-Screening-Tests schon

zu einem vergleichsweise früheren Zeitpunkt der Entwicklung eines zukünftigen

Enzymproduktes durchzuführen. Hierdurch wären erhebliche Einsparungen zu erwarten:

eine Weiterentwicklung fände nur für Prototypen statt, die im In-vivo-Screening-Test als

effektiv beurteilt wurden. Dadurch könnten die zu einem späteren Entwicklungszeitpunkt


33

zeit- und materialaufwendigen klassischen Verdaulichkeitsstudien auf die Testung viel

versprechender Enzyme reduziert werden.

Wie bei anderen als Screening eingesetzten Methoden ist auch bei dem hier neu zu

entwickelndem Screening-Test eine realistische „Einschätzung“ in einem wenig

aufwändigem Verfahren oberstes Ziel, während im Anschluss an das Screening für Erfolg

versprechende Produkte eine Absicherung in weitergehenden Untersuchungen mit

Verfahren höherer Genauigkeit erfolgen sollte.

Die Überprüfung der im Screening-Test ermittelten Ergebnisse erfolgt durch Vergleich mit

Ergebnissen aus „klassischen“ Verdaulichkeitsuntersuchungen ausgewählter Lipasen, die

bereits von KARTHOFF (2004) und BECKER (2005) untersucht wurden.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte somit ein In-vivo-Screening-Test zur Einschätzung der

Wirksamkeit lipolytischer Enzyme entwickelt werden. Während der Entwicklungsphase

wurde ein etabliertes Multienzympräparat verwendet, das in verschiedenen

vorangegangenen Untersuchungen als hochwirksam befunden wurde. Eine Überprüfung

des neu zu entwickelnden Tests sollte anhand klassischer Verdaulichkeitsversuche

stattfinden, indem zwei ausgewählte Testlipasen mit beiden Verfahren untersucht wurden.

Alle Versuche waren von der Bezirksregierung Hannover genehmigt worden.

3.1.2 Versuchstiere

In den vorliegenden Untersuchungen wurden insgesamt 13 adulte weibliche Göttinger

Miniaturschweine der Zuchtlinie Ellegaard eingesetzt. Allen Tieren wurde operativ eine

ileocaecale Umleitungsfistel implantiert, um die Verdaulichkeit der Nährstoffe bis zum

Ende des Ileums quantifizieren zu können. Bei 10 Schweinen (PL-Tiere) erfolgte

zusätzlich eine Ligatur des Ductus pancreaticus accessorius zur Simulation einer

chronischen exokrinen Pankreasinsuffizienz. Bei 3 Tieren blieb der

Pankreasausführungsgang unversehrt, so dass diese als Kontrollgruppe (KT =

Kontrolltiere) Verwendung fanden.


34

Die Operationsmethode wurde bereits ausführlich in vorangegangenen Arbeiten des

Projektes „pankreasgangligiertes Miniaturschwein“ beschrieben (TABELING 1998;

FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003;

KAMMLOTT 2003), so dass hier auf eine genauere Beschreibung verzichtet wird.

Während der Entwicklung des Screenings unter Verwendung eines bekannten

Multienzymproduktes wurden insgesamt 10 PL-Tiere eingesetzt. Für die Testung von

Lipasen mit bisher unbekannter In-vivo-Aktivität fanden nur die PL-Tiere Nr. 80, 81, 83 und

die KT-Tiere Nr. 38, 68, 69 Verwendung. Während der Versuchsphase war das

Allgemeinbefinden der Tiere stets ungestört. Einmal wöchentlich erfolgte die Überprüfung

des Körpergewichts der Tiere (s. Tabelle 3) Durch Gewöhnung an Menschen und

schonendes Handling konnte die Probengewinnung ungestört durchgeführt werden.

Tabelle 3: Überblick über die eingesetzten Versuchstiere

Tier

- Nr.

gebo

ren

(Alte

r)

KM

(kg)

M

W w

öche

ntl.

Wäg

ung

Dat

um d

er

Fist

el-O

P

Liga

tur d

es

Pank

reas

-

gang

es

Ileo-

caec

ale

Fist

el

Vers

uche

38 11/1998 43,8 06.04.2000 - + KT-Tier

68 05/2002 43,9 29.07.2003 - + KT-Tier

69 08/2002 42,0 30.07.2003 - + KT-Tier

43 02/1999 41,9 05.09.2000 + + Entwicklung

56 09/2000 40,9 18.09.2001 + + Entwicklung

63 10/2000 36,5 13.06.2002 + + Entwicklung

65 10/2000 36,8 17.09.2002 + + Entwicklung

82 10/2002 37,9 05.05.2004 + + Entwicklung

91 05/2004 27,1 20.04.2005 + + Entwicklung

93 06/2004 29,6 18.05.2005 + + Entwicklung

80 05/2003 36,0 31.03.2004 + + alle

81 12/2000 34,6 04.05.2004 + + alle

83 11/2000 34,1 06.05.2004 + + alle


35

3.1.3 Aufstallung und Haltung

Die Aufstallung und Haltung erfolgten in Einzelboxen ohne Einstreu. Auf eine detaillierte

Beschreibung wurde an dieser Stelle verzichtet, da diese denen in den vorangegangenen

Arbeiten des Projektes entsprach (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001;

MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004;

BECKER 2005).

3.1.4 Statistische Methoden

Zur statistischen Auswertung der Daten wurden folgende Methoden angewandt:

• Berechnung des arithmetischen Mittels

• Berechnung der Standardabweichung

• Varianzanalyse mit repeated measurements nach Tukey Kramer

(Vergleich der verschiedenen Behandlungen)

• t-Test für unverbundene Stichproben

(Vergleich KT-Tiere versus PL-Tiere)

Sowohl die Berechnung der arithmetischen Mittelwerte als auch der

Standardabweichungen erfolgte unter Anwendung des Tabellenkalkulationsprogrammes

Exel’ 2000. Die statistischen Vergleiche wurden mit Hilfe des Statistik Programms SAS

nach Auswahl der statistischen Methoden durch das Institut für Biometrie der Stiftung der

Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

Signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit

von p ≤ 0,05 wurden durch unterschiedliche Buchstaben bzw. Symbole gekennzeichnet.


36

3.2 Versuchsdurchführung

3.2.1 Übersicht über die durchgeführten Versuche

Die Versuche unterteilten sich in folgende Abschnitte:

• Entwicklung (Entwicklung der Testmahlzeit) eines In-vivo-Screening-Tests zur

Einschätzung der Wirksamkeit lipolytischer Enzyme unter Verwendung eines

etablierten Multienzympräparates mit bekannter Wirkung

• Verwendung des neu entwickelten Screening Verfahrens zur Überprüfung der

Effektivität von 5 Lipasen mit noch unbekannter In-vivo-Wirksamkeit

• Rangierung der getesteten Lipasen anhand der ermittelten Ergebnisse

bezüglich:

⇒ Anflutung von Trockensubstanz und Rohfett in einem definiertem

Zeitraum

(→ Maß für Wirksamkeit der Enzyme, Maß für Passage)

⇒ Rohfett-Konzentration im Chymus

(→ Maß für Wirksamkeit der Enzyme)

⇒ Cr2O3-Konzentration im Chymus

(→ Maß für Wirksamkeit der Enzyme, Maß für Passage)

⇒ Rohfett / Cr2O3-Konzentration im Chymus


⇒ Cr2O3-Wiederfindung im Chymus

(→ Maß für Passage)

⇒ „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett


⇒ Relativer Anflutung von Trockensubstanz und Rohfett


⇒ Relative Trockensubstanz- und Rohfett-„Verschwindensrate“



37

Der erste Abschnitt umfasste Versuche, die zur Entwicklung eines Screening-Tests für Lipasen führten. Die im Rahmen des Screenings für Amylasen und Proteasen (BECKER

2005) verwendeten Mischfuttermittel enthielten eine absolute Rohfettmenge von ca. 5g /

Mahlzeit (entsprechend 2 %). Diese Fettmenge pro Mahlzeit erwies sich für die Testung

von Lipasen als zu gering. Demzufolge sollte eine wesentlich fettreichere Ration zum

Einsatz kommen. Als fettreiche Mahlzeit stand die Standard-Fettdiät (30 % Rohfett in der

TS / 70 g Rfe je Mahlzeit), die schon in vorangegangenen Arbeiten des Projektes

verwendet wurde, zur Verfügung. Ihr testweiser Einsatz ergab jedoch, dass

Modifikationen, insbesondere im Bezug auf die Zusammensetzung und Zubereitung der

Testmahlzeit, notwendig sein würden, da die Ergebnisse auf Entmischungen zwischen

Futter und Marker sowie Durchmischungen mit der vorherigen Mahlzeit hindeuteten.

Daraufhin folgte die Entwicklung einer geeigneten Versuchsdiät. Bis zur Festsetzung der

endgültigen Testmahlzeit wurden insgesamt 20 Versuche mit unterschiedlich

zusammengesetzten Mahlzeiten durchgeführt. Davon werden in dem Abschnitt „Versuche

zur Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit“ acht Diäten exemplarisch (zur

Demonstration der Zwischenschritte) dargestellt.

Obgleich dieser Abschnitt sehr umfangreich ist, werden die Untersuchungen zur

„Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit“ und die entsprechenden Ergebnisse im

Teil „Material und Methoden“ dieser Arbeit dargestellt, da die Kenntnis der entwickelten

Vorgehensweisen bzw. Methoden für das Verständnis des eigentlichen Screening-Tests

für Lipasen (Ergebnisse: Ergebnisteil) zwingend notwendig ist.

Im zweiten Abschnitt wurde die Effizienz von fünf mikrobiellen Lipasen sowie des

Multienzymproduktes PK mit dem neu entwickelten Screening-Test untersucht und die

Enzyme entsprechend ihrer In-vivo-Wirksamkeit rangiert.


38

3.2.2 Methodik der Chymuskollektion

Die Methodik der Chymuskollektion sowie der Probenaufbereitung folgt grundsätzlich der

von BECKER (2005) beschriebenen Vorgehensweise (s. Abbildung 2):

• Vollständiger Verzicht auf eine Anfütterungsphase

• einmalige Verabreichung einer markerhaltigen Testmahlzeit

• Beginn der Chymuskollektion erst mit beginnender Anflutung der markerhaltigen

Ingesta an der ileocaecalen Umleitungsfistel

• Chymussammlung in zweistündigen Kollektionsintervallen

• Kollektionsdauer: 8 Stunden nach Erscheinen des Markers

• Mindestabstand zwischen zwei Testmahlzeiten von 48 Stunden

* fettfreie, energiereiche Mahlzeit (ProvideXtra®) mit hohem Kohlenhydrat- und Protein-Anteil

Abbildung 2: Schematische Übersicht zum Vorgehen bei der Fütterung und Chymuskollektion im Screening-Test für Lipasen

Versuchsdesign: Chymuskollektion (s. BECKER 2005):

Getrennte & fraktionierte Kollektion

Fütterung der

Testmahlzeit

Morgen des

Versuchstag

Abend des

Versuchstages

Kollektion des „braunen Chymus“

(Kollektionsintervall:

Fütterung bis „Farbumschlag“)

Kollektion des

„grünen“ Chymus

Fütterung

Vorabend* Fütterung von

Haltungsfutter


39

Kollektion des „braunen“ Chymus:

Kollektionsintervall: Fütterung bis „Farbwechsel“

Kollektion des „grünen“ (= markerhaltigen) Chymus:

Kollektionsintervall: Beginn: „Farbwechsel“; Dauer: 8 Stunden; Sammlung des Chymus

fraktioniert; ⇒ 4 Proben aus je 2 Stunden je Tier und Tag

Analog zu BECKER (2005) wurde die Effektivität der zu testenden Enzyme sowohl anhand

der absoluten Anflutung des nicht umgesetzten Substrates innerhalb eines definierten

Zeitraums an der ilealen Fistel als auch anhand der kalkulierten „Verschwindensrate“ des

Substrates bewertet.

3.2.2.1 Exkurs: Begriffsbestimmung „ Verschwindensrate“

Aufgrund des Verzichts auf eine Anfütterungsphase und auf

eine mehrtägige Sammlung sind nicht alle Bedingungen im

Sinne eines herkömmlichen Verdaulichkeitsversuchs erfüllt.

Insbesondere befinden sich die Tiere nicht in einem „steady-

state“ bezüglich des Chromoxids. Deshalb sollte bei

Verwendung dieser abgewandelten Versuchsdurchführung im

Screening-Test nicht von „Verdaulichkeiten“ gesprochen

werden, sondern vielmehr von „Verschwindensraten“. Mit der

Nutzung des Begriffes „Verschwindensrate“ (VR) soll zudem

betont werden, dass es sich hierbei um Werte für eine erste

Einschätzung der Wirksamkeit bzw. Effektivität von

Monoenzympräparaten handelt. Verdaulichkeitswerte im

engeren Sinne müssen weiterhin in herkömmlich

durchgeführten Verdaulichkeitsuntersuchungen (inklusive

Anfütterungszeit) und mehrtägiger Kollektion ermittelt werden.


40

3.2.3 Enzymprodukte und –substitution

Multienzymprodukt: Zur Entwicklung des Screenings kam das bewährte Multienzym Pankreatin

(Multienzymprodukt Pankreon®, im Folgenden als PK abgekürzt) tierischen Ursprungs

zum Einsatz, das seit mehreren Jahren in etablierten Verdaulichkeitsstudien verwendet

wurde. Demzufolge liegen Ergebnisse vor, welche die In-vitro- und In-vivo-Wirksamkeit

beschreiben (siehe vorangegangene Dissertationen des Projektes: KARTHOFF 2004;

BECKER 2005). Das hochwirksame Multienzymprodukt PK wurde daher für die

Entwicklung einer Testmahlzeit in der Entwicklungsphase des Screenings verwendet.

Die folgenden Tabellen (Tabelle 4, 5) geben einen Überblick über die spezifischen

Aktivitäten des Multienzymproduktes PK sowie über die eingesetzten Dosierungen des

Enzymproduktes PK im Verlauf der Entwicklung des Lipase-Screenings (s. Tabelle 5).

Tabelle 4: Aktivitäten des Multienzmproduktes Pankreon® (IE / g Protein)

Lipase Protease Amylase

PK 67 921 4 559 68 693

Tabelle 5: Einsatz verschiedener Dosierungen des Multienzymproduktes PK in IE in den Diäten 1. - 8. bei der Entwicklung des Lipase-Screenings

Flüssige Testmahlzeit 0 500 5 000 10 000 50 000 55 000 75 000

1. X X X

2. X X X

4. X X X X

5. X X X X

6. X X X X

7. X X X X

8. X X X X


41

Monopräparate: Zur Testung innerhalb des Screenings gelangten Lipasen mikrobiellen Ursprungs.

Wenngleich ihre In-vitro-Wirksamkeit zuvor getestet, also bekannt war, stand ihre In-vivo-

Wirksamkeit bis zu diesem Zeitpunkt noch in Frage.

Zu Beginn jeder Versuchsphase wurde die spezifische Aktivität der eingesetzten

Präparate bestimmt. Die eingesetzten Dosierungen richten sich nach den ermittelten

enzymatischen Aktivitäten, die sich auf die lipolytischen Aktivität des bekannten

Pankreon® in IE / g Protein beziehen. Die mikrobiellen lipolytischen Aktivitäten (s. Tabelle

6) wurden anhand eines für Pankreon® optimierten In-vitro-Verfahrens ermittelt. Die

mikrobiellen Lipasen kamen im Screening Test in den Dosierungen 500, 5 000 sowie

75 000 IE lipolytischer Aktivität zum Einsatz (s. Tabelle 7).

Tabelle 6: Lipolytische Aktivität der Testlipasen (IE / g Protein)

E1 E2 E3 E4 E5

3 580 000 3 720 000 3 720 000 4 180 000 220 000

Tabelle 7: Im Lipase-Screening-Test eingesetzte Dosierungen des Multienzymproduktes PK und der Testlipasen E1 - E5

500 IE (D1) 5 000 IE (D2) 75 000 IE (D3)

PK*; E 1; E 2; E 3; E 4; E 5 PK*; E 1; E 2; E 3; E 4; E 5 PK*; E 1; E 2; E 3; E 4; E 5

* zusätzlich 10 00, 50 000 und 55 000 IE

3.2.4 Versuchsfutter

Um die Lipasen im Screening testen zu können, musste eine spezielle Diät eingesetzt

werden. Bei einer TS-Menge von 146,9 g, einer Gesamtfettmenge von 51,6 g und einer

Cr2O3-Menge von 0,368 g / Mahlzeit wurde eine Portion Calshakepulver® (Beutelinhalt =

87g) mit 240 ml Milch (1,5 % Fettanteil, haltbare Vollmilch) und 29,37 g Olivenöl der Firma

Roth angerührt. Durch Verwendung eines Ultra-turrax 900® konnte eine stabile Emulsion


42

erreicht werden. Der Flüssigmahlzeit wurde kurz vor der Verfütterung das jeweilige

Testenzym zugeführt und homogen verteilt.

In Tabelle 8 sind die verschiedenen während der Entwicklung einer geeigneten

Testmahlzeit eingesetzten Testmahlzeiten sowie die optimierte Testmahlzeit (Versuch 7 und 8) aufgeführt.

Tabelle 8: Übersicht über die in den verschiedenen Schritten zur Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit für ein Lipase-Screening eingesetzten Testmahlzeiten

Ver

such

TS*

(g)

Rfe

(g)

OL

(g)

ML

(g)

Cr2O3

(g)

Rfe-

Gehalt

(%)

Milch-

Fett

(%)

Futter

Vorabend

Zube-

reitung

Rfa

(g)

1. 108 38,2 12,1 10,1 35,4

2. 152 67,8 25,8 27,5 44,7

3. 147 56,4 17,0 18,0 38,3

HF

4. 152 67,8 25,8 27,5 44,7

3,5

5. 155 57,5 19,6 20,7 37,2

─

6. 155 51,5 19,6 20,7

0,625

33,3

Hand-

mixer

7. 152 51,6 29,4 34,0

8. 152 51,6 29,4 ─ 0,368

34,0

1,5

Provide Xtra

Ultra- turrax

9,9

* generell, d.h. ohne Ausnahme, 240 ml Milch je Mahlzeit

3.2.5 Versuchsablauf

Der unterschiedliche Versuchsaufbau zwischen etablierten Verdaulichkeits-

untersuchungen und Screenings betrifft vor allem die Versuchsdauer (Dauer der

Anfütterung, Dauer bzw. Anzahl der Tage der Kollektionsphase). Während im klassischen

Verdaulichkeitsversuch bei Bestimmung der praecaecalen und der Gesamtverdaulichkeit

innerhalb von 18 Tagen lediglich eine Enzymdosierung getestet werden konnte, war es im

Screening möglich, drei Dosierungen eines Enzyms an einem Tier innerhalb einer Woche

zu testen (s. Abbildung 3). Hierzu wurde innerhalb einer Woche im Abstand von

mindestens 48 Stunden je eine Testmahlzeit (inklusive Marker und Enzymzusatz)


43

gefüttert. Aufgrund der technischen und personellen Gegebenheiten in der

Versuchsanlage konnten pro Versuchswoche maximal drei Tiere das Screening

durchlaufen. Somit ließen sich pro Woche 3 x 3 Dosierungen testen.

Bei der Durchführung des Screenings wurden die zu testenden Enzyme in einer Dosierung

von 500 (D1), 5 000 (D2) und 75 000 IE pankreatische Einheiten (D3) eingesetzt (s.

Tabelle 7). Das zu prüfende Enzym wurde der Testmahlzeit lediglich am Morgen des

Screenings zugegeben. Die Prüfung der verschiedenen Dosierungen eines Enzyms

erfolgte im 3 x 3 Lateinischen Quadrat, um den Einfluss tagesabhängiger Schwankungen

zu minimieren. Das Auffangen von Chymus nach Farbwechsel erfolgte in zweistündigen

Intervallen. Nach Gefriertrocknung und Homogenisierung wurde der Rfe-, TS- und Cr2O3-

Gehalt der Proben ermittelt.

Klassischer Verdaulichkeitsversuch: Bestimmung der Bestimmung der

Gesamt- praecaecale

Anfütterungsphase verdaulichkeit: Verdaulichkeit Kollektion 12h: 8-20 Uhr

1.Tag

10. Tag 15.Tag 18.Tag

Screening-Verfahren: 3 Versuchstage je 1 Dos. 3 Versuchstage je 1 Dos. 3 Versuchstage je 1 Dos.

Enzym 1 Enzym 2 Enzym 3

…48 h…

1.d ….. 7.d 1.d …. 7.d 1.d …..

Abbildung 3: Schematische Übersicht über den zeitlichen Ablauf klassischer Verdaulichkeitsversuche und den zeitlichen Ablauf des Screening-Verfahrens


44

Fütterung in der Phase „Versuchstage“:

Die Tiere erhielten am Morgen des Versuchstages um 745 Uhr die Testmahlzeit. Direkt vor

Aufnahme der Versuchsration erfolgte die Zumischung des Markers und des jeweils zu

testenden Enzyms. Nach Beendigung der Kollektionsphase erhielten die Tiere 250 g

„Haltungsfutter“, angemischt mit 1000 ml Wasser (ohne Enzym- und Markerzulagen). Allen

Tieren stand jederzeit Tränkwasser über Nippeltränken ad libitum zur Verfügung.

Fütterung in der Phase „Versuchsfreie Tage“:

Wegen des Verzichts auf eine mehrtägige Anfütterung wurden die Versuchstiere zwischen

den einzelnen Versuchstagen mit „Haltungsfutter“ (HF) der Firma Altromin® gefüttert (s.

Tabelle 9). Dieses Alleinfuttermittel für Minischweine basiert auf verschiedenen

Getreideschroten und entsprechenden Nährstoffergänzungen. Die Deckung des Bedarfs

von Rohnährstoffen, Mengen- und Spurenelementen sowie Vitaminen war damit

gewährleistet. Um eine Verstopfung der Fisteln zu vermeiden, wurden die

Ausgangskomponenten doppelt gemahlen. Die Verabreichung von 250 g des Futters,

angemischt mit 1000 ml Wasser, erfolgte in einem Rhythmus von 12 h (745 / 1945). Die PL-

Tiere erhielten zusätzlich zweimal täglich 336 000 IE lipolytischer Aktivität Pankreatin®

(PK), welches jeweils drei Tage vor Versuchsbeginn abgesetzt wurde, um eine

„Verschleppung“ von enzymatischer Restaktivität in der jeweiligen Testphase zu

vermeiden. Das HF enthielt keinen Marker (Cr2O3).

Tabelle 9: Analysenwerte der Rohnährstoffe des „Haltungsfutter“ (g / kg TS)

Ra oS Rp Rfe Rfa Nfe Stärke Zucker

52,7 947 189 49,8 30,3 677 477 62,9

Am Vorabend jedes Versuchstages wurde den Versuchstieren anstelle des

„Haltungsfutters“ 400 ml eines fettfreien, kohlenhydratreichen, eiweißreichen flüssigen

„Energiedrinks“ (ProvideXtra®: 12 % Rp, 88 % KH, 0 % Rfe) in der Geschmacksrichtung

Karotte / Apfel angeboten (s. Tabelle 10).


45

Tabelle 10: Zusammensetzung 100 ml des „Energiedrinks“ ProvideXtra® (Geschmackrichtung: Apfel / Karotte)

KJ (kcal) Rp (g) KH(g) Zucker(g) Rfe (g) Ges. FS(g) Rfa (g) Wasser(ml)

525 (125) 3,75 2 7 , 5 5,5 0 0 1 80

3.2.6 Probengewinnung und –aufbereitung

Am Morgen des Versuchstages wurden die ileocaecalen Umleitungsfisteln um 745 Uhr

geöffnet und auf ihre Durchgängigkeit überprüft. An dem ilealen Abschnitt der Fistel wurde

mittels einer Metallklammer ein Behältnis zum Auffangen des Chymus befestigt. Die

caecale Fistel wurde für die Versuchsdauer mit einer Schraubkappe verschlossen.

Gleichzeitig erfolgte die Fütterung, woraufhin die Chymussammlung begann. Der

anflutende Chymus wurde in zweistündigen Intervallen gesammelt und währenddessen

sofort bei -20°C eingefroren.

Auffälliger Weise flutete in den ersten Stunden nach der Aufnahme der markerhaltigen

Diät ausnahmslos brauner Chymus an. Wie BECKER (2005) feststellte, handelte es sich

dabei nahezu ausschließlich um Anflutung von markerlosem Haltungsfutter aus der

Vorabendmahlzeit. Analytisch konnte diese Vermutung bestätigt werden. Zusätzlich wurde

diese These durch eine verringerte TS-Anflutung von „braunem“ Chymus bei Einsatz von

ProvideXtra® gestützt. Der zunächst anflutende braune Chymus wurde gesondert

aufgefangen. Da sich aber der Wechsel zu dem grün -und damit markerhaltigen- Chymus

scharf vollzog, war davon auszugehen, dass die markerhaltige Testmahlzeit zu diesem

Zeitpunkt das Ende des Ileums erreichte. Dieser Farbwechsel im Chymus fand bei den

Tieren zu individuell unterschiedlichen Zeitpunkten, aber im Allgemeinen 4-8 h nach

Fütterung, statt. Mit dem Farbwechsel von „braunem“ zu „grünem“ Chymus begann für das

jeweilige Tier ein neues Sammlungsintervall und die für das eigentliche Screening

relevante Sammlung von Chymus. Der Kollektionszeitraum (siehe BECKER 2005),

welcher in zweistündige Intervalle unterteilt wurde, betrug insgesamt acht Stunden (nach

Farbwechsel). Die Sammlung des Chymus erfolgte in austarierten Plastikschälchen. Ab


46

einer Masse von ca. 50 g wurden diese aus verfahrenstechnischen Gründen

(Gefriertrocknung) mit dem dazugehörigen Deckel verschlossen und zur Ermittlung der

ursprünglichen Substanz gewogen. Während des Sammelns und nach dem Verschließen

fand die Aufbewahrung der Proben bei -20°C statt. Am Ende jedes zweistündigen

Intervalls begann auch bei Nichterreichen des maximalen Befüllungszustandes stets die

Verwendung eines neuen Plastikschälchens. Nach Versuchsende wurden die Proben bis

zur Weiterverarbeitung bei -80°C gelagert.

Nach zweitägiger Gefriertrocknung und Ermittlung des Gewichtes wurden die Proben

jedes einzelnen Tieres und jeden Intervalls getrennt unter Verwendung einer Messermühle

(Grindomix GM 200®, Firma Retsch, Haan) gemahlen und homogenisiert.

3.2.7 Analytik und angewandte Untersuchungsparameter

Lediglich die „nach Farbwechsel“ (n. F.) gewonnenen Chymusproben wurden analysiert,

so dass pro Versuchstag und Tier jeweils vier Proben der Analyse zugeführt wurden. Von

den zuvor gefriergetrockneten und gemahlenen Chymusproben wurden der

Trockensubstanz- (TS)-, Rohfett- (Rfe)- und Chromoxid- (Cr2O3)-Gehalt ermittelt. In der

verwendeten Diät wurde zusätzlich der Gehalt an Rohfaser (Rfa), Rohasche (Ra), Zucker

und Stärke bestimmt. Die Ermittlung der N-freien Extraktstoffe (NfE) und organischen

Substanz (oS) erfolgte rechnerisch.

Trockensubstanz (TS):

Die Analyse der Trockensubstanz erfolgte mittels Weender Futtermittelanalyse nach den

Vorschriften der VDLUFA in der Fassung von NAUMANN und BASSELER (2004).

Nach Ermittlung der ursprünglichen Substanz und Zwischenlagerung bei -80°C erfolgte die

Trocknung der Proben in einer Vakuumgefriertrocknungsanlage (alpha 1-4, Firma Christ

und Lyovac GT 2, Firma Finn-Aqua) bis zur Gewichtskonstanz. Nach erneuter

Bestimmung des Gewichtes und Homogenisierung folgte die Entnahme einer Teilprobe,

welche im Trockenschrank bei 103°C mindestens 8 Stunden bis zur Gewichtskonstanz

nachgetrocknet wurde. Über Gewichtsdifferenz wurde der TS-Gehalt ermittelt.


47

Rohasche (Ra):

Der Gehalt an Rohasche wurde nach einer zwölfstündigen Veraschung der Probe bei

550°C im Muffelofen ermittelt. Als Rohasche wird dabei der Anteil der Probe bezeichnet,

der nach der Veraschung im Veraschungstiegel verbleibt.

Organische Substanz (oS):

Der Gehalt an organischer Substanz wurde rechnerisch mit Hilfe folgender Formel

bestimmt:

oS = TS – Ra

Rohprotein (Rp):

Die Bestimmung des Rohprotein-Gehaltes erfolgte anhand des Gesamtstickstoff-Gehaltes

mit dem Vario Max® der Firma Elementar (Hanau). Das Gerät arbeitet nach dem Prinzip

der katalytischen Rohrverbrennung der Probe unter Sauerstoffzufuhr und hohen

Temperaturen.

Das hierdurch entstehende N2 wird mit Hilfe eines Wärmeleitfähigkeitsdetektors bestimmt.

Rohfaser (Rfa):

Nach 30-minütiger Vorentfettung wurden die Proben mit jeweils 1,25 %iger Schwefelsäure

und 1,25 % Natronlauge für je eine halbe Stunde in einem Rohfaserbestimmungsgerät

(Fibertec System M1020 Hot Extraktor®, Firma Tecator) gekocht. Nachdem der Rückstand

gewaschen, getrocknet und gewogen worden war, erfolgte eine Veraschung im Muffelofen

bei 550°C. Die dabei auftretenden Massenverluste entsprechen dem Rohfasergehalt der

Probe.

N-freie Extraktstoffe (NfE):

Dieser Parameter wurde rein rechnerisch nach folgender Formel bestimmt:

NfE= TS- (Ra+ Rp+ Rfe+ Rfa)


48

Stärke:

Die Ermittlung des Stärkegehaltes basierte auf einer doppelten Bestimmung nach der

amtlichen Methode des VDLUFA (NAUMANN u. BASSLER 2004).

Bestimmung des Hauptwertes: Säurehydrolyse durch Kochen der Probe mit verdünnter

Salzsäure. Nach Abkühlung der Probe folgte Klärung, Filtrierung und polarimetrische

Messung der Lösung. Bestimmung des Blindwertes: Extraktion der Probe mit 40 %igem

Ethanol. Nach Filtration, Säurehydrolyse und anschließende Klärung mit abermaliger

Filtration wurde die optische Drehung der Probenlösung analog zum Hauptwert ermittelt.

Die Multiplikation der Differenz beider Werte mit einem bekannten Faktor für Stärkegehalte

in Mischfuttermitteln von 10,87 ergab den Stärkegehalt der Probe.

Zucker:

Die Methode von LUFF-SCHORL nach Vorschriften der VDLUFA (2004) wurde zur

Bestimmung des Zuckergehaltes verwendet. Die Reduktion des Kupfer(II)-salzes erfolgte

mittels reduzierten Zuckers zu Kupfer(I)-oxid. Durch jodometrische Titration des

unverbrauchten Kupfers konnte auf den Zuckergehalt der Probe geschlossen werden.

Chromoxid:

Die Cr2O3-Gehalte wurden mit Hilfe der Methode nach PETRY und RAPP (1970)

bestimmt. Im Laufe einer Nassveraschung erfolgte die Überführung von Chromoxid

anhand eines Oxidationsgemisches aus Schwefelsäure, Perchlorsäure und

Natriummolybdat in Chromat. Die Messung der Extinktion gegen einen Blindwert wurde im

Photometer bei 365 nm durchgeführt, nachdem die Probe durch Natronlauge alkalisiert

worden war. Der Cr2O3-Gehalt der Probe wurde mit Hilfe eines durch eine Eichreihe

ermittelten Extinktionskoeffizienten errechnet.

Rohfett (Rfe):

Zu Beginn der Entwicklung einer Testmahlzeit im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die

Validierung eines neuen Analysengerätes namens AnkomHCl Hydrolysis System® der

Firma Ankom Technology Corporation zur Bestimmung des Rohfettgehaltes.


49

Die analytische Genauigkeit der Ergebnisse betrug laut Angaben der Firma ± 0,1 mg. Die

Analyse erfolgte dabei in zwei Schritten:

1. Hydrolyse:

Im ersten Schritt wurden unter Verwendung der Filterbag-Säurehydrolyse-Technik® (Filter

Bag Technique Acid Hydrolysis) die löslichen Nichtfette aus der Probe heraus gelöst. Die

zu lösende Rfe-Fraktion bestand vornehmlich aus Triglyceriden.

Zunächst wurden 0,3 - 0,6 g (je nach vorhandener Probenmenge) Probenmaterial in

säureresistente Filterbags mit einer Porengröße von 1 µm eingewogen, die zwar der

Salzsäurelösung den Durchtritt gewähren, nicht aber das Probenmaterial austreten lassen.

Der Einwaage wurden ca. 0,25 g einer Filtrierhilfe aus Kieselgur (Hyflo Super Cel®

medium der Firma Fluka Chemika) zugegeben. Nach Verschließen der Filterbags mit Hilfe

des so genannten Heatsealers oder Filterbag-Schweißgerätes wurden bis zu 20 Filterbags

in einem Probenständer in der Kammer des Hydrolysegerätes gleichmäßig verteilt.

Grundsätzlich erfolgte eine Doppelbestimmung der Proben. Daraufhin wurden 500 ml 3N

HCl (= 12,7 %ige Salzsäurelösung) in die Kammer gegeben und der Deckel verschlossen.

Der Vorgang wurde auf eine Hydrolysezeit von 40 Minuten und 6 Spülgänge mit

Leitungswasser programmiert. Nach ca. 1,5 Stunden erfolgte die Probenentnahme und die

Filterbags wurden nochmals unter laufendem destilliertem Wasser nachgespült.

Anschließend wurden die Filterbags einzeln auf zuvor ausgewogene Uhrgläser verteilt und

in einen 80°C heißen Trockenschrank überführt. Nach mindestens 6 Stunden folgte ihre

Entnahme und Abkühlung in Exsiccatoren.

2. Extraktion:

Die Extraktion der Rohfette erfolgte in diesem zweiten Analysenschritt. In dem hierfür

benutzten Gerät AnkomXT15Extraktor® der Firma Ankom wurde Petrolether zum Lösen der

fetthaltigen Bestandteile verwendet.

Maximal 15 der nach Punkt 1. bearbeiteten Filterbags wurden in dem Extraktionskessel

platziert. Dieser bestand aus einem verschließbaren und druckstabilen Kammersystem.

Nach 50-minütiger Extrationszeit mit Petrolether wurden die Proben gespült und das

heraus gelöste Extraktionsgemisch automatisch aus dem Kessel abgesaugt.


50

Nach Beendigung des Vorganges wurden die Proben wiederum bei 80°C im

Trockenschrank für drei Stunden getrocknet und nach Abkühlung im Exsiccator gewogen.

Durch Differenzbildung zwischen zweitem und dritten Wiegen und Division durch das

eingewogene Anfangsgewicht errechnete sich der prozentuale Rohfett-Anteil der Probe.

Validierung des alternativen Verfahrens zur Rohfettbestimmung (AnkomHCl Hydrolysis Systems®)

Zur Analyse des Rohfettgehaltes in den Chymus- und Futtermittelproben wurde eine

andere Methode als in den vorangegangenen Dissertationen des Projektes (Verwendung

der Soxhlet-Apparatur nach Vorschriften der Weender-Analyse) benutzt. Zur Überprüfung

der Anwendbarkeit bzw. Eignung der neuen Methode sowie zur Bestimmung der

Vergleichbarkeit der Ergebnisse der beiden Verfahren erfolgten zu Beginn der Versuche

zahlreiche parallele Bestimmungen unter Verwendung beider Methoden.

In diesem Abschnitt werden die Ergebnisse der zwei verschiedene Verfahren zur

Bestimmung des Rfe-Gehaltes gegenübergestellt: Die Chymus- und Futterproben wurden

sowohl mit der erstmalig in diesem Projekt verwendeten Ankom-Apparatur, als auch mit

der herkömmlich benutzten Methode der Rohfettbestimmung unter Verwendung der

Soxhlet-Apparatur untersucht und deren Ergebnisse verglichen. Um die

Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der neuen Methode nachzuweisen, werden

Mehrfachwiederholungen einzelner Proben ausgewertet.

Anfangs wurden 22 Proben, parallel sowohl mit der etablierten Soxhlet-Methode als auch

mit der neuen Methoden des Hydrolysator- und Extraktionsgerätes von Ankom® (=

% Rfe = 100 x ((Gew. des Beutels nach Hydrolyse – Gew. des Uhrglases) – Gew. des Beutels nach Extraktion)

Einwaagegewicht


51

AnkomHCl Hydrolysis System® (Filterbag-Säurehydrolyse-Technik® und AnkomXT15

Extraktor®)) analysiert, wobei stets eine Doppelbestimmung erfolgte.

Es muss hier daraufhin gewiesen werden, dass zum Zeitpunkt dieser Validierung noch

eine geringfügig andere Geräteeinstellung benutzt wurde (Hydrolyse: mit 550 ml HCl für

40 min, 2x spülen mit H2O / Extraktion: 40 min). Während der Versuche wurden hingegen

einige Modifikationen hinzugefügt: es wurden lediglich 500 ml HCl benutzt und die Anzahl

der Spülgänge wurde auf sechs im Gerät und einer weiteren manuellen Spülung mit

destilliertem H2O angehoben. Des Weiteren wurde die Extraktionszeit von 40 auf 50

Minuten erhöht. Diese Veränderungen fanden statt, da sich in den Proben nach

Bearbeitung noch Reste von HCl fanden. Durch diese Modifikationen verbesserte sich die

Übereinstimmung der Doppelwerte deutlich bzw. die Abweichungen bei

Doppelbestimmungen wurden deutlich reduziert.

Vergleich der Methoden: Der Vergleich der Mittelwerte der Doppelwerte zwischen herkömmlicher (Soxhlet) und

neuer Methode (Ankom-Technologie) zeigte, dass die Ergebnisse des Ankom-Gerätes

nicht exakt denen der Soxhlet-Methode entsprechen.

Die mit der Ankom-Apparatur ermittelten Ergebnisse ergaben Werte, die zwischen 1-29 %,

im Mittel aber 10 %, höher lagen als die mit dem Soxhlet-Verfahren gewonnenen

Vergleichswerte. Es ließ sich also eine gerichtete Abweichung der Rfe-Ergebnisse der

„Ankom-Methode“ gegenüber der Werte der „Weender-Methode“ (Soxhlet) ablesen (s. Tabelle 13).

Die Ermittlung der relative Abweichung der Einzelwerte voneinander nach der jeweiligen

Methode betrachtet, ergab vergleichbare Abweichung vom Mittelwert: Bei Bestimmung

des Rohfett-Gehaltes nach der Weender-Methode (Soxhlet) wurden 3,68 % relative

Abweichung vom Mittelwert berechnet, während nach Verwendung der Ankom-Geräte

eine Wert von 3,86 % kalkuliert wurde (s. Tabelle 11).


52

Tabelle 11: Mittelwerte der prozentualen Differenz der beiden ermittelten Rohfett-Gehalte der Einzelbestimmung** dargestellt für zwei Methoden zur Rohfett-Bestimmung

Soxhlet® Ankom®*

MW der Differenz der Einzelwerte (%) 3,63 3,86 *Geräteeinstellung: Hydrolyse: mit 500ml HCl für 40min, 2x spülen mit H2O Extraktion: 40 min ** bezogen auf den kleineren Wert

Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

Die Probe Nummer 4554/05 wurde insgesamt 65mal als Doppelprobe und die Probe

Nummer 5508/05 69mal als Doppelprobe mit der neuen „Ankom-Apparatur“ untersucht.

Dadurch sollte die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse überprüft werden, indem von der

jeweiligen Probe Mittelwert, Standardabweichung und Varianzkoeffizient gebildet wurden.

Tabelle 12: Kalkulierte Mittelwerte, Standardabweichungen und Varianzkoeffizienten der Mehrfach-Bestimmungen des Rohfett-Gehaltes zweier Proben

Probe Mittelwert ± Standardabweichung Varianzkoeffizient

4554/05 31,6 ± 0,621 1,96

5508/05 36,6 ± 0,676 1,79

Beim Vergleich der Mittelwerte („Ankom-Werte“ vs. „Weender-Werte“) der

Rohfettbestimmung (Rohfett-Gehalt der Probe in %) wurde festgestellt, dass die Differenz

zwischen 0,21 und 2,76 (MW 1,34) liegt.


53

Tabelle 13: Gegenüberstellung der ermittelten Rohfett-Gehalte in %; bestimmt nach Soxhlet und Ankom und der relativen Abweichung (%) ihrer Mittelwerte

Methode Probe Rfe- Gehalt (%)

1. 2. MW

Abweichung

(%) **

∆ der

Mittelwerte

Rel. Abweichung

Ankom zu Soxhlet (%) Soxhlet® 8,05 7,6 7,83 +6 Ankom®*

4704/05 9,51 9,43 9,47 +1

1,64 121

Soxhlet® 18,5 19,4 19,0 +4 Ankom®*

4734/05 20,9 20,0 20,5 +5

1,5 108

Soxhlet® 13,5 13,1 13,3 +3 Ankom®*

4182/05 16,3 15,7 16,0 +4

2,76 120

Soxhlet® 6,91 6,31 6,61 +10 Ankom®*

4183/05 9,13 8,21 8,67 +11

2,06 131

Soxhlet® 10,2 10,2 10,2 ±0 Ankom®*

4185/05 11,4 11,9 11,6 +4

1,44 114

Soxhlet® 17,3 16,7 17,0 +4 Ankom®*

4731/05 17,9 17,7 17,8 +1

0,79 105

Soxhlet® 33,7 33,9 33,8 +1 Ankom®*

4741/05 34,9 33,0 33,9 +6

0,13 100

Soxhlet® 32,0 33,0 32,5 +3 Ankom®*

4743/05 34,7 34,7 34,7 ±0

2,21 107

Soxhlet® 24,5 24,6 24,6 ±0 Ankom®*

4442/05 25,3 26,1 25,7 +3

1,12 104

Soxhlet® 32,1 31,7 31,9 +1 Ankom®*

4443/05 31,9 32,3 32,1 +1

0,24 101

Soxhlet® 31,1 30,8 31,0 +1 Ankom®*

4554/05 30,8 34,6 32,7 +12

1,74 105

Soxhlet® 34,6 34,1 34,3 +1 Ankom®*

4521/05 35,2 35,4 35,4 +1

1,04 103

Soxhlet® 36,5 37,6 37,1 +3 Ankom®*

4518/05 37,5 39,3 38,4 +5

1,35 104

Soxhlet® 19,6 18,9 19,3 +4 Ankom®*

4709/05 21,2 21,9 21,5 +3

2,24 111

Soxhlet® 29,0 28,6 28,8 +1 Ankom®*

4694/05 29,9 32,4 31,1 +8

2,3 108

Soxhlet® 27,1 26,1 26,6 +4 Ankom®*

4695/05 26,5 28,1 27,3 +6

0,73 103

Soxhlet® 8,15 7,23 7,69 +13 Ankom®*

4713/05 9,86 10,0 9,93 +1

2,24 129

Soxhlet® 17,6 17,1 17,4 +3 Ankom®*

4715/05 17,6 17,5 17,6 +1

0,21 101

Soxhlet® 37,5 37,8 37,6 +1 Ankom®*

4732/05 39,2 38,9 39,1 +1

1,44 104

Soxhlet® 18,5 19,4 19,0 +5 Ankom®*

4734/05 19,4 20,0 19,7 +3

0,75 104

Soxhlet® 8,82 8,88 8,85 +1 Ankom®*

4737/05 9,26 9,06 9,16 +2

0,31 104

Soxhlet® 36,9 37,0 37,0 ±0 Ankom®*

4738/05 37,8 37,0 37,4 +2

0,44 101

Mittelwert 1,34 110 ** bezogen auf den kleineren Wert


54

3.2.8 Verwendete Berechnungsansätze zur Einschätzung der praecaecalen Fettverdaulichkeit

Im Folgenden werden drei unterschiedliche Berechnungsansätze zur Ermittlung der

Fettverdaulichkeit sowie ein Ansatz für die Chromoxid-Wiederfindung angegeben.

1. Anflutung:

1a. Trockensubstanz (TS)- und Rohfett (Rfe)-Anflutung absolut (g):

In dem 8-stündigen Kollektionszeitraum wurden in zweistündigen Intervallen sowohl die

angeflutete Trockensubstanz- als auch Rohfettmenge in Gramm ermittelt.

Die Multiplikation von Chymusmenge (TS) und des Rohfettgehaltes (g / kg TS) ergibt die

tatsächlich angeflutete Fettmenge:

Rfe-Anflutung (g) = Rfe im Chymus (g/kg) x Chymusmenge (g)/1000

1b. Flussrate relativ:

Bildung des prozentualen Verhältnisses aus Einzelintervall zu Gesamtintervall des

Kollektionszeitraumes für Rfe.

Die Bestimmung der relativen Flussrate für TS und Cr2O3 erfolgte analog.

Chymusmenge (uS) (g) x TS-Gehalt im Chymus (g/kg)

100TS-Anflutung im Chymus (g) =

Rfe rel. Fluss = Rfe (g) Anflutung im jeweiligen Intervall (2 h)

Rfe (g) Anflutung im Gesamtintervall 0-8 h n.F.

( X 100)


55

1c. rel. Anflutung:

Bildung der Relation der absoluten Rohfettanflutung bei PL-0-Tieren mit und ohne

Enzymsubstitution

2. Konzentrationen: Im folgenden Abschnitt werden die zur Berechnung der Konzentrationen von Rohfett und

Chromoxid (Cr2O3) im Chymus genutzten Formeln dargestellt:

2a. – Fettkonzentration

2b. Relation von Rohfett-Konzentration zu Cr2O3-Konzentration

(das aufgenommene Futter enthielt generell eine Rfe- zu Cr2O3-Konzentration Relation

von 140)

Rfe Anflutungsrelation = Rfe Anflutung (g) nach Enzymverabreichung

Rfe Anflutung (g) ohne Enzymverabreichung( ) X 100

Cr2O3- Konzentration (%) = ( Cr2O3 im Chymus (g)

Chymusmenge (g)) X 1000

Relation Rfe-Konz. / Cr2O3-Konz. (%) = Rfe-Konzentration (%)

Cr2O3- Konzentration (%)) X 1000(

Rfe-Konzentration (%) (% der TS)

(Rfe im Chymus (g)

Chymusmenge (g)) X 1000=


56

3. Indikatormethode: Diese Berechnung dient der Ermittlung der scheinbaren praecaecalen Verdaulichkeit.

Obwohl diese Methode die Grundlage der Berechnung der Verdaulichkeiten in dieser

Arbeit darstellt, wird im Folgenden von Verschwindensrate gesprochen werden, da die

Bedingungen eines herkömmlichen Verdaulichkeitsversuches nicht erfüllt wurden (s.

vorher).

Chromoxid-Wiederfindung:

1) im Zeitraum 0-8h

sV (%) = 100 - ( % Indikator im Futter

% Indikator im Chymusx

% Nährstoff im Chymus

% Nährstoff im Futter) X 100

Cr2O3-Wiederfindung (%) =Cr2O3- Anflutung im Chymus (g) 1)

Cr2O3 im Futter (g) / 147 g TSX 100


57

3.2.9 Entwicklung eines In-vivo-Screening-Tests zur Einschätzung der Wirksamkeit von Lipasen anhand eines bekannten Multienzym-produktes

Fragestellung: Welche Anforderungen werden an eine Diät gestellt, die für einen Lipase-Screening-Test geeignet ist? Der von BECKER (2005) für Proteasen und Amylasen entwickelte Schnelltest sollte, wenn

möglich, auch für die Testung von Lipasen zum Einsatz kommen. Zu diesem Zwecke war

es zum einen notwendig, das Verhältnis von Substrat (Fett) und Enzym (Lipase) in der

Testmahlzeit so auszubalancieren, dass die Substratverfügbarkeit nicht den limitierenden

Faktor darstellte und zum anderen dosisabhängige Effekte erkennbar waren.

Bei Verabreichung fettreicher Mahlzeiten ohne Anfütterungsphase waren die

nachstehenden Probleme zu befürchten:

• Veränderungen bzw. Störungen der Magen-Darm-Motorik und

Passagebeeinträchtigungen durch mangelnde Adaptation infolge des Verzichts

auf eine Anfütterungsphase

• Nicht parallele Anflutung der Nährstoffe und des Markers an der Fistel durch

Entmischungsprozesse (Entmischung des Markers von der Testmahlzeit sowie

Entmischungen der einzelnen Komponenten der Testmahlzeit)

Es stellte sich heraus, dass die Verwendung der von BECKER (2005) eingesetzten

Testmahlzeit, eine Modifikation auf der Basis einer herkömmlichen gebräuchlichen

Mahlzeit (BECKER 2005), wegen der Besonderheiten des Lipase-Screenings nicht zum

Erfolg führte. Es war also notwendig, eine gänzlich neue Testmahlzeit zu entwickeln,

um die vorgenannten Probleme zu minimieren bzw. zu beseitigen.


58

3.2.10 Anforderungen an eine Testmahlzeit für ein Lipase-Screening

• paralleler Fluss von Trockensubstanz, Rohfett, Enzym und Marker

(= keine Entmischung)

• physiologische Verhältnisse bezüglich Magenentleerung und Passageraten

(physiologische Verweildauer der Nahrung inklusive der Enzyme in den

verschiedenen Abschnitten des GIT; damit „realistische“ Bedingungen für

Enzym)

• uneingeschränkte Substratverfügbarkeit durch hohen Fettgehalt der

Testmahlzeit

• Fettqualität

• Orientierung an Humanernährung (z.B. Einsatz von Milchfett) als Fettquelle

• Anpassung an In-vitro-Untersuchungen (z.B. Einsatz von Olivenöl) als Fettquelle

(Anforderung ergab sich aus der Verwendung von Olivenöl (in-vitro) und dem

Ziel der Verbesserung der Übereinstimmung der Ergebnisse der In-vivo und In-

vitro-Tests)

• erhöhter Anteil langkettiger Fettsäuren (hoher Olivenölanteil)

Als Basisdiät wurde eine pulverförmige, in Milch zu lösende Mahlzeit mit dem Charakter

eines Milchshakes, der so genannte „Calshake®“ der Firma Fresenius, Bad Homburg,

ausgewählt, der einen hohen Fettgehalt aufwies. Dieser hochkalorische und

leichtverdauliche Milchshake findet als Nahrungsergänzungsmittel Anwendung bei

Personen, die von Malabsorption und Maldigestion (z.B. durch Mukoviszidose, Tumor-

Erkrankungen, Essstörungen etc.) betroffen sind. Bei Zubereitung nach Packungsbeilage

wird das Calshakepulver (g / kg Pulver: Rp 43; Rfe 244; KH 649; Rfa 0; 20 770 kJ / kg)

eines Beutels (= 87 g) mit 240 ml Milch (mit einem Milchfettgehalt von 3,5 %) vermischt. Je

100 ml des auf diese Weise zubereiteten Calshakes enthalten: 3,8 g Rp; 9,6 Rfe g; 21,7 g

KH, 0 Rfa g sowie 788 kJ.

Im Laufe der Entwicklungsphase der Testmahlzeit wurde die Notwendigkeit einiger

Modifikationen bzw. weiterer Additive deutlich, die im Folgenden vorgestellt werden:

Die Hydrolyse und Resorption kurz- und mittelkettiger Fettsäuren erfolgt zum Teil auch

ohne pankreatische Verdauungsenzyme (z.B. Spaltung durch gastrische Lipasen). Um


59

insbesondere das lipolytische Vermögen der pankreatischen Lipasen zu beurteilen,

wurden deshalb vermehrt langkettige Fettsäuren eingesetzt, zumal diese einen

bedeutenden Anteil der humanen Fettaufnahme bilden.

Außerdem sollte die Erhöhung des Fettgehaltes der Diät mittels einer in In-vitro-Versuchen

genutzten Fettquelle stattfinden, um die Vergleichbarkeit von Screening-Ergebnissen mit

jenen der In-vitro-Versuche zu verbessern. Diese vorgenannten Gründe führten zu der

Entscheidung, auch Olivenöl als Fettquelle zu nutzen. Durch den Zusatz von Olivenöl

wurde der Fettanteil in der Testmahlzeit auf ca. 35% der TS angehoben, wodurch der

Fettgehalt mit jenem der in früheren Arbeiten des Projektes verwendeten fettreichen

Ration (TABELING 1998) vergleichbar war. Aufgrund der flüssigen Zubereitung bzw. der

Applikation als Emulsion wurde trotz vergleichbarem Fettgehalt eine Verringerung der

oben genannten Probleme (insbesondere der Entmischungsprozesse) erwartet.

Der in der Testmahlzeit eingesetzte Marker Chromoxid (Firma Aldrich®, Steinheim)

erfüllte analog zu dem von BECKER entwickelten Screening-Verfahren zweierlei

Aufgaben:

Optische Kontrolle der Anflutung: Nach BECKER (2005) flutete in den ersten Stunden

nach der morgendlichen Fütterung der Versuchsmahlzeit „brauner“ Chymus aus dem

Haltungsfutter der vorabendlichen Mahlzeit an der Fistel an. Durch die Markierung der

Versuchsmahlzeit mit nichtabsorbierbarem grünem Cr2O3 konnte der aus der Testmahlzeit

stammende Chymus von jenem, der aus dem Futter vom Vorabend bestand, abgegrenzt

werden. Demzufolge war es möglich, die auffällige grüne Farbe des Chymus zu nutzen,

um den Zeitpunkt der Ankunft des Versuchsfutters zu bestimmen und somit den

Chymus des Haltungsfutters von dem des Versuchsfutters zu unterscheiden. Dieser im

Folgenden als „Farbwechsel“ bezeichnete Wechsel der Farbe von „braunem“ zu „grünem“

Chymus wurde also als „Startsignal“ für den Beginn der Chymuskollektion genutzt.

Markerkorrigierte Berechnung der Verschwindensrate (= Indikatormethode) zur Kalkulation

der im jeweiligen Kollektionszeitraum resorbierten Nährstoffmenge mit Hilfe des Markers.

Infolge einer parallel verlaufenden relativen Flussrate von Nährstoffen und Marker kann

am Ileumende die „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett berechnet

werden. Die Berechnung der „Verschwindensrate“ bietet den Vorteil, dass anhand der


60

markerkorrigierten Kalkulation differenziert werden kann, ob beispielsweise eine geringe

Chymus- bzw. Nährstoffanflutung aus einer hohen Verdaulichkeit oder aber aus einer

geringen Flussrate resultiert.

Im Verlauf der Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit erschien es außerdem

zweckmäßig, eine Ballaststoffquelle (= Methocel®: Methylcellulose (ca. 30 %

Methoxylgruppen und 70 % Cellulose)) hinzu zu fügen. Zum einen führte der Einsatz einer

Rohfaser-Quelle zur Erhöhung der Chymusmenge, da keine beachtenswerte Verdauung

von Rfa im praecaecalen Bereich beim Schwein stattfindet und somit ein Füllungseffekt

des GIT auftrat (und damit indirekt über Dehnungsreize die Passagerate beeinflusst

wurde). Zum anderen erhöhte sich die Chymusanflutung an der ilealen Fistel und damit

die Menge des für Analysen zur Verfügung stehenden Materials. Des Weiteren sollte mit

Zulage des Methocels (= partikuläre Struktur) der Entmischung von Marker, Enzym und

Testmahlzeit entgegen gewirkt werden. Zudem bestand die Annahme, dass die Erhöhung

der TS-Aufnahme zu einem ausgeprägterem Sättigungsgefühl der Tiere betragen würde.

Zusätzlich sollte geprüft werden, ob der Zusatz von Rohfaser („Ballaststoffen“) einen

Einfluss auf die Magenentleerung im Sinne einer Förderung der Magenpassage hat.

Auf die anfangs eingesetzte Fettquelle Mikrolipid (Rohfett-Gehalt: 50 %; emulgierte Fette,

die zur Sondenernährung in der Humanmedizin eingesetzt werden) musste im weiteren

Verlauf der Studie wegen mangelnder Verfügbarkeit verzichtet werden.

Um eine stabile Emulsion zu erlangen wurde im Verlauf der Versuche der Mixer Ultra-turrax 900® anstelle eines Handrührgerätes eingesetzt, da dieser eine feinere Verteilung

der Bestandteile erzeugte. Die verbesserte Homogenität sollte sich stabilisierend auf die

Emulsion der Diät auswirken.

Nach Testung verschiedener Varianten des Calshakes, insbesondere in Bezug auf

Zusammensetzung und Zubereitung, wurde schließlich eine Erfolg versprechende

Rezeptur entwickelt (s. Tabelle 14, 15). Die Testung der Mahlzeit erfolgte ebenso wie die

Auswahl der drei zu testenden Dosierungen, um dosisabhängige Wirkungen für die


61

Testung unbekannter Lipasen festzulegen, anhand des gut untersuchten

Multienzympräparates PK (Pankreon®).

Tabelle 14: Menge der Rohnährstoffe und Cr2O3 (g) in der zubereiteten Testmahlzeit

TS Ra Rp Rfe Rfa NfE Cr2O3

147 33,5 11,3 51,6 6,80 73,8 0,368

Tabelle 15: Zubereitungsrezept der Testmahlzeit (modifizierter Calshake®)

Einwaage der Einzelkomponenten und Homogenisierung mittels Ultra-turrax 900® (9500

U / min.): 247,2 g H-Milch (1,5 % Fettanteil) und 0,368 g Chromoxid für 1 Minute

Zugabe von 29,9 g Olivenöl und nochmaligen Homogenisieren mittels Ultra-turrax 900®

für zwei Minuten

Zugabe von einem Beutel Calshake (87 g) und Durchmischung für zwei Minuten mit

Handmixer

Zugabe von 9,88 g Methocel; langsam dazugeben während ca. dreiminütigen Rührens

mit dem Ultra-turrax 900®, bis eine klumpenfreie Emulsion entsteht.

3.2.11 Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit

Im Folgenden wird eine Zusammenstellung der Modifikationen und Bewertungen

maßgeblicher Komponenten der zu entwickelnden Testmahlzeit dargestellt. Ausgehend

von der Idee einer flüssigen Mahlzeit mit hohem Fettanteil (Calshake®) entwickelte sich die

oben genannte Versuchsdiät schrittweise über sieben Optimierungsstufen (flüssige

Testmahlzeit I-VII) zur endgültigen Versuchsmahlzeit:

Parallel zur Entwicklung der Testmahlzeit erfolgten erste Versuche zur Ermittlung

geeigneter Enzymdosierungen, wobei das bereits in zahlreichen In-vivo-Versuchen

(Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit sowie der Gesamtverdaulichkeit)

eingesetzte Multienzymprodukt Pankreon genutzt wurde.


62

Aufgrund des chronologischen Verlaufes und der parallel durchgeführten Modifikationen

sowohl des Fettgehaltes als auch der Enzymkonzentration zur Optimierung des

Verhältnisses von Substrat (= Fett) und Enzym (= Lipase) werden die Entwicklung der

Testmahlzeit und die Dosisfindungsversuche im Folgenden gemeinsam behandelt.

Die nun folgenden „Testmahlzeiten I-VIII“ sind Modifikationen der Originalrezeptur des

Calshakes®:

Tabelle 16: Zusammensetzung des Calshakes® pro 100 g Pulver

MJ (kcal) Rp(g) KH(g) Zucker(g) Laktose(g) Rfe (g) Ges.FS(g) Ballast-

stoffe(g)

2,077(495) 4,3 64,9 49,0 3,3 24,4 15,4 0

3.2.11.1 1. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit

Fragestellung: Ist der „Calshake®“ mit zusätzlicher Fettanreicherung auf 38,2g Rfe /

Mahlzeit (= Testmahlzeit I) als flüssige Testmahlzeit für ein Lipase-Screening geeignet?

Versuchsdesign:

Probenkollektion: analog Screening-Test (BECKER 2005)

Dauer: 8 Stunden

Beginn der Kollektion: nach „Farbwechsel“ (n. F.)

Fütterung am Vorabend des Versuchstages (12 h vor Versuchsbeginn): Haltungsfutter

Flüssige Testmahlzeit I:

Zur Klärung der Frage, ob der „Calshake®“ als Testmahlzeit für einen Lipase-Screening

Test geeignet ist, wurde die Originalrezeptur (s. Anforderungen an eine Testmahlzeit für

ein Lipase-Screening) des „Calshakes®“ durch weitere Zusätze ergänzt: Der Fettanteil

wurde durch Zulage von 12,1 g Olivenöl (OL) und 10,1 g Mikrolipid (ML) auf eine

analysierte Rohfettmenge von 38,2 g pro Mahlzeit (Fettgehalt: 35,4 %) angehoben. Die

gesamte Trockensubstanzmenge betrug 107,9 g / Mahlzeit (s. Tabelle 17). Aus


63

vorangegangenen Untersuchungen war bekannt, dass sich die flüssige Darreichungsform

und die Zusammensetzung (hochverdauliche Nährstoffe) in der flüssigen Testmahlzeit

positiv auf die Effizienz der Lipasen auswirken würden. Demzufolge fand eine Reduktion

der Enzymmenge des während der Entwicklung als Standardenzym verwendeten

Pankreon® (PK) von 0 / 56 000 / 112 000 / 336 000 / 1 120 000 IE in der Standard-Fettdiät

(30 % Rfe / kg TS, 250 g TS, s. KARTHOFF (2004); angeboten mit 1 000 ml Wasser) auf

0 / 10 000 / 75 000 IE in der flüssigen Testmahlzeit statt.

Tabelle 17: Inhaltsstoffe (g) der Testmahlzeit I

TS Rfe-Gehalt (%) Rfe OL ML Milch* Cr2O3 (IE)**

107,9 35,4 38,2 12,1 10,1 240 0,625 0; 10 000; 75 000

* Milchfettgehalt: 3,5 % ** IE=Dosierungen des Multienzymproduktes Pankreatin® in lipolytischer Aktivität

Zubereitung der Testmahlzeit: elektrischer Handmixer

Ergebnisse:

Bei allen Tieren erfolgte im Untersuchungszeitraum von 8 Stunden nach Farbwechsel eine

dosisabhängige Reduktion der absolut angefluteten Chymusmenge bzw. der angefluteten

Menge an TS sowie Rfe (Anflutungsmenge reziprok zur Enzymdosierung; s. Tabelle 18).

Tabelle 18: Angeflutete Menge an TS und Rfe (g) im Kollektionsintervall 0-8 Std. nach Farbumschlag bei den Tieren 63, 82 und 83 nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit I

Tier 63 82 83

IE 0 10 000 75 000 0 10 000 75 000 0 10 000 75 000

TS 70,7 30,1 21,0 39,6 34,0 22,1 45,2 22,8 17,8

Rfe 24,4 6,35 4,95 14,3 5,88 1,91 21,04 2,49 2,36

Da eine geringe Anflutung nicht nur aus einer hohen Verdaulichkeit der Nährstoffe,

sondern auch aus einer geringen Passagerate resultieren kann, wurde analog zum


64

Vorgehen von BECKER (2005) die angeflutete Chromoxidmenge bestimmt und zu der mit

der Testmahlzeit applizierten Chromoxidmenge in Relation gesetzt. Die bei diesem

Vorgehen ermittelte so genannte „Chromoxid-Wiederfindung“ differiert durchaus zwischen

den einzelnen Tieren, ist jedoch bei jedem einzelnen Tier relativ konstant (s. Tabelle 19).

Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Verringerung der angefluteten Menge an

Trockensubstanz und Rohfett bei steigender Dosierung des eingesetzten

Multienzymproduktes Folge der enzymatischen Aktivität des Enzyms ist und nicht als

Effekt einer verzögerten Anflutung zu werten ist.

Die Kalkulation der so genannten „Verschwindensraten“ ergab tendenziell eine reziproke

Entwicklung im Vergleich zu der Anflutung, wobei ein stark unterschiedlich hohes Niveau

der VR bei fehlender Enzymsubstitution zu konstatieren war. Bezüglich der Rohfett-

Verschwindensrate konnte bei zwei der drei Tiere jedoch keine deutliche Steigerung nach

Einsatz der höchsten Enzymdosierung im Vergleich zu der mittleren Dosierung beobachtet

werden. Allgemein wurden bereits mit der mittleren Dosierung sehr hohe VR (60-88 %)

erreicht (s. Tabelle 19). Bei einem Tier wurde eine negative TS-VR kalkuliert (s. Tabelle

19).

Tabelle 19: „Verschwindensrate“ von TS und Rfe (%) sowie Chromoxid-Wiederfindung (%) nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit I

Tier 63 82 83

IE 0 10 000 75 000 0 10 000 75 000 0 10 000 75 000

TS -1,30 50,7 67,1 17,8 19,4 53,0 36,5 61,2 72,2

Rfe 1,22 79,4 78,1 16,0 60,6 88,5 16,5 88,0 89,5

Cr2O3 64,7 56,6 59,2 44,7 39,1 43,5 66,0 54,4 59,2

Tabelle 20: Mittlere Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate (%) der flüssigen Testmahlzeit I

Enzymdosierung IE 0 10 000 75 000

Trockensubstanz-VR 17,7 ± 18,9 43,7 ± 21,8 60,0 ± 9,98

Rohfett-VR 11,3 ± 8,69 76,0 ± 14,0 85,4 ± 6,35


65

Schlussfolgerungen:

Der erste Einsatz einer flüssigen Testmahlzeit (Testmahlzeit I) als einmalige Versuchsdiät

für die Überprüfung der lipolytischen Aktivität zugesetzter Enzyme war grundsätzlich

positiv zu bewerten (dosisabhängige Effekte bezüglich der absoluten Anflutung von

Trockensubstanz und Rohfett; bis auf wenige Ausnahmen dosisabhängige Steigerung der

kalkulierten Verschwindensraten von Trockensubstanz und Rohfett). Die Chromoxid-

Wiederfindung war mit mittleren Werten von ~60 % leicht niedriger als die von BECKER

(2005) ermittelten Werte. Insgesamt waren bezüglich der Chromoxid-Wiederfindung

weniger Effekte der Enzymzulage bzw. tagesabhängige Schwankungen als vielmehr

tierindividuelle Einflüsse zu vermuten.

Schwerpunkt in der weiteren Optimierung einer Testmahlzeit war die Minderung möglicher

Entmischungsvorgänge (Separation von Marker, Testmahlzeit und zugesetztem Fett). Die

z.T. hohe TS-Anflutung an der ilealen Fistel (TS-Anflutung Tier 63; 0 Enzym: 70,7 g;

negative TS-VR) könnte zudem auf eine Vermischung der flüssigen Testmahlzeit und dem

schrotförmigen Futter des Vorabends hindeuten.

Des Weiteren wurden trotz deutlicher Reduktion der Enzymdosierungen (s. o.) -im

Vergleich zu vorangegangenen Arbeiten des Projektes, in denen fettreiche Mischfutter auf

der Basis von Getreideschrot verwendet wurden- bereits in der geringeren Dosierung (10

000 I.E. / Mahlzeit) sehr hohe Rohfett-Verschwindensraten von im Mittel 76 % erreicht, so

dass im Folgenden eine weitere Reduktion der Enzymdosierung und / oder eine Erhöhung

der Fettmenge pro Mahlzeit notwendig erschien.


Fragestellung: Können dosisabhängige Effekte der Rohfett-Verschwindensrate durch

Erhöhung des Fettanteils bei gleichzeitiger Reduzierung der Enzymdosierung erreicht

werden?

Versuchsdesign:

Probenkollektion: analog Screening-Test BECKER (2005)

Dauer: 8 Stunden

Beginn der Kollektion: nach „Farbwechsel“


66

Fütterung am Vorabend des Versuchstages (12 h vor Versuchsbeginn): Haltungsfutter

Flüssige Testmahlzeit II:

Um das Ziel einer dosisabhängigen Steigerung der Rohfett-Verschwindensrate bei Einsatz

eines Multienzympräparates mit bekannter Wirksamkeit (PK) im Rahmen eines Lipase

Screenings zu erreichen, wurden im 2. Versuch zur Optimierung einer Testmahlzeit

folgende Veränderungen gegenüber der Testmahlzeit I vorgenommen: Da im

vorangegangenen Versuch bereits in der mittleren Dosierung eine hohe Rohfett-

Verschwindensrate erreicht wurde, erfolgte in der Testmahlzeit II eine Reduktion der

Enzymdosierung des etablierten Multienzympräparates (PK) von 0 / 10 000 / 75 0000 IE

auf 0 / 5 000 / 55 000 IE sowie eine Erhöhung des Fettgehaltes der Diät (s. Tabelle 21).

Tabelle 21: Inhaltsstoffe (g) der flüssigen Testmahlzeit II

TS Rfe-Gehalt (%) Rfe OL ML Milch * Cr2O3 (IE)**

151,6 44,7 67,8 25,8 27,5 240 0,625 0; 5 000; 55 000



Im 2. Versuch zur Optimierung einer Testmahlzeit wurden folgende Modifikationen

vorgenommen:

• Erhöhung der Olivenölmenge auf 25,8 g (vormals 12,1 g)

• Erhöhung der Mikrolipidmenge auf 27,5 g (vormals 10,1 g)

• Erhöhung des Fettanteiles der Ration auf insgesamt 44,7 % (vormals 35,4 %)

• Reduktion der Enzymdosierung auf 0 / 5 000 / 55 000 IE (vormals 0 / 10 000/ 75 000

IE)


67

Ergebnisse:

Bei allen Tieren erfolgte eine dosisabhängige Reduktion (je höher die Enzymdosis, desto

geringer die Anflutung) der absolut an der Ileumfistel angefluteten Menge von

Trockensubstanz und Rohfett im Untersuchungszeitraum von 8 Stunden nach

Farbwechsel (s. Tabelle 22).

Tabelle 22: Angeflutete Menge an Trockensubstanz und Rohfett (g) im Kollektionsintervall 0-8 Std. nach Farbumschlag nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit II

Tier 63 82 83

IE 0 5 000 55 000 0 5 000 55 000 0 5 000 55 000

TS 120 70,9 41,2 71,6 45,9 13,2 54,9 30,5 30,2

Rfe 53,7 29,7 12,6 37,8 22,1 1,91 20,0 8,23 2,62

Die Kalkulation der „Verschwindensraten“ ergab sowohl für Trockensubstanz als auch für

Rohfett tendenziell einen Anstieg der Verschwindensrate bei steigender Enzymdosierung

(Ausnahme Tier 63; Rfe-VR), wobei sich das Niveau der einzelnen Tiere, insbesondere

bei fehlender Enzymsubstitution, deutlich voneinander unterschied. Zwei von drei Tieren

(63 und 83) erreichten schon nach Einsatz der mittleren Dosierung sehr hohe VR (79,4

und 77,2 %). Es wurde bei keinem Tier eine negative TS-VR ermittelt (s. Tabelle 23).

Tabelle 23: „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett (%) sowie Chromoxid-Wiederfindung (%) nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit II

Tier 63 82 83

IE 0 5000 55000 0 5000 55000 0 5000 55000

TS 5,68 26,6 61,7 29,7 50,2 78,5 26,9 62,3 66,4

Rfe 5,19 79,4 73,8 17,1 46,4 93,1 40,2 77,2 93,5

Cr2O3. 83,6 63,7 71,0 67,3 61,0 40,6 49,5 53,3 59,3


68

Tabelle 24: Mittlere Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate (%) der flüssigen Testmahlzeit II

Enzymdosierung 0 5 000 55 000

Trockensubstanz-VR 20,8 ± 13,1 46,4 ± 18,2 70,1 ± 11,9

Rohfett-VR 20,9 ± 17,8 67,7 ± 18,5 86,8 ± 11,3

Schlussfolgerungen:

Trotz Erhöhung der Fettkonzentration der Mahlzeit bei gleichzeitiger Reduktion der

Enzymdosis ergaben sich nach wie vor sehr hohe Rohfett-Verschwindensraten in der

mittleren (~80 %, außer Tier 82) und hohen Dosierung (~93 %, außer Tier 63). Dies deutet

darauf hin, dass die maximale Enzymwirkung schon fast bei der mittleren Dosierung

erreicht war.


Fragestellung: Kann durch Verfütterung einer flüssigen Mahlzeit am Vorabend eines

Screening-Versuchs eine „Verschleppung“ von Vorabendfutter in die Kollektionsphase

verhindert werden? Ist es weiterhin möglich, durch Reduktion der mittleren Dosierung eine

deutlichere Abgrenzung der Wirkung der verschiedenen Enzymdosierungen zu erhalten?

Versuchsdesign:

Probenkollektion: analog Screening-Test (BECKER 2005)

Dauer: 8 Stunden


Fütterung am Vorabend des Versuchstages (12 h vor Versuchsbeginn):

400 ml ProvideXtra® pro Schwein

Testmahlzeit III:

Die Dosierung des Multienzymproduktes wurde dahingehend modifiziert, dass eine

weitere, sehr niedrige Enzymdosierung (500 IE Pankreatin) hinzugefügt wurde (s. Tabelle

25). Zusätzlich wurde am Vorabend der jeweiligen Versuche statt des schrotförmigen

Haltungsfutters auf Getreidebasis (Breifütterung) 400 ml einer flüssigen Mahlzeit


69

(ProvideXtra®) verabreicht. ProvideXtra® ist ein fettfreier Energiedrink (Protein 3,75 g /

Kohlenhydrate 27,5 g, davon Zucker 5,5 g / Fett 0 g / Ballaststoffe 0 g und 80 ml Wasser

je 100 ml fertigem Getränk).

Die vorabendliche Verabreichung von ProvideXtra® wurde erwogen, da bei Gabe einer

flüssigen, fettfreien Mahlzeit mit einer zügigen Magenentleerung gerechnet werden

konnte. Somit sollte eine Anflutung von Rfe aus der Vorabendmahlzeit an der Ileumfistel

im Kollektionsintervall verhindert werden.

Tabelle 25: Inhaltsstoffe (g) der flüssigen Testmahlzeit III


151,6 44,7 67,8 25,8 27,5 240 0,625 0, 500; 5 000; 55 000


Zubereitung der Testmalzeit: elektrischer Handmixer


vorgenommen:

• Einsatz einer Flüssignahrung (ProvideXtra®) am Vorabend des Versuches

• Einführung einer neuen Enzymdosierung: 0/ 500/ 5 000/ 55 000 IE (vormals 0 /

5 000 / 55 000 IE )

Ergebnisse:

Aus versuchstechnischen Gründen lagen keine Ergebnisse für Tier 82 und 83 (0 Enzym)

sowie für Tier 43 und 93 in der höchsten Dosierung (55 000 IE) vor. Nicht in allen Fällen

konnte eine dosisabhängige Reduktion der Anflutung verzeichnet werden (s. Tabelle 26).

Da in diesen Fällen jedoch gleichzeitig eine höhere Cr2O3-Wiederfindung vorlag (s. Tabelle

27), ist davon auszugehen, dass diese erhöhte Anflutung aus einer höheren Passagerate

resultierte.


70

Tabelle 26: Angeflutete Menge an TS und Rfe (g) im Kollektionsintervall 0-8 Std. nach Farbumschlag nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit III

Tier 43 82 83 93

IE 0 500 5000 500 5000 55000 500 5000 55000 0 500 5000

TS 22,3 37,6 24,7 20,4 20,3 10,5 38,7 20,4 9,75 19,3 29,5 16,9

Rfe 10,6 15,4 7,31 9,87 6,54 1,84 20,9 2,76 1,61 9,24 15,7 6,10

Die Trockensubstanz-Verschwindensraten von Tier 82 und 83 stiegen mit zunehmender

Enzymdosierung an. Schon in der mittleren Dosierung (5000 IE) wurden erneut hohe

Trockensubstanz-Verschwindensraten zwischen 57,7 und 74,5 % erreicht (s. Tabelle 27).

Bezüglich der Rohfett-Verschwindensrate wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet:

Während bei Tier 82 und 83 eine dosisabhängige Steigerung der Rohfett-

Verschwindensrate zu verzeichnen war (s. Tabelle 27), lagen die Werte des Versuchs

ohne Enzymzulage bei zwei Tieren über denen der geringen Dosierungen. Die

Wiederfindung des verabreichten Markers Chromoxid erreichte nur relativ geringe Werte

zwischen 34,6 und 46,3 % (Ausnahmen: Tier 82 und 83; s. Tabelle 27).

Tabelle 27: „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett sowie Chromoxid-Wiederfindung (%) nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit III

Tier 43 82 83 93

IE 0 500 5000 500 5000 55000 500 5000 55000 0 500 5000

TS 64,5 46,4 57,7 65,3 74,5 83,7 54,9 67,5 83,6 67,3 57,2 67,8

Rfe 62,2 50,9 72,0 62,4 81,6 93,6 45,4 90,1 93,9 65,0 49,2 74,0

Cr2O3 41,4 46,3 38,5 38,8 52,4 42,7 54,5 41,4 39,2 38,9 45,5 34,6

Tabelle 28: Mittlere Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate (%) der flüssigen Testmahlzeit III

Enzymdosierung 0 500 5 000 55 000

Trockensubstanz-VR 65,9 55,9 ± 7,74 66,9 ± 6,92 83,7

Rohfett-VR 63,6 52,0 ± 7,35 79,4 ± 8,27 93,8


71

0

10

20

30

40

50

60

70

Intervall I Intervall II Intervall III

CrTSRfe

0 – 2 h n. F. 2 – 4 h n. F. 4 – 6 h n. F.

Abbildung 4: Beispieldiagramm für relative Flussraten (%) der Parameter Rfe, TS und Cr2O3 für Tier 83, 5 000 IE des Multienzymproduktes PK

Schlussfolgerungen:

Durch die Verabreichung einer flüssigen, fettfreien Vorabendmahlzeit gelang es, die

„Verschleppung“ von Anteilen der Vorabendmahlzeit in den Kollektionszeitraum am

Folgetag und somit negative TS-VR zu verhindern (s. Tabelle 27). Es traten jedoch

weiterhin, besonders in der mittleren Dosierung hohe Rohfett-Verschwindensraten auf (s.

Tabelle 28), die das Niveau der höchsten Dosierung (Rohfett-Verschwindensraten (%):

MW 93,8) annähernd erreichten. Des Weiteren wurden im Versuch ohne Enzymzulage für

die Tiere 43 und 93 (62,2-65,0 %) höhere Rohfett-Verschwindensraten ermittelt als in der

500 IE Dosierung (49,2-62,4 %). Es war also zu vermuten, dass das Substrat (= Fett) trotz

seines hohen Anteils in der Testmahlzeit (ca. 45 %) relativ einfach zu hydrolysieren war,

da offensichtlich auch ohne die Supplementierung von pankreatischen

Verdauungsenzymen ein Großteil des Rfe verdaut bzw. absorbiert werden konnte (s.

Tabelle 28). Anhand der relativen Flussraten (s. Abbildung 4) wurde deutlich, dass ein

paralleler Fluss der Komponenten nicht erreicht worden war.


72


Fragestellung: Können durch eine Veränderung der Fettqualität bzw. –zusammensetzung

deutlichere dosisabhängige Effekte erzeugt werden?

Versuchsdesign:


Dauer: 8 Stunden



400 ml ProvideXtra® pro Schwein

Testmahlzeit IV:

Bei der flüssigen Testmahlzeit IV wurde eine Veränderung der Fettzusammensetzung

angestrebt. Es wurde Milch mit einem Milchfettanteil von 1,5 %, anstelle der bisher

gebräuchlichen 3,5 %igen verwendet. Infolge der verringerten Milchfettmenge reduzierte

sich die Gesamtfettmenge in der Ration auf 57,5 g (s. Tabelle 29). Hierdurch erhöhte sich

der prozentuale Anteil des Olivenöls in der Testmahlzeit, wodurch eine erhöhte Zufuhr von

langkettigen Fettsäuren erreicht und der Anteil des leicht zu hydrolysierenden Milchfetts

reduziert wurde.

Tabelle 29: Inhaltsstoffe (g) der flüssigen Testmahlzeit IV


154,6 37,2 57,5 19,6 20,7 240 0,625 0; 5 00; 5 000, 75 000

* Milchfettgehalt: 1,5 % ** IE=Dosierungen des Multienzymproduktes Pankreatin® in lipolytischer Aktivität Zubereitung der Testmahlzeit: elektrischer Handmixer


73


vorgenommen:

• Einsatz von Milch mit einem Milchfettgehalt von 1,5 % (vormals 3,5 %)

• Verringerung der Fettmenge / Mahlzeit auf 57,5 g (vormals 67,8 g)

• Verringerung der Mikrolipidmenge auf 20,7 g (vormals 27,5 g)

• Reduktion des Fettanteiles der Ration auf insgesamt 37,2 % Rfe (vormals 44,7

%)

Ergebnisse:

Auch im 4. Versuch zur Optimierung einer Testmahlzeit waren bezüglich der

Trockensubstanz- und Rohfett-Anflutung nicht bei allen Tieren gerichteten Effekte der

verabreichten Enzymdosierungen zu verzeichnen (s. Tabelle 30). Es ist jedoch in diesem

Zusammenhang darauf hinzuweisen, dass z.T. die beobachtete erhöhte Anflutung von TS

bzw. Rfe anhand der gleichzeitig hohen Chromoxidwiederfindung auf eine erhöhte

Passage zurückzuführen ist (s. Tabelle 30; 31; Tier 43, Tier 93). Bezüglich der

Verschwindensraten von TS und Rfe sind im Allgemeinen hingegen dosisabhängige

Effekte zu verzeichnen (s. Tabelle 31).


74

Tabelle 30: Angeflutete Menge an Trockensubstanz und Rohfett (g) im Kollektionsintervall 0-8 Std. nach Farbumschlag nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit IV

Tier 43 82 83

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 29,9 23,4 24,1 25,2 32,7 28,5 7,76 11,0 35,6 19,8 19,5 14,9

Rfe 13,9 5,33 8,77 4,01 7,53 12,0 2,02 1,74 19,8 4,48 4,61 1,20

Tier 93

IE 0 500 5 000 75 000

TS 15,2 10,8 13,9 9,85

Rfe 1,52 3,18 3,30 2,36

Für 3 von 4 Tieren konnte bei steigender Enzymdosierung eine Reduktion der an der

ilealen Fistel anflutenden Chymusmenge (TS) beobachtet werden. Die TS- und Rohfett-

Verschwindensrate stieg bei steigender Dosierung an (s. Tabelle 31; Ausnahme TS-VR

Tier 43). Dennoch wurden schon in den niedrigen Dosierungen hohe Rohfett-

Verschwindensraten ermittelt, so dass die Abstufungen zwischen den einzelnen

Dosierungen lediglich gering ausfielen (s. Tabelle 31). Zum Teil wurde eine nur sehr

geringe Chromoxid-Wiederfindung von lediglich 20 % ermittelt (s. Tabelle 31). Diese

belegten dass im achtstündigen Kollektionszeitraum erhebliche Anteile der Testmahlzeit

noch nicht bis zum Ende des Ileums gelangt waren oder aber Entmischungsprozesse

vonstatten gingen.


75

Tabelle 31: „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett sowie Chromoxid-Wiederfindung (%) nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit IV

Tier 43 82 83

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 61,3 60,7 74,0 73,3 28,2 69,6 74,9 84,3 60,9 66,2 78,5 84,8

Rfe 51,6 75,9 74,6 88,6 55,4 65,6 82,4 93,4 41,4 79,3 86,3 96,7

Cr2O3 49,9 38,5 60,0 61,1 29,4 60,6 20,0 45,5 58,8 37,7 58,6 63,1

Tier 93

IE 0 500 5 000 75 000

TS 55,9 77,4 78,6 83,0

Rfe 87,8 82,2 86,3 89,0

Cr2O3 21,7 31,0 41,8 37,4

Tabelle 32: Mittlere Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate (%) der flüssigen Testmahlzeit IV

0 500 5 000 75 000

Trockensubstanz-VR 51,3 ± 15,7 68,5 ± 7,00 76,5 ± 2,39 81,3 ± 5,42

Rohfett-VR 59,0 ± 20,1 75,8 ± 7,22 82,4 ± 5,53 91,9 ± 3,87

Schlussfolgerungen:

Erstmals wurde nach Verabreichung einer einzigen fettangereicherten Testmahlzeit eine

dosisabhängige Steigerung der Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate

ermittelt (eine Ausnahme; s. o.). Da schon in der niedrigsten Dosierung (500 IE) deutliche

Effekte erkennbar waren, erklärte sich, warum in den vorangegangenen Versuchen keine

deutlichen Unterschiede zwischen den höher gewählten Dosierungen sichtbar wurden,

besonders auffällig wurde dieses an Tier 93 (s. Tabelle 31). Das maximale Niveau wurde

bereits bei 5 000 IE erreicht. Außerdem konnten bezüglich der Trockensubstanz- und


76

Rohfett-Anflutungen weiterhin keine klaren dosisabhängigen Effekte abgegrenzt werden

(s. Tabelle 31). Die teilweise sehr geringen Anflutungen waren Folgen der geringen

Trockensubstanz-Menge pro Mahlzeit in Kombination mit einer hohen Wirksamkeit der

eingesetzten Enzyme. Die niedrigen Flussraten bargen die Unsicherheit, dass bereits

kleine Abweichungen erhebliche Veränderungen der Anflutung bedingten. Des Weiteren

könnte die geringe Anflutung nicht nur ein Resultat der hohen Verschwindensrate sein,

sondern auch auf einem geringen Chymusfluss basieren. Bei Tier 43 und 82 deuteten die

höheren Cr2O3-Wiederfindungen auf eine erhöhte Passagerate hin, in deren Folge die

Trockensubstanz-Anflutung anstieg. Deshalb war es angezeigt, relative Flussraten zu

berechnen, um den parallelen Verlauf der Parameter beurteilen zu können (s. Abbildung

5): Um der anhand der relativen Flussraten dokumentierten Entmischungen entgegen zu

wirken und eine zügige Magenentleerung, Darmpassage sowie einen parallelen Fluss der

Rationskomponenten Trockensubstanz, Rohfett, Enzym und Marker und zu gewährleisten,

mussten weitere Modifikationen vorgenommen werden.

0

10

20

30

40

50

60

70

Intervall I Intervall II Intervall III Intervall IV

CrTSRfe

0 – 2 h n. F. 2 – 4 h n. F. 4 – 6 h n. F. 6 – 8 h n. F.

Abbildung 5: Beispieldiagramm für relative Flussraten (%) der Parameter Rfe, TS und Cr2O3 für Tier 43, 75 000 IE des Multienzymproduktes PK


77

3.2.11.5 5. Ansatz zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit

Fragestellung: Verbessert der Einsatz einer Ballaststoffquelle die Eigenschaften der

Testmahlzeit bezüglich Magenentleerung und paralleler Anflutung von Rohfett,

Trockensubstanz, Marker (und Enzym) an der ilealen Fistel?

Versuchsdesign:


Dauer: 8 Stunden



400 ml ProvideXtra® pro Schwein.

Testmahlzeit V:

Durch den Einsatz einer Rohfaserquelle (64 g Methylcellulose / kg TS) sollte zum Einen

durch Addition einer partikulären Struktur einer Entmischung der einzelnen Komponenten

der Testmahlzeit entgegengewirkt, zum Anderen durch Volumeneffekte die Peristaltik

gefördert werden, um eine zügige Anflutung der Testmahlzeit an der ileocaecalen Fistel zu

gewährleisten. Des Weiteren sollte durch die Erhöhung der an der Fistel anflutenden

Chymusmenge (geringe bis fehlende VR der Rfa) eine Steigerung der für Analysen zur

Verfügung stehenden Probenmenge erreicht werden.

Tabelle 33: Inhaltsstoffe (g) der flüssige Testmahlzeit V je Mahlzeit

TS Rfe-Gehalt (%) Rfe OL ML Milch* Rfa Cr2O3 (IE)**

154,6 33,3 51,5 19,6 20,7 240 64 0,625 0; 500; 5 000; 75 000

* Milchfettgehalt: 1,5 %

** IE=Dosierungen des Multienzymproduktes Pankreatin® in lipolytischer Aktivität



78


vorgenommen:

• Verringerung der Fettmenge / Mahlzeit auf 51,5 g (vormals 57,5 g)

• Reduktion des Fettanteils der Ration auf insgesamt 33,3 % Rfe (vormals 37,2

%)

• Einsatz einer Ballaststoffquelle (Methylcellulose) in einer Dosierung von 9,9 g /

Mahlzeit (64,0 g / kg TS)

Ergebnisse:

Eine dosisabhängige Verringerung sowohl der Trockensubstanz- als auch der Rohfett-

Anflutung konnte lediglich bei zwei der vier Tiere beobachtet werden (s. Tabelle 34).

Hinzuweisen ist jedoch auf die bei allen Tieren sehr deutliche Reduktion der anflutenden

Trockensubstanz- und Rohfett-Mengen bereits nach Einsatz der geringsten Dosierung des

Multienzympräparates PK.

Tabelle 34: Angeflutete Menge an Trockensubstanz und Rohfett (g) im Kollektionsintervall 0-8 Std. nach Farbumschlag nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit V

Tier 43 80 81

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 57,3 16,2 16,6 22,0 41,5 14,0 10,8 15,7 55,4 32,7 33,0 11,5

Rfe 21,5 2,60 2,88 1,58 19,9 2,49 1,59 1,17 28,4 10,9 10,1 1,27

Tier 83

IE 0 500 5 000 75 000

TS 38,3 23,5 24,7 17,2

Rfe 22,6 5,63 7,45 2,09

Bezüglich der Verschwindensrate von Rohfett und Trockensubstanz wurde bei allen

eingesetzten Tieren eine dosisabhängige Steigerung verzeichnet (s. Tabelle 35). Erstmals


79

sanken die Werte bei fehlender Enzymsubstitution auf das erwartete Niveau ab (16,8 –

42,0 % Rohfett-Verschwindensrate; s. Tabelle 35).

Bezüglich der Cr2O3-Wiederfindungen wurden sehr große tages- und tierindividuelle

Schwankungen beobachtet (20,2 und 72,0 %; s. Tabelle 35).

Bezüglich der Parameter Trockensubstanz, Rohfett und Chromoxid konnte anhand der

Berechnung der relativen Flussraten ein nicht paralleler Fluss der genannten Parameter

dokumentiert werden (s. Abbildung 6).

Tabelle 35: „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett sowie Chromoxid-Wiederfindung (%) nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit V

Tier 43 80 81

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 47,4 47,0 64,4 64,3 54,7 69,1 77,8 76,3 44,6 46,6 54,4 80,4

Rfe 42,0 75,0 81,8 92,5 36,3 83,8 90,4 94,9 16,8 48,0 58,9 93,7

Cr2O3 72,0 20,2 30,8 40,8 60,5 29,8 32,0 43,9 66,2 40,5 47,8 38,8

Tier 83

IE 0 500 5 000 75 000

TS 56,8 61,2 74,9 77,4

Rfe 25,3 72,7 77,0 92,0

Cr2O3 58,6 40,0 65,2 50,5

Tabelle 36: Mittlere Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate (%) der flüssigen Testmahlzeit V

Enzymdosierung 0 500 5 000 75 000

Trockensubstanz-VR 50,9 ± 5,80 56,0 ± 11,1 67,9 ± 10,6 74,6 ± 7,11

Rohfett-VR 30,1 ± 11,3 69,9 ± 15,3 77,2 ± 13,3 93,2 ± 1,29


80

0

10

20

30

40

50

60

70


CrTSRfe

0 – 2 h n. F. 2 – 4 h n. F. 4 – 6 h n. F. 6 – 8 h n. F.

Abbildung 6: Beispieldiagramm zur Parallelität des relativen Cr2O3, TS und Rfe-Flusses im grünen Ileumchymus (Gesamtmenge an Cr2O3, TS und Rfe über 8 Stunden = 100): Tier 81; 500 IE des Multienzymprodukt PK

Schlussfolgerungen:

Erstmalig konnte eine deutliche dosisabhängige Steigerung der Trockensubstanz- und

Rohfett-Verschwindensrate bei ansteigender Enzymdosierung bei allen Tieren dargestellt

werden (s. Tabelle 35). Hervorzuheben ist allerdings die sehr variable Cr2O3-

Wiederfindungsrate, die bei der Bewertung der Anflutung berücksichtigt werden sollte (s.

Tabelle 35). Als weiterhin problematisch ist der nicht parallele relative Fluss von

Trockensubstanz, Rohfett und Chromoxid zu bewerten.

3.2.11.6 6. Ansatz zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit

Fragestellung: Führen Modifikationen der Chromoxidmenge, der Fettquelle und die

Verwendung eines Ultra-turrax 900® zu einer Verbesserung des parallelen Flusses der

Komponenten der Testmahlzeit?


81

Versuchsdesign:


Dauer: 8 Stunden



400 ml ProvideXtra® pro Schwein.

Testmahlzeit:

Da bisher die Vergleichbarkeit mit voraus gegangenen Versuchen im Vordergrund stand,

wurde bei der flüssigen Testmahlzeit I-V die bisher in diesem Projekt verwendete Menge

Chromoxid (= 0,625g / Mahlzeit) eingesetzt. Aufgrund der im Vergleich zu üblichen

Rationen geringeren Trockensubstanz-Menge je Mahlzeit resultierte aus der Beibehaltung

der Cr2O3-Menge eine erhöhte Chromoxidkonzentration von 4,1 g / kg anstelle von 2,5 g /

kg TS. Da wegen des flüssigen Charakters der Mahlzeit ohnehin die Problematik der

Cr2O3-Entmischung (hohes spezifisches Gewicht) bestand, wurde die Chromoxidmenge

mit dieser Maßnahme an die reduzierte TS-Menge angepasst. Im Folgenden wurden

daher 0,368 g Chromoxid statt 0,625 g pro Versuchsmahlzeit verabreicht (s. Tabelle 37).

Infolge mangelnder Verfügbarkeit (Produktion wurde eingestellt) musste außerdem im

weiteren Verlauf der Versuche auf den Einsatz von Mikrolipid® verzichtet werden. Um die

im Mikrolipid® enthaltenden Fettmengen zu ersetzen, wurde die Olivenöl-Menge von 19,6

g auf nunmehr 29,4 g angehoben (s. Tabelle 37).

Tabelle 37: Inhaltsstoffe (g) der flüssigen Testmahlzeit VI

TS Rfe-Gehalt (%) RfE OL ML Milch* Rfa Cr2O3 (IE)**

151,6 34,6 51,6 29,4 --- 240 64 0,368 0; 500; 5 000; 75 000

* Milchfettgehalt: 1,5 %

** IE=Dosierungen des Multienzymproduktes Pankreatin® in lipolytischer Aktivität

Zubereitung der Testmahlzeit: Ultra-turrax 900®


82


vorgenommen:

• Homogenisierung / Zubereitung der Testmahlzeit mittels Ultra-turrax 900®

anstelle eines Handrührgerätes

• Reduzierung der Chromoxidmenge je Mahlzeit (vormals 4,1 g / kg TS) auf 2,5 g

/ kg TS

• Verzicht auf den Einsatz von Mikrolipid® und Ersatz durch Erhöhung der

Olivenöl-Menge, um trotz Verzichts auf Mikrolipid® identische Fettmenge wie in

der flüssigen Testmahlzeit Nr.5 zu erreichen

Ergebnisse:

Bei allen Tieren (Ausnahme Tier 65) wurde bei steigender Enzymdosierung sowohl eine

Reduktion der innerhalb des achtstündigen Kollektionszeitraumes ileal anflutenden

Chymusmenge (TS) als auch der Rohfettmenge beobachtet (s. Tabelle 38).

Tabelle 38: Angeflutete Menge an Trockensubstanz und Rohfett (g) im Kollektionsintervall 0-8 Std. nach Farbumschlag nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit VI

Tier 56 65 82

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 51,5 42,5 23,7 21,3 61,1 65,8 34,2 26,7 63,0 36,8 29,9 22,5

Rfe 26,1 21,1 6,31 2,67 24,3 18,4 10,3 3,83 34,5 17,8 9,88 2,61

Bei allen eingesetzten Tieren konnte (bis auf wenige Ausnahmen) eine dosisabhängige

Steigerung der Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate verzeichnet werden (s.

Tabelle 39; Ausnahmen Tier 56 und Tier 65). Die Cr2O3-Wiederfindung variierte zwischen

35,8 und 74,1 % (s. Tabelle 39).


83

Tabelle 39: „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett (%) sowie Chromoxid-Wiederfindung (%) nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit VI

Tier 56 65 82

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 43,6 53,9 73,0 66,6 10,7 6,97 34,8 60,7 42,2 54,1 69,9 74,2

Rfe 18,8 34,7 79,5 88,1 -0,98 25,9 44,4 83,9 9,9 36,8 71,8 91,5

Cr2O3 62,1 62,7 59,7 43,4 46,6 48,2 35,8 46,2 74,1 54,7 67,8 59,5

Abbildung 7: Mittlere Verschwindensrate (TS) in % nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit VI

32,3 38,3 59,2 67,20

20

40

60

80

100

0 Enzym 500 IE 5 000 IE 75 000 IE


84

Abbildung 8: Mittlere Verschwindensrate (Rfe) in % nach Fütterung der flüssigen

Testmahlzeit VI

Schlussfolgerungen:

In Anwendung dieser Futtervariante wurden bei allen Tieren dosisabhängige Effekte

sowohl bezüglich der Anflutung von Trockensubstanz und Rohfett als auch bezüglich der

anhand der Chromoxid-Wiederfindung kalkulierten „Verschwindensraten“ beobachtet.


Fragestellung: Sind die im vorangegangenen Screening (6. Versuch) gewonnenen

Testergebnisse reproduzierbar?

Versuchsdesign:

siehe Flüssige Testmahlzeit VI

Testmahlzeit:

siehe Flüssige Testmahlzeit VI

9,3

32,5 65,2 87,80

20

40

60

80

100

0 Enzym 500 IE 5 000 IE 75 000 IE


85

Um die Wiederholbarkeit der Ergebnisse zu testen wurde die Testmahlzeit aus dem 6.

Versuch zur Entwicklung einer Testmahlzeit in identischer Form bei einer weiteren

Tiergruppe eingesetzt.

Bei allen Tieren, die im 7. Versuch zur Entwicklung einer Testmahlzeit verwendet wurden,

konnte eine dosisabhängige Verringerung der Trockensubstanz- und Rohfett-Anflutung (s.

Tabelle 40) ermittelt werden (Ausnahme Tier 81; vermutlich erhöhte Passagerate, s.

Cr2O3-Wdf. s. Tabelle 41).

Tabelle 40: Angeflutete Menge an Trockensubstanz und Rohfett (g) im Kollektionsintervall 0-8 Std. nach Farbumschlag nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit VI

Tier 43 80 81

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 74,9 51,8 32,4 20,9 67,2 38,7 32,3 18,5 61,5 39,6 35,4 37,4

Rfe 31,2 23,1 9,14 3,77 29,4 18,8 10,6 3,65 33,1 18,1 9,76 9,23

Tier 83

IE 0 500 5 000 75 000

TS 71,7 30,5 30,4 25,9

Rfe 39,6 12,6 7,88 4,60

Durch den Einsatz der Testmahlzeit VI konnte bei allen Tieren eine deutliche Steigerung

der Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate (%) bewirkt werden (s. Tabelle 41).

Erstmals wurden in allen Versuchen Chromoxid-Wiederfindungen von mehr als 50 %

beobachtet (MW in %: 64,4 ± 9,6; s. Tabelle 41).


86

Tabelle 41: „Verschwindensrate“ von Trockensubstanz und Rohfett (%) sowie Chromoxid-Wiederfindung (%) nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit VI

Tier 43 80 81

IE 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000 0 500 5000 75000

TS 22,3 43,7 59,0 75,0 40,4 49,3 68,3 81,8 36,2 47,0 59,9 64,8

Rfe 7,99 28,5 67,1 87,2 25,8 30,0 71,3 89,8 2,14 31,1 68,6 75,3

Cr2O3 65,7 62,6 53,9 56,8 76,8 52,0 71,3 69,4 65,6 51,0 60,2 72,4

Tier 83

IE 0 500 5 000 75 000

TS 40,9 60,0 68,1 75,9

Rfe 7,12 53,0 76,4 87,8

Cr2O3 82,6 51,8 64,8 73,2

Abbildung 9: Mittlere Trockensubstanz-Verschwindensrate in % nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit VII

35,0 50,0 63,8 74,40

20

40

60

80

100

0 Enzym 500 IE 5 000 IE 75 000 IE


87

Abbildung 10: Mittlere Rohfett-Verschwindensrate in % nach Fütterung der flüssigen Testmahlzeit VII Schlussfolgerungen:

Die Ergebnisse des 7. Versuchs zur Optimierung einer Testmahlzeit ergaben

vergleichbare Resultate mit denen des 6. Versuchs zur Optimierung einer Testmahlzeit:

Die Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate (%) stiegen mit ansteigender

Enzymdosierung deutlich an. Sowohl der Vergleich der Rohfett-Verschwindensrate (%) als

auch der Trockensubstanz-Verschwindensrate (%) des 6. und 7. Versuchs ergaben

Ergebnisse auf ähnlichem Niveau. Die bei 5 000 IE im 6. Versuch auftretende hohe

Standardabweichung von 18,4 % kam durch den niedrigen Wert (44,4 % Rfe-VR) des

Tieres Nr. 65 zustande.

Es war also möglich, die Dosiseffekte der steigenden Enzymdosierung bezüglich der

Rohfett-Verschwindensrate (%) des 6. Versuchs im 7. an weiteren vier Tieren (insgesamt

an sieben Tieren) zu wiederholen. Damit konnte von einer Reproduzierbarkeit der

Ergebnisse bei Einsatz der flüssigen Testmahlzeit VI bzw. VII ausgegangen werden.

10,8

35,7 70,9 85,00

20

40

60

80

100

0 Enzym 500 IE 5 000 IE 75 000 IE


88

Tabelle 42: Gegenüberstellung der Rohfett-Verschwindensrate in % der Mittelwerte des 6. (Tiere: 56, 65, 82) und 7. Versuchs (Tiere: 43, 80, 81, 83) zur Optimierung einer Testmahlzeit

Dosierung IE 0 500 5 000 75 000

MW STABW MW STABW MW STABW MW STABW

6. flüssige

Testmahlzeit 9,3 9,22 32,5 5,77 65,2 18,4 87,8 3,79

7. flüssige

Testmahlzeit 10,8 10,4 35,7 11,6 70,9 4,10 85,0 6,59

Es konnte ferner davon ausgegangen werden, dass die in den letzten beiden Versuche

zur Optimierung einer Testmahlzeit (6. / 7.) eingesetzte Diät in Verbindung mit der

angewandten Probenentnahme-Prozedur geeignet war, die Wirksamkeit von Lipasen in

einem Screening-Verfahren mit einmaliger Fütterung zu quantifizieren.

Die 6. / 7. flüssige Testmahlzeit (Zusammensetzung s. Tabelle 43) kam daher bei allen

nachfolgenden Versuchen zum Einsatz.


89

Tabelle 43: Übersicht über die in der optimierten Testmahlzeit für Lipase-Screening eingesetzten Komponenten

Komponenten

Menge

bzw. Test-

mahlzeit

Definitionen Ziel des Einsatzes

Rfe-Gesamt

(g) 51,6

Summe aller in der

Testmahlzeit

enthaltener Rfe-

Mengen u. -quellen

von den Testlipasen

umzusetzendes Substrat

Olivenöl (g) 29,4 Fettquelle (LCFA) schwer spaltbares Substrat

Mikrolipid (g) — Emulgierte Fettquelle Emulgiertes Substrat

Milchfett (%) 1,5 Fettquelle (SCFA) leicht spaltbares Substrat

Milch (g) 247 Emulsion Lösungsmittel

Chromoxid(g) 0,368 Marker

1.Kennzeichnung des Kollektions-

intervalls

2. Berechnung der VR

Enzymdos.

(IE)

0/

500/

5000/

75000

Entwicklung:

PK

Screening:

unbekannte Lipasen

1. Entwicklung einer Testmahlzeit

2. Screening: Ranking der Lipasen

Cellulose (g) 2,52 Rfa-quelle Verringerung von Entmischungen,

Passageförderung

ProvideXtra

(ml) 400

Nahrungsergänzungs-

mittel, flüssig, fettfrei

Vorabendmahlzeit

Passageförderung,

ausschl. Anfluten der Testmahlzeit

während der Chymussammlung;

Zubereitungs-

verfahren

Ultra-turrax

900® Mixen mit 9500 U/min

Homogenität,

Stabilität der Testmahlzeit

Aufgrund des annähernd parallelen Flusses von Marker, Trockensubstanz und Rohfett in

den beiden zuletzt verwendeten Diäten (s. Abbildung 11 und Abbildung 12) war es


90

möglich, diesen zur Kalkulation des durch die Enzyme hydrolysierten Anteils an

Nährstoffen in der Versuchsdiät einzusetzen.

0

10

20

30

40

50

60

70

Intevall I Intevall II Intevall III Intevall IV

CrTSRfe

Abbildung 11: Beispieldiagramm zur Parallelität des relativen Cr2O3, TS und Rfe-Flusses im grünen Ileumchymus (Gesamtmenge an Cr2O3, TS und Rfe über 8 Stunden = 100): Tier 93; 75 000 IE des Multienzymproduktes PK

0

10

20

30

40

50

60

70


CrTSRfe

Abbildung 12: Beispieldiagramm zur Parallelität des relativen Cr2O3, TS und Rfe-Flusses im grünen Ileumchymus (Gesamtmenge an Cr2O3, TS und Rfe über 8 Stunden = 100): Tier 65, 0 Enzym des Multienzymproduktes PK

0 – 2 h n. F. 2 – 4 h n. F. 4 – 6 h n. F. 6 – 8 h n. F.

0 – 2 h n. F. 2 – 4 h n. F. 4 – 6 h n. F. 6 – 8 h n. F.


91

3.3 Ergebnisse

3.3.1 Screening-Test für Lipasen

Nachfolgend wird auf die Versuche eingegangen, die zur Beurteilung der Wirksamkeit von

Monolipasen durchgeführt wurden (Screening-Test für Lipasen). Die Versuche, die im

Rahmen der Entwicklung des Lipase-Screening-Tests stattfanden, sind inklusive ihrer

Ergebnisse im Kapitel „Material und Methoden“ beschrieben.

In den im Kollektionszeitraum (0-8 Stunden n. F.) gewonnenen Chymusproben wurden

folgende Parameter bestimmt:

• Durch Wiegen bestimmte bzw. analysierter Werte:

⇒ Trockensubstanz-Menge (g; uS-Masse x TS-Gehalt)

⇒ Rohfettkonzentration (g / kg) in der TS

⇒ Absolute Anflutung von Rohfett (g; TS-Masse x Rfe-Gehalt)

• Marker-bezogene Werte

⇒ Chromoxid-Konzentration (g / kg TS)

⇒ Chromoxid-Wiederfindung (%)

⇒ Verhältnis der Konzentrationen von Rohfett und Chromoxid

• Sonstige kalkulatorisch abgeleitete Werte

⇒ Trockensubstanz-Verschwindensrate in % (TS-VR)

⇒ Rohfett-Verschwindensrate in % (Rfe-VR)

⇒ Relative Anflutung von TS und Rfe

(Werte im Vergleich zu denen von PL-0-Tieren)

⇒ Relative TS- und Rfe-VR

(Werte im Vergleich zu denen von PL-0-Tieren)

Die Ergebnisse werden im Folgenden abschnittsweise für die verschiedenen Enzyme

einzeln vorgestellt. Innerhalb eines jeden Abschnitts werden zuerst die Kontrolltiere den

pankreasgangligierten Tieren ohne Enzymzulage (PL-0-Tiere) gegenübergestellt.


92

Anschließend wird die Wirkung der Enzymzulage auf die verschiedenen Parameter (s. o.)

betrachtet; dabei erfolgt zunächst eine vergleichende Darstellung der Dosis-

Wirkungsbeziehung jedes einzelnen Enzyms (D1, D2, D3 sowie im Vergleich mit KT und

PL-0). Nachfolgend erfolgt eine vergleichende Darstellung der Effekte verschiedener

Lipasen innerhalb einer Dosierung. Abschließend erfolgt eine Rangierung der Enzyme

anhand des jeweiligen Parameters. Als effektivstes Enzym wird dabei jeweils dasjenige

bezeichnet, welches die durch die Pankreasgangligatur bedingten Veränderungen der PL-

Tiere am deutlichsten reduziert bzw. zu einer „Normalisierung“ im Sinne einer Angleichung

an die Werte der Kontrolltiere führt.

Die aufgeführten Werte stellen -soweit nicht anders gekennzeichnet- Mittelwerte der

Ergebnisse von mindestens drei Tieren dar (Darstellung als Mittelwert ±

Standardabweichung). Die Einzelwerte können dem Tabellenanhang entnommen werden.

Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher

Dosierung werden durch Großbuchstaben (z.B. A, B) gekennzeichnet. Signifikante

Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den verschiedenen Dosierungen eines Enzyms werden

durch unterschiedliche Kleinbuchstaben (z.B. a, b) gekennzeichnet.

3.3.2 Allgemeine Beobachtungen

Das Allgemeinbefinden aller Versuchstiere war während der Versuche ungestört. Das

angebotene Versuchsfutter wurde von den Tieren ausnahmslos vollständig und innerhalb

weniger Minuten aufgenommen.

3.3.3 Untersuchte Parameter

3.3.3.1 Absolute Anflutung von Chymus (Trockensubstanz)

Die aus dem absoluten Chymusfluss (uS) und dem Trockensubstanzgehalt des Chymus

resultierende, über 8 h n. F. am terminalen Ileum anflutende TS-Menge (g) betrug bei den


93

Kontrolltieren im Mittel 24,2 (± 1,53) g und war somit signifikant geringer als die ileale TS-

Anflutung der pankreasgangligierten Tiere ohne Enzymzulage (68,8 ± 5,82 g; s. Tabelle

44).

Tabelle 44: Trockensubstanz-Anflutung (g) bei KT und PL-0 –Tieren innerhalb von 8 h n. F. KT 24,2 ± 1,53 aA PL-0 68,8 ± 5,82 bB

Wurden den PL-Tieren Lipasen (E1 - E5) substituiert, kam es zu einer Reduktion der

Trockensubstanz-Anflutung (s. Tabelle 45). Ein dosisabhängiger Effekt konnte bei allen

Enzymen festgestellt, jedoch nicht immer statistisch abgesichert werden (s. Tabelle 45).

Nach Zulage der niedrigsten Dosierung (D1) konnte lediglich durch das Multienzymprodukt

PK eine im Vergleich zu den PL-0-Tieren signifikante Reduktion der anflutenden Chymus

(TS)-Menge beobachtet werden. Durch keines der Enzyme wurde das Niveau der

Kontrolltiere erreicht. In der mittleren Dosierung (D2) bewirkten nur Enzym E1, E4 und PK

eine signifikante Reduktion der Trockensubstanz-Anflutung im Vergleich zu den

pankreasgangligierten Tieren ohne Enzymzulage. Aufgrund hoher Standardabweichungen

konnten E1, E3, E4 und E5 allerdings nicht statistisch von den KT-Tieren abgegrenzt

werden. Obwohl durch das Multienzymprodukt PK die größten Effekte erzielt wurden,

wurde durch dieses, ebenso wie von E2, das Niveau der Kontrolltiere nicht erreicht (s.

Tabelle 45). In der höchsten Dosierung (D3) führten alle verabreichten Enzyme zu einer

signifikanten Verringerung der Trockensubstanz-Anflutung im Vergleich zu PL-0-Tieren.

Durch alle verabreichten Testenzyme mit Ausnahme von E5 wurde das Niveau der KT-

Tiere erreicht. Dosisabhängige Effekte zwischen D1 und D3 waren lediglich für E1, E3 und

E4 zu verzeichnen.


94

Tabelle 45: Trockensubstanz-Anflutung (g) bei PL-Tieren im Zeitraum von 8 h n.F. unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und –dosierungen D1 D2 D3 E1 56,3 ± 13,3 bBC 33,1 ± 8,20 aAC 30,3 ± 4,58 aAC E2 53,4 ± 2,22 cBC 51,1 ± 2,27 bcBC 30,2 ± 10,4 abAC

E3 59,6 ± 12,8 bcBC 51,7 ± 14,7 abABC 28,9 ± 8,32 acAC E4 46,7 ± 3,46 bcBC 36,0 ± 10,3 acdAC 27,0 ± 5,30 adAC

E5 52,9 ± 7,95 bBC 49,8 ± 17,3 abcABC 32,4 ± 3,09 cC PK* 36,3 ± 5,04 cC 33,0 ± 2,54 cC 27,3 ± 9,53 acAC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren * neben Lipasen auch Proteasen und Amylasen enthaltend

Vergleich der verschiedenen Enzyme innerhalb einer Dosierung:

Im Vergleich der verschiedenen Enzyme bestanden in keiner Dosierung signifikante

Unterschiede bezüglich der Effekte auf die TS-Anflutung am terminalen Ileum 8 h n. F. (s.

Abbildung 13). Tendenziell führte die Dosierung D1 von PK und E4 jedoch zu einer

stärkeren Verringerung der TS-Anflutung als für E2, E3 und E5.

D1

24,2 0 53,4 46,768,8 56,3 59,6 52,9 36,30

20

40

60

80

KT PL-0 Reihe3 E1 E2 E3 E4 E5 PK

Abbildung 13: Trockensubstanz-Anflutung (g) bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen in der Dosierung D1

A

B BC

BC

BC

BC

BC

C


95

Bei Verabreichung der Enzyme in der mittleren Dosierung (D2) zeigte sich für E4 und PK

numerisch die deutlichste Reduktion der Trockensubstanz-Anflutung. Bei Einsatz der

Enzyme E2, E3 und E5 wurden Werte auf einem vergleichbaren Niveau ermittelt; die

Trockensubstanz-Anflutung unterschied sich nach Einsatz der letztgenannten Enzyme

jedoch lediglich numerisch von jener der pankreasgangligierten Tiere (s. Abbildung 14).

D2

24,2 68,8 0 33,1 51,1 51,7 36,0 49,8 33,00

20

40

60

80


Abbildung 14: Trockensubstanz-Anflutung (g) bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen in der Dosierung D2

Alle Enzyme bewirkten in der höchsten Dosierung (D3) eine vergleichbare signifikante

Verringerung der Trockensubstanz-Anflutung gegenüber den PL-0-Tieren (s. Abbildung

15).

A

B

ACBCBC

ABC

AC

ABC

C


96

D3

24,2 68,8 0 30,2 28,9 27,0 27,330,3 32,40

20

40

60

80


Abbildung 15: Trockensubstanz-Anflutung (g) bei KT und PL-Tieren ohne und unter

Einfluss von Enzymzulagen in der Dosierung D3

Rangierung

In der höchsten Dosierung war bei allen getesteten Enzymen eine deutliche Reduktion der

Trockensubstanz-Anflutung erkennbar; die innerhalb von 8 h n. F. angeflutete TS-Menge

unterschied sich bei den PL-Tieren mit Enzymsubstitution (Ausnahme: E5) nicht von jener

der gesunden Kontrolltiere, so dass von einer „Normalisierung“ gesprochen werden kann,

auch wenn numerisch teils eine geringgradig höhere Anflutung zu verzeichnen war.

Da keine signifikanten Unterschiede zwischen den in der gleichen Dosierung eingesetzten

Enzymen bestanden, konnte keine Rangierung der Enzyme anhand Ihres Einflusses auf

die Trockensubstanz-Anflutung vorgenommen werden (s. Tabelle 46), wodurch eine

Einschätzung lediglich auf tendenziellen Unterschieden basiert: Durch den Einsatz des

Enzyms E5 wurde in der höchsten Dosierung (D3) tendenziell eine geringere Reduktion

der angefluteten Trockensubstanz-Menge erzielt (s. Tabelle 45). Numerische

Unterschiede werden in folgenden Tabellen zur Rangierung durch Kommata, signifikante

Effekte durch < > Zeichen gekennzeichnet.

A

B

AC AC ACAC

C AC


97

Tabelle 46: Rangierung der Enzyme bezüglich der Fähigkeit zur Reduktion der TS-Anflutung (g) am terminalen Ileum Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E4, E5, E2, E1, E3 ─ D2 PK, E1, E4, E5, E2, E3 ─ D3 E4, PK, E3, E2, E1, E5 ─

3.3.3.2 Rohfettkonzentration im Chymus

Im Vergleich zu den Kontrolltieren, die im Ileumchymus innerhalb von 8 Stunden n. F. eine

mittlere Rohfett-Konzentration von 169 (± 35,6) g / kg TS aufwiesen (s. Tabelle 47), war

die Rohfett-Konzentration bei pankreasgangligierten Tieren massiv erhöht (509 ± 62,6 g /

kg TS).

Hinweis: Die verabreichte Testmahlzeit enthielt eine Rohfett-Konzentration von 351 g / kg

TS.

Tabelle 47: Rohfett-Konzentration (g / kg TS) im ilealen Chymus von KT und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.) KT 169 ± 35,6 aA PL-0 509 ± 62,6 bB Alle zugelegten Enzymprodukte bewirkten eine dosisabhängige Reduktion der Rohfett-

Konzentration des am terminalen Ileum anflutenden Chymus, die jedoch nicht in allen

Fällen statistisch abgesichert werden konnte (s. Tabelle 48): In der niedrigsten Dosierung

(D1) führten alle Enzyme lediglich zu einer tendenziellen Verringerung der Rohfett-

Konzentration im Chymus des terminalen Ileums. Das Niveau der Kontrolltiere wurde bei

dieser Dosierung von keinem der Testenzyme erreicht (s. Tabelle 48). Nach Erhöhung der

Enzymdosierung (D2) ergaben sich lediglich nach Einsatz der Enzyme PK und E1

signifikante Verringerungen der Rohfett-Konzentration des Chymus im Vergleich zu den

PL-Tieren ohne Enzymzulage, wobei auch hier das Niveau der KT-Tiere durch keines der

Enzyme erreicht wurde. In der höchsten Dosierung (D3) führten vier der sechs geprüften

Enzyme zu einer signifikanten Reduktion der Rohfett-Konzentration gegenüber den PL-0-

Tieren (s. Tabelle 48). In dieser Dosierung wurde nach Einsatz der Enzyme PK, E1, E3

und E5 bezüglich der Rohfett-Konzentration im Chymus das Niveau der KT-Tiere erreicht.


98

Zudem war die Rohfett-Konzentration nach Einsatz der Enzyme PK, E1, E4 und E5 in der

höchsten Dosierung (D3) signifikant geringer als jene nach Einsatz der geringen

Dosierung (D1; s. Tabelle 48).

Tabelle 48: Rohfett-Konzentration (g / kg TS) im ilealen Chymus bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und -dosierungen D1 D2 D3 E1 453 ± 69,8 bcB 312 ± 13,3 cdC 220 ± 5,69 adAC E2 495 ± 124 bB 409 ± 23,2 bBC 337 ± 73,4 bBC E3 476 ± 59,5 bB 418 ± 135 bBC 311 ± 89,8 abABC E4 510 ± 60,8 bB 428 ± 18,4 bcBC 343 ± 49,8 cC E5 443 ± 78,3 bB 409 ± 30,7 bBC 270 ± 34,8 cAC PK 451 ± 35,8 bB 284 ± 30,1 cC 207 ± 35,7 acAC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Vergleich der verschiedenen Enzyme innerhalb einer Dosierung: In der niedrigsten Dosierung (D1) war der Einfluss der verschiedenen Enzyme auf die

Rohfett-Konzentration vergleichbar. Die mittlere Rohfett-Konzentration (443 – 510 g / kg

TS) im Chymus entsprach – unabhängig vom eingesetzten Enzym - jener der PL-0 Tiere

(509 g / kg TS) und war signifikant höher als jene der KT-Tiere (~170 g / kg TS; s.

Abbildung 17).


99

D1

169 509 0 453 495 476 510 443 4510

100

200

300

400

500

600

700


Abbildung 16: Mittlere Rohfett-Konzentration (g / kg TS) im ilealen Chymus bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D1 Die verschiedenen Enzyme konnten auch in der mittleren Dosierung (D2) nicht anhand

ihrer Effekte auf die Rohfett-Konzentration gegeneinander abgegrenzt werden (s.

Abbildung 17).

D2

169 509 0 312 418 428 409 2844090

100

200

300

400

500

600

700


Abbildung 17: Mittlere Rohfett-Konzentration (g / kg TS) im ilealen Chymus bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D2

A

B B

B

BB

BB

A

B

C

BC

BC

BCBC

C


100

Der Einsatz der Enzyme in der höchsten Dosierung (D3) bedingte eine Reduktion der

Rohfett-Konzentration des Chymus, wobei nach Einsatz der Enzyme PK, E1 sowie E3 das

Niveau der Kontrolltiere erreicht wurde. Die verschiedenen Enzyme konnten auch in der

höchsten Dosierung (D3) nicht anhand ihrer Effekte auf die Rohfett-Konzentration

gegeneinander abgegrenzt werden (s. Abbildung 18).

D3

169 509 0 220 337 311 343 270 2070

100

200

300

400

500

600

700


Abbildung 18: Mittlere Rohfett-Konzentration (g / kg TS) im ilealen Chymus bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D3

Wenngleich die Erhöhung der Enzymdosierung (D2) bei allen Enzymen zu reduzierten

Fettgehalten im Ileumchymus führten, so wurde lediglich nach Einsatz des Enzyms PK in

der mittleren Dosierung (D2) eine signifikante Reduktion der Rohfett-Konzentration

verglichen mit der niedrigeren Dosierung (D1) erreicht.

Die Wirkung des Einsatzes der Enzyme in der höchsten Dosierung (D3) ließ sich lediglich

bei E5 von jener der mittleren Dosierung (D2) statistisch abgrenzen. Die Testenzyme PK,

E1, E4 und E5 reduzierten die Rohfett-Konzentration des Chymus nach Applikation in der

höchsten Dosierung (D3) dabei in signifikant höherem Maße als in der niedrigsten

Dosierung (D1).

A

B

AC

BC ABC C

ACAC


101

Rangierung:

Alle Enzyme hatten eine dosisabhängige Reduktion der Rohfett-Konzentration im ileal

anflutendem Chymus zur Folge. Dennoch sank lediglich in der höchsten Dosierung bei

vier Enzymen (E1, E5, E3 und PK) die Rohfett-Konzentration des ilealen Chymus auf das

Niveau der KT-Tiere ab. Aufgrund mangelnder signifikanter Unterschiede zwischen den

Effekten der einzelnen Enzyme innerhalb einer Dosierung konnte eine Rangierung der

Enzyme nur unter Einbeziehung von lediglich tendenziellen Effekten erfolgen (s. Tabelle

49). Das Multienzympräparat PK verringerte die Rohfett-Konzentration am effektivsten.

Von den Monolipasen war E1 in den Dosierungen D1 und D2 am wirkungsvollsten

bezüglich der Reduktion der Rohfett-Konzentration des Chymus. In der höchsten

Dosierung (D3) wurde durch dieses Enzym die Rohfett-Konzentration im Chymus im

Vergleich zu den PL-0-Tieren mehr als halbiert (Reduktion von 509 g / kg TS auf 220 g /

kg TS).

Tabelle 49: Rangierung der Enzyme bezüglich der Reduktion der Rohfett-Konzentration(g / kg TS) im Chymus des terminalen Ileums Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 E5, PK, E1, E3, E2, E4 ─ D2 PK, E1, E5, E2, E3, E4 ─ D3 PK, E1, E5, E3, E2, E4 ─

3.3.3.3 Absolute Anflutung von Rohfett

Die am terminalen Ileum innerhalb des Zeitraumes 8 h n. F. angeflutete Rohfett-Menge (g)

betrug bei den Kontrolltieren 4,05 (± 0,70) g. Bei den PL-0-Tieren flutete hingegen ohne

Enzymzulage mit 33,3 (± 4,44) g eine um den Faktor 8,2 signifikant erhöhte Menge an

Rohfett an (s. Tabelle 50).

Tabelle 50: Rohfett-Anflutung (g) am terminalen Ileum bei KT- und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.) KT 4,05 ± 0,70 aA PL-0 33,3 ± 4,44 bB


102

Alle eingesetzten Enzyme führten zu einer dosisabhängigen Verringerung der Rohfett-

Anflutung im Vergleich zu den PL-0-Tieren (s. Tabelle 50). In der geringsten Dosierung

(D1) bewirkte lediglich das Multienzymprodukt PK eine signifikante Reduktion der Rohfett-

Anflutung im Vergleich zu den PL-0-Tieren. Das Niveau der KT-Tiere wurde in der

geringsten Dosierung (D1) durch keines der Testenzyme erreicht. Während es nach

Einsatz von PK, E1, E2 und E4 in der mittleren Dosierung (D2) zu einer signifikanten

Reduktion der Rohfett-Anflutung im Vergleich zu den PL-0-Tieren kam, wurde diese durch

Gabe der Enzyme E3 und E5 nicht signifikant reduziert. Infolge der hohen

Standardabweichung konnte die Rohfett-Anflutung nach Einsatz der Enzyme E4 und E5

nicht von dem Niveau der KT-Tiere abgegrenzt werden.

Die Werte, die nach Einsatz des Multienzymproduktes PK und der Monolipase E3 in der

höchsten Dosierung (D3) ermittelt wurden, waren nicht von den Werten der Kontrolltiere

abzugrenzen.

Zwischen der niedrigsten und der mittleren Dosierung (D1 und D2) bestanden lediglich bei

E1 signifikante Unterschiede in der Rohfett-Anflutung. Ebenso konnte für jedes der

getesteten Enzyme durch Applikation der höchsten Dosierung (D3) eine signifikante

Reduktion der Rohfett-Anflutung gegenüber jener nach Einsatz der niedrigsten Dosierung

(D1) erreicht werden (s. Tabelle 51).

Tabelle 51: Absolute Rohfett-Anflutung (g) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und -dosierungen D1 D2 D3 E1 25,6 ± 6,88 bBC 10,4 ± 2,89 cC 6,66 ± 0,91 cC E2 26,3 ± 6,17 bcBC 21,0 ± 0,20 cdC 9,71 ± 1,41 dC E3 28,9 ± 8,05 bBC 20,9 ± 6,64 bcBC 9,03 ± 3,95 acAC E4 23,9 ± 3,00 bBC 15,5 ± 5,04 acdAC 9,13 ± 0,82 cdC E5 23,2 ± 3,20 bBC 20,6 ± 7,89 abcABC 8,84 ± 1,96 cC PK 16,5 ± 3,39 cC 9,40 ± 1,37 cdC 5,83 ± 2,99 adAC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren


103


In der niedrigsten Dosierung (D1) fand zwar durch Zulage aller Testenzyme eine

numerische Reduktion der Rohfett-Anflutung statt. Die sechs zugelegten Enzyme (E1 - E5

sowie PK) unterschieden sich in der Dosierung (D1) bezüglich ihrer Wirkung auf die

Rohfett-Anflutung nicht voneinander (s. Abbildung 19).

D1

0

4,05

33,3 25,6 26,3 28,9 23,9 23,2 16,50

10

20

30

40

50


Abbildung 19: Rohfett-Anflutung (g) bei KT- und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen in der Dosierung D1

Auch in der mittleren Dosierung (D2) waren die verschiedenen Enzymen bezüglich ihres

Effekts auf die Rohfett-Anflutung vergleichbar, wenngleich E1 und PK tendenziell

geringere Rohfett-Anflutungen zur Folge hatten (s. Abbildung 20).

A

B

BC BC

BC

BC BC

C


104

D2

33,3 0 10,4 21,0 20,9 15,5 20,6 9,40

4,05

0

10

20

30

40

50



Obwohl numerisch die Verringerung der Rohfett-Anflutung deutlich erkennbar war,

konnten die unterschiedlichen Effekte der verschiedenen getesteten Enzyme bezüglich

der Rohfett-Anflutung nicht statistisch abgesichert werden (s. Abbildung 10).

D3

33,3 6,66 9,71 9,03 9,13 8,84 5,83

4,05

0

0

10

20

30

40

50



A

B

C

C

BC

AC

ABC

C

A

B

C C

ACC C

AC


105

Rangierung:

In keiner Dosierung (D1, D2, D3) bestanden bezüglich der Effekte auf die Rohfett-

Anflutung signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen (s. Tabelle

51). In der höchsten Dosierung zeigten alle eingesetzten Enzyme eine weitgehende

Reduktion der angefluteten Rohfett-Mengen, wobei bei Einsatz der Testenzyme PK und

E3 sogar das Niveau der Kontrolltiere erreicht wurde. Eine Rangierung der Enzyme

hinsichtlich der Effektivität der Verringerung der Rohfett-Anflutung konnte infolge

mangelnder statistischer Effekte nicht erfolgen. Numerisch bedingten jedoch in der

niedrigsten Dosierung (D1) PK, E5 und E4 sowie PK und E1 in der mittleren (D2) und

höchsten (D3) Dosierung die vergleichsweise deutlichste Reduktionen der angefluteten

Rohfett-Menge (s. Tabelle 52).

Tabelle 52: Rangierung der Enzyme bezüglich der Reduktion der absoluten Rohfett-Anflutung (g) am terminalen Ileum

Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E5, E4, E1, E2, E3 ─ D2 PK, E1, E4, E5, E3, E2 ─ D3 PK, E1, E5, E3, E4, E2 ─

3.3.3.4 Chromoxid-Konzentration im Chymus

Mit zunehmender Verdauung und Absorption von Nährstoffen ist generell eine steigende

Konzentration des Markers zu erwarten, d.h. der Marker reichert sich bei Erhöhung der

Verdaulichkeit der Nährstoffe zunehmend im Chymus an. Die im Chymus ermittelte Cr2O3-

Konzentration (8 h n. F.) war bei den PL-0-Tieren signifikant geringer (s. Tabelle 53) als

bei den Kontrolltieren.

Tabelle 53: Chromoxid-Konzentrationen (g / kg TS) am terminalen Ileum bei Kontroll- und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.) KT 8,44 ± 0,54 a PL-0 3,94 ± 0,11 b Tendenziell ergab sich nach Einsatz der verschiedenen substituierten Enzyme eine

dosisabhängige Steigerung der Cr2O3-Konzentration (s. Tabelle 54). In der niedrigsten

Dosierung (D1) wurde nach Einsatz von E4 eine signifikant höhere Cr2O3-Konzentration


106

ermittelt als bei E3. Des Weiteren konnte PK in der mittleren Dosierung (D2) anhand der

Cr2O3-Konzentration im Chymus gegenüber E1, E2 sowie E5 statistisch abgegrenzt

werden (s. Tabelle 54). Bei Einsatz der höchsten Dosierung (D3) wurde nach Einsatz von

E4 eine signifikant höhere Cr2O3-Konzentration verzeichnet als nach Substitution von E5.

Lediglich nach Verabreichung der höchsten Dosierung (D3) wurde von PK, E1, E2 und E3

das Niveau der KT-Tiere erreicht.

Tabelle 54: Chromoxid-Konzentrationen (g / kg TS) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und -dosierungen D1 (PL-0 AB) D2 (PL-0 AD) D3 (PL-0 A) E1 4,16 ± 0,675 AB 5,88 ± 0,781 CE 7,14 ± 1,70 ABC E2 3,97 ± 1,04 AB 3,93 ± 0,782 AE 6,50 ± 1,36 ABC E3 4,22 ± 0,571 A 4,77 ± 0,940 ABC 7,42 ± 2,00 ABC E4 4,58 ± 0,518 B 5,13 ± 0,660 BCD 6,47 ± 0,908 B E5 3,52 ± 0,511 AB 4,63 ± 0,939 AC 5,59 ± 0,70 C PK 5,00 ± 0,781 AB 7,05 ± 0,864 B 9,87 ± 3,12 ABC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Tendenziell wurden beim Einsatz von PK, E1, E4 und E3 höhere Cr2O3-Konzentrationen

im Chymus verzeichnet (s. Tabelle 55).

Tabelle 55: Rangierung der Enzyme bezüglich der Cr2O3-Konzentration (g / kg TS) im ilealen Chymus Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E4, E3, E1, E2, E5 E4 > E3 D2 PK, E1, E4, E3, E5, E2 PK > E1/ PK > E2/ PK > E5 D3 PK, E3, E1, E2, E4, E5 E4 > E5

3.3.3.5 Chromoxid-Wiederfindung

Die Bestimmung der Cr2O3–Wiederfindung erfolgte unter Verwendung der in Kapitel

3.1.5.8 beschriebenen Formel. Im Mittel betrug die Chromoxid-Wiederfindung im

Kollektionszeitraum (0-8 h nach Farbumschlag) 56 % (s. Tabelle 56).


107

Die Cr2O3-Wiederfindung war bei PL-0- und Kontrolltieren vergleichbar. Demnach hatte die

Pankreasgangligatur keinen Einfluss auf die Cr2O3-Wiederfindung im Chymus

(Kollektionszeitraum 0-8 h nach Farbumschlag (s. Tabelle 57)).

Tabelle 56: Mittlere Cr2O3-Wiederfindung in %; Vergleich des gesamten Probenumfangs mit dem Anteil der Proben zwischen 45 und 75 %. 54 Proben (alle) 56,2 ± 11,7 44 Proben (> 45 % u. < 75 %) 57,2 ± 7,40

Tabelle 57: Cr2O3-Wiederfindung (%) am terminalen Ileum bei KT und PL-0–Tieren im Zeitraum von 0-8 h n. F. KT 58,1 ± 2,95 aA PL-0 72,7 ± 8,47 acA

Die mittlere Cr2O3-Wiederfindung-Rate betrug bei den durchgeführten Versuchen 56,2 ±

11,7 % (s. Tabelle 56). Dies bedeutete, dass im Mittel innerhalb des achtstündigen

Kollektionsintervalls ca. 56 % der am Morgen verabreichten Cr2O3-Menge von 0,368 g an

der ilealen Fistel anfluteten. Insgesamt wurden bei 44 von 54 Einzelergebnissen Cr2O3-

Wiederfindung-Raten im Bereich von 45-75 % ermittelt. Werte < 45 % wurden in 7 Fällen,

Werte > 75 % in 3 Fällen verzeichnet. Die Cr2O3-Wiederfindung war bis auf wenige

Ausnahmen (PK und E5 (D1) sowie PK (D3)) dosis- und enzymabhängig vergleichbar.

Insgesamt wurde nach Einsatz des Multienzympräparates PK eine geringe Variation der

Cr2O3-Wiederfindung beobachtet (s. Tabelle 58).

Tabelle 58: Cr2O3-Wiederfindung (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und –dosierungen D1 D2 D3 MW E1 64,4 ± 18,4 aA 52,1 ± 9,61 aA 56,8 ± 4,87 aA 57,8 E2 49,7 ± 14,2 aA 54,2 ± 7,48 aA 53,1 ± 20,3 aA 52,3 E3 68,5 ± 19,4 aA 64,3 ± 7,00 aA 55,3 ± 3,83 aA 62,7 E4 58,4 ± 7,45 aA 49,8 ± 13,7 aA 47,3 ± 15,2 aA 51,8 E5 50,4 ± 3,47 bA 60,8 ± 12,0abA 49,3 ± 2,04 abA 53,5 PK 49,2 ± 0,52 bA 62,4 ± 5,34 abcA 68,4 ± 1,90 cA 61,1 MW 56,8 57,3 55,0 Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren


108

3.3.3.6 Verhältnis der Konzentrationen von Rohfett und Chromoxid

Bezüglich des Verhältnisses der Rohfett-Konzentration zur Chromoxid-Konzentration im

Chymus wirkte sich die Ligatur des Pankreasganges (129 ± 17,4) im Vergleich zu den

Kontrolltieren (20,1 ± 4,77) signifikant aus. Die Relation Rfe / Cr2O3-Konzentration war bei

den PL-0-Tieren mit nahezu 130 im Vergleich zu den KT-Tieren um den Faktor 6 x erhöht

(s. Tabelle 59).

Tabelle 59: Relation der Rohfett / Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus bei KT- und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.) KT 20,1 ± 4,77 aA PL-0 129 ± 17,4 bB

Alle Enzyme bedingten eine dosisabhängige Reduktion der Relation von Rohfett-

Konzentration zur Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus, wobei diese Effekte

unterschiedlich stark ausgeprägt waren und nur zum Teil abgesichert werden konnten (s.

Tabelle 60).

In der niedrigsten Dosierung (D1) erzielte keines der eingesetzten Enzyme einen

signifikanten Effekt auf die Rohfett- / Cr2O3-Konzentration verglichen mit den PL-0-Tieren;

ebenfalls wurde durch keines der Testenzyme das Niveau der KT-Tiere erreicht (s. Tabelle

60 und Abbildung 22). Erst in der mittleren Dosierung (D2) konnte nach Einsatz des

Multienzymproduktes PK sowie der Lipase E1 eine signifikante Reduktion der Relation Rfe

/ Cr2O3-Konzentration im Vergleich zu den PL-Tieren ohne Enzymzulage beobachtet

werden. Nach Einsatz des Enzyms E1 wurde bezüglich dieses Parameters sogar das

Niveau der KT-Tiere erreicht. In der höchsten Dosierung (D3) resultierte aus der Zulage

aller Enzyme eine im Vergleich zu den PL-0-Tieren signifikante Reduktion der Relation der

Rfe- / Cr2O3-Konzentration im ileal anflutenden Chymus. Das Niveau der Rfe- / Cr2O3-

Konzentration der KT-Tiere wurde durch Substitution der Enzyme PK, E2 und E3 in der

höchsten Dosierung (D3) erreicht (s. Tabelle 60). Bei PK und E1 war die Reduktion der

Relation in D2 signifikant größer als in D1. Im Vergleich von D3 zu D2 unterschieden sich

E2, E3 und E5 signifikant voneinander. Außerdem wurde durch alle Testenzyme in D3


109

eine signifikante Verringerung der Rfe- / Cr2O3-Konzentration verglichen mit D1 bewirkt.

Tabelle 60: Relation der Rfe- / Cr2O3-Konzentration am terminalen Ileum bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und –dosierungen D1 D2 D3 E1 109 ± 2,83 bB 53,9 ± 9,36 adAD 32,0 ± 7,49 cdC E2 125 ± 3,20 bB 106 ± 13,82 bB 54,2 ± 20,8 aAC E3 113 ± 2,92 bcB 86,9 ± 21,09 cBC 44,3 ± 19,1 aAC E4 111 ± 1,41 bcBC 84,7 ± 13,12 cdBC 54,3 ± 15,3 dC E5 126 ± 6,88 bB 91,1 ± 21,26 bB 49,3 ± 11,8 cC PK 92,1 ± 19,2 bC 40,5 ± 5,28 cD 23,2 ± 11,7 acAC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren


Alle substituierten Enzyme bedingten in der niedrigsten Dosierung (D1) eine vergleichbare

Relation der Rfe- / Cr2O3-Konzentration im Chymus des terminalen Ileums (s. Abbildung

22).

D1

20,1 129 0 109 113 111 126 92,11250

20406080

100120140160


Abbildung 22: Relation der Rfe- / Cr2O3-Konzentration bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D1

A

BC

BCB BC BC

B

C


110

In der mittleren Dosierung (D2) erzielte das Multienzymprodukt PK eine signifikante

Reduktion des Parameters (Relation Rfe- / Cr2O3-Konzentration) gegenüber E2, E3, E4

und E5, während das Testenzym E1 eine signifikant niedrigere Relation der Rfe- / Cr2O3-

Konzentration gegenüber E2 bedingte (s. Abbildung 23).

D2

20,1 129 0 53,9 106 86,9 84,7 91,1 40,50

20406080

100120140160


Abbildung 23: Relation der Rfe- / Cr2O3-Konzentration bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D2

In der höchsten Dosierung (D3) war der Effekt der substituierten Enzyme auf die Relation

von Rfe-/ Cr2O3-Konzentration vergleichbar (s. Abbildung 24). Tendenziell wurden nach

Einsatz des Multienzympräparates PK die geringsten Werte erzielt.

A

B

AD

B BCBC

B

D


111

D3

20,1 129 0 32,0 54,2 44,3 54,3 49,3 23,20

20406080

100120140160


Abbildung 24: Relation der Rfe- / Cr2O3-Konzentration bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D3 Rangierung:

In der geringsten Dosierung (D1) reduzierte PK die Relation Rfe- / Cr2O3-Konzentration im

Chymus des terminalen Ileums signifikant stärker als E5 und E1. In der mittleren

Dosierung (D2) bestanden signifikante Unterschiede zwischen den eingesetzten Enzymen

(s. Tabelle 61); PK senkte die Relation von Rfe / Cr2O3-Konzentration im Chymus

signifikant stärker als E2, E3, E4 und E5. E1 erzielte zusätzlich eine signifikant größere

Reduktion als E2 (s. Tabelle 61).

Tabelle 61: Rangierung der Enzyme bezüglich der Reduktion der Relation der Rfe / Cr2O3-Konzentration im Chymus des terminalen Ileums Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E1, E4, E3, E2, E5 PK > E5, PK > E1 D2 PK, E1 > E4, E3, E5, E2 PK > E2/ PK > E3/ PK >E4 / PK >E5 / E1 > E2 D3 PK, E1, E3, E5, E2, E4 ─

A

B

C

ACAC

CC

AC


112

3.3.3.7 Trockensubstanz-Verschwindensrate (TS-VR)

Im Vergleich zu den Kontrolltieren, bei denen im Kollektionszeitraum (8 h n. F.) eine

Trockensubstanz-Verschwindensrate von 71,6 (± 1,50) % kalkuliert wurde, war die

Trockensubstanz-Verschwindensrate bei den PL-0-Tieren mit 35,0 (± 8,68) % signifikant

geringer (s. Tabelle 62).

Tabelle 62: Trockensubstanz-Verschwindensrate (%) am terminalen Ileum bei Kontroll- und PL-0 –Tieren KT 71,6 ± 1,50 aA PL-0 35,0 ± 8,68 bB

Durch die Zulage der Enzymprodukte konnte im Vergleich zu den PL-0-Tieren ein

dosisabhängiger Anstieg der TS-Verschwindensrate verzeichnet werden, der jedoch nicht

immer statistisch abzusichern war (s. Tabelle 63). Eine signifikante Erhöhung der

Trockensubstanz-Verschwindensrate gegenüber jener der PL-0-Tieren wurde in der

geringsten Dosierung (D1) lediglich durch PK, in der mittleren Dosierung (D2) durch PK,

E1, E3 und E4 erreicht. In der höchsten Dosierung (D3) wurde bei Einsatz von vier der

sechs Enzyme eine signifikante Steigerung der Trockensubstanz-Verschwindensrate

gegenüber den PL-0-Tieren erreicht. Während in der geringsten Dosierung (D1) lediglich E2 -aufgrund der hohen Standardabweichung- nicht von den Kontrolltiere abzugrenzen

war, wurde das Niveau der Kontrolltiere jedoch von E3 in der mittleren Dosierung (D2)

sowie durch Einsatz der Enzyme E1, E2, E3, und PK in der höchsten Dosierung (D3)

erreicht (s. Tabelle 63).

Es wurde eine signifikante Steigerung der Werte der Trockensubstanz-Verschwindensrate

nach Einsatz der Enzyme PK und E1 in der Dosierung D2 gegenüber der geringsten

Dosierung (D1) nachgewiesen; die höchste Dosierung (D3) bewirkte bei allen Enzymen

(außer E2) eine Steigerung der Trockensubstanz-Verschwindensrate gegenüber der

geringsten Dosierung (D1). Zwischen der mittleren Dosierung (D2) und der höchsten

Dosierung (D3) konnte lediglich für E3 ein signifikanter Effekt der Dosis beobachtet

werden.


113

Tabelle 63: Trockensubstanz-VR (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und -dosierungen D1 D2 D3 E1 39,2 ± 9,94 bBC 56,9 ± 5,13 cCD 63,1 ± 8,86 acAC E2 22,6 ± 21,6 abABC 34,7 ± 10,9 bBC 60,5 ± 7,67 abABC E3 39,5 ± 9,26 bBC 45,7 ± 11,3 abACD 64,8 ± 8,16 cAC E4 45,0 ± 7,26 bcBC 50,7 ± 5,99 cdCD 59,8 ± 6,35 dC E5 28,3 ± 10,6 bBC 45,4 ± 10,9 bcBCD 55,1 ± 6,08cBC PK 49,8 ± 7,24 cC 63,8 ± 4,99 dD 72,9 ± 9,07 adAC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren


Der Vergleich der Enzyme innerhalb einer Dosierung zeigte für die Dosierungen D1 und

D3 keine statistisch abzusichernden Unterschiede der Effekte der verschiedenen

getesteten Enzymprodukte auf die Trockensubstanz-Verschwindensrate (s. Abbildung 25, Abbildung 27). Lediglich in der mittleren Dosierung (D2) war die Trockensubstanz-

Verschwindensrate nach Einsatz des Multienzymprodukts PK signifikant höher als nach

Einsatz von E2 (s. Abbildung 26).

In D1 bewirkte die Zulage des Enzyms E5 eine tendenziell geringere Trockensubstanz-

Verschwindensrate als die übrigen Enzyme.


114

D1

71,6 35,0 0 39,2 22,6 39,5 45,0 28,3 49,80

20

40

60

80


Abbildung 25: Trockensubstanz-VR (%) bei KT- und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D1

In der mittleren Dosierung (D2) resultierte aus der Zulage der Enzyme E1 und PK

tendenziell höhere TS-VR als aus Zulage der übrigen substituierten Enzyme (s. Abbildung

26).

D2

71,6 35,0 0 56,9 45,7 50,7 45,4 63,834,70

20

40

60

80


Abbildung 26: Trockensubstanz-VR (%) bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D2

A

B BC ABC

BC BC

BC

C

A

B

CD

BC

ACD CD BCD

D


115

D3

71,6 35,0 0 63,1 64,8 59,8 55,1 72,960,50

20

40

60

80


Abbildung 27: Trockensubstanz-VR (%) bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D3

Rangierung:

Die Ligatur des Pankreasganges führte zu einer signifikanten Reduktion der

Trockensubstanz-Verschwindensrate (TS-VR), wohingegen die Zulage aller geprüften

Enzyme eine dosisabhängige Steigerung der TS-VR bewirkte. Durch Substitution von vier

der sechs Enzyme (E1, E2, E3 und PK) in der höchsten Dosis (D3) wurde die

Trockensubstanz-VR auf das Niveau der KT-Tiere angehoben. In der mittleren Dosierung

(D2) kam es bei Einsatz des Multienzymproduktes PK zu einer signifikant höheren

Trockensubstanz-VR als nach Verwendung der Monolipase E2. (Hinweis: Durch

Verabreichung eines Multienzympräparates wird generell die Verdaulichkeit aller

Nährstoffe gefördert, so dass der hierdurch resultierende Anstieg der TS-VR zu erwarten

war.)

Infolge des Vergleichs der Werte einzelner Enzyme innerhalb einer Dosierung entstand

lediglich eine tendenzielle Rangierung der Enzyme bezüglich ihrer Fähigkeit, die

Trockensubstanz-VR zu erhöhen (s. Tabelle 64):

A

B

AC ABC

AC

C BC

AC


116

Tabelle 64: Rangierung der Enzyme bezüglich der Erhöhung der Trockensubstanz-VR (%) Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E4, E3, E1, E5, E2 ─ D2 PK, E1, E4, E3, E5, E2 PK > E2 D3 PK, E3, E1, E2, E4, E5 ─

3.3.3.8 Rohfett-Verschwindensrate (Rfe-VR)

Im Vergleich zu den Kontrolltieren (86,4 ± 3,04 %) wiesen die pankreasgangligierten Tiere

(10,8 ± 10,4 %) eine signifikant geringere Rohfett-Verschwindensrate im

Kollektionsintervall 0-8 h n. F. auf (s. Tabelle 65).

Tabelle 65: Rohfett-Verschwindensrate (%) bei KT- und PL-0–Tieren (Zeitraum: 0-8 h n. F.) KT 86,4 ± 3,04 aA PL-0 10,8 ± 10,4 bBC Alle zugelegten Enzyme (Ausnahme E2; D1) bedingten einen dosisabhängigen Anstieg

der Rohfett-Verschwindensrate verglichen mit den PL-0-Tieren, der jedoch nur zum Teil

statistisch abgesichert werden konnte (s. Tabelle 66). In der geringsten Dosierung (D1) war enzymunabhängig kein signifikanter Effekt auf die Rohfett-Verschwindensrate zu

erkennen (Ausnahme: PK signifikante Steigerung). Vier der sechs geprüften

Enzymprodukte bedingten in der mittleren Dosierung (D2) eine signifikante Erhöhung der

Rohfett-Verschwindensrate im Vergleich zu den PL-0-Tieren. Durch keines der Enzyme

konnte bei Substitution in der mittleren Dosierung das Niveau der Kontrolltiere erreicht

werden. In der höchsten Dosierung (D3) erbrachten alle substituierten Enzyme eine

signifikante Steigerung der Rohfett-Verschwindensrate gegenüber den PL-Tieren ohne

Enzymsubstitution; zudem wurde die Rohfett-Verschwindensrate auf das Niveau der

Kontrolltiere angehoben (Ausnahme: E2 und E4).

Bei Verabreichung von PK und E1 wurde ein signifikanter dosisabhängiger Anstieg

(Vergleich D1 und D2) der Rohfett-Verschwindensrate in verzeichnet (s. Tabelle 66).

Zwischen den Dosierungen D2 und D3 wurde bei Einsatz von E2, E3 und E5 eine

signifikante Steigerung der Rohfett-Verschwindensrate beobachtet. Die Rohfett-

Verschwindensrate war enzymunabhängig nach Einsatz in der höchsten Dosierung (D3)


117

signifikant höher als nach Einsatz der niedrigen Dosierung (D1).

Tabelle 66: Rohfett-Verschwindensrate (%) bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und –dosierungen

D1 D2 D3 E1 22,8 ± 1,51 bB 61,6 ± 6,18 cCD 77,0 ± 5,12 acAC E2 6,67 ± 5,87 bB 24,0 ± 9,13 bBE 61,5 ± 14,3 cC E3 17,9 ± 4,01 bcBC 37,6 ± 15,3 cCE 68,6 ± 13,1 aAC E4 20,8 ± 1,19 bcBC 39,8 ± 8,93 cdCE 60,3 ± 12,0 dC E5 11,1 ± 6,15 bB 36,1 ± 14,8 bBC 65,0 ± 9,12 aAC PK 35,1 ± 13,6 bC 70,8 ± 4,18 cD 83,5 ± 8,25 acAC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren


Der Vergleich der Enzyme einer Dosierung untereinander zeigte, dass in der geringsten

Dosierung (D1) das Multienzymprodukt PK eine signifikant höhere Rohfett-

Verschwindensrate bewirkte als die Monolipasen E1, E2 und E5 (s. Abbildung 28).

D1

86,4 0 22,8 17,9 20,8 11,1 35,1

10,8

6,67

0

20

40

60

80

100


Abbildung 28: Rohfett-Verschwindensrate (%) bei KT und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D1

A

B

B

B BC BC

C

B


118

In der mittleren Dosierung (D2) führte die Zulage des Multienzympräparates PK zu einer

signifikant höheren Rohfett-VR als der Einsatz der übrigen getesteten Enzyme

(Ausnahme: E1). Des Weiteren war die Rohfett-Verschwindensrate nach Einsatz des

Enzyms E2 signifikant geringer als jene durch E1 erzielte Rohfett-Verschwindensrate (s. Abbildung 29).

D2

86,4 0 61,6 24,0 37,6 39,8 36,1 70,8

10,8

0

20

40

60

80

100


Abbildung 29: Rohfett-Verschwindensrate (%) bei KT- und PL-Tieren ohne und unter

Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D2 In der höchste Dosierung (D3) war (s. Abbildung 30) der Effekt aller Enzyme auf die

Rohfett-Verschwindensrate vergleichbar. Vier der sechs Enzyme (Ausnahmen: E2 und E4)

führten zu einer Rohfett-Verschwindensrate, die mit jener der Kontrolltiere vergleichbar

war.

A

B BE

CDCE

CE

D

BC


119

D3

86,4 0 77,0 61,5 68,6 60,3 65,0 83,5

10,8

0

20

40

60

80

100


Abbildung 30: Rohfett-Verschwindensrate (%) bei KT- und PL-Tieren ohne und unter Einfluss von Enzymzulagen der Dosierung D3 Rangierung:

Deutliche Unterschiede zwischen den Enzymen innerhalb der jeweiligen Dosierung

hinsichtlich der Rohfett-Verschwindensrate bestanden vorwiegend in der niedrigen (D1)

und mittleren (D2) Dosierung. In der höchsten Dosierung (D3) konnten keine Effekte

statistisch abgesichert werden. Bei Einsatz von vier (E1, E3, E5 und PK) der sechs

Enzyme wurde in PL-Tieren das Niveau der Kontrolltiere erreicht. Erneut war das

Multienzympräparat PK in seiner Wirkung auf die Fettverdaulichkeit bzw.

Verschwindensrate als überragend einzustufen. Als effektivste Monolipase bedingte E1 in

allen Dosierungen höhere Rohfett-Verschwindensraten als die übrigen Monoenzyme (s.

Tabelle 67).

Tabelle 67: Rangierung der Enzyme bezüglich der Erhöhung der Rohfett-Verschwindensrate (%) Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E1, E4, E3, E5, E2 PK > E1, E 2, E 5 D2 PK, E1, E4, E3, E5, E2 PK > E2, E3, E4, E5; E1 > E2 D3 PK, E1, E3, E5, E2, E4 ─

B

CAC AC

C

AC

AC A


120

3.3.3.9 Relative Anflutung von Trockensubstanz

Wird die ileal bei PL-0-Tieren innerhalb von 8 h n. F. angeflutete Chymusmenge (TS-

Menge) mit 100% gleichgesetzt, fluteten im Chymus des terminalen Ileums der

Kontrolltiere im gleichen Zeitraum lediglich 35,2 % der Chymusmenge der PL-0-Tiere an

(s. Tabelle 68).

Tabelle 68: Absolute und relative Trockensubstanz-Anflutung (%) am terminalen Ileum bei KT- und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.; Werte der PL-0 = 100) Absolut (g) Relativ (PL-0 = 100) KT 24,2 35,2 PL-0 68,8 100 A


Bereits in der niedrigsten Dosierung (D1) hatte der Einsatz des Multienzympräparates PK

eine signifikante Verringerung der relativen TS-Anflutung um fast 50 % im Vergleich zu

den PL-0-Tieren zur Folge; alle eingesetzten Monolipasen bewirkten hingegen lediglich

eine Verringerung der innerhalb von 8 Stunden n. F. anflutenden Chymusmenge (TS) auf

67,8 bis 86,6 % der Werte der PL-0-Tiere (s. Tabelle 69).

In der mittleren Dosierung (D2) wurde die relative Trockensubstanz-Anflutung durch den

Einsatz von PK und E1 signifikant reduziert.

In der höchsten Dosierung (D3) der Enzyme wurde die Trockensubstanz-Anflutung durch

alle eingesetzten Enzyme im Vergleich zu den PL-0-Tieren signifikant verringert, wobei

sich die verschiedenen Enzyme in ihrer Wirkung jedoch nicht voneinander abgrenzen

ließen (s. Tabelle 69).


121

Tabelle 69: Absolute (g) und relative Trockensubstanz-Anflutung bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und –dosierungen (PL-0 = 100 A) Dosierung D1 D2 D3 absolut relativ absolut relativ absolut relativ Enzym g (%) g (%) g (%) E1 56,3 81,8 A 33,1 48,1 B 30,3 44,0 B E2 53,4 77,6 A 51,1 74,3 A 30,2 43,9 B E3 59,6 86,6 AB 51,8 75,3 AB 28,9 42,0 B E4 46,7 67,8 BC 36,0 52,3 AB 27,0 39,2 B E5 52,9 76,8 AC 49,8 72,4 AB 32,4 47,1 B PK 36,3 52,8 B 33,0 48,0 B 27,3 39,7 B Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren

Rangierung:

Alle getesteten Enzymprodukte führten zu einer Reduktion der Trockensubstanz-

Anflutung, wobei jedoch das Multienzympräparat PK die relative Trockensubstanz-

Anflutung bereits in der niedrigsten Dosierung erheblich minderte (s. Tabelle 70). In den

höheren Dosierungen (D2 und D3) war die Wirkung der Enzyme hingegen vergleichbar (s.

Tabelle 69).

Tabelle 70: Rangierung der Enzyme bezüglich der Reduktion der relativen Trockensubstanz-Anflutung am terminalen Ileum Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E4, E5, E2, E1, E3 PK > E1, E5 / E4 > E2 D2 PK, E1, E4, E5, E2, E3 PK > E2/ E1 > E2 D3 E4, PK, E3, E2, E1, E5 ─

3.3.3.10 Relative Anflutung von Rohfett

Im Verhältnis zu den pankreasgangligierten Tieren ohne Enzymzulage (= 100 %) flutete

bei den Kontrolltieren innerhalb des Kollektionszeitraumes (8 h n.F.) mit lediglich 12,2 %

signifikant weniger Rohfett an (s. Tabelle 71).


122

Tabelle 71: Absolute und relative Rohfett-Anflutung am terminalen Ileum bei KT- und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.; Werte der PL-0-Tiere = 100) Absolut (g) Relativ (PL-0 = 100) KT 4,05 12,2 acA PL-0 33,3 100 bB


Eine dosisabhängige Verringerung der relativen Rohfett-Anflutung konnte bei allen

eingesetzten Testenzymen beobachtet werden (s. Tabelle 72).

Die relative Rohfett-Anflutung wurde durch Substitution des Enzyms PK bereits in der

niedrigsten Dosierung (D1) auf weniger als 50 % der bei PL-0-Tieren beobachteten

Rohfett-Anflutung reduziert, während die Testenzyme E1 bis E5 in der niedrigsten

Dosierung (D1) nur eine moderate Reduktion – auf Werte zwischen 69,7 und 86,8 %-

verglichen mit den PL-0-Tieren-bewirkten. Gegenüber den PL-0-Tieren signifikant war

dieser Effekt lediglich für PK und E4. Die für E1, E2 und E3 ermittelten Werte ließen sich –

aufgrund hoher Standardabweichung - nicht von den Kontrolltieren abgrenzen.

In der mittleren Dosierung (D2) sank auch nach Einsatz der Enzyme E1 und E4 die

Rohfett-Anflutung signifikant auf weniger als 50 % der Referenzwerte (Anflutung bei PL-0-

Tieren), während PK in der mittleren Dosierung (D2) sogar eine signifikante Reduktion

gegenüber den PL-0-Tieren auf 27,5 % bewirkte. Die Enzyme E2, E3 und E5 vermochten

bei vergleichbarer Dosierung die Rohfett-Anflutung hingegen lediglich auf ca. 60 % der

Werte der PL-0-Tiere (nicht signifikant) zu senken.

In der höchsten Dosierung (D3) wurde bei Verwendung aller Enzyme eine signifikante

Verringerung der relativen Rohfett-Anflutung im Vergleich zu den PL-0-Tieren ermittelt. Bei

Einsatz von E2 bis E5 wurden Ergebnisse zwischen 26,6 und 29,2 % erreicht. Dies

bedeutete, dass die Rohfett-Anflutung der PL-0-Tiere um ca. 2 / 3 reduziert werden

konnte, das Niveau der Kontrolltiere jedoch von E1, E2 und E4 nicht erreicht wurde. E1

und PK bedingten sogar eine Rohfett-Anflutung von ca. 20 % bezogen auf die PL-0-Tiere.

Die Steigerung der Enzymdosis von D1 auf D2 des Testenzyms E1 bedingte eine

signifikante Reduktion der Rohfett-Anflutung. Der Einsatz der Enzyme in der höchsten

Dosierung führte bei allen Enzymen zu einer signifikanten Verringerung der Rohfett-

Anflutung gegenüber dem Einsatz der geringsten Dosierung (D1). Zwischen den

Dosierungen D3 und D2 bestand lediglich für das Enzym E5 ein signifikanter Effekt der


123

Dosis auf die Rohfett-Anflutung (s. Tabelle 72).

Tabelle 72: Absolute (g) und relative (%) Rohfett-Anflutung bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und –dosierungen (PL-0 = 100) Dosierung D1 D2 D3 absolut relativ absolut relativ absolut relativ Enzym g (%) g (%) g (%) E1 25,6 76,9 abABC 10,4 31,2 cAC 6,66 20,0 cC E2 26,3 79,0 abABC 21,0 63,1 bcBC 9,71 29,2 cC E3 28,9 86,8 abABC 20,9 62,8abcABC 9,03 27,1 cC E4 23,9 71,8 cC 15,5 46,6 acdAC 9,13 27,4 adC E5 23,2 69,7 bBC 20,6 61,9 abABC 8,84 26,5 cAC PK 16,5 49,5 cC 9,40 28,2 cdC 5,83 17,5adAC Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren

Rangierung:

Zusammenfassend konnte bei allen verwendeten Enzymen eine dosisabhängige

Reduktion der relativen Rohfett-Anflutung verzeichnet werden. Insgesamt war das

Multienzymprodukt PK bei vergleichbarer Dosierung effektiver in der Reduktion der

anflutenden Rohfett-Anflutung als die substituierten Lipasen. Als beste Monolipase ist

unter Verwendung der relativen Rohfett-Anflutung als Bewertungskriterium E1

anzusprechen, wenngleich E4 und E5 in der niedrigsten Dosierung tendenziell bessere

Wirkungen erreichten. (s. Tabelle 72).

Tabelle 73: Rangierung der Enzyme bezüglich der Reduktion der relativen Rohfett-Anflutung (%) am terminalen Ileum Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E5, E4, E1, E2, E3 ─ D2 PK, E1, E4, E5, E3, E2 ─ D3 PK, E1, E5, E3, E4, E2 ─


124

3.3.3.11 Relative Trockensubstanz-Verschwindensrate

Wird die Trockensubstanz-Verschwindensrate der PL-0-Tiere (35,0 %) mit 100

gleichgesetzt, so beträgt die Trockensubstanz-Verschwindensrate der Kontrolltiere 205 %

(s. Tabelle 74). Die Pankreasgangligatur bedingt demnach eine Reduktion der

Trockensubstanz-Verschwindensrate um ca. 50 %.

Tabelle 74: Absolute und relative Trockensubstanz-Verschwindensrate am terminalen Ileum bei KT und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.) Absolut (%) Relativ (PL-0 = 100) KT 71,6 205 PL-0 35,0 100 A


Alle eingesetzten Enzyme bewirkten eine dosisabhängige Steigerung der relativen

Trockensubstanz-Verschwindensrate, für deren Kalkulation die Werte der PL-Tiere ohne

Enzymzulage gleich 100 gesetzt wurden. Ausnahmen hierzu bildeten lediglich die Enzyme

E5 in der niedrigsten sowie E2 in der niedrigsten (D1) und mittleren (D2) eingesetzten

Dosierung, bei denen eine numerische Abnahme der Trockensubstanz-Verschwindensrate

gegenüber den Tieren ohne Enzymzulage zu verzeichnen war.

Bereits in der niedrigsten Dosierung (D1) erreichte PK mit der 1,37fache

Verschwindensrate eine signifikante Steigerung der relativen Trockensubstanz-

Verschwindensrate verglichen mit pankreasgangligierten Tieren ohne Enzymzulage. Die

effektivste Lipase (E4) bedingte eine Steigerung um den Faktor 1,29 und war damit

statistisch von E3 abzugrenzen.

Auch in der mittleren Dosierung (D2) ergaben sich durch den Einsatz des Produktes PK

die höchsten Werte (182 %), die signifikant gegenüber den Werten der PL-0-Tiere, aber

auch von E1 und E2 abgrenzbar waren. Die Werte der besten Monolipase E1 konnten von

denen der PL-0-Tiere abgegrenzt werden. Nach Einsatz der übrigen Testenzyme wurden

Werte ermittelt, die zwischen 99,1 und 163 % lagen (verglichen mit den PL-0-Tiere; s. Tabelle 72).

Infolge der Zulage von PK wurden in der höchsten Dosierung (D3) signifikant höhere

relative Trockensubstanz-Verschwindensraten ermittelt als für alle Monolipasen


125

(Ausnahme E3). Währenddessen wurden durch Einsatz von E1-E5 Ergebnisse ermittelt,

die die Werte der PL-0-Tiere um das 1,57 bis 1,85-fache überstiegen und sich somit

signifikant von den Werten der PL-0-Tiere unterschieden (Ausnahme E5)

Tabelle 75: Absolute und relative Trockensubstanz-Verschwindensrate bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und –dosierungen (PL-0=100) Dosierung D1 D2 D3 absolut relativ B absolut relativ C absolut relativA

Enzym % (%) % (%) % (%) E1 39,2 112 AB 56,9 163 BD 63,1 180 BD E2 22,6 64,6 AB 34,7 99,1 BD 60,5 173 BD E3 39,5 113 AC 45,7 131 AD 64,8 185 B E4 45,0 129 BD 50,7 145 AD 59,8 171 B E5 28,3 80,9 AB 45,4 130 AC 55,1 157 A PK 49,8 142 ACD 63,8 182 A 72,9 208 C Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren

Rangierung:

Während das Multienzymprodukt PK in der niedrigsten Dosierung (D1) gegenüber den

übrigen Enzymen eine deutlich höhere Effektivität bezüglich der Steigerung der bei PL-

Tieren herabgesetzten Trockensubstanz-Verschwindensrate hatte, bedingten in der

höchsten Dosierung (D3) auch alle Monolipasen (außer E5) eine signifikante Erhöhung

der Trockensubstanz-Verschwindensrate. Die durch den Einsatz des Multienzymproduktes

PK erzielten Werte wurden jedoch durch keine der Monolipasen erreicht.

Anhand der Beeinflussung der relativen Trockensubstanz-Verschwindensrate ergibt sich

nachfolgende Rangierung der Testenzyme und des Multienzympräparates (s. Tabelle 76):

Tabelle 76: Rangierung der Enzyme bezüglich der Erhöhung der relativen Trockensubstanz-Verschwindensrate Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E4, E3, E1, E5, E2 E4 > E3 D2 PK, E1, E4, E3, E5, E2 P > E1 / PK > E2 D3 PK, E3, E1, E2, E4, E5 P > E1 / PK > E2 / PK > E4 / PK > E5


126

3.3.3.12 Relative Rohfett-Verschwindensrate

Im Vergleich zu den PL-0-Tieren (100 %) betrug die relative Rohfett-Verschwindensrate

bei den Kontrolltieren ein 8-fach höherer Wert (s. Tabelle 77).

Tabelle 77: Relative Rohfett-Verschwindensrate (%)bei KT- und PL-0 –Tieren (Zeitraum: über 8 h n. F.)

Absolut (%) Relativ (PL-0 = 100) KT 86,4 800 PL-0 10,8 100 A


Auch die relative Rohfett-Verschwindensrate spiegelte die vorgenannten Verhältnisse

wider: Die deutlichsten Steigerungen der relativen Rohfett-Verschwindensrate gegenüber

den PL-0-Tieren wurden durch das Multienzymprodukt PK (Faktor 7,7) und E1 (Faktor 7,1)

erzielt. Damit wurde durch Substitution beider Enzyme das Niveau der KT-Tiere erreicht.

Die Monolipasen E2-E5 erhöhten die relative Rohfett-Verschwindensrate gegenüber den

PL-0-Tieren um den Faktor 1,03 und 2,1 (in der Dosierung; D1), den Faktor 2,2 bis 3,7 in

der mittleren Dosierung und um den Faktor 5,6 bis 6,4 in der höchsten Dosierung (s. Tabelle 78)

Tabelle 78: Absolute und relative (PL-0 = 100) Rohfett-Verschwindensrate bei PL-Tieren unter dem Einfluss unterschiedlicher Enzymzulagen und -dosierungen Dosierung D1 D2 D3 Enzym absolut relativ absolut relativ absolut relativ E1 22,8 211 A 61,6 570 A 77,0 713 A E2 6,67 61,8 A 24,0 222 A 61,5 569 A E3 17,9 166 A 37,6 348 A 68,6 635 A E4 20,8 193 A 39,8 369 A 60,1 557 A E5 11,1 103 A 36,1 334 A 65,0 602 A PK 35,1 325 A 70,8 656 A 83,5 7738 A Großbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung sowie zwischen PL-0- und KT-Tieren

In der Rangierung wurden die Testenzyme PK und E1 als tendenziell am effektivsten

bezüglich der Erhöhung der relativen Rohfett-Verschwindensrate eingestuft (s. Tabelle


127

79). Durch Zulage der Enzyme E2 - E5 konnten vergleichbare Werte verzeichnet werden,

so dass eine weitergehende Rangierung dieser Enzyme nicht möglich war.

Tabelle 79: Rangierung der Enzyme bezüglich der Erhöhung der relativen Rohfett-Verschwindensrate (%) Dosierung Wirksamkeit (numerisch) Wirksamkeit (statistische Unterschiede) D1 PK, E1, E4, E3, E5, E2 ─ D2 PK, E1, E4, E3, E5, E2 ─ D3 PK, E1, E3, E5, E2, E4 ─

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

128

4 Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, unter Verwendung pankreasgangligierter

Miniaturschweine einen In-vivo-Screening-Test für die Überprüfung der Effektivität

substituierter Lipasen zu entwickeln. Nachdem von BECKER (2005) ein solcher Test für

Amylasen und Proteasen entwickelt wurde, sollte in der hier vorliegenden Studie überprüft

werden, ob dieser Ansatz auch für ein Lipase-Screening-Verfahren umzusetzen sei.

Nach FUENTE-DEGE (2003) ist die Bestimmung der Rohfett-Verdaulichkeit über den

gesamten Verdauungstrakt geeignet, die Wirksamkeit lipolytischer Enzyme zu

quantifizieren, da die im postilealen Bereich erfolgenden mikrobiellen Umsetzungen

bezüglich des Rohfettes – im Unterschied zu Kohlenhydraten und Protein - zu

vernachlässigen sind. Als große Nachteile dieser etablierten Methode sind nach

GREGORY (persönliche Mitteilung, 2006) jedoch ein hoher zeitlicher Aufwand sowie der

Verbrauch relativ großer Mengen des zu prüfenden Enzyms zu nennen. Trotz Verzichts

auf eine mehrtägige Anfütterungsphase wird von einem Screening-Test die Möglichkeit

einer vergleichenden Quantifizierung der Effizienz lipolytischer Monopräparate verlangt.

Die im Screening-Test ermittelten Ergebnisse sollten also eine erste Einschätzung

ermöglichen, so dass nur „erfolgversprechende“ Neuentwicklungen in größerem Umfang

für weitere Untersuchungen produziert werden müssten. Ein Schnelltest ist jedoch nur

sinnvoll, wenn die Ergebnisse mit denen aus klassischen Verdaulichkeitsstudien

korrelieren. Eine Fehleinschätzung hätte gravierende Folgen wie beispielsweise

Investitionen in eine Weiterentwicklung von Lipasen unzureichender Wirksamkeit oder

einen Abbruch der Entwicklung effektiver Enzyme.

4.1 Kritik der Methoden

4.1.1 Anzahl der Tiere

Die Versuche im Rahmen der Entwicklung eines Screening-Tests sowie die Überprüfung

der Wirksamkeit verschiedener lipolytischer Enzyme wurden lediglich an einer geringen

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

129

Tierzahl durchgeführt. Die geringe Tierzahl (n=3 bzw. 4) in der Phase der Entwicklung des

Screening-Tests begründete sich zunächst einmal mit den räumlichen und personellen

Gegebenheiten, die parallele Chymussammlungen lediglich bei 3, ausnahmsweise bei 4,

Tieren je Tag erlaubten. In der Phase der Entwicklung einer optimierten Versuchsmahlzeit

wurden insgesamt 7 PL-Tiere eingesetzt, die in zwei Gruppen abwechselnd zum Einsatz

kamen. Dieses Vorgehen war trotz eingeschränkter Vergleichbarkeit notwendig, um den

Tieren eine „Regenerationsphase“ zwischen den Versuchen im Stoffwechselkäfig zu

gewähren. Abschließend wurde die optimierte Testmahlzeit unter identischen

Versuchsbedingungen an allen 7 Tieren überprüft, so dass durch eine größere Anzahl

vergleichbarer Ergebnisse die Reproduzierbarkeit abgesichert werden konnte.

In der Testphase bislang ungeprüfter Lipasen kam nur eine Tiergruppe, bestehend aus

drei identischen Tieren pro Enzymdosierung, zum Einsatz, so dass - trotz des z. T.

unterschiedlichen Niveaus der Werte der Tiere - die Vergleichbarkeit der Ergebnisse

gegeben war. Dennoch verstärkte sich das Gewicht von „Ausreißern“ dadurch, dass

anstelle einer dreitägigen Chymussammlung mit 3 - 6 Tieren pro Dosierung (entsprechend

9 bzw. 18 Ergebnissen pro Dosierung) in etablierten Verdaulichkeitsuntersuchungen von

TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE

2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004) im Screening-Test lediglich bei drei Tieren

eine eintägige Kollektion pro Enzymdosierung stattfand (3 Ergebnisse pro Dosierung).

Dementsprechend wäre auch im Screening-Verfahren eine Erhöhung der Tierzahl

wünschenswert. Aufgrund der räumlichen, technischen und personellen Ausstattung (s. o.)

wäre die Testung einer weiteren Tiergruppe jedoch nicht zeitgleich, sondern nur

anschließend durchführbar. Außerdem würde die Erhöhung der Tierzahl auch einen

erhöhten Enzymverbrauch bedeuten. Der sich demnach etwa verdoppelnde Bedarf an Zeit

und Material schien jedoch nicht gerechtfertigt: Erstens war als entscheidende

Anforderung an ein Lipase-Screening ein möglichst geringer Zeit- und Enzymaufwand

definiert worden. Auch wenn die Ergebnisse der einzelnen Tiere durchaus in der Höhe der

Werte variierten, so war zweitens festzuhalten, dass die dosisabhängigen Effekte bei allen

Tieren vergleichbar waren. Drittens wurden zur Minimierung tagesabhängiger Einflüsse

die drei zu testenden Dosierungen jedes Testenzyms randomisiert im 3 x 3 Lateinischen

Quadrat an die drei Tiere verabreicht. Darüber hinaus besteht für ein Lipase-Screening die

Anforderung, lediglich eine erste Rangierung und keine Absolutwerte zu erlangen.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

130

Der Verzicht auf eine Ausweitung des Versuchsumfanges war hier somit tolerierbar.

Idealer Weise sollte aber bei entsprechender Verfügbarkeit der Enzyme der Einsatz einer

größeren Tierzahl erfolgen.

4.1.2 Validierung des Schnelltests

In einer Vergleichsstudie zur Validierung des Lipase-Screenings wurde auf bereits

vorhandene Daten klassischer Verdaulichkeitsversuche zurückgegriffen, in denen die

beiden Testlipasen E3 und E4 zum Einsatz kamen.

Jedoch konnte im Screening lediglich in der höchsten Dosierung ein deutlicher, jedoch

nicht abzusichernder Unterschied verzeichnet werden. Allerdings bestätigte sich dadurch

die in den Ergebnissen der Gesamtverdaulichkeitsstudie nachgewiesene Überlegenheit

der Effekte der Lipase E3 gegenüber dem Produkt E4.

Die Rangierung der Testlipasen im Screening-Test ergab für beide Enzyme eine

Bewertung im Mittelfeld. Es wäre jedoch wünschenswert gewesen, wenn zur Validierung

des Testverfahrens zwei Lipasen hätten gegenübergestellt werden können, die deutlichere

Differenzen aufwiesen, z.B. das als bestes und das als schlechtestes eingeschätzte

Enzym der Rangierung. Dieses war infolge mangelnder Verfügbarkeit entsprechender

Enzymmengen jedoch nicht realisierbar.

4.1.3 Eignung der erstmalig angewandten Methode zur Fettbestimmung (AnkomHCl Hydrolysis System®)

Durch die Veränderungen in Versuchsablauf und Anzahl der Versuche pro Woche infolge

der Entwicklung eines Lipase-Screenings stieg die Zahl der Proben erheblich.

Die Einführung des AnkomHCl Hydrolysis System® bot gegenüber der bisher in diesem

Projekt verwendeten Methode folgende Vorteile:

• wesentliche Steigerung des täglichen Probenumsatzes

• entscheidende Verringerung der benötigten Probenmasse

• Senkung der Arbeitsaufwandes infolge weitgehender Automatisierung

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

131

Durch Nutzung dieser Methode wurde es möglich, das erhöhte Probenaufkommen zu

bewältigen. Außerdem konnte auf diese Art und Weise - trotz zum Teil geringer

Probenmengen - der Rohfett-Gehalt der Proben bestimmt werden, so dass die Bildung

von Sammelproben mehrerer Kollektionsintervalle lediglich in Ausnahmefällen notwendig

war. Bei Verwendung der Ankom Geräte ergaben sich methodisch bedingte, gerichtete,

Abweichungen gegenüber der herkömmlichen VDLUFA-Methode (Soxhlet) von ca. 10 %.

Diese Differenz könnte eine Folge von methodischen Unterschieden sein: mit dem

Soxhlet-Verfahren wird der Rohfettgehalt durch Quantifizierung des Rückstandes nach

Etherextraktion und Trocknung bestimmt, während bei Verwendung der Ankom-Methode

die Bestimmung des Fettgehaltes über Differenzbildung (Masse vor Extraktion − Masse

nach Extraktion) erfolgt. Somit werden im Gegensatz zum Soxhlet-Verfahren bei

Bestimmung durch das Ankom-Verfahren alle flüchtigen lipophilen Substanzen in den

Rohfett-Gehalt mit einbezogen. Innerhalb des Screening-Tests fand ein Vergleich der

Ergebnisse lediglich anhand der mit der neuen Methode ermittelten Werte statt, so dass

die Vergleichbarkeit der Werte gegeben war. Da bei dem Vergleich der Screening-Test-

Ergebnisse mit denen aus Gesamtverdaulichkeiten aufgrund mehrerer Unterschiede keine

direkte Vergleichbarkeit vorlag, sollte lediglich die Rangierung begutachtet werden.

Demzufolge fand auch hier kein direkter Vergleich der beiden Methoden statt, so dass

innerhalb der jeweiligen Versuche alle eingesetzten Enzyme unter denselben

Bedingungen geprüft wurden.

Unter Verwendung der neuen Methode (AnkomHCl Hydrolysis System® (Filterbag-

Säurehydrolyse-Technik®)) wurde eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

erzielt. Die neu etablierte Ankom-Methode konnte demnach als zuverlässig und geeignet

zur Bestimmung der Rohfett-Konzentration im Chymus eingestuft werden.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

132

4.2 Erörterung der eigenen Ergebnisse

4.2.1 Wie muss eine Testmahlzeit beschaffen sein, um In-vivo die Wirksamkeit von Lipasen in einem Schnelltest überprüfen zu können?

Die in dieser Studie zu prüfenden Lipasen waren bisher lediglich mittels In-vitro-Versuchen

auf ihre hydrolytische Aktivität und ihre pH-Stabilität untersucht worden (Ausnahme: E3

und E4, s. o.). Zur Überprüfung ihrer tatsächlichen Effektivität war eine In-vivo-

Untersuchung unerlässlich. Da in dieser Phase der Entwicklung jedoch nur sehr begrenzte

Enzymmengen zur Verfügung standen, war die Durchführung herkömmlicher

Verdaulichkeitsuntersuchungen unmöglich. Demzufolge bestand die Notwendigkeit zur

Entwicklung eines zeit- und materialsparenden In-vivo-Verfahrens, das dennoch eine erste

Einschätzung der In-vivo-Wirksamkeit der Lipasen ermöglichte.

Wie in Kapitel 3.1.6 – 3.1.8 (Material- und Methoden) beschrieben, stand bei der

Entwicklung eines Lipase-Screenings die Optimierung einer geeigneten Testmahlzeit im

Vordergrund: Trotz zu befürchteter Passagestörungen wurde ein hoher Fettanteil

angestrebt, insbesondere unter Verwendung langkettiger Fettsäuren, um auch im unteren

Dosierungsbereich eine ausreichende Differenzierung der Wirksamkeit zwischen den

verschiedenen Lipase-Produkten zu forcieren. Anderenfalls wären Wirkungen der

substituierten Enzyme nicht von denen endogener, z. B. gastrischer Lipasen

differenzierbar.

Die entscheidende Anforderung an die Beschaffenheit einer geeigneten Testmahlzeit

war jedoch die Erzielung eines parallelen Flusses von Trockensubstanz, Rohfett, Enzym

und Marker. Dieses Kriterium entstand aus folgender Problematik:

⇒ Ist es Ausdruck einer hohen Rohfett-Verdaulichkeit oder einer geringen

Chymusflussrate, wenn lediglich geringe Mengen Rohfett am terminalen Ileum

anfluten?

⇒ Ist es vorstellbar, dass lediglich Trockensubstanz und Marker an der ilealen Fistel

aufgefangen werden, Rohfett jedoch selektiv zurückgehalten wird?

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

133

Um sicher zu stellen, dass eine verringerte Rohfett-Anflutung Folge der Verdauung

(Resorption der Hydrolysespaltprodukte infolge der Enzymsubstitution) und kein Effekt von

Passagestörungen war, wurde eine fraktionierte Sammlung und Analyse des Chymus

durchgeführt, anhand derer relative parallele Flussraten kalkuliert wurden. Des Weiteren

wurde zur Überprüfung der Rohfett-Verschwindensrate eine Vielzahl von Parametern

eingesetzt.

Die Diskussion der Optimierungsvorgänge der Testmahlzeit zur Verbesserung paralleler

Flussraten erfolgt anhand folgender Gesichtspunkte:

• Modifikation des Trockensubstanz- und Rohfasergehaltes (4.2.1.1)

• Verringerung der Chromoxidmenge pro Mahlzeit (s. 4.2.1.2)

• Einsatz einer flüssigen Mahlzeit am Vorabend der Verabreichung der Testmahlzeit

(4.2.1.3)

• Stabilisierung der Testmahlzeit (Homogenisierung; 4.2.1.4)

4.2.1.1 Modifikation des Trockensubstanz- und Rohfasergehaltes

Bei der Optimierung der Testmahlzeit wurde von der Idee einer flüssigen Mahlzeit

ausgegangen. Die auf Basis eines Milchshakes nach verschiedenen Modifikationen

entwickelte endgültige Variante wies einen Trockensubstanz-Gehalt von ca. 40 % auf (147

g TS in 372 g uS). Die Testmahlzeit war eine Öl-in-Wasser-Emulsion, in der die feinst

verteilten unlöslichen Bestandteile für einen bestimmten Zeitraum eine stabile Mischung

bildeten. Im Gegensatz dazu sedimentierten die in der herkömmlichen Standard-Fettdiät

vorhandenen festen Bestandteile umgehend, so dass sich eine wässrige Schicht über den

festen Bestandteilen bildete. Hingegen blieb die flüssige „optimierte“ Testmahlzeit über

Stunden stabil, so dass von der berechtigte Annahme ausgegangen werden konnte, dass

auch im GIT des Tieres keine Entmischungen stattfanden. Trotz des höheren

Trockensubstanz-Anteils der Screening-Test-Diät gegenüber der Standard-Fettdiät konnte

deshalb von einem Flüssigfutter gesprochen werden, von dem zu erwarten war, dass sich

die passageregulierenden Aspekte einer flüssigen Mahlzeit insbesondere auf die

Magenentleerung auswirken könnten (BRAUDE et al.1970; HUNT u. STUBBS 1975;

READ 1984; DECUYPERE et al. 1985). Im 5. Versuch zur Optimierung einer Testmahlzeit

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

134

wurde erstmals zusätzlich Rohfaser (9,88 g Methocel®) eingesetzt, um Entmischungen

des Markers von der Testmahlzeit entgegenzuwirken. In den folgenden Versuchen traten

deutlichere dosisabhängige Effekte auf. Durch diese Maßnahmen konnten die erwarteten

Probleme infolge des hohen Fettgehaltes in der Diät reduziert und der parallele Fluss der

Mahlzeitkomponenten verbessert werden.

4.2.1.2 Verwendung von Chromoxid als Marker

Der eingesetzte Marker Chromoxid diente neben der optischen Abgrenzung des aus der

Testmahlzeit stammenden Chymus zur Berechnung der „Verschwindensrate“, der die

Formel der Indikatormethode zu Grunde lag. Eine geringe Anflutung von Chymus (bzw.

Rohfett) infolge hoch wirksamer lipolytischer Enzyme konnte damit von einer geringen

Anflutung infolge einer geringen Passagerate abgegrenzt werden.

Für die Verwendung dieser Formel ist ein paralleler Fluss von Trockensubstanz, Rohfett

und Marker von zentraler Bedeutung. In den ersten Ansätzen zur Optimierung einer

geeigneten Testmahlzeit konnten jedoch keine parallelen relativen Flussraten ermittelt

werden.

Dennoch wurde am Einsatz von Cr2O3 aufgrund folgender Gesichtspunkte festgehalten:

• Die Bestimmung des Markers war etabliert und es lagen entsprechende

Erfahrungen aus vorangegangen Studien des Projektes vor.

• Der Marker sollte eine optische Abgrenzung ermöglichen, um mit dem ersten

Erscheinen des gefärbten Chymus an der Fistel mit der Kollektion beginnen zu

können.

• Die Vergleichbarkeit mit vorangegangenen Studien des Projektes sollte erhalten

bleiben.

• Nach Zubereitung der Mahlzeit als Emulsion fand über Stunden keine

Entmischung von wässriger und fettiger Phase statt.

Infolge der durchgeführten Modifikationen gelang bei Verwendung der endgültigen

Testmahlzeit ein weitestgehend paralleler Fluss von Nährstoffen und Chromoxid im

Chymus (s. Abbildung 31):

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

135

• Anpassung der Chromoxidmenge an die verringerte Trockensubstanz-Menge (2,5 g

/ kg TS entsprechen 0,368 g Cr2O3)

• Verbesserte Homogenisierung der Emulsion durch mehrminütige Vermischung

• der Komponenten mittels Ultra-turrax 900® anstelle eines Handmixers

4.2.1.3 Einsatz einer flüssigen Mahlzeit am Vorabend des Screening-Tests

Um Interferenzen der dem Versuch vorangegangenen Abendfütterung mit der

Testmahlzeit im GIT infolge von „Verschleppungen“ (TS- und Rfe-Übertrag des

Haltungsfutters in den Kollektionszeitraum) zu vermeiden, wurde eine fettfreie

Flüssigmahlzeit (ProvideXtra®) 12 Stunden vor Fütterung der Testmahlzeit verabreicht.

Der Hintergrund dieses Vorgehens war das Bestreben, evtl. Reste vorheriger Mahlzeiten

in Magen oder Dünndarm weiter zu transportieren und eine zügige Passage der

Abendmahlzeit selbst sicherzustellen. Die im Lipase-Screening verwendete Testmahlzeit

war besonders empfindlich gegenüber einem Nährstoffeintrag aus vorherigen Mahlzeiten,

da sie lediglich 150 g TS (im Gegensatz zum üblicherweise verabreichten Mischfutter-

Mahlzeiten: ca. 225 g TS) beinhaltete, so dass selbst relativ geringe Mengen des sonst

verwendeten Mischfutters verhältnismäßig starken Einfluss auf Trockensubstanz-

Anflutung und -Verschwindensrate ausüben würden. Des Weiteren bestand zwischen

herkömmlichem Mischfutter und Testmahlzeit eine große Differenz hinsichtlich des

Rohfett-Gehaltes (Mischfutter ca. 2 % vs. Testmahlzeit ca. 35 % der TS), wodurch bei

Vermischung mit der Testmahlzeit eine erhöhte Rohfett-Verschwindensrate im

aufgefangenen Chymus vorgetäuscht würde.

Bei Einsatz von ProvideXtra® war jedoch davon auszugehen, dass es zu keinen

Interferenzen mit der Testmahlzeit im Magen und Dünndarm kam und an der ilealen Fistel

nach Farbwechsel lediglich aus der Testmahlzeit stammender (und damit enzymhaltiger)

Chymus gesammelt wurde, so dass eine Verbesserung in den parallelen Flussraten

verzeichnet werden konnte.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

136

4.2.1.4 Stabilisierung der Testmahlzeit (Homogenisierung)

Zur Erzielung einer stabilen Testmahlzeit wurde die neu entwickelte Testmahlzeit

zusätzlich mit dem Homogenisator Ultra-turrax 900® für insgesamt sechs Minuten

homogenisiert.

Durch diese intensive Vermischung gewann die Emulsion an Stabilität, so dass ab dem

ersten Einsatz des Ultra-turrax 900® im sechsten Optimierungsversuch ein paralleler Fluss

von Trockensubstanz, Rohfett und Cr2O3 (s. Abbildung 31) erreicht wurde. Außerdem

wurden nicht nur dosisabhängige Effekte der Trockensubstanz- und Rohfett-

Verschwindensraten sondern auch der Trockensubstanz- und Rohfett-Anflutung

festgestellt.

Fazit: Trotz des hohen Fettgehaltes in der Testmahlzeit, der flüssigen Darreichungsform

der Testmahlzeit und der Reduktion der Chromoxidmenge pro Mahlzeit gelang es, durch

Zusatz einer Rohfaserquelle sowie Verwendung eines Homogenisators eine stabile

Emulsion zu schaffen. Zusätzlich wurde ein Übertrag von Chymus vorheriger Mahlzeiten

durch den Einsatz einer flüssigen Trinknahrung am Vorabend der Versuche bedeutend

vermindert. Mit Durchführung dieser Modifikationen stand ein Verfahren zur Verfügung, in

dem zuverlässig parallele relative Flussraten von Trockensubstanz, Rohfett und

Chromoxid ermittelt werden konnten, wie in nachstehender Abbildung (s. Abbildung 31)

exemplarisch dargestellt wird. Zur Ermittlung und Überprüfung der parallelen Flussraten

war der Einsatz des Markers Chromoxid entscheidend. Aufgrund dieser nachgewiesenen

Parallelität war es möglich, die Formel der Indikatormethode zur Kalkulation der

Verschwindensrate einzusetzen.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

137

0

10

20

30

40

50

60

70


CrTSRfe

0 – 2 h n. F. 2 – 4 h n. F. 4 – 6 h n. F. 6 – 8 h n. F.

Abbildung 31: Beispiel für relative parallele Flussraten im 6. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit an Tier 56, 500 IE PK

4.2.2 Ist es möglich, neu entwickelte Lipasen mit einer optimierten Testmahlzeit vergleichend zu prüfen und hinsichtlich ihrer Effektivität zu rangieren?

Bei der Etablierung eines Lipase-Screening-Tests wurde eine Vielzahl von Modifikationen

gegenüber herkömmlichen Verdaulichkeitsversuchen durchgeführt. Im Folgenden werden

Besonderheiten der Testmahlzeit und deren Einflüsse erörtert.

4.2.2.1 Vorteile eines Screening-Verfahrens

Durch den Verzicht auf eine Anfütterungsphase sind bei der In-vivo-Testung von

Verdauungsenzymen immense Zeiteinsparungen möglich. Die genannten Modifikationen

erlauben gegenüber einer klassischen Verdaulichkeitsuntersuchung (1 Enzym in 13

Tagen: 10 Tage Anfütterungsphase + 3 Tage Chymuskollektion) eine erste Rangierung

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

138

von 6 Enzymen bzw. 6 verschiedenen Enzymdosierungen im gleichen Zeitraum.

Außerdem werden bedeutend geringere Enzymmengen benötigt: 1 statt 26

Enzymapplikationen pro Enzym, so dass erste In-vivo-Studien zu einem deutlich früheren

Zeitpunkt im pharmazeutischen Entwicklungsprozess möglich werden. Dies ist von

besonderer Bedeutung, da die ersten In-vivo-Tests oftmals durch die in dieser

Entwicklungsphase nur in geringeren Mengen verfügbaren neuen Substanzen limitiert

werden.

4.2.2.2 Bedeutung der relativen Flussraten für die Berechnung der „Verschwindensrate“

Zur Berechnung der Verschwindensrate wird die Formel der Indikatormethode (s. 3.1.5.8)

herangezogen. Voraussetzung zur Bestimmung der Nährstoffverdaulichkeit mit der

Indikatormethode ist der parallele Fluss von Trockensubstanz, Rohfett und Chromoxid.

Durch diesen ist die Verwendung der Formel zu rechtfertigen, die in der Regel nur im

Zustand des „steady state“ nach mehrtägiger Anfütterungsphase (klassische

Verdaulichkeitsuntersuchung) gilt. Im Rahmen eines Screening-Verfahrens ohne

Anfütterungsphase kann die Indikatormethode also nur dann angewandt werden, wenn ein

paralleler Fluss der Parameter nachweisbar ist (BECKER 2005). Um den relativen Fluss

von Trockensubstanz, Rohfett und Chromoxid zu ermitteln, wurde die absolute Anflutung

dieser Parameter in 2-Stunden-Intervallen fraktioniert gesammelt und analysiert.

Anschließend wurden die angefluteten Mengen an Trockensubstanz, Rohfett und

Chromoxid auf den gesamten Kollektionszeitraum bezogen.

Erst mit Einsatz der optimierten Testmahlzeit konnte der parallele Fluss der Parameter

über den Kollektionszeitraum von 8 Stunden sichergestellt werden. Während der

Durchführung der Wirksamkeitsprüfung der Testenzyme wurde der parallele relative Fluss

weiterhin bestätigt (s. Abbildung 32).

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

139

0

10

20

30

40

50

60

70


CrTSRfe

0 – 2 h n. F. 2 – 4 h n. F. 4 – 6 h n. F. 6 – 8 h n. F.

Abbildung 32: Beispiel: relativer Flussraten der Parameter Trockensubstanz, Rohfett und Cr2O3 bei Einsatz der Lipase E1 (Tier 81-500 IE)

4.2.2.3 Beurteilung der Parameter

Zur Beurteilung der In-vivo-Wirksamkeit sollten möglichst aussagekräftige Parameter

genutzt werden. In Analogie zu BECKER (2005) sollte dazu vor allem die

Verschwindensrate des Substrats, also Rohfett, verwendet werden.

Es wurden in der vorliegenden Arbeit insgesamt zehn Parameter geprüft und ausgewertet,

um eine geringe Anflutung infolge geringer Passagerate von einer geringen Anflutung

infolge hoher Effektivität der zugesetzten lipolytischen Enzyme abzugrenzen.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

140

Folgende Parameter wurden erhoben:

⇒ Trockensubstanz- und Rohfett-Anflutung (g):

(Keine Differenzierung zwischen hoher Passagerate und schlechter Wirksamkeit

des Enzyms möglich)

⇒ Rohfett- und Chromoxid-Konzentration (g / kg TS):

(Maß für die Wirksamkeit der substituierten Enzyme. Bei zunehmender Wirksamkeit

der Enzyme: Rfe-Konz. ↓ und Cr2O3 ↑)

⇒ Chromoxid-Wiederfindung (%):

(Berechnung der Verschwindensrate mittels Indikatormethode, enzym- und

dosisunabhängige Wiederfindung)

⇒ Verhältnis der Konzentrationen von Rohfett zu Chromoxid, Trockensubstanz- und

Rohfett-Verschwindensrate (%), Relative Anflutung und Verschwindensrate von

Trockensubstanz und Rohfett:

(Differenzierung zwischen der Wirksamkeit der Lipasen und Einflüssen der

Passageraten durch Einbeziehung der Cr2O3-Wiederfindung)

Für alle Parameter waren dosisabhängige Effekte erkennbar. Einzige Ausnahme bildete

die Chromoxid-Wiederfindung: bezüglich dieser Werte ließen sich weder dosis- noch

enzymabhängige Zusammenhänge nachweisen, womit Cr2O3 in diesen Versuchen seiner

Aufgabe als unverdaulicher, farblicher Marker gerecht wurde.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

141

Anhand der übrigen zehn Parameter waren folgende Ergebnisse hinsichtlich der Testung

und Rangierung der In-vivo-Wirksamkeit der zu prüfenden Enzyme feststellbar:

• Für das Multienzymprodukt PK sowie die Monolipase E1 wurden in allen drei

geprüften Dosierungen die höchste Effizienz ermittelt.

• In der höchsten Dosierung wurde von drei der sechs Enzyme das Niveau der

Kontrolltiere bei allen Parametern erreicht.

• In der niedrigsten und mittleren Dosierung war infolge höherer

Standardabweichungen oftmals keine statistische Abgrenzung gegenüber den

Kontrolltieren zu verzeichnen.

• Beim Vergleich der Enzyme miteinander in einer einzigen Dosierung konnten

nur wenige signifikante Differenzen in der Wirksamkeit abgegrenzt werden: Das

Multienzym PK und E1 als beste Monolipase waren jedoch in mehreren Fällen

von den weniger wirksamen Lipasen (z.B. E2) signifikant abzugrenzen.

Als Ursache für die häufig nicht abzusichernden Effekte könnte die Auswahl der

Dosierungen in Betracht kommen: In vorangegangenen Arbeiten dieses Projektes wurden

112 000 bis 1 120 000 IE lipolytischer Aktivität des Multienzymproduktes PK unter

Verwendung der breiförmigen Standard-Fettdiät zur Bestimmung der scheinbaren Rohfett-

Verdaulichkeit eingesetzt. Die ermittelten Werte der KT-Tiere lagen in den

Untersuchungen von TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER

2002; FUENTE-DEGE 2003) bei 88,2 – 97,6 %, während von den PL-Tieren in der

höchsten Dosierung (336 000 IE) des Multienzymproduktes PK eine scheinbare

Rohfettverdaulichkeit (Rfe-sV) von 71,4 – 83,3 % erreicht wurde. Im Verlauf der

Optimierung der Testmahlzeit zur Entwicklung eines Lipase-Screenings wurden die

Dosierungen wesentlich reduziert. Mit Einsatz einer flüssigen Mahlzeit wurden bereits in

geringsten Dosierungen vergleichbare Effekte erzielt. Schon bei Einsatz von nur 75 000 IE

wurden die Werte der maximalen Wirksamkeit von PK ermittelt (87,8 % bzw. 85,0 % Rfe-

VR im 6. bzw. 7. Versuch zur Optimierung einer Testmahlzeit). Ebenfalls konnte bereits

bei 5 000 IE ein vergleichbares Niveau erreicht werden: 77,1 % bzw. 81,9 % Rfe-VR im 3

bzw. 4. Versuch zur Optimierung einer Testmahlzeit. Ein Erklärungsansatz könnte in den

Unterschieden der eingesetzten Rationen liegen: In den vorherigen Studien wurde die

Standard-Fettdiät des Projektes eingesetzt. Diese wurde im Gegensatz zur Testmahlzeit

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

142

(stabile Emulsion s. o.) als Suspension (Brei) verabreicht, die sich eher entmischte (s. o.:

verbesserte Bedingungen für die Enzyme in flüssiger, homogener Umgebung).

Schließlich wurden bei der optimierten Testmahlzeit deutliche dosisabhängige Effekte in

den Dosierungen D1 = 500, D2 = 5 000 und D3 = 75 000 IE lipolytischer Aktivität erreicht.

Es ist zum derzeitigen Zeitpunkt nicht abschließend zu bewerten, ob die hohe Effektivität

der substituierten Enzyme (inkl. des etablierten Multienzymproduktes PK) eine Folge der

speziellen Zusammensetzung der Testmahlzeit oder aber der Zubereitung (flüssige,

homogenisierte Diät) ist. Es ist zu berücksichtigen, dass unterschiedliche Fettquellen in

den verschiedenen Versuchsmahlzeiten verwendet wurden: während in den klassischen

Gesamtverdaulichkeitsstudien Sojaöl zum Einsatz kamen, wurde der Screening-Test-Diät

Olivenöl und Milchfett zugesetzt. Eine besonders hohe Effektivität der zugesetzten

Monolipasen kann ausgeschlossen werden, da sich das bekannt sehr wirksame

Multienzymprodukt PK ebenfalls im Screening-Test durch eine vergleichsweise höhere

Effektivität als in früheren Studien auszeichnete (71,4 – 83,3 % Rfe-sV vs. 85,0 – 87,8 %

Rfe-VR).

Fazit: Insgesamt kann der Schluss gezogen werden, dass alle erhobenen Parameter zur

Rangierung der Lipasen geeignet sind. Die im Screening-Verfahren mittels Rohfett-

Verschwindensrate aufgestellte Rangierung war demnach anhand aller verglichenen

Parameter (exklusive Cr2O3-Wdf.) nachzuvollziehen.

4.2.3 Korrelieren die Ergebnisse aus dem Schnelltest für Lipasen mit denen aus etablierten Verdaulichkeitsuntersuchungen?

Bei Vergleich der Ergebnisse des Lipase-Screenings mit Ergebnissen aus herkömmlichen

Gesamtverdaulichkeitsversuchen ausgewählter Enzyme (KARTHOFF (2004) und

BECKER (2005)) wurde lediglich der Parameter Rfe-Verschwindensrate ausgewertet.

Anschließend wurde die im Screening aufgestellte Rangierung der Testenzyme E3 und E4

anhand weiterer Parameter überprüft.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

143

4.2.3.1 Vergleich der Ergebnisse des Screening-Tests mit denen herkömmlicher Gesamtverdaulichkeitsstudien

In einem ersten Schritt (s. 3.1.6 bis 3.1.8) wurde ein Lipase-Screening-Test unter

Verwendung des bekannten Multienzymproduktes PK entwickelt.

In einem zweiten Schritt wurde das neue Testverfahren an fünf Lipasen fungaler Herkunft

überprüft.

Da lediglich geringe Mengen der Testenzyme vorlagen, war es jedoch unmöglich,

klassische Verdaulichkeitsversuche, die eine mehrtägige Anfütterungsphase erfordern,

durchzuführen. Deshalb kamen für den Vergleich der Methoden nur die Monolipasen E3

und E4 in Betracht, die bereits in früheren herkömmlichen Verdaulichkeitsstudien

untersucht worden waren (KARTHOFF 2004; BECKER 2005). Bei dem Vergleich mit

Ergebnissen klassischer Verdaulichkeitsversuche sind mehrere Unterschiede im

Versuchsablauf zu beachten: In den vorangegangenen Studien des Projektes

„pankreasgangligiertes Minischwein“ wurden die Enzyme E3 und E4 in ähnlicher, jedoch

nicht identischer Dosierung eingesetzt: Die Lipase E3 wurde in 100 000 IE und die Lipase

E4 in 110 000 IE lipolytischer Einheiten dosiert. Des Weiteren befand sich zu dem

damaligen Zeitpunkt noch keine Flüssigmahlzeit als Testdiät im Einsatz. Stattdessen

wurde die Standard-Fettdiät des Projektes mit einem Fettanteil von 30 % (2x täglich, 250g

uS, ca. 70 g Rfe / Mahlzeit) verabreicht. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte von

Einzelwerten, die an je sechs pankreasgangligierten Tieren im Rahmen einer fünftägigen

Gesamtverdaulichkeitsuntersuchung ermittelt wurden. Da aber sowohl Versuchsdesign als

auch Versuchsdiät in den beiden Gesamtverdaulichkeitsstudien absolut vergleichbar

waren und nahezu identische Tiergruppen verwendet wurden, ist ein direkter Vergleich der

Ergebnisse und eine Rangierung der beiden Enzyme anhand ihres Einflusses auf die

Fettverdaulichkeit trotz zeitlicher Differenz zwischen den Versuchen zulässig.

Dieser Versuch einer Validierung kann und soll daher keinen direkten Vergleich zwischen

Screening-Verfahren und etablierter Gesamtverdaulichkeitsstudie darstellen, sondern

lediglich der Überprüfung dienen, inwiefern die anhand der Ergebnisse im Screening-Test

vorgenommene Rangierung mit der aus klassischen Verdaulichkeitsuntersuchungen

übereinstimmt.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

144

Die im Lipase-Screening-Test ermittelte Überlegenheit von Lipase E3 gegenüber Lipase

E4 bezüglich einer positiven Beeinflussung der Fettverdaulichkeit in der höchsten

Dosierung (E3: 68,6 % / E4: 60,3 %) war ebenfalls in der Ermittlung der Rohfett-

Gesamtverdaulichkeit erkennbar geworden (s. Abbildung 33; E3: 51,1 % / E4: 43,2 %).

Somit konnte die im Screening-Test aufgestellte Rangierung von etablierten

Verdaulichkeitsstudien bestätigt werden.

Rfe-Verschwindensrate (VR) Rfe-Verdaulichkeit (sV) (Lipase-Screening) (Gesamtverdaulichkeit)

19,1 20,9 37,9 39,9 68,6 60,3 1 51,1 43,20

10

20

30

40

50

60

70

80

%

Kleinbuchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den drei Dosierungen eines Enzyms

Großbuchstaben kennzeichnen Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen gleicher Dosierung

Abbildung 33: Vergleichende Darstellung der Rohfett-Verschwindensrate von E3 zu E4 in Dosierungen 1-3 sowie die Rohfett-Verdaulichkeit von E3 zu E4 in einer Dosierung

Im vierten Schritt sollte anhand weiterer Parameter geprüft werden, ob die im Screening

bezüglich der Rohfett-Verschwindensrate aufgestellte und in der klassischen

Verdaulichkeitsuntersuchung verifizierte Rangierung (E3 > E4) durch weitere Parameter

bestätigt werden konnte: Zu diesem Zwecke wurden Ergebnisse des Screenings für die

Parameter Trockensubstanz-Anflutung, Rohfett-Anflutung, Cr2O3-Wiederfindung,

Trockensubstanz- und Rohfett-Verschwindensrate in drei Dosierungen gegenübergestellt

E3

aA

E4

aA

E3

aA

E4

abA

E3

cA E4

bA E3

B E4 C

D1 (500 IE) D2 (5 000 IE) D3 (75 000 IE) 110 000 IE 100 000 IE

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

145

(s. Tabelle 80). Auch wenn innerhalb der einzelnen Dosierungen keine signifikanten

Unterschiede zwischen den Monolipasen E3 und E4 verzeichnet wurden, zeigte sich für

alle verglichenen Parameter immer die gleiche Tendenz: in Bezug auf die

Trockensubstanz-Anflutung und Rohfett-Anflutung wurden nach Einsatz des Enzyms E3 in

allen Fällen höhere Werte als für E4 ermittelt (Ausnahme: Rfe-Anflutung in Dosierung D3

gleiches Niveau: E3: 9,03 g / E4: 9,13 g). Für die Trockensubstanz-Verschwindensrate

und Rohfett-Verschwindensrate erreichte die Lipase E3 lediglich in Dosierung D3 höhere

Werte als Enzym E4, da in den niedrigeren Dosierungen (D1 und D2) nahezu gleiche

Werte auftraten. Anhand der übrigen Parameter war es nicht möglich, die Effekte der

Lipasen E3 und E4 eindeutig zu unterscheiden, da zumeist sehr ähnliche Werte erreicht

wurden z.B. Rohfett-Anflutung (g) in der Dosierung D3 für Lipase E3 (9,03 g) und für

Lipase E4 (9,13 g; s. Tabelle 80).

Die Berechnung der Rohfett-Verschwindensrate ist also ein aussagekräftiger Parameter

zur Einschätzung von Lipasen bezüglich ihrer In-vivo-Wirksamkeit (s. o.).

Tabelle 80: Vergleichende Darstellung der Screening-Test-Ergebnisse für die Parameter TS-Anflutung (g), Rfe-Anflutung (g), Cr2O3-Wiederfindung (%), TS-Verschwindensrate (%) und Rfe-Verschwindensrate (%) der Testenzyme E3 und E4

TS-Anfl. (g) Rfe-Anfl. (g) Cr2O3 (%) TS-VR (%) Rfe-VR (%)

E3 59,6 ± 12,8 28,9 ± 8,05 68,5 ± 19,4 39,5 ± 9,26 17,9 ± 4,01 D1

E4 46,7 ± 3,46 23,9 ± 3,00 58,4 ± 7,45 45,0 ± 7,26 20,8 ± 1,19

E3 51,7 ± 14,7 20,9 ± 6,64 64,3 ± 7,00 45,7 ± 11,3 37,6 ± 15,3 D2

E4 36,0 ± 10,3 15,5 ± 5,04 49,8 ± 13,7 50,7 ± 5,99 39,8 ± 8,93

E3 28,9 ± 8,32 9,03 ± 3,95 55,3 ± 3,83 64,8 ± 8,16 68,6 ± 13,1 D3

E4 27,0 ± 5,30 9,13 ± 0,82 47,3 ± 15,2 59,8 ± 6,35 60,3 ± 12,0

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

146

Die im Screening-Test aufgestellte Rangierung bezüglich der Rohfett-Verschwindensrate

wurde auch durch die Ergebnisse der Gesamtverdaulichkeitsuntersuchungen bestätigt.

Für die Enzyme PK, E3 und E4 war beim Vergleich der Ergebnisse der

Gesamtverdaulichkeitsuntersuchungen mit denen der Screening-Tests folgendes

beobachtet worden (s. Abbildung 34):

• Die Ergebnisse beider Verfahren ergaben eine übereinstimmende Rangierung

der Enzyme beobachtet: PK ≥ E3 ≥ E4.

• Generell überstieg die Rohfett-Verschwindensrate die Werte der Rohfett-

Verdaulichkeit (Effekt der flüssigen Darreichungsform gegenüber der

herkömmlichen breiförmigen Standard-Fettdiät, s. o.). Es ist jedoch zu

berücksichtigen, dass es sich um ein gänzlich anderes Versuchsdesign handelte

und somit identische Werte auch nicht zu erwarten waren.

• Die Gesamtheit der Kurven des einen Verfahrens war der des anderen

Verfahrens im Verlauf geometrisch ähnlich, d. h. dass sich das Verhältnis der

Gesamtheit der Kurven beider Verfahren in der Anordnung der Kurven

zueinander ähnelte.

• Wie bereits beschrieben, unterschieden sich die Effekte der Lipasen E3 und E4

in der niedrigen und mittleren Dosierung des Screening-Tests nur unwesentlich.

Obwohl die Testlipase E4 in der Gesamtverdaulichkeitsstudie aufgrund von

Umrechnungsfaktoren geringgradig höher dosiert war als das Multienzymprodukt PK

und die Testlipase E3, wurden für E4 niedrigere Rohfett-Verdaulichkeiten ermittelt.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

147

Abbildung 34: Vergleich Gesamtverdaulichkeitsstudie (durchgezogene Linien) versus Screening-Test (gestrichelte Linien) für die Enzyme PK, E3 und E4

4.2.3.2 Vergleich der im Screening-Verfahren aufgestellten Rangierung mit In-vitro-Ergebnissen

In einem In-vitro-Modell zur Testung von Lipasen wurde die Fähigkeit der Enzyme

untersucht, Trigylceride in freie Fettsäuren (FFS) zu spalten. Damit wurde versucht,

Voraussagen über die potentielle In-vivo-Effektivität der Lipasen zu treffen. Die Lipase E2

wurde in diesen Verfahren nicht getestet. Mit Ausnahme der Testlipase E5 ergab die

ermittelte Aktivitätskurve im In-vitro-Verfahren eine mit den In-vivo-Ergebnissen

übereinstimmende Rangierung: Die Testlipasen E1, E3 und E4 verliefen im unteren

Dosierungsbereich sehr ähnlich, während das Enzym E3 im oberen Dosierungsbereich

tendenziell höhere Werte erreichte als E4. Somit bestätigten sich die im Screening-Test

festgestellten geringen Unterschiede zwischen den beiden Lipasen. Die Werte der

Testlipase E5 stiegen nach anfänglich geringen Werten im Verlauf deutlich an und

beschrieben eine sigmoide Kurve. Demgegenüber war bei den anderen Testlipasen ein

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000

Logarhythmische Lipase-Einheiten (FIP / Mahlzeit)

Hyd

roly

sepr

oduk

te F

FS (%

)

PK sV (“klassisch”) PK VR (Screening)E3 sV (“klassisch”) E3 VR (Screening)E4 sV (“klassisch”)E4 VR (Screening)

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

148

annähernd linearer Verlauf zu erkennen, der bei ca. 100 mg ein Plateau erreichte. Beim

Vergleich der Kurven ab ca. 50 mg Enzym entstand folgende Rangierung: E5 > E1 > E3 >

E4.

Abbildung 35: In-vitro-Effektivität für die Testlipasen E1, E3, E4 und E5

Dieser Kurvenverlauf war vergleichbar mit den Beobachtungen des Screening-Tests (s.

o.). Allerdings wurde E5 aufgrund seiner bekannt niedrigen Aktivität (ca. 6 % Aktivität von

E3) um das ca. 17fache höher dosiert (POTTHOFF 2005), so dass für E5 keine direkte

Vergleichbarkeit gegeben war.

Tabelle 81: Lipolytische Aktivitäten der Monolipasen E1, E3, E4 und E5 (spezifische Aktivität IE / g Protein

Testlipase E1 E2 E3 E4 E5

IE / g Protein 3 600 000 3 700 000 3 700 000 4 200 000 220 000

in-vitro-Modell

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 10 100 1000mg Enzyme / 250 g meal

Hyd

roly

sepr

oduk

te F

FS (m

M)

E1 E3 E4 E5

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

149

Die Monolipase E5 wurde trotz geringer Hydrolyseaktivität im In-vivo-Screening in einer

mit den anderen Testenzymen vergleichbaren Dosierung eingesetzt, da die Lipase sich in

den In-vitro-Tests als besonders gallensalz- und pepsinstabil gezeigt hatte (POTTHOFF

2005). Allerdings konnte auch In-vivo die hohe Stabilität nicht die niedrige Aktivität der

Lipase ausgleichen. Ob der Einsatz des Enzyms E5 in wesentlich höheren Dosierungen

sinnvoll ist, muss allerdings hinterfragt werden, da einer der besonderen Vorteile des

Einsatzes mikrobieller Produkte die drastische Reduktion der Enzymmengen (SUZUKI et

al. 1997, 1999) sein sollte. Es also zu bedenken, inwiefern E5 unter diesen Zielvorgaben

gegenüber den anderen Testlipasen konkurrenzfähig ist (GRIFFIN et al. 1989;

MORRISON et al. 1992; SANTINI et al. 2000). Andererseits ist die außerordentliche

Gallensalz- und Pepsinstabilität von E5 im Rahmen einer Weiterentwicklung zukünftiger

Optimierungen ein interessanter Ansatz.

4.2.3.3 Kombinationsversuch

Eine im Screening-Test erfolgreich getestete Lipase sollte auch auf ihre Stabilität

gegenüber Proteasen geprüft werden: Bei isolierter Prüfung der Wirksamkeit von Lipasen

besteht die Problematik, dass eine eventuelle Empfindlichkeit gegenüber proteolytisch

wirksamen Enzymen nicht beurteilt werden kann. Die bekannte Sensitivität von Lipasen

gegenüber Proteasen, verstärkt durch die bei EPI häufig vorliegenden tiefen pH-Werte,

wurde bereits von THIRUVENGADAM u. DIMAGNO (1988) u. LAYER et al. (1990)

beschrieben.

Da das Ziel des Gesamtprojektes die Entwicklung eines Multienzymproduktes ist, sollte

die Lipase in Kombination mit Proteasen und Amylasen geprüft werden. Zu diesem

Zwecke wurden eine Protease und eine Amylase der Wirksamkeitsstudien von BECKER

(2005) mit der Testlipase E3 des hier vorgestellten Lipase-Screenings gemeinsam

eingesetzt. Das Auswahlkriterium der Lipase war vor allem die Verfügbarkeit

ausreichender Mengen, so dass hier leider nicht die effektivste Monolipase verwendet

werden konnte. Auch in diesem Versuch konnten dosisabhängige Effekte hinsichtlich der

Anflutungen und Verschwindensraten von Trockensubstanz und Rohfett ermittelt werden.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

150

Im Vergleich der Ergebnisse mit denen von E3 im singulären Lipase-Screening ergaben

sich vergleichbare Werte bzw. lediglich geringfügig geringere Rohfett-Verschwindensraten

im Kombinationsversuch (s. Abbildung 36, Abbildung 37, Tabelle 82).

Tabelle 82: Angeflutete Menge an Trockensubstanz und Rohfett im Kollektionsintervall 0-8 Stunden nach Farbwechsel im Kombinationsversuch

Tier 43 56 82

IE 500 5 000 75 000 500 5 000 75 000 500 5 000 75 000

TS-Anfl. 43,6 45,9 27,5 52,9 51,4 37,8 61,0 47,5 45,1

Rfe-Anfl. 19,8 22,6 7,83 23,6 22,7 12,1 26,3 23,6 24,6

Cr2O3 60,4 67,3 54,9 44,7 59,0 49,3 62,5 64,4 86,1

TS-VR 40,3 47,9 53,1 33,6 47,1 62,1 33,5 51,7 64,3

Rfe-VR 24,4 34,7 57,2 14,2 25,7 69,2 18,6 31,8 44,7

Abbildung 36: Kombination Lipase E3 + Abbildung 37: Lipase E3 im Lipase-Screening Protease + Amylase im Lipase-Screening

19,1 30,7 57,00

20

40

60

80

100

500 IE 5 000 IE 75000 IE

17,9 37,6 68,6 0

20

40

60

80

100

500 IE 5 000 IE 75000 IE

Demzufolge lassen die Ergebnisse des Kombinationsversuches den Schluss zu, dass die

geprüfte fungale Monolipase gegenüber Proteasen bemerkenswert stabil zu sein scheint.

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

151

Der Vergleich verschiedener Verfahren mit dem Lipase-Screening-Test erlaubt

folgendes Fazit:

• Zwischen den im In-vitro- und im Screening-Verfahren erhobenen Werten konnte

eine enge Korrelation bezüglich der Rangierung von Enzymen festgestellt werden.

o Die im Screening-Verfahren aufgestellte Rangierung der Monolipasen

bestätigte demzufolge die Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen.

• Es konnte eine gute Übereinstimmung der Screening-Test-Ergebnisse mit

herkömmlichen Gesamtverdaulichkeitsuntersuchungen ermittelt werden.

• Die Kombinationsversuche bestätigen zudem, dass nur unwesentliche Abstriche

bezüglich der Lipase-Wirksamkeit der eingesetzten Lipasen Amylase und Protease

zu erwarten sind.

4.3 Ausblick

Nach der Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit wurde ein Lipase-Screening-

Verfahren etabliert, mit welchem fünf mikrobielle Monolipasen vergleichend auf ihre In-

vivo-Wirksamkeit hin untersucht und entsprechend rangiert wurden. Werden die

Ergebnisse der neu entwickelten Methode mit Ergebnissen aus In-vitro-Studien ergänzt,

ist es möglich, erfolgversprechende Lipasen frühzeitig und gezielt auszuwählen. Somit

können die zeitaufwändigen herkömmlichen Verdaulichkeitsstudien auf ein Minimum

beschränkt werden, da eine weitergehende Testung lediglich für die effektivsten und

stabilsten Enzyme durchgeführt werden muss. Außerdem können die ersten In-vivo-

Untersuchungen der Enzyme zu einem viel früheren Entwicklungszeitpunkt eines neuen

Produktes stattfinden, da für den Screening-Test vergleichsweise geringere

Enzymmengen benötigt werden. Da mit der Entwicklung des Lipase-Screenings nun

Schnelltest-Verfahren für alle drei Gruppen der Verdauungsenzyme vorliegen (Amylase-

und Protease-Screening siehe BECKER 2005), besteht die Möglichkeit, die Effektivität von

Monopräparaten beispielsweise für die Auswahl eines mikrobielles Multienzymproduktes

innerhalb eines wesentlich verkürzten Zeitraumes zu beurteilen. Durch das beschriebene

Verfahren des Lipase-Screening-Tests wird eine Rangierung der untersuchten Enzyme im

direkten Vergleich ermöglicht. Die Ergebnisse sind dabei nicht als absolute Werte zu

DISKUSSION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

152

verstehen, sondern stellen lediglich eine vergleichende Bewertung der Testenzyme

untereinander dar.

Als Ziel bleibt die Entwicklung eines Schnell-Test-Verfahrens zur gleichzeitigen Prüfung

von Amylasen, Proteasen und Lipasen bestehen (BECKER 2005). Der unter Punkt 4.2.3.3

beschrieben Kombinationsversuch, in welchem die Testmahlzeit des Lipase-Sreenings

genutzt wurde, könnte hierzu als Ansatz dienen. Die Versuchsmahlzeit müsste dann mit

einem höheren Stärke- und Proteingehalt modifiziert werden, um die Effektivität von

Proteasen und Amylasen hinreichend quantifizieren zu können.

4.4 Schlussfolgerungen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Screening-Test zur zeit-, kosten- und

arbeitssparenden Untersuchung von Lipasen entwickelt. Bei Anwendung dieser Methode

werden bedeutend geringere Enzymmengen (lediglich ca. 2 %) im Vergleich zu etablierten

Verdaulichkeitsstudien benötigt. Deshalb ist es mit dieser Methode möglich, erste In-vivo-

Untersuchungen zu einem früheren Zeitpunkt in der Entwicklungsphase neuer

Verdauungsenzyme durchzuführen. Aufgrund des beschleunigten Verfahrens kann

darüber hinaus der Einsatz von Versuchstieren reduziert werden.

Durch die Entwicklung der Lipase-Screening-Methode besteht nun die Möglichkeit,

verschiedene Lipasen mit bisher unbekannter In-vivo-Wirkung durch Applikation einer

einzigen Versuchsmahlzeit auf ihre Effektivität hinsichtlich ihres Einflusses auf die

Rohfettverdaulichkeit vergleichend zu untersuchen.

Die Testergebnisse des Screenings stimmen mit den Ergebnissen aus In-vitro- und

klassischen (aufwändigeren) Verdaulichkeitsversuchen hinsichtlich einer Rangierung der

getesteten Enzyme überein. Nach einer Vorselektion durch das In-vivo-Screening-

Verfahren sollten „erfolgversprechende“ Lipasen mit weiterführenden klassischen

Verdaulichkeitsstudien näher quantifiziert werden.

Infolge des hier etablierten Screening-Verfahrens besteht in Zukunft die Möglichkeit, die

vorklinische Entwicklungsphase pharmazeutischer Neuentwicklungen deutlich zu

verkürzen und aufgrund der frühzeitigen Vorselektion die Ausgaben für abgebrochene

Projekte (s. 2.4.1: entsprechen 70 % der Gesamtkosten) zu reduzieren.

ZUSAMMENFASSUNG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

153

5 Zusammenfassung

Sonka Zantz

Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung substituierter Lipasen im Modell pankreasgangligiertes Miniaturschwein

Die Substitution von Verdauungsenzymen stellt die entscheidende Möglichkeit für die

Behandlung einer exokrinen Pankreasinsuffizienz (EPI) dar. Vor diesem Hintergrund

verständlich zielten die eigenen Untersuchungen auf die Entwicklung eines In-vivo-

Schnelltests zur Wirksamkeitsprüfung neuer Enzyme bei Verfügbarkeit nur geringer

Enzymmengen. Basierend auf dem von BECKER (2005) erfolgreich etablierten Screening-

Test für Amylasen und Proteasen sollte in der vorliegenden Arbeit ein Schnelltest für Lipasen entwickelt werden. Hierbei ging es zunächst um die Entwicklung einer geeigneten

Testmahlzeit, darauf folgten vergleichende Untersuchungen zur Wirksamkeit neuer

Lipasen, in denen ein bekannt wirksames Multienzymprodukt als Positivkontrolle zum

Einsatz kam. Ziel des Schnelltests war eine vergleichende Bewertung verschiedener

Lipasen, um Weiterentwicklung und Produktion größerer Enzymmengen nur auf die

erfolgreichsten Neuentwicklungen beschränken zu können.

Für die In-vivo-Untersuchungen standen insgesamt 10 adulte weibliche Göttinger

Miniaturschweine mit ileocaecaler Umleitungsfistel zur Verfügung. Zur Auslösung einer

EPI war bei 7 Tieren der Ausführungsgang des Pankreas ligiert worden (PL-Tiere),

wohingegen die übrigen 3 Tiere als Kontrolltiere (KT) dienten. Die Analyse des

Rohnährstoffgehaltes der Futtermittel erfolgte nach den Vorschriften zur Weender-Analyse

von NAUMANN u. BASSLER (2004). Die Chromoxidbestimmung wurde nach PETRY u.

RAPP (1970) durchgeführt. Die Analyse des Fettgehaltes der Futter- und Chymusproben

fand unter Verwendung der Geräte der Firma Ankom Technology Corporation® (AnkomHCl

Hydrolysis System und AnkomXT15 Extraktor) statt, wobei zuvor eine Validierung der

Methoden durchgeführt wurde.

Basis der Testmahlzeit war ein flüssiges Nahrungsergänzungsmittel, das im Rahmen der

Optimierung einer einmalig zu applizierenden markerhaltigen Testmahlzeit modifiziert


154

wurde. Die Versuchsmahlzeit wurde insbesondere hinsichtlich des Fettgehaltes verändert,

so dass sie schließlich aus (g / kg Trockensubstanz (TS)): 351 Rohfett (Rfe); 76,9

Rohprotein (Rp); 46,3 Rohfaser (Rfa); 22,8 Rohasche (Ra); 2,5 Cr2O3 bestand. Diese

flüssige Testmahlzeit (ca. 150 g TS) wurde lediglich am Morgen des Versuchstages

verabreicht, während sonst das übliche Mischfutter (g / kg TS: 49,8 Rfe / 189 Rp / 477

Stärke / 30,3 Rfa / 53 Ra) ohne Enzymzulage zum Einsatz kam. Am Vorabend des

Versuchstages wurden anstelle des o. g. Mischfutters 400 ml einer fettfreien Trinkmahlzeit

(g /100 ml: 525 KJ / 3,75 Rp / 27,5 KH / 5,5 Zucker / 0 Rfe / 1 Rfa / 80 ml H2O) angeboten.

Die Chymuskollektion begann mit der Anflutung der durch den Marker farblich

gekennzeichneten Testmahlzeit an der ilealen Fistel und endete 8 Stunden später. In

diesem neu entwickelten Lipase-Screening wurden fünf verschiedene Monolipasen

mikrobiellen Ursprungs (E1 - E5) in drei verschiedenen Dosierungen (500, 5 000 und

75 000 IE) geprüft. Hierzu wurde das von BECKER (2005) entwickelte Versuchsdesign

(Fütterungs-, Kollektions- und Versuchsintervalle) angewandt.

Die Beurteilung der Wirksamkeit der zugelegten Lipasen nach einmaliger Verabreichung

der Testmahlzeit erfolgte anhand nachstehender Parameter: absolute TS- und Rfe-

Anflutung, Rfe-Konzentration im Chymus, Rfe / Cr2O3-Verhältnis und kalkulierte

Verschwindensraten (VR) für TS und Rfe. Eine Korrelation zwischen Ergebnissen im

Schnelltest und denen klassischer Verdaulichkeitsstudien wurde anhand von Daten bereits

vorgenommener Untersuchungen geprüft.

1. Die optimierte Testmahlzeit führte zu einer homogenen Chymusanflutung am

terminalen Ileum. Anhand paralleler relativer Flussraten von Trockensubstanz,

Rohfett und Marker konnte eine Entmischung der Komponenten weitestgehend

ausgeschlossen werden. Der „grüne“ Chymus der Testmahlzeit flutete regelmäßig

4 - 6 Stunden ppr. am Ileumende an, so dass von einer zügigen Magen-

Dünndarmpassage auszugehen war. Infolge des hohen Fettgehaltes (34,6 % der

Testmahlzeit) war es trotz der flüssigen Darreichungsform möglich, PL-0-Tiere von

gesunden Kontrolltieren zu unterscheiden (Rfe-VR: PL-0-Tiere 10,8 %; KT 86,4 %).

2. Der Lipase-Screening-Test wurde eingesetzt, um fünf Monolipasen vergleichend

einer ersten In-vivo-Wirksamkeitsprüfung zu unterziehen. Dabei konnten für alle

Enzyme bezüglich der Rfe-VR (und weiterer erhobener Parameter) dosisabhängige

Effekte ermittelt werden. In der höchsten Dosierung erreichten mehrere Enzyme


155

das Niveau des bekannt hochwirksamen Multienzymproduktes PK, wobei die

Rangierung PK, E1, E3, E5, E2, E4 entstand. In den verschiedenen Dosierungen

waren produktabhängige Unterschiede zu erkennen, wobei in allen

Untersuchungen PK und E1 tendenziell den anderen Testenzymen überlegen

waren (Rfe-VR (%): PK 83,5; E1 77,0; E3 68,6; E5 65,0; E2 61,5; E4 60,1). Für die

meisten Parameter (s. o.) konnte eine übereinstimmende Rangierung der fünf

Testlipasen und des Multienzymproduktes PK erstellt werden.

3. Um die im Lipase-Screening-Test ermittelte Rangierung abzusichern, wurde auf

Ergebnisse aus früheren Studien zur Gesamtverdaulichkeit zurückgegriffen, in

denen zwei (E3 und E4) der fünf Testlipasen eingesetzt wurden. Zusätzlich wurden

Ergebnisse aus In-vitro-Verfahren mit denen des Screening-Tests verglichen. Die

verschiedenen Verfahren ergaben dabei eine übereinstimmende Rangierung; stets

war das Testenzym E3 in seiner Wirksamkeit dem Produkt E4 überlegen.

Schlussfolgerung: Der im Rahmen dieser Studie neu entwickelte In-vivo-Screening-Test

zur vergleichenden Beurteilung von Lipasen erlaubte eine Differenzierung der Enzyme

anhand ihrer Wirksamkeit.

Diese ergänzende Methode stellt dabei keinen vollständigen Ersatz für herkömmliche

Verdaulichkeitsstudien dar, sondern ein Verfahren, mit Hilfe dessen innerhalb kürzester

Zeit (nach einmaliger Fütterung der Testmahlzeit mit Enzymzulage) und unter minimalem

Enzymverbrauch eine erste Einschätzung der Wirksamkeit neu entwickelter Lipasen

möglich ist. Die in dem Screening-Test ermittelte erste In-vivo-Bewertung erlaubt damit

eine gezielte Vorauswahl effektiver Enzyme, deren weitere Entwicklung und Produktion

forciert werden kann.

SUMMARY ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

156

6 Summary

Sonka Zantz

Development of a novel In-vivo screening test to assess the efficacy of substitute lipases in pancreatic duct ligated minipigs.

The substitution of digestive enzymes is an essential treatment of pancreatic exocrine

insufficiency (PEI). The aim of the present investigation was to develop an In-vivo lipase screening test, which requires only small amounts of enzymes to estimate enzyme

efficacy. The test which was developed was based on BECKER’s (2005) successfully

established protease and amylase screening tests. At first it was necessary to select a

suitable test diet. The assay was then established using different doses of a well known

and highly potent standard multienzyme product (PK). In a third step the efficacy of 5

microbial lipases were compared to each other and to that of the standard product.

The studies were performed in 10 female Göttingen Minipigs all fitted with an ileo-caecal-

reentrant fistula. Additional pancreatic exocrine insufficiency was induced by ligation of the

pancreatic duct (PL-animals) in 7 of them. The remaining 3 pigs served as controls (KT-

animals). The test diet and the chyme samples were analysed for crude nutrients

according to standard VDLUFA methods (NAUMANN u. BASSLER 2004). Chromic oxide

Cr2O3 was analysed after PETRY u. RAPP (1970). For the analysis of crude fat Ankom

Technology Corporation® was used, a method which was validated in this study.

The test diet was based on a liquid nutritional supplement called “Calshake®”, which was

optimised for single lipase dose application mainly with respect to crude fat content and

homogeneity. The final test diet contained (g / kg) 351 crude fat (cfa); 76,9 crude protein

(cp); 46,3 crude fibre (cfi); 22,8 crude ash (ca); 2,5 Cr2O3. This liquid test meal (ca. 150 g

DM), into which the test enzymes were mixed, was given only once, on the morning of

each trial day, while in the evenings of the trials and on all other days the pigs were fed a

regular diet (g / kg DM: 49,8 cfa / 189 cp / 477 st / 30,3 cfi / 53 ca) without enzymes. An

exception was the evening meal given 12 hours before starting each trial: instead of the

regular diet a fat-free liquid meal was offered (ProvideXtra® g /100 ml: 525 KJ / 3,75 cp /

27,5 carbohydrates / 5,5 sugar / 0 cfa / 1 cfi / 80 ml H2O). The chyme collection was

SUMMARY ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

157

started individually for each pig with the arrival of the Cr2O3 (green) labelled chyme of the

test diet at the ileal fistula and was finished after an 8-hour-chyme collection. The dose-

dependency of a standard multienzyme product (PK) on fat digestibility was investigated

and three doses (500, 5000, 75000 IU) selected. Five unknown microbial lipases (E1 – E5)

were then assayed in this newly developed lipase screening test using the same three

doses (500, 5000 and 75000 IU). Therefore the same trial design used by BECKER (2005)

(feeding, collection and time schedule for testing) was used in this screening test.

After single dose application of the test diet the efficacy of the lipases was estimated

according to the following parameters: absolute DM- and cfa- appearance and

disappearance rate and the relationships between them. The results of the screening test

with two of the microbial and the standard lipase supplement were compared to results in

previously performed standard total digestibility trials.

1. By calculating parallel flow rates it could be excluded that there was separation of

the diet’s components (DM, cfa and marker). The “green” chyme of the test diet

flowed regularly 4 to 6 hour postprandial at the ileal fistula. Although the cfa

digestibility was improved by using a liquid test diet, marked differences were

observed between PL- and KT-animals (Rfe-VR: PL-0-Tiere 10,8 %; KT 86,4 %),

due to the high fat content of the diet (34,6 %). The conspicuous green colour of the

marker, Cr2O3, was used as a signal to determine the time of arrival of the test meal

at the ileal fistula and to separate this from earlier meals (brown chyme). Thus the

marker indicated the ileal arrival of the test diet and the beginning of the 8 hour

chyme collection.

2. The standard multienzyme product PK caused a dose-dependent improvement in

cfa digestibility. Subsequently, the screening test was used to compare the in-vivo-

efficacy of five microbial lipases. For all five enzymes dose-dependent responses

were measured. Several lipases approached the level of efficacy of PK at the

highest dosage used, although differences were observed at the low and medium

dosages. Nevertheless in all trials PK and E1 tended to show higher potency than

the other enzymes (Rfe-VR: PK 83,5 %; E1 77,0 %; E3 68,6 %; E5 65,0 %; E2 61,5

%; E4 60,1 %;). The five test lipases and PK showed a corresponding ranking of

most parameters. The following tendentious ranking demonstrates the precaecal

cfa disappearance rate (highest dosage): PK, E1, E3, E5, E2, E4

SUMMARY ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

158

3. The ranking of selected lipases in the screening test compared well to results

observed in standard efficacy studies by KARTHOFF (2004) and BECKER (2006,

personal communication). Thus for PK and the test lipases E3 and E4 the same

ranking was ascertained in total digestibility studies. Furthermore, an in-vitro-

digestibility model yielded a similar ranking of lipases (exception: E5). Because of

different trial conditions E5’s in-vivo-results were not directly comparable.

Conclusion: A screening test has been established that allows differentiation and

selection of lipases according to their efficacy in-vivo. The results of the screening test

compare well to findings in standard in-vivo-digestibility trials and additional in-vitro-

assays. This lipase screening test is not a replacement for standard digestibility trials, but

is to be used as a way to estimate the in-vivo-efficacy of substituted enzymes with a

minimum of time and enzyme consumption. This allows preliminary selection of effective

enzymes, whose efficacy has still to be properly quantified in standard digestibility trials.

LITERATURVERZEICHNIS ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

159

7 Literaturverzeichnis

ABELLO J., X. PASCAUD, C. SIMONES-NUNES, J. C. CUBER, J. L. JUNIEN u. C. ROZE (1989): Total pancreatic insufficiency in pigs: A model to study intestinal enzymes and plasma levels of digestive hormones after pancreatic supplementation by a whole pancreas preparation. Pancreas 4, Nr. 5, 556-564 ABRAMS, J., M. HAMOSH, S. K. DUTTA, V. S. HUBBARD u. P. HAMOSH (1987): Role of nonpancreatic lipolytic activity in exocrine pancreatic insufficiency. Gastroenterol. 92, 125-129 ALLIANCE PHARMACEUTICAL CORPERATION (2006): Phases of Product development 2006 AMMAN, R. W., H. BUEHLER, R. MUENCH, A. W. FREIBURGHAUS u. W. SIEGENTHALER (1987): Differences in the natural history of idiopathic (nonalcoholic) and alcoholic chronic pancreatitis. Pancreas 2, 368-377 ANDERSON, D. M. u. R. W. ASH (1971): The effect of ligating the pancreatic duct on digestion in the pig. Proc. Nutr. Soc. 30 (1), 34A-35A ARGENZIO, R. A., J. E. LOWE, D. W. PICKARD u. C. E. STEVENS (1974): Digesta passage and water exchange in the equine large intestine. Am. J. Physiol. 226 (5), 1035-1042 BECKER, C. (2005): Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit substituierter Enzyme (Proteasen und Amylasen) am Modelltier pankreasgangligiertes Minischwein Hannover, Tierärztl. Hochschule, Diss. BEITZ, D. C. u. R. S. ALLEN (1993): Lipid Metabolism. In: M. J. SWENSON u. W. O. REECE (Hrsg.) Duke’s Physiology of domestic animals. 11th ed. Cornell University Press, Ithaca, New York, 453-460


160

BERKHOFF, M., D. GROßNER, R. KLAPDOR, G. KLÖPPEL u. H. v. KROGE (1988): Die intravenös stimulierte Insulinreserve des Pancreas nach experimenteller Pancreasgangligatur beim Schwein – Untersuchungen 2, 4 und etwa 60 Tage nach Ligatur. Langenbecks Arch. Chir. 373, 151-158 BOIVIN, M., S. J. LANSPA, A. R. ZINSMEISTER, V. L. GO u. E. P. DIMAGNO (1990): Are diets associated with different rates of human interdigestive and postprandial pancreatic enzyme secretion? Gastroenteol. 99, 1763-71 BOOK, S. A. u. L. K. BUSTAD (1974): The fetal and neonatal pig in biomedical research. J. Anim. Sci. 38 (5), 997-1002. BRAUDE, R., M. H. NEWPORT u. J. W. G. PORTER (1970): Artificial rearing of pigs. Br. J. Nutr. 24 (3), 827-842 BROWNING, T. (1998): Exocrine pancreatic insufficiency in a cat. Austr. Vet. J. 76 (2), 104-6. BRUNO, M. J., E. B. HAVERKORT, G. N. TYTGAT u. D. J. VAN LEEUWEN (1995): Maldigestion associated with exocrine pancreatic insufficiency: implications of gastrointestinal physiology and properties of enzyme preparations for a cause-related and patient-tailored treatment. Am. J. Gastroenterol. 90 (9), 1383-93. CARRIERE, F., J. A. BARROWMAN, R. VERGER u. R. LAUGIER (1993): Secretion and contribution to lipolysis of gastric and pancreatic lipases during a test meal in humans. Gastroenterol. 105, 876-888 CARRIERE, F., P. GRANDVAL, P. C. GREGORY, C. RENOU, F. HENNIGES, S. SANDER-STRUCKMEIER u. R. LAUGIER (2005): Does the pancreas really produce much more lipase than required for fat digestion? JOP. 6 (3), 206-15 CRANWELL, P. D. u. P. J. MOUGHAN (1989): Biological limitations imposed by the digestive system to the growth performance of weaner pigs. in: J. L. BARNETT u D. P. HENNESSY (Hrsg.).: Manipulating Pig Production II. Australasian Pig Science Association, Werribee, Australia, S. 140-159


161

DECUYPERE, J. A., R. M. DENDOOVEN u. H. K. HENDERICKX (1985): Stomach emptying of milk diets in pigs – A mathematical model allowing description and comparison of the emptying patterns. Prod. 3rd Int. Sem. Dig. Physiol. in the Pig, Copenhagen, 16. – 18.5.1985, S. 51-57 DEGEN, L., D. MATZINGER, J. DREWE u. C. BEGLINGER (2001): The effect of cholecystokinin in controlling appetite and food intake in humans. Peptides 22 (8), 1265-9. DESPORT, J. C., C. JUSTE, B. BEAUFRÈRE u. T. CORRING (1997): The pig as a model in clinical investigation in the exocrine pancreatic insufficiency and of cholesterol crystallisation from bile. in: J. P. LAPLACE, C. FÉVRIER u. A BARBEAU (Hrsg.): 7th Int. Sympos. Dig. Physiol. In Pigs, Saint Malo, 26.-28.5.1997, Proc., S.17-27 DIMAGNO, E. P., V. L. W. GO u. W. H. J. SUMMERSKILL (1973): Relations between pancreatic enzyme outputs and malabsorption in severe pancreatic insufficiency. New Engl. J. Med. 288, 813-815 DIMAGNO, E. P., J. R. MALAGELADA, V. L. W. GO u. C. G. MOERTEL (1977): Fare of orally ingested enzymes in pancreatic insufficiency: comparison of two dosage schedules. New Eng. J. Med. 9, 1318-1322 DIMAGNO, E. P., H. A. REBER u. M. A. TEMPERO (1999): AGA technical review on the epidemiology, diagnosis, and treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma. American Gastroenterological Association. Gastroenterology 117, (6), 1464-84 DIMAGNO, E. P. (2001): Gastric acid suppression and treatment of severe exocrine pancreatic insufficiency. Best Pract Res Clin Gastroenterol 15, 477-86 DIMAGNO, E. P. (2003): Autoimmune chronic panceatitis: a plea for simplification and consistency. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 1 (6), 421-2. DODGE, J. A., J. M. CUSTANCE, M. C. GOODCHILD, S. C. LAING u. M. VAUGHAN (1990): Paradoxical effects of essential fatty acid supplementation on lipid profiles and sweat electrolytes in cystic fibrosis. Br. J. Nutr. 63 (2), 259-271


162

DOBRILLA, G. (1989): Management of chronic pancreatitis. Focus on enzyme replacement therapy. Int. J. Pancreatol. 5 (Suppl.), 17-29. DREYER, J. (1990): In-vitro-Untersuchungen mit der Colon-Simulations-Technik (COSITEC) zum mikrobiellen Stoffwechsel im Dickdarm von Schweinen. Göttingen, Univ., Fachber. Agrarwiss., Diss. DROCHNER, W. (1984): Einfluss wechselnder Rohfaser- und Pektingehalte im Futter auf einige praecaecale und postileale Verdauungsvorgange beim wachsenden Schwein. Fortschr. Tierphysiol. Tierernähr., Band 14 DROCHNER, W. (1987): Untersuchungen zur Verdauung im Dickdarm beim Schwein. Fortschr. Tierphysiol. Tierernähr., Beih. 17 DROCHNER, W. u. H. MEIER (1991): Verdauung organischer Substanzen im Dickdarm verschiedener Haustierarten. Fortschr. Tierphysiol. Tierernähr., Beih. 22 DUTTA, S. K., M. P. BUSTIN, R. M. RUSSELL u. B. S. COSTA (1982): Deficiency of fat-soluble vitamins in treated patients with pancreatic insufficiency. Ann. Intern. Med. 97 (4), 549-52. EHRLEIN, H. J. (2000a): Motorik des Dünndarms. in: W. v. ENGELHARDT u. G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. Enke im Hippokrates Verlag GmbH, Stuttgart, S. 323-327 EHRLEIN, H. J. (2000b): Motorik des Dickdarms. in: W. v. ENGELHARDT u. G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. Enke im Hippokrates Verlag GmbH, Stuttgart, S. 327-333 FASSMANN, C. (2001): Untersuchungen zum Umfang und Lokalisation der Nährstoffverdaulichkeit von fettreichen Rationen bei pankreasgangligierten Schweinen. Hannover, Tierärztl. Hochschule., Diss. FLEMMING, S. E. u. M. M. WASILEWSKI (1984): Using the pig as a tool for studying fermentation in the gut. Nutr. Rep. Int. 30, 825-834


163

FLORES, C. A., P. M. BRANNON, S. A. BUSTAMANTE, J. BEZERRA, K. T. BUTLER, T. GODA u. O. KOLDOVSKY (1988): Effect of diet on intestinal and pancreatic enzyme activities in the pig. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 7, 914-921 FREUDIGER, U. (1971): Die Erkrankung des exokrinen Pankreas des Hundes. Kleintier-Prax. 16, 210-228 FREUDIGER, U. (1991): Physiologie, Pathologie, Labor und Therapie der exokrinen Erkrankung der Bauchspeicheldrüse beim Hund. Kleintier-Prax. 36, 5-16 FRIESS, H., J. DING, J. KLEEFF, Q. LIAO, P. O. BERBERAT, J. HAMMER u. M. W. BUCHLER (2001): Identification of disease-specific genes in chronic pancreatitis using DNA array technology. Ann. Surg. 234 (6), 769-78 FUENTE-DEGE, A. (2003): Untersuchungen an pankreasgangligierten Schweinen zu Beziehungen zwischen der Verdaulichkeit von Nährstoffen im praecaecalen Bereich und der Verdaulichkeit über den gesamten Verdauungstrakt. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. GOODCHILD, M. C. u. J. A. DODGE (1986): Biochemical basis of cystic fibrosis. Nature 323 (6087), 400 GRABOWSKI, H. (2004): Are the economics of pharmaceutical research and development changing?: productivity, patents and political pressures. Pharmacoeconomics 22 (Suppl 2), 15-24. GRAHAM, D. Y. (1977): Enzyme replacement therapy of exocrine pancreatic insufficiency in man Relation between In-vitro Enzyme activities and In-vivo Potency in Comercial Pancreatic Extracts. New Engl. J. Med. 296, Nr. 23, 1314-1317 GREGORY, P. C. (2006): Persönliche Mitteilung. Solvay Pharmaceuticals Deutschland, Hannover


164

GRIFFIN, S. M., D. ALDERSON u. J. R. FARNDON (1989): Acid resistant lipase as replacement therapy in chronic pancreatic exocrine insufficiency: a study in dogs. Gut 30, 1012-1015 HASHOLT, J. (1972): Atrophy of the pancreas in budgerigars. Nord. Vet. Med. 24 (9), 458-61. HAYAKAWA, T., T. KONDO, T. SHIBATA, Y. SUGIMOTO u. M. KIAGAWA (1989): Chronic alcoholism and evolution of pain and prognosis in chronic pancreatitis. Dig. Dis. Sci. 34, 33-8 HELDT, D. (2001): Untersuchungen am pancreasgangligierten Schwein zu Effekten zweier unterschiedlicher Enzympräparationen auf die Verdaulichkeit (praecaecal/ in toto) einer fettreichen Diät. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. HERTEL, J., H. J. ALTMANN u. K. DREPPER (1970): Nutritional physiology studies of the horse. II. Raw nutrient studies of the gastrointestinal tract of slaughtered horses. Tierphysiol. Tierernahr. Futtermittelkd. 26 (3), 169-74. HEYMANS,H. S. (1989): Gastrointestinal dysfunction and its effects on nutrition in CF. Acta Paediatr. Scand. Suppl. 363, 74-8 HINZE, S., T. REISS, I. DOMINGUEZ-LACASA u. S. WÖRNER (2001): Einfluss der Biotechnologie auf das Innovationssystem der pharmazeutischen Industrie Bericht an das Bundesministerium für Bildung und Forschung, Referat Z25, Frauenhofer Institut für Systemtechnik und Innovationsforschung, Karlsruhe HUNT, J. N. u. D. F. STUBBS (1975): The volume and energy content of meals as determinants of gastric emptying. J. Physiol. 245, 209-25 IFFLÄNDER, F. (2006): Persönliche Mitteilung. Solvay Pharmaceuticals, Hannover JENSEN, M. S., S. K. JENSEN u. K. JAKOBSEN (1997): Development of digestive enzymes in pigs with emphasis on lipolytic activity in the stomach and pancreas. J. Anim. Sci. 75, 437-445


165

JONES, T. (1999): The changes of market success in pharmaceutical research and development. In: Sussex, J.; Marchant, N (eds.): Risk and return in the pharmaceutical industry. Springer Verlag, Berlin KAMMLOTT, E. (2003): Untersuchungen am pankreasgangligierten Schweinen zur Nährstoffverdaulichkeit (praecaecal/ in toto) unter dem Einfluss einer Enzympräperation sowie zur Wirksamkeit ergänzender Maßnahmen (Einsatz von Omeprazol oder Lecithin bzw. fraktionierte Futter- und/oder Enzymgabe). Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. KAMPHUES, J. (1987): Untersuchungen zu Verdauungsvorgängen bei Absatzferkeln in Abhängigkeit von Futtermengen und –zubereitungen sowie Futterzusätzen Hannover, Tierärztl. Hochsch., Habil.-Schr. KAMPHUES, J., M. COENEN, E. KIENZLE, J. PALLAUF, O. SIMON u. J. ZENTEK (Hrsg.; 2004): Supplemente zu Vorlesungen und Übungen in der Tierernährung. 10. überarbeitete Aufl., Verlag M.&H. Schaper, Alfeld, Hannover KARTHOFF, J. (2004): Beurteilung der Wirksamkeit einer Enzymsubstitution am Modell des pankreasgangligierten Minischweins mittels unterschiedlicher Methoden bzw. Parameter (Nährstoffverdaulichkeit, Konzentration absorbierter Nährstoffe und unterschiedlicher Testsubstanzen im Blut). Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. KAWCHAK, D. A., H. ZHAO, T. F. SCANLIN, J. L. TOMEZSKO, A. CNAAN u. V. A. STALLINGS (1996): Longitudinal, prospective analysis of dietary intake in children with cystic fibrosis. J. Pediatr. 129 (1), 119-29. KEYS, J. E. u. J. V. DE BARTHE (1974): Site and extend of carbohydrate, dry matter, energy and protein digestion and the rate of passage of grain diets in swine. J. Anim. Sci. 39, 57-62 KIDDER, D. E., u. M. J. MANNERS (1978): Digestion in the pig. Scientechnica, Bristol, UK KIES, A. K., P. J. MOUGHAN u. W. C. SMITH (1986): The apparent and truth ileal digestibility of nitrogen and amino acids in lactic casein for the growing pig. Anim. FEED Sci. Technol. 16, 169-178


166

KIRCHGESSNER, M. (2004): Tierernährung. 11. Aufl., DLG-Verlag, Frankfurt (Main) KNOX, M. T. u. C. N. MALLINSON (1971): Gastric emptying of fats in patients with pancreatitis. Rendiconti 3, 115 KOLBEL, C., P. LAYER, J. HOTZ u. H. GOEBELL (1986): Effect of an acid protected, micro-encapsulated pancreatin preparation on pancreatogenic steatorrhea. Med. Klin. (Munich) 81 (3), 85-6. KUHEL, D. G., S. ZHENG, P. TSO u. D. Y. HUI (2000): Adenovirus-mediated human pancreatic lipase gene transfer to rat bile: gene therapy of fat Malabsorption. Am. J. Physiol. Gastrointes. Liver Physiol. 279, G1031-G1036 KUMAR, G., S. FARR-JONES u. M. SCHUPPENHAUER (2001): Value chain management. In: BioCentury 9, No. 6, A1-A5 LADAS, S. D., K. GIORGIOTIS u. S. A. RAPITS (1993): Complex carbohydrate malabsorption in exocrine pancreatic insufficiency. Gut 34, 984-987 LANKISCH, P. G. (1993): Function tests in the diagnosis of chronic pancreatitis. Critical evaluation. Int. J. Pancreatol. 14 (1), 9-20. LANKISCH, P. G. (2001): Natural course of chronic pancreatitis. Pancreatology 1 (1), 3-14. LAYER, P., A. R. ZINSMEISTER u. E. P. DIMAGNO (1986): Effects of decreasing intraluminal activitiy on starch digestion and postprandial gastrointestinal function in humans. Gastroenteol. 91, 41-48 LAYER, P., J. B. JANSEN, L. CHERAN, C. B. LAMERS u. H. GOEBELL (1990): Feedback regulation of human pancreatic secretion. Gastroenterol. 98, 1311-1319 LAYER, P. u. G. HOLTMANN (1994): Pancreatic enzymes in chronic pancreatitis (state-of-the-art). Int. J. Pancreatol. 15, 1-11


167

LAYER, P., H. YAMAMOTO, L. KALTHOFF et al. (1994): The different courses of early- and late-onset idiopathic and alcoholic chronic pancreatitis. Gastroenterol 107, 1481-7 LAYER, P., M. RÜNZI u. U. ROSIEN (1997): Klinik und Verlauf der chronischen Pankreatitis. Z. Gastroenterol. (Suppl. 1) LAYER, P. u. E. P. DIMAGNO (1999): Early and late onset in idiopathic and alcoholic chronic pancreatitis. Different clinical courses. Surg. Clin. North. Am. 79 (4), 847-60. LAYER, P. u. J. KELLER (1999): Pancreatic Enzymes: Secretion and Luminal Nutrient Digestion in Health and Disease Clinical Reviews: Pancreatic and Biliary Diseases. J. Clin. Gastroenterol. 28, 1-15 LAYER, P., J. KELLER u. P. G. LANKISCH (2001): Pancreatic enzyme replacement therapy. Curr. Gastroenterol. Rep. 3 (2), 101-8. LAYER, P. u. J. KELLER (2003): Lipase supplementation therapy: standards, alternatives, and perspectives. Pancreas 26, 1-7. LECHOWSKI, R., J. PISARSKI, J. GOSHAWSKI u. M. LENARCIK (1991): Exocrine pancreatic insufficiency-like syndrome in giraffe. J. Wildl. Dis. 27, 728-730 LEBENTHAL, E., D. D. ROLSTON u. D. S. HOLSCLAW jr. (1994): Enzyme therapy for pancreatic insufficiency: present status and future needs. Pancreas 9 (1), 1-12 LEIBNIZ GEMEINSCHAFT (2005): Zwischenruf: Umweltforschung für politische Praxis Heft 2 / 2005 LEIBOLZ, J., R. J. LOVE, Y. MOLLAH u. R. R. CARTER (1986): The absorption of dietary L-Lysine and extruded L-Lysine in pigs. Anim. FEED Sci. Technol. 15, 141-148 LEIDINGER, E. (1997): Exokrine Pankreasinsuffizienz bei Hund und Katze. Wien. tierärztl. Monatsschr. 84, 355-358


168

LIDE, D. R., u. H. P. R. FREDERIKSE (1995): CRC Handbook of Chemistry and Physics. CRC Press, Boca Raton, Florida LÖSCHER, W. (2006): Generelle Aspekte bei der Entwicklung neuer Arzneimittel. Vortrag i. Rahmen des pharmakolog.-toxikolog. Seminars, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, 03.05.06 LÖSER, CH. u. U. R. FÖLSCH (1991): Klinische und pharmakologische Aspekte der Pankreasenzymsubstitution. Leber Magen Darm 2, 56-65 LÖSER, CH. u. U. R. FÖLSCH (1995): Differentialtherapie der exokrinen Pankreasinsuffizienz – Aktuelle Aspekte und zukünftige Perspektiven der Substitutionstherapie mit Pankreasenzymen. Z. Gastroenterol. 33, 715-722 LOW, A. G. (1982): Digestibility and availability of amino acids from feedstuffs for pigs: a review. Livest. Prod. Sci. 9, 511-520 LÜTHEN, R. u. C. NIEDERAU (1994): Die Magenlipase übernimmt einen wesentlichen Teil der Fettverdauung. Z. Gastroenterol. 32, 519-520 MAEDA, H., C. DANEL u. R. G. CRYSTAL (1994): Adenovirus-mediated transfer of human lipase complementary DNA to the gallbladder. Gastroenterology 106, 1638-44 MALLINSON, C. N. (1968): Effect of pancreatic insufficiency and intestinal lactase deficiency on the gastric emptying of starch and lactose. Gut 9 (6), 737 MANDISCHER, C. (2002): Untersuchungen am pankreasgangligierten Schwein zur Verdaulichkeit (praecaecal / in toto) eines stärkereichen Mischfutters unter dem Einfluss zwei verschiedener oral verabreichter Enzympräparationen. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. MAYERLE, J. u. M. M. LERCH (2001): Course of illness in acute pancreatitis. Kongressbd. Dtsch. Ges. Chir. Kongr. 118, 296-300


169

MOREAU, H., Y. GARGOURI, D. LECAT, J. L. JUNIEN u. R. VERGER (1988): Screening of preduodenal lipases in several mammals. Biochim. biophys. Acta 959, 247-252 MORRISON, G., J. M. MORRISON, A. O. REDMOND, C. A. BYERS, K. J. MCCRACKEN, J. A. DODGE, S. A. GUILFORD u. M. W. BOWDEN (1992): Comparison between a standard pancreatic supplement and a high enzyme preparation in cystic fibrosis. Alimentary pharmacology & therapeutics 6 (5), 549-55 MÖSSELER, A. K., P. C. GREGORY u. J. KAMPHUES (2005): Influence of ligation of the pancreatic duct on praecaecal / total digestibility of starch in minipigs In: Proceedings of the 9th ESVCN-conference, Grufliasco (Torino), 22. – 24.09.2005 MÖSSELER, A. K., P. C. GREGORY u. J. KAMPHUES (2006 a): Compensatory digestion of fat, protein and starch (rates and amounts) in the large intestine of pigs in cases of reduced prececal digestion 10th International Symposium on Digestive Physiology in Pigs, Danish Institute of Agricultural Science, Vejle (Denmark), 25. – 27.06.06, 55 MÖSSELER, A. K., P. C. GREGORY u. J. KAMPHUES (2006 b): Bedeutung des exokrinen Pankreas für die Verdauung beim Schwein. Übersichten zur Tierernährung 1, 57-103 MÖSSNER, J. (1994): Sense and nonsense in the treatment of exocrine pancreatic insufficiency. Schweiz Rundsch 9, 873-6 MOUGHAN, P. J., P. D. CRANWELL, A. J. DARRAGH u. A. M. ROWAN (1994): The domestic pig as a model: animal for studying in humans. in: W. B. SOUFFRANT und HAGEMEISTER (eds.): Proc. 6th Int. Sympos. Dig. Physiol. In Pigs, Bad Doberan, 4-6.10.1994, S. 389-396 NAKAMURA, T., H. KIKUCHI, K TABEKE, M. ISHII, K. IMAMURA, N. YAMADA, K. KUDOH u. A. TERADA (1994): Correlation between bile acid malabsorption and pancreatic exocrine dysfunction in patients with chronic pancreatitis. Pancreas 9, 580-584 NAKAMURA, T., K. TAKEBE, M. ISHII et al. (1996): Study of gastric emptying in patients with pancreatic diabetes (chronic pancreatitis) using acetaminophen and isotope. Acta Gastroenterol. Belg. 59, 177


170

NAUMANN, C., u. R. BASSLER (2004): Die chemische Untersuchung von Futtermitteln. 3. Aufl., 5. Ergänzungslieferung 2004 VDLUFA-Verlag, Darmstadt OECD, ANBERD DATABASE (2000): Industrial structure statistics, Vol. 1, 1999 edition. Paris OELFKE, S. (1978): Untersuchungen zur Verdaulichkeit verschiedener Stärkearten im Magen-Dünndarmbereich des Schweins. Hannover, Tierärztl. Hochsch. (Inst. Tierernähr.), Staatsexamensarbeit PAP, A., M. KOROM, E. MAROSI u. V. VARRO (1990): Requirements for successful pancreatic enzyme replacement therapy ( comparative study of Kreon and Panpur). Orv. Hetil. 131 (5), 241-4. PARRA, R. (1978): Comparison of foregut and hindgut fermentation in herbivores. in: G. G. MONTGOMERY (Hrsg.): The ecology of arboreal folivores. Smithsonian Inst., Washington D. C., S. 205-229 PAYNE, W. L., G. F. COMBS, R. R. KIFER u. D. G. SNYDER (1968): Investigation of protein quality – ileal recovery of amino acids. Fed. Proc. 27, 1190-1203 PEKAS, J. C., V. W. HAYS u. A. M. THOMPSON (1964): Exclusion of the exocrine pancreatic secretion: effect on digestibility of soybean and milk protein by baby pigs at various ages. J. Nutr. 82, 277-286 PEREZ, M. M., A. D. NEWCOMER, C. G. MOERTEL, V. L. GO u. E. P. DIMAGNO (1983): Assessment of weight loss, food intake, fat metabolism, malabsorption, and treatment of pancreatic insufficiency in pancreatic cancer. Cancer 15, 346-52 PITKÄRANTA, P., L. KIVISAARI, S. NORDLING, A. SAARI u. T. SCHRÖDER (1989): Experimental chronic pancreatitis in the pig. Scand. J. Gastroenterol. 24, 987-992 POINTER, H. u. FLEGEL (1975): Die Behandlung der exokrinen Pankreasinsuffizienz mit einer säurestabilen Pilzlipase. Arzneim. Forsch. 25, Nr. 11, 1833-1835


171

POND, W. G. u. K A. HOUPT (1978): The biology of the pig. Cornell University Press, Ithaca, New York POTTHOFF, A. (2005): Persönliche Mitteilung. Solvay Pharmaceuticals Deutschland, Hannover PROESMANS, M. u. K. DE BOECK (2003): Omeprazole, a proton pump inhibitor, improves residual steatorrhea in cystic fibrosis patients treated with high dose pancreatic enzymes. Eur. J. Pediatr. 162 (11), 760-3. RADUN, D. u. P. MALFERTHEINER (1996): Chronic pancreatitis: conservative therapy. Ther. Umsch. 53 (5), 359-64. RADUN, D., J. E. DOMINGUEZ-MUNOZ u. P. MALFERTHEINER (1997): Chronische Pankreatitis: Konservative Therapie. Z. Gastroenterol. Suppl. 1, 130-134 RAHKO, T., T. V. KALIMA u. H. SALONIEMI (1987): Pancreatic Duct Obstruction in the Pig: Light Microscopy of chronic Pancreatitis. Acta vet. scand. 28, 285-289 RAIMONDO, M. u. E. P. DIMAGNO (1994): Lipolytic activity of bacterial lipase survives better than that of porcine lipase in human gastric and duodenal content. Gastroenteology 107, 231-5 READ, N. W. (1984): The control of gastrointestinal transit by luminal nutrients. in: E. SKADHAUGE u. K. HEINTZE (Hrsg.): Intestinal absorption and secretion. MTP Press, 153-160 READ, N. W., A. MCFARLANE, R. I. KINSMAN et al. (1984): Effect of infusion of nutrient solutions into the ileum on gastrointestinal transit and plasma levels of neurotensin and enteroglucagon. Gastroenterology 86, 274-80 REGAN, P. T., J. R. MALAGELADA, E. P. DIMAGNO u. V. L. GO (1977): Reduced intraluminal bile acid concentration and fat maldigestion in pancreatic insufficiency: correction by treatment. Gastroenterology 77, 285-9


172

RERAT, A. (1983): Function and dysfunction of the small intestine. in: R. M. BATT u. T. L. J. LAWRENCE (eds.): Proc. 2nd George Durant Memorial Symposium, 22 RIMAILA-PARNANEN, E. u. E. WESTERMARCK (1982): Pancreatic degenerative atrophy and chronic pancreatitis in dogs. A comparative study of 60 cases. Acta vet. scand. 23 (3), 400-6. RINDERKNECHT, H. (1993): Pancreatic secretory enzymes. in: V. L. W. GO, E. P. DIMAGNO, J. D. GARDNER, E. LEBENTHAL, H. A. REBER, G. A. SCHEELE (Hrsg.): The pancreas: Biology, Pathobiology and Disease. Raven press, New York, S. 219-251 RITCHEY, J. W., L. A. DEGERNES u. T. T. BROWN (1997): Exocrine pancreatic insufficiency in a yellow-naped Amazon with pancreatic adenocarcinoma. Vet. Pathol. 34, 55-57 ROTHENBACHER, D., M. LOW, P. D. HARDT, H. U. KLOR, H. ZIEGLER u. H. BRENNER (2005): Prevalence and determinants of exocrine pancreatic insufficiency among older adults: results of a population-based study. Scand J Gastroenterol 40, 697-704 RUTZ, G. M., J. M. STEINER u. J. HIRSCHBERGER (2000): Exokrine Pankreasinsuffizienz des Hundes. Tierärztl. Prax. 28, 138-144 SANTINI, B., M. ANTONELLI, A. BATTISTINI, S. BERTASI, M. COLLURA, I. ESPOSITO, L. DI FEBBRARO, R. FERRARI, L. FERRERO, L. IAPICHINO, V. LUCIDI, A. MANCA, C. L. PISCONTI, G. PISI, V. RAIA, L. ROMANO, P. ROSATI, I. GRAZIOLI u. G. MELZI (2000): Comparison of two enteric coated microsphere preparations in the treatment of pancreatic exocrine insufficiency caused by cystic fibrosis. Dig. Liver. Dis. 32 (5), 406-11 SCHARRER, E. u. S. WOLFFRAM (2000): Funktionen des Dünndarms und seiner Anhangdrüsen. in: W. v. ENGELHARDT u. G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. Enke Verlag, Stuttgart, S. 369-394


173

SCHNEIDER, M. U., S. KNOLL-RUZICKA, S. DOMSCHKE, G. HEPTNER u. W. DOMSCHKE (1985): Pancreatic enzyme replacement therapy: Comparative effects of conventional and enteric-coated microspheric pancreatin and acid-stable fungal enzyme preparations on steatorrhea in chronic pancreatitis. Hepato-Gastroenterol. 32, 97-102 SCHÜRCH, A. (1969): Die Verdaulichkeit der Nahrung bzw. Nahrungskomponenten. In: LENKEIT, W., K. BREIREM u. E. CRASEMANN: Handbuch der Tierernährung, Bd. 1 Paul Parey Verlag, Berlin und Hamburg, S. 272-294 SHAW, D. W. u. G. O. BARBEZAT (1982): Comparative In-vitro enzyme activities of five commercially available pancreatic supplements. N. Z. Med. J. 95 (710), 424-5 SHIAU, Y. - F. (1987): Lipid digestion and absorption. in: L. R. JOHNSON (Hrsg.): Physiology of the Gastrointestinal Tract. Vol. II., 2.ed. Raven press, New York, U.S.A. SINGER, M. V. u. M. K. MÜLLER (1995): Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese der chronischen Pankreatitis. in: J. MÖSSNER, G. ADLER, U. R. FÖLSCH u. M. V. SINGER (Hrsg.): Erkrankungen des exkretorischen Pancreas. 2. Auflage, Gustav Fischer Verlag, Jena, Stuttgart, S. 313-324 SLAFF, J., D. JACOBSON, C. R. TILLMANN, C. CURINGTON u. P. TOSKES (1984): Protease-specific suppression of pancreatic exocrine secretion. Gastroenterol. 87 (1), 44-52 STEINBERG, W. M., S. T. CHARI, C. E. FORSMARK, S. SHERMAN, H. A. REBER, E. L. BRADLEY 3rd u. E. DIMAGNO (2003): Controversies in clinical pancreatology: management of acute idiopathic recurrent pancreatitis. Pancreas 27 (2), 103-17 STERNBY, B., G. HOLTMANN, D. G. KELLY u. E. P. DIMAGNO (1992): Effect of gastric or duodenal nutrient infusion on gastric and pancreatic lipase secretion. Gastroenterol. 102, A292


174

STEVENS, C. E. (1977): Comparative physiology of the digestive system. in: M. J. SWENSON (Hrsg.): Duke's Physiology of Domestic Animals. 9th ed. Cornell University Press, Ithaca, New York SUZUKI A., A. MIZUMOTO, M. G. SARR u. E. P. DIMAGNO (1997): Bacterial lipase and high-fat diets in canine exocrine pancreatic insufficiency: a new therapy of steatorrhea? Gastroenterol. 112, 2048-55 SUZUKI, A., A. MIZUMOTO, R. RERKNIMITR, M. G. SARR u. E. P. DIMAGNO (1999): Effect of bacterial or porcine lipase with low- or high-fat diets on nutrient absorption in pancreatic-insufficient dogs. Gastroenterol. 116, 431-437 TABELING, R. (1998): Untersuchungen am pankreasgangligierten Schwein zu Effekten einer Enzympräparation auf die Nährstoffverdaulichkeit (praecaecal / in toto). Hannover, Tierärztl. Hochsch. Diss. THIRUVENGADAM, R. u. E. P. DIMAGNO (1988): Inactivation of human lipase by proteases. Am. J. Physiol. 255, G476-81 TUFTS CENTER FOR THE STUDY OF DRUG DEVELOPMENT (1999): European and U.S. approval times for new drugs are virtually identical. Impact Report Vol. 1, November 1999, Boston VFA STATISTICS - VERBAND FORSCHENDER ARZNEIMITTELHERSTELLER e.V. (2005): Die Arzneimittelindustrie in Deutschland www.vfa.de, Berlin VILLE, E., F. CARRIERE, C. RENOU u. R. LAUGIER (2002) Physiological study of pH stability and sensitivity to pepsin of human gastric lipase. Digestion 65, 73-81 WALKOWIAK, J., H. WITMANOWSKI, K. STRZYKALA, B. BYCHOWIEC, T. SONGIN, K. BORSKI u. K. H. HERZIG (2003): Hemmung der endogenen Sekretion von Pankreasenzymen durch orale Therapie mit Pankreasenzymen. Eur. J. Clin.Invest. 33, 65-69 WATSON, A. D. J., D. B. CHURCH, D. J. MIDDLETON u. T. L. W. ROTHWELL (1981): Weight loss in cats which eat well. J. Small. Anim. Pract. 22,473-482


175

WESTERMARCK, E. (1980): The hereditary nature of canine pancreatic degenerative atrophy in the German Shepherd dog. Acta vet. scand. 21, 389-394 WESTERMARCK, E., V. MYLLYS u. M. AHO (1993): Effect of treatment on the jejunal and colonic bacterial flora of dogs with exocrine pancreatic insufficiency. Pancreas 8, 559-562 WIBERG, D. A. (2004): Pancreatic acinar atrophy in german Shepherd dogs and rough-coated collies. A review. Veterinary Quarterley 26 (2), 61-75 WILLIAMS, D. A. u. F. MINNICH (1990): Canine exocrine pancreatic insufficiency – a survey of 640 cases diagnosed by assay of serum trypsin like immunoreactivity. J. Vet. Int. Med. 4, 123 YIN, Y.-L., J. D. G. MCEVOY, H. SCHULZE u. K. J. MCCRACKEN (2000): Studies on cannulation method and alternative indigestible markers and the effects of food enzyme supplementation in barley-based diets on ileal and overall apparent digestibility in growing pigs. Animal Science 70, 63-72 ZABIELSKI, R., T. ONAGA, H. MINRO u. S. KATO (1993): Periodic fluctuations in pancreatic secretion and duodenal motility investigated in neonatal calves. Exp. Physiol. 78 (5), 675-84 ZABIELSKI, R., P. KIELA, V. LESNIEWSKA, R. KREMINSKI, M. MIKOLAICZYK u. W. BAREJ (1997): Kinetics of pancreatic juice secretion in relation to duodenal migrating myoelectric complex in preruminant and ruminant calves fed twice daily. Br. J. Nutr. 78 (3), 427-42 ZEBROWSKA, T., O. SIMON, R. MÜNCHMEYER u. H. BERGER (1980): Untersuchungen zur Sezernierung endogener Aminosäuren in den Verdauungstrakt und zur Aminosäureresorption beim Schwein. Arch. Tierernähr. 26, 69-82 ZENTLER-MUNRO, P. L., B. A. ASSOUFI, K. BALASUBRAMANIAN, S. CORNELL, D. BENOLIEL, T. C. NORTHFIELD u. M. E. HODSON (1992): Therapeutic potential and clinical efficacy of acid-resistant fungal lipase in the treatment of pancreatic steatorrhea due to Cystic Fibrosis. Pancreas 7, Nr. 3, 311-319

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

176

8 Tabellenanhang

Anhang 1.1: Rohfett- Konzentration des Chymus (g/ kg TS) sowie Relation Rohfettkonzentration / Chromoxidkonzentration im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (1.-3. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit) Nr. Enzym Dosierung (IE)] Tier Fett Konz. Fett / Cr Konz.

63 344 59,7 82 361 51,1 0 83 462 50,7 82 173 23,6 63 210 17,7 10 000 83 110 7,41 82 90,7 7,30 63 234 13,5

1. PK

75 000 83 132 6,40 63 450 104 83 363 65,2 0 82 529 89,8 63 420 74,4 82 480 57,6 5 000 83 271 24,7 63 306 28,6 83 88,5 7,00

2. PK

55 000 82 145 7,52 43 477 41,9 0 93 479 37,8 43 410 54,3 83 543 60,7 500 93 531 87,9 82 481 41,0 43 296 30,6 93 360 27,8 5 000

83 138 10,2 82 323 20,2

3. PK

55 000 83 162 6,57

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

177

Anhang 1.2: Rohfett- Konzentration des Chymus (g/ kg TS) sowie Relation Rohfettkonzentration / Chromoxidkonzentration im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (4.und 5. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit) Nr. Enzym Dosierung (IE)] Tier Fett Konz. Fett / Cr Konz.

83 175 6,97 43 226 39,5 93 248 26,7 0

82 556 54,1 83 463 43,8 43 401 38,3 93 227 19,3 500

82 414 31,1 83 290 16,1 43 365 23,6 93 249 15,2 5 000

82 239 12,6 83 240 12,5 43 160 10,7 93 240 10,0

4. PK

75 000

82 163 6,51 83 127 4,77 81 513 68,3 43 378 47,6 0

80 481 53,0 83 442 60,8 81 331 43,2 43 162 21,2 500

80 239 22,3 83 186 14,2 81 307 33,9 43 175 15,0 5 000

80 302 18,5 83 147 7,87 43 73,4 6,43 81 74,4 4,19

5. PK

75 000

80 122 6,58

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

178

Anhang 1.3: Rohfett- Konzentration des Chymus (g/ kg TS) sowie Relation Rohfettkonzentration / Chromoxidkonzentration im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (6. und 7. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit) Nr. Enzym Dosierung (IE)] Tier Fett Konz. Fett / Cr Konz.

81 110 5,26 65 396 143 0 82 547 125 56 506 112 65 281 102 500 56 497 91,4 82 484 87,5 65 297 78,8 82 330 40,3 5 000

56 268 29,3 65 143 22,7 56 125 16,6 82 116 11,8

6. PK

75 000

81 538 141 80 437 109 83 552 138 43 415 133 0

81 456 102 80 484 104 83 413 69,9 43 445 107 500

81 276 45,4 80 317 41,2 83 258 34,9 43 281 48,7 5 000

81 246 36,7 80 197 15,2 83 177 17,8

7. PK

75 000 43 180 19,0

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

179

Anhang 1.4: Rohfett- Konzentration des Chymus (g/ kg TS) sowie Relation Rohfettkonzentration / Chromoxidkonzentration im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test, Lipase E1) Enzym Dosierung (IE)] Tier Fett Konz. Fett / Cr Konz.

81 441 45,7 80 529 36,2 500 83 391 106 81 324 109 80 297 112 5000 83 314 63,2 81 215 44,5 80 220 53,9

E1

75000 83 226 39,9

Anhang 1.5: Rohfett- Konzentration des Chymus (g/ kg TS) sowie Relation Rohfettkonzentration / Chromoxidkonzentration im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test, Lipase E2) Enzym Dosierung (IE)] Tier Fett Konz. Fett / Cr Konz

81 535 25,1 80 594 31,0 500 83 357 121 81 392 126 80 400 128 5000 83 436 112 81 398 116 80 358 90,2

E2

75000 83 256 77,8


81 509 37,9 80 512 48,5 500 83 408 115 81 524 110 80 464 114 5000 83 266 110 81 413 81,1 80 275 69,3

E3

75000 83 244 65,4

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

180


81 529 15,2 80 559 17,8 83 442 19,0

500

43 493 113 81 445 111 80 431 110 83 409 106 5000

43 418 86,6 81 397 96,7 80 331 70,7 83 299 66,1

E4

75000

43 147 45,2 Anhang 1.8: Rohfett- Konzentration des Chymus (g/ kg TS) sowie Relation Rohfettkonzentration / Chromoxidkonzentration im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test, Lipase E5) Enzym Dosierung (IE)] Tier Fett Konz. Fett / Cr Konz.

81 526 45,8 80 370 39,0 500 83 433 133 81 407 125 80 440 119 5000 83 379 109 81 309 97,2 80 241 67,4

E5

75000 83 261 61,4

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

181

Anhang 2.1: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (1. – 3. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Versuch Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 0 63 377 261 297 343 0 82 434 444 261 430 0 83 320 410 355 623 10000 63 205 96,0 * 245 10000 82 116 359 154 * 10000 83 90,7 31,4 186 170 75000 63 98,9 * 395 241 75000 82 78,2 93,2 69,0 182

1. PK

75000 83 112 241 58,4 76,0 0 63 283 744 279 110 0 82 164 580 676 530 0 83 71,5 534 398 262 5000 63 204 631 522 245 5000 82 389 502 572 392 5000 83 283 108 131 413 55000 63 267 428 222 271 55000 82 90,2 227 136 154

2. PK

55000 83 66,4 231 136 22,3 0 43 445 472 560 * 0 93 523 * * 460 500 43 376 * 529 398 500 82 255 498 * * 500 83 509 510 542 666 500 93 595 526 347 * 5000 43 370 372 21,9 387 5000 82 185 * 405 460 5000 83 78,0 357 152 * 5000 93 435 323 412 275 55000 82 206 159 132 200

3. PK

55000 83 290 * 148 159

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

182

Anhang 2.2: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (4. und 5. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Versuch Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 0 43 367 565 442 * 0 82 204 467 494 * 0 83 288 649 495 508 0 93 50,2 * 339 403 500 43 319 * 570 408 500 82 1009 268 261 350 500 83 231 207 163 301 500 93 * 286 332 249 5000 43 326 * 452 447 5000 82 399 * 0,00 * 5000 83 196 304 233 369 5000 93 72,9 * 308 267 75000 43 135 28,9 298 226 75000 82 193 * 51,7 277 75000 83 68,5 * 172 183

4. PK

75000 93 * 244 231 * 0 43 189 342 552 429 0 80 306 407 717 433 0 81 430 * 600 492 0 83 99,0 403 663 495 500 43 70,6 * 232 * 500 80 124 96,7 * 414 500 81 183 372 507 * 500 83 288 252 137 * 5000 43 144 215 * 301 5000 80 91,0 269 * * 5000 81 225 * 348 485 5000 83 * 149 * 467 75000 43 42,7 48,1 268 * 75000 80 64,7 76,7 79,7 * 75000 81 116 109 * *

5. PK

75000 83 61,3 64,6 174 221

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

183

Anhang 2.3: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (6. und 7. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Versuch Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 0 56 495 518 * 515 0 65 440 414 264 232 0 82 230 604 569 530 0 93 146 * 187 207 500 56 498 516 512 436 500 65 86,6 441 397 387 500 82 483 * 513 464 500 93 149 207 127 213 5000 56 330 209 * 222 5000 65 58,0 482 327 * 5000 82 274 361 423 119 5000 93 273 131 263 373 75000 56 104 75,0 * 198 75000 65 170 124 * 136 75000 82 124 103 113 115

6. PK

75000 93 124 115 147 217 0 43 403 * 457 388 0 80 464 580 * 235 0 81 584 * 487 * 0 83 592 600 495 395 500 43 478 469 337 202 500 80 514 365 541 316 500 81 472 449 * 392 500 83 381 * 513 * 5000 43 307 310 230 219 5000 80 278 317 402 * 5000 81 295 98,3 * 393 5000 83 292 163 100 459 75000 43 195 119 165 329 75000 80 * 186 186 216 75000 81 117 290 * 313

7. PK

75000 83 98,1 217 184 205

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

184

Anhang 2.4: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening, Lipase E1)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 500 80 523 578 500 378 500 81 434 426 499 462 500 83 390 422 346 * 5000 80 163 88,7 351 * 5000 81 363 187 * 454 5000 83 422 314 270 325 75000 80 171 264 264 246 75000 81 360 85,1 120 284

E1

75000 83 176 266 238 253 Anhang 2.5: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening, Lipase E2)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 500 80 539 693 660 403 500 81 479 626 * 625 500 83 562 483 * * 5000 80 359 571 * * 5000 81 569 596 * 247 5000 83 367 450 * 493 75000 80 415 359 359 327 75000 81 396 489 343 302

E2

75000 83 438 262 176 209 Anhang 2.6. Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening, Lipase E3)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 500 80 549 547 * 353 500 81 514 527 * 469 500 83 510 360 * 373 5000 80 352 440 522 319 5000 81 566 479 472 * 5000 83 404 * 191 75,0 75000 80 292 253 253 286 75000 81 * 407 477 333

E3

75000 83 277 295 * 168

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

185

Anhang 2.7: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening, Lipase E4)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 500 43 426 * 766 612 500 80 479 * 606 * 500 81 528 * 538 518 500 83 508 428 287 285 5000 43 523 390 381 * 5000 80 416 401 521 * 5000 81 499 407 450 451 5000 83 390 454 328 * 75000 43 91,2 149 94,9 323 75000 80 411 267 267 * 75000 81 331 * 423 289

E4

75000 83 362 143 281 289 Anhang 2.8: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening, Lipase E5)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 500 80 326 368 574 * 500 81 * 545 448 430 500 83 490 246 * 482 5000 80 280 505 294 332 5000 81 472 * 306 210 5000 83 440 * 306 * 75000 80 235 225 149 96,1 75000 81 398 380 127 *

E5

75000 83 337 258 180 149 Anhang 2.9: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening, Kombinationsversuch)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Enzym Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 500 43 400 337 592 718 500 56 521 290 250 * 500 82 332 328 463 527 5000 43 439 490 240 * 5000 56 355 * 521 588 5000 82 111 466 644 522 75000 43 284 313 506 285 75000 56 300 276 278 244

Kombinationsversuch

75000 82 526 * 574 545

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

186

Anhang 2.10: Rohfett-Konzentration des Chymus (g/ kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening, Kontrolltiere)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Versuch Enzymmenge Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 38 121 151 * 169 68 149 146 226 127 Kontrolltiere 0 69 275 123 151 *

Anhang 3.1: Chymusmengen (g uS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (1.-2. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Zeitintervall nach Fütterung [h] Nr. Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8

63 166 16,3 85,7 112 82 29,0 44,8 124 59,5 0 83 85,6 34,6 40,6 73,1 63 109 36,4 * 151 82 133 53,5 144 * 10000 83 99,0 61,5 32,6 46,7 63 89,5 * 60,0 45,6 82 56,9 60,8 69,1 34,0

1.

75000 83 71,2 58,4 30,6 39,1 63 137 123 40,7 87,3 82 98,2 34,4 102 109 0 83 133 108 68,9 11,9 63 141 105 110 24,1 82 73,4 451 39,5 31,0 5000 83 71,0 44,0 48,0 34,9 63 94,7 75,6 59,8 36,3 82 43,4 29,9 23,0 42,4

2.

55000 83 131 29,1 54,7 48,2

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

187



43 33,2 83,5 16,0 * 0 93 71,0 * * 105 43 52,9 * 39,0 267 82 16,7 127 * * 83 47,4 45,6 77,8 18,2 500

93 26,4 221 26,3 * 43 98,5 12,3 64,9 24,0 82 89,3 * 36,6 48,9 83 117 31,2 35,6 * 5000

93 32,9 43,7 18,3 36,7 82 47,7 38,9 36,5 17,1

3.

55000 83 46,5 * 85,1 8,18 43 11,0 37,6 127 * 82 94,5 143 81,4 * 83 32,3 63,2 31,3 41,1 0

93 47,3 * 21,7 37,4 43 80,2 * 32,9 9,64 82 130 26,5 61,8 118 83 51,3 15,2 45,3 43,3 500

93 * 44,8 30,6 13,4 43 115 * 26,2 42,2 82 36,9 * 16,4 * 83 85,4 29,2 33,0 14,8 5000

93 41,8 * 65,9 29,8 43 107 42,8 56,1 39,2 82 44,8 * 61,1 29,7 83 76,8 * 45,2 37,1

4.

75000

93 * 67,2 36,7 *

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

188



43 101 30,9 25,8 123 80 86,9 45,8 37,2 37,3 81 132 * 109 12,8

0

83 89,6 82,9 54,1 42,7 43 47,7 * 65,0 * 80 104 30,7 * 16,1 81 121 83,4 85,5 * 500

83 66,4 72,3 53,5 * 43 72,2 48,2 * 12,1 80 64,4 36,1 * * 81 131 * 287 33,1 5000

83 * 113 * 66,7 43 91,4 90,9 27,0 * 80 45,3 48,5 74,3 * 81 25,8 90,9 * *

5.

75000

83 49,3 72,1 16,3 55,4 56 114 34,9 * 88,4 65 127 75,3 23,7 36,4 82 45,6 123 37,4 55,6

0

93 80,7 * 20,2 54,1 56 95,4 29,6 74,5 29,8 65 143 44,3 89,9 32,1 82 159 * 30,7 27,8 500

93 40,7 37,3 35,1 37,8 65 92,2 66,3 52,7 * 82 53,8 44,9 92,4 45,9 93 47,4 39,9 34,0 22,9 5000

56 105 62,5 * 39,9 56 72,7 41,7 * 44,4 65 87,2 61,7 * 65,9 82 90,6 45,1 48,0 28,1

6.

75000

93 47,0 99,1 27,6 16,5

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

189

Anhang 3.4: Chymusmengen (g uS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (7. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)


43 253 * 90,1 19,6 80 215 77,4 * 72,4 81 142 * 126 * 0

83 85,2 77,9 83,0 33,6 43 163 60,2 21,5 22,9 80 94,7 70,2 84,9 20,1 81 90,0 99,8 * 17,9 500

83 165 * 47,5 * 43 111 51,6 84,0 16,0 80 91,3 249 99,2 * 81 189 65,4 * 58,1 5000

83 96,2 77,4 35,1 44,6 43 45,6 124 36,8 50,7 80 * 65,3 48,3 74,1 81 120 160 * 43,7

7.

75000

83 69,3 100 61,3 36,5 Anhang 3.5: Chymusmengen (g uS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Kontrolltiere)


38 121 85,9 * 81,6 68 71,7 65,1 38,8 57,0 Kontrolltiere 0 69 89,7 54,4 29,7 *

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

190

Anhang 3.6: Chymusmengen (g uS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening Test für Lipasen, E 1)


80 134 68,5 32,1 27,3 81 180 76,7 20,5 88,4 500 83 156 65,7 48,7 * 80 100 19,0 151 * 81 190 108 * 68,2 5000 83 45,8 60,0 102 33,8 80 124 50,2 52,1 46,9 81 114 115 40,3 44,5

E1

75000 83 88,9 27,4 66,2 57,5



80 117 48,2 82,7 22,6 81 206 61,7 * 20,9 500 83 47,2 99,1 * 55,7 80 96,2 133 * 58,8 81 94,4 66,4 69,7 20,6 5000 83 79,5 81,3 * 68,7 80 61,8 11,4 46,3 104 81 147 44,8 17,9 13,1

E2

75000

83 38,0 105 54,9 45,7 Anhang 3.8: Chymusmengen (g uS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening Test für Lipasen, E 3)


80 104 80,6 * 53,9 81 173 87,5 * 76,7 500 83 85,9 84,3 * 91,3 80 48,5 22,7 136 27,5 81 113 75,6 51,2 * 5000 83 169 * 54,3 157 80 99,3 13,8 55,8 35,7 81 * 63,5 61,3 51,4

E3

75000 83 158 24,7 * 77,0

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

191



43 178 * 22,0 49,4 80 101 * 96,2 * 80 161 * 36,0 23,4

500

83 95,7 79,2 18,0 21,3 43 39,4 108 51,6 * 80 158 86,6 31,5 * 81 94,5 148 33,3 28,1 5000

83 49,1 140 53,0 * 81 27,5 * 99,9 11,6 43 39,5 146 62,9 21,5 80 115 33,2 127 *

E4

75000

83 149 65,5 24,7 41,9 Anhang 3.10: Chymusmengen (g uS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening Test für Lipasen, E 5)


80 229 159 37,3 * 81 * 162 40,7 9,38 500 83 91,2 58,1 * 52,8 80 57,0 170 11,7 49,2 81 213 * 117 45,0 5000 83 90,7 * 78,1 * 80 59,9 101 24,9 52,8 81 89,1 64,1 73,7 *

E5

75000 83 64,9 93,2 23,3 28,6

Anhang 3.11: Chymusmengen (g uS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening Test für Lipasen, Kombinationsversuch)


43 93,9 168 93,6 34,2 56 131 50,4 17,4 * 500 82 134 34,6 31,4 91,7 43 268 72,4 25,7 * 56 82,91 * 79,1 78,6 5000 82 47,9 96,8 67,9 45,1 43 156 91,1 45,4 55,7 56 114 72,7 30,7 15,1

Kombinations-versuch

75000 82 155 * 64,7 55,1

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

192

Anhang 4.1: Rohfett (Rfe-)- und Trockensubstanz (TS-)-Verschwindensrate (VR) in %, Rohfett- und Trockensubstanz-Anflutung (Anfl.) in g sowie Cr2O3-Wiederfindung (%) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (1.-3. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Nr. Enzym Dosierung (IE) Tier Rfe- VR

Rfe-Anfl. TS Anfl. TS-VR Cr2O3

Wdf. 63 1,22 24,4 70,7 -1,30 64,7 82 16,0 14,3 39,6 17,8 44,7 0 83 36,2 21,1 45,2 51,2 93,6 82 60,6 5,88 34,0 19,4 39,1 63 79,4 6,35 30,1 50,7 56,6 10 000 83 88,0 2,49 22,8 61,2 54,4 82 88,5 1,91 22,1 53,0 43,5 63 78,1 4,958 21,0 67,1 59,2

1. PK

75 000 83 89,5 2,36 17,8 72,2 59,21 63 5,19 53,7 120 5,68 83,6 83 40,2 20,0 54,9 26,9 49,5 0 82 17,1 37,8 71,6 29,7 67,3 63 79,4 29,7 70,9 26,6 63,7 82 46,4 22,1 45,9 50,2 61,0 5 000 83 77,2 8,23 30,5 62,3 53,3 63 73,8 12,6 41,2 61,7 71,0 83 93,1 2,62 30,2 66,4 59,3

2. PK

55 000 82 93,5 1,91 13,2 78,5 40,6 43 61,8 10,6 22,3 64,2 41,4 0 93 64,8 9,24 19,3 67,1 38,9 43 50,3 15,4 37,6 45,8 46,3 83 44,6 20,9 20,4 54,4 54,5 93 49,1 15,7 29,5 57,1 45,5 500

82 62,3 9,87 20,4 65,0 38,8 43 72,2 7,31 24,7 57,9 38,5 93 74,1 6,10 16,9 68,2 34,6 83 90,5 2,76 20,4 69,2 41,4 5 000

82 81,6 6,54 20,3 74,5 52,4 83 93,8 1,61 9,75 83,2 39,2

3. PK

55 000 82 93,5 1,84 10,5 83,5 42,7

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

193

Anhang 4.2: Rohfett (Rfe-)- und Trockensubstanz (TS-)-Verschwindensrate (VR) in %, Rohfett- und Trockensubstanz-Anflutung (Anfl.) in g sowie Cr2O3-Wiederfindung (%) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (4. und 5. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Nr. Enzym Dosierung (IE) Tier Rfe- VR


Wdf. 43 49,9 13,9 29,9 51,6 49,9 82 55,4 7,53 32,7 28,2 29,4 83 41,4 19,8 35,6 60,9 58,8 0

93 87,8 1,52 15,2 55,9 21,7 43 38,5 5,33 23,4 60,7 38,5 82 65,6 12,0 28,5 69,6 60,6 83 79,3 4,48 19,8 66,2 37,7 500

93 82,2 3,18 10,8 77,4 31,0 43 74,6 8,77 24,1 74,0 60,0 82 82,4 2,02 7,76 74,9 20,0 83 86,3 4,61 19,5 78,5 58,6 5 000

93 86,3 3,30 13,9 78,6 41,8 43 88,6 4,01 25,2 73,3 61,1 82 93,4 1,74 11,0 84,3 45,5 83 96,7 1,20 14,9 84,8 63,1

4. PK

75 000

93 89,0 2,36 9,85 83,0 37,4 81 16,8 28,4 55,4 44,6 58,6 43 42,0 21,5 57,3 47,4 72,0 80 36,3 19,9 41,5 54,7 60,5

0

83 25,3 22,6 38,3 56,8 66,2 81 48,0 10,9 32,7 46,6 40,5 43 75,0 2,60 16,2 47,0 20,2 83 72,7 5,63 23,5 61,2 40,0 500

80 83,8 2,49 14,0 69,1 29,8 81 58,9 10,1 33,0 54,4 47,8 43 83,8 2,88 16,6 64,4 30,8 83 77,8 7,45 24,7 74,9 65,2 5 000

80 90,4 1,59 10,8 77,8 32,0 43 92,5 1,58 22,0 64,3 40,8 80 94,9 1,17 15,7 76,3 43,9 83 92,0 2,09 17,2 77,4 38,8

5. PK

75 000

81 93,7 1,27 11,5 80,4 50,5

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

194

Anhang 4.3: Rohfett (Rfe-)- und Trockensubstanz (TS-)-Verschwindensrate (VR) in %, Rohfett- und Trockensubstanz-Anflutung (Anfl.) in g sowie Cr2O3-Wiederfindung (%) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (6. und 7. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Nr.. Enzym Dosierung (IE) Tier Rfe- VR


Wdf. 65 -0,98 24,3 61,1 10,7 46,6 82 9,90 34,5 63,0 42,2 74,1 0 56 18,8 26,1 51,5 43,6 62,1 65 25,9 18,4 65,8 6,97 48,2 56 34,7 21,1 42,5 53,9 62,7 500 82 36,8 17,8 36,8 54,1 54,7 65 44,4 10,3 34,2 34,8 35,8 82 71,8 9,88 29,9 69,9 67,8 5 000 56 79,5 6,31 23,7 73,0 59,7 65 83,9 3,83 26,7 60,7 46,2 56 88,1 2,67 21,3 66,6 43,4

6. PK

75 000 82 91,5 2,61 22,5 74,2 59,2 81 2,14 33,1 61,5 36,2 65,6 80 25,8 29,4 67,2 40,4 76,8 83 7,12 39,6 71,7 40,9 82,6 0

43 7,99 31,2 74,9 22,3 65,7 81 31,1 18,1 39,6 47,0 51,0 80 30,0 18,8 38,7 49,3 52,0 83 53,0 12,6 30,5 60,0 51,8 500

43 28,5 23,1 51,8 43,7 62,6 81 68,6 9,76 35,4 59,9 60,2 80 71,3 10,6 32,3 68,3 71,3 83 76,4 7,88 30,4 68,1 64,8 5 000

43 67,1 9,14 32,4 59,0 53,9 81 75,3 9,23 37,4 64,8 72,4 80 89,8 3,65 18,5 81,8 69,4 83 73,2 4,60 25,9 75,9 73,2

7. PK

75 000

43 87,2 3,77 20,9 75,0 56,8

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

195

Anhang 4.4: Rohfett-(Rfe-) und Trockensubstanz (TS)-Verschwindensrate (VR) in %, Rohfett- und Trockensubstanz-Anflutung (Anfl.) in g sowie Cr2O3-Wiederfindung in % im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test; Lipase E1) Enzym Dosierung (IE) Tier Rfe-VR Rfe-Anfl. TS-Anfl TS-VR Cr2O3 Wdf.

81 24,2 31,5 71,3 39,6 80,4 80 23,1 27,2 51,4 48,9 68,5 500 83 21,2 18,0 46,1 29,0 44,2 81 55,4 13,6 42,1 51,7 59,3 80 67,8 9,29 31,3 61,9 55,9 5000 83 61,5 8,18 26,0 57,0 41,2 81 71,6 7,51 35,0 53,3 51,3 80 81,8 5,70 25,9 70,9 60,6

E1

75000 83 77,6 6,76 30,0 65,0 58,4


81 14,7 29,4 55,0 11,0 42,1 80 11,0 30,3 50,9 47,5 66,0 500 83 8,99 19,2 54,5 9,27 40,9 81 18,2 21,0 53,1 27,2 49,7 80 19,8 20,9 51,6 29,7 50,0 5000 83 34,5 21,2 48,6 47,3 62,8 81 66,5 8,10 22,6 67,1 46,8 80 45,4 10,3 25,8 52,1 36,6

E2.

75000 83 72,6 10,7 42,0 62,3 75,8


81 17,5 37,9 74,4 43,2 89,1 80 22,1 29,4 51,6 46,4 65,6 500 83 14,2 22,5 52,9 29,0 50,7 81 20,5 28,5 35,9 46,6 69,5 80 42,6 16,7 54,5 56,5 56,3 5000 83 49,9 17,3 64,9 34,1 67,0 81 54,1 13,2 32,1 60,8 55,8 80 79,8 5,35 19,4 74,2 51,2

E3

75000 83 71,9 8,54 35,1 59,4 58,8

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

196


81 20,1 26,6 50,3 46,9 64,5 80 22,1 24,3 43,4 51,1 60,4 500 83 20,1 20,7 46,4 36,9 50,1 81 37,4 21,1 47,5 50,6 65,4 80 32,2 14,1 32,6 44,7 65,4 5000 83 49,6 11,4 27,8 56,7 43,8 81 46,2 8,35 20,9 52,8 30,1 80 67,1 9,99 30,1 65,2 58,8

E4

75000 83 66,9 9,04 30,0 61,3 52,9


80 4,61 26,5 50,3 16,3 50,3 81 12,0 22,9 61,9 36,4 53,9 500 83 16,8 20,1 55,3 45,7 46,9 81 31,8 24,4 55,3 45,7 69,3 80 23,9 25,9 63,6 34,4 65,9 5000 83 52,0 11,5 30,4 56,1 47,1 81 55,4 10,9 35,3 49,3 47,4 80 73,5 7,03 29,2 61,4 51,5

E5

75000 83 66,2 8,57 32,8 54,5 49,1

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

197

Anhang 5.1: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (1.-3. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Nr. Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 63 6,89 4,19 5,12 4,89 82 12,1 10,3 5,47 5,24 0 83 9,21 10,4 6,88 9,42 63 10,5 13,1 * 12,3 82 2,97 20,0 6,14 * 10000 83 7,74 19,4 32,2 17,1 63 10,2 * 29,2 12,9 82 2,98 24,2 7,76 26,4

1. PK

75000 83 22,7 34,1 8,64 8,03 63 2,97 7,10 2,93 0,957 82 2,39 10,9 7,73 3,93 0 83 1,03 8,61 5,30 4,68 63 4,20 8,76 5,17 4,59 82 11,9 7,97 3,64 8,39 5000 83 7,67 22,5 8,00 10,2 63 8,85 14,7 10,0 9,08 82 6,31 33,1 34,9 15,4

2. PK

55000 83 7,07 41,6 20,1 4,39 43 14,5 11,5 5,71 * 0 93 8,24 * * 14,4 43 1,79 * 16,8 8,63 82 2,27 12,5 * * 83 10,3 11,4 8,64 3,71 500

93 10,2 9,78 2,88 * 43 7,14 8,98 18,5 7,83 82 8,19 * 26,4 20,3 83 4,26 27,3 33,0 * 5000

93 0,527 16,9 26,3 14,2 82 31,9 32,5 16,9 7,04

3. PK

55000 83 37,6 * 25,5 12,6

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

198

Anhang 5.2: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (4. und 5. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Nr. Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 43 14,4 13,9 8,86 * 82 4,14 5,38 8,02 * 83 3,47 13,1 9,54 7,57 0

93 2,83 * 13,8 12,7 43 6,70 * 16,9 15,9 82 10,7 22,9 12,7 14,9 83 7,94 7,18 17,5 14,4 500

93 * 15,2 22,5 18,5 43 13,6 * 16,4 21,9 82 17,4 * 13,7 * 83 9,02 40,6 28,1 23,6 5000

93 2,80 * 24,6 24,2 43 8,68 8,24 21,7 45,4 82 34,0 * 28,0 13,2 83 21,3 * 35,8 26,0

4. PK

75000

93 * 24,8 21,4 * 43 6,62 7,12 11,3 7,67 80 11,5 8,92 7,13 9,32 81 8,34 * 6,40 9,03

0

83 3,30 10,5 4,58 8,71 43 2,04 * 12,3 * 80 15,5 13,4 * 6,73 81 6,07 12,9 4,48 * 500

83 11,2 13,1 6,82 * 43 8,14 17,9 * 17,9 80 19,8 15,9 * * 81 11,4 * 8,00 3,50 5000

83 * 17,6 * 15,2 43 6,77 16,2 18,0 * 80 9,00 20,2 22,0 * 81 16,9 22,2 * *

5. PK

75000

83 14,7 23,3 26,6 11,0

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

199

Anhang 5.3: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (6. und 7. Versuch zur Optimierung einer flüssigen Testmahlzeit)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Nr. Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 56 4,53 4,17 * 4,45 65 2,90 2,84 2,94 2,16 82 2,07 5,07 3,86 3,95

0

93 5,50 * 15,5 6,33 56 5,21 5,68 5,88 4,73 65 1,10 2,86 4,37 3,06 82 5,70 * 5,01 4,65 500

93 7,11 16,7 6,96 9,32 56 7,38 8,00 * 14,7 65 1,09 5,80 4,37 * 82 5,48 9,70 10,7 4,33 5000

93 11,1 10,3 9,59 12,9 56 6,49 7,02 * 9,33 65 5,95 6,00 * 7,15 82 10,5 12,1 8,86 5,52

6. PK

75000

93 7,43 5,55 6,45 9,38 43 2,74 * 3,53 4,60 80 3,71 4,23 * 4,57 81 3,90 * 3,57 * 0

83 4,56 3,67 4,05 3,18 43 4,13 4,64 4,20 4,23 80 5,37 6,13 3,28 4,50 81 4,60 4,46 * 4,29 500

83 5,65 * 6,96 * 43 4,41 6,38 7,55 8,19 80 13,7 4,97 3,62 * 81 6,31 2,77 * 8,12 5000

83 6,76 8,18 5,10 9,32 43 11,8 6,07 9,91 16,2 80 * 17,3 18,0 5,84 81 5,26 6,15 * 12,9

7. PK

75000

83 8,36 14,0 8,66 3,92

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

200

Anhang 5.4: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test für Lipasen; E1)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 80 4,63 5,48 4,45 5,35 81 4,10 3,48 4,82 4,75 500 83 3,23 4,34 3,59 * 80 3,81 2,29 7,69 * 81 6,15 3,49 * 4,99 5000 83 9,41 6,93 4,76 3,83 80 7,88 8,13 14,1 5,85 81 7,58 2,52 3,83 8,98

E1

75000 83 5,63 11,7 7,54 6,23


Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 80 4,49 5,54 5,04 2,65 81 3,86 5,44 * 5,54 500 83 4,56 3,71 * * 80 4,06 4,61 * * 81 5,10 4,96 * 2,17 5000 83 4,78 4,03 * 5,80 80 2,43 12,0 12,2 7,73 81 5,40 3,62 6,35 6,23 83 9,78 7,27 3,96 5,37 68 8,09 8,36 8,36 7,30

E2

75000

69 9,82 5,17 9,91 * Anhang 5.6: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test für Lipasen; E3)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 80 5,44 4,32 * 3,15 81 4,41 4,42 * 4,39 500 83 4,15 2,93 * 3,62 80 5,00 6,71 6,08 3,99 81 4,88 4,48 4,50 * 5000 83 3,54 * 11,1 0,727 80 8,64 13,4 9,47 10,3 81 * 6,03 8,11 4,73

E3

75000 83 6,58 6,18 * 5,40

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

201


Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 80 4,29 * 5,60 * 81 4,54 * 5,62 5,16 500 83 4,55 3,57 3,15 2,82 43 7,86 5,22 6,97 * 80 4,06 5,31 6,12 * 81 4,58 5,34 5,41 5,02 5000

83 7,01 5,58 4,98 * 43 2,13 3,94 2,56 11,8 80 6,23 10,6 7,50 * 81 5,12 * 5,30 5,78 83 7,26 3,86 6,83 6,65 68 8,09 8,36 8,36 7,30

E4

75000

69 9,82 5,17 9,91 * Anhang 5.8: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test für Lipasen; E5)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 80 2,76 2,64 5,34 * 81 * 4,03 3,48 3,77 500 83 3,88 2,21 * 4,67 80 3,49 5,30 2,87 2,89 81 4,33 * 3,14 1,72 5000 83 6,21 * 5,08 * 80 4,49 9,18 4,99 5,36 81 4,34 6,19 4,42 *

E5

75000 83 4,66 6,53 5,84 3,95

Anhang 5.9: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test für Lipasen; Kontrolltiere)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 38 5,86 10,3 * 14,5 68 8,09 8,36 8,36 7,30 Kontrolltiere 0 69 9,82 5,17 9,91 *

TABELLENANHANG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

202

Anhang 5.10: Cr2O3-Konzentration im ilealen Chymus (g / kg TS) im Kollektionsintervall 0-8 h n. F. (Screening-Test für Lipasen; Kombinationsversuch)

Zeitintervall nach Farbwechsel (h) Enzym Dosierung (IE) Tier 0-2 2-4 4-6 6-8 43 3,79 3,13 4,87 8,36 56 4,45 1,88 2,42 * 500 82 2,52 2,16 3,53 5,29 43 5,24 2,78 2,88 * 56 2,46 * 5,17 6,35 5000 82 0,581 4,61 6,36 7,35 43 4,18 6,95 4,56 7,61 56 7,33 5,60 6,91 5,59

Kombinations- versuch

75000 82 6,78 * 9,04 5,31

* keine Analyse aufgrund fehlender Anflutung von Ingesta

DANKSAGUNG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

203

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. J. Kamphues für die Überlassung des Themas

und die jederzeit gewährte freundliche und konsequente Unterstützung während der

Anfertigung dieser Arbeit.

Dr. Anne Katrin Mößeler möchte ich in freundschaftlicher Verbundenheit für ihre

unermüdliche und uneingeschränkte Hilfsbereitschaft und Unterstützung bei der Erstellung

dieser Arbeit während der letzten zwei Jahre herzlichst danken.

Bei der Firma Solvay Pharmaceutical GmbH bedanke ich mich nicht nur für die materielle

und finanzielle Unterstützung, sondern danke auch vielen Mitarbeitern für ihre freundliche

Hilfsbereitschaft. Besonders bedanke ich mich bei Dr. P. C. Gregory für die kollegiale

Zusammenarbeit. Bei dem „Minipig-Team“ (Petra, Bernd, Bianca, Ille und Aileen) danke

ich für die freundschaftliche Aufnahme, die umfassende und allgegenwärtige

Hilfsbereitschaft sowie das großartige Engagement.

Ein besonderer Dank gilt auch Katrin Kiesmann für die tatkräftige Unterstützung bei der

praktischen Durchführung der Versuche.

Ebenfalls möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Instituts für Tierernährung,

insbesondere bei Jutta und Katja, für die ausdauernde und herzliche Unterstützung

bedanken.

Des Weiteren gilt mein Dank dem Institut für Biometrie für die Beratung und Unterstützung

bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse.

Meinen Eltern und meinem Bruder Tanno danke ich herzlichst für die umfassende

Unterstützung der letzten 28 Jahre, die mir letztendlich ermöglichte, diese Arbeit zu

erstellen.

Ganz besonders danke ich auch meinen Freunden, die mich in kleinen und großen Krisen

stets treu begleitet haben und immer für mich da waren.

Robert sei für die rettende Lösung meines Computerproblems gedankt.

Documents

Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur ... · 2.5.1 Möglichkeiten und Grenzen eines Screening-Verfahrens für Proteasen und Amylasen als ergänzende Methode 29