Aus dem Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Molekulare Grundlagen des defekten Transports eines Glykoproteins

bei der Pathogenese

der Congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Valentina Ritz

aus Lugano (Schweiz)

Hannover 2002

2

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Hassan Y. Naim 1. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. Hassan Y. Naim 2. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. Georg Herrler Tag der mündlichen Prüfung: 4.6.2002

3

Meinen Eltern

4

5

1. EINLEITUNG 1

1.1 EINLEITUNG 1

1.2 DER SEKRETORISCHE WEG FÜHRT DIE MEISTEN PROTEINE DURCH DAS ER 1

1.3 MOLEKULARE CHAPERONE 5

1.4 KORREKTE FALTUNG ALS VORAUSSETZUNG FÜR INTRAZELLULÄREN

PROTEINTRANSPORT 8

1.5 TRANSPORT IN POLAREN EPITHELZELLEN 10

1.6 DIE ROLLE DER PROTEINPROZESSIERUNG IN DER PATHOPHYSIOLOGIE VON GENETISCH

BEDINGTEN ERKRANKUNGEN 11

1.7 SACCHARASE-ISOMALTASE (SI), EIN GLYKOPROTEIN DER APIKALEN

BÜRSTENSAUMMEMBRAN DES DARMS 14

1.8 BIOSYNTHESE, REIFUNG UND STRUKTUR DER HUMANEN SACCHARASE-ISOMALTASE 15

1.9 ENZYMDEFIZIENZEN UND PHÄNOTYPEN DER CONGENITALEN

SACCHARASE-ISOMALTASE DEFIZIENZ (CSID) 19

2. MATERIAL UND METHODEN 24

2.1. MATERIAL 24

2.1.1. BIOPSIEN AUS HUMANER DARMSCHLEIMHAUT 24

2.1.2. REAGENZIEN FÜR DIE CDNA-ISOLIERUNG 24

2.1.3. OLIGONUKLEOTIDE ZUR AMPLIFIZIERUNG DER PATIENTEN CDNA 25

2.1.4. REAGENZIEN FÜR DIE POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) UND FÜR DIE

KLONIERUNG IN EINEN VEKTOR 26

2.1.5. CHEMISCH KOMPETENTE BAKTERIEN 27

2.1.6. BAKTERIENNÄHRMEDIEN 28

2.1.7. LÖSUNGEN FÜR PLASMIDPRÄPARATIONEN 28

2.1.8. GRÖßENSTANDARD FÜR DNA/ MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD FÜR PROTEINE 29

2.1.9. REAGENZIEN FÜR DIE OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE MUTAGENESE 30

6

2.1.10. OLIGONUKLEOTIDE, DIE IN DER OLIGONUKLEOTID-GERICHTETEN MUTAGENESE

VERWENDET WURDEN 30

2.1.11. PLASMIDE 31

2.1.12. ZELLLINIEN 31

2.1.13. KULTURMEDIUM FÜR SÄUGERZELLEN 32

2.1.14. REAGENZIEN, DIE IN DER ZELLKULTUR EINGESETZT WURDEN 33

2.1.15. ANTIKÖRPER 33

2.1.16. PUFFER UND PROTEASE-INHIBITOREN, DIE BEI IMMUNPRÄZIPITATIONEN

VERWENDET WURDEN 34

2.1.17. ALLGEMEIN VERWENDETE PUFFER 35

2.1.18. REAGENZIEN FÜR DEGLYKOSYLIERUNGSREAKTIONEN UND

PROTEASESENSITIVITÄTSVERSUCHE 35

2.1.19. PUFFER UND REAGENZIEN FÜR ELEKTROPHORESEN 36

2.1.20. MATERIALIEN FÜR DIE AUTOMATISCHE SEQUENZIERUNG VON DNA 37

2.1.21. MATERIALIEN FÜR DIE IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE 38

2.1.22. MATERIALIEN FÜR DIE KONFOKALE FLUORESZENZMIKROSKOPIE 38

2.1.23. LÖSUNGEN FÜR DEN ENZYMAKTIVITÄTSTEST 38

2.2. METHODEN 39

2.2.1. HOMOGENISIERUNG DER DARMBIOPSIE 39

2.2.2. ZELLLYSE UND ISOLIERUNG DER GESAMT-RNA 39

2.2.3. REVERSE TRANSKRIPTION DER M-RNA UND CDNA-SYNTHESE 40

2.2.4. POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 41

2.2.5. BESTIMMUNG DER NUKLEINSÄURE-KONZENTRATION 42

2.2.6. AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS GELELEKTROPHORESE 42

2.2.7. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 42

2.2.8. DNA-LIGATION 43

2.2.9. TRANSFORMATION VON E.COLI 44

2.2.10. PLASMID-DNA-PRÄPARATION AUS E.COLI 44

2.2.11. ANZUCHT UND LAGERUNG VON BAKTERIENSTÄMMEN 45

2.2.12. DNA-RESTRIKTION 46

2.2.13. DNA-SEQUENZIERUNG 46

7

2.2.14. OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE MUTAGENESE 47

2.2.15. PFLEGE DER ZELLKULTUR 48

2.2.16. TRANSIENTE TRANSFEKTION VON COS-1-ZELLEN NACH DER DEAE-DEXTRAN-

METHODE 49

2.2.17. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PROTEINEN 50

2.2.18. ZELLLYSE UND IMMUNPRÄZIPITATION 50

2.2.19. ENDOGLYKOSIDASE H- UND ENDOGLYKOSIDASE F- BEHANDLUNG 51

2.2.20. TRYPSIN-BEHANDLUNG 51

2.2.21. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 52

2.2.22. MESSUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT 53

2.2.23. KONFOKALE FLUORESZENZMIKROSKOPIE 53

2.2.24. ORGANKULTUR UND BIOSYNTHETISCHE MARKIERUNG VON BIOPSIEN 54

2.2.25. ELEKTRONENMIKROSKOPIE 54

3. ERGEBNISSE 55

GRUNDLAGEN DER VERSUCHE 55

3.1.1. DIAGNOSE DER CSID 55

3.1.2. BIOCHEMISCHER NACHWEIS DER SI IN DER DARMBIOPSIE DES PATIENTEN

MITTELS IMMUNPRÄZIPITATION 59

3.1.3. ELEKTRONENMIKROSKOPISCHER NACHWEIS DER SI, VON LPH UND VON DPPIV

IN EINER DARMBIOPSIE 61

MOLEKULARBIOLOGISCHE UND PROTEINBIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER

PATIENTEN-SI 65

3.1.4. NACHWEIS VON PUNKTMUTATIONEN IN DER CDNA DES PATIENTEN 65

3.1.5. GENERIERUNG VON VERSCHIEDENEN MUTANTEN DER SI 67

3.1.6. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER A231T MUTANTE IN VERSCHIEDENEN

ZELLLINIEN 71

3.1.7. ANALYSE VON MÖGLICHEN FALTUNGSDEFEKTEN MITTELS TRYPSIN-

BEHANDLUNG BEI DER A231T MUTANTE 74

8

3.1.8. UNTERSUCHUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT DER MUTANTE A231T IM

VERGLEICH ZUR WILDTYP-SI 76

3.1.9. VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNG ZUR STABILITÄT ZWISCHEN A231T-MUTANTE

UND WILDTYP-SI NACH 10 STUNDEN CHASE 77

3.1.10. IN SILICO-UNTERSUCHUNG ZUR AUSWIRKUNG DER VERSCHIEDENEN

AMINOSÄUREAUSTAUSCHE AUF DIE POSTULIERTE SEKUNDÄRSTRUKTUR 79

3.1.11. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER L620P MUTANTE IN COS-1-ZELLEN 86

3.1.12. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER L702P MUTANTE IN COS-1-ZELLEN 88

3.1.13. CHARAKTERISIERUNG DER L702P MUTANTE MITTELS KONFOKALER

LASERMIKROSKOPIE 90

4. DISKUSSION 92

4.1.1. DIE PROZESSIERUNG DER SACCHARASE-ISOMALTASE DES PATIENTEN 92

4.1.2. ROLLE DER EINMALIG IDENTIFIZIERTEN PROLINMUTATIONEN 99

5. ZUSAMMENFASSUNG 104

6. SUMMARY 106

7. LITERATURVERZEICHNIS 108

8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 123

9. TABELLENVERZEICHNIS 125

10. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 126

11. DANKSAGUNG 129

1

1. Einleitung

1.1 Einleitung

Bis zu 10000 verschiedene Proteinarten können in Säugerzellen vorkommen. Um ihre

ordnungsgemäße Funktion zu ermöglichen, muß jedes dieser Proteine zur entsprechenden

Membran oder in das entsprechende Kompartiment einer Zelle gelangen können. Ein

korrekter Proteintransport ist daher Voraussetzung für die vielfältigen Aufgaben, die

eukaryontische Zellen leisten müssen. Dieser Prozess, der jedes in einer Zelle gebildete

Protein zu einem bestimmten Ort dirigiert, wird als „protein targeting“ oder „sorting“

bezeichnet. Die Erforschung der wesentlichen Schritte beim intrazellulären Proteintransport

ist ein wichtiger Bereich der aktuellen Zellbiologie. Entlang des sekretorischen Weges

passieren Proteine mehrere Zellkompartimente und somit mehrere Kontrollpunkte, an denen

über deren Transportrichtung und –kompetenz entschieden werden kann. Die biochemischen

Vorgänge an diesen Kontrollpunkten werden derzeit anhand verschiedener Modellproteine

intensiv untersucht.

In dieser Arbeit ist ein Transportdefekt bei einem natürlich vorkommenden Phänotyp der

Congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID), mittels molekular- und zell-

biologischer Methoden analysiert worden.

1.2 Der sekretorische Weg führt die meisten Proteine durch das ER

Proteine, die für die Plasmamembran oder für die Lysosomen bestimmt sind, sowie Proteine,

die von der Zelle schließlich sezerniert werden, lassen sich zu einer gemeinsamen Gruppe

zusammenfassen. Sie werden unmittelbar nach Beginn der Biosynthese an den freien

Ribosomen im Zytosol in das rauhe Endoplasmatische Retikulum (ER) transloziert

(RAPOPORT et al. 1996). Solche Eiweiße, die diesen als „secretory pathway“ bezeichneten

Weg einschlagen, gelangen vom ER schließlich in den Golgi Apparat, von wo sie endgültig

zu ihrem Bestimmungsort sortiert werden. Im Bereich des trans-Golgi-Netzwerkes (TGN)

werden sie dazu in verschiedene Vesikel eingebaut (GRIFFITHS u. SIMONS 1986) .

2

Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Darmepithelzelle

Im Zellkern findet die Transkription der DNA statt. Die Biosynthese von Proteinen, die den „secretory pathway“ einschlagen, wird unmittelbar nach ihrem Beginn an den freien Ribosomen des Zytosols im rauhen Endoplasmatischen Retikulum zu Ende geführt. Anschließend gelangen diese über Vesikel in den Golgi Apparat, von wo sie endgültig zu ihrem Bestimmungsort sortiert werden. Abb. modifiziert nach KUCHEL und RALSTON (1988).

Um zum ER dirigiert zu werden, tragen naszierende Polypeptidketten ein spezifisches Signal,

welches aus hydrophoben Aminosäuren besteht und meist aminoterminal gelegen ist

(MARTOGLIO u. DOBBERSTEIN 1998). Damit werden die freien Ribosomen, an denen die

Biosynthese begonnen hat, zum ER gelenkt. Ein „signal-recognition particle“ (SRP) bindet

an die Signalsequenz des Peptids und der Komplex aus SRP, naszierendem Protein und

Ribosom bindet anschließend an die a-Untereinheit des SRP-Rezeptors in der ER-Membran

(BACHER et al. 1996). Sobald SRP und Rezeptor (RAPOPORT 1991) unter Hydrolyse von

GTP von der Peptidkette dissoziiert sind, bindet die Signalsequenz an einen mit TRAM-

Proteinen und Sec61 Komplex umgebenen Kanal, das Translocon (MATLACK et al. 1998).

Mitochondrium

Peroxisom

Freie Ribosomen

Endosom

Lysosom

Golgi Apparat

Zytoplasma

Rauhes Endoplasmatisches Retikulum

Kern

Basolaterale Membran

Apikale Membran

3

Das Tor, welches die Innenseite des Translocon verschließt, öffnet sich und ermöglicht somit

der Signalsequenz und der naszierenden Peptidkette, mit einer Polypeptidschlaufe in das

Lumen des ER einzudringen, so daß nach und nach das gesamte Protein im ungefalteten

Zustand in das Lumen des ER gleiten kann (CORSI u. SCHEKMAN 1996). Sowohl SRP als

auch der Rezeptor werden freigesetzt und können erneut an ein naszierendes Polypeptid

binden. Während der Elongation der Polypeptidkette trennt eine im Lumen des ER

lokalisierte Signalpeptidase die Signalsequenz ab (DALBEY u. VON HEIJNE 1992). Vom

vollständig translatierten Protein dissoziieren die Ribosomen ab (POWERS u. WALTER

1996), der C-terminale Teil gelangt schließlich in das ER-Lumen und das Tor vom

Translocon schließt sich.

Der größte Anteil der Proteinsynthese findet an den gebundenen Ribosomen des rauhen

Endoplasmatischen Retikulums (rER) statt, seine Konformation erlangt ein Protein durch die

Faltungsprozesse im Lumen des ER (GETHING u. SAMBROOK 1992; HIGH et al. 2000),

wobei die Erlangung einer korrekten Konformation eine wichtige Voraussetzung für die

Erlangung seiner Transportkompetenz ist (RANDALL u. HARDY 1986).

Intramolekulare und intermolekulare Disulfidbrücken entstehen durch oxidative Verknüpfung

von Sulfhydrylgruppen, ein Reaktionstyp, der aufgrund des oxidativen Milieus im ER

möglich ist. Diese kovalente Bindung ist oft für die Stabilität und Funktion, weiterhin auch

für die Reifung und den intrazellulären Transport nötig. Dabei ist bei Proteinen, die mehr als

eine Disulfid-Brücke aufweisen, eine korrekte Paarung der Sulfhydrylreste notwendig, da die

Ausbildung der Brücken in vielen Fällen, z.B. während der Synthese der leichten Ketten der

Immunglobuline (Ig) (BERGMAN u. KUEHL 1979), von Serumalbumin (PETERS u.

DAVIDSON 1982) oder von Influenza-Hämagglutinin (BRAAKMAN et al. 1992a;

BRAAKMAN et al. 1992b) kotranslational erfolgt. Ein Umlagern von unphysiologisch

ausgebildeten Brücken ist durch die ER-ständige Protein-Disulfid-Isomerase (PDI)

(FREEDMAN et al. 1989) möglich. Eine weitere Enzymfamilie, die ebenfalls an der Faltung

der Proteine in ihre native Konformation beteiligt ist, stellen die Peptidyl-Prolyl-Isomerasen

dar, die eine Rotation der Peptidyl-Prolyl-Bindungen beschleunigen können. Diese im ER

residenten Proteine (BOSE u. FREEDMAN 1994), die andere Proteine bei ihrer Faltung

unterstützen, haben in den meisten Fällen eine geringe Substratspezifität. Es gibt jedoch unter

den Peptidyl-Prolyl-Isomerasen spezifische Enzyme, die nur die Umsetzung einzelner

4

Substrate katalysieren, wie z.B. die ER-Peptidyl-Prolyl-Isomerase NINAA, die die Faltung

von Opsin, einem lichtabsorbierenden visuellen Triggerprotein von Drosophila, katalysiert

(COLLEY et al. 1991).

Eine weitere wichtige Veränderung, die Proteine im ER erfahren, ist die Aneinanderlagerung

mehrerer Polypeptidketten zu multimeren Proteinen. Die räumliche Anordnung mehrerer

gleicher oder auch unterschiedlicher Polypeptidketten eines Proteins bezeichnet man als

Quartärstruktur, deren Ausbildung als Assemblierung. Neben einer korrekten Faltung ist auch

dieser Vorgang essentiell, damit Proteine das rER verlassen können, um weiter zum Golgi-

Apparat und anschließend zur Zelloberfläche oder zu einem anderen Bestimmungsort

gelangen zu können (GETHING et al. 1986b). Ungefaltete, fehlerhaft oder teilweise gefaltete

und assemblierte Proteine werden selektiv im ER zurückbehalten oder gelangen bis zum cis-

Golgi. Von dort werden sie dann zum ER zurücktransportiert, gelangen durch das Translocon

zurück ins Zytosol und werden anschließend durch das Proteasom abgebaut (JENTSCH u.

SCHLENKER 1995).

Neben der Ausbildung der Disulfidbrücken, der korrekten Faltung und der Assemblierung

von Polypeptiduntereinheiten zu multimeren Proteinen, finden im ER noch weitere Vorgänge

statt, wie spezifische proteolytische Spaltungen oder Anheftung und Prozessierung von

Kohlehydratketten. Dieser Vorgang der Glykosylierung stellt die am häufigsten

vorkommende Art der chemischen Modifizierung eines Proteins dar. Dabei finden einige der

Glykosylierungsreaktionen im Lumen des ER, andere im Lumen der Cisternen des cis-,

medialen- oder trans-Golgi statt. Daher kann das Vorkommen von bestimmten glykosylierten

Seitenketten als Marker für den Transport von Glykoproteinen durch das ER bzw. den Golgi-

Apparat herangezogen werden. N- und O-Glykosylierung haben eine stark unterschiedliche

Struktur: O-gebundene Glykane bestehen aus meist kurzen Seitenketten (1 bis 4

Zuckerreste), die über N-Acetylgalactosamin (GalNac) an die Hydroxylgruppe von Serin oder

Threonin gebunden sind, während bei allen N-glykosydisch gebundenen Oligosacchariden N-

Acetylglucosamin (GlcNac) an den Aminostickstoff von Asparagin gebunden ist. Bei dieser

Glykosylierungsform kommt immer neben N-Acetylglucosamin auch Mannose vor, die

Seitenketten sind stark verzweigt und enden jeweils mit einem negativ geladenen

Neuraminsäurerest (LODISH et al. 2001) .

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Die N-Glykosylierung beginnt immer im ER mit der Addition eines 14 Zucker umfassenden,

präformierten mannosereichen Oligosaccharids, der von einem als Carrier fungierenden

Dolicholmolekül auf ein Asparagin übertragen wird. Dabei muß das Asparagin immer in einer

Tripeptidsequenz Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser stehen, damit die Oligosaccharid-

Proteintransferase, die diese Reaktion katalysiert, das entsprechende Asparagin als Substrat

erkennt (KORNFELD u. KORNFELD 1985). Nach weiteren Veränderungen der

Oligosaccharidverzweigungen im ER, wird beim weiteren Transport des Glykoproteins durch

den Golgi-Apparat die im ER begonnene Glykosylierung beendet. Die komplexe

Glykosylierung ist dabei für verschiedene Proteine, Zelltypen und Organismen stark

unterschiedlich.

Die O-Glykosylierung beginnt je nach enzymatischer Ausstattung der Organellen im ER oder

im cis-Golgi und setzt sich im trans-Golgi oder im trans-Golgi-Netzwerk fort.

An Glykoproteinen angehängte Oligosaccharidmodifikationen können Proteine vor

Proteolyse bewahren, sind in manchen Fällen an der Zelladhäsion beteiligt, stellen

Erkennungsmerkmale für andere Proteine an der Zelloberfläche dar (PAULSON 1989) und

können an der Erlangung einer korrekten Proteinfaltung beteiligt sein (siehe Kapitel 1.4).

1.3 Molekulare Chaperone

Für einige Proteine konnte gezeigt werden, daß die Ausbildung eines nativen Proteins aus der

ungefalteten Vorstufe ein spontaner Prozeß ist, der von der freien Energie im System abhängt

(ANFINSEN 1973). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Faltung kleiner globulärer Proteine in

ihre nativen Form von ihrer Aminosäuresequenz bestimmt wird. Allerdings sind die

Bedingungen, die im Experiment gewählt werden müssen, um andere, größere Proteine in

vitro zu falten, häufig unphysiologisch (sehr geringe Proteinkonzentration, sehr lange

Inkubationszeiten und geringe Temperatur), so daß man annehmen mußte, daß bei der

Proteinfaltung in vivo zusätzliche Faktoren eine Rolle spielen müssen (ELLIS et al. 1989;

ELLIS u. VAN DER VIES 1991).

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Die Faltung der meisten neusynthetisierten Proteine in der Zelle benötigt die Interaktion von

Protein-Kofaktoren, die als molekulare Chaperone bekannt sind. Diese Moleküle erkennen

und binden entstehende Polypeptidketten und teilweise gefaltete Proteinintermediate. Sie

wirken unterstützend bei deren Faltung mit, werden wieder abgelöst und bewahren somit

Proteine vor Aggregation und der Erlangung einer fehlerhaften Konformation (ELLIS et al.

1989; FINK 1999). Dabei erkennen molekulare Chaperone selektiv nicht native Proteine und

bilden mit ihnen relativ stabile Komplexe aus (ELLIS et al. 1989), die durch die Bindung und

Hydrolyse von ATP dissoziieren. Wichtige Chaperon-Familien sind die 40 kDa

Hitzeschockproteine (Hsp 40; DnaJ ist ein wichtiger Vertreter), die 60 kDa

Hitzeschockproteine (Hsp 60; GroEL und und TCP-1 gehören zu dieser Familie) und die 70

kDa sowie die 90 kDa Hitzeschockproteine. Das im ER lokalisierte und zu der Hsp 70

Familie gehörende ER-Chaperon BiP wurde bei Untersuchungen über die Assemblierung von

Immunglobulinen entdeckt (BOLE et al. 1986). Die schweren Ketten der Immunglobuline

bleiben mit BiP so lange assoziiert, bis die leichten Ketten angehängt werden. Erfolgt keine

Anlagerung der leichten Ketten, verbleiben die schweren Ketten an BiP gebunden im Lumen

des ER. Bei Untersuchungen über die Bindung von BiP an N-glykosidisch modifizierten

Proteinen konnte eine Korrelation zwischen Glykosylierungsmuster des Proteins, Assoziation

mit BiP und der Sekretion von Faktor VIII (F VIII), des von Willebrand-Faktors und vom

tissue plasminogen activator (tPA) festgestellt werden (DORNER et al. 1987).

Zudem konnte gezeigt werden, daß BiP mit mutierten oder falsch glykosylierten Proteinen

assoziiert (GETHING et al. 1986). In Affenzellen konnte anhand des exprimierten Influenza-

Virus-Hämagglutinins gezeigt werden, daß allein das falsch gefaltete Protein, welches

aufgrund einer Mutation im ER verbleibt, nicht aber das Wildtyp-Hämagglutinin in der Lage

ist, die Synthese von Grp 78 (BiP) zu induzieren (KOZUTSUMI et al. 1988). Um seine

Aufgaben erfüllen zu können, muß ein solches Chaperon zwischen unvollständig gefaltetem

und korrekt gefaltetem Protein unterscheiden können. Über die Untersuchung von

Bindungsaffinitäten verschiedener synthetischer Peptide an BiP ist die Hypothese entstanden,

daß bestimmte Abschnitte an der Oberfläche des Proteins zur Bindung von BiP führen und

den nachfolgenden Faltungsprozeß anregen (FLYNN et al. 1989). Anhand eines modifizierten

sekretorischen Proteins, welches während seiner Translokation in das ER in der Membran

verbleibt, konnte gezeigt werden, daß BiP in Hefezellen direkt an der Translokation des

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Polypeptids in das ER beteiligt ist (SANDERS et al. 1992). Bei Studien über die Biosynthese

des Thyreoglobulins, welches sich aufgrund seiner ungewöhnlichen Größe gut für

Untersuchungen zur Erlangung der Tertiärstruktur und der Wirkung von Chaperonen eignet,

konnte festgestellt werden, daß das Protein sofort nach seiner Translokation in das ER mit

BiP interagiert (KIM et al. 1992).

Mitglieder der Hsp 90-Familie sind in allen Organismen vom Bakterium bis zum Menschen

anzutreffen. In Eukaryonten kommt neben der zytosolischen Hsp 90-Form mit Grp 94 eine

ER-Form vor. Eine Mutante von Hsp 90 in Hefezellen, die bei hohen Temperaturen schnell

und vollständig ihre Aktivität verliert, wurde verwendet, um die Funktion von Hsp 90 in vivo

zu untersuchen. Dabei fand man heraus, daß Hsp 90 bei der Erlangung der korrekten

Konformation keinen direkten Einfluß ausübt, vielmehr aber von bestimmten Proteinen

benötigt wird, die Schwierigkeiten bei der Faltung in ihre native Konformation aufweisen

(NATHAN et al. 1997).

Unter den vielen weiteren ER-Faltungsfaktoren gibt es drei, die spezifisch die Faltung von N-

glykosidisch modifizierten Proteinen unterstützen. Diese sind Calnexin, Calretikulin und

ERp57 (HIGH et al. 2000). Im Gegensatz zu den klassischen Chaperonen scheint die

Polypeptidkette wenig Einfluß auf die Bindung mit Calnexin/Calretikulin zu haben, hingegen

wurde gezeigt, daß die Struktur der Zuckerkette eine wesentliche Rolle bei der Bindung der

Chaperone spielt. Daher können diese beiden Moleküle als ER-Lektine beschrieben werden,

die spezifisch N-glykosidisch gebundene Zuckerketten an Proteinen erkennen (RODAN et al.

1996; HIGH et al. 2000). Calnexin und Calretikulin sind calciumabhängig an der Faltung und

Assemblierung naszierender Proteine im ER beteiligt und spielen eine wichtige Rolle bei der

Reifung der Glykoproteine und deren Qualitätskontrolle. Calnexin ist ein glykosyliertes

Transmembranprotein, das sequenzhomolog zu seinem löslichen Partner, Calretikulin, ist.

ERp57 ist homolog zu der Proteindisulfidisomerase und kann mit den selben

monoglykosylierten Glykoproteinen vernetzt werden, die auch an Calnexin oder Calreticulin

binden.

8

1.4 Korrekte Faltung als Voraussetzung für intrazellulären Proteintransport

Eukaryontische Zellen besitzen eine Proteinmaschinerie, die Polypeptidketten bei ihrer

Faltung unterstützt, falsch gefaltete Proteine wieder entfaltet und bei Bedarf degradiert. Dieser

Mechanismus benötigt ein Qualitätskontrollsystem, das zwischen korrekt und falsch

gefalteten Proteinen unterscheiden und diese entsprechend weiterleiten kann. Das

Qualitätskontrollsystem des ER enthält eine Saccharidtransferase, die als Faltungssensor

fungiert (ELLGAARD et al. 1999). Ziel dieses Systems ist, alle Proteine, die nicht ihre native

Konformation erlangt haben, im ER zurückzubehalten und sie nochmals mit Faltungsfaktoren

in Verbindung zu bringen. Ein beträchtlicher Teil der im ER synthetisierten Proteine werden

während ihrer Translokation durch das ER glykosyliert. Das angehängte Glykan ist verzweigt,

wobei ein Ast mit drei Glucoseresten endet. Im Lumen des ER wird das Glykan durch zwei

Glucosidasen getrimmt. Das verbleibende monoglykosylierte Protein bindet an die

Faltungsfaktoren Calretikulin, Calnexin und ERp57.

Calretikulin und Calnexin verhindern wie klassische Chaperone die Proteinaggregation und

wirken bei der Proteinfaltung unterstützend mit. Allerdings scheinen sie nicht direkt an die

Polypeptidkette ihres Substrats zu binden, setzen auch kein ATP um, sondern verhalten sich

eher wie Lektine (RODAN et al. 1996), binden also den Zuckeranteil der Proteine. ERp57

hingegen ist ein Enzym, nämlich eine Disulfid-Isomerase (ZAPUN et al. 1998).

Die Bindung des Glykans an die Lektine hängt von dem Vorhandensein eines einzelnen

Glucoserestes am Ende des Glykans ab. Das Substrat wird erst dann von den Lektinen

entlassen, sobald dieser Glucoserest von einer Glucosidase abgespalten worden ist.

Falls das Protein un- oder falsch gefaltet ist, wird es von einer Saccharidtransferase, die als

Faltungssensor fungiert, erkannt. In solchen Fällen werden wieder drei Glucosereste an das

Glykan angehängt, so daß das Glykoprotein wieder mit den Lektinen reassoziieren und einen

neuen Faltungszyklus durchlaufen kann. Die meisten Proteine durchlaufen einen oder

mehrere solcher Faltungszyklen.

Falls das Protein nach mehreren Zyklen nicht die native Konformation erlangen kann, wird es

in einigen Fällen in das Zytosol zurücktransportiert, wo es deglykosyliert, dann ubiquitiniert

und schließlich durch das Proteasom abgebaut wird (PLEMPER u. WOLF 1999).

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Diese Saccharidtransferase, die in der Lage ist, zwischen korrekt und falsch gefalteten

Proteinen zu unterscheiden, ist die UDP-Gluc:Glucosyltransferase (GANAN et al. 1991;

ZAPUN et al. 1997). Nur dieses Enzym reagiert sensibel auf die Proteinkonformation,

wohingegen weder die Glucosidasen, noch die Lektine zwischen unterschiedlichen

Proteinkonformationen unterscheiden können.

Damit die UDP-Gluc:Glucosyltransferase ein Protein als ihr Substrat erkennt, müssen zwei

Bedingungen gegeben sein: das Substrat muß einerseits glykosyliert sein und andererseits in

einer nicht nativen Form vorliegen. Um den Erkennungsmechanismus der

Saccharidtransferase auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurden von RITTER u.

HELENIUS (2000) verschiedene Proteinchimäre aus zwei Domänen der bovinen

pankreatischen RNAse A und B generiert. Proteolytisch wurden dabei vom N-Terminus

beider Formen 20 Aminosäuren entfernt und das Protein in Anwesenheit des jeweils anderen,

nicht zum Teil deletierten Proteins renaturiert, so daß ein Heterodimer mit einer korrekt

gefalteten und einer falsch gefalteten Domäne vorlag. Da sich RNAse A und B nicht in ihrer

Aminosäuresequenz, sondern dadurch unterscheiden, daß RNAse B monoglykosyliert

vorkommt, konnte in den entstandenen Chimären nicht nachvollzogen werden, welche der

beiden Domänen falsch gefaltet vorlag. Das monoglykosylierte Glykan lag daher entweder

bei der falsch oder bei der korrekt gefalteten Domäne. Wie bisher vermutet, wurden nur

diejenigen Domänen von der Glykosyltransferase glykosyliert, die bereits das Monoglykan

trugen, überraschenderweise jedoch wurden Glykane, die an einer glykosylierten, aber korrekt

gefalteten Domäne gebunden waren und in Nachbarschaft einer falsch gefalteten Domäne

lagen, nicht erkannt und glykosyliert.

Dies zeigt, daß die UDP-Gluc:Glykoprotein Glucosyltransferase (GT) Faltungsdefekte auf der

Ebene von individuellen Domänen erkennt und ausschließlich Glykane, die an diese

Domänen gebunden sind, reglykosyliert (RITTER u. HELENIUS 2000).

10

1.5 Transport in polaren Epithelzellen

Die Plasmamembran der Enterozyten spiegelt die hohe Polarisation dieser Zellart wieder. Sie

besteht aus einer apikalen und einer basolateralen Domäne (Abb.1) mit unterschiedlicher

Protein- und Lipidzusammensetzung (CAPLAN et al. 1987; MASSEY-HARROCHE 2000).

Strukturen, die diese unterschiedlichen Membrandomänen bedingen und erhalten, sind z.B.

„tight junctions“ zwischen den beiden Domänen und das korticale Zytoskelett, welches

selektiv bestimmte Transmembranproteine binden kann (LE GALL et al. 1995).

Von Markerproteinen beider Domänen sind viele Studien über deren Biosynthese und deren

intrazellulären Weg durchgeführt worden (MASSEY-HARROCHE 2000). Für die

Inkorporation von Plasmamembranproteinen sind mehrere Vorgänge beschrieben worden,

wie die aus dem trans-Golgi-Netzwerk (TGN) abgeschnürten Vesikel sowohl direkt als auch

indirekt in die richtige Membrandomäne eingelagert werden (BURDICK et al. 1996). Für

basolateral sortierte Proteine wurde dabei ein direkter Weg beschrieben, wohingegen für

apikal sortierte Proteine abhängig vom Protein zwei Wege, ein direkter und ein indirekter

über die basolaterale Domäne, beschrieben worden sind (MASSEY-HARROCHE 2000).

Dabei sind bestimmte im Protein selbst enthaltene Signale in der Lage, die Membranproteine

auf unterschiedliche Vesikel aufzuteilen (BURDICK et al. 1996). Die Vesikel selbst

enthalten unterschiedliche Oberflächenproteine. Apikale Sortiersignale scheinen in der

luminalen Domäne von Transmembranproteinen lokalisiert zu sein. Bei Proteinen, die über

einen Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol-Anker (GPI-Anker) in der apikalen Plasmamembran

verankert sind, scheint die Sortierinformation über diesen Lipid-Anker kodiert zu sein

(LISANTI u. RODRIGUEZ-BOULAN 1990; LISANTI et al. 1988; LISANTI et al. 1989)

Im Gegensatz dazu, sind basolaterale Signale in der zytoplasmatischen Domäne von

Transmembranproteinen identifiziert worden. Außerdem haben Ähnlichkeiten zwischen den

basolateralen Signalen und den Signalen, die für endozytotische Vorgänge benötigt werden,

zu der Annahme geführt, daß diese beiden Sortierprozesse miteinander verbunden sein

könnten (LE GALL et al. 1995).

Der Vorgang der Sortierung von Proteinen und Lipiden setzt nicht nur das Vorhandensein von

Sortiersignalen und unterschiedlichen Transportvesikeln voraus, es müssen auch zelluläre

11

Sortierungsmaschinerien vorhanden sein, die anhand von Sortiersignalen Proteine bzw.

Lipide an bestimmten Stellen umleiten (IKONEN u. SIMONS 1998).

In epithelialen Zellen findet die Sortierung von apikalen bzw. basolateralen Proteinen durch

die Sortierung im TGN und den Transport in getrennten Vesikeln statt. Wichtig erscheint ein

in Triton-X-100 unlöslicher, GPI-und Glykolipid-reicher Membranrest. Von FIEDLER et al.

(1993) wurde dieser charakterisiert und seine Beteiligung am Transport zur apikalen

Zellmembran beschrieben. Die Schaffung und Aufrechterhaltung einer asymmetrischen

Zelloberfläche ist für den geordneten Ablauf vieler Zellfunktionen, wie z.B. Absorption,

Sekretion, Signalübertragung, Entwicklung und Morphogenese von essentieller Bedeutung.

Durch die Verwendung von mehreren farbigen Varianten des Grün Fluoreszierenden Proteins

(GFP), konnten in lebenden Zellen mehrfarbige Bilder von apikal bzw. basolateral

lokalisierten Proteinen aufgenommen und somit ihr Transportverhalten studiert werden.

Dadurch konnte fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden, daß sich apikale und basolaterale

Proteine nach und nach in großen Domänen im Golgi-Apparat und im trans-Golgi-Netzwerk

anreichern, Golgi-Proteine aussortiert und apikale und basolaterale Proteine in verschiedenen

Transportvesikeln getrennt und anschließend aus dem TGN entlassen werden (KELLER et al.

2001). Einige Proteine assoziieren vor dem Transport zur apikalen Membran mit

Membranabschnitten, die reich an Glykosylphosphatidylinositol und Cholesterol sind und

sich nicht in dem Detergens Triton X-100 lösen lassen (DIGs). Andere apikal sortierte

Proteine assoziieren nicht mit diesen DIGs. In post-Golgi Transportvesikeln konnten zudem

unterschiedliche Subdomänen für DIG-assoziierte und nicht assoziierte apikale Proteine in

lebenden Säugerzellen nachgewiesen werden (JACOB u. NAIM 2001a).

1.6 Die Rolle der Proteinprozessierung in der Pathophysiologie von genetisch

bedingten Erkrankungen

Bei etwa der Hälfte aller genetisch bedingten Erkrankungen, denen eine Punktmutation in

einem kodierenden Bereich eines Gens zugrunde liegt, ist eine fehlerhafte m-RNA oder eine

zu geringe Konzentration dieser Nukleinsäure dafür verantwortlich, daß kein oder zu wenig

des entsprechenden Proteins gebildet wird. Bei der anderen Hälfte führen Punktmutationen

12

oder kleine Insertionen und Deletionen innerhalb des Leserahmens nicht zu einer

herabgesetzten Synthesemenge des Polypeptids, vielmehr kommt es hier zur Bildung eines

veränderten, oft labileren und schlecht gefalteten Proteins (GREGERSEN et al. 2000).

Krankheiten, deren Pathomechanismus darauf beruht, daß ein falsch gefaltetes Protein

gebildet wird, werden auch als konformationsbedingte Krankheiten bezeichnet (CARRELL u.

LOMAS 1997; THOMAS et al. 1995). Dabei können unterschiedliche Auswirkungen einer

veränderten Konformation beobachtet werden:

Beispielsweise sind an der Entstehung der Alzheimer Erkrankung und der Creutzfeld-Jakob-

Erkrankung unerwünschte Proteinaggregationen beteiligt (GOLDFARB et al. 1993;

HILBICH et al. 1991; MASTERS et al. 1985). Bei einer besonderen Form der hypertrophen

Kardiomyopathie, der humanen Desmin-Kardiomyopathie, führt das Vorliegen der dominant

negativen D7-Mutation zur Expression eines leicht aggregierenden Desmin-Proteins (WANG

et al. 2001; BONNE et al. 1995; BONNE et al. 1998). Am häufigsten finden sich

Erkrankungen, deren Pathomechanismus auf einem vermehrten Abbau von instabilem Protein

beruht oder bei denen das betroffene Protein aufgrund seiner veränderten Konformation keine

Transportkompetenz erlangt und in verschiedenen Kompartimenten entlang des

sekretorischen Weges akkumuliert (BROSS et al. 1999; GREGERSEN et al. 2000;

GREGERSEN et al. 2001).

Fehlerhafte Proteinprozessierungen, die dadurch charakterisiert sind, daß ein mutiertes

Protein mit der normalen Prozessierungsmaschinerie interagiert, betreffen lysosomale

Proteine und Zelloberflächenproteine, genauso wie Proteine der extrazellulären Matrix und

sekretorische Proteine.

Da von der Zelle aufgenommenes organisches Material und zelluläre Bestandteile in den

Lysosomen abgebaut werden, führen genetische Erkrankungen, die diese lysosomalen

Enzyme in ihrer Funktion beeinträchtigen, zu intrazellulären Anhäufungen von teilweise

abgebautem Substrat. Diese Ablagerungen führen zu den Symptomen von lysosomalen

Speicherkrankheiten, deren schwerwiegende klinische Bilder u.a. mit Hepatosplenomegalien,

Ankylosen, Skelettmalformationen, geistiger Retardierung und Frühsterblichkeit einhergehen.

Zu diesen lysosomalen Speicherkrankheiten zählt die autosomal-rezessiv vererbte

Sphingolipidose, die als Morbus Gaucher bekannt ist. Diese Erkrankung beruht auf

Mutationen im Gen der Glucocerebrosidase. Bei der Untersuchung von Personen, die an

13

Morbus Gaucher erkrankt sind, wurde bei unterschiedlichen Genotypen eine geringe

Enzymaktivität der Glucocerebrosidase gefunden (SINCLAIR et al. 2001; TORRALBA et al.

2001). Zudem wurde bei dem G202R-Genotyp ein beeinträchtigter Transport der sauren

Glukosidase festgestellt (ZIMMER et al. 1999). Bei der D409H-Mutation hingegen kommt es

zur Bildung einer labilen m-RNA, die auch zur Bildung eines labilen korrespondierenden

Proteins führt (PASMANIK-CHOR et al. 1996). Das Vorkommen dieser Erkrankung ist auch

bei einem Hund beschrieben worden (VAN DE WATER et al. 1979).

Neben den Lipidosen sind auch Mukopolysaccharidosen bekannt, deren Pathophysiologie auf

einer Speicherung von Mukopolysacchariden in den Lysosomen zurückzuführen ist.

Bei der Mukopolysaccharidose Typ IV beträgt die Aktivität des Enzyms N-

Acetylgalaktosamin-4-Sulfatase in den Fibroblasten bei erkrankten Individuen weniger als

5% im Vergleich zu der Enzymaktivität von Kontrollpersonen (BROOKS 1993). Die bei

Untersuchungen betroffener Individuen festgestellten Proteinmengen in Verbindung mit den

gemessenen Enzymaktivitäten führen zu der Schlußfolgerung, daß die Pathophysiologie

dieser Erkrankung in der geringen Enzymkonzentration begründet liegt (BROOKS et al.

1991). Weiterführende Untersuchungen führten zur Beschreibung mehrerer

pathophysiologischer Vorgänge als Ursache der Mucopolysaccharidose Typ IV. Unter

anderem führte eine Mutation im Stopp-Codon *534Q im Enzym Arylsulfatase zu deutlichen

Konformationsänderungen und niedrigen intrazellulären Proteinkonzentrationen. Studien zur

Prozessierung dieser Mutante zeigten, daß das Protein zwar normal synthetisiert, aber nicht

zum TGN transportiert, sondern im ER zurückbehalten und anschließend degradiert wurde

(ARLT et al. 1994).

Die häufigste autosomal-rezessive Erkrankung der kaukasischen Bevölkerung mit einer

Inzidenz von 1:2500 unter den Neugeborenen ist die Mukoviszidose (Zystische Fibrose). Sie

wird durch Mutationen im CFTR-Gen verursacht. Das CFTR-Gen kodiert für einen an der

Plasmamembran lokalisierten Chlorid-Kanal, der aktiv Chlorid-Ionen aus der Zelle

transportiert. Durch vermehrte Produktion und erhöhte Viskosität des Sekrets der mukösen

Drüsen, kommt es bei homozygoten Trägern zu schweren Erkrankungen des Atmungs- und

Verdauungstraktes. Bei der häufigsten Mutation, einer Deletion des Phenylalanins an Position

508 des Polypeptids (? F508), wird das CFTR normal synthetisiert, jedoch ist das Protein

nicht in der Lage, das ER zu verlassen (CHENG et al. 1990). Das retenierte Protein ist dabei

14

funktionell aktiv (PASYK u. FOSKETT 1995). Die ? F508-Mutante wird anschließend über

das Proteasom degradiert (WARD et al. 1995; BROOKS 1997; CHENG et al. 1990;

GREGERSEN et al. 2000). Weiterhin konnte beobachtet werden, daß der Transport der

Mutante ? F508 temperatursensitiv ist (LUKACS et al. 1993) und, daß diese Mutante mit dem

ER-Chaperon Calnexin länger als das Wildtyp-Protein assoziiert bleibt (PIND et al. 1994).

Diese Beobachtungen sprechen dafür, daß auch bei dieser Erkrankung die

Proteinkonformation an der Pathologie beteiligt zu sein scheint (THOMAS et al. 1992).

Durch die Beschreibung verschiedener subzellulärer Strukturen und Mechanismen, die über

die Qualität des Proteins und somit über ihre Transportkompetenz entscheiden, konnte bei

diesen proteinkonformationsbedingten Krankheiten der Pathomechanismus weiter aufgeklärt

werden, so daß sich in Zukunft daraus innovative therapeutische Ansätze ergeben könnten.

1.7 Saccharase-Isomaltase (SI), ein Glykoprotein der apikalen

Bürstensaummembran des Darms

Dünndarmepithelzellen stellen aufgrund ihrer Polarität ein geeignetes Modell dar, um

funktionell wichtige Proteindomänen zu untersuchen. Ihre apikalen und basolateralen

Membranen exprimieren eine Vielzahl von Proteinen, die beispielhaft studiert werden

können, um Mechanismen und Interaktionen von normalem und fehlerhaftem Transport von

Eiweißen auf molekularer Ebene aufzuklären.

Die SI kommt ausschließlich im Darm vor und ist das am meisten vorkommende

Glykoprotein der Bürstensaummembran des Duodenums (SEMENZA et al. 1983). Dieses

Enzym gehört wie auch die Laktase-Phlorizin-Hydrolase, die Maltase-Glukoamylase und die

Trehalase zu den Disaccharidasen der intestinalen Mikrovillimembran.

Die beiden Untereinheiten Saccharase und Isomaltase verdauen ? -glykosidisch verbundene

Kohlehydrate, welche die vornehmlich vorkommende Klasse an Kohlehydraten der

Säugerernährung darstellt. Aufgrung dieser Eigenschaft zählt dieses Enzym zur Klasse der a-

Glukosidasen, zu der auch u.a. die Glukoamylase zählt. Beispielsweise wird Stärke, neben

15

Glykogen ein wichtiges Nahrungskohlehydrat, durch verschiedene Verdauungsenzyme des

Pankreas stufenweise zu Oligosacchariden abgebaut. Die eigentliche Absorption von

Kohlehydraten geschieht in Form von Monosacchariden, da kein effizienter Mechanismus

existiert, um Disaccharide in Darmzellen aufzunehmen. Daher erfolgt der endgültige Abbau

von Stärke und Saccharose durch die Saccharase. Die freigesetzten Monosaccharide Glucose

und Fruktose können dann in das Zellinnere aufgenommen werden. Glukose wird sekundär-

aktiv über den Ko-Transport mit Na+ an der apikalen Membran eingeschleust und

anschließend über „carrier“ ins Pfortaderblut abgegeben. Unverdaute Saccharose kann nicht

absorbiert werden und wird im Dickdarm vergärt. Im Dünndarm entfaltet nicht verdaute

Saccharose eine osmotische Wirkung, die gemeinsam mit den Gärprodukten aus dem

Dickdarm zu Bauchkrämpfen und Diarrhoe führt. Diese Symptome werden auch bei der

erblichen Saccharase-Isomaltase-Defizienz beobachtet.

Während Saccharase a–1,2-und a–1,4-glykosidisch verbundene Kohlehydrate spaltet,

hydrolysiert die Isomaltase vor allen Dingen a–1,6-glykosidisch gebundenen Zucker. Sie

besitzt außerdem eine Maltase-Aktivität.

Die beiden homologen Domänen Saccharase und Isomaltase entstehen aus einer

Polypeptidkette, dem Vorläuferprotein pro-SI, welches erst im Darmlumen durch Trypsin

gespalten wird (HAURI et al. 1985). Beide Untereinheiten der SI bleiben an der apikalen

Bürstensaummembran über ionische Wechselwirkung miteinander verbunden (NAIM et al.

1988b).

1.8 Biosynthese, Reifung und Struktur der humanen Saccharase-Isomaltase

Das Gen, welches für die Saccharase-Isomaltase kodiert, ist auf dem Chromosom 3 lokalisiert

(WEST et al. 1988). Seine 5’-flankierende Region enthält mehrere potentielle Bindungsstellen

für Intestinum-spezifische Transkriptionsfaktoren (TRABER u. SILBERG 1996). Die SI-

cDNA besteht aus 5484 Nukleotiden, die für 1827 Aminosäuren codieren (GREEN et al.

1987), wobei die genaue Exon-Intron-Struktur nicht bekannt ist. Biochemische Analysen

haben gezeigt, daß in der translatierten Polypeptidkette 4 Domänen beschrieben werden

können.

16

ZS SS/MA

Isomaltase Saccharase

N C

Spaltungsstelle für Trypsin (Arg1007/Ile1008)

Pro SIh 1827 AS

Abbildung 2: Struktur der SI

Die erste nachweisbare Form der SI ist die pro-SIh im ER. Dieses Vorläufermolekül besitzt eine nicht abspaltbare Signalsequenz (SS), die zusätzlich als Membrananker (MA) dient. Der zytoplasmatische Teil (ZS) besteht aus 12 AS. Daran schließt sich der Membrananker aus 20 AS an, dem eine Serin/Threonin-reiche Stabregion aus 28 AS folgt. Diese wird bereits zur Isomaltase-Untereinheit gezählt, die am Arginin (Arg) 1007 endet. Zwischen der Isomaltase-Untereinheit und der Saccharase-Untereinheit, die mit Isoleucin (Ile) 1008 beginnt, befindet sich eine Spaltungsstelle für Trypsin, an der das reife SI-Molekül im Darmlumen gespalten wird, wobei beide Untereinheiten anschließend durch ionische Wechselwirkungen miteinander verbunden bleiben.

Die Membranankerdomäne durchspannt die Lipiddoppelschicht nur einmal, wobei der N-

Terminus des Proteins zum Zytoplasma gerichtet ist (Abb.3). Neben der Verankerung der SI

in der Membran, ist in dieser Domäne auch die Signalsequenz für die Translokation des

naszierenden Proteins in das ER enthalten (HUNZIKER et al. 1986). Aufgrund dieser

Eigenschaften wird die SI zu den Typ-II Membranproteinen gezählt (BLOBEL 1980).

17

Abbildung 3: Der Aminoterminus (N) befindet sich am zytoplasmatischen Teil des Proteins, das carboxyterminale Ende des Peptids (C) ist zum Lumen des Darmkanals gerichtet (Typ-II-Membranprotein)

Zwischen der Isomaltase-Untereinheit und der Saccharase-Untereinheit, die mit Ile 1008 beginnt, befindet sich eine Spaltungsstelle für Trypsin, an der das reife SI-Molekül im Darmlumen gespalten wird, wobei beide Untereinheiten anschließend durch ionische Wechselwirkungen miteinander verbunden bleiben.

Der zytoplasmatische Teil besteht aus 12 Aminosäuren (AS) und verfügt über einen

konservierten Serin-Rest (Ser6) .

An die Membranankerdomäne schließt sich C-terminal eine Serin/Threonin-reiche Region

(Stabregion) an (HUNZIKER et al. 1986), die stark O-glykosyliert ist und zur Isomaltase-

Untereinheit gerechnet wird (HAURI et al. 1985). Vergleicht man die aus der m-RNA

abgeleitete Aminosäuresequenz der Saccharase mit derjenigen der Isomaltase-Einheit, ist eine

starke Homologie erkennbar, die auf eine partielle Genduplikation hinweisen könnte

Stabdomäne C

SI

Trypsinspaltungsstelle Arg1007/Ile1008

N

extrazellulärer Raum/ Lumen des Darmkanals

Intrazellulärer Raum

18

(HUNZIKER et al. 1986; NAIM et al. 1991b). Das Vorläuferpeptid (pro-SI) wird im

Darmlumen in die beiden Untereinheiten Saccharase und Isomaltase gespalten. Die Spaltung

der humanen SI erfolgt zwischen Arginin 1007 und Leucin 1008 nach Einwirkung von

Trypsin (HAURI et al. 1985), jedoch bleiben beide Untereinheiten durch ionische

Wechselwirkungen miteinander verbunden (NAIM et al. 1988b). Mittels monoklonaler

Antikörper gegen SI (HAURI et al. 1985) konnte in Organkulturen aus menschlichem Darm

die Biosynthese der Saccharase-Isomaltase studiert werden (NAIM et al. 1988a). Dabei wurde

als erste Form der SI der mannosereiche Vorläufer (pro-SIh) im ER mit einem

Molekulargewicht von ca. 210 kDa beschrieben. Diese Form wird relativ langsam (T1/2 ca.75

min) vom ER zum Golgi Apparat transportiert (HAURI et al. 1985; NAIM et al. 1988b), ohne

vorher Dimere zu bilden, wie dies bei vielen Proteinen üblich ist. Aufgrund der beschriebenen

starken Homologie zwischen Saccharase und Isomaltase könnte allerdings die

Pseudodimerisierung, also eine Aneinanderlagerung der Isomaltase- und der Saccharase-

Untereinheit der SI denkbar sein. Im Golgi-Apparat erfolgt die Prozessierung des

mannosereichen, N-glykosylierten Vorläufers zum komplexen N-glykosylierten Molekül.

Die O-Glykosylierung erfolgt im Bereich des cis-Golgi, setzt aber erst nach dem Trimmen

der Oligosaccharidseitenkette durch die Mannosidase I ein. Da sowohl der korrekte Transport

zur apikalen Membran (ALFALAH et al. 1999) als auch die Aktivität der Isomaltase-

Untereinheit stark von der vollständigen und korrekten O-Glykosylierung abhängen, ist die

erfolgreiche komplexe N-Glykosylierung für das „targeting“ und die Funktion des Proteins

erforderlich. Sowohl bei der Saccharase- wie auch bei der Isomaltase-Untereinheit ist eine O-

Glykosylierung nachweisbar. Dabei sind vier verschiedene O-Glykosylierungsmuster der

Saccharase gefunden worden, das Muster der Isomaltase-Untereinheit ist hingegen

gleichmäßig stark ausgeprägt. Hauptsächlich jedoch findet die O-Glykosylierung an der

Ser/Thr-reichen sogenannten Stabregion der Isomaltase-Untereinheit statt. Die Rolle von O-

Glykanen als Sortiersignal wurde im heterologen Zellsystem für Neutrophin-Rezeptoren

nachgewiesen (YEAMAN et al. 1997). Erstmals konnte anhand der SI in Caco-2-Zellen an

einem endogen exprimierten Protein die Rolle der O-Glykane als Sortiersignal in Assoziation

mit Lipidmikrodomänen (sog. „rafts“) (ALFALAH et al. 1999) für die Sortierung des

Proteins an die apikale Zellmembran nachgewiesen werden (ALFALAH et al. 1999). Dazu

wurde ein Konstrukt der SI mit deletierter Stabregion hergestellt und der Transport in polaren

19

Zellen studiert. In einem anderen Versuchsansatz wurde mit dem Inhibitor Fumonisin die

Assoziation der Mikrodomänen verhindert und der Transport der endogenen SI studiert. Beide

Experimente führten zu einer zufälligen Verteilung, so daß die Existenz eines koppelnden

Rezeptors zwischen Mikrodomänen und O-Glykanen der Stabregion angenommen werden

kann (NAIM 2001).

1.9 Enzymdefizienzen und Phänotypen der Congenitalen Saccharase-Isomaltase-Defizienz (CSID)

Im Gegensatz zur Laktase, deren Aktivität bei den Säugern um die Geburt herum und

während der Säugung am höchsten ist und anschließend bis zu 90% abfällt, ist bei der

Saccharase eine Zunahme ihrer Aktivität ab der Entwöhnung bis zum Erwachsenenalter zu

beobachten (KRETCHMER 1989). Obwohl die Regulation der Saccharase-Isomaltase-

Aktivität ein transkriptionales Ereignis ist, das mehrere SI- und Intestinum-spezifische

nukleäre Faktoren erfordert (TRABER u. SILBERG 1996; WU et al. 1994), beruhen die

seltenen bisher beobachteten Formen von Enzymdefizienzen auf einer beeinträchtigten oder

fehlerhaften Prozessierung des Proteins und nicht auf einer Beeinträchtigung seiner

Expression (NAIM et al. 1988a). So auch bei der autosomal-rezessiv vererbten Saccharase-

Isomaltase-Defizienz, die bei den betroffenen Patienten nach Aufnahme von Di- und

Polysacchariden eine osmotisch-fermentative Diarrhoe verursacht (TREEM 1995).

Während bei dieser Erkrankung die Aktivität der Saccharase ganz eingeschränkt ist, waren bei

einigen Patienten die Werte der Isomaltase-Aktivität im Normbereich. Aufgrund der

beobachteten unterschiedlichen Pathogenese, z.B. Block der SI im Bereich des Golgi-

Apparates oder korrekt lokalisiertes, aber inaktives Protein, sind mehrere Phänotypen dieser

Erkrankung beschrieben worden.

20

Mitochondrium

Peroxisom

Freie Ribosomen

Endosom

Lysosom

Golgi ApparatZytoplasma

Rauhes Endoplasmatisches Retikulum

Kern

Basolaterale Membran

Apikale Membran

1

2

3

4

5

6

Abbildung 4: Phänotypen der Congenitalen Saccharase-Isomaltase-Defizienz (CSID)

1 ER-Block; 2 Golgi-Block; 3 Inaktives Enzym; 4 Fehlsortierung zur basolateralen Membran; 5 Abnorme intrazelluläre Spaltung; 6 lösliches Protein. Abb. modifiziert nach KUCHEL u. RALSTON (1988)

Mittels Untersuchungen der SI auf subzellulärer und molekularer Ebene von Patienten, die an

dieser Erkrankung leiden, konnten sechs verschiedene Phänotypen der CSID (FRANSEN et

al. 1991; JACOB et al. 2000; NAIM et al. 1988a) identifiziert werden, die biochemisch

charakterisiert worden sind (Abb. 3):

Beim Phänotyp I erlangt der mannosereich glykosylierte Vorläufer keine

Transportkompetenz, akkumuliert im ER und wird schließlich abgebaut.

21

Phänotyp II ist charkterisiert durch eine Retention der pro-SI im ER/cis-Golgi intermediären

Kompartiment (ERGIC), im cis- und im trans-Golgi Netzwerk.

Auch Phänotyp III ist enzymatisch inaktiv, obwohl in diesem Fall das Protein an die apikale

Zelloberfläche gelangt, es also normal transportiert und sortiert wird.

Eine zufällige Sortierung des teilweise falsch gefalteten Proteins wird beim Phänotypen IV

beobachtet, so daß das Enzym nicht ausschließlich zur apikalen, sondern auch zur

basolateralen Membran sortiert wird (SPODSBERG et al. 2001).

Beim Phänotypen V führt eine abnorme intrazelluläre Spaltung des Enzymkomplexes in seine

beiden Untereinheiten zur Degradation der Saccharase, wohingegen die Isomaltase korrekt

nach apikal sortiert wird.

Kürzlich wurde ein weiterer Fall der CSID beschrieben, bei der durch Spaltung eine

sekretorische Form der ansonsten membrangebundenen Form des Proteins entsteht (JACOB

et al. 2000).

Da translatierte Produkte entstanden sind, wurden als Ursachen dieser Phänotypen

Punktmutationen oder kleinere Deletionen oder Insertionen innerhalb des Leserahmens

angenommen.

Die Ergründung der molekularen Hintergründe dieser Erkrankung sind nicht nur aus

klinischer Sicht interessant, vielmehr liefern diese natürlichen Modelle wichtige Aussagen

hinsichtlich bisher noch unzureichend charakterisierter funktioneller Domänen der SI und

ermöglichen daher eine weitere Aufklärung des zellulären Transports.

Ein Glutamin zu Prolin-Austausch an Aminosäureposition 1098 (Q1098P) in der

Aminosäuresequenz der SI eines Patienten konnte als Ursache des Phänotypen II der CSID

durch Untersuchung einer Darmbiopsie bestätigt werden, bei dem die mannosereich

glykosylierte pro-SI im cis-Golgi und ER/Golgi-intermediären Kompartiment (ERGIC)

akkumuliert (MOOLENAAR et al. 1997). Die elektronenmikroskopische und biochemische

Beobachtung eines solchen Phänotypen, der eine Akkumulation eines Proteins in einem

Kompartiment beschreibt, welches entlang des sekretorischen Weges hinter dem ER gelegen

ist, läßt vermuten, daß neben dem Qualitätskontrollsystem des ER eine weitere Maschinerie

zur Kontrolle von Proteinen nach dem ER und vor dem Golgi-Apparat vorhanden sein muß.

Die Tatsache, daß diese Q1098P Mutante nicht vom Qualitätskontrollsystem des ER erkannt

wird, läßt die Frage aufkommen, ob dieses hypothetische System ein Protein genauer

22

untersucht als das bisher bekannte Kontrollsystem oder ob andere Erkennungsmerkmale oder

anders arbeitende Faltungssensoren an der Signalisierung von Fehlfaltungen beteiligt sind.

Durch Expression dieser Mutante in COS-1 Zellen, die nicht-intestinaler Herkunft sind,

konnte einerseits demonstriert werden, daß die Mutation an sich Ursache der Retention ist und

andererseits, daß mögliche Faltungssensoren des hypothetischen Kontrollsystems nicht auf

Zellen des Darmes beschränkt sind.

Ein weiterer Phänotyp, bei dem die strikte Sortierung der Saccharase-Isomaltase an die

apikale Bürstensaummembran aufgehoben scheint und es vielmehr zu einer zufälligen

Sortierung an die apikale und basolaterale Zelloberfläche kommt, konnte ebenfalls auf einen

Aminosäureaustausch zurückgeführt werden (SPODSBERG et al. 2001). Dieser Austausch

von Glutamin zu Arginin an Position 117 der Polypeptidkette zeigt, daß eine einzige, an einer

bestimmten Stelle ausgetauschte Aminosäure eine korrekte Sortierung verhindern kann. Somit

scheint diese Stelle in der Peptidkette Teil einer noch unbekannten Domäne zu sein, die

wichtige Aufgaben im Bereich der Sortierung der SI übernimmt.

Dieser natürlich vorkommende Phänotyp (Phänotyp IV) bekräftigt die Hypothese, daß für die

apikale Sortierung der SI, die von der Assoziation O-gebundener Glykane mit

Lipidmikrodomänen abhängig ist, ein dazwischengeschaltetes Molekül existieren muß,

welches diese Assoziation vermittelt. Kann diese Erkennung zwischen SI und Vermittler nicht

stattfinden, kommt es nach diesem Modell wie im Falle des Phänotypen IV zu einem

zufälligen Weitertransport des Proteins sowohl an die apikale wie auch an die basolaterale

Zelloberfläche.

Auch ohne Untersuchung der genetischen Information der veränderten SI liefert uns die

Beobachtung von Phänotyp V wichtige Informationen über das apikale Sortiersignal der SI.

Da bei diesem Phänotypen die Isomaltase-Untereinheit die apikale Membran im Alleingang

erreicht, die Saccharase-Untereinheit aber degradiert wird, ist die Transportkompetenz der

Isomaltase-Untereinheit für sich alleine nachgewiesen. Allerdings findet die Spaltung in die

beiden Untereinheiten erst im Golgi-Apparat statt, so daß dieser Phänotyp nicht klärt, ob die

Isomaltase in der Lage ist, alleine das Qualitätskontrollsystem des ER zu passieren oder ob

bis zum Austritt aus dem ER die Saccharase für den Transport eine wichtige Rolle

übernimmt.

23

Beim Phänotypen VI der CSID kommt es durch Spaltung der Saccharase-Isomaltase zur

Bildung einer sekretorischen anstatt einer membrangebundenen Form des Proteins. Auch in

diesem Fall war eine Punktmutation der Auslöser für eine Änderung einer Aminosäure in der

Polypeptidkette (JACOB et al. 2000). Anhand dieses Phänotypen der CSID konnte zum ersten

Mal eine Erkrankung beschrieben werden, bei der der Pathomechanismus darauf beruht, daß

ein membrangebundenes Protein durch einen Aminosäureaustausch in ein lösliches Protein

umgewandelt wird.

Zielsetzung dieser Arbeit war die Aufklärung der zugrundeliegenden molekularen

Mechanismen eines Phänotypen der CSID, bei dem durch biochemische Charakterisierung

bereits vermutet wurde, daß der mannosereich glykosylierte Vorläufer der Saccharase-

Isomaltase (SI) keine Transportkompetenz erlangt, im ER akkumuliert und schließlich

abgebaut wird.

24

2. Material und Methoden

2.1. Material

Allgemein gebräuchliche Reagenzien waren mindestens von p.a.-Qualität und wurden von

den Firmen Fluka, Merck, Riedel-de-Haen, Serva oder Sigma bezogen. Sämtliches für

molekularbiologische Arbeiten verwendete Material wurde autoklaviert bzw. sterilfiltriert.

Glasgeräte und Glaspipetten, die in der Bakterien- oder Zellkultur eingesetzt wurden, waren

vor dem Gebrauch sterilisiert worden.

2.1.1. Biopsien aus humaner Darmschleimhaut

CSID wurde bei einem Patienten mit fermentativer Diarrhoe nach Durchführung eines H2-

Atemtests vermutet. Diesem Patienten wurden peroral Saugbiopsien für die RNA Präparation

und für die elektronenmikroskopische Untersuchung aus dem Bereich des oberen Jejunums

entnommen und sofort in flüssigem Stickstoff gelagert. Zwei weitere Biopsien wurden für die

biochemische Untersuchung der SI und weiterer interner Markerproteine entnommen, sofort

in Kulturmedium ohne L-Methionin unter Zusatz von Methionin-freiem Fetalen Kälberserum

verbracht und 2 h bei 37°C unter Carbogen-Atmosphäre inkubiert. Die Biopsien für die

biochemische Untersuchung der SI wurden unverzüglich bearbeitet, die übrigen Biopsien

wurden bis zu ihrer Aufarbeitung bei -80°C gelagert.

2.1.2. Reagenzien für die cDNA-Isolierung

Zur Isolierung der cDNA aus Darmbiopsien, erfolgte die Aufreinigung der Gesamt-RNA nach

der Guanidinisothiocyanat-Methode (modifiziert), wobei zum Homogenisieren der Biopsie

und dem Lysieren der Zellen der Lysis/Binding-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5;

25

500 mM LiCl; 10 mM EDTA, pH 8.0; 1% LiDS; 5 mM Dithiothreitol (DTT) ) aus dem

Dynabeads Oligo (dT) Kit® (Dynal, Oslo, Norwegen) verwendet wurde.

Die cDNA Synthese erfolgte mit dem First Strand cDNA Synthesis Kit® von MBI Fermentas

(Litauen). Folgende Reagenzien wurden verwendet:

M-MuLV Reverse Transcriptase, 20 u/µl in 50mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.1 M NaCl, 1 mM

EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton® X-100 und 50% Glyzerin gelagert;

Ribonuklease Inhibitor, 20 u/µl in 20 mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 50 mM NaCl,

8 mM DTT, 0.5 mM ELUGENT® Detergens und 50% Glyzerin gelagert;

5X Reaktions-Puffer: 250 mM Tris-HCl (pH 8.3 bei 25°C), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2,

50 mM DTT; 10 mM dNTP Mix (10 mM wässriger Lösung von dGTP, dATP, dTTP und

dCTP);

Random Hexamer Primer:

0.2 µg/µl (6A260 units/ml) in wässriger Lösung sowie

deionisiertes und nukleasefreies DEPC-Wasser.

2.1.3. Oligonukleotide zur Amplifizierung der Patienten cDNA

Zur Vervielfältigung der Patienten cDNA mittels PCR wurden sieben Oligonukleotid-Paare

verwendet (OUWENDIJK et al. 1996).

DNA Fragment (bp) Primer (5´? 3´)

29-695

CCGGGTACCAGCCTTATCCAAGTCTG

TGAGATCTGTAAGTACTGGTCA

652-1366 GCATTGGTCCCTTAGTGTAC

ATCCACACATGTTGTGTGTT

1299-2066 ATAGGTCGACGTGCCAATGG

CTGCCTTGATGATTTAACCA

26

1952-3139 GATGCAACTTGGGGCATTT

GGTACTTCATATCTCTTCTT

2967-4201 GCTCGCTATTCATCCATGGG

GATGGCTCATTCATATCAAT

4071-4923 TCCAGAGCTCATGTAGCTTTC

GTACTGGGGTAACCATAAATGCT

4876-5555 TATTCAAGCAGTTCTTATGG

TGTAAGTGCTGTGAAACTT

Tabelle 1: Oligonukleotide zur cDNA-Amplifikation

Oligonukleotid-Primer wurden in deionisiertem Wasser so aufgenommen, daß sie eine

Konzentration von 100 pmol/µl hatten. Anschließend wurden Aliquots mit der

Gebrauchskonzentration 20 pmol/µl hergestellt.

2.1.4. Reagenzien für die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und für

die Klonierung in einen Vektor

Für die Durchführung der PCR wurde die Taq®-Polymerase von Eppendorf® (5 U/µl)

benutzt. Sie wurde in einem Aufbewahrungspuffer geliefert, der aus 20 mM Tris-HCL pH 8,0

(bei 25°C); 100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50% Glyzerin und 0,5% Tween 20

besteht. Die Reaktionen fanden im Reaktionspuffer statt, der als 10x Konzentrat geliefert

wurde: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,0 (bei 25°C); 15 mM MgCl2

und 1% Triton- X-100.

In den Reaktionsansätzen wurden weiterhin eingesetzt: 10mM dNTP-Mix (10 mM wässriger

Lösung von dGTP, dATP, dTTP und dCTP); Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation

beider DNA-Stränge (20 pmol/µl); 25 mM MgCl2; deionisiertes Wasser und cDNA (20-

50 ng/µl).

27

Die Klonierung der PCR-Fragmente erfolgte in den TA-pCR 2.1® Vektor von Invitrogen

(Groningen, Niederlande). Aus dem Kit wurden für die Klonierungen folgende Reagenzien

verwendet:

linearisierter pCR2.1-Vektor (25 ng/µl in Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 7,5);

10x Ligationspuffer (60 mM Tris-HCl, pH 7,5; 60 mM MgCl2; 50 mM NaCl2; 1mg/ml

Rinderserum; 70 mM ß-Mercaptoethanol; 1 mM ATP; 20 mM Dithiothreitol;

10 mM Spermidin)

T4-Ligase (4,0 Weiss Units/µl) und steriles Wasser.

2.1.5. Chemisch kompetente Bakterien

Chemisch kompetente E.coli-Bakterien (TOP 10 und TOP 10 F´) wurden von Invitrogen

(Groningen, Niederlande) bezogen.

E.coli TOP 10:

F-mcrA ? (mrr-hsdRMS-mcrBC) ? 80lacZ? M15 ? lacX74recA1 deoR araD139 ? (ara-

leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

E.coli TOP 10F´:

F- ?lacIqTn10 (TetR)? mcrA ? (mrr-hsdRMS-mcrBC) ? 80lacZ? M15 ? lacX74recA1 deoR

araD139 ? (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

28

2.1.6. Bakteriennährmedien

LB (Luria-Bertani) Medium: 1% Bacto-Trypton (DIFCO), 0,5% Bacto-Hefe-Extrakt

(DIFCO), 1% NaCl. Zur Selektion wurde dem Medium ein entsprechendes

Selektionsantibiotikum (50µg/ml Ampicillin bzw. 50µg/ml Kanamycin) zugefügt. Für die

Herstellung fester Nährböden wurde 1,5% Agar zugesetzt.

2.1.7. Lösungen für Plasmidpräparationen

Folgende Lösungen wurden für Plasmidpräparationen nach der Methode der alkalischen Lyse

hergestellt und verwendet:

Lösung 1

25 mM Tris-HCl (pH 8.0) ; 10 mM EDTA (pH 8.0)

Lösung 2

0,2 N NaOH; 1% SDS

Lösung 2 wurde zum Zeitpunkt des Gebrauches jeweils frisch hergestellt und bei

Raumtemperatur belassen.

Lösung 3

5 M Kaliumacetat 60 ml; Eisessig 11,5 ml; H2O 28,5 ml

Die so hergestellte Lösung ist 3 M bezüglich des Kaliums und 5 M bezüglich des Acetat.

Die Lagerung von Lösung 1 und Lösung 3 erfolgte bei 4°C.

29

2.1.8. Größenstandard für DNA/Molekulargewichtsstandard für Proteine

DNA-Standard:

? - DNA: EcoRI/HindIII verdaut

Fragmentgrößen in Basenpaaren:

21226, 5148, 4973, 4268, 3530, 2027, 1904, 1584, 1375, 947, 831, 564, 125

(MBI Fermentas, Litauen)

Protein-Standard:

Protein Molekulargewicht (kDa)

Myosin, Kaninchenmuskel 205 kDa

? -Galactosidase, E. coli 116 kDa

Phosphorylase b, Kaninchenmuskel 97,4 kDa

Albumin, Rind 66 kDa

Albumin, Ei 45 kDa

Carboanhydratase, Rindererythrozyten 29 kDa

Tabelle 2: Protein-Standard

Der Proteinstandard wurde von der Firma Sigma bezogen.

30

2.1.9. Reagenzien für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese

Die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wurde nach Protokoll unter Verwendung von Pfu-

Polymerase (2,5 U/µl) von Stratagene durchgeführt (SAMBROOK 2001). Im Reaktionsansatz

wurden weiterhin verwendet:

10x Reaktionspuffer (100 mM KCl; 100 mM (NH4)2SO4; 200 mM Tris-HCl (pH 8,75);

20 mM MgSO4; 1% Triton-X-100 und 1000 mg/ml BSA),

10 mM dNTP-Mix (10 mM wässriger Lösung von dGTP, dATP, dTTP und dCTP);

Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation beider DNA-Stränge (25 pmol/µl); cDNA

(100 ng/µl) und destilliertes Wasser (dH2O).

2.1.10. Oligonukleotide, die in der Oligonukleotid-gerichteten

Mutagenese verwendet wurden

DNA Fragment (bp) Primer (5´? 3´)

677-708 TACTTACAGATATCAACCCGTCTTCCA

AGTG

708-677 CACTTGGAAGACGGGTTGATATCTGTA

AGTA

1848-1877 TAACTGGAATGCCGGAATTCAGTTTGT

TTG

1877-1848 CAAACAAACTGAATTCCGGCATTCCAG

TTA

2093-2129 TTCCTCTACACTCCGTTTTATAAAGCC

CACGTGTTTG

2129-2093 CAAACACGTGGGCTTTATAAAACGGA

GTGTAGAGGAA

Tabelle 3: Oligonukleotide für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese

Das hervorgehobene Nukleotid führt zum Aminosäureaustausch. Nummerierung der Basen nach (GREEN et al. 1987a; GREEN et al. 1987b; LE BIVIC et al. 1991)

31

Oligonukleotid-Primer wurden in deionisiertem Wasser so aufgenommen, daß sie eine

Konzentration von 100 pmol/µl hatten. Anschließend wurden Aliquots mit der

Gebrauchskonzentration 20 pmol/µl hergestellt.

2.1.11. Plasmide

Für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wurden folgende Plasmide eingesetzt:

-phSI (MOOLENAAR et al. 1997)

komplette humane Saccharase-Isomaltase im Plasmidvektor pSG8

-SI-YFP (JACOB u. NAIM 2001a)

komplette humane Saccharase-Isomaltase im Plasmidvektor YFP-C1

Das Gelb Fluoreszierende Protein (YFP) ist eine Variante des GFP und dient als

Reporterprotein.

2.1.12. Zelllinien

COS-1-Zellen

Fibroblastenähnliche, unpolare Nieren-Zelllinie, die durch Transformation von CV-1-Zellen

der Affenart Cercopithecus aethiops mit einer origin-defekten SV 40-Virus Mutante, die das

Wildtyp T-Antigen exprimiert, hergestellt worden ist (GLUTZMAN 1981).

(American Type Culture Collection; Rockeville, USA)

32

CHO-Zellen Ausgang dieser epithelialen Zelllinie war eine Biopsie eines Ovars vom Chinesischen

Hamster (Cricetulus griseus) von PUCK et al. (1958).

(American Type Culture Collection; Rockeville, USA)

2.1.13. Kulturmedium für Säugerzellen

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) low glucose, flüssig

1 g/l Glucose, 10% fetales Kälberserum (FKS), 292 mg/l L-Glutamin, 110 mg/l

Natriumpyruvat, 50.000 U/l Penicillin und 10 mg/l Streptomycin

DMEM wurde zur Kultivierung von COS-1-Zellen verwendet.

Minimum Essential Medium (MEM) ohne Methionin, flüssig

1 g/l Glucose, 2% fetales Kälberserum (FKS), 292 mg/l L-Glutamin, 50.000 U/l Penicillin

und 10 mg/l Streptomycin)

MEM wurde zur Inkubation von Zellen vor der biosynthetischen Markierung mit S35-

Methionin benutzt.

Alle Produkte von Gibco, Berlin

33

2.1.14. Reagenzien, die in der Zellkultur eingesetzt wurden

Trypsin/EDTA Die Gebrauchslösung enthielt 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS). DEAE-Dextran: Die Gebrauchslösung hatte eine Konzentration von 50 mg DEAE-Dextran/ml dH20 . Chloroquin: Die Gebrauchslösung hatte eine Konzentration von 50 mg Chloroquin/ml dH2O.

2.1.15. Antikörper

Vier monoklonale epitopspezifische Antikörper (AK) gegen Saccharase, Isomaltase oder pro-

SI wurden zur Immunpräzipitation verwendet (HAURI et al. 1985). Diese präzipitieren die

mannosereich glykosylierte (pro-SIh) und die komplex glykosylierte Form (pro-SIc) der pro-

SI. Die Produkte der Hybridomazellen HBB 1/691, HBB 2/614 und HBB 2/219 sowie HBB

3/705 wurden uns freundlicherweise von Prof. Dr. H.P. Hauri (Biozentrum Basel, Schweiz)

und von Prof. Dr. E.E. Sterchi (Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Universität

Bern, Schweiz) zur Verfügung gestellt.

Folgender AK-Mix wurde verwendet, von dem pro Immunpräzipitation (IP) 2µl eingesetzt

wurden:

Antikörper Menge in µl

Glu 2 5

691 5

705 5

Glu 3 5

PBS 80

Gesamt 100

Tabelle 4: SI-Antikörper-Mix

34

2.1.16. Puffer und Protease-Inhibitoren, die bei

Immunpräzipitationen verwendet wurden

Standard-Lysis-Puffer

25 mM Tris-HCl pH 8,0

50 mM NaCl

0,5% DOC

0,5% Triton-X-100

Protease-Inhibitoren

1 mM PMSF

1 µg/ml Pepstatin

1 µg/ml Aprotinin

5 µg/ml Antipain

5 µg/ml Leupeptin

100 µg/ml Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor

Waschpuffer I

0,5% Triton-X-100

0,005% Na-Desoxycholat in PBS

Waschpuffer II

500 mM NaCl

0,5% Triton-X-100

10 mM EDTA

125 mM Tris/HCl pH 8,0

35

2.1.17. Allgemein verwendete Puffer

Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)

0,8% NaCl

0,2% KCl

8 mM Na2HPO4

1,5 mM K2HPO4 pH 7,4

Tris-EDTA-Puffer (TE)

50 mM Tris/HCl

1 mM EDTA pH 7,5

Tris-Acetat-EDRA-Puffer (TAE)

40 mM Tris-Acetat

1 mM EDTA pH 8,0

2.1.18. Reagenzien für Deglykosylierungsreaktionen

und Proteasesensitivitätsversuche

Um das Glykosylierungsmuster von Proteinen zu untersuchen, wurden zwei

Endoglykosidasen eingesetzt: Endo-ß-Acetylglucosaminidase (Endo H) spaltet

mannosereiche, N-glykosidisch gebundene Zucker zwischen den beiden Acetylglukosaminen,

wohingegen Endo-N-Glykosidase F (Endo F) bei mannosereichen wie auch bei komplexen N-

glykosylierten Proteinen zwischen dem N-Acetylglukosamin des Oligosaccharids und dem

Asparagin des Polypeptids spaltet. Vor der eigentlichen enzymatischen Reaktion wurde das

36

Protein in Denaturierungspuffer (10x Konzentration: 5% SDS; 10% Mercaptoethanol) 10 min

bei 95°C gekocht, anschließend wurde für die Endo-H-Reaktion G5-Puffer (10x

Konzentration: 0,5 M Natriumcitrat pH 5,5 bei 25°C) und Endo H (500 U/µl) bzw. für die

Endo F-Reaktion NP-40-Puffer (10x Konzentration: 10%ig), G7-Puffer (10x Konzentration:

0,5 M Natriumphosphat pH 7,5 bei 25°C) und Endo F (500 U/µl) zugesetzt. Enzyme und

Puffer von New England Biolabs, Inc.

Bei den Trypsin-Versuchen wurden Trypsin (Sigma) und Trypsin-Inhibitor (Boehringer)

eingesetzt. Die Gebrauchskonzentrationen waren 500 µg Trypsin/ml H2O und 2 mg Inhibitor/

10µl PBS.

2.1.19. Puffer und Reagenzien für Elektrophoresen

Die Auftrennung von DNA wurde durch die nicht-denaturierende Agarosegel-Elektrophorese

erreicht. Als Laufpuffer diente TAE-Puffer (40 mM Tris/HCL und 1 mM EDTA pH8,0), der

auch als Gelpuffer diente und dem dann Agarose zugesetzt wurde. Nach dem Aufkochen

wurden dem Gel 10 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) zugesetzt, ein Stoff, der zwischen den

Stickstoffbasen der DNA interkaliert und durch UV-Licht zum Fluoreszieren angeregt wird.

DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit 20% Ladepuffer (0,25% Bromphenolblau,

0,25% Xylencyanol FF und 30% Glyzerin) versetzt.

Die Größe der DNA-Fragmente wurde über einen DNA-Molekulargewichtsstandard

abgeschätzt (siehe oben).

Hingegen wurde zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen die Sodium-Dodecyl-

Sulfat-Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Als Trenngelpuffer

wurde dabei 1,5 mM Tris/HCl pH 8,8 und als Sammelgelpuffer 1 mM Tris/HCl pH 6,8

verwendet. Der Elektrophoresepuffer bestand aus 3,082 g Tris/HCl; 14,4 g Glycin und 1 g

SDS pro Liter deionisiertem Wasser. Weiterhin wurden für die Erstellung der Gele folgende

Substanzen benötigt: deionisiertes Wasser, Acrylamid, 10%ige SDS-Lösung, TEMED und

10%ige Ammoniumpersulfatlösung. Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 30% 3x

37

Lämmli-Puffer (6% SDS; 20% Glyzerin; 150 mM Tris/HCl pH 6,8; 0,02% Bromphenolblau

und 150 mM DTT) versetzt. Nach dem Gellauf wurde das Gel ca. 30 min in Coomassieblau-

Lösung (0,1% Coomassiebrillantblue; 25% Isopropanol, 10% Essigsäure) gefärbt und der

ungebundene Farbstoff anschließend mit Entfärber (25% Isopropanol und 10% Essigsäure)

bis zum Sichtbarwerden der Proteinbanden entfernt. Die Größe der Proteine wurde über den

Protein-Molekulargewichtsstandard (siehe oben) ermittelt.

2.1.20. Materialien für die automatische Sequenzierung von DNA

Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit dem Thermo Sequenase Fluorescent Labelled

Cycle Sequencing Kit® durchgeführt. Die PCR wurde auf einem PTC-100 Programmable

Thermal Controller® durchgeführt.

Folgender Auftragspuffer wurde verwendet:

10 mM EDTA pH 8,0

0,1% Bromphenolblau

Für die Sequenzierung von phSI-Plasmiden wurde folgender Primer verwendet:

5’ SEQ GAT TGG AAA TCT CTC TCT GAT TGT CCT TTT TGT CAT A

PROL 1 CTG CTC ATT GGT TAG GAG AC

Für die Sequenzierung von pCR2.1-Plasmiden kamen folgende Sequenzierungsprimer zur

Anwendung:

M13 universal TGT AAA ACG ACG GCC AGT

M13 reverse GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG

Für die Auftrennung von nichtradioaktiven Sequenzreaktionen wurde der LI-COR Modell

4200 und die Software BaseImageIR® Version 4.1 verwendet. Als Gelmatrix für die

38

Auftrennung von bis zu ca. 850 bp wurde Sequagel XR® unter Zusatz von 1% DMSO

verwendet. Die für das Gelgießen verwendeten Glasplatten waren 41 cm lang.

2.1.21. Materialien für die Immunelektronenmikroskopie

Utradünnschnitte wurden mit dem Leica EM ULTRACUT RFCS Kryoultramikrotom bei

-100°C bis -110°C durchgeführt. Die Markierung der SI erfolgte mit einem polyklonalen SI-

Antikörper. Die Markierung von LPH bzw. DPPIV erfolgte mit anti-LPH bzw. anti-DPPIV.

Anschließend erfolgte eine Behandlung mit einem Ziegen-anti-Kaninchen Immunogold-

Antikörper (Dianova). Die grids wurden mit in 2% Methylcellulose eingebettetem

Uranylacetat kontrastiert (1 ml Methylcellulose enthielt 0,1 ml 3% Uranylacetat) und

anschließend in einem Phillips 400 Elektronenmikroskop (Phillips) untersucht.

2.1.22. Materialien für die Konfokale Fluoreszenzmikroskopie

Die Beobachtung transfizierter lebender Zellen erfolgte mit dem Leica TCS SPII Mikroskop

unter Verwendung einer 63-fachen Plasmachromat-Linse (Leica-Microsystems). Die

aufgenommenen Daten wurden mit der Leica Confocal Software ausgewertet.

2.1.23. Lösungen für den Enzymaktivitätstest

Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität erfolgte mit dem Gluco-quant Glucose/HK Test

von Roche Diagnostics.

Die für die Durchführung des Enzymaktivitäts-Tests erforderliche Reagenzlösung bestand aus

Lösung 1(Tris-Puffer: 100mmol/l, pH 7,8; Mg2+: 4 mmol/l; NADP>oder =1.0mmol/l; ATP

>oder =1,7mmol/l) und aus Lösung 2 (Hexokinase>oder = 8,3U/ml; Glucose-6-Phosphat-

Dehydrogenase>oder= 15 U/ml). Die Reagenzlösung wurde aus sechs Volumenanteilen

Lösung 1 und einem Teil Lösung 2 bei Bedarf gemischt.

39

2.2. Methoden

2.2.1. Homogenisierung der Darmbiopsie

Die Darmbiopsie, die zur mRNA-Isolierung vorgesehen war, wurde sofort nach der Entnahme

in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei –80°C gelagert. Zur Isolierung

der RNA wurde sie auf Eis in einem Eppendorf-Cup mit einem Handhomogenisator

homogenisiert.

2.2.2. Zelllyse und Isolierung der Gesamt-RNA

Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurde eine modifizierte Guanidinisothiocyanatmethode

angewendet (CHOMCZYNSKI u. SACCHI 1987).

Die Zelllyse erfolgte mit 300 µl Lysis/Binding Puffer aus dem Dynabead-Kit®.

Für die anschließende Gesamt-RNA-Isolierung wurde ein 50 µl Aliquot des Zelllysats

verwendet, das restliche Lysat wurde bei –80°C gelagert.

Zu 50 µl Zelllysat wurden 2 µl 3M Natriumacetat-Lösung (NaAc-Lösung) und das zweifache

Volumen an 96%igem Ethanol gegeben. Anschließend wurde die Probe für 13 min bei

12000g zentrifugiert.

Das Pellett wurde mit 100 µl 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend in 100 µl

DEPC-Wasser aufgenommen.

Die Aufreinigung der Gesamt-RNA erfolgte über eine Phenol-Chloroform-Extraktion, indem

zunächst das gleiche Volumen an Phenol zugegeben wurde. Nach Zentrifugation über 13 min

bei 12000g wurde die wässrige Phase in ein neues Eppendorf-Cup überführt und mit gleichem

Volumen Chloroform versetzt. Nach erneuter Zentrifugation (5 min bei 12000g) erfolgte die

Fällung mit 1/10 Volumen (der wässrigen Phase) 3 M NaAc-Lösung. Das Präzipitat wurde

mit 70%igem Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in 20 µl DEPC-Wasser

aufgenommen. Die Lagerung erfolgte bei –80°C. Von diesem Gesamt-RNA Extrakt wurden

jeweils 2 µl (entsprachen 5 µg Gesamt-RNA) für die Synthese der cDNA eingesetzt.

40

2.2.3. Reverse Transkription der m-RNA und cDNA-Synthese

Für die Synthese einer „ full-length-cDNA“ wurde der First Strand cDNA Synthesis Kit® von

MBI Fermentas benutzt. Die mit diesem System synthetisierte cDNA wurde als „template“ in

der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwendet.

Der folgende Reaktionsansatz wurde in einem Eppendorf-Cup auf Eis vorbereitet:

RNA (Gesamt-RNA) 5 µg (entsprachen 2 µl Gesamt-RNA-Lösung)

random hexamer primer 0,5 µg/µl 1 µl

deionisiertes Wasser, nukleasefrei auf 11µl Gesamtvolumen

Nach vorsichtigem Mischen und kurzem Abzentrifugieren (3-5 s) wurde der Mix 5 min bei

70°C inkubiert, dann kurz abzentrifugiert und auf Eis gebracht.

Folgende Komponenten wurden in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt:

5x Reaktionspuffer 4 µl

Ribonuklease-Inhibitor (20 U/µl) 1 µl

10mM dNTP Mix 2 µl

Nach vorsichtigem Mischen und kurzem Abzentrifugieren (3-5 s) wurde der Mix 5 min bei

37°C inkubiert und anschließend

M-MuLV Reverse Transkriptase (20 U/µl) 2 µl

Tabelle 5: Chemikalien für die Reverse Transkription von cDNA

zu einem Endvolumen von 20 µl hinzugefügt. Dieser Mix wurde 60 min bei 37°C inkubiert

und die Reaktion anschließend 10 min bei 70°C abgestoppt. Die so erhaltene cDNA wurde

direkt als „template“ in verschiedenen Polymerase-Ketten-Reaktionen eingesetzt.

41

2.2.4. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Zur Aufklärung der molekularen Ursache der CSID auf DNA-Ebene, wurde nach der RNA-

Isolierung die cDNA mittels RT-PCR vervielfältigt. Die PCR wurde dabei mit 7

verschiedenen Primerpaaren durchgeführt (OUWENDIJK et al. 1996). Folgende Reagenzien

wurden zu einem 100 µl Reaktionsansatz auf Eis zusammenpipettiert:

10x PCR-Puffer 10 µl

dNTPs 25 mM 2 µl

Primer up 20 pmol/µl 5 µl

Primer down 20 pmol/µl 5 µl

MgCl2 Endkonzentration 1,5 mM bis 6,5 mM

cDNA (40-100 ng) 2 µl

Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl

dH20 ad 100 µl Gesamtvolumen

Tabelle 6: Standard-PCR-Reaktionsansatz

Standard-PCR-Programm:

95°C 1 min Denaturierungsschritt

95°C 45 s Denaturierungsschritt

55°C 1 min Primeranlagerungsschritt

72°C 1 min Elongationsschritt

72°C 6 min Elongationsschritt

4°C Pause

Tabelle 7: Standard-PCR-Programm

Es wurden 28 PCR-Zyklen durchgeführt.

42

2.2.5. Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration

Die Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration und deren Reinheitsgrad erfolgte

absorptionsphotometrisch mittels einer geeigneten Verdünnung (5:1000) der DNA in Wasser

bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm (SAMBROOK 2001). Dabei wurde für die

Messung doppelsträngiger (ds) DNA zugrundegelegt, daß eine OD260 von 1 von 50 µg

dsDNA/ml Lösung erreicht wird. Der Reinheitsgrad der Nukleinsäurelösung wurde über das

Verhältnis der Absorptionswerte A260:A280 ermittelt, das bei ausreichender Reinheit für

Klonierungen zwischen 1.8 und 2.0 liegen sollte.

Alternativ erfolgte eine Abschätzung der DNA-Menge mittels Gelelektrophorese. Dabei

wurde die Leuchtkraft der zu bestimmenden DNA mit dem DNA-Standard verglichen. Bei

bekannter Größe und Konzentration des DNA-Standards konnte die Menge an aufgetragener

DNA errechnet werden.

2.2.6. Auftrennung von DNA-Fragmenten mittels Gelelektrophorese

Analytische und präparative Agarosegelelektrophoresen wurden durchgeführt um einerseits

die Größe von DNA-Fragmenten zu bestimmen (PCR-Produkte, Fragmente nach

Restriktionsanalysen) und andererseits um PCR-Produkte als Vorbereitung für Ligationen

aufzureinigen.

Die Agarosegel-Konzentration wurde entsprechend dem gewünschten Auftrennungsbereich

gewählt (SAMBROOK 2001). Der Gellauf erfolgte mit konstant 80-100 V.

2.2.7. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte nach der Freeze-Squeeze-

Methode (THURING et al. 1975). Dazu wurde die gewünschte Bande nach

elektrophoretischer Auftrennung der DNA-Probe aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten und

43

nach dem Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff zwischen zwei Parafilmblättern durch

Ausquetschen der Gelflüssigkeit gewonnen. Nach Fällung der DNA mittels 1/10 Volumen

3 M NaAc und doppeltem Volumen 96%igem Ethanol (Volumenangaben bezogen auf die

gewonnene Flüssigkeit), wurde das Pellett mit 70%igem Ethanol gewaschen. Die isolierte und

getrocknete DNA wurde in 20 µl dH20 aufgenommen und bei -20°C gelagert.

2.2.8. DNA-Ligation

Zur Sequenzierung wurden die sieben PCR-Produkte aus mehreren voneinander

unabhängigen Reaktionen in den pCR 2.1-Vektor kloniert. Durch die Verwendung eines

linearisierten Vektors mit Thymidin-Überhang an beiden Enden, konnte auf die Verwendung

von PCR-Primern mit Restriktionsschnittstellen verzichtet werden, da die Taq-Polymerase

eine „template“-unabhängige Aktivität besitzt, die Desoxyadenosin am 3´- Ende des

PCR-Produkts anlagert. Für die Ligations-Reaktion wurden folgende Reagenzien nach

modifiziertem Herstellerprotokoll auf Eis zusammenpipettiert:

10x Ligationspuffer 2 µl

pCR 2.1 Vektor (25 ng/µl) 0,5 µl

PCR-Produkt (50-100 ng/µl) 2 µl

dH2O ad 20µl

T4 Ligase (4 Weiss-U/µl) 1 µl

Gesamtansatz 20 µl

Tabelle 8: Standard-Ligationsansatz

Die Reaktion erfolgte über 12 h bei 16°C im Wasserbad.

44

2.2.9. Transformation von E.coli

Die Transformation von E.coli erfolgte nach der von HANAHAN (1983) beschriebenen

Methode in folgendermaßen abgeänderter Weise: Ein 50 µl Aliquot chemisch kompetenter

E.coli-Bakterien (mind. 107 CFU/µg DNA) wurde auf Eis aufgetaut und mit 2 µl vom

Ligationsansatz transformiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock über

genau 90 s bei 42°C. Das anfängliche Wachstum erfolgte in 200 µl LB-Medium im Schüttler

bei 37°C und 225 rpm. Nach einer bzw. eineinhalb Stunden wurden die Bakterien

entsprechend der Antibiotikaresistenz ihres Plasmids auf Ampicillin- (100 mg/ml) bzw.

Kanamycin- (50 mg/ml) haltigen LB-Agarplatten ausplattiert.

2.2.10. Plasmid-DNA-Präparation aus E.coli

Analytische Minipräparationen von Plasmid-DNA wurden mittels Alkalischer Lyse

gewonnen. Dem Protokoll liegen die Methoden von BIRNBOIM u. DOLY (1979) und das

Protokoll von SAMBROOK (2001) zugrunde.

Die Anzucht einer Einzelzellkolonie erfolgte über Nacht in 3 ml LB Medium mit dem

entsprechenden Antibiotikum bei 37°C und 225 rpm.

1,5 ml der Kultur wurde bei 12000 g für 30 s zentrifugiert. Der Rest der Kulturen wurde bei

4°C gelagert.

Das Bakterienpellet wurde in 60 µl eiskalter Lösung 1 resuspendiert (Destabilisierung der

Bakterienwand durch EDTA).

Zu der Supension wurden erst 200 µl frisch angesetzte Lösung 2 (Lyse der Bakterien durch

SDS und Denaturierung der DNA durch NaOH), dann 150 µl eiskalte Lösung 3

(neutralisierend, denaturierte Proteine und chromosomale DNA präzipitieren mit dem

Kaliumsalz des Dodecylsulfats) zugegeben, wobei nach jeder Zugabe kräftig geschüttelt

wurde.

Durch Zentrifugation bei 12000 g bei 4°C erfolgte die Sedimentation. Der Überstand wurde in

ein neues Cup überführt und die doppelsträngige DNA mit 2 Volumenanteilen 96%igem

45

Ethanol präzipitiert. Die Zentrifugation erfolgte bei 12000 g für 15 min. Das Pellett wurde

anschließend getrocknet und in 50 µl TE (pH 8.0) resuspendiert

Die Lagerung der Plasmid-Minipräparationen erfolgte bei –20°C.

Zur Gewinnung von ca. 100-150 µg DNA wurde eine Einzelzellkolonie über Nacht in 100 ml

LB Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum bei 37°C und 225 rpm angezogen. Nach

Zentrifugation über 5 min bei 5000 g wurde das Pellett in 6 ml Lösung 1 resuspendiert. Nach

Inkubation bei Raumtempertur über 10 min wurden 12 ml Lösung 2 zugegeben. Nach

weiteren 10 min Inkubation bei Raumtempertur wurden 9 ml der Lösung 3 zugegeben und die

Inkubation über 20 min auf Eis fortgeführt, wobei nach jeder Zugabe kräftig geschüttelt

wurde. Durch Zentrifugation bei 12000 g erfolgte die Sedimentation der chromosomalen

DNA und der Proteine. Der Überstand wurde filtriert und in neue Zentrifugenbecher

überführt. Nach Fällung der Plasmid-DNA mit 15ml Isopropanol über 15 min bei 12.000 g

wurde das Pellett mit 10 ml 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend getrocknet.

Anschließend wurde das Pellett in 300 µl TE-Puffer und 30 µl RNAseA aufgenommen und

über 30 min bei 37°C inkubiert. Eine Reinigung der DNA erfolgte mittels Phenol-

Chloroform-Extraktion. Dazu wurde das gleiche Volumen Phenol hinzugefügt und nach

Zentrifugation über 5 min bei 12000 g wurde die wässrige Phase in ein neues Eppendorf-Cup

überführt. Anschließend wurde das gleiche Volumen Chloroform hinzugegeben und nach

erneuter Zentrifugation die wässrige Phase in ein neues Cup überführt. Diesem Überstand

wurden 0,7 Volumenanteile Isopropanol und 0,1 Volumenanteile NaAc-Lösung

hinzugegeben. Nach Fällung der DNA über 10 min bei 4°C und 12000 g wurde das Pellett mit

70%igem Ethanol gewaschen und anschließend getrocknet. Die gewonnene DNA wurde in

500 µl TE-Puffer aufgenommen und bei 4°C gelagert.

2.2.11. Anzucht und Lagerung von Bakterienstämmen

Die Anzucht der Bakterien erfolgte entweder über Nacht in 3 ml LB-Medium unter Zusatz

des entsprechenden Selektionsantibiotikums auf einem Schüttler (225 rpm, 37°C ) oder im

Falle von beimpften LB-Agar-Platten ebenfalls über Nacht in einem Inkubator bei 37°C.

46

Die Lagerung von Bakterienklonen erfolgte für bis zu einem Monat auf den Agarplatten im

Kühlschrank, zur längerfristigen Lagerung jedoch wurden flüssige Übernachtkulturen 1:1 mit

Glyzerin gemischt und bei –80°C gelagert.

2.2.12. DNA-Restriktion

Um die DNA durch Restriktionsverdau zu überprüfen, wurden für einen 20 µl Ansatz 2 µl der

Mini-Plasmidpräparation (0,5-1 µg Plasmid-DNA) in einem Mix aus 16 µl dH2O, 2 µl 10x

Restriktionsenzympuffer und 1-2 U des entsprechenden Restriktionsenzyms gelöst.

Die Reaktion wurde für 1 h bei der empfohlenen Temperatur inkubiert. Der Rest der

Plasmidpräparation wurde bei –20°C gelagert.

2.2.13. DNA-Sequenzierung

Die nichtradioaktive Sequenzierung doppelsträngiger DNA (SANGER et al. 1977) erfolgte

nach folgendem Ansatz:

Plasmid-DNA 200 fmol (ca. 200 ng pro kb)

IRD-800 markierter Primer 2 pmol

IRD-700 markierter Primer 2 pmol

Dimethylsulfoxid (DMSO) 1µl

dH2O ad 25 µl

Je 6µl von diesem Ansatz wurden zu 2µl der Terminationsansätze pipettiert und mit Mineralöl

überschichtet. Die PCR wurde nach folgendem Programm durchgeführt:

94°C 45 s

58°C 45 s

68°C 45 s

Tabelle 9: Ansatz zur nicht-radioaktiven DNA-Sequenzierung

47

Um unspezifische Kettenbrüche an C7-Desaza-dGTP-Nukleotiden zu vermeiden, wurden die

5µl Auftragspuffer erst nach dem ersten Denaturierungsschritt zum Gesamtansatz pipettiert.

Diese durch Fluorochrome markierte DNA wurde durch eine Elektrophorese aufgetrennt.

Mittels Laser wurden die Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und deren Absorptionsmaxima

gemessen. Als Gelmatrix für die Auftrennung von bis zu ca. 850 bp wurde Sequagel XR®

unter Zusatz von 1% DMSO verwendet.1.

2.2.14. Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese

Zur Mutagenese der Wildtyp-SI im phSI bzw. im SI-YFP-Vektor, wurde die Methode der

Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese gewählt (SAMBROOK 2001). Zwei

Oligonukleotidprimer, die jeweis komplementär zueinander sind und die erwünschte Mutation

tragen, binden dabei sequenzspezifisch im doppelsträngigen Plasmid und werden mittels einer

Proofreading-Polymerase extendiert. Als Produkt entstehen doppelsträngige Plasmide, die an

der gewünschten Stelle die Mutation in beiden Strängen tragen. Auf Eis wurden nacheinander

folgende Komponenten zusammenpipettiert:

10x Reaktionspuffer 5µl

dsDNA template xµl (5-50 ng)

10 mM dNTP-Mix 2µl

Primer up (25 pmol/µl) 1µl

Primer down (25 pmol/µl) 1µl

dH2O ad 50µl

Erst nach dem Primer-Anlagerungs-Schritt des ersten Zyklus erfolgte die Zugabe von

Pfu-Polymerase (2,5 U/µl) 1µl

Tabelle 10: Standard-Mutagenese-Ansatz

als hotstart. 1 Die Sequenzierungsreaktionen und die elektrophoretische Auftrennung der fluoreszenzmarkierten DNA wurden von Alexander Giese und Heike Klippert vom Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

48

Als Standardprogramm für die Mutagenese-PCR (12 Zyklen) wurde verwendet:

95°C 1 min

95°C 45 s

55°C 1 min

70°C 22 min (2 min pro 1 kb)

70°C 10 min

4°C Pause

Tabelle 11: Standard-Mutagenese-Programm

2.2.15. Pflege der Zellkultur

Die Lagerung von Säugetierzellen erfolgte in flüssigem Stickstoff. Um diese Zellen in Kultur

zu nehmen, wurde ein Kryoröhrchen mit eingefrorenen Zellen kurz im 37°C-Wasserbad

aufgetaut und der Inhalt nach dem Resuspendieren mit 5 ml DMEM-Medium (für COS-1-

Zellen) bzw. MEM-Medium (für CHO-Zellen) in ein steriles, zentrifugierbares Röhrchen

überführt. Nach Zentrifugation wurde das Pellett erneut in 5 ml Kulturmedium aufgenommen

und die Suspension auf mehrere Zellkulturschalen aufgeteilt. Nach Zugabe von

Kulturmedium auf ein Gesamtvolumen von 10 ml wurden diese Schalen in einem

Zellkulturbrutschrank (37°C, Carbogenatmosphäre und 95% relative Luftfeuchtigkeit)

inkubiert. Ein Wechseln des Mediums war ca. alle 3 bis 4 Tage nötig. Sobald die einschichtig

wachsenden Zellen einen Monolayer gebildet hatten, wurden sie, nachdem das Kulturmedium

entfernt worden war, unter Zugabe von 2 ml Trypsin/EDTA und Inkubation über 2-10 min

abgelöst und unter Zugabe von frischem Kulturmedium auf mehrere neue Schalen ausgesät.

Nicht länger in der Kultur benötigte Zellen wurden folgendermaßen auf ihre Lagerung in

flüssigem Stickstoff vorbereitet: Pro einzufrierende Schale wurde in einem separaten

Röhrchen ein Gemisch aus 1,5 ml Kulturmedium mit 10% DMSO angesetzt. Die Zellen dicht

bewachsener Schalen wurden unter Zugabe von 2 ml Trypsin/EDTA abgelöst und nach

Zugabe von 5 ml Kulturmedium abzentrifugiert. Das Pellett wurde in dem erkalteten Gemisch

49

resuspendiert und in ein Kryoröhrchen überführt. Anschließend wurde das Röhrchen in einer

geeigneten Einfrierbox 24 h bei -80°C gelagert, um ein langsames Einfrieren zu erzielen. Die

langfristige Lagerung erfolgte anschließend in flüssigem Stickstoff.

2.2.16. Transiente Transfektion von COS-1-Zellen nach der

DEAE-Dextran-Methode

Der transienten Tranfektion mittels DEAE-Dextran-Methode liegt die Methode von

PAGANO u. VAHERI (1965) in ihrer Modifikation von NAIM et al. (1991a) zugrunde. In

Kultur gehaltene COS-1-Zellen wurden 24 h vor der geplanten Transfektion durch die Zugabe

von 2 ml Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturschale abgelöst und so vereinzelt, daß am

folgenden Tag die zu transfizierenden Zellen zu etwa 40% konfluent waren.

Zunächst wurden 5 µg der DNA inh 1,5 ml Transfektionsmedium gegeben und anschließend

10 µl Diethylaminoethyl-(DEAE)-Dextran dazu pipettiert. Die Bildung des DEAE-Dextran-

DNA-Komplexes erforderte ca. 30 min. Dieses Gemisch wurde auf zuvor zweimal mit PBS

gewaschene Zellen pipettiert und über eineinhalb Stunden auf den Zellen belassen.

Anschließend wurde der DEAE-Dextran-DNA-Komplex von den Zellen abgesaugt und gegen

10 ml entsprechendes Kulturmedium ausgetauscht. Dem Kulturmedium wurden 10µl

Chloroquin zugegeben und diese Inkubation über 4 h bei 37°C und Carbogenatmosphäre in

einem Inkubator mit 95%-Luftfeuchte durchgeführt. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die

Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 10 ml neuem Kulturmedium

versorgt. Das transfizierte Plasmid wird bei dieser Methode nicht stabil in das Zellgenom

eingebaut, so daß die Zellen nach einigen Tagen das Plasmid wieder verlieren.

50

2.2.17. Radioaktive Markierung von Proteinen

Die radioaktive Markierung der Proteine für die Fluorographie erfolgte mit S35-Methionin

(TORIAN u. KENNY 1986). Die modifizierte Methode wurde von NAIM et al. (1991a)

beschrieben. 48 h nach durchgeführter Transfektion wurde eine Stunde vor Beginn der

radioaktiven Markierung von den Zellen das Kulturmedium abgesogen, die Zellen wurden

zweimal mit PBS gewaschen und anschließend über eine Stunde mit Methionin-freiem ME-

Medium inkubiert.

Nach Ablauf der Stunde wurde das Methionin-freie Medium durch frisches ersetzt und die

Zellen wurden mit 80 µCi S35-Methionin markiert. Die Markierung erstreckte sich je nach

Experiment (Pulse-Chase-Versuch oder kontinuierliche Markierung) über eine bis zu sechs

Stunden.

2.2.18. Zelllyse und Immunpräzipitation

Die Methode wurde von NAIM et al. (1991a) beschrieben. Zu den Zellen wurden 10 µl

Protease-Inhibitoren und 1 ml Standardlysispuffer gegeben, die Zellen wurden von der

Zellkulturschale mit Hilfe eines Gummischabers abgelöst und in ein Eppendorf-Cup gegeben.

Die Lyse erfolgte über 30 min bei 4°C auf einem Schüttler.

Anschließend erfolgte über eine Zentrifugation bei 12000 g und 4°C die Sedimentation der

unlöslichen Zellbestandteile. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt und es

wurden 30 µl Protein-A-Sepharose-„beads“ zugesetzt (bei diesem Vorgang des „preclearing“

von mindestens 1 h bei 4°C auf den Schüttler kommt es zu einer Vielzahl von unspezifischen

Bindungen an die Protein-A-Sepharose). Nach Zentrifugation bei 6000 g und 4°C wurde der

Überstand zur spezifischen Präzipitation der SI benutzt. Dazu wurde in einem neuen

Röhrchen 50 µl Protein-A-Sepharose mit 2 µl des SI-Antikörper (AK)-Mix vermischt und der

Überstand dazu pipettiert. Die spezifische Präzipitation der SI erfolgte über 12 h bei 4°C auf

dem Schüttler. Die präzipitierte, an Protein-A-Sepharose über die AK gebundene SI, konnte

nun über Zentrifugation bei 6000 g über 1 min sedimentiert werden. Danach erfolgte ein

Waschen der „beads“ mit 1 ml Waschpuffer 1 (WP 1). Nach erneuter Zentrifugation der

51

„beads“ bei 6000 g über 1 min erfolgten zwei weitere Waschschritte mit WP1. Anschließend

folgten analog drei Waschschritte mit je 1 ml Waschpuffer (WP 2).

2.2.19. Endoglykosidase H- und Endoglykosidase F- Behandlung

Die Methode wurde von NAIM et al. (1987) beschrieben. Endoglykosidase H spaltet

ausschließlich mannosereiche Zuckerketten ab, während eine Behandlung mit Endo F die

komplex und die mannosereich glykosylierten Modifikationen eines Proteins abspaltet.

Auf die Beads einer Immunpräzipitation (IP) wurden 45 µl dH2O und 5 µl 10x

Denaturierungspuffer gegeben. Die Denaturierung erfolgte über 10 min bei 95°C. Nach dem

Erhitzen der Proben wurde der Überstand von 50 µl für die Behandlung mit Endoglykosidase

H in zwei Aliquots zu je 25 µl aufgeteilt. Nach dem Pipettieren von 2,5 µl G5-Puffer in beide

Aliquots, wurde in ein Aliquot zusätzlich 0,2 µl Endoglykosidase H pipettiert.

Die Inkubation erfolgte über 1 h bei 37°C.

Analog erfolgte die Behandlung mit Endoglykosidase F. Nach dem Aufteilen der beiden

Aliquots erfolgte in beiden die Zugabe von je 2,5 µl G7-Puffer und NB40-Puffer, in eins der

Aliquots zusätzlich die Zugabe von 0,2 µl Endoglykosidase F.

Die Inkubation erfolgte über 1 h bei 37°C.

2.2.20. Trypsin-Behandlung

Die Behandlung mit Trypsin wurde nach metabolischer Markierung mit S35-Methionin und

Immunpräzipitation der SI durchgeführt (MOOLENAAR et al. 1997). Die Inkubation erfolgte

mit 30 µl Trypsin-Lösung (500 µg Trypsin/ml H2O) bei 37°C. Die Reaktion wurde durch

Abkühlen auf Eis und durch Zugabe von 10 µl Trypsin-Inhibitor-Lösung (2 mg Trypsin-

Inhibitoren /10 µl PBS) und 20 µl dreifach Lämmli-Puffer abgestoppt.

52

2.2.21. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Methode wurde von LAEMMLI (1970) beschrieben. Zum Auftragen auf das SDS-Gel

wurde zu jeder der Proben 30 µl dreifach Lämmli-Puffer gegeben und eine Denaturierung der

Proteine durch Erhitzen der Proben für 10 min bei 95°C erreicht.

Zuvor wurde das Gel für die SDS-PAGE vorbereitet. Die Dichte der Gelmatrix richtet sich

nach der Größe der aufzutrennenden Proteine und ist abhängig von dem relativen Anteil der

zum Gelgießen verwendeten Reagenzien. Für die Auftrennung der Saccharase-Isomaltase

wurden 6%ige Gele verwendet, mit denen Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 60

und 250 kDa gut aufgetrennt werden können.

Trenngel 6%

Tabelle 12: Zusammensetzung des SDS-Geles zur Auftrennung der molekularen Formen der Saccharase Isomaltase

Für die Analyse der SI wurden die Gele in einer Protean2-Kammer von Biorad gefahren. Der

Lauf erfolgte bei 6 mA (konstant) pro Gel über Nacht.

Die Anfärbung der Proteine erfolgte mit Coomassie-Blau über ca. 30 min, anschließend

wurde der überflüssige Farbstoff mit Entfärber bis zum Sichtbarwerden der Proteinbanden

entfernt.

Die Proteingele wurden auf Whatman-Papier geblottet und die Proteine durch Auflegen des

Gels auf einen Phosphorschirm detektiert.

H2O (ml) 16,5

Acrylamid (ml) 6,2

1,5 M Tris pH 8,8 (ml) 7,7

10% SDS (µl) 310

TEMED (µl) 18,6

10%ige APS-Lösung (µl) 310

53

2.2.22. Messung der Enzymatischen Aktivität

Die Beurteilung der Aktivität der Saccharase-Isomaltase erfolgte in Anlehnung an

DAHLQVIST (1968), wobei als Substrat Saccharose eingesetzt wurde. Für diesen Versuch

wurden je 15 Schalen von 100 mmm Durchmesser konfluenter COS-1-Zellen verwendet, die

48 h nach der Transfektion mit den Plasmiden phSI bzw. phSIA231T homogenisiert und lysiert

wurden. Aus den vereinigten Lysaten von je 15 Platten erfolgte mit einem Mix aus den

Hybridomaantikörpern HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705 die

Präzipitation der SI. Die Präzipitate wurden direkt im Enzymaktivitätstest eingesetzt. Die

Messung der spezifischen Enzymaktivität der SI erfolgte mit dem Gluco-quant Glucose/HK-

Kit (Roche), wobei die Menge an umgesetzter Saccharose anhand des in Nachfolgereaktionen

entstandenen NADH+H+ photometrisch bei 339 nm gemessen wurde.

Parallel wurden je 3 Platten COS-1-Zellen mit den Plasmiden phSI bzw. phSIA231T transfiziert.

Nach 48 h erfolgte die radioaktive Markierung der Zellen mit S35-Methionin. Nach 6 h

radioaktiver Markierung wurden die Zellen homogenisiert, lysiert und die SI ebenfalls mit

einem Mix aus den Hybridoma-AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705

gefällt. Die Präzipitate wurden einer SDS-PAGE unterzogen und fluorografisch untersucht.

Anhand des Fluorogramms wurde die Transfektionseffizienz von Wildtyp-SI und A231T-

Mutante berechnet, so daß die errechneten Werte an umgesetzter Glukose von Wildtyp-SI und

A231T-Mutante in Bezug zur Transfektionseffizienz ausgewertet werden konnten.

2.2.23. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie

Die Methode wurde von HIRSCHBERG et al. (1998) beschrieben. Für die Beobachtung

lebender Zellen mit dem Konfokalen Mikroskop wurden COS-1-Zellen in Zellkulturschalen

mit Deckgläschen gegeben und mit SI-YFP bzw. mit SI-YFPL702P transfiziert. 48 h nach der

Transfektion erfolgten Aufnahmen konfokaler Bilder. Als Linse diente eine 63-fache

Plasmachromatlinse. Die YFP-Anregung erfolgte mit einem Argon-Laser bei einer

Wellenlänge von 514 nm. Der Wellenbereich, in dem die Emmission der Konstrukte

gemessen wurde, lag bei 520 bis 530 nm. Die konfokalen Bilder wurden mit der Leica

Confocal Software® bearbeitet.

54

2.2.24. Organkultur und biosynthetische Markierung von Biopsien

Die Methode wurde von NAIM et al. (1987) beschrieben. Die Biopsien aus dem Dünndarm

des Patienten, aus denen die Enzyme Saccharase-Isomaltase (SI), Laktase-Phlorizin-

Hydrolase (LPH) und Dipeptidylpeptidase IV (DPPIV) präzipitiert worden sind, wurden

unverzüglich nach der Entnahme in Methionin-freies Kulturmedium unter Zusatz von 5%

Methionin-freiem FKS verbracht und 2 h bei 37°C unter Carbogen-Atmosphäre inkubiert. Die

anschließende Markierung mit S35-Methionin erfolgte nach Ausrichtung der Biopsien mit den

Darmzotten nach oben und der Basalmembran auf einem Metallgitternetz aufliegend in einer

Petrischale, so daß die Biopsien nur von der Schleimhautseite aus mit radioaktivem Medium

benetzt waren (NAIM et al. 1987). Die Markierung erfolgte ebenso unter Carbogen-

Atmosphäre. Anschließend wurden die Biopsien in HB-Puffer (25 mM Tris; 50 mM NaCl;

pH 8,0) homogenisiert und lysiert. Die Präzipitation erfolgte mit den Hybridoma-AK HBB

1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705 (SI), mAK anti-LPH (LPH) und mit mAK

anti-DPPIV (HAURI et al. 1985a) 2. Eine weitere Behandlung mit Endo H erfolgte wie bereits

in Kapitel 2.2.19 beschrieben.

2.2.25. Elektronenmikroskopie

Die Dünndarmbiopsien des Patienten, die für die Immunelektronenmikroskopie bestimmt

waren, wurden sofort nach der Fixierung in 5% Paraformaldehyd (in 50 mM HEPES) unter

Zusatz von Krykonservantien ( Polyvinylpyrrolidon und Saccharose) in flüssigem Stickstoff

gelagert. Die für die Erstellung von Ultradünnschnitten und für die Behandlung mit

Antikörpern durchgeführten Techniken wurden bereits beschrieben (ZIMMER et al. 1995).

Die aufgetauten Ultradünnschnitte wurden über 45 min mit dem entsprechenden Antikörper

und anschließend mit dem Immunogoldantikörper bei Raumtemperatur inkubiert 3

2 Die Biosynthetische Markierung der Biopsie des Patienten und die Präzipitation von SI, LPH und DPPIV ist von PD Dr.Ralf Jacob und Prof. Dr. Hassan Naim, Institut für Physiologische Chemie, Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt worden. 3 Die Anfertigung der Ultradünnschnitte, deren Behandlung mit Antikörpern und die Elektronenmikroskopischen Aufnahmen sind von Prof. Dr. K.-P. Zimmer und seinen Mitarbeitern, Kinderklinik der Universität Münster, durchgeführt worden.

55

3. Ergebnisse

Grundlagen der Versuche

3.1.1. Diagnose der CSID

Bei einem Patienten wurde aufgrund der Symptomatik nach Aufnahme von Zucker

(Bauchkrämpfe und Durchfall) eine Saccharosemalabsorption vermutet. Anhand des

durchgeführten H2-Atemtests wurde das Vorliegen einer Saccharasedefizienz weiter

bekräftigt. Zur Klärung der Ursache dieses Enzymmangels entnahm man dem Patienten

Biopsien aus dem Jejunum4, in dessen Bürstensaummembran bei gesunden Patienten

Saccharase-Isomaltase nachweisbar ist.

Neben der Saccharase-Isomaltase wurden zwei weitere Enzyme der Bürstensaummembran

des Darmes, die Laktase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) und die Dipeptidylpeptidase IV (DPPIV)

voneinender unabhängig, nacheinander aus den Biopsien präzipitiert und deren Prozessierung

untersucht. Sie dienten als Kontrollproteine, um eine generalisierte Enzymdefizienz bei

diesem Patienten auszuschließen und werden daher zuerst dargestellt.

Bereits durchgeführte Untersuchungen an Dünndarmbiopsien gesunder Menschen haben

ergeben, daß nach einer 30 min Markierung mit S35-Methionin und anschließender

Präzipitation von LPH ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 215 kDa

nachzuweisen ist. Diese Form entspricht der mannosereich glykosylierten pro-Laktase-

Phlorizin-Hydrolase (pro-LPH). Nach 4 h Markierung ist in Darmbiopsien gesunder

Menschen neben der mannosereich glykosylierten Pro-LPH eine weitere Form mit einem

Molekulargewicht von 160 kDa zu sehen, die der komplex glykosylierten Form der LPH

entspricht. Nach Behandlung mit Endo H erlangt die mannosereich glykosylierte Bande ein

Molekulargewicht von 200 kDa und die 160 kDa-Bande ein Molekulargewicht von 155 kDa

(NAIM et al. 1987).

4 Die Klinische Diagnostik und die Entnahme der Dünndarmbiopsien des Patienten ist von Prof. Dr. Jacques Schmitz, Hopital Necker Enfants Malades, Paris, durchgeführt worden.

56

Zur Untersuchung der Biosynthese und Transportkinetik der LPH wurden zwei

Dünndarmbiopsien des Patienten 30 min bzw. 4 h lang biosynthetisch mit S35-Methionin

markiert, homogenisiert, lysiert, und anschließend mit dem monoklonalen Antikörper (mAK)

anti-LPH versetzt (HAURI et al. 1985). Je ein Teil der Präzipitate wurde mit Endo H versetzt.

Als Kontrolle diente das LPH-Präzipitat eines bezüglich der Expression der LPH gesunden

Menschen (Daten nicht gezeigt).

Patient

Pulse (h)

Endo H

0,5 4

+ +- -

pro-LPHh

200

215

160155

LPHc

kDa

Abbildung 5: Präzipitation der Laktase-Phlorizin-Hydrolase aus Dünndarmbiopsien des Patienten

Je eine Biopsie aus dem Jejunum wurde über 30 min bzw. über 4 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert (Pulse), anschließend homogenisiert und mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der LPH erfolgte mit dem mAK anti-LPH. Beide Lysate (Markierung über 30 min bzw. 4 h) wurden geteilt und je eine Hälfte wurde mit Endo H behandelt. Anschließend wurden die Präzipitate einer SDS-PAGE auf 6%igen Gelen unterzogen und fluorografisch untersucht.

57

Wie aus Abbildung 5 ersichtlich, ist in der Immunpräzipitazion der LPH aus der

Patientenbiopsie nach 30 min Markierung die mannosereiche, ungespaltene Vorläuferform

(Pro-LPHh) mit einem Molekulargewicht von 215 kDa sowie nach 4 h Markierung zusätzlich

die reife, gespaltene Form der LPH (LPHc) mit einem Molekulargewicht von 160 kDa zu

sehen. Nach Endo H Behandlung erlangt die mannosereiche Form ein Molekulargewicht von

200 kDa, während die komplexe Form ein scheinbares Molekulargewicht von 155 kDa

aufweist. Dies entspricht der beschriebenen Prozessierung der Laktase-Phlorizin-Hydrolase in

humanen Darmbiopsien (NAIM et al. 1987).

Als weiteres Kontrollprotein wurde DPPIV, ebenfalls ein Glykoprotein aus der Membran von

Enterozyten, mittels Immunpräzipitation untersucht. In gesunden Menschen wird dieses

Protein gleich wie die LPH und die SI an der apikalen Bürstensaummembran von Enterozyten

exprimiert.

Bereits durchgeführte Experimente haben ergeben, daß nach einer halben Stunde Markierung

mit S35-Methionin aus humanen Darmbiopsien gesunder Menschen ein Polypeptid mit einem

Molekulargewicht von 100 kDa präzipitiert werden kann, welches nach Endo H-Behandlung

ein Molekulargewicht von 85 kDa aufweist. Nach 4 h Markierung ist neben dieser

mannosereich glykosylierten Form eine weitere Proteinbande mit einem Molekulargewicht

von 124 kDa nachweisbar, die der komplex glykosylierten Form von DPPIV (DPPIVc)

entspricht (NAIM et al. 1999).

Nachdem aus den vorliegenden Patienten-Lysaten bereits die LPH präzipitiert worden ist,

wurde nachfolgend von den gleichen Lysaten DPPIV mit dem mAK anti-DPPIV (HBB

3/153) gefällt (Abb. 6). Als Kontrolle dienten DPPIV-Präzipitate eines bezüglich der

Expression von DPPIV gesunden Menschen (Daten nicht gezeigt).

Nach 30 min Markierung ließ sich aus der Biopsie des Patienten eine Bande mit einem

Molekulargewicht von ca. 100 kDa präzipitieren, die der mannosereich glykosylierten Form

des Proteins (DPPIVh) entspricht. Auch nach 4 h Markierung wird diese mannosereich

glykosylierte Form noch exprimiert, jedoch ist zusätzlich eine weitere Proteinbande mit einem

Molekulargewicht von 124 kDa, die der komplex glykosylierten Form (DPPIVc) entspricht,

58

zu sehen5. Dies stimmt mit der beschriebenen Prozessierung von DPPIV in Darmbiopsien

gesunder Patienten überein (NAIM et al. 1999).

Nach den Ergebnissen dieser durchgeführten Vorversuche scheint die enzymatische Defizienz

bei diesem Patienten ausschließlich auf die Saccharase-Isomaltase beschränkt zu sein, da die

zur Kontrolle in den Darmbiopsien des Patienten untersuchten Bürstensaummembranenzyme

LPH und DPPIV keine beeinträchtigte Biosynthese und Prozessierung aufweisen.

5 Die Markierung der Biopsien und die Immunpräzipitationen von LPH und DPPIV erfolgten durch PD Dr.Ralf Jacob und Prof. Dr.Hassan Y. Naim, Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Abbildung 6: Präzipitation von DPPIV aus Dünndarmbiopsien des Patienten

Je eine Biopsie aus dem Jejunum wurde über 30 min bzw. über 4 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert (Pulse), homogenisiert und anschließend mit Standardlysispuffer lysiert. Die Fällung von DPPIV erfolgte mit dem mAK anti-DPPIV (HBB 3/153). Die Präzipitate wurden anschließend einer SDS-PAGE auf 6%igen Gelen unterzogen und fluorografisch untersucht.

Patient

Pulse (h) 0,5 4

DPPIVc 124 100 DPPIVh

kDa

Lauffront

59

3.1.2. Biochemischer Nachweis der SI in der Darmbiopsie des

Patienten mittels Immunpräzipitation

Bereits durchgeführte Untersuchungen an Dünndarmbiopsien von Kontrollpersonen haben

ergeben, daß nach 30 min Markierung mit S35-Methionin (Daten nicht gezeigt) und

anschließender Präzipitation der SI, ein einziges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von

210 kDa zu erkennen ist (NAIM et al. 1988b), welches der mannosereich glykosylierten

Form der pro-SI (pro-SIh) entspricht.

Dieses Polypeptid ist Endo H empfindlich, da eine Behandlung mit Endo H ein Molekül mit

einem Molekulargewicht von 185 kDa generiert (NAIM et al. 1988b). Nach biosynthetischer

Markierung über 4 h (Abb.7 Kontrollperson) liegt neben dieser mannosereich glykosylierten

Form eine weitere Bande mit einem Molekulargewicht von 245 kDa vor, die der komplex

glykosylierten Form der pro-SI (pro-SIc) entspricht. Nach Endo H Behandlung weist die pro-

SIc ein Molekulargewicht von 243 kDa auf.

Um herauszufinden, ob und wie die Prozessierung der Saccharase-Isomaltase bei diesem

Patienten abläuft, wurden die strukturellen Merkmale der pro-SI untersucht, indem die SI aus

den beiden Lysaten (Markierung über 30 min bzw. über 4 h) gefällt wurde.

Als Kontrolle dienten Präzipitate der SI eines bezüglich der Expression von SI gesunden

Menschen (Abb.7 Kontrollperson).

Zur Fällung der SI wurde ein Mix aus den Hybridoma-Antikörpern HBB 1/691, HBB 2/614,

HBB 2/219 und HBB 3/705 benutzt. Die Präzipitate (Markierung über 30 min und

Markierung über 4 h) wurden anschließend aufgeteilt und je ein Teil wurde mit Endo H

versetzt (Abb.7 Patient).

In der Patienten- wie auch in der Kontrollprobe erkennt man nach 30 min biosynthetischer

Markierung ein einziges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 210 kDa, welches nach

Endo H Behandlung ein Molekulargewicht von 185 kDa aufweist. Nach 4 h Markierung ist

die SI beim gesunden Menschen zu einem großen Teil komplex glykosyliert worden (Abb.7

Kontrollperson), erkennbar an der zweiten Bande mit einem Molekulargewicht von 245 kDa,

die nach Zugabe von Endo H noch ein Molekulargewicht von 243 kDa aufweist.

60

Abbildung 7: Präzipitate der SI des Patienten verglichen mit denen einer Kontrollperson

Je eine Biopsie aus dem Jejunum des Patienten wurde über 30 min bzw. über 4 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert (Pulse), homogenisiert und anschließend mit Standardlysispuffer lysiert. Eine Biopsie aus dem Jejunum einer Kontrollperson wurde über 4 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert (Pulse), homogenisiert und anschließend mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit einem Mix aus den Hybridoma-AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Beide Lysate des Patienten und das Lysat der Kontrollperson wurden geteilt und je eine Hälfte wurde mit Endo H behandelt. Anschließend wurden die Präzipitate einer SDS-PAGE auf 6%igen Gelen unterzogen und fluorografisch untersucht. Beim Patienten hingegen liegt der größte Anteil der SI nach 4 h immer noch mannosereich

glykosyliert vor, nur ein geringer Teil der SI ist komplex glykosyliert worden (Pfeil). Daraus

kann gefolgert werden kann, daß die SI bei diesem Patienten zwar korrekt exprimiert aber

nicht korrekt prozessiert wird6.

Die klinisch diagnostizierte Saccharase-Isomaltase-Defizienz des Patienten läßt sich somit auf

molekularer Ebene durch die defekte Prozessierung des Proteins nachvollziehen.

6 Die Präzipitation der SI aus den Biopsien des Patienten ist von PD Dr.Ralf Jacob und Prof. Dr. Hassan Y. Naim, Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt worden.

Pulse (h)

Patient

Endo H

Kontrollperson

0,5 4 4

- + - + -

+

SIh SIc 245

185 210

61

3.1.3. Elektronenmikroskopischer Nachweis der SI, von LPH und

von DPPIV in einer Darmbiopsie

Nachdem biochemisch festgestellt wurde, daß die SI des Patienten exprimiert, aber nicht

korrekt prozessiert wird, wurde die subzelluläre Lokalisation des Proteins mittels

Elektronenmikroskopie untersucht7.

Eine der Darmbiopsien des Patienten wurde nach Fixierung mit Paraformaldehyd und Zusatz

von Kryokonservantien in flüssigem Stickstoff gelagert. Ultradünnschnitte wurden im Cryo-

Ultramikrotom durchgeführt, anschließend mit einem Mix aus den Antikörpern AK HBB

1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705 behandelt und mit einem Protein A-Gold

Antikörper versetzt. Einer Kontrollperson wurde entsprechend Gewebe aus dem Bereich des

Jejunum entnommen und analog behandelt. Während in der Kontrollbiopsie die meisten

Immunogoldpartikel im Bereich der apikalen Bürstensaummembran gefunden werden

konnten (Abb. 10), war in der Biopsie des untersuchten Patienten eine Anreicherung der

Immunogoldpartikel sowohl im Lumen des ER als auch zu einem geringeren Anteil im

Lumen des Golgiapparates nachweisbar (Abb. 8 und 9). Einzelne wenige Goldpartikel

konnten zudem im Bereich der apikalen Membran dargestellt werden (Abb. 9). Dabei scheint

der Anteil an aus dem ER transportiertem Protein erheblich vom Zellinneren zur apikalen

Membran abzunehmen.

Als weitere Kontrolle wurden LPH und DPPIV elektronenmikroskopisch nachgewiesen. Die

Behandlung der Ultradünnschnitte erfolgte zum Nachweis der LPH mit dem mAK anti-LPH

(HAURI et al. 1985) und zum Nachweis von DPPIV mit anti-DPPIV (HBB 3/153).

Elektronenmikroskopisch konnte für beide Proteine keine Veränderung im Transport

nachgewiesen werden8, so daß die biochemischen und die elektronenmikroskopischen Daten

darauf hindeuten, daß der Defekt im Transport auf die SI beschränkt ist.

7 Die Probenvorbereitung und die Elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden von Prof. Dr. K.-P Zimmer und seinen Mitarbeitern, Kinderklinik der Universität Münster, durchgeführt. 8 Laut persönlicher Mitteilung von Prof. Dr. K.-P. Zimmer, Münster am 7.9.2001

62

Abbildung 8: Elektronenmikroskopische Aufnahme der SI in Enterozyten des Patienten, Ausschnitt in der Nähe des Zellkerns.

Die SI wurde in Ultradünnschnitten von Dünndarmbiopsien des Patienten in zwei unterschiedlichen Enterozyten lokalisiert (A und B), die mit einem polyklonalen SI-Antikörper und mit 12 nm-Ziegen-anti-Kaninchen-Immunogoldpartikel markiert worden sind. Im zellkernnahen Bereich der Patienten-Biopsie ist im Vergleich zu einer Kontrollmarkierung der SI an Enterozyten eines gesunden Patienten eine deutlichere Markierung durch den SI-Antikörper zu sehen (Pfeile). Zellkern, K; Endoplasmatisches Retikulum, ER; M, Mitochondrium. Maßstrich: 0,5µm.

ER

M

K

ER

ER

K

63

Abbildung 9: Elektronenmikroskopische Aufnahme der SI in Enterozyten des Patienten, Ausschnitt in der Nähe der Mikrovilli- k membran

Die SI wurde in Ultradünnschnitten von Dünndarmbiopsien des Patienten in zwei verschiedenen Enterozyten lokalisiert (C und D), die mit einem polyklonalen SI-Antikörper und mit 12 nm-Ziegen-anti-Kaninchen-Immunogoldpartikel markiert worden sind (Pfeile). An der Bürstensaummembran der Patienten-Biopsie ist im Vergleich zu einer Kontrollmarkierung der SI an Enterozyten eines gesunden Patienten eine schwächere Markierung durch den SI-Antikörper zu sehen. Mi, Mikrovilli; Lu, Lumen; G, Golgi; M, Mitochondrium. Maßstrich: 0,5µm.

Mi

Mi

Mi Mi

Lu

Lu

G

MG

64

Abbildung 10: Elektronenmikroskopische Aufnahme der SI aus Enterozyten einer Kontrollperson

Die SI wurde in Ultradünnschnitten von Dünndarmbiopsien der Kontrollperson lokalisiert, die mit einem polyklonalen SI-Antikörper und mit 12 nm-Ziegen-anti-Kaninchen-Immunogoldpartikel markiert worden sind (Pfeile). An der apikalen Bürstensaummembran (E) ist die starke Anreicherung der SI deutlich zu sehen. Hingegen sind im Bereich des Zellinneren (F) nur wenige SI-Moleküle nachweisbar. Mi, Mikrovilli; Lu, Lumen; BL, basolaterale Membran; G, Golgi; M, Mitochondrium. Maßstrich: 0,5µm. Abb. aus JACOB et al. (2000) modifiziert.

Mi

Mi

Lu

ER

G

ER

G

G

BL

65

Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung der Patienten-SI

3.1.4. Nachweis von Punktmutationen in der cDNA des Patienten

Da die Expression der pro-SI im Patientengewebe zwar nicht beeinträchtigt war, jedoch durch

die biochemische Untersuchung eine fehlerhafte Prozessierung festgestellt worden ist, liegt

vermutlich eine Mutation oder Deletion im kodierenden Bereich des Gens vor, die für diesen

Phänotypen verantwortlich ist.

Um mögliche Unterschiede zwischen der cDNA des Patienten und dem Wildtyp-SI-Gen

herauszufinden, wurden sieben überlappende cDNA Abschnitte (OUWENDIJK et al. 1996)

der Patienten-SI jeweils mindestens zweimal durchsequenziert. Die Klonierungen in den

pCR-2.1 Vektor erfolgten mit Patienten cDNAs aus unabhängigen Reaktionsansätzen und

wurden in unabhängigen Reaktionen amplifiziert. Die Sequenzierung erfolgte ausgehend von

den flankierenden M 13 universe und reverse Primerbindungsstellen im Vektor.

Nach mehrmaligem Sequenzieren wurden 3 Mutationen der Patienten-cDNA im Vergleich

zum Wildtyp-SI-Gen (CHANTRET et al. 1992) bestätigt:

In der Membranankerdomäne ergab ein G zu T Austausch an Nukleotid 105 einen Austausch

von Valin zu Phenylalanin (V15F). Dieser Austausch wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht

charakterisiert, da angenommen wurde, daß diese Mutation ein zytosolisch lokalisiertes

Protein bedingen würde, weil der Membrananker der SI gleichzeitig auch als Signalpeptid

fungiert.

In der Saccharase-Domäne führte ein C zu G Austausch an Nukleotid 3669 zu einem

Aminosäureaustausch von Glutamin zu Glutaminsäure an Position 1203 (Q1203E). Diese

Q1203E Mutation scheint polymorph vorzukommen (MOOLENAAR u. NAIM 1995).

Eine A/T Mutation an Nukleotid 705 im Bereich der Isomaltase führt zu einem Austausch von

Alanin zu Threonin an Position 231 der pro-SI (A231T). Diese 3 Mutationen wurden in

unabhängigen Polymerase-Ketten-Reaktionen mit cDNA aus unterschiedlichen Reaktionen

durch Sequenzierung nachgewiesen.

66

ZT MA/SS I S

Zwei Mutationen konnten nur einmal nachgewiesen werden. Diese erschienen aufgrund des

Aminosäureaustauschs (Leucin zu Prolin) interessant, da Proline häufig aufgrund ihrer

Struktur in der Lage sind, a-Helices zu durchbrechen und über die Änderung der Sekundär-

und Tertiärstruktur zu Faltungsdefekten zu führen.

Neben der Art des Aminosäureaustausches ist auch ihr relativer Abstand interessant, da sie

nur in einem Abstand von 82 AS auseinanderliegen, so daß untersucht werden sollte, ob

womöglich jede der beiden Mutationen zu einer beeinträchtigten Faltung führen und damit ein

wichtiger Bereich für die Faltung der SI (AS 620 bis AS 702) identifiziert werden kann.

Daher wird im Rahmen dieser Arbeit von den nachgewiesenen Punktmutationen

ausschließlich auf die Charakterisierung der A231T-Mutante und auf die beiden Prolin-

Mutanten L620P und L720P eingegangen.

Abbildung 11: Die relative Lage der in der Patienten-cDNA bestätigten Mutationen

Dargestellt ist die relative Lage der Mutationen in der SI des Patienten, sowie die schematische Darstellung der SI: Zytoplasmatischen Domäne (ZT), Membrananker (MA), Signalsequenz (SS), Isomaltase (I) und Saccharase (S).

C N

A231T

Pro-SI (1827 AS)

V15F Q1203E

67

3.1.5. Generierung von verschiedenen Mutanten der SI

Um festzustellen, welche der in der Patienten cDNA nachgewiesenen Mutationen für den

Transportstopp der SI im ER verantwortlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit die

Mutation A231T über Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese in das cDNA-Konstrukt der SI

eingefügt. Für die biochemischen Experimente wurde das Plasmid phSI (MOOLENAAR et

al. 1997), das die cDNA der Saccharase-Isomaltase trägt, verwendet. Weiterhin wurden die

Mutationen L620P und L702P in das Wildtyp-SI-Gen eingefügt. Es entstanden die mutierten

Plasmide phSIA231T, phSIL620P und phSIL702P. Für die Durchführung der konfokalen

Mikroskopie wurde ein Plasmid verwendet, welches das Gen für das Gelb Fluoreszierende

Protein trägt. Dieses nach Anregung durch einen Argonlaser bei 514 nm Gelb Fluoreszierende

Protein kann somit als Reporterprotein dienen. Durch die Herstellung des Plasmids SI-YFP

entstand ein leuchtendes Fusionsprotein (JACOB u. NAIM 2001a), mit dem in

Echtzeituntersuchungen die Lokalisation und der Transport der SI im heterologen Zellsystem

untersucht werden konnte. Mittels Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese wurde das Plasmid

SI-YFPL702P hergestellt, welches verwendet wurde, um konfokale Bilder der Mutante L702P

aufzunehmen.

Die generierten Plasmide tragen teilweise neben der Mutation, die zu einer Änderung der

gewünschten Aminosäure geführt hat, auch eine Mutation für eine zusätzliche

Restriktionsschnittstelle, über die die erfolgte Mutagenese überprüft werden konnte. Diese

zusätzliche Restriktionsschnittstelle wurde so eingefügt, daß die Mutation nicht zu einer

weiteren Änderung einer Aminosäure führen konnte. Die eingefügte Mutation wurde durch

Sequenzierung des Plasmids bestätigt.

68

Folgende Konstrukte wurden generiert:

…CAG ATC TCA GCC CGT… Wildtyp-SI

…Gln Ile Ser Ala Arg …

AS 210 211 212 213 214

…CAG ATC TCA ACC CGT … mutierte SI

…Gln Ile Ser Thr Arg …

5’ 3’

ZT MA/SS I S

pro-SI (1827AS)

Abbildung 12: Alanin zu Threonin Austausch im phSI-Konstrukt der A231T Mutante

Dargestellt ist der die Mutation enthaltende Ausschnitt der cDNA-Sequenz von Wildtyp-SI und A231T Mutante und die relative Lage der Mutation im Gen (A), sowie die schematische Darstellung der SI (B) Zytoplasmatischen Domäne (ZT), Membrananker (MA), Signalsequenz (SS), Isomaltase (I) und Saccharase (S) mit der relativen Lage der Mutation (A231T) im Protein.

C N

A231T

SI-cDNA (5484 bp)

Pro-SI (1827 AS)

AS 228 229 230 231 232 A

B

69

…GGA ATG CTG GAG TTC… Wildtyp-SI

…Gly Met Leu Glu Phe…

AS 618 619 620 621 622

…GGA ATG CCG GAG TTC … mutierte SI

…Gly Met Pro Glu Phe …

5’ 3’

ZT MA/SS I S

Abbildung 13: Leucin zu Prolin Austausch im phSI-Konstrukt der L620P-Mutante

Dargestellt ist der die Mutation enthaltende Ausschnitt der cDNA-Sequenz von Wildtyp-SI und L620P-Mutante und die relative Lage der Mutation im Gen (A), sowie die schematische Darstellung der SI (B) Zytoplasmatischen Domäne (ZT), Membrananker (MA), Signalsequenz (SS), Isomaltase (I) und Saccharase (S) mit der relativen Lage der Mutation (L620P) im Protein.

C N

L620P

SI-cDNA (5484 bp)

Pro-SI (1827 AS)

A

B

70

…TAC ACT CTG TTT TAT …Wildtyp-SI

…Tyr Thr Leu Phe Tyr …

AS 700 701 702 703 704

…GGA ATG CCG GAG TTC … mutierte SI

… Tyr Thr Pro Phe Tyr …

5’ 3’

ZT MA/SS I S

Abbildung 14: Leucin zu Prolin Austausch der AS 702 im phSI-Konstrukt und im SI-YFP-Konstrukt

Dargestellt ist der die Mutation enthaltende Ausschnitt der cDNA-Sequenz von Wildtyp-SI und L702P Mutante und die relative Lage der Mutation im Gen (A), sowie die schematische Darstellung der SI (B) Zytoplasmatischen Domäne (ZT), Membrananker (MA), Signalsequenz (SS), Isomaltase (I) und Saccharase (S) mit der relativen Lage der Mutation (L702P) im Protein.

C N

L702P

SI-cDNA 5484 bp

A

B

Pro-SI (1827 AS)

71

3.1.6. Biochemische Charakterisierung der A231T Mutante in verschiedenen

Zelllinien

Um nun herauszufinden, ob die in der cDNA des Patienten gefundene Mutation, die zu dem

A231T Austausch geführt hat, für die stark eingeschränkte Prozessierung der SI zur

Zelloberfläche verantwortlich ist, wurde die generierte Mutante in verschiedenen Zelllinien

transient transfiziert. Für die Analyse in COS-1 Zellen, wurden 30% konfluente Schalen

mittels DEAE-Dextran-Methode transfiziert. Dazu wurden die Plasmide phSI bzw. phSIA231T

eingesetzt. Die biosynthetische Markierung mit S35-Methionin erfolgte 48 h nach der

Transfektion.

Abbildung 15: Pulse-Chase-Versuch in COS-1-Zellen (Vergleich des Transports zwischen A231T- Mutante und Wildtyp-SI)

COS-1-Zellen, die mit den Plasmiden phSI bzw. phSIA231T transfiziert worden waren, wurden über 1 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert und nach 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h und 4 h Chase homogenisiert und mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit einem Mix aus den Antikörpern HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Alle Lysate wurden mit Endo H behandelt, damit die Banden der SI deutlicher zu differenzieren waren. Die Elektrophorese erfolgte in einem 6%igen SDS-Gel, das anschließend fluorografisch analysiert wurde.

Pulse (h)

Chase (h)

Endo H (µl)

Wildtyp-SI A231T Mutante

0 0,5 1 2 4 0 0,5 1 2 4

0,5 0,5

SIc

SIh

243

185

1 1

kDa

72

Für das vorliegende Experiment erfolgte die Markierung über 1 h. Anschließend wurden

alle Schalen mit normalem Zellkulturmedium inkubiert und die Zellen nach 0 min; 30 min;

1 h; 2 h und 4 h geerntet (Pulse-Chase-Experiment). Die Zellen wurden homogenisiert und

lysiert. Die Immunpräzipitation der SI erfolgte aus den Lysaten mit den AK HBB 1/691,

HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Anschließend wurden alle Proben mit Endo H

behandelt, damit die Banden deutlicher differenziert werden konnten. Die Auftrennung der

Proben erfolgte mittels SDS-PAGE. Diese wurden anschließend fluorografisch untersucht.

Ein Vergleich zwischen Wildtyp-SI und A231T Mutante zeigt, daß auch die A231T

Mutante zu jedem Zeitpunkt eine komplex glykosylierte Bande aufweist und auch ein

Unterschied zwischen den Anteilen an mannosereich zu komplex glykosyliertem Protein

zwischen Wildtyp-SI und A231T Mutante nicht erkennbar ist.

Um durch die Wahl der Zelllinie möglicherweise auftretende Effekte auf das

Transportverhalten der Proteine auszuschließen, wurde das Experiment analog in einer

anderen Zelllinie wiederholt, in der Proteine nicht wie in COS-1-Zellen überexprimiert

werden. Die Expression des Proteins in CHO-Zellen (Abb. 16), einer epithelialen, aber

unpolaren Zelllinie, erfolgte ebenfalls nach transienter Transfektion der Zellen mittels DEAE-

Dextran Methode. Analog zu dem Expriment in COS-1-Zellen wurden die Zellen mit den

Plasmiden phSI bzw. phSIA231T transfiziert. 48 h nach erfolgter Transfektion wurden die

Zellen radioaktiv mit S35-Methionin über 1 h markiert. Anschließend wurden alle Schalen mit

normalem Zellkulturmedium inkubiert und die Zellen nach 0 h; 0,5 h; 1 h; 2 h und 4 h

geerntet. Danach wurden die Zellen homogenisiert und lysiert. Nach Immunpräzipitation der

SI aus den Lysaten mit den AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705, wurden

die Proben mit Endo H behandelt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend

fluorografisch untersucht.

Auch bei dieser Zelllinie konnte kein Effekt der eingefügten Mutation auf das

Transportverhalten der SI nachgewiesen werden (Abb. 15), da zu jedem gewählten Zeitpunkt

auch die A231T Mutante eine komplex glykosylierte Bande aufwies und somit das

Transportverhalten von Wildtyp-SI und A231T-Mutante nicht unterschiedlich war.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß das Transportverhalten der A231T-Mutante weder

in COS-1-Zellen noch in CHO-Zellen Unterschiede zum Transportverhalten der Wildtyp-SI

aufzeigt.

73

Abbildung 16: Pulse -Chase-Versuch in CHO-Zellen (Vergleich des Transports zwischen Wildtyp-SI und A231T-Mutante)

CHO-Zellen, die mit den Plasmiden phSI bzw. phSI A231T transfiziert worden waren, wurden über 1 Stunde mit S35-Methionin biosynthetisch markiert und nach 0 min, 30 min, 1 Stunde, 2 Stunden und 4 Stunden Chase mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit einem Mix aus den Antikörpern AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Alle Lysate wurden mit Endo H behandelt. Die Elektrophorese erfolgte in einem 6%igen SDS-Gel. Auch in CHO-Zellen ist bereits ab dem Zeitpunkt 0 h Chase bei der A231T-Mutante eine komplex glykosylierte Bande zu sehen.

Chase (h) 0 0,5 1 2 4 0 0,5 1 2 4

Pulse (h) 1 1

Endo H + +

Wildtyp-SI A231T Mutante

SIc

SIh

243

185

kDa

74

3.1.7. Analyse von möglichen Faltungsdefekten mittels Trypsin- Behandlung

b bei der A231T Mutante

Zum Nachweis von eingetretenen Faltungsveränderungen durch Einfügen einer Mutation,

kann unter anderem untersucht werden, ob das mutierte Protein im Vergleich zum Wildtyp-

Protein sensitiver auf die Behandlung mit einer geeigneten Protease reagiert oder nicht. Im

Falle der SI kann diese Behandlung mit Trypsin erfolgen, einer Protease, der das Protein auch

unter physiologischen Bedingungen im Darmlumen ausgesetzt ist und die zu einer Spaltung

der SI zwischen AS Ile 1007 und Arg 1008 führt (NAIM et al. 1988b). Im Darmlumen

bleiben die beiden Untereinheiten Saccharase und Isomaltase über ionische

Wechselwirkungen miteinander verbunden (HAURI et al. 1985). Im Experiment unterwirft

man das Protein einer definierten Trypsineinwirkung und untersucht das Abbauverhalten zu

unterschiedlichen Zeitpunkten. Dabei erklärt man eine stärkere Wirkung der Protease bei

einem mutierten Protein damit, daß die Mutation durch Faltungsänderung potentielle

Proteasespaltungsstellen im Protein freilegt.

Die Durchführung dieses Experiments erfolgte nach MOOLENAAR et al. (1997). Nach

transienter Transfektion von COS-1 Zellen mit den Plasmiden phSI bzw. phSIA231T nach der

DEAE-Dextran Methode, erfolgte 48 h später die kontinuierliche Markierung über 6 h mit

S35-Methionin. Aus dem Zelllysat erfolgte die Präzipitation der SI mit einem Mix aus den

Hybridomaantikörpern HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705 . Die Reaktion

mit Trypsin ( 30 µl einer 500 µg Trypsin/1ml dH2O Lösung) erfolgte über 0 min, 5 min, 30

min, 90 min und 180 min und wurde durch die Zugabe von 10 µl Trypsin-Inhibitor-Lösung (2

mg Trypsin-Inhibitor/10 µl PBS) abgestoppt.

Anschließend wurden die Präzipitate des Wildtyp-Proteins und der Mutante A231T im SDS-

PAGE aufgetrennt (Abb. 17).

Die Stärke des Einflusses von Trypsin auf Wildtyp-SI und A231T-Mutante wurde

anschließend analysiert. Dabei zeigte sich, daß das Verhalten von Wildtyp-Protein und

A231T-Mutante gegenüber Trypsin nicht unterschiedlich ist, da zu jedem der gewählten

Zeitpunkte die Menge an in Saccharase und Isomaltase gespaltenem Protein gleich ist.

75

Abbildung 17: Trypsin-Sensitivitäts-Versuch in COS-1-Zellen (Vergleich des Transports zwischen

A213T-Mutante und Wildtyp-SI)

COS-1-Zellen, die mit den Plasmiden phSIA231T bzw. phSI transfiziert worden waren, wurden über 6 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert, anschließend homogenisiert und mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit einem Mix aus den Antikörpern AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Die Präzipitate wurden mit 30 µl Trypsin (500 µg Trypsin/1 ml dH2O über 0 min, 5 min, 30 min, 90 min und über 180 min) inkubiert. Die Reaktion wurde über die Zugabe von 10 µl Trypsin-Inhibitor (2 mg Trypsininhibitor/10 µl PBS) gestoppt. Die Elektrophorese erfolgte in einem 6%igen SDS-Gel. Anschließend wurde das Gel fluorographisch untersucht. Das Verhalten von Wildtyp-Protein und A231T-Mutante gegenüber Trypsin ist nicht unterschiedlich, da zu jedem der gewählten Zeitpunkte die Menge an gebildeten Untereinheiten (Saccharase und Isomaltase) im Vergleich zwischen A231T-Mutante und Wildtyp-SI gleich ist.

Wildtyp-SI A231T- Mutante

Pulse (h)

Trypsin (min) kDa

6 6

0 5 30 90 180 0 5 30 90 180

SIc

SIh

S und I

245 210

76

3.1.8. Untersuchung der Enzymatischen Aktivität der Mutante A231T

im Vergleich zur Wildtyp-SI

Eine weitere Methode, um Faltungsänderungen bei katalytisch aktiven Peptiden

nachzuweisen, besteht in der Messung ihrer Enzymaktivität. Um die Aktivität der Saccharase-

Isomaltase zwischen Wildtyp-Protein und mutiertem Protein zu vergleichen, wurden im

Emzymaktivitätstest die Versuchsbedingungen so gewählt, daß der SI als Substrat Saccharose

angeboten und nach 1 h Inkubation bei 37°C die Extinktion des in Nachfolgereaktionen

entstandenen NADH+H+ photometrisch bei 339 nm gemessen wurde. Dazu wurden Wildtyp-

SI und die Mutante A231T jeweils in 15 Schalen mit COS-1-Zellen transfiziert. Nach 48 h

wurden die Zellen homogenisiert und lysiert. Aus den vereinigten Lysaten von je 15 Platten

erfolgte mit einem Mix aus den Hybridomaantikörpern HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219

und HBB 3/705 die Präzipitation der SI. Die Präzipitate wurden direkt im Enzymaktivitätstest

eingesetzt.

Von dem in 15 COS-1-Schalen exprimierten Wildtyp-SI-Protein wurden 1,83 mmol

Saccharose und von der A231T Mutante 1,52 mmol Saccharose umgesetzt (Mittelwerte aus

drei Versuchen). Dies entsprach einer enzymatischen Aktivität von 30,5 U bzw. 25,33 U.

Parallel dazu wurden radioaktiv markierte Präzipitate der Wildtyp-SI und der A231T-Mutante

einer SDS-PAGE unterzogen. Anhand des Fluorogramms wurde die Transfektionseffizienz

von Wildtyp-SI und A231T-Mutante berechnet, so daß die errechneten Werte an umgesetzter

Saccharose von Wildtyp-SI und A231T-Mutante in Bezug zur Transfektionseffizienz

ausgewertet werden konnte. Danach konnte kein Unterschied zwischen den umgesetzten

Mengen zwischen Wildtyp-Protein und A231T-Mutante nachgewiesen werden. Das bedeutet,

daß die Mutante A231T im Vergleich zu der Wildtyp-SI keinen Unterschied in der

Enzymaktivität aufweist.

77

3.1.9. Vergleichende Untersuchung zur Stabilität zwischen

A231T-Mutante und Wildtyp-SI nach 10 Stunden Chase

Um zu untersuchen, ob die Mutante auch nach längeren Chase-Zeiten (siehe Pulse-Chase-

Versuche in COS-1-Zellen und in CHO-Zellen) nachweisbar ist und ob dabei ein Unterschied

in der Stabilität zwischen Wildtyp-Protein und A231T Mutante beobachtet werden kann,

wurden COS-1-Zellen 48 h nach Transfektion mit den Plasmiden phSIA231T bzw. phSI über

1 h mit S35-Methionin markiert (Pulse). Anschließend wurden sie mit nicht-radioaktivem

Medium inkubiert. Nach 0 min, 6 h und 10 h Chase wurden die Zellen geerntet,

homogenisiert und mit Standardlysispuffer lysiert.

Abbildung 18: Immunpräzipitation der SI aus COS-1-Zellen nach 1 Stunde, 6 Stunden und 10 Stunden Chase (Vergleich des Transports zwischen A231T-Mutante und Wildtyp-SI)

COS-1-Zellen, die mit den Plasmiden phSI bzw. phSIA231T transfiziert worden waren, wurden über 1 Stunde mit S35-Methionin biosynthetisch markiert. Der Chase erfolgte über 0 min, 6 Stunden bzw. 10 Stunden. Anschließend wurden die Zellen homogenisiert und mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit einem Mix aus den Antikörpern AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Alle Lysate wurden mit Endo H behandelt. Die Elektrophorese erfolgte in einem 6%igen SDS-Gel.

A231T Mutante Wildtyp-SI

Pulse (h)

Chase (h) 0 6 10 0 6 10

1 1

SIc

SIh

243 185

kDa

78

Die Immunpräzipitation der SI erfolgte aus den Lysaten der COS-1-Zellen mit den

Hybridoma-AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Die Präzipitate wurden

alle mit Endo H behandelt, damit die Banden der SI besser zu differenzieren waren.

Anschließend wurden sie mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Analyse der Proteinbanden im

Fluorogramm zeigt bei beiden Proteinen nach 0 min, 6 h, und 10 h Chase die gleiche

Bandenstärke bei Wildtyp-SI und A231T-Mutante. Auch gibt es zu den Zeitpunkten 0 min,

6 h, und 10 h Chase keinen Unterschied zwischen dem Glykosylierungsmuster von Wildtyp-

SI und A231T-Mutante.

Demnach liegt zumindestens nach 10 h Chase kein Unterschied in der Stabilität zwischen der

A231T-Mutante und der Wildtyp-SI vor.

79

3.1.10. in silico - Untersuchung zur Auswirkung der verschiedenen

Aminosäureaustausche auf die postulierte Sekundärstruktur

Eine Reihe von Eigenschaften von Peptidsequenzen können aus der

Aminosäurezusammensetzung und –abfolge angenähert werden. Jedoch entstehen

Strukturvorhersagen aus Algorithmen, die die Eigenschaft eines nativen Proteins nur

unvollständig wiederspiegeln, da Wechselwirkungen zwischen Molekülen gefalteter

Peptidketten zu Abweichungen vorhergesagter Proteineigenschaften führen können. Dennoch

eignen sich solche Modelle, um in vitro erzeugte Daten zu unterstützen.

In a-Helices wurde eine gerichtete Anordnung hydrophober und hydrophiler Bereiche der

Primärstruktur beobachtet. Über die Analyse der Verteilung dieser Bereiche in einem

gegebenen Polypeptid können erste Vorhersagen über das Vorkommen der a-Helix als

Sekundärstruktur gemacht werden. Dazu wurden den Aminosäuren (AS) aufgrund ihrer

physiko-chemischen Eigenschaften numerische Werte zugeordnet und die AS in

verschiedenen Stufen eingeteilt. Hydrophobizitätsplots zeigen einen solchen

Hydrophobizitätsindex einer Aminosäure als Funktion ihrer Position in der Polypeptidkette.

Über den Vergleich solcher Hydrophobizitätsplots zwischen den relevanten Bereichen von

Wildtyp-SI und mutagenisierter SI wurde versucht, eine mögliche Änderung der

Eigenschaften der Primärstruktur aufzudecken. Stark hydrophobe Regionen sind häufig in ß-

Faltblatt-Strukturen zu finden, so daß eine geringere Hydrophobizität auf einen Verlust einer

ß-Faltblatt-Struktur deuten könnte. Jeder Aminosäure ist ein Hydrophobizitätswert (KYTE u.

DOOLITTLE 1982) zugeordnet. Diese wurden über ein Fenster von 11 AS gemittelt und nach

dem Algorithmus von Kyte und Doolittle aufgetragen. Im dem gezeigten

Hydrophobizitätsplot werden Ausschnitte (jeweils 11 AS) aus den Regionen, die

ausgetauschte AS enthalten, dargestellt.

Eine Änderung der Hydrophobizität durch den betreffenden Aminosäureaustausch ist am

deutlichsten für die beiden Mutanten L620P und L702P vorhergesagt worden (Abb. 19 B), da

hier die angegebenen Regionen durch die eingefügte AS Prolin deutlich hydrophiler werden.

80

Abbildung 19: Vergleich der Hydrophobizitätsprofile zwischen Wildtyp-SI und A231T Mutante (A) bzw. zwischen Wildtyp-SI und L620P Mutante (B)

Jeder Aminosäure wurde ein Hydrophobizitätswert zugeordnet. Diese wurden über ein Fenster von 11 AS gemittelt und nach dem Algorithmus von Kyte und Doolittle aufgetragen. Dargestellt sind Ausschnitte (jeweils 11 AS) aus den Regionen, die eine ausgetauschte AS enthalten. Die AS sind im Einbuchstabencode aufgeführt, die mutierte AS ist mit einem Kästchen umgeben.

0

4.5

-4.5

> Y L Q I S T R L P S D *

0

4.5

-4.5

> Y L Q I S A R L P S D *

B

0

4.5

-4.5

> S I T G M P E F S L F *

0

4.5

-4.5

> S I T G M L E F S L F *

Hydrophobizität

Hydrophobizität

Hydrophilizität

Hydrophilizität

Hydrophilizität

Hydrophilizität

A

Hydrophobizität

Hydrophobizität

81

Abbildung 20: Vergleich der Hydrophobizitätsprofile zwischen Wildtyp-SI und L702P Mutante

Jeder Hydrophobizitätswert, der einer Aminosäure (AS) zugeordnet ist, wurde über ein Fenster von 11 AS gemittelt und nach dem Algorithmus von Kyte und Doolittle aufgetragen. Dargestellt sind Ausschnitte (jeweils 11 AS) aus den Regionen, die eine ausgetauschte AS enthalten. Die AS sind im Einbuchstabencode aufgeführt, die mutierte AS ist mit einem Kästchen umgeben.

Um Vorhersagen über die Sekundärstruktur der relevanten Proteinabschnitten zu erhalten,

wurden Peptidsequenzen, die im Bereich der mutagenisierten Stelle lagen, an Predict Protein

geschickt (http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html). Dieser Service

führt eine Sequenzanalyse des Proteins durch und generiert Vorhersagen über die

Sekundärstruktur des angegebenen Proteins.

Das angewendete Verfahren zur Analyse der Sekundärstruktur von Proteinen (PHDsec)

basiert auf einem neuronalen Netzwerk, so daß die Vorhersage der Sekundärstruktur unter

idealen Bedingungen über 70 % Genauigkeit aufweist (ROST u. SANDER 2000) und somit

höher als bei den bisher angewandten Methoden liegt. Neben der Vorhersage von

Wahrscheinlichkeiten für das Vorkommen von Helix = H, Faltblatt = E und

Hydrophilizität

0

4.5

-4.5

> P F L Y T P F Y K A H *

0

4.5

-4.5

> P F L Y T L F Y K A H *

Hydrophobizität

Hydrophilizität

Hydrophobizität

82

Loop (Schleife) = L wird auch eine Klassifizierung der Peptidsequenz in „nur a-Helix“, „nur

ß-Faltblatt“, „a-Helix und ß-Faltblatt“ und „gemischt“ vorgenommen. Die Einteilung erfolgt

nach den für eine bestimmte Sequenz vorhergesagten Wahrscheinlichkeiten für das

Vorkommen von Helix = H, Faltblatt = E und Loop (Schleife) =L (Tabelle 13).

Sekundärstruktur Wahrscheinlichkeit

„nur a-Helix“ %H>45% und %E<5%

„nur ß-Faltblatt“ %H<5% und %E >45%

„a-Helix und ß-Faltblatt“ %H>30% und %E>20%

„gemischt“ Alle anderen Kombinationen

Tabelle 13: Klassifizierungsschema für die Sekundärstruktur von Peptidsequenzen

Die Einteilung erfolgt nach den für eine bestimmte Sequenz vorhergesagten Wahrscheinlichkeiten für das Vorkommen von Helix = H, Faltblatt = E und Loop (Schleife) = L (ROST u. SANDER 1994).

PHDsec, die Vorhersage der Sekundärstruktur ergab folgende Klassifizierung der

eingeschickten Peptidsequenzen von SI-Wildtyp-Protein und A231T Mutante:

SI-Wildtyp-Sequenz A231T Sequenz

Eingeschickte

Peptidsequenz

SIGPLVYSDQYLQISARLP SDYIYGIGEQV

SIGPLVYSDQYLQISTRLP SDYIYGIGEQV

Wahrscheinlichkeiten

für Helix = H,

Faltblatt = E und

Loop = L

%H: 10,0

%E: 43,3

%L: 46,7

%H: 0,0

%E: 40,0

%L: 60,0

Gesamtklassifizierung „gemischt“ „gemischt“

Tabelle 14: Vorhersage der einzelnen Wahrscheinlichkeiten für Helix=H, Faltblatt=E und Loop=L und Gesamtklassifizierung der eingeschickten Peptidsequenzen von SI-Wildtyp-Protein und A231T Sequenz.

In der eingeschickten Peptidsequenz ist die mutierte AS hervorgehoben.

83

Für die angegebene Sequenz der A231T Mutante wurde eine höhere Wahrscheinlichkeit für

das Vorkommen einer ß-Faltblatt-Struktur berechnet als für das Wildtyp-Protein. Die

Gesamtklassifizierung ergab für beide Abschnitte „gemischt“.

Zusätzlich zu der Vorhersage der Sekundärstruktur (PHDsec) (ROST u. SANDER 1994)

wurde auch ein alignment (MAXHOM) (SANDER u. SCHNEIDER 1991) mit den

Sequenzen der SI verschiedener Säugetiere durchgeführt.

Eingeschickte Sequenz YLQISTRLPSD

SI (Mensch) YLQISARLPSD

SI (Kaninchen) YLQISTRLPSE

SI (Ratte) YLQISTRLPSE

MAXHOM alignment ergab, daß bei Kaninchen und Ratte an Aminosäureposition 231

Threonin statt Alanin vorkommt.

Auch für die interessant erscheinenden Mutanten L620P und L702P wurden Peptidsequenzen

analysiert.

PHDsec ergab folgende Klassifizierung der eingeschickten Peptidsequenzen für SI-Wildtyp-

Protein und L620P Mutante :

SI-Wildtyp-Sequenz L620P Sequenz

Eingeschickte Peptidsequenz NTASWEQMEWSITGMLE

FSLFGIPLVGADI

NTASWEQMEWSITGMPE

FSLFGIPLVGADI

Wahrscheinlichkeiten für

Helix = H, Faltblatt = E und

Loop = L

%H: 50.0

%E: 20.0

%L: 30.0

%H: 46.7

%E: 23.3

%L: 30.0

Gesamtklassifizierung „gemischt“ „a-Helix und ß-Faltblatt“

Tabelle 15: Vorhersage der einzelnen Wahrscheinlichkeiten für Helix=H, Faltblatt=E und Loop=L der eingeschickten Peptidsequenzen von SI-Wildtyp-Protein und L620P Sequenz.

In der eingeschickten Peptidsequenz ist die mutierte AS hervorgehoben.

84

Für die angegebene Sequenz der L620P-Mutante wurde in silico eine höhere

Wahrscheinlichkeit für das Vorkommen einer ß-Faltblattstruktur vorhergesagt als für die

entsprechende Wildtyp-Sequenz. Die Gesamtklassifizierung lautet „a-Helix und ß-Faltblatt“

für die Peptidsequenz der L602P-Mutante, hingegen „gemischt“ für die Peptidsequenz der

Wildtyp-SI.

MAXHOM alignment ergab, daß die mutierte AS L620P im Vergleich verschiedener Spezies

konserviert ist.

Ausschnitt aus der eingeschickten Sequenz SITGMPEFSSL

SI (Mensch) SITGMLEFSSL

SI (Kaninchen) SITGMLEFSSL

SI (Ratte) SITGMLEFSSL

PHDsec ergab für die eingeschickte Sequenz von SI-Wildtyp-Protein und L702P folgende

Klassifizierung des Proteins:

SI-Wildtyp-Sequenz L702P Sequenz

Eingeschickte Peptidsequenz QYLTIRYTLLPFLYTLFY

KAHVFGETVARP

QYLTIRYTLLPFLYTPFY

KAHVFGETVARP

Wahrscheinlichkeiten für

Helix = H, Faltblatt = E und

Loop = L

%H: 46.7

%E: 23.3

%L: 30.0

%H: 43.3

%E: 23.3

%L: 33.3

Gesamtklassifizierung „a-Helix und ß-Faltblatt“ „a-Helix und ß-Faltblatt“

Tabelle 16: Vorhersage der einzelnen Wahrscheinlichkeiten für Helix=H, Faltblatt=E und Loop=L der eingeschickten Peptidsequenzen von SI-Wildtyp-Protein und L702P Sequenz.

In der eingeschickten Peptidsequenz ist die mutierte AS hervorgehoben.

85

Für die eingeschickte Sequenz von der L702P-Mutante wurde bei der Vorhersage der

Wahrscheinlichkeit für das Vorkommen einer a-Helix-Struktur eine geringere

Wahrscheinlichkeit berechnet als bei der Wildtyp-Protein Sequenz.

MAXHOM alignment ergab, daß die mutierte AS an Position 702 in der Polypeptidkette im

Vergleich verschiedener Spezies konserviert ist.

Ausschnitt aus der eingeschickten Sequenz PFLYTPFYKAH

SI (Mensch) PFLYTLFYKAH

SI (Kaninchen) PFLYTLFYRAH

SI (Ratte) PFLYTLFYKAH

Diese in silico-Ergebnisse sind herangezogen worden, um die in vitro erzeugten Daten zu

ergänzen.

Ein möglicher Einfluß der anfänglich beobachteten Abnahme der Hydrophobizität auf die

Sekundärstruktur der SI konnte durch PHDsec nicht bestätigt werden. Zusammenfassend

wurde für die A231T-Mutante im Hydrophobizitätsplot und in der Strukturvorhersage kein

wesentlicher Unterschied zum Wildtyp-Protein vorhergesagt. Es wurde deutlich, daß eine

Auswirkung der A231T Mutante auf den Proteintransport unwahrscheinlich erscheint, da bei

Kaninchen und Ratte ein solches Threonin an Position 231 der Polypetidkette vorkommt.

Hingegen konnte erkannt werden, daß die AS an den Positionen 620 und 703 zwischen den

Spezies Mensch, Kaninchen und Ratte konserviert sind und daher ein Austausch in diesen

Regionen einen Effekt auf die Faltung wahrscheinlicher macht.

86

3.1.11. Biochemische Charakterisierung der L620P Mutante in

COS-1- Zellen

Um zu überprüfen, ob das Einfügen eines Prolins an Position 620 der Polypeptidkette der SI

einen Einfluß auf die Faltung und damit den Transport des Proteins hat, wie er in silico

vorhergesagt worden ist, wurde eine Expression des mutierten Proteins in COS-1-Zellen

vorgenommen. Dazu wurden COS-1-Zellen 48 h nach Transfektion mit den Plasmiden

phSIL620P bzw. phSI mittels DEAE-Dextran-Methode über 6 h kontinuierlich mit S35-

Methionin markiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit dem Antikörper-Mix AK HBB

1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705 aus dem Zelllysat.

Vor der Denaturierung für die SDS-PAGE erfolgte jeweils für Wildtyp-SI und L620P

Mutante bei einem Drittel des präzipitierten Proteins eine Behandlung mit Endo H und bei

einem weiteren Drittel eine Behandlung mit Endo F. Der Rest des gefällten Proteins blieb

ohne Behandlung.

Die L620P Mutante zeigt in COS-1-Zellen nur eine einzige Bande, die nach Behandlung mit

Endo H und auch Endo F ein Molekulargewicht von 185 kDa aufweist, wohingegen das

Wildtyp-Protein eine mannosereiche und eine komplex glykosylierte Bande zeigt. Nach

Behandlung mit EndoH zeigt die mannosereiche Bande der Wildtyp-SI ein Molekulargewicht

von 185 kDa, wohingegen die komplexe Bande nach Behandlung mit Endo H ein

Molekulargewicht von 243 kDa aufweist. Die mannosereiche wie die komplex glykosylierte

Bande werden durch Endo F im Molekulargewicht auf 185 kDa herabgesetzt. Somit handelt

es sich bei der einzigen Proteinbande der Mutante L620P um eine mannosereich glykosylierte

Bande.

Die biochemischen Daten zeigen, daß diese in die Wildtyp-SI eingefügte Mutation L620P

eine Prozessierung über das ER hinaus verhindert, so daß das mutierte Protein lediglich

mannosereich glykosyliert bleibt.

87

Abbildung 21: Vergleich des Glykosylierungsmusters zwischen Wildtyp-SI und L620P-Mutante

Nach Transfektion mit den Plasmiden phSI bzw. phSI L620P wurden die COS-1-Zellen über 6 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert, homogenisiert und mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit einem Mix aus den Antikörpern HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Jeweils ein Drittel des Präzipitats wurde mit Endo H behandelt, je ein weiteres Drittel wurde mit Endo F behandelt und der restliche Anteil wurde ohne Behandlung belassen. Die Elektrophorese erfolgte in einem 6%igen SDS-Gel, das anschließend fluorografisch analysiert wurde.

Wildtyp-SI L620P Mutante

Endo H

Endo F

- + - - + -

- - + - - +

SIc

SIh 210

185

kDa

245

88

3.1.12. Biochemische Charakterisierung der L702P Mutante in

COS-1-Zellen

Die Charakterisierung dieser Mutante wurde analog zur Charakterisierung der L620P Mutante

durchgeführt. Auch in diesem Fall wurden die Banden durch Behandlung mit Endo H und

Endo F untersucht. Dazu wurden COS-1-Zellen 48 Stunden nach Transfektion mit den

Plasmiden phSIL702P bzw. phSI über 6 h kontinuierlich mit S35-Methionin markiert. Die

Präzipitation der SI erfolgte mit dem Antikörper-Mix AK HBB 1/691, HBB 2/614, HBB

2/219 und HBB 3/705 aus dem Zelllysat.

Vor der Denaturierung für die SDS-PAGE erfolgte jeweils für Wildtyp-SI und L702P

Mutante bei einem Drittel des präzipitierten Proteins eine Behandlung mit Endo H und bei

einem weiteren Drittel eine Behandlung mit Endo F. Der Rest des gefällten Proteins blieb

ohne Behandlung.

Die L702P Mutante zeigt in COS-1-Zellen nur eine einzige Bande, die nach Behandlung mit

Endo H und auch Endo F ein Molekulargewicht von 185 kDa aufweist, wohingegen das

Wildtyp-Protein durch eine mannosereiche und eine komplex glykosylierte Bande

charakterisiert ist. Nach Behandlung mit Endo H besitzt die mannosereiche Bande der

Wildtyp-SI ein Molekulargewicht von 185 kDa, wohingegen die komplexe Bande nach

Behandlung mit Endo H ein Molekulargewicht von 243 kDa aufweist. Die mannosereiche wie

die komplex glykosylierte Bande werden durch Endo F im Molekulargewicht auf 185 kDa

herabgesetzt. Somit handelt es sich bei der einzigen Proteinbande der Mutante L702P um eine

mannosereich glykosylierte Bande.

Die biochemischen Daten demonstrieren, daß diese in die Wildtyp-SI eingefügte Mutation

L702P, ebenso wie die L620P Mutante, eine Prozessierung über das ER hinaus verhindert, so

daß das mutierte Protein lediglich mannosereich glykosyliert bleibt.

89

Abbildung 22: Vergleich des Glykosylierungsmusters zwischen Wildtyp-SI und L702P-Mutante

COS-1-Zellen, die mit den Plasmiden phSI bzw. phSIL702P transfiziert worden waren, wurden über 6 h mit S35-Methionin biosynthetisch markiert, homogenisiert und mit Standardlysispuffer lysiert. Die Präzipitation der SI erfolgte mit einem Mix aus den Antikörpern HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 und HBB 3/705. Jeweils ein Drittel des Präzipitats wurde mit Endo H behandelt, je ein weiteres Drittel wurde mit Endo F behandelt und der restliche Anteil wurde ohne Behandlung belassen. Die Elektrophorese erfolgte in einem 6%igen SDS-Gel, das anschließend fluorografisch analysiert wurde.

kDa

Wildtyp-Protein L702P Mutante

Endo H

Endo F

- + - - + -

- - + - - +

SIc

SIh

245 210 185

90

3.1.13. Charakterisierung der L702P Mutante mittels konfokaler

Lasermikroskopie

Um die Lokalisation eines ER-Blocks in Säugerzellen in vivo zu zeigen, wurde ein

gekoppeltes Konstrukt der Mutante L702P der SI mit einer gelb leuchtenden Variante des

Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) erstellt. Die zu transfizierenden COS-1-Zellen wurden

auf Deckgläschen gesplittet und mit dem Konstrukt SI-YFPL702P nach der DEAE-Dextran-

Methode transfiziert. 48 h nach erfolgter Transfektion konnte eine Untersuchung der lebenden

COS-1-Zellen mit dem Leica TCS SPII Mikroskop durchgeführt werden. Die gelbe

Emmission konnte nach dem Scannen der Zellen mit Licht einer Wellenlänge von 514 nm

Abbildung 23: ER-Block der L702P Mutante, Aufnahme in COS-1-Zelle

Die zu transfizierenden COS-1-Zellen wurden auf Deckgläschen gesplittet und mit dem Konstrukt SI-YFPL702P transfiziert. 48 h nach erfolgter Transfektion konnte eine Untersuchung der lebenden COS-1-Zellen mit dem Leica TCS SPII Mikroskop durchgeführt werden. Die gelbe Emmission konnte nach dem Scannen der Zellen mit Licht einer Wellenlänge von 514 nm durch einen Argonlaser beobachtet werden. Maßstrich: 20µm.

91

durch einen Argonlaser beobachtet werden. An der Zelle läßt sich ein ovaler, dunkler Kern

erkennen, von dem eine netzwerkartige, gelb leuchtende Struktur ausgeht, die dem ER

entspricht. Da keine gelb leuchtenden Transportvesikel zu sehen sind, muß die Mutante

L702P im ER verblieben sein. Dies stimmt mit den biochemischen Daten zu dieser Mutante

überein.

92

4. Diskussion

4.1.1. Die Prozessierung der Saccharase-Isomaltase des Patienten

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der molekularen Mechanismen eines

Phänotypen der CSID, bei dem es durch gestörten intrazellulären Transport zu einer

Anhäufung von mannosereich glykosylierter SI im ER kommt (NAIM et al. 1988a).

Transportierte Proteine gelangen nach dem Beginn der Translation an freien Ribosomen des

Zytoplasmas an die Membran des rER. Nach der Translokation in das Lumen des ER werden

sie gefaltet und modifiziert, so daß sie nach der Erlangung einer korrekten Sekundär- bzw.

Tertiärstruktur das ER verlassen und weiter entlang des sekretorischen Weges zum Golgi-

Apparat transportiert werden. Dort werden sie weiter modifiziert und in Vesikel verpackt, so

daß sie zu ihrem endgültigen Bestimmungsort gelangen können. Störungen bei dem

intrazellulären Proteintransport sind als Ursachen vieler schwerwiegender Krankheiten

beschrieben worden (BROSS et al. 1999; GREGERSEN et al. 2000; GREGERSEN et al.

2001). Über die Aufklärung der zugrundeliegenden Pathomechanismen kann sowohl der

physiologische Transport in seinen Einzelheiten besser ergründet, als auch der Weg für

neuartige therapeutische Ansatzpunkte bereitet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit

wurden Subdomänen der SI beschrieben, die an der Entstehung von Transportschwierigkeiten

beteiligt zu sein scheinen.

Als Untersuchungsmaterial dienten Biopsien humaner Darmmukosa eines Patienten, bei dem

aufgrund der vorliegenden klinischen Symptomatik eine Saccharase-Isomaltase-Defizienz

vermutet und mittels eines H2-Atemtests bekräftigt wurde. Die Enzyme LPH und DPPIV

wurden aus dem Untersuchungsmaterial präzipitiert, um das Vorliegen einer generalisierten

enzymatischen Defizienz auszuschließen. Beide Bürstensaumenzyme wurden bei diesem

Patienten korrekt prozessiert. Die anschließende Fällung der SI zeigte, daß die SI zwar

korrekt synthetisiert, aber nur zu einem geringen Anteil komplex glykosyliert wird, so daß der

Transport vom ER weiter zum Golgi-Apparat und zur apikalen Membran gestört sein muß.

Verschiedene intrazelluläre Lokalisationen der SI sind bereits als Ursache einer erblichen

Saccharase-Isomaltase-Defizienz (CSID) beschrieben worden (NAIM et al. 1988a). Nach

93

immunhistochemischen und proteinbiochemischen Untersuchungen an 8 verschiedenen

Patienten mit klinischen Symptomen der CSID, konnten mindestens drei verschiedene

Phänotypen dieser Erkrankung beschrieben werden (NAIM et al. 1988a). Bei den Phänotypen

I und II war die Überexpression eines unreifen, mannosereich glykosylierten Vorläufers

kennzeichnend. Diese mannosereich glykosylierte SI (pro-SIh) konvertierte beim Phänotyp I

kaum zur komplex glykosylierten SI (pro-SIc) und erreichte somit nicht die

Bürstensaummembran der Enterozyten. Der mannosereich glykosylierte Vorläufer

akkumulierte membrangebunden proximal vom cis-Golgi. Zwei der untersuchten Patienten

konnten diesem Phänotypen zugeordnet werden. Bei beiden Patienten wurde die 212 kDa-

Form der pro-SIh nach 30 min Markierung nachgewiesen, die nach 4 h Markierung bei einem

der Patienten immer noch als einziges Peptid nachweisbar war, bei dem anderen Patienten

aber zu etwa 10 % zur 245 kDa Form konvertiert war. Hinweise auf einen möglichen Abbau

des Vorläufers konnten nicht gefunden werden. Elektronenmikroskopische Daten lagen zu

beiden Fällen nicht vor.

Beim Phänotypen II hingegen wurde die pro-SIh normal exprimiert und das Vorläufermolekül

konnte an den medialen und trans-Zisternen des Golgi-Apparats, jedoch nicht an der

Bürstensaummembran der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Zusätzlich zu der 210 kDa-

Bande waren in einem Fall nach 4 h Markierung noch mehrere Banden im

Molekulargewichtsbereich zwischen 150-200 kDa sichtbar, die wahrscheinlich

Abbauprodukte der SI darstellten.

Bei einem anderen Fall des Phänotypen II konnte das Vorläuferpeptid ebenfalls im medialen-

und trans-Golgi nachgewiesen werden, eine Markierung von ER oder Lysosomen wurde nicht

gefunden. In zwei weiteren Fällen, bei denen die SI noch nach 4 h Markierung als

hauptsächlich Endo H-empfindliches, 210 kDa Protein nachgewiesen wurde, konnte mittels

Immunhistochemie der Vorläufer im Golgi, jedoch nicht an der Zelloberfläche detektiert

werden. Einer dieser beiden Fälle zeigte nach 4 h Markierung zusätzliche Banden mit

geringerem Molekulargewicht, bei dem anderen Fall konnte gezeigt werden, daß auch nach

16 h Markierung der Vorläufer nicht weiter glykosyliert worden ist.

Nach Untersuchung anderer CSID-Patienten konnten weitere Phänotypen beschrieben

werden: In einem Fall konnte die Saccharase-Isomaltase-Defizienz auf ein intrazellulär

abnorm gespaltetes Protein zurückgeführt werden, wobei die Isomaltase-Untereinheit korrekt

94

nach apikal sortiert, die Saccharase-Untereinheit hingegen intrazytoplasmatisch degradiert

wurde. Der biochemische Nachweis der SI eines anderen Patienten zeigte eine zufällige

Sortierung des Proteins sowohl an die apikale wie an die basolaterale Zellmembran

(FRANSEN et al. 1991).

Wiederum ein neuer Pathomechanismus wurde als Ursache des Phänotypen VI der CSID

beschrieben. Nach Immunpräzipitation der SI aus den Lysaten der Biopsie des untersuchten

Patienten konnte eine einzige Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 210 kDa

präzipitiert werden, die allerdings leicht diffus erschien. Nach Behandlung mit Endo H

konnten zwei Polypeptide mit geringfügig unterschiedlichem Molekulargewicht identifiziert

werden. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der SI in einer Biopsie dieses Patienten

zeigte eine im Vergleich zum gesunden Patienten deutlichere Markierung des ER und des

Golgi-Apparates, aber keine Markierung an der apikalen Membran. Bei diesem Patienten

konnte ein Leucin zu Prolin Austausch an Aminosäureposition 340 innerhalb der Isomaltase-

Einheit als Ursache einer abnormen intrazelluläre Spaltung der SI identifiziert werden, die

eine lösliche anstatt einer membrangebundenen Form der SI bewirkte (JACOB et al. 2000).

Die biochemische Untersuchung der Patienten-SI in der vorliegenden Arbeit zeigte eine

deutliche mannosereich glykosylierte Bande des Proteins sowohl nach Markierung über 30

min als auch nach Markierung über 4 h. Zudem ist nach Markierung über 4 h eine deutlich

schwächere Bande zu sehen, die dem Molekulargewicht nach der komplex glykosylierten

Bande der SI entspricht und Endo H resistent ist.

Somit könnte nach biochemischer Untersuchung der Patienten-Biopsie die Pathogenese dieser

CSID-Erkrankung in einer Retention der SI im Bereich des ER liegen (Phänotyp I), da die

hauptsächlich nachgewiesene Form der SI in der Patienten-Biopsie mehrere Merkmale einer

ER-Lokalisation zeigt: Das nachgewiesene Polypetid wird sowohl nach 30 min Markierung

als auch nach 4 h Markierung stark exprimiert. Eine Konvertierung zur 245 kDa-Form findet

nur zu einem geringen Anteil statt und auch nach 4 h Markierung sind keine Banden mit

geringerem Molekulargewicht nachweisbar, die auf einen intrazellulären Abbau des Proteins

hinweisen könnten.

Mittels Elektronenmikroskopie konnte bei dem Patienten gezeigt werden, daß der Transport

der SI zwar sehr stark eingeschränkt ist, jedoch nicht, wie bei den bisher beschriebenen Fällen

95

vom Phänotypen I, ganz unterbrochen zu sein scheint. Im Unterschied zu den bisher

beschriebenen Fällen konnte ein immunoreaktives Signal sowohl im Bereich des Golgi-

Apparates als auch im Bereich der apikalen Bürstensaummembran nachgewiesen werden.

Im Gegensatz zum Phänotypen II der CSID läßt sich der größte Anteil an SI beim Patienten

nicht im Bereich vom Golgi-Apparat nachweisen, sondern hauptsächlich im Bereich des ER.

Ebenso wie bei dem Patienten, an dem der Phänotyp VI der CSID beschrieben wurde, konnte

bei dem im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Patienten im Präzipitat der SI nach 30 min

Markierung eine Bande mit einem Molekulargewicht von 210 kDa nachgewiesen werden.

Beim Phänotypen VI zeigt die SI auch nach 4 h Markierung keine komplex glykosylierte

Bande, wohingegen bei dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patienten nach 4 h

Markierung ein geringer Anteil komplex glykosylierter SI nachgewiesen werden konnte.

Weiterhin konnten beim Phänotypen VI der CSID nach Endo H Behandlung in den

Präzipitaten der SI sowohl nach 30 min Markierung als auch nach 4 h Markierung zwei

mannosereich glykosylierte Polypeptide nachgewiesen werden, die bei dem in dieser Arbeit

untersuchten Patienten nicht festgestellt werden konnten. Dennoch zeigten die untersuchten

elektronenmikroskopischen Aufnahmen der Dünndarmbiopsien Ähnlichkeiten mit denen des

zuvor beschriebenen Phänotypen VI. Bei beiden wurde im Vergleich zu einem gesunden

Menschen eine stärkere Markierung der SI im ER und im Golgi-Apparat und wenig

Markierung an der apikalen Membran der Enterozyten nachgewiesen.

Die Charakterisierung der molekularen Grundlage des im Rahmen dieser Arbeit untersuchten

Phänotypen der CSID, erfolgte durch Sequenzanalyse der Patienten cDNA und nachfolgender

Mutagenisierung des Wildtyp-Proteins, indem die Auswirkung von gefundenen Mutationen

auf den Transport der SI untersucht wurde. Bei der Sequenzanalyse konnten insgesamt drei

Mutationen im SI-Gen des Patienten nachgewiesen und verifiziert werden. Eine der

Mutationen wurde bereits als Polymorphismus ohne Auswirkung auf den intrazellulären

Transport beschrieben (MOOLENAAR u. NAIM 1995). Die Mutation im Membrananker der

SI (V15F) wurde nicht weiter verfolgt, da der Membrananker der SI gleichzeitig auch als

Signalsequenz dient und somit postuliert wurde, daß eine Mutation im Membrananker eine

Störung der Interaktion mit dem SRP verursachen könnte und somit eine zytosolische

Lokalisation des Proteins bedingen würde.

96

Die biochemische Untersuchung der A231T Mutante im heterologen Zellsystem (COS-1-

Zellen und CHO-Zellen) zeigte keine Auswirkung auf das Transportverhalten, die Faltung

und die enzymatische Aktivität des Proteins im Vergleich zum Wildtyp-SI-Protein. Eine

erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Trypsineinwirkung bei der Mutante A231T ist im

Vergleich zum Wildtyp-Protein nicht nachweisbar gewesen. Weiterhin konnte kein

Unterschied in der Stabilität und im Glykosylierungsmuster zwischen Wildtyp-SI und A231T-

Mutante nach 10 h Chase in COS-1-Zellen nachgewiesen werden.

Da mehrere Mutationen in dem Gen des Patienten, das für die Saccharase-Isomaltase kodiert,

festgestellt wurden, könnte ein komplexerer CSID verursachender Genotyp als bei den bisher

untersuchten CSID-Fällen vorliegen. Das Vorkommen von mehrfachen Mutationen in

krankheitsassoziierten Allelen ist bereits bei mehreren Erkrankungen beschrieben worden.

DORK et al. (1991) haben die Beteiligung von drei Mutationen bei einem Phänotypen der

Mukoviszidose nachweisen können. Auch bei der rezessiven Retinadystrophie

(PAPAIOANNOU et al. 2000), bei der Hyperhomocysteinämie (ISOTALO et al. 2000) , bei

der familiären Hypercholesterinämie (EKSTROM et al. 2000) und bei der Galaktosämie

(LANGLEY et al. 1997) konnten mehrere Mutationen im kodierenden Bereich des Gens

festgestellt werden. Abhängig von dem relativen Anteil jeder Mutation an dem Phänotypen,

führen Mehrfachmutationen eines Gens zu einem milderen (LANGLEY et al. 1997), einem

vergleichbaren (EKSTROM et al. 2000) oder einem schwerwiegenderen Phänotypen

(ISOTALO et al. 2000) als eine Punktmutation im selben Gen.

Ein Fall wurde beschrieben, bei dem ein Patient heterozygot für die Hämochromatose-

Mutation C282Y und homozygot für die Mutation H63D war (LUCOTTE et al. 2001). Da die

Hämochromatose autosomal-dominant vererbt wird, ist dieser Phänotyp bei diesem Patienten

synergistisch durch beide Punktmutationen entstanden. Das Vorliegen einer synergistischen,

homozygot vorkommenden, nicht-polymorphen Doppelmutation ist jedoch noch nicht bei

einer autosomal-rezessiv vererbten Erkrankung beobachtet worden. Lediglich wurde bisher

der Einfluß einer heterozygoten und polymorphen zweiten Mutation auf ein autosomal-

rezessiv vererbtes Gen beschrieben (DORK et al. 1991; ISOTALO et al. 2000). Ein Vorliegen

eines solchen komplexen krankheitsauslösenden Genotypen beim vorliegenden Patienten läßt

sich zum jetzigen Untersuchungszeitpunkt nicht ausschließen.

97

Grundsätzlich sind drei diesem Phänotypen zugrundeliegende Pathomechanismen denkbar,

die mit den Ergebnissen aus der Immunpräzipitation der SI aus den Biopsien und mit den

elektronenmikroskopischen Aufnahmen der SI in Darmbiopsien des Patienten in Einklang

stehen:

Zum einen könnte eine Mutation oder mehrere Mutationen gemeinsam die Faltung der SI des

Patienten so verändert haben, daß die Proteinmoleküle einerseits vom Qualitätskontrollsystem

des ER erkannt und zum großen Teil an ihrem Austritt aus dem ER gehindert werden,

andererseits auch vor ihrem Austritt aus dem Golgi-Apparat einer zweiten Qualitätskontrolle

unterzogen werden. Eine solche Qualitätskontrollinstanz im Bereich des Golgi Apparats ist

auch beim Phänotypen II der CSID vermutet worden (MOOLENAAR et al. 1997). Dieses

Qualitätskontrollsystem müßte dann andere Faltungssensoren für falsch gefaltete Proteine

besitzen bzw. andere Kriterien für die Erkennung einer Fehlfaltung zugrundelegen als das

Qualitätskontrollsystem im ER. Nach den vorliegenden Ergebnissen nach Expression der

Mutante A231T im heterologen Zellsystem, kann diese Mutante nicht alleine den zugehörigen

Phänotypen bedingen, da das Transportverhalten der Mutante A231T auch in Zelllinien

verschiedener Herkunft nicht von dem der Wildtyp-SI zu unterscheiden war.

Zum anderen könnten eine oder mehrere Mutationen synergistisch die Stabilität des Moleküls

so verändert haben, daß beim Transport der Proteinmoleküle an die apikale Membran viele

der Moleküle bereits entlang des sekretorischen Weges abgebaut werden. Die stärkere

Anhäufung im ER könnte dabei auf eine reaktive Überproduktion der Zelle aufgrund der

wenigen SI-Proteine an der apikalen Zelloberfläche erklärt werden. Ein solcher

Pathomechanismus ist bei der D409H-Mutante der Glucocerebrosidase (PASMANIK-CHOR

et al. 1996) bekannt. Auch bei Vorliegen dieses Mechanismus kann aufgrund der Ergebnisse

nach Expression im heterologen Zellsystem die Mutante A231T nicht alleine den zugehörigen

Phänotypen generieren, da selbst nach 10 h Chase kein Unterschied in der Stabilität zwischen

der Mutante A231T und der Wildtyp-SI nachweisbar war.

Grundsätzlich ist bei diesem untersuchten Patienten auch ein sekretorischer

Pathomechanismus nicht auszuschließen. Ein solcher Mechanismus konnte bereits bei

Phänotyp VI der CSID von JACOB et al. (2000) als Pathomechanismus nachgewiesen

werden. Bei diesem Fall führte die Mutation L340P zu einer intrazellulären Abspaltung der

98

Transmembrandomäne der SI, so daß aus der membranverankerten Form eine lösliche Form

der SI entstand. Durch die heterologe Expression der Mutante L340P in MDCK-Zellen

(einer polaren Nierenepithelzelllinie) konnte sowohl die Spaltung der SI nachgewiesen

werden als auch über einen Pulse-Chase-Versuch die Sekretion des Proteins in das

Kulturmedium nachgewiesen werden.

Beim vorliegenden Patienten konnte in den Immunpräzipitationen der SI aus den

Dünndarmbiopsien eine intrazelluläre Spaltung der Saccharase-Isomaltase nicht beobachtet

werden. Bei einem Vorversuch mit der beim vorliegenden Patienten verifizierten Mutante

A231T wurden COS-1 Zellen transient mit dem Plasmid phSIA231T transfiziert, mit S35-

Methionin biosynthetisch markiert und sowohl das Kulturmedium als auch das Zelllysat mit

dem SI-AK-Mix versetzt. Die Präzipitation der SI gelang dabei nur aus den Zelllysaten

(Daten nicht gezeigt). Eine intrazelluläre Spaltung des Proteins wurde nicht beobachtet.

Dennoch läßt sich eine extrazelluläre Abspaltung der SI als möglicher Pathomechanismus

nicht ausschließen, da die Expression der Mutante A231T nicht in einer Darmzelllinie,

sondern in einer Nierenzelllinie erfolgte und die Interaktion des mutierten Proteins mit einer

nur in Darmzellen vorkommenden Endopeptidase zum jetzigen Untersuchungszeitpunkt

durchaus möglich wäre. Außerdem verhindert die Mutation A231T nicht die komplexe

Glykosylierung der SI.

Es ist also denkbar, daß diesem CSID-Fall ein neuer Pathomechanismus zugrunde liegt, bei

dem im Gegensatz zu dem bisher von JACOB et al. (2000) beschriebenen Fall einer

intrazellulären Spaltung, eine Spaltung erst erfolgt, wenn das Protein membrangebunden

extrazellulär vorliegt.

Zur weiteren Klärung des vorliegenden Phänotypen wäre es interessant zu untersuchen, ob die

Expression der Mutante SI A231T im heterologen Zellsystem unter Einwirkung einer putativen

Endopeptidase eine extrazelluläre Spaltung der SI bewirkt. Weiterhin könnte über die

Generierung weiterer Mutanten (V15F, kombinierte Doppelmutanten V15F/A231T und

A231T/Q1203E bzw. eine kombinierte Dreifachmutante V15F/A231T/Q1203E) und ihre

Expression in Säugerzellen geklärt werden, ob doch ein komplexerer Genotyp Ursache dieser

CSID-Erkrankung beim untersuchten Patienten ist.

99

4.1.2. Rolle der einmalig identifizierten Prolinmutationen

Einen wichtigen Beitrag zur Klärung der für die Faltung von diesem Membranprotein

wichtigen Domänen hat die durchgeführte Mutagenisierung des Wildtyp-Proteins an den

Aminosäurepositionen 620 und 703 gebracht. Diese Mutationen sind nur in einem

Sequenzierungsdurchgang aufgetreten, so daß sich der vorliegende Phänotyp nicht eindeutig

mit diesen beiden Mutationen in Verbindung bringen läßt. Die anschließend durchgeführte

Expression in COS-1-Zellen zeigte, daß die eingeführte Mutation zu einem deutlichen

Transportstopp des Proteins geführt hat, da ausschließlich die 210 kDa Form der SI, die der

mannosereichen Form entspricht, nachgewiesen werden konnte. Diese Beobachtung bestätigt

zudem, daß obgleich Proteine in COS-1-Zellen stark überexprimiert werden, dieses

Zellsystem geeignet ist, um einen Transportblock nachzuweisen (MOOLENAAR et al. 1997).

Es konnte gezeigt werden, daß jede der beiden Prolinmutationen in der Lage ist, an ihrer

Position in der Peptidkette die Faltung des Proteins zu stören. Eine für eine korrekte Faltung

wichtige Domäne der SI wird dadurch so beeinträchtigt, daß eine weitere Prozessierung

verhindert wird. Dies stimmt mit den in silico-Beobachtungen überein. Es konnten bisher eine

Reihe von Mutanten beschrieben werden, die zu Schwierigkeiten bei der Faltung und beim

Transport von Proteinen geführt haben. In einigen Fällen führt dieser beeinträchtigte

Proteintransport zu schwerwiegenden Krankheiten: Morbus Gaucher beruht auf Mutationen

im Gen der Glucocerebrosidase. Der G202R-Genotyp dieser Erkrankung führt zu einem

beeinträchtigten Transport der sauren Glucosidase (ZIMMER et al. 1999). Bei einer anderen

Lipidspeicherkrankheit, der Mukopolysaccharidose IV führt eine Mutation im Stopp-Codon

der Arylsulfatase zu Konformationsänderungen, die einen Transportblock des Proteins im ER

zur Folge haben (ARLT et al. 1994). Die häufigste genetische Erkrankung der kaukasischen

Bevölkerung ist die Mukoviszidose. Sie basiert auf Mutationen im CFTR-Gen. Die am

häufigsten vorkommende Mutation, ? F508, führt zur Bildung eines funktionell aktiven, aber

transportinkompetenten Moleküls, welches schließlich im ER akkumuliert (CHENG et al.

1990).

Untersuchungen mit Austauschen bestimmter Aminosäuren, die zu verschiedenen Gruppen

gezählt werden, haben gezeigt, daß häufig Proline bedingt durch ihre Struktur den Aufbau

100

einer ? -Helix stören können. Wenn Proline über ihre Aminogruppe Peptidbindungen

ausbilden, steht kein Wasserstoff aus der Amidgruppe mehr zur Verfügung, um eine a-Helix

über Wasserstoffbrückenbildung zu stabilisieren. Weiterhin ist eine Rotation um die N-Ca–

Bindung nicht mehr möglich, da die Seitengruppe des Prolins an der a-Aminogruppe hängt

(KUCHEL u. RALSTON 1988), so daß Proline nicht in der Lage sind, eine korrekte Struktur

in a-Helices einzunehmen. Die Polypeptidkette erfährt vor dem Prolin einen Wendeknick, an

dem eine Polypeptidkette einen der beiden energetisch günstigsten Stellungen, die trans- oder

die cis-Konformation einnimmt. Daher führt die Aminosäure Prolin häufig zu einer Änderung

der Sekundärstruktur und Tertiärstruktur von Proteinen und damit zu Faltungsdefekten

(GREGERSEN et al. 2000; GREGERSEN et al. 2001; MOOLENAAR et al. 1997). Solche

Faltungsdefekte, die durch die Einfügung eines Prolins verursacht wurden, konnten bereits als

Ursache mehrerer Krankheiten, unter anderem für Phänotyp II (Q1098P) und für Phänotyp VI

(L340P) der CSID beschrieben werden. Auch konnte eine Prolinmutation als Ursache

mehrerer Fälle von Retinitis pigmentosa nachgewiesen werden (DRYJA et al. 1991;

TRUJILLO et al. 2000). Umgekehrt führte auch die Entfernung von Prolinen aus bestimmten

Positionen in der Polypeptidkette zu Krankheitserscheinungen, wie im Falle einer

dysfunktionellen Form eines Natrium/Gallensäure-Kotransporters (WONG et al. 1995) oder

bei einer besonderen Form einer Gangliosidose (HOU et al. 1998).

Der Ablauf der korrekten Proteinfaltung läßt sich in vitro über die Bildung verschiedener

Intermediate nachvollziehen.

Zunächst entsteht durch einen hydrophoben Kollaps der Polypeptidkette und Ausbildung

einer Sekundärstruktur ein relativ kompaktes Gebilde. Abhängig vom jeweiligen Protein

erfolgt die Ausbildung weiterer kompakter Strukturen über die Bildung mehrerer Substrate, so

daß letztlich mehrere besonders stabile Intermediate vorliegen, die aus einem gefalteten

Kernbereich bestehen, wobei noch ungefaltete Bereiche vorliegen, die teilweise

vorübergehend eine Sekundärstruktur annehmen können.

Diese teilweise gefalteten Intermediate neigen eher zur Aggregation als völlig ungefaltete

Moleküle, wahrscheinlich dadurch bedingt, daß in ungefalteten Molekülen die hydrophoben

Bereiche zufällig in der Polypeptidkette verteilt vorliegen, während in teilweise gefalteten

101

Molekülen die hydrophoben Bereiche in bestimmten Regionen gehäuft vorkommen (FINK

1999).

Somit wird deutlich, daß Proteine mit veränderter Sekundär- und Tertiärstruktur, die häufig

durch Mutationen entstehen, dazu neigen, über Wechselwirkungen mit homologen oder

heterologen Molekülen zu interagieren und somit zu aggregieren (HILBICH et al. 1991). In

anderen Fällen entsteht z.B. durch eine veränderte Sekundär- und Tertiärstruktur ein

verändertes Protein, welches bezüglich der Einwirkung anderer Moleküle, z.B. Proteasen

empfindlicher als der zugehörige Wildtyp reagiert, so daß es in solchen Fällen zu einem

vermehrten Abbau kommt. Durch die Behandlung mit Proteasen konnte oftmals ein

Unterschied zwischen der Sensitivität des korrekt gefalteten Wildtyp-Proteins gegenüber

einer Mutante beobachtet werden (BENHAROUGA et al. 2001; JACOB et al. 2001b;

MOOLENAAR et al. 1997). Eine mögliche Erklärung für ein solches Verhalten ist, daß in

nativen Proteinen mit korrekter Faltung mögliche Angriffspunkte für bestimmte Proteasen, im

Inneren des Proteins versteckt vorliegen.

In vielen Fällen bedingt eine nicht-physiologische Sekundär- und Tertiärstruktur eine

Erkennung des veränderten Proteins über das zelluläre Qualitätskontrollsystem, so daß

Proteine bereits im ER zurückbehalten werden.

Zellen enthalten eine Proteinmaschinerie, die Polypeptidketten bei ihrer Faltung unterstützt,

falsch gefaltete Proteine entfaltet und in manchen Fällen degradiert. Um diese Aufgaben zu

erfüllen, muß ein Qualitätskontrollsystem vorhanden sein, welches zwischen korrekt und

falsch gefalteten Proteinen unterscheiden kann (MATOUSCHEK 2000). Das

Qualitätskontrollsystem des ER enthält eine Saccharidtransferase, die als Faltungssensor

fungiert und dafür sorgt, daß falsch gefaltete Proteine im ER mit den Foldasen weiter in

Kontakt bleiben und falls die Erlangung der korrekten Faltung nicht möglich ist, schließlich

degradiert werden.

Fast alle im ER synthetisierten Proteine werden während ihrer Translokation ins ER

glykosyliert. An einer Verzweigung trägt das angehängte Glykan drei Glukosereste, die von

zwei ER-ständigen Glucosidasen erkannt und getrimmt werden. Das so entstandene

monoglykosylierte Protein bindet nachfolgend an drei Foldasen:

102

Calnexin und Calreticulin wirken wie Chaperone nichtglykosylierter Proteine (ELLGAARD

et al. 1999; RITTER u. HELENIUS 2000), sie unterstützen die Proteinfaltung und verhindern

die Aggregation von Intermediaten, allerdings üben sie diese Wirkung nicht durch Bindung

an die Polypeptidkette aus, sondern verhalten sich auch wie Lektine und binden an Proteine

über ihre Zuckerseitenkette (RODAN et al. 1996; ZAPUN et al. 1998). Die dritte Foldase,

ERp27, ist eine Disulfid-Isomerase (ZAPUN et al. 1997). Sie kann mit den selben

Glykoproteinen vernetzt werden, die auch an Calnexin und Calretikulin binden.

Die Bindung an diese drei Faktoren hält so lange an, bis auch der letzte Glucoserest durch

eine der beiden Glucosidasen entfernt wird, wenn zu diesem Zeitpunkt das Protein nicht oder

falsch gefaltet vorliegt, dann wird es von der UDP-Glucose:Glucosyltransferase (GT) erkannt

und reglukosyliert, so daß diese monoglykosylierte Proteine wieder an die drei Foldasen

binden können und einen neuen Faltungszyklus durchlaufen können.

Um aus diesem Zyklus auszuscheiden muß ein Glykoprotein demnach korrekt gefaltet und

deglukosyliert vorliegen. Falls auch nach mehreren Zyklen das Protein nicht korrekt gefaltet

ist, kann es evtl. zurück in das Zytosol gelangen, wo es deglykosyliert, ubiquitiniert und

schließlich durch das Proteasom abgebaut wird (PLEMPER u. WOLF 1999). Daß die UDP-

Gluc:Glucosyltransferase (GT) die Funktion des Faltungssensors übernehmen muß, konnten

GANAN et al. (1991) und ZAPUN et al. (1997) zeigen, da sie von den untersuchten

Komponenten der Proteinmaschinerie als einzige nicht-native Glykoproteine erkennt.

Wenn tatsächlich die beiden Mutanten L620P und L702P vom Qualitätskontrollsystem des

ER erkannt und zurückgehalten werden, sollte eine Assoziation dieser beiden Mutanten mit

den ER-Chaperonen BiP und Calnexin nachweisbar sein. Eine solche Assoziation zwischen

ungefalteter Polypeptidkette und BiP bzw. Calnexin konnte für eine Vorstufe der LPH (LPH

initial) nachgewiesen werden (JACOB et al. 2001b). Auch konnte eine längere Assoziation

von ER-Block-Mutanten der Tyrosinase mit Calnexin beschrieben werden (HALABAN et al.

2000). LOO u. CLARKE (1994) untersuchten die Assoziation von ER-Block-Mutanten des

P-Glykoproteins mit Calnexin. Eine längere Assoziation mit dem ER-Chaperon Calnexin

konnte auch für die CFTR-Mutante ? F508 beobachtet werden (PIND et al. 1994). Zudem

konnte bei dieser Mutante beobachtet werden, daß ihr Transport temperatursensitiv ist

(LUKACS et al. 1993), das bedeutet, daß bei Inkubationstemperaturen zwischen 20°C und

103

24°C ein Austritt aus dem ER für das fehlgefaltete Protein möglich ist. Diese

Temperatursensitivität trifft auch für einige Mutanten des P-Glykoproteins zu (LOO u.

CLARKE 1994).

Um zu zeigen, daß die beiden zufällig generierten Mutanten L620P und L703P tatsächlich

einen ER-Block bewirken, könnte biochemisch die Kolokalisation der mutierten SI mit ER-

spezifischen Foldasen, z.B. BiP oder Calnexin untersucht werden und der Austritt an SI aus

dem ER bei Inkubationstemperaturen zwischen 20°C und 24°C überprüft werden.

Zwar ließen sich die Mutationen L620P und L702P bisher nicht eindeutig auf den Phänotypen

des Patienten zurückführen, jedoch liefern sie relevante Aussagen über funktionelle

Faltungsdomänen der SI, die bisher nicht ausreichend charakterisiert worden sind. Somit stellt

diese Arbeit einen Beitrag für die molekulare Aufklärung pathologischer Transportvorgänge

dar, wodurch funktionelle Proteindomänen identifiziert worden sind, welche für deren

Transport zur Zelloberfläche notwendig erscheinen.

104

5. Zusammenfassung

Ein korrekter Proteintransport und eine effiziente Proteinfaltung sind Voraussetzung für

physiologische Zellfunktionen in eukaryontischen Organismen. Fehler in diesen Vorgängen

führen zu pathologischen Veränderungen, die für den betroffenen Organismus häufig

schwerwiegende Folgen haben können. Bekannte Krankheiten, die auf dieser Grundlage

beruhen, sind z.B. die Cystische Fibrose oder eine Reihe lysosomaler Speicherkrankheiten

wie bei Morbus Gaucher. Mildere Symptome werden bei der Congenitalen Saccharase-

Isomaltase-Defizienz (CSID) beobachtet, einer Erkrankung, die für die betroffenen Patienten

im klinischen Verlauf mit osmotischer Diarrhoe und abdominalen Krämpfen nach Aufnahme

von Zucker einhergeht. Bei dieser klinisch relevanten, autosomal-rezessiv vererbten

Krankheit wurden bisher sechs Phänotypen biochemisch und immunhistologisch

charakterisiert.

Zielsetzung dieses Projekts war die Aufklärung der zugrundeliegenden molekularen

Mechanismen eines Phänotypen der CSID, bei dem durch biochemische und morphologische

Charakterisierung bereits festgestellt wurde, daß der mannosereich glykosylierte Vorläufer

der Saccharase-Isomaltase (SI) keine Transportkompetenz erlangt und im ER akkumuliert.

Die Methodik der Arbeit umfasste die Isolierung der SI-cDNA mittels RT-PCR, die

Identifikation der Mutanten, den Austausch der relevanten Basenpaare im Wildtyp-Protein

mittels Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese und dessen Expression in verschiedenen

Säugetierzellen. Durch Sequenzieren konnten 3 signifikante Mutationen in der cDNA des

Patienten nachgewiesen und verifiziert werden.

Ein Austausch von Valin zu Phenylalanin an Position 15 im Bereich des Membranankers

(V15F) wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht charakterisiert, da diese Domäne auch als

Signalsequenz im Typ II SI-Protein fungiert. Es wurde angenommen, daß diese Mutation ein

zytosolisch lokalisiertes Protein bedingen würde. Ein Austausch von Glutamin zu

Glutaminsäure (Q1203E) ist bereits als Polymorphismus beschrieben worden. Eine A/T

Mutation an Nukleotid 705 im Bereich der Isomaltase führte zu einem Alanin zu Threonin

Austausch an Position 231 der pro-SI (A231T). Die Einführung dieser Mutation zeigte keine

Auswirkung auf Transportverhalten, Faltung, enzymatischer Aktivität und Stabilität im

Vergleich zum Wildtyp-Protein. Ein neuer Pathomechanismus konnte postuliert werden, bei

105

dem die A231T Mutante eine sekretorische Form der SI generiert. Es ist genauso

wahrscheinlich, daß ein komplexerer Mechanismus vorliegt, bei dem zwei oder mehrere

Mutationen synergistisch wirken.

Zwei Mutationen, die nur einmal nachgewiesen wurden, erschienen aufgrund des

Aminosäureaustauschs (Leucin zu Prolin) pathophysiologisch interessant. Zum einen lagen

beide Mutationen (L620P und L702P) in einer konservierten Region, zum anderen führten

beide Mutationen zu einem Transportblock der SI im ER.

Diese Mutationen zeigen die wichtige Rolle der relevanten Domänen in der Faltung der SI.

Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei, die molekularen Mechanismen des

intrazellulären Proteintransports aufzuklären, indem eine pathologische Störung als Modell

verwendet wurde.

106

6. Summary

Valentina Ritz

Implication of defective transport of a glycoprotein in the pathogenesis of Congenital

Sucrase-Isomaltase Deficiency

Correct protein transport and efficient folding are prerequisites for physiological functions in

eukaryotic organisms. Alterations in these processes may lead to pathological phenomena

with tremendous perspectives for the affected organism. Known diseases based on this

mechanisms are e.g. Cystic Fibrosis or some lysosomal storage diseases like Morbus

Gaucher. Milder symptoms are encountered in Congenital Sucrase Isomaltase Deficiency

(CSID) which causes osmotic diarrhea and abdominal cramps upon ingestion of sugar.

Six phenotypes of this clinically relevant and autosomal-recessive inherited disease have been

characterized biochemically and by immunohistological techniques.

The aim of this project was the identification of the molecular mechanisms underlying a

phenotype of CSID, in which biochemical and morphological data revealed that the SI-

precurser does not acquire transport competence and persists as a mannose rich polypeptide in

the ER.

Methods included isolation of SI-cDNA by RT-PCR, identification of the mutations and their

introduction into the wildtype SI gene through site-directed mutagenesis and their expression

in different mammalian cell systems. Three point mutations in the patient’s cDNA could be

detected by sequencing the DNA. A Valine to Phenylalanine substitution at residue 15 within

the membrane anchoring domain was not further analysed, since this domain acts also as a

signal sequence in the type II SI protein indicating that this mutation would generate a

cytosolic protein and this was not the case. An exchange of Glutamine to Glutamic acid

(Q1203E) was already described as polymorphism. An A to T exchange of nucleotide 705

within the isomaltase domain led to a amino acid substitution of Alanine to Threonine at

position 231 of the isomaltase subunit (A231T). Introduction of this mutation in the wild type

SI gene revealed no effect on the folding, enzymatic activity and stability as compared to wild

type SI. A novel pathomechanism could be postulated implicating the A231T mutation in the

107

generation of a secretory form of SI. It is also likley, that a more complex mechanism exists

involving two or more mutations that act synergistically.

Two mutations which appeared only once during sequencing seemed to be of

pathophysiological interest because they generated a switch to the amino acid proline. First,

both mutations (L620P and L702P) are located within a conserved region and second, both

mutations resulted in a ER block of SI.

Furthermore, these mutations suggest an important role of the relevant domains in the overall

folding of SI. This work contributes to elucidate the molecular mechanisms underlying

intracellular protein transport using a pathological disorder as a model.

108

7. Literaturverzeichnis

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ZIMMER, K. P., P. LE COUTRE, H. M. AERTS, K. HARZER, M. FUKUDA, J. S. O'BRIEN u. H. Y. NAIM (1999): Intracellular transport of acid beta-glucosidase and lysosome- associated membrane proteins is affected in Gaucher's disease (G202R mutation). J. Pathol. 188, 407-414

ZIMMER, K. P., I. MATSUDA, T. MATSUURA, M. MORI, J. P. COLOMBO, H. D. FAHIMI, H. G. KOCH, K. ULLRICH u. E. HARMS (1995): Ultrastructural, immunocytochemical and stereological investigation of hepatocytes in a patient with the mutation of the ornithine transcarbamylase gene. Eur. J. Cell Biol. 67, 73-83

123

8. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Darmepithelzelle 2

Abbildung 2: Struktur der SI 16

Abbildung 3: Der Aminoterminus (N) befindet sich am zytoplasmatischen Teil des

Proteins, das carboxyterminale Ende des Peptids (C) ist zum Lumen

des Darmkanals gerichtet (Typ-II-Membranprotein) 17

Abbildung 4: Phänotypen der Congenitalen Saccharase-Isomaltase-Defizienz

(CSID) 20

Abbildung 5: Präzipitation der Laktase-Phlorizin-Hydrolase aus

Dünndarmbiopsien des Patienten 56

Abbildung 6: Präzipitation von DPPIV aus Dünndarmbiopsien des Patienten 58

Abbildung 7: Präzipitate der SI des Patienten verglichen mit denen einer

Kontrollperson 60

Abbildung 8: Elektronenmikroskopische Aufnahme der SI in Enterozyten

des Patienten, Ausschnitt in der Nähe des Zellkerns 62

Abbildung 9: Elektronenmikroskopische Aufnahme der SI in Enterozyten

des Patienten, Ausschnitt in der Nähe der Mikrovilli-

membran 63

Abbildung 10: Elektronenmikroskopische Aufnahme der SI aus Enterozyten

einer Kontrollperson 64

Abbildung 11: Die relative Lage der in der Patienten-cDNA bestätigten

Mutationen 66

Abbildung 12: Alanin zu Threonin Austausch im phSI-Konstrukt

der A231T Mutante 68

Abbildung 13: Leucin zu Prolin Austausch im phSI-Konstrukt

der L620P-Mutante 69

Abbildung 14: Leucin zu Prolin Austausch der AS 702 im phSI-Konstrukt

und im SI-YFP-Konstrukt 70

Abbildung 15: Pulse-Chase-Versuch in COS-1-Zellen (Vergleich des

Transports zwischen A213T-Mutante und Wildtyp-SI) 71

124

Abbildung 16: Pulse -Chase-Versuch in CHO-Zellen (Vergleich des

Transports zwischen A213T-Mutante und Wildtyp-SI) 73

Abbildung 17: Trypsin-Sensitivitäts-Versuch in COS-1-Zellen (Vergleich des

Transports zwischen A231T-Mutante und Wildtyp-SI) 75

Abbildung 18: Immunpräzipitation der SI aus COS-1-Zellen nach 1 Stunde,

6 Stunden und 10 Stunden 77

Abbildung 19: Vergleich der Hydrophobizitätsprofile zwischen Wildtyp-SI und

A231T-Mutante bzw. zwischen Wildtyp-SI und L620P Mutante 78

Abbildung 20: Vergleich der Hydrophobizitätsprofile zwischen Wildtyp-SI und

L702P Mutante 81

Abbildung 21: Vergleich des Glykosylierungsmusters zwischen Wildtyp-SI und

L620P-Mutante 87

Abbildung 22: Vergleich des Glykosylierungsmusters zwischen Wildtyp-SI und

L702P-Mutante 89

Abbildung 23: ER-Block der SI-YFPL702P-Mutante, Aufnahme in COS-1-Zelle 90

125

9. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Oligonukleotide zur cDNA-Amplifikation 26

Tabelle 2: Protein-Standard 29

Tabelle 3: Oligonukleotide für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese 30

Tabelle 4: SI-Antikörper-Mix 33

Tabelle 5: Chemikalien für die Reverse Transkription von cDNA 40

Tabelle 6: Standard-PCR-Reaktionsansatz 41

Tabelle 7: Standard-PCR-Programm 41

Tabelle 8: Standard-Ligationsansatz 43

Tabelle 9: Ansatz zur nicht-radioaktiven DNA-Sequenzierung 46

Tabelle 10: Standard-Mutagenese-Ansatz 47

Tabelle 11: Standard-Mutagenese-Programm 48

Tabelle 12: Zusammensetzung des SDS-Geles zur Auftrennung der molekularen

Formen der Saccharase Isomaltase 52

Tabelle 13: Klassifizierungsschema für die Sekundärstruktur von

Peptidsequenzen 82

Tabelle 14: Vorhersage der einzelnen Wahrscheinlichkeiten für Helix=H,

Faltblatt=E , Loop=L und Gesamtklassifizierung der eingeschickten

Peptidsequenzen von SI-Wildtyp-Protein und A231T Sequenz 82

Tabelle 15: Vorhersage der einzelnen Wahrscheinlichkeiten für Helix=H,

Faltblatt=E, Loop=L und Gesamtklassifizierung der eingeschickten

Peptidsequenzen von SI-Wildtyp-Protein und L620P Sequenz 83

Tabelle 16: Vorhersage der einzelnen Wahrscheinlichkeiten für Helix=H,

Faltblatt=E, Loop=L und Gesamtklassifizierung der eingeschickten

Peptidsequenzen von SI-Wildtyp-Protein und L702P Sequenz 84

126

10. Abkürzungsverzeichnis

A Adenosin (bei der Angabe innerhalb von Nukleotidsequenzen)

Abb. Abbildung

ADP Adenosindiphosphat

APS Ammoniumperoxidsulfat

AS Aminosäure(n)

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C Cytosin (bei der Angabe innerhalb von Nukleotidsequenzen)

°C Grad Celsius

cDNA komplementäre DNA

Ci Curie

Da Dalton

DEAE Diethylaminoethyl

DMEM Dulbecco’s modifiziertes Eagle Medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz

Endo F Endo -N-acetyl-ß- glukosaminidase H (Flavobacterium

meningosepticum)

Endo H Endo -N-acetyl-ß- glukosaminidase H (Streptomyces plicatus)

ER Endoplasmatisches Retikulum

FKS fötales Kälberserum

G Guanin (bei der Angabe innerhalb von Nukleotidsequenzen)

g Gramm

G-6-P Glucose-6-Phosphat

h Stunde

127

IP Immunpräzipitation

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

l Liter

LB Luria-Bertani-Medium

LPH Laktase-Phlorizin-Hydrolase

LPHm gespaltene, komplex glykosylierte Form der Laktase-Phlorizin-

Hydrolase

M Molar

mA Milliampère

MA Membrananker

MEM Modifiziertes Eagle Medium

min Minute(n)

ml Milliliter

mRNA Boten-Ribonukleinsäure

NaAc Natriumacetat

NADP+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-phosphat (oxidierte Form)

NADPH+H+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-phosphat (reduzierte Form)

PBS Phosphat gepufferte Salzlösung

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

pro-LPHc komplex glykosylierter Vorläufer der Laktase-Phlorizin-

Hydrolase

pro-LPHh mannosereich glykosylierter Vorläufer der Laktase-Phlorizin-

Hydrolase

pro-SIc komplex glykosylierter Vorläufer der Saccharase-Isomaltase

pro-SIh mannosereich glykosylierter Vorläufer der Saccharase-

Isomaltase

rER rauhes Endoplasmatisches Retikulum

RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute

128

s Sekunde(n)

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

SI Saccharase-Isomaltase

SIc gespaltene, komplex glykosylierte Form der Saccharase-

Isomaltase

SS Signalsequenz

T Thymin (bei der Angabe innerhalb von Nukleotidsequenzen)

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

TGN trans-Golgi-Netzwerk

Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan

U unit, Enzymeinheit

u.a. unter anderem

V Volt

ZS Zytoplasmatischer Schwanz

129

11. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Univ.-Prof. Dr. H.Y. Naim für die freundliche Aufnahme

am Institut, die Überlassung des interessanten Dissertationsthemas und für die wohlwollende

Betreuung der Arbeit durch seine stets gewährte Gesprächsbereitschaft.

Für die gute Betreuung , die ständige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft und die kritische

Durchsicht des Manuskriptes danke ich Herrn PD Dr. R. Jacob.

Besonders bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. K.-P. Zimmer, in dessen Arbeitsgruppe an

der Kinderklinik der Universität Münster die elektronenmikroskopischen Aufnahmen

angefertigt worden sind und der mir bei der Beurteilung dieser Bilder sehr behilflich war.

Für die Klinische Diagnostik und die Entnahme der Dünndarmbiopsien danke ich Prof. Dr.

Jacques Schmitz vom Hospital Necker Enfants Malades in Paris.

Im besonderen Danke ich Heike Klippert und Dipl.-Biol. Alexander Giese aus dem Institut

für Tierzucht und Vererbungslehre der Tierärztlichen Hochschule Hannover, die mit

persönlichem Einsatz die DNA-Sequenzierung durchgeführt haben.

Allen Mitarbeitern des Instituts für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover, insbesondere denen der AG Naim sei ganz herzlich für die stetige Hilfsbereitschaft

und die gute Arbeitsatmosphäre gedankt. Ein großes Dankeschön gilt Dagmar Bühring,

Jürgen Eickemeyer und Gabriele Wetzel, die mir bei der Durchführung der Experimente mit

wertvollen Ratschlägen geholfen haben und ohne die ein reibungsloser Laborablauf

unmöglich wäre.

Sehr herzlich danke ich meinen Eltern Dr. Maria-Vittoria Ritz und Dr. Klaus Ritz für ihre

großzügige Unterstützung, ihre unermüdliche Ermunterung und die fortwährende

Diskussionsbereitschaft, ohne die diese Arbeit nicht entstanden wäre.

Ein besonders herzliches Dankeschön gilt allen Freunden und Verwandten, die mir stets mit

Rat und Tat zur Seite standen.