Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen

WS 09/10Praktikum

Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie15.-19.02.10

Abbildungen zur

SDS-PAGE und zum

Western Blot

Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen

PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie

Verwendete Proteinmärker

Gel # 1Proteinfärbung nach dem SDS-

PAGE:Proteinkontrolle zum Nachweis von

PAL und CHS nach Blotting

Fotos Western Blot: Gruppen 1 und 5

SDS-PAGE

Gel # 5Proteinfärbung nach dem SDS-

PAGE:Proteinkontrolle zum Nachweis von

RubisCO nach Blotting

Probenauftrag Gele 1-4 (L R):

Marker (s.o.) RE Kontrollzellen RE Zellen mit 1 nM Pep13 RE Zellen mit 10 nM Pep13 RE Zellen mit 100 nM Pep13 RE Zellen mit 1 µM Pep13 RE Zellen mit 50 µM AgNO3

Marker

Probenauftrag Gele 5-6 (L R):

Marker (s.o.) RE Spinatblatt (1) RE Spinatblatt (2) RE Gartenkresse-Blatt RE Maisblatt RE Kontrolle Kulturzellen Re Zellen mit 1µM Pep13 Marker

Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen

PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie

Fotos Western Blot: Gel # 2

Zum Nachweis von PAL

Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot

Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit Anti-PAL-

Primärantikörpern

Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting

Fazit:

Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen

Ein starker immunchemischer Signal bei einem Protein knapp > 70 kD und ein schwächerer bei ca. 50 kD. Beide Signale unspezifisch, da gute Reaktion überall vorhanden, unabhängig von Pep13-Behandlung

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PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie

Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot

Fotos Western Blot: Gel # 3

Zum Nachweis von CHS und von PAL nach Immunoabsortion

Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit CHS-Primärantikörpern

und mit Anti-PAL-Primärantikörpern nach versuchten Immunoabsorption von

unspezifischem 70 kD-Protein

Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting

Fazit:

Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen

Immunchemische Signale wie für Gel #2, wenn auch etwas schwächer. D.h. keine sichtbare Reaktion auf CHS; versuchte Immunoabsorption von Antikörpern gegen unspezifischem 70 kD-Protein im Anti-PAL-Serum (s. Gel # 4) nicht geglückt!

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PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie

Fotos Western Blot: Gruppe 4

Bereitstellung von 70 kD-Protein zur Immunoabsorption von unspezifischen Proteinen, die mit Anti-PAL-Antiserum

reagieren

Ausschnitt des 70 kD_Proteins aus dem Membran nach dem Blot zur Immunoabsorption mit

dem PAL-Antiserum

Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot

Das ausgeschnittene Membranstuck entsprechend Protein von ca. 70 kD, das unspezifisch mit unseren Anti-PAL-Serum reagiert, wurde mit TBS-Milchpulver blockiert und dann für eine Stunde mit Anti-PAL-Serum (1:1000 Verdünnung in TBS-Milchpulver) inkubiert

Diese versucht Immunoabsorption der unspezifischen Antikörper war aber nach dem Enzym-Nachweis mit dem Membran von Gel # 3 (s.o.) aber nicht erfolgreich!

Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting

(Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen)

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PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie

Fotos Western Blot: Gel # 6

Zum Nachweis von RubisCO

Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit Anti-RubisCO-

Primärantikörpern

Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting

Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot

Fazit:

Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen

Ein starker immunchemischer Signal bei einem Protein von ca. 50 kD (≈ große Untereinheit von RubisCO) in den Blattproben, aber nicht bzw. Kaum in den Kulturzellproben

Signal spezifisch für RubisCO, auch wenn einige weitere Reaktionen ersichtlich sind