V2: Aktivitätsbestimmung von Enzymen

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Methodik:

• Beobachtung des zeitlichen Verlaufs einer Enzymreaktion über denNachweis von Substraten und Produkten

• Ermittlung von Rahmenbedingungen zur Bestimmung derspezifischen Aktivität der Hefe-ADH auf der Basis des optischen Tests

• Nachweis der Substratspezifität von Enzymen am Beispiel von Proteasen

Messung von Enzymaktivitäten: Warum?

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• Charakterisierung von Enzymen, Aufklärung von Stoffwechselvorgängen

• Labordiagnostik (Vermehrung eines bestimmten Enzyms oftmals Hinweis auf Schädigung eines bestimmten Organs)

z.B. Alkalische Phosphatase → TumormarkerProteasen (Trypsin, Chymotrypsin) → PankreaserkrankungenTransaminasen → Leber- und GallenwegserkrankungenHBDH → Myocardinfarkt

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Enzyme: Katalysatoren des Stoffwechsels

• Enzyme sind Proteine

• Enzyme sind Biokatalysatoren, die den

Stoffwechsel einer Zelle regulieren und organisieren

• Enzyme binden an Substrate und wandeln sie in

chemisch veränderte Produkte um

• Enzyme arbeiten hocheffektiv: Sie beschleunigen

Reaktionen um den Faktor 106 bis 1012

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Unkatalysierte Reaktionen

• Zusammenstoß von A und B äußerst unwahrscheinlich

• Bildung des Übergangszustandes: Aktivierungsenergie notwendig

Was macht ein Enzym?• Komplementäre Bindungsstelle im aktiven Zentrum

• Annäherung und Orientierung der Substrate

• Erreichen des Übergangszustandes ist erleichtert

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Enzyme verringern Aktivierungsenergie

Aktivierungsenergie für Einzelschritte der enzymkatalisiertenReaktion ist geringer

als für die gesamte unkatalysierte Reaktion

Unkatalysiert Enzymkatalysiert

S P

Enzyme kinetics - basics

Rate2 = k2[ES]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

Geschwindigkeits-bestimmender

Schritt

k-1[ES] = k1[E][S]

Gleichgewicht

[ES] = Konstant

“Steady state” BedingungenLineare Änderung von [S] und [P]

Molekularbiologie 06/7

Wovon hängt die Gesamtgeschwindigkeit ab?

Rate2 = k2[ES]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

k-1 [ES]= k1[E][S]

𝑉∆ 𝑃

∆𝑡 𝑘2 ES

V hängt von [S] und [E] abBeide beeinflussen das Gleichgewicht und damit [ES]

Geschwindigkeits-bestimmender

SchrittGleichgewicht

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Die Maximale Geschwindigkeit

je 10 Reaktionen/min

[E]T = [ES]Das Enzym ist gesättigt

For [E] = constant, and [S]>>>[E]

Vmax = 40 Reaktionen/min

𝑉 𝑉∆ 𝑃

∆𝑡 𝑘2 ES ≅ 𝑘2 E T 𝑉 𝑘𝑐𝑎𝑡 E T

Sättigung Sättigung Reaktionsgeschwindigkeit ist unabhängig von [S]

Molekularbiologie 06/9

Begriffe

Spezifische AktivitätMaximale Substratmenge, die pro mg Enzym über eine gewisse Zeit ins Produkt gewandelt wird.

mmol of substrate

min x mg enzyme

Turnover number (kcat)Maximale Substratmenge (Mol), die 1 Mole Enzyme innerhalb 1 Zeiteinheit ins Produkt umwandeln kann.

mmol of substrate

min x mmol enzyme= min-1

Aktivitätsbestimmung  Geschwindigkeitsmessung

Bei Vorliegen des Enzyms in Proteingemisch , Angabe in U/mgWobei: 1U enzyme converts 1 mol of substrate per minute

mg mg total protein

1/60 = sec-1

1010

Turnover Number, kcat bzw. spezifische Aktivität

Kcat:

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Teilversuche

1. Beobachtung des zeitlichen Verlaufes einer Enzymreaktion und Berechnung von Substrat- und Produktmengen aus dem Beer-Lambert Gesetz

2. Bestimmung der spezifischen Aktivität eines Enzymes

3. Nachweise der Substratspäzifität von zwei Enzymen

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Ziel von Teilversuch 2.1

• Zeitlicher Verlauf einer Gleichgewichtsreaktion• Berechnung von Substrat- und Produktmengen

aus Lambert Beerschem Gesetz

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Teilversuch 1 - Zeitlicher Verlauf einer Enzymreaktion

Sorbinalkohol + NAD+ → Sorbinaldehyd + NADH + H+

Coenzym

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Teilversuch 1 - Anzatz

1,955 ml Testpuffer10 µl NAD+

15 µl ADH20 µl Sorbinalkohol

Testansatz:

C2H5OH + NAD+ C2H4O + NADH + H+

340 nm280 nm259 nm228 nm

ADH

Bis 220 nm280 nm

ADH NAD+

Basislinie mit Gesamtansatz bloß OHNE ALKOHOL

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Teilversuch 1 - Zeitliche Umsetzung von Sorbinalkoholdurch ADH

aus maximalem Umsatz (20 min)Menge an gebildetem Sorbinaldehyd und NAD+ bestimmen

Von gelesene E

Beer-LambertE = c d

Konzentrationswerte

Volume

nmol

228 nmAlkohol

280 nmAldehyd

340 nmNADH

Bestimmung von spezifische Aktivität - Tangentenverfahren

[t]

E

t

E

[t]

E

t

E

LinearePhase

LinearePhase

NADH, Sorbinaldehyd

Sorbinalkohol Tangentenfefahren

∆𝐸 𝜀 · ∆𝑐 · 𝑑

E

𝑉0∆𝑃∆𝑡

∆𝑐 · 𝑣𝑜𝑙𝑚𝑖𝑛

∆𝐸 · 2𝑚𝑙𝑚𝑖𝑛 · 𝜀 · 𝑑

μmolmin

𝐴𝑉0

mg enzym U/mg

Von E zu A:

NADH

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Ziel von Teilversuch 2

• Bestimmung von spezifischen Aktivitäten• Vergleich der spezifischen Aktivitäten für

homologe Substrate

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Teilversuch 2: Bestimmung der spezifischen Aktivität der ADH für EtOH

• Enzymreaktion siehe Teilversuch 1, aber mit EtOH als Substrat • Messung der Reduktion von NADH bei 340 nm• Für Zeitraum von 2‘ optimalen Konzentrationsbereich der ADH finden, der eine verlässliche

Aktivitätsbestimmung zulässt (Verdopplung, Halbierung, Vorverdünnung der Enzymlösung: steadystate, Linearität!)

V ist von [S] und [E] beeinflusst. Wir arbeiten mit:- Variable Enzymkonzentration- Konstante Substratskonzentration in Sättigungsbereich

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Teilversuch 2: Bestimmung der spezifischen Aktivität der ADH für EtOH

• 5 verschiedene Enzymkonzentrationen auswählen (Verdünnung in Phosphatpuffer mit RSA) und ΔE/min bestimmen (Glasküvetten)

Start der Reaktion durch Zugabe des Enzyms (5 – 50 µl): optimale Enzymmenge bestimmen (s.o.)!

• Reaktionsgeschwindigkeit in µmol/minBerechnung der spez. Akt. in µmol/min/mg = U/mg und Berechnung der Wechselzahl

x ml Testpuffer100 µl NAD+

60 µl EthanolLeerwert (Abgleich des Photometers bei 340 nm)

y = 0,0154x ‐ 0,0098

00,010,020,030,040,050,060,070,08

0,05 0,15 0,25 0,35 0,45

Reaktio

nsge

schw

indigkeit 

[µmol/m

in]

Enzymmenge [µg]

Unit/mgBeide machen!

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Auswertung Teilversuch 2.2

• Berechnung der Enzymmenge im TestansatzVerdünnung

• Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit P/tE/t Beer Lambert P/t

• Berechnung der spezifischen AktivitätReaktionsgeschwindigkeit /Menge von EnzymEinzelwerte E/t + Linear plot von V0 gegen g

• Vergleich der spezifischen Aktivitäten von ADH für EtOH/Sorbinalkohol

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Ziel von Teilversuch

• Nachweis der Substratspezifität von Enzymen

Durch Bestimmung von der spezifischen Aktivität mit verschiedenen Substraten

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Teilversuch 3: Substratspezifität von Enzymen

… am Beispiel der Serinproteasen Trypsin und Chymotrypsin

Superpositionof trypsin

and chymotrypsin

Wenzhe Ma, Chao Tang, Luhua Lai, Biophys J. 2005 Aug; 89(2): 1183–1193.

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Teilversuch 3: Substratspezifität von Enzymen

• Benzoyl-D,L-arginin-p-nitroanilid (BNA):

• N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-4-nitroanilid (SPNA):

Substrat für Trypsin

Substrat für Chymotrypsin

Frage: Nach welchen Aminosäuren könnten diese Proteasen spalten?

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Chromogene Substrate

ε Nitroanilin: 9,96 cm2 / µmol

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Ablauf von Teilversuch 2.3

Substratspezifität von Proteasen und Bestimmung der spezifischen Aktivität• Enzymreaktion mit 2 synthetischen chromogenen Substraten • Farbnachweis über Nitroanilin ( = 405 nm, Einwegküvetten) • Substratspezifität: Jedes Substrat wird mit beiden Enzymen getestet

(Verdünnungen nach Angabe)• Vorversuch: Einstellung der Enzymmenge

• Messung bei 3 verschiedenen Enzymkonzentrationen (5-50 µl; entsprechende Verdünnung)Start der Reaktion durch Enzymzugabe

• Berechnung von Menge mg Enzym im Testansatz und der Reaktionsgeschwindigkeit • spez. Aktivität: aus Einzelwerten bzw. aus Grafik (V gegen Enzymmenge; Anstieg = U/mg)

ΔE/min

t

Substratspezifität von Enzymen

spez. Aktivität für einzelne Substrate lässt Aussagen zur

Substratspezifität der Proteasen zu:

Trypsin: nach basischen Aminosäuren

Chymotrypsin: nach großen, hydrophoben Aminosäuren