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Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation · PDF fileGenomreplikation von DNA-Viren Sommersemester 2006 Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation Elisabeth

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  • Genomreplikation von DNA-Viren

    Sommersemester 2006

    Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation

    Elisabeth SchwarzDKFZ

    20. Juni 2006

  • Genexpression und DNA-Replikation

    frh (early, E) spt (late, L)

    Early-late switch

  • Replikation von DNA-Viren

    Wo: Cytoplasma oder Kern?Kern > Transkription

    > DNA-Replikation

    G2

    S

    G1

    MS-Phaseangewiesen auf S-PhaseInduktion von S-Phase

    Wann?

  • DNA-Replikation

    DNA-abhngige DNA-Polymerasen

    semikonservative Replikation

    Initiation:origin of replication = ori (Replikationsursprung)

    Elongation:bidirektionale ReplikationReplikationsgabelnbidirektionale Wanderungsrichtung der ReplikationsgabelReplikationsblasen

    +

  • DNA-Replikation keine de-novo-Synthese! RNA-Primer

    DNA-Synthese durch Anheftung von Nucleotiden an das 3'-OH-Endeder RNA-Primer

    Template (Matrize) und Primer (Starter)

    Direktionalitt: Kettenverlngerung in 5'-> 3'-Richtung

    dsDNA: Strnge komplementr und antiparallelPolymerisationsrichtung = Wanderungsrichtung der Replikationsgabel>kontinuierliche Synthese (leading strand, Leitstrang, Vorwrtsstrang)Polymerisationsrichtung gegenlufig zur Wanderungsrichtung>diskontinuierliche Synthese (lagging strand, Folgestrang, Rckwrtsstrang)

    Molecular Cell Biology, 2004

  • Initiation der DNA-Replikation

    1.

    2.

    3.

    4.

    SV40

    T-Ag

    T-Ag

    T-Ag

    T-Ag

    Zelle

    ORC

    Cdc6/Cdt1/ORC

    MCM

    Cdc6/Cdt1/ORC

  • Ziel: viele neue Virusgenome

    T-Antigen

    SV40 Ziel: Verdopplung! origin licensing + origin-Aktivierung ORC (origin recognition

    complex, 6 Proteine) CDC6, CDT1 MCM2-7 CDC7, S-CDKs, CDC45

    Chromosom

    DNA-Replikation

  • DNA-Replikationvon SV40

    12

    3

    44

    3

    2

    1

    oribidirektionaleReplikation

    Molecular Cell Biology, 1999

    Fareed et al., 1972

  • DNA-Replikation von SV40

    Bindung von T-Antigen (doppeltes Hexamer) an ORI

    lokales Entwinden der Doppelhelix(Helicase-Aktivitt von T-Antigen)

    ffnen des Doppelstrangs (bentigt ATP + RFA als ssDBP)

    Bindung von Primase-Polymerase-alpha

    Synthese der Primer durch Primase Bindung von RFC stimuliert dieLeitstrang-Synthese

    Molecular Cell Biology, 1999

  • Bindung von PCNA> Inhibition und Verdrngung von Pol> Unterbrechung der Leitstrang-

    Synthese Bindung von Pol an PCNA/RFC> erhhte Prozessivitt> Synthese des Leitstrangs Bindung von Pol-Primase (+ RFC) anFolgestrang-Template

    Synthese des Folgestrangs> Okazaki-Fragmente (100-200 Nucl.) Entfernen der RNA-Primer durch5>3-Exonuclease-Aktivitt von Pol

    Auffllen und Ligation der Fragmente Wanderung der Replikationsgabel:durch T-Antigen erleichtert

    Trennung der beiden Tochtermolekle:Topoisomerase II Molecular Cell Biology, 1999

    DNA-Replikation von SV40

  • Molecular Cell Biology, 2004

  • Struktur des SV40 oriminimaler ori: ca. 65 bp, 3 essentielle Elemente T-Ag-Bindungsstelle II

    inverted repeat, 23-34 bp, GC-reich T-Bindungsstellen G-A/G-G-G-C

    AT-reiche Sequenz (15-20 bp) early imperfect palindrome

    Principles of Virology, 1999, 2004

  • SV40: T-Ag und origin

    Hexamer-Bildung von T-AgBindung an LT-BS IIStrukturvernderung von earlypalindrome (EP)Bindung von RFA (RpA)Entwinden der DNA-StrngeStabilisierung durch RFA

    1.

    2.

    3.

    Principles of Virology, 1999, 2004

  • SV40 DNA-Replikation

    Prinitiationskomplex:ori + T-Ag + RFA

    Initiationskomplex:(ori + T-Ag + RFA) + Primase-Pol

    Bildung des Initiationskomplexes bestimmt den engen Wirtsbereich von Polyomaviren

    Principles of Virology, 1999, 2004

  • SV40 DNA-ReplikationTopoisomerasen

    Decatenation

    Principles of Virology, 2004

  • Papillomaviruses Different modes of DNA replication

    1. Establishment replicationLimited amplification:50-100 copies/cell

    2. Maintenance replication(1+2: bidirectional replication)

    3. Productive replication(rolling circle replication)

    Principles of Virology, 2004

  • Rolling-circle replication

    Principles of Virology, 1999

  • Initiation der DNA-Replikationbei Papillomviren

    1. Kooperative Bindung von E1 und E2 an ori.2. ATP-abhngige Bindung von weiteren E1-Moleklen

    und Verdrngung von E2

  • Das Enden-Replikationsproblembei linearen DNA-Genomen

    Principles of Virology, 1999

  • Problem: Replikation der GenomendenProblemlsungen

    eukaryote Chromosomen

    Bakteriophage T7 Bakteriophage T4 Adenoviren Herpesviren

    Bakteriophage Lambda Pockenviren Parvoviren

    Telomere / Telomerase

    terminale Redundanz (tR)tR, zirkulre PermutationProtein-PrimerZirkularisierung

    self priming, hairpin loopsself priming

  • Bakteriophage T7

    Virion:polyedrischer Kopf (Durchmesser 30 nm)kurzer, nicht kontraktiler SchwanzFamilie Podoviridae

    Genom:ds-DNA, linear, ca. 40 kbSequenzwiederholungen an den Enden(160 bp): > terminale Redundanz

    Bakterienviren, 1992

  • Bakteriophage T7: DNA-Replikation

    origin bei ca. 15% am linken Genomende bidirektionale Replikation (RNA-Primer) unvollstndige Replikation des Folgestrangs

    > einzelstrngige 3-Enden wegen terminaler Repeats: berstehende 3-Enden komplementr Zusammenlagerung zu Dimeren Auffllen der Lcken durch DNA-Ligase sequenzspezifische versetzte Spaltung durch Endonuclease gp3

    > berstehende 5-Enden Auffllen der Einzelstrang-Enden

    > vollstndige Genome mit terminalen Repeats bei weiterer Replikation: Bildung von Konkatemeren

    (bis ca. 100 Kopien) durch Stranginvasion (strand invasion)

  • Bakteriophage T7: DNA-Replikation

    5-ATTCAT ATTCAT-33-TAAGTA TAAGTA-5

    ori

    5-ATTCAT ATTCAT3-TAAGTA TAAGTA

    ATTCAT-3TAAGTA-5

    ba

    5-ATTCAT ATTCAT-33-TAAGTA -5

    5- ATTCAT-33-TAAGTA TAAGTA-5

    +a

    b

    bid. Replikation

    ZusammenlagerungLigation

  • Bakteriophage T7: DNA-Replikation

    a

    5-ATTCAT ATTCAT-3-TAAGTA TAAGTA-

    ATTCAT-3TAAGTA-5

    a b

    Spaltung durch gp3

    5-ATTCAT ATTCAT-33-TAAGTA TAAGTA-5

    b+5-ATTCAT ATTCAT-33-TAAGTA TAAGTA-5

    5-ATTCAT

    5-ATTCAT

    3-TAAGTA TAAGTA-5

    ATTCAT-3TAAGTA-5

    +

    aAuffllen der Enden

    b

  • Bakteriophage T4Virion:elongierter polyedrischer Kopf (111 nm x 78 nm)langer kontraktiler SchwanzFamilie Myoviridae, geradzahlige T-Phagen

    Genom:ds-DNA, linear, ca. 166 kbGenom in Virionen ca. 171 kb, wegen:Sequenzwiederholungen an den Enden (ca 5 kb): terminale Redundanzzirkulre Permutation

    Viren, 1993

  • Bakteriophage T4: DNA-Replikation mehrere origins frhe Replikation: bidirektionale Replikation > unvollstndige Enden

    spte Replikation:Konkatemerbildung durch Rekombination(recombination-dependent DNA replication)Invasion der 3-Enden in homologe ds-DNA (strand invasion)> komplexes Netzwerk von replizierender Virus-DNA

    Verpackung des Genoms in Phagenkopf:head full-MechanismusVerpackungslnge grer als Genomlnge> terminale Redundanz, zirkulre Permutation

  • Bakteriophage T4: DNA-Replikation

    ABCD...........YZA

    BCDE..........YZAB

    CDEF.........YZABC

    Terminale Redundanz und zirkulre Permutation

    A A A A AZ Z Z ZA A A A A A AZ Z Z Z Z Z Z

  • T4 + T7: Virale ReplikationsfaktorenT4 DNA-Polymerase

    (gp43) Helikase, Primase

    (gp41 + gp61) Einzelstrang-bindendes

    Protein gp32 ca. 30 virale

    Genprodukteinsgesamt

    T7 DNA-Polymerase

    (gp5) Helikase, Primase

    (gp4) Endonuclease

    (gp3) DNA-Ligase

    >> autonomer viraler Replikationsapparat mit allennotwendigen Komponenten

  • Adenoviren

    Viruspartikel: Ikosaeder (Durchmesser 80-110 nm) 252 Capsomere(240 Hexone, 12 Pentone)

    1953 aus Rachenmandeln (adenoids) isoliert

    Erkrankungen der Atemwege, des Gastrointestinalbereichs, der Augenbindehaut

    >100 Adenovirus-Typen bei Wirbeltieren

    Adenoviren als Modellsysteme: effiziente Vermehrung in Zellkultur Genexpression: Splicing DNA-Replikation Onkogenese, Zelltransformation Vektoren Viren, 1993

  • Adenoviren: Genom

    terminales Protein TP kovalent an 5-Enden Interaktion der TPs > quasizirkulrer Zustand der DNA Strangtrennung: ITRs > Hybridisierung der komplementren Sequenzen > Pfannenstiel-Strukturen

    lineare doppelstrngige DNA, 36 38 kb inverted terminal repeats (ITRs, 54-166 bp)

    Molekulare Virologie, 2003

  • Adenoviren: InitiationTP 80 kD TP 55 kD

    Bindung von pTP + Pol an terminalen ORI

    Bindung von NF-1 und Oct-1 an ORI kovalente Bindung von dCMP an Serin-OH: TP-C (Protein-Primer) TP-C komplementr zu 3-terminalem G Initiation der DNA-Synthese an TP-C Bindung von ssDBP an verdrngten Einzelstrang

    M

    olek

    ular

    e V

    irolo

    gie,

    200

    3

  • Adenoviren: ElongationPhase I: kontinuierliche Leitstrang-synthese

    Strangverdrngung(strand displacement)

    Phase II: verdrngter Strang: ITR>Pfannenstielstruktur

    Gegenstrangsynthese

    Virale Replikationsproteine: Pol, pTP, ssDBP

    Molekulare Virologie, 2003

  • Herpesviren groe umhllte Viren (Durchmesser 100-200 nm) Envelope durch Knospung an innerer Kernmembran lytische Infektion Etablierung von latenten Infektionen (> Viruspersistenz)

    Reaktivierung

    Genom: lineare ds-DNA(130-240 kb)

    im Virus-Corespulenfrmig um Proteinmatrix gewickelt

    Enden werden zus