V1: Antikörper Untersuchung in Stichproben - ein ideales .... Riemser Dia-tage/wolf.pdf · Georg.Wolf @LMU.de Institut für Medzinische Mikrobiologie, Infektions-und Seuchenmedizin

1

V1: Antikörper Untersuchung in Stichproben -

ein ideales Instrument für die BVDV-Tilgung?

TankmilchErstlaktationsmilchJungtierfenster

diagnostische Trägheit

Einflussfaktoren: Zeit:

individuell nachweisbare Antikörper 2-3 Wochen

Ansprechen der Stichprobe variabel (Aufstallung ...)

Stichprobenintervall z.B. 6 Monate

GW 1/04

V2: BVD-Virusnachweis im neugeborenen Kalb als einziges Diagnostikum für eine BVDV-Tilgung?

NPI NPI

negativer BVD-VirusnachweisKalb und Mutter sind lebenslang NPIHandelszertifikat über Tierdatenbank abrufbar

positiver BVDV-NachweisKalb ist vorläufig PI, Verbringungsregelung, PI-Bestätigung zu gegebener Zeit, Schlachtung

Untersuchung der Mutter

2

Diagnostik des BVDV-PI-Kalbes mit Blutproben und

mit Ohrstanzproben

[email protected] für Medzinische

Mikrobiologie, Infektions-

und Seuchenmedizin Veterinärstraße 13 D-80539 München

+49 (089) 2180 2533

„Die sichere Definition von BVDV nicht-PI-Tieren, ein lebenslang gültiger Status, spielt bei Tilgungs-programmen für den Tierverkehr eine große Rolle.“

0

2

4

6

8

10

12

14

Mil

ch

au

fna

hm

e L

/Ta

g

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tage p.n.

10

9

9

9 9

9

9

9

9

9 9

9 9

9 9

Milchaufnahme L/Tag MIN

MAX STD

spontane Milchaufnahme aus Tränkeeimer

5‘UTRNproKapsid

ErnsE1E2p7NS2/3

(p80)......3‘UTR

Methoden

Antigen-fängerELISAs

Virusisolierung auf primären Zellen (IF)

RT-PCR (Bern, Stendal, Riems)

Immunhistologie eigen & Zürich

S i d e s c a t t e r

Al

ex

a-

Fl

uo

re

sz

en

z

(F

L1

)

F L 1

#

of

C

el

ls

W B 1 0 3 / 1 0 5

Leukozyten-IF (FACS)

Virusneutrali-sationstestauf primären

Zellen (IF)

Antikörper ELISAs:indirekter Test; p80-blocking-Test

3

kolostraleAntikörper

1E-1

1E0

1E1

1E2

1E3

1E4

Tit

er

p80 (

CE

DI

= 5

0%

Blo

ck)

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tage p.n.

A172 B165 C180 D195 E185 F

G168 H188 I J67 K149

BVDV-PI CR4043

-20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

% In

hib

itio

n (

EL

ISA

)

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tag p.n.

A172 B165 C180 D195 E185 F

G168 H188 I J67 K149

BVDV-CR4043 - PI-Tiere

NS2/3-Antikörper (CEDI p80 blocking)

1E-1

1E0

1E1

1E2

1E3

1E4

Tit

er

p8

0 (

CE

DI

= 5

0%

Blo

ck

)

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tage p.n.

A172 B165 C180 D195 E185 F

G168 H188 I J67 K149

BVDV-PI CR4043

-10%

10%

30%

50%

70%

90%

110%

130%

150%

%-W

ert

rel. z

u P

osit

ivko

ntr

olle

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tage p.n.

A33 B32 C20 D39 E46 F35

G20 H28 I36 K15 J~4


BVDV-Antikörper ind. ELISA Barvac

0

2

4

6

8

10

12

14 M

ilch

au

fnah

me L

/Tag

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tage p.n.

10

9

9

9 9

9

9

9

9

9 9

9 9 9

9


MAX STD

spontane Milchaufnahme aus Tränkeeimer

BVDV-Isolierung aus Leukozyten

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

"Tit

er"

10

e-X

WB

C =

TC

ID5

0

0 14 28 42 56 70 Tage p.n.

BVDV-Isolierung

Ayla (BVDV-1 PT810 dG 81)

BVDV-Isolierung (log 10, Doppelansatz)

neg.

-6,5

-5,5

-4,5

-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

1,5

2,5

10e-X

WB

C =

TC

ID50

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Tage p.n.

Agnes Benni Chrissi Dany Edi Finni

Gina Hansi Ikarus Judith Karli


log10; rechnerisch 0:= 1 Leukozyt

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

"Tit

er"

10

e-X

WB

C =

TC

ID5

0

0 14 28 42 56 70 Tage p.n.

BVDV-Isolierung

Ayla (BVDV-1 PT810 dG 81)

BVDV-Isolierung (log 10, Doppelansatz)

neg.

4

BVDV-NS2/3 in Leukozyten

0

2

4

6

8

10

12

14

Mil

ch

au

fna

hm

e L

/Ta

g

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 day after birth

10

9

9

9 9

9

9

9

9

9 9

9 9

9 9


MAX STD

Milchaufnahme L/Tag

1E-1

1E0

1E1

1E2

1E3

1E4

Tit

er

p8

0 (

CE

DI

= 5

0%

Blo

ck

)

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tage p.n.

A172 B165 C180 D195 E185 F

G168 H188 I J67 K149

BVDV-PI CR4043

-10%

10%

30%

50%

70%

90%

110%

130%

150%

%-W

ert

re

l. z

u P

os

itiv

ko

ntr

oll

e

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tage p.n.

A33 B32 C20 D39 E46 F35

G20 H28 I36 K15 J~4



Immunfluoreszenz (FACS)

-5%

5%

15%

25%

35%

45%

55%

% W

B1

03

/10

5 p

os

itiv

e W

BC

0

2

4

6

8

10

12

14

Milc

ha

ufn

ah

me

L/T

ag

0 7 14 21 28 35 42 49 Tage p.n.

Lymphozyten Granulo-/Monoz. Milch Tag 1-14

Edi (BVDV-1 CR4043 dG 62-69)

Kolostrum & BVDV-Antigen in WBC

Immunfluoreszenz (FACS)


1E-1

1E0

1E1

1E2

1E3

1E4

Tit

er

p8

0 (

CE

DI

= 5

0%

Blo

ck

)

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tage p.n.

A172 B165 C180 D195 E185 F

G168 H188 I J67 K149

BVDV-PI CR4043

-10%

10%

30%

50%

70%

90%

110%

130%

150%

%-W

ert

re

l. z

u P

os

itiv

ko

ntr

oll

e

0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Tage p.n.

A33 B32 C20 D39 E46 F35

G20 H28 I36 K15 J~4



-5%

5%

15%

25%

35%

45%

55%

% W

B1

03

/10

5 p

os

itiv

e W

BC

0

2

4

6

8

10

12

14

Mil

ch

au

fna

hm

e L

/Ta

g

0 7 14 21 28 35 42 49 Tage p.n.

Lymphozyten Granulo-/Monoz. Milch Tag 1-14

Edi (BVDV-1 CR4043 dG 62-69)

Kolostrum & BVDV-Antigen in WBC

-0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

% W

B1

03

/10

5 IF

-po

sit

iv

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.

Agnes (BVDV-1 CR4043 dG 97-104) Benni (BVDV-1 CR4043 dG 84-91) Chrissi (BVDV-1 CR4043 dG 83-90)

Dany (BVDV-1 CR4043 dG 54) Edi (BVDV-1 CR4043 dG 62-69) Finni (BVDV-1 CR4043 dG 56-63)

Gina (BVDV-1 CR4043 dG 52-59) Hansi (BVDV-1 CR4043 dG 43-50) Ingo (BVDV-1 CR4043 dG 40-47)

Judith (BVDV-1 CR4043 dG 98-105) Karli (BVDV-1 CR4043 dG 97-104)

BVDV-CR4043: diagnostische Lücke

NS2-3 in Monoz./neutroph. Granuloz.

cut off 1%-0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

% W

B1

03

/10

5 IF

-po

sit

iv

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.





BVDV-CR4043: diagnostische LückeBVDV-NS2-3 in Lymphozyten

cut off 1%

-5%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

55%

60%

% N

S2

/3 IF

po

sit

ive

WB

C

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 Tage p.n.

Lymphozyten Granulo-/Monoz.

Ayla (BVDV-1 PT810 dG 81)BVDV NS2/3 in Leukozyten

1% cut off

5


Antigen-Fänger

ELISAs p80

-10%

10%

30%

50%

70%

90%

110%

130%

150%

%-W

ert

re

l. z

u P

os

itiv

ko

ntr

oll

e

0 14 28 42 56 70 Tage p.n.

A33 B32 C20 D39 E46 F35

G20 H28 I36 K15 J~4



-0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

% W

B1

03

/10

5 I

F-p

os

itiv

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.





BVDV-CR4043: diagnostische Lücke

NS2-3 in Monoz./neutroph. Granuloz.

cut off 1%

-10%

40%

90%

140%

190%

240%

290%

340%

EL

ISA

%-W

ert

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Alter (Tage)


Gina Hansi Ingo Judith Karli


o p80

BVDV-Erns im Serum/Plasma

-10%

10%

30%

50%

70%

90%

110%

130%

150%

%-W

ert

rel. z

u P

osit

ivko

ntr

olle

0 14 28 42 56 70 Tage p.n.

A33 B32 C20 D39 E46 F35

G20 H28 I36 K15 J~4



-10%

40%

90%

140%

190%

240%

290%

340%

EL

ISA

%-W

ert

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Alter (Tage)




o p80

-0,1

0,4

0,9

1,4

1,9

2,4

2,9

3,4

3,9

4,4

4,9

OD

( -

µ n

eg

.KO

)

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.





BVDV-CR4043: diagnostische LückeTest cc Erns Serum 4°C

cut off

6

BVDV-Antigen (polyklonaler

capture ELISA) Serum/Plasma

-10%

10%

30%

50%

70%

90%

110%

130%

150%%

-Wert

rel. z

u P

osit

ivko

ntr

olle

0 14 28 42 56 70 Tage p.n.

A33 B32 C20 D39 E46 F35

G20 H28 I36 K15 J~4



-10%

40%

90%

140%

190%

240%

290%

340%

EL

ISA

%-W

ert

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Alter (Tage)




o p80

-0,1

0,4

0,9

1,4

1,9

2,4

2,9

3,4

3,9

4,4

4,9

OD

( -

µ n

eg

.KO

)

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.






cut off

-10%

40%

90%

140%

190%

EL

ISA

%

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.





BVDV-CR4043: diagnostische LückeBVDV-Antigen, capture polyklonal

cut off

-0,1

0,4

0,9

1,4

1,9

2,4

2,9

3,4

3,9

4,4

4,9

OD

( -

µ n

eg

.KO

)

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.

Agnes (BVDV-1 CR4043 dG 97-104)Benni (BVDV-1 CR4043 dG 84-91) Chrissi (BVDV-1 CR4043 dG 83-90)



Judith (BVDV-1 CR4043 dG 98-105)Karli (BVDV-1 CR4043 dG 97-104)


cut off

-10%

40%

90%

140%

190%

EL

ISA

%

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Tage p.n.





BVDV-CR4043: diagnostische LückeBVDV-Antigen, capture polyklonal

cut off

-5%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

55%

% W

B103/1

05 p

osit

ive W

BC

-0,1

0,4

0,9

1,4

1,9

2,4

2,9

3,4

3,9

4,4

4,9

EL

ISA

OD

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77

day after birth


Test cc Erns Serum -20°C

Ayla (BVDV-1 PT810 dG 81)Test cc Erns Serum -20°C

1% cut off

-5%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

55%

% W

B1

03

/10

5 p

os

itiv

e W

BC

-10%0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%110%120%130%140%150%160%170%180%190%200%

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77

Tage p.n.


test dd Erns Serum -20°C

Ayla (BVDV-1 PT810 dG 81)test dd Erns Serum -20°C

30% cut off

BVDV-Antigen-capture ELISA Serum/Plasma Erns polyklonal

7

PCR mit Leukozyten-Pellets (Riems): analog BVDV-Isolierung aus Leukozyten

-6,5

-5,5

-4,5

-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

1,5

2,5

10

e-X

WB

C =

TC

ID5

0

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Tage p.n.Agnes Benni Chrissi Dany

Edi Finni Gina Hansi

Ikarus Judith Karli Ayla (PT810)


log10; rechnerisch 0:= 1 Leukozyt

PCR mit Serum/Plasma (Stendal)

-5%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

55%

60%

% W

B1

03

/10

5 p

os

itiv

e W

BC

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

10

e-X

WB

C =

TC

ID5

0

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98

day after birth

lymphocytes granulo-/monoc. BVDV-isolation

Edi (BVDV-1 CR4043 dG 62-69)

WBC: BVDV-NS2/3 and BVDV-isolation

1% cut off

Ct-Wert Leukos: 26,6Serum/Plasma: >38

ct-Werte (N=6 Kälber)

Lücke nachher ∆∆∆∆Leukos: 27,2 22,0 5,2Serum: 35,1 26,8 8,3Plasma: 34,7 25,7 9,0

Untersuchungsmaterial getrocknete Ohrstanze

GW 1/04

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

OD

-Wert

e

0 7 14 21 28 35 42 49 Tage p.n.

A B C D E F G H I J K

BVDV-PI (BVDV-1 CR4043)

Ohrstanze Erns OD

Kälber:

cut off 0,30

oben: ACEplus

unten: ACE

BVDV-Ernscapture ELISA

-0,1

0,4

0,9

1,4

1,9

2,4

2,9

3,4

3,9

4,4

4,9

OD

( -

µ n

eg

.KO

)

0 7 14 21 28 35 42 49 Tage p.n.


cut off

-5%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

55%

% W

B1

03

/10

5 p

os

itiv

e W

BC

-0,1

0,4

0,9

1,4

1,9

2,4

2,9

3,4

3,9

4,4

4,9

EL

ISA

OD

0 7 14 21 28 35 42 49

day after birth


Test cc Erns Serum -20°C

Ayla (BVDV-1 PT810 dG 81)Test cc Erns Serum -20°C

1% cut off

?; ?; ?; ?; AylaAylaAylaAyla

geb.geb.geb.geb.

7.3.19947.3.19947.3.19947.3.1994

A-Kgeb. 2003/2004

8

Diagnostikprojekt Ohrstanze & BVDV:(BVDV-CR4043 - Studie TSK Bayern, BMVEL)

IRG 9/05

Test Analyt Titer Varianz Ak-Einfluss

A/B/C p80=NS3 4 hoch ++++

D Erns 32 gering ++

E/F polyklonal 50 gering ++

G 5‘UTR-PCR 1-10 4 sehr hoch -

H 5‘UTR-PCR 0-10 3 sehr hoch -

G€ 5‘UTR-PCR 10 3,5 gering (?) -

Test Analyt Titer Varianz Ak-Einfluss unsp.I.

A/B/C p80=NS3 4 hoch ++++

D Erns 32 gering ++ ??

E/F polyklonal 50 gering ++ ??

G 5‘UTR-PCR 1-10 4 sehr hoch -

H 5‘UTR-PCR 0-10 3 sehr hoch -

G€ 5‘UTR-PCR 10 3,5 gering (?) - ??

BVDV-Isolierung 10----------30

GW 9/05

0 1 2 3 4 5 6 7 .10..14......30...40..........60.........90......

PCR Serum 3-------------------------------40 PCR Leukos keine Lücke bei Einzelproben (?)Erns/pol. 1-----------------------------------------------60NS2/3 (1)...3-----------------------------------------------------90..(200)

5‘UTRNproKapsid

ErnsE1E2p7NS2/3

(p80)......3‘UTR

BVDV: Diagnostische Lücke bei Blutproben

9

NS2/3 1---------------------------------------------------------90..(200)

GW 9/05

0 1 2 3 4 5 6 7 .10..14......30...40..........60.........90......

PCR keine LückeErns/pol.1-----------? keine Lücke?----------------60

5‘UTRNproKapsid

ErnsE1E2p7NS2/3

(p80)......3‘UTR

BVDV: Diagnostische Lücke bei Ohrstanzen

Immunhistologie keine Lücke

Danke für‘s Zuhören!

Tierpfleger:Hans DöringHans KluschAxel Groß

Labor-TAs:Astrid FreudensteinMichaela ReisigeHilke HubertGudrun Matschke

Tierärzte:Ilona MoßbruggerRobert Fux.....

Kooperationen:Martin Beer

Wolfgang GaedeFelix Ehrensperger

Ernst Peterhansund Mitarbeiter

Sponsoren: Bayerische TSK

BMVEL Bonnalle Hersteller

von Testkits

[email protected] für Medzinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenmedizin

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V1: Antikörper Untersuchung in Stichproben - ein ideales .... Riemser Dia-tage/wolf.pdf · Georg.Wolf @LMU.de Institut für Medzinische Mikrobiologie, Infektions-und Seuchenmedizin