VU 771.119 und 771.314 Validierung von Analysenmethoden

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Validierung von AnalysenmethodenValidierung von Analysenmethoden

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GrundlagenGrundlagen

Analytische Ergebnisse haben oft weitreichende Konsequenzen.

Die Untersuchungen müssen demnach mit nachweislich geeigneten Methoden durchgeführt werden.

Die Validierung ist der Nachweis der Gebrauchstauglichkeit.

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Was bedeutet ValidierungWas bedeutet Validierung

Validierung einer Analysenmethode beinhaltet: Festlegung der analytisch/chemischen Anforderungen Bestimmung der Methodenparameter Überprüfung, dass die Methode die Anforderungen erfüllt Angabe der Gültigkeit

EN/IEC 17025: „Eine durch Überprüfung erlangte Bestätigung, dass alle Voraussetzungen für eine beabsichtigte Anwendung erfüllt sind“

„Ein Prozess der feststellt, dass eine Methode geeignet ist“

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Ziel der ValidierungZiel der Validierung

Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten)

Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der

Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung)

Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen?

Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

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Ziel der ValidierungZiel der Validierung

Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten)

Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der

Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung)

Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen?

Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

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3 Milestones der ISO/IEC 170253 Milestones der ISO/IEC 17025

Validierung (validation)– Basisvalidierung (für in-house Methoden und nicht normierte

bzw. von der Norm abweichende Verfahren)– Bestätigung (im Falle von über ÖNORM, ISO, EN, DIN etc.

normierten Verfahren)

Rückführbarkeit der Analysenergebnisse (tracebility) Unsicherheit der Analysenergebnisse (uncertainty)

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Wozu?Wozu?

Sicherung der Qualität der Analysenergebnisse (im eigenen Interesse)

Voraussetzung für Akkreditierung Juristisch abgesichert Forderung der Auftraggeber

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Wann?Wann?

Entwicklung einer Methode Änderung einer Methode Wenn Kontrollunterschungen zeigen, daß sich die

Methode verändert hat Wenn eine anerkannte Methode in einer neuen

Umgebung eingearbeitet werden soll.

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ChecklistChecklist

Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt)

– Arbeitsbereich / linearer Bereich)– Empfindlichkeit– Selektivität, Spezifität– Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze

Eigenschaften des Analysenresultates– Rückführbarkeit (z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI)– Unsicherheit, unter Berücksichtigung von:

• Wiederfindung

• Robustheit

• Wiederholbarkeit

• Reproduzierbarkeit

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ChecklistChecklist

Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt)

– Arbeitsbereich / linearer Bereich)– Empfindlichkeit– Selektivität, Spezifität– Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze

Eigenschaften des Analysenresultates– Rückführbarkeit (z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI)– Unsicherheit, unter Berücksichtigung von:

• Wiederfindung

• Robustheit

• Wiederholbarkeit

• Reproduzierbarkeit

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0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 20 40 60 80 100 120

NWG

BG

Arbeitsbereich

ArbeitsbereichArbeitsbereichWird durch technische und praktische Erwägungen festgelegt und durch die Validierung bestätigt. (Meist bestimt durch den niedrigsten und höchsten Kalibrations Standard)

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Empfindlichkeit (sensitivity)Empfindlichkeit (sensitivity)

Steigung der Kalibrationsgeraden Differenz in der Analytkonzentration, die der kleinsten

detektierbaren Signaldifferenz entspricht

Ein Maß für die Signalauflösung eines Verfahrens.

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Selektivität/SpezifitätSelektivität/Spezifität

Spezifität bedeutet 100% Selektivität

Die IUPAC empfiehlt diesen Begriff nicht zu verwenden, weil praktisch keine Methode spezifisch ist.

Selektivität bedeutet bis zu welchem Ausmaß eine Methode geeignet ist, einen Analyten in einer Matrix ohne Störungen der anderen Komponenten zu bestimmen.

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S E L E K T I V I T Ä T

WägenLC

LC-DAD

LC/GC/CE-ICP-MSNAA

LC-MS-MS-MS

GC-MS-MSGC GC-MS

Photometrie

ICP-AES, ICP-MS, AAS

SelektivitätSelektivität

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RobustheitRobustheit

Beeinflussung der Leistungsfähigkeit bei (unvermeidlich) kleinen Änderungen bei der Durchführung des Analysenverfahrens.

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Nachweisgrenze (limit of detection)Nachweisgrenze (limit of detection)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)

Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (-Fehler = 50%).

Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist.

Blindwert

X0MeßwertXNG

Nachweisgrenze

50 %negativ

50 %positiv

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Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (-Fehler = 50%).

Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist.

Blindwert

X0MeßwertXNG

Nachweisgrenze

50 %negativ

50 %positiv

Vorgegebene Sicherheit3σ = 99.7%

=> NG = 3 x σ BW

Nachweisgrenze (limit of detection)Nachweisgrenze (limit of detection)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)

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ErfassungsgrenzeErfassungsgrenze(kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit (kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden kann – Untere Grenze für die Quantifiziernug eines Analyten)nachgewiesen werden kann – Untere Grenze für die Quantifiziernug eines Analyten)

Vorgegebene Sicherheit= 99.7%

=> EG = 2 x NG = 6 x σ BW

Um den -Fehler der Nachweisgrenze zu verringern, wurde die Erfassungsgrenze eingeführt. Sie stellt den Meßwert dar, bei dem der -Fehler gleich dem -Fehler ist. Damit entspricht die Erfassungsgrenze dem 2 fachen der Nachweisgrenze. Unter Zugrundelegung eines -Fehlers von 1% ist der Analyt auch hier, wie bei der Nachweisgrenze, mit einer Sicherheit von 99% nachgewiesen.

Blindwert

X0MeßwertXNG

Nachweisgrenze Erfassungsgrenze

XEG

= ß = 1%

ß-Fehler -Fehler

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Bestimmungsgrenze (limit of determination)Bestimmungsgrenze (limit of determination)(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers)innerhalb eines bestimmten Fehlers)

Die Analysenpräzision sollte über den gesamten Messbereich gleich groß sein. Die relative analytische Unpräzision (VB) nimmt mit sinkender Konzentration zu. Die BG entspricht jener Konzentration, ab der die geforderte Analysenpräzision (zumeist 33.3%) erfüllt ist.

0

20

40

60

80

100

120

140

Konzentration

Rel

. an

alyt

. Un

prä

zisi

on

VB

rel i

n %

33%

XB

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Bestimmungsgrenze (limit of determination)Bestimmungsgrenze (limit of determination)(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers)innerhalb eines bestimmten Fehlers)

Annähernd: BG ≈ 3.33 NG => BG = 10 x σ BW

Im Konzentrationsbereich der Bestimmungsgrenze wird die Anwesenheit des Analyten vorausgesetzt. Über das die Kalibrationsgerade umschliessenden Vertrauensband errechnet sich der Bestimmungsfehler ± VB. VB ist in der Arbeitsbereichsmitte am kleinsten und steigt mit zunehmender Entfernung von der Mitte. Es gilt BG = k* VB, näherungsweise auch BG = k * NG. Die Bestimmungsgrenze bezeichnet den Konzentrationswert, bei dem der relative Fehler erstmals die vorgegebene Schranke der Ergebnisunsicherheit unterschreitet. z.B. k=3 entsprechend 33,3%

f(x)

k * VB

VB

x

VB

BG

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Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode

Bestimmung erfolgt über das Blindwertrauschen (Blindwertstatistik)

=> Gültig für alle nicht kalibrierbare Methoden

=> Gute Annäherung für kalibrierbare Methoden

Instrumenteller Blindwert (=> instrumentelle NG) Methodenblindwert (=> NG der Methde)

Lineare Kalibrierfunktion (ohne Blankkorrektur) :

y=kx + d sbl ... Standardabweichung des Blanksignals

yNWG = Ybl + 3 sbl NWG = (yNWG – d)/k

yBG = Ybl + 10 sbl BG = (yBG – d)/k

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Bestimmung von NG/EG/BG - Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBlindwertmethode

lineare Kalibration

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 2 4 6 8 10 12

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsi

tät

[cp

s]

lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

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lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

BW σ

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lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

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lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

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lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

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lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

6 x σ = EG

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lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

6 x σ = EG

EG

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lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5


Inte

nsi

tät

[cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

6 x σ = EG

EG

10 x σ = BG

BG

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Bestimmung über die KalibrationsgeradeBestimmung über die KalibrationsgeradeBestimmung erfolgt über die Kalibrationsgerade bei kalibrierbaren Methoden

(z.B. Mittels Software DIN Test©):

Ausreisserkontrolle + Statistik (t-Test...)

Bestimmung der NG/EG/BG über die Vertrauensbänder (Berechnung nach DIN 32645)

Nachteil der Berechnung: – Standards, aus denen die Kalibrationskurve erstellt wurde, müssen eigentlich

dieselbe Probenvorbereitungsprozedur wie die Proben durchlaufen, um einen dem Methodenblank entsprechende NG/BG und EG zu ergeben.

– Standards sollten äquidistant in der Nähe der NG liegen.– Bei nicht-linearer Kalibration: Gewichtung der Punkte

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Bestimmung über die KalibrationsgeradeBestimmung über die Kalibrationsgerade NG/EG/BG eines Verfahrens kann nicht aus einer einmaligen

Kalibrierung ermittelt werden

Bei einmaliger Kalibrierung dient die Berechnung der EG zur Überprüfung des unteren Arbeitsbereichsendes.

Das untere Arbeitsbereichsende ist nur dann statistisch abgesichet, wenn EG kleiner als die Konzentration des niedrigsten Standards ist.

Zur Ermittlung der EG aus der Kalibration wird mehrfach mit immer kleineren Standarkonzentrationen kalibriert.

Liegt die berechnete EG im Bereich der niedrigsten Standardkonzentration, wird das Ergebnis als EG genommen.

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Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN 3264532645x < NG: nicht nachgewiesen (mit NG), Höchstgehalt EG

NG < x < EG: nachgewiesen, nicht quantifizierbar

EG < x < BG: quanitifzierbar

EG < x < BG: Gehalt mit Konfidenzintervall bzw. Messunsicherheit

NG und BG müssen für jede Probenart (Matrix) separat ermittelt bzw. angegeben werden und dürfen sich nicht nur auf Standardlösungen beziehen.

Beim Vergleich der NG und BG verschiedener Laboratorien ist es wichtig, wie diese Parameter ermittelt worden sind und auf welche Matrix sich diese beziehen.

Für „worst case“-Betrachtungen von Werten unter der NG (n.n. Werte) kann gemäßDIN 32645 die Erfassungsgrenze als möglicher Höchstgehalt herangezogen werden.

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BeispielBeispiel

Bei der Bestimmung von Pb in Trinkwasser mittels ICP-MS wurde eine Kalibrationsgerade von

I[cps] = 75000 x c[ng g-1] (nach Blank Korrektur).

Für den Blank wurden nun folgende Intensitäten gemessen:

1520; 1340; 1850; 1250; 1670 cps

Berechnen Sie die NG/EG/BG dieser Messung.

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