This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

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sieht der bis 1953 verfügbaren Daten. Eine neuere Bestimmung (1954) von L e v i n t o v v , M e i s t e r und M o r a l e s 1 6 ergab — 7900 cal und die letzte von M o r a l e s et al . 1 7 ungefähr — 7000 cal. Mit diesem Wert und AH = — 4800 cal würde T J S = — 2200 cal, und die Entropieänderung der Reak-tion wäre rund 7 Einheiten. M e y e r h o f 4 hat an-genommen, daß Wärmetönung und freie Energie der ATP-Spaltung sich wenig unterscheiden. Mutatis mutandis scheint dies noch heute zu gelten.

16 L. L e v i n t o w u. A. M e i s t e r , mit Anhang von M. F. Morales, J. biol. Chemistry 209, 265 [1954].

Für die Synthese von ATP mit Hilfe oxydativer Reaktionen im Citronensäurezvklus werden rund 15 000 cal freier Energie aufgewendet. Wenn die klassischen AH- und AF-Werte von — 12 000 bis — 16 000 cal zugrunde gelegt werden, ergibt sich ein ungewöhnlich hoher Nutzeffekt der ATP-ADP-Reaktion, in welcher sich alle Hauptlinien des Ener-giestoffwechsels begegnen. Mit den neueren Be-stimmungen liegt der geschätzte Nutzeffekt näher an 50 als an 100 Prozent.

" M. F. M o r a 1 e s , J. B o 11 s , J. J. B 1 u m u. T. L. H i l l , Physiol. Rev., im Druck [1955].

Vermehrungsweise beim A-Organismus aus der Pleuropneumonie-Gruppe V o n G . G E R B E R

Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen (Z. Naturforschg. 10 b, 382—384 [1955]; eingegangen am 2. Februar 1955)

Herrn Prof. Dr. J. W. Harms zum 70. Geburtstag gewidmet

Der Erreger der Pleuropneumonie der Rinder und eine Reihe ähnlicher Organismen ge-hören zu den kleinsten bekannten Lebewesen. Sie sind auf Bakterien-Nährböden züditbar, doch wie große Virusarten durdi grobe Bakterienfilter filtrierbar. Sie stehen an der Grenze der mikroskopisdien Sichtbarkeit. In die Gruppe der pleuropneumonie-ähnlichen Organismen (PPLO = pleuropneumonia like organisms) werden audi Formen gestellt, von denen nicht bekannt ist, ob sie als Krankheitserreger eine Rolle spielen können. Derartige Organismen wurden von L a i d I a w und E 1 f o r d 1 1936 aus Londoner Abwasser isoliert und von S e i f f e r t 2 1937 aus Komposterde. In den letzten Jahren wurden eine größere Anzahl verschiedener PPLO-Arten aus dem Genitaltrakt und der Konjunktiva des Menschen und aus dem Genitaltrakt von Rindern und Hunden isoliert 3.

Bei allen diesen Organismen ist ihre Stellung im System unklar. Von D i e n e s und G ö n n e r t sowie von R u s k a und P o p p e 4 werden sie mit den großen Virusarten der Lymphogranuloma-Psittacose-Gruppe in Zusammenhang gebracht 5, andererseits läßt die Ent-deckung der L-Formen bei den Bakterien auch einen Anschluß in dieser Richtung als möglidi erscheinen 6> Über die Vermehrungsweise der PPLO bestehen nur Untersuchungen, die sich auf die mikroskopische Beobachtung stützen8>9. K a n d i e r 1 1 sah bei seinen licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen multi- und unipolare Sprossung und in flüssigem Nährmedium das Auftreten von traubigen Verbänden. Danadi besteht eine Art Entwicklungs-cyclus. Naturgemäß sind diese Untersuchungen sehr schwierig, da die Teilchengröße an der Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops liegt.

Die Absicht der im Folgenden kurz zusammenge-faßten Untersuchungen war, durch Anwendung

verschiedener, voneinander unabhängiger Methoden die Vermehrungsweise eines Angehörigen dieser Gruppe näher zu untersuchen, insbesondere zu klä-ren, ob eine Vermehrung durch Zweiteilung erfolgt oder ein anderer Vermehrungscyclus vorliegt.

Für alle Untersuchungen wurde der von L a i d -1 a w und E 1 f o r d 1 aus dem Londoner Abwasser

gezüchtete Stamm A verwendet *. Die Versuche wur-den mit einem einheitlichen Klon durchgeführt, der durch Abimpfen aus einer Einzelkultur gewonnen war. Das Nährmedium hatte folgende Zusammen-setzung: 2% Bakteriocym (von der Firma Blaes & Co., München), 20% Pferdeserum mit 10% Hefekoch-

, " n Fußnoten 1 bis 11 s. Seite 383. * Der Stamm wurde mir von Herrn Dr. K. L i e b e r -

m e i s t e r zur Verfügung gestellt, dem idi dafür herz-lidi danke.

V E R M E H R U N G S W E I S E B E I M A - O R G A N I S M U S 3 8 3

saft, 100 U/ml Penicillin. Zunächst wurde ein Test ausgearbeitet, der es ermöglicht, die Keimzahl mit einer Streuung om von 20% zu bestimmen. Das Ver-fahren bestand darin, daß 0,2 ccm der zu bestim-menden Keimverdünnung mit 2 ccm etwa 45° C warmem flüssigen Nähragar vermischt und auf eine Agar-Platte ausgegossen wurden. Nach einer Bebrü-tung von 2—3 Tagen bei 37° wird die Zahl der Kulturen im Plattenmikroskop ausgezählt.

Mit dieser Testmethode wurde geprüft, ob nach Zentrifugierung der Keime und Wiederaufschwem-mung die ursprüngliche Keimzahl wieder erreicht werden kann. Bei Zentrifugierung in Bouillon oder physiologischer Kochsalz-Lösung können nur 10 bis 25% der ursprünglichen Keimzahl wiedergefunden werden. Vermutlich tritt eine Agglutination ein, die im Plattenkultur-Test eine Herabsetzung der Keim-zahl vortäuscht. Nach Zentrifugierung in 0,25-m. Sac-charose-Lösung in m/100-Phosphatpuffer vom pn 8 wurde die Keimzahl um höchstens 25%, meist weni-ger, verringert. Damit war eine Grundlage gegeben, um Größenbestimmungen durch Zentrifugierung nach der Methode von B e c h h o 1 d und S c h l e -s i n g e r 1 0 durchzuführen. Unter der Annahme, daß die Dichte etwa 1,25 beträgt und die Teilchen kugel-förmig sind, ergibt sich eine Größenschwankung zwischen 200 und 700 m/i für den Durchmesser. Die-ser erhebliche Unterschied der Größe der Keime in dem untersuchten Klon des A-Organismus spricht be-reits gegen eine Vermehrung durch Zweiteilung. Um die Frage, in welcher Weise der A-Organismus sich vermehrt, näher zu untersuchen, wurden 5 verschie-dene Verfahren angewandt.

1. Durch Zentrifugierung wurden die kleinsten Keime von den größeren abgetrennt. Die kleinsten wurden dann für sich in flüssiger Kultur abgeimpft und mit dem Test die Zunahme der Keimzahl im Laufe der Zeit verfolgt. Nach einer Latenzzeit, die zwischen 15 und 30 Stdn. variieren kann und in der die Keimzahl konstant bleibt, findet innerhalb 2 Stdn. eine Vermehrung auf das 20-fache statt. Nach meh-

1 P. O. L a i d 1 a w u. W. J. E 1 f o r d , Proc. Roy. Soc. [London] Ser. B 120, 293 [1936].

2 G. S e i f f e r t , Zbl. Bakteriol., Parasitenkunde In-fektionskrankh., Abt. I, Orig. 139, 337 [1937],

3 D. G. E d w a r d , Brit. J. vener. Disease 28, 89 [1952]; D. G. E d w a r d u. W. A. F i z g e r a l d , J. gen. Microbiology 5, 566 [1951].

4 H. R u s k a u. K . P o p p e , Z. Naturforschg. 2 b, 35 [1947],

5 Vgl. K. L i e b e r m e i s t e r , Z. Naturforschg. 8 b, 757 [1953].

Zeit Gefundene Keimzahlen [h]

0 1, 3, 4, 9, 6, 4, 5, 7, 10, 6 24 4, 5, 9, 12, 6, 9, 2, 10, 8, 5 26 4, 300, 70, 3, 500, 350, 80, 6, 5, 200 27,5 350, 400, 900, 750, 1000, 300, 100, 200 29 400, 600, 1100, 450, 700, 380 31 1000, 5000, 10 000, 300, 50000, 8000

Tab. 1. Vermehrung der Keimzahlen.

reren Stdn. kann sich eine zweite Stufe anschließen, bei der wieder eine Zunahme auf das 10—20-fache beobachtet wird.

2. Nach diesem Ergebnis war zu vermuten, daß die kleinen Formen zu den größeren heranwachsen,, die dann wieder in viele Keime zerfallen. Größen-bestimmungen durch Zentrifugierung vor und nach einer Vermehrungsstufe gaben eine Bestätigung die-ser Vorstellung, weil vor der Wachstumsstufe eine Abnahme der kleinsten Keime und nachher eine Ver-mehrung gefunden werden konnte. Allerdings war die Abnahme der Keime vor der Wachstumsstufe nicht regelmäßig reproduzierbar. Es muß berücksich-tigt werden, daß die Abtrennung verschiedener Grö-ßenordnungen durch Zentrifugierung nur sehr un-vollkommen ist.

3. Die klarsten Ergebnisse konnten mit der 3. Me-thode erzielt werden. Hierbei wurden die Keime so stark verdünnt und auf einzelne Kulturröhrchen ab-geimpft, daß in jedem Röhrchen nur wenige Keime vorhanden waren. Wenn die Vermehrung durch Ver-dopplung erfolgt, so sollte man erwarten, daß all-mählich die ursprüngliche Keimzahl sich verdoppelt, dann vervierfacht und so weiter. Das wirklich erhal-tene Ergebnis zeigt die Tab. 1.

Nach einer Latenzzeit von 26 Stdn. findet in ein-zelnen Röhrchen eine Vermehrung auf das 50—100-fache statt, die nach weiteren 1,5 Stdn. in allen Röhr-chen eingetreten ist. Im Laufe von weiteren 3 bis

8 L. D i e n e s , J. infect. Disease 65, 24 [1939]. 7 E. K l i e n e b e r g e r , Bacteriol. Rev. 15, 77 [1951], 8 J. C. G. L e d i n g h a m , J. Pathol. Bacteriol. 37, 393

[1933]. 9 E. K l i e n e b e r g e r , J. of Hyg. 40, 204 [1940], 10 H. B e c h h o l d u. M. S c h l e s i n g e r , Biochem.

Z. 236, 387 [1931]. 11 G. K a n d 1 e r , H. K a n d 1 e r , Arch. Mikrobiol. 21,

178 [1934]; G. K a n d i e r , H. K a n d i e r u. O. H u -b e r , Arch. Mikrobiol. 21, 202 [1954],

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5 Stdn. beginnt die nächste Wachstumsstufe, die in einzelnen Röhrchen wieder Werte zwisdien dem 50-und 100-fadien erreicht.

4. Die Tatsache, daß die A-Organismen in der Größenordnung der Lichtwellenlänge liegen, ermög-licht es, den stufenweisen Zerfall auf optischem W7ege zu verfolgen. Teilchen über Lichtwellenlänge streuen das Licht stärker und bevorzugt nach vorn als die gleiche Gewichtsmenge kleinerer Teilchen. Wie nach Methode 1 und 2 wurden zunächst die kleinsten Teilchen abzentrifugiert und in Kultur-lösung abgeimpft. Dann wurde die Streuung im Laufe der Zeit verfolgt mit einer Apparatur, die die Messung des Streulichts unter verschiedenen Winkeln gestattet *. Abb. 1 zeigt das Ergebnis der Messungen unter einem Winkel von 15°. Bei Be-ginn der Messung nach 25 Stdn. der Bebrütung er-folgt ein Anstieg, der nach 26 Stdn. sein Maximum erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt muß der Zerfall der größeren Teilchen, die nach vorn streuen, in kleinere, die mehr nach der Seite streuen, stattfinden, weil nun ein Abfall der Streuintensität bis zur 32. Stde. erfolgt, worauf ein neuer Anstieg einsetzt. Dieser erreicht zur 34. Stde. sein Maximum. Noch zwei weitere derartige Stufen sind erkennbar. Diese Cyclen treten auch noch auf, wenn die Keimzahl nicht mehr wesentlich zunimmt und Zuwachs- und Absterberate ungefähr gleich sind.

5. Schließlich wurden die Größenveränderungen auch elektronenmikroskopisch verfolgt. Formen, die gerade im Zerfall oder in der Teilung sind, konnten allerdings mit dem Elektronenmikroskop nidit auf-gefunden werden. Es war aber auch hier die Ver-änderung von einer vorzugsweise auftretenden Teil-chengröße von 150 m,u Durchmesser zu Teilchen mit einem Durdimesser von 600 mu kurz vor dem Zerfall feststellbar. Ein Beispiel für das Aussehen der Orga-nismen im Elektronenmikroskop gibt Abb. 2** . Für weitere Bilder von PPLO vergleiche L i e b e r m e i -s t e r 5. Das Verhältnis der Durchmesser der kleinen und der großen Formen beträgt 4, das Volumenver-hältnis demnach 64. Diese Verhältnisse stimmen etwa mit der Zerfallsrate überein, wie sie nach der 3. Methode bestimmt wurde.

Alle diese Versuche sprechen dafür, daß der A-Or-ganismus von einer kleinen Form zu einer großen heranwächst, die dann plötzlich in viele Teilchen zer-fällt. Eine gewisse Diskrepanz im Grad der Vermeh-

Diese Messungen wurden genieinsam mit Herrn Dipl.-Physiker R. B u r b e r g durchgeführt, der die Apparatur im Institut entwickelt hat.

lung scheint zwischen Methode 1, die auf das 10- bis 20-fache führt, und Methode 3, die das 5 0 - 1 0 0 -fache ergibt, zu bestehen. Es ist aber zu berücksidi-tigen, daß bei Methode 1 bereits eine hohe Konzen-tration der Keime vorliegt, bei der vermutlich bereits eine Wachstumshemmung im Vergleich zu Kulturen besteht, die nur wenig Keime enthalten. Aus dem gleichen Grunde kann auch der Abstand zwischen den Zerfallsperioden bei der Lichtstreuungsmethode größer sein als bei Methode 3, denn audi die Licht-streuungsmethode erfordert eine sehr hohe Keimzahl pro ccm.

25 3o J5 Zo <5 50 S S -

Abb. 1. Änderung der Streuintensität des Lichtes im Winkel von 15° zur Einfallsrichtung bei einer wachsen-

den Kultur von A-Organismen.

Die Ergebnisse geben eine gewisse Stütze für die Vermutung, daß diese Organismen eine Beziehung zu den Viren der Lvmphogranuloma-Psittacose-Gruppe haben, bei denen ebenfalls ein Entwicklungs-cyclus in der Vermehrung beobachtet wurde. Zur Frage der Beziehung zu den L-Formen vergleiche L i e b e r m e i s t e r 5 .

Ergänzend mag noch erwähnt werden, daß die A-Organismen nach Bestimmung im Beckman-Spek-trophotometer und auf Grund des N : P-Verhältnisses einen Nucleinsäure-Gehalt über 20% haben. Bei der Bestimmung des Nucleinsäure-Gehalts darf man allerdings nicht den Fehler begehen, die Organismen nach Waschung in destilliertem Wasser zu verwen-den, weil in diesem Falle die Nucleinsäure zum gro-ßen Teil in Lösung geht. Damit stimmt überein, daß die Keimzahl der lebensfähigen Organismen nach dieser Behandlung sehr stark herabsinkt. Nach vor-läufiger Bestimmung nach der Methode von Thann-hauser besteht die Nucleinsäure etwa zur einen Hälfte aus Desoxvribonucleinsäure und zur anderen aus Ribonucleinsäure.

Die Arbeit wurde auf Anregung und unter Leitung von Herrn Prof. H. F r i e d r i c h - F r e k s a durch-geführt.

** Abb. 2 s. Tafel S. 404 a.