Einführung in die ChromatographieVorlesung WS 2007/2008

VAK 02-03-5-AnC2-1

Johannes Ranke

Einführung in die Chromatographie – p.1/36

Programm

23. 10. 2007 Trennmethoden im Überblick und Geschichte der Chromatographie30. 10. 2007 Thermodynamik der Stofftrennung06. 11. 2007 Stofftransport und intermolekulare Wechselwirkungen13. 11. 2007 Präparative Chromatographie und Dünnschichtchromatographie20. 11. 2007 Kenngrößen für die Säulenchromatographie27. 11. 2007 Gaschromatographie: Probenaufgabe und Trennsäulen04. 12. 2007 Gaschromatographie: Detektoren und Quantifizierung11. 12. 2007 Flüssigkeits-Chromatographie: Trennsäulen und Laufmittel18. 12. 2007 Flüssigkeits-Chromatographie: Gradienten und Detektion08. 01. 2008 Charakterisierung von Analyten in der Chromatographie15. 01. 2008 Ionenchromatographie22. 01. 2008 Gelpermeationschromatographie29. 01. 2008 Trenntechniken für die Probenvorbereitung05. 02. 2008 Beispiele aus Akademie und Praxis

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Literatur

J. Silberring et al.Size-exclusion chromatography. In: Chromatography, 6th editionJournal of Chromatography Library, Vol 69AElsevier, Amsterdam (2004).

Polymer LaboratoriesKursunterlagenVarian (2007).

ViskothekKursunterlagenViskothek (2007).

C. F. PooleThe Essence of ChromatographyElsevier, Amsterdam (2003).

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Überblick

Allgemeines und Theorie

Einführung in die Chromatographie – p.4/36

Überblick

Allgemeines und Theorie

Detektion und Kalibration

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Allgemeines zurGel-Permeations-Chromatographie

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Definition

Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) oderauch Größenausschluss-Chromatographie (englischSize Exclusion Chromatography, SEC) trennt gelösteMoleküle nach ihrem hydrodynamischen Volumenauf.

Einführung in die Chromatographie – p.6/36

Definition

Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) oderauch Größenausschluss-Chromatographie (englischSize Exclusion Chromatography, SEC) trennt gelösteMoleküle nach ihrem hydrodynamischen Volumenauf.

Wird mit einem wässrigen Laufmittel gearbeitet, soverwendet man auch häufig den BegriffGelfiltrations-Chromatographie (GFC)

Einführung in die Chromatographie – p.6/36

Definition

Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) oderauch Größenausschluss-Chromatographie (englischSize Exclusion Chromatography, SEC) trennt gelösteMoleküle nach ihrem hydrodynamischen Volumenauf.

Wird mit einem wässrigen Laufmittel gearbeitet, soverwendet man auch häufig den BegriffGelfiltrations-Chromatographie (GFC)

Die stationäre Phase besteht im Allgemeinen auseinem hochvernetzten Polymer.

Einführung in die Chromatographie – p.6/36

Ziel

Im Unterschied zu den meisten anderenchromatographischen Analysemethoden ist dasHauptziel der GPC zumeist die Charakterisierungder Größenverteilung in einer Mischung anhand derGrößen

Viskosität η

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Ziel

Im Unterschied zu den meisten anderenchromatographischen Analysemethoden ist dasHauptziel der GPC zumeist die Charakterisierungder Größenverteilung in einer Mischung anhand derGrößen

Viskosität η

Radius RG, RH

Einführung in die Chromatographie – p.7/36

Ziel

Im Unterschied zu den meisten anderenchromatographischen Analysemethoden ist dasHauptziel der GPC zumeist die Charakterisierungder Größenverteilung in einer Mischung anhand derGrößen

Viskosität η

Radius RG, RHMittlere Molmasse MN,MW

Einführung in die Chromatographie – p.7/36

Ziel

Im Unterschied zu den meisten anderenchromatographischen Analysemethoden ist dasHauptziel der GPC zumeist die Charakterisierungder Größenverteilung in einer Mischung anhand derGrößen

Viskosität η

Radius RG, RHMittlere Molmasse MN,MW

Aus den Verhältnissen dieser Größen wird aufPolydispersität und Konformation geschlossen.

Einführung in die Chromatographie – p.7/36

Anwendungsbereich

Polymer Laboratories

Einführung in die Chromatographie – p.8/36

Typische Anwendungen

Charakterisierung von Polymeren:

Polysaccharide

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Typische Anwendungen

Charakterisierung von Polymeren:

Polysaccharide

Proteine

Einführung in die Chromatographie – p.9/36

Typische Anwendungen

Charakterisierung von Polymeren:

Polysaccharide

Proteine

Kunststoffe (z.B. PE, PET)

Einführung in die Chromatographie – p.9/36

Typische Anwendungen

Charakterisierung von Polymeren:

Polysaccharide

Proteine

Kunststoffe (z.B. PE, PET)

Weitere Anwendungen umfassen dieProbenvorbereitung, Entsalzung undphysikochemische Studien.

Einführung in die Chromatographie – p.9/36

Aufbau

Polymer Laboratories

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Trennsäulen

HochvernetztePolymerkügelchen,Partikelgrößen 5 bis15 µm

Satz von SinglePorosity Säulenoder Mixed BedSäulen

Alternativ: monolithi-sche Trennsäulen

Wikipedia

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Typische Mobile Phasen

Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oderSäurezusatz

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Typische Mobile Phasen

Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oderSäurezusatz

Toluol (Polystyrol, Polybutadien,Polydimethylsiloxan)

Einführung in die Chromatographie – p.12/36

Typische Mobile Phasen

Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oderSäurezusatz

Toluol (Polystyrol, Polybutadien,Polydimethylsiloxan)

Tetrahydrofuran (Celluloseacetat,Polymethacrylat, PVC)

Einführung in die Chromatographie – p.12/36

Typische Mobile Phasen

Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oderSäurezusatz

Toluol (Polystyrol, Polybutadien,Polydimethylsiloxan)

Tetrahydrofuran (Celluloseacetat,Polymethacrylat, PVC)

Um die Probe zu lösen, wird teilweise bei erhöhtenTemperaturen gearbeitet.

Einführung in die Chromatographie – p.12/36

Geschichte der GPC

40er Trennungen per Größenausschluss mitKohle und Zeoliten

1955 Größenausschlusschromatographie mitStärke

Lindqvist undStorgård

1958 Einführung dextranbasierter Säulen mitdefinierter Porengröße (Sephadex)

Flodin und Porath

1961 Agar als Säulenmaterial Polson1962 Einführung von vernetztem Polyacrylamid

(Biogel P)Hjertén und Mos-bach

Einführung in die Chromatographie – p.13/36

Mechanismus

Ausschluss

Polymer Laboratories

Einführung in die Chromatographie – p.14/36

Mechanismus

Ausschluss

Selektive Permeation

Polymer Laboratories

Einführung in die Chromatographie – p.14/36

Mechanismus

Ausschluss

Selektive Permeation

Volle Permeation

Polymer Laboratories

Einführung in die Chromatographie – p.14/36

Weitere Mechanismen

Ionenausschluss

Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004

Einführung in die Chromatographie – p.15/36

Weitere Mechanismen

Ionenausschluss Adsorption

Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004

Einführung in die Chromatographie – p.15/36

Weitere Mechanismen

Ionenausschluss Adsorption Größenausschluss

Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004

Einführung in die Chromatographie – p.15/36

Weitere Mechanismen

Ionenausschluss Adsorption Größenausschluss Abbau

Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004

Einführung in die Chromatographie – p.15/36

Trennung

Große Moleküle könnennicht in die Poren ein-dringen, und eluierenzuerst.

Kleinen Molekülen stehtein größerer Porenraumzur Verfügung, so dasssie später eluieren.

Polymer Laboratories

Einführung in die Chromatographie – p.16/36

Detektion und Kalibration in derGel-Permeations-Chromatographie

Einführung in die Chromatographie – p.17/36

Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)

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Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)

UV

Einführung in die Chromatographie – p.18/36

Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)

UV

Viskosität

Einführung in die Chromatographie – p.18/36

Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)

UV

Viskosität

Lichtstreuung

Einführung in die Chromatographie – p.18/36

Einfache Kalibration

KonzentrationsabhängigerDetektor:

RI

UV

Wikipedia

Einführung in die Chromatographie – p.19/36

Kalibration mit mehreren Standards

Mirko Weinhold, UFT Bremen

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Einfache Kalibration

Standards definierter Molekülgröße notwendig

Sigma Aldrich Website

Einführung in die Chromatographie – p.21/36

Einfache Kalibration

Standards definierter Molekülgröße notwendig

Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere

Einführung in die Chromatographie – p.21/36

Einfache Kalibration

Standards definierter Molekülgröße notwendig

Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere

Kostengünstige Apparatur

Einführung in die Chromatographie – p.21/36

Einfache Kalibration

Standards definierter Molekülgröße notwendig

Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere

Kostengünstige Apparatur

Genaue Konzentration ist unkritisch

Einführung in die Chromatographie – p.21/36

Einfache Kalibration

Standards definierter Molekülgröße notwendig

Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere

Kostengünstige Apparatur

Genaue Konzentration ist unkritisch

Sehr gute Reproduzierbarkeit

Einführung in die Chromatographie – p.21/36

Das Chromatogramm als Histogramm

Für jede Scheibe i kanndie Molekülgröße Mi

aus der Retentionszeit,und die Anzahl derMoleküle Ni aus derSignalhöhe bestimmtwerden.

Polymer Laboratories

Einführung in die Chromatographie – p.22/36

Die mittlere Molmasse

Zahlenmittel der Molmasse:

MN =

∑

NiMi∑

Ni

Einführung in die Chromatographie – p.23/36

Die mittlere Molmasse

Zahlenmittel der Molmasse:

MN =

∑

NiMi∑

Ni

Gewichtsmittel der Molmasse:

MW =

∑

NiM2i

∑

NiMi

Einführung in die Chromatographie – p.23/36

Die mittlere Molmasse

Zahlenmittel der Molmasse:

MN =

∑

NiMi∑

Ni

Gewichtsmittel der Molmasse:

MW =

∑

NiM2i

∑

NiMi

Polydispersität d = MwMN

Einführung in die Chromatographie – p.23/36

Beispiele

MW = 200000MN = 200000d = 1

MW = 200000MN = 60000d = 3, 33

Mirko Weinhold

Einführung in die Chromatographie – p.24/36

Molekülformen

Dissertation Pascal Pfefferkorn

Einführung in die Chromatographie – p.25/36

Kalibrationskurven

Kursunterlagen Viskothek

Einführung in die Chromatographie – p.26/36

Intrinsische Viskosität

[η] =ηsp

c

bei unendlicher Verdünnung. Die spezifischeViskosität ηsp der Lösung von Makromolekülen oderPartikeln mit der Konzentration c ist

ηsp =η − η0

η

wobei η0 die Viskosität des Lösungsmittels ist.

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Einsteins Viskositätsgesetz

Nach Einstein (1905) gilt folgende Näherung fürharte, sphärische Partikel

ηsp = 2.5 Φ

Φ ist der Volumenanteil der Makromoleküle in derLösung.

Einführung in die Chromatographie – p.28/36

Einsteins Viskositätsgesetz

Nach Einstein (1905) gilt folgende Näherung fürharte, sphärische Partikel

ηsp = 2.5 Φ

Φ ist der Volumenanteil der Makromoleküle in derLösung. Daraus folgt

[η] =ηsp

c=2.5

ρ

wenn ρ die Dichte der Partikel in Lösung ist.

Einführung in die Chromatographie – p.28/36

Flory-Fox Gleichung

Für zufällig geknäuelte Polymere gilt

M[η] = 63/2Φ0RG

Φ0 ist die Flory-Fox Konstante, und RG derGyrationsradius des Makromoleküls.

Einführung in die Chromatographie – p.29/36

Flory-Fox Gleichung

Für zufällig geknäuelte Polymere gilt

M[η] = 63/2Φ0RG

Φ0 ist die Flory-Fox Konstante, und RG derGyrationsradius des Makromoleküls.

Hier kann die Dichte ρ eingesetzt werden:

[η] = 63/2Φ04π

3

3R3G

4πM=1.67

ρ

Einführung in die Chromatographie – p.29/36

Universelle Kalibration

Kursunterlagen Viskothek

Einführung in die Chromatographie – p.30/36

Universelle Kalibration

Bei bekannter Konzentration und Trennung strengnach Größenausschluss:

Kalibration für das Molekulargewicht unabhängigvom chemischen Typ des Polymers

Einführung in die Chromatographie – p.31/36

Universelle Kalibration

Bei bekannter Konzentration und Trennung strengnach Größenausschluss:

Kalibration für das Molekulargewicht unabhängigvom chemischen Typ des Polymers

und unabhängig vom Verzweigungsgrad

Einführung in die Chromatographie – p.31/36

Lichtstreudetektion

Verdampfungslichtstreuung

Einführung in die Chromatographie – p.32/36

Lichtstreudetektion

Verdampfungslichtstreuung

Kleinwinkelstreuung

Einführung in die Chromatographie – p.32/36

Lichtstreudetektion

Verdampfungslichtstreuung

Kleinwinkelstreuung

Streuung bei 90 °

Einführung in die Chromatographie – p.32/36

Winkelabhängigkeit

Kursunterlagen Viskothek

Einführung in die Chromatographie – p.33/36

Dreifachdetektion

Kursunterlagen Viskothek

Einführung in die Chromatographie – p.34/36

Response-Verhalten

RI-Detektor

A = KRIdn

dcc

ViskometerA = KVisc [η] c

Lichtstreuung

A = KLS MW

(

dn

dc

)2

c

Einführung in die Chromatographie – p.35/36

Response-Verhalten

RI-Detektor

A = KRIdn

dcc

ViskometerA = KVisc [η] c

Lichtstreuung

A = KLS MW

(

dn

dc

)2

c

Einführung in die Chromatographie – p.35/36

Response-Verhalten

RI-Detektor

A = KRIdn

dcc

ViskometerA = KVisc [η] c

Lichtstreuung

A = KLS MW

(

dn

dc

)2

c

Einführung in die Chromatographie – p.35/36

Dreifachdetektion

Unter optimalen Bedingungen bekommt man

Absolutes Molekulargewicht

Einführung in die Chromatographie – p.36/36

Dreifachdetektion

Unter optimalen Bedingungen bekommt man

Absolutes Molekulargewicht

Verzweigungsgrad

Einführung in die Chromatographie – p.36/36

Dreifachdetektion

Unter optimalen Bedingungen bekommt man

Absolutes Molekulargewicht

Verzweigungsgrad

Polydispersität

Einführung in die Chromatographie – p.36/36