Wirksamkeits- und Konzentrationsbestimmung durch Tierversuche

Wirksamkeits- und Konzentrationsbestimmung durch Tierversuche.

Von

B. L. van der Waerden in Leipzig.

Mit 4 Textabbildungen.

(Eingeffangen am 15. Mai 19~0.)

Um die biologische Wirksamkeit eines Prs zu priifen, oder um (wenn chemische Mittel etwa versagen) die Konzentration des Wirkungs- stoffes mit der eines anderen Pr~parats desselben Stoffes zu vergleiehen, wird das Priiparat in abgestuften Dosen einer Anzah] von Versuchstieren verabreicht und festgestellt, wieviel Tiere jeweiis in bestimmter Weise reagieren. Das primitivste Verfahren zur Auswertung der so erhaltenen Versuchsergebnisse besteht darin, da~ man festsetzt: Sobald ein bestimmter 1)rozentsatz (etwa 75 oder 80 %) yon den untersuchten Tieren reagiert, ist die ,,Normaldosis" erreicht. Dieses Verfahren ist abet nicht sehr genau und stS~t unter Umst~inden auf Schwierigkeiten, wenn zufallig bei einer grSl~eren Dosis einmal weniger Tiere reagieren als bei einer kleineren. Man hat daher genauere rechnerische Auswertungsverfahren ausgearbeitet.

Das Ziel dieser Abhandlung ist, die verschiedenen Rechenmethoden, die zur Auswertung der Versuehsergebnisse vorgeschlagen worden sind, auf ihre Genauigkeit hin zu untersuchen und die Bedingungen ihrer An- wendbarkeit anzugeben.

Um etwas Bestimmtes vor Augen zu haben, nehmen wit an, es handle sieh um einen Giftstoff, obwohl alle Rechnungen genau so verlaufen, wenn es sich um andere Stoffe mit spezifischer Wirkung, z.B. um Vitamine hande]t, deren Konzentration oder Wirksamkeit man bestimmen will. Die Wirkung des Giftes werde an einem bestimmten Merkmal beurteilt, z. B. ob das Versuchstier Kriimpfe kriegt oder innerhalb einer bestimmten Zeit stirbt. Welches Merkmal man zugrunde legt, ist Sache der Physiologen und fiir die matheraatische Behandlung gleichgiiltig; wit nehmen etwa an, es handle sich am den eintretenden Tod.

Des folgende w 1 enth~lt allgemeine Vorbemerkungen. Die w 2, 3, 4 behandeln verschiedene numerische Auswertungsverfahren.

w Wirkungskurven .

Die tSdliche Dosis eines Versuchstieres ist bei den meisten Giften starken Schwankungen unterworfen. Es gibt eine Dosis, wir nennen sie die 50 %-Dosis (DL 50), die durchschnittlich 50 % aller Versuchstiere tStet. Es kann abet Tiere geben, die eine fiinfmal grSi]ere Menge vertragen, oder auch so]che, die an einer fiinfmal kleineren Dosis schon sterben.

27*

390 B.L. vA~ i)nR WAE~DE~:

Solange man zu einer bestimmten Jahreszeit mit einem bestimmten Tiermaterial arbeitet, geh6rt zu jeder Giftdosis eine Mor t a l i t~ t : eine Zahl p, die angibt, wieviel Prozent der Versnehstiere im Dnrchsehnitt an 4er betreffen4en Dosis sterben. Bei der Dosis 0 wird die Mortalit~t 0 % betragen; bei zunehmender Dosenst~rke w~tehst sie immer starker an bis etwa 50 ~o, sodann wgehst sie inamer ]angsamer an, u m b e i sehr grogen Dosen den Weft 100 % zu erreiehen. Man kann aueh annehmen, dalt die Mortalit~t den Wert 100 ~o nieht erreieht, sondern sieh nut diesem Wert unbesehr~nkt n~hert; jedoch kommt das praktisch auf 4asselbe hinaus, als wenn der Weft 100 ~ wirklieh erreicht wird. Stellt man die Mortalit~t p als Funktion der Dosis graphisch dar, so erhglt, man eine S-fSrmige Kurve, die W i r k u n g s k u r v e des betrachteten Giftes (Fig. 1).

iO0 -

1,0 p

Dzsa D0s~

Fig. 1. Wirkungskurve.

iO0

SO

P

+3o"

Fig, 2. Wirkm~gskurve in Logarithmen.

Es hat sich sowoh[ ftir die Zeichnung der Wirkungskurve als fiir ihre mathematische Behandlung als zweckmggig ergeben, auf der horizontalen Achse nicht die Dosen selbst, sondern ihre Logarithmen x abzutragen (Fig. 2). Der Vorteit ist namlich der, daS die logarithmische Wirkungs- kurve in den meisten Fgllen symmetrisch in bezug auf ihren Mittelpunkt ist: sie ni~hert sich rechts ebenso r~sch dem Endwert 100 ~o als links der Null. Dazu kommt noch der wiehtige praktische u dag einer Ande- rung der Konzentration des Giftes immer eine Paralldversehiebung der logarithmisehen Wirkungskurve entsprieht: ist ein Pr&parat z. B. zweimM konzentrierter als ein ancleres, so liegt seine Wirkungskurve um log 2 ~ 0,30 mehr naeh links. -- Wenn man sieh auf die ersten zwei oder drei Dezimal- stellen im Logarithmus besehrgnkt, maeht 4as Aufsuehen der Logarithmen ~ueh keine grol~e Miihe.

Die Mufigste Form der Wirkungskurve ist die no rma ie Wi rkungs - k u r v e , die in Fig. 2 dargesteilt ist. Sie ist eine ,,integrierte Gaugsche Fehlerkurve" und h~ngt yon zwei Konstanten ab:

die eine, ~, der L o g a r i t h m u s der 50%-Dos i s , bestimmt die Lage des Mittelpunktes der Kurve;

die an4ere, a, die S t r e u u n g 4er t 6 d l i e h e n Dosis , bestimmt die Breite der Kurve in dem Sinne, daS in einem Abstand 3 G links yore MitteI-

Wirksamkeits- und Konzentrationsbestimmung dureh Tierversuche. 391

punkt die dutch die Wirkungskurve dargestelRe Mortalit~t nahezu = 0 ist, wghrend sie im gleiehen Abstand rechts yore Mittelpunkt kaum yon 100 % zu unterseheiden ist. f i

Die normalen Wirkungskurven sind dadureh eharakterisiert, dal~ sie dureh eine bestimmte Deformation der p-Aehse in Geraden verwanclelt werden kSnnen. Die deformierte p-Skala ist in Fig. 3 ganz lblks c[argestellt. Sie wird erhalten, indem an Stelle yon F eine Gr613e y abgetragen wird, die naeh einem bestimmten Gesetz (vgl. die Tabelle am Sehlul3 der Arbeit, Spalten 2 und 3) yon -- c~ fiber 0 n a c h + ~ geht, wghrencl p yon 0 fiber 50 % naeh 100 % geht 1. In der xy-Ebene wird die Wirkungskurve zu einer Geraden mit der Gleiehung

x - - ~ = Y== a

Man nennt sie die W i r k u n g s g e r a d e (siehe Fig. 3).

g6 7&

56

P S~ 26

/

/

/ /

ff

/

t3 4z 5 I [ i 19t7

I 3 X

F i g . 3. W i r k t t ; i g s g e r a d c .

Zum Zeichnen einer experimentell bestimmten Wirkungsgeraden benutzt man zweckm~l~ig das l o g a r i t h m i s c h e W a h r s c h e i n l i c h k e i t s - p a p i e r yon Schleicher und Schiill (Diiren), Nr. 2971/2 A3, das so ein- gerichtet ist, dal3 man zu jedem Punkt (x, y) direkt die Dosis (deren Lo- garithmus x ist) und die Mortalit~t p (die nut yon y abhgngt) ablesen k~nn.

Der SchniRpunkt der Wirkungsgeraden mit der x-Achse ergibt direkt die 50%-Dosis bzw. deren Logarithmus ~0 wiihrend die Steigung der Geraden den Weft a bestimmt (siehe Fig. 3).

1 Mathematisch ist der Zusammenhang zwischen p und y durch

1 e -~ t2 d t

gegeben.

392 B.L. w~- DEU WAEUnE~:

Das Ziel aller Auswertungsmethoden ist die Bestimmung der 50%- I)0sis oder einer damit gleichwertigen Gr5ge, die zur Festlegung der Kon- zentration bzw. der Wirksamkeit eines Pr~parats gen~gt. Hat man dann zum Vergleich ein irgendwie geeiehtes Standardpr~parat, so weig man, dal~ die 50 %-Dosis eines gerade untersuehten Pr~parats dieselbe Giftmenge enth~lt (oder allgemeiner dieselbe Wirksamkeit hat) wie die 50 ~o-Dosis des Standardpriiparats.

Ist die 50 ~o-Dosis des Standardpri~parats zeitlieh konstant, so braueht man sie nur einmM zu bestimmen; ist abet die Giftempfindliehkeit der Tiere erhebliehen zeitliehen Sehwankungen unterworfen oder wird das Tiermaterial geweehselt, so mug man j edesmal die 50 ~o-I)osis des Standard- priiparats zugleieh mit der 50 ~o-Dosis des gerade untersuehten Pr~parats neu bestimmen.

Sofern ein Pri~parat sieh yore Standard nut dureh die Konzentration des Giftstoffs unterseheidet, mug seine Wirkungskurve oder Wirkungs- gerade parallel zur Wirkungskurve bzw. Wirkungsgeraden des Standard- priiparats sein. Der horizontal gemessene Abstand zwisehen den beiden Kurven oder Geraden ist dann gleieh item Logarithmus des umgekehrten u der Konzentrationen.

Etwas sehwieriger wird die Saehe bei solehen Priiparaten, deren Wirk- samkeit aueh bei gleieher Konzentration versehieden sein kann, wie es bei Impfstoffen u. dgl. hiiufig der Fall ist. Hier ist die Parallelitgt tier Wirkungs- geraden eine Arbeitshypothese, die man zugrunde legen wird, solange das Gegenteil nieht erwiesen ist. Die Hypothese bedeutet, dal] nieht nut die 50 %-Dosis des Pr~parats dieselbe Wirksamkeit hat wie die des Standard- priiparats, sondern (tag aneh jedes Vielfaehe der 50 %-Dosis g]eieh stark wirkt wie das entspreehende Vielfaehe yore Standardpriiparat.

Wenn im folgenden yon der ,,Dosis x" die Rede ist, ist diejenige Dosis gemeint, deren Logarithmus gleieh x ist.

An der Dosis x m5gen yon n Versuehstieren k sterben und/c am Leben

bleiben, wobei k -~/~ = n ist. Die experimentell gefundene H~ufigkeit des Sterbens ist also

k n

Sie ist ni~herungsweise, aber nieht genau gleieh der dutch die Wirkungs- kurve gegebenen Mortaliti~t i0, denn i0 h~ngt nur vonder Dosenstiirke, h aber aueh yon der zufMligen Auswahl der herangezogenen Versuehstiere ab. Zu mehreren Dosen xl, xe, �9 �9 xs mSgen in derselben Weise die Tier- zahlen nl, n2, �9 �9 n~, die Hgufigkeiten h~, h2, . . . , h~ gehSren. Die Auf- gabe ist, aus diesen beobaehteten Hgufigkeiten die Gr5ge ~, den Logarith- mus der 50 ~o-Dosis, mSglichst genau zu bestimmen.

Wirks~mkeits- und Konzentrationsbestimmung durch Tierversuche. 393

w 2. Die Fliichenmethode (Methode ~on B e h r e n s und Kiirber) .

Diese Methode wurde yon W i r t h 2 zuerst in die Psyehophysik, y o n Behrens und Kgrbe r 8 in die Pharmakologie eingefiihrt. Sie hat vor anderen Methoden den u da~ sie sehr wenig Rechnung erfordert. Die Normalitgt der Wirkungskurve wird bei ihr nicht vorausgesetzt; die Wirkungskurve muir nut bei 0 % anfangen und bis 100 % aufsteigen. Ist die Wirkungskurve symmetrisch, so liefert die Methode direkt die 50 %- Dosis; ist sie es nieht, so ergibt das Verfahren start dessen eine ,,mittlere tSdliche Dosis", die sich um eine Kleinigkeit yon der 50%-Dosis unterscheiden kann, abet ebensogut brauehbar ist wie diese.

Die verwendeten Tierzahlen kSnnen bei dieser Methode ruhig klein sein; sogar bei nur eindm Tier je Dosis ist die Methode anwendbar, wenn auch ihre Genauigkeit dann naturgemi~l~ kleiner wird. Erforderlich ist aber, da$ die Dosen nicht allzuweit auseinander liegen. Am praktischsten ist es, wenn die Dosen ungef~hr eine geometrische Reihe, ihre Logarithmen somit eine arithmetische Reihe bilden. Die Differenz der letzteren Reihe mul~ klein gegen die halbe Breite 3 ~ der Wirkungskurve sein. ErforderIich ist weiter, da$ die Reihe tier Dosen nach beiden Seiten soweit fortgesetzt wird, daI~ man annehmen kann, da$ bei noch weiterer Fortsetzung der Reihe die n~chstgrSSere Dosis fast 100% MortaIit/~t, die n/~chstkleinere Dosis fast 0 % Mortalit/it ergeben wiirde.

B e h r e ns und K ar b e r haben urspriinglich die Rechenmethode auf die Dosen selbst angewandt. Ich mSchte abet vorschlagen, sie (mit Gaddum) lieber auf die Logarithmen tier Dosen anzuwenden, da die Symmetrie der Wirkungskurve die Genauigkeit erhSht. Der Rechenaufwand erhSht sich bei Verwendung der Logarithmen kaum, insbesondere dann nicht, wenn die Dosenfolge so gew/ihlt wird, dal] die Logarithmen regeIm~$ig ansteigen, wie z. B. : o,6 ~ :~ ./- ~ .~- 8, ~ 3, ~ r

Dosis . . . . . . . 1,0 1,6 2,5 4,0 6,3 10 16 usw. Logarithmus 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20.

1. Die mittlere t~dliehe Dosis .Mr und ihre Berechnung.

Es sei x~ der Logarithmus einer so starken Dosis, da~ die zugehSrige Mortalit~t fast = 100 % ausfglIt. Man zeichne in die Figur der Wirkungs- kurve an der Stelle x~ eine senkrechte Gerade. Nun konstruiere man eine zweite senkrechte Gerade links yon der ersten so, da]3 die Rechtecksflgehe zwischen den beiden Senkrechten gleich der (in der Abbildung sehraffierten) Fl~tche unterhalb der Wirkuiigskurve ist. Die Stelle der zweiten senkreehten

2 Wirth, W. : Wundt's psych01ogisehe Studien 6, 141 (1940); vgl. auch Wirth, Psychophysik, Leipzig 1912. -- a K~rber, G.: Naunyn-Schmiedebergs Arch. 162, 480 (193]).

394 B.L. vAx DE~ WAEnDE~:

Gera4en (in Fig. 4 mit M bezeiehnet) ergibt dann den Logarithmus der ,,mittleren tSdliehen Dosis ''~. Im Falle einer symmetrischen Wirkungs- kurve ist M = ~.

Ist Xo der Logarithmus einer Dosis, die praktiseh yon allen Tieren noeh vertragen wird ( / ) = 0%) und sind xl, . . . , x~ Dosenlogarithmen, die geniigend dieht zwisehen Xo und x~,) verteilt sind, setzt man sehlieBlieh x~+~ = x~, so kann man die Fl~ehe F unterhalb der Wirkungskurve mit geniigender Genauigkeit dutch eine Summe yon Trapezfl~ehen ersetzen:

2 (x~ - Xo) + - - ~ - - t x 2 - x~) + . . . +

P~ § P.~ 2 - + ~ - - "

xo xr x2 74

Fig. 4.

xs x~

Diese Fliiehe soll nun gleieh 4er Flgehe eines Rechtecks yon der HShe 1 sein, dessen Basis x~ -- M i s t :

F = x~+ t -- M, also M = X s+ 1 - - F .

Sucht man in F die Glieder mit Pl, mit t)2, usw. zusammen und beaehtet noeh, dab /)0 = 0 und p~+ 1 = 1 angenommen wurde, so erhiilt man:

xs + xs 4-t 1 (1) M - - 2 2 {Pl (X.~ - - Xo) +

~- p2(X3-- Xl) - ~ ' ' " ~- p s ( X s + i - - ZS__I) }.

Dies ist also die Definition der mittleren t6dlichen Dosis. Die exakten Werte der/) kennt man abet nieht; also wird man Pl , / )s , �9 �9 -,/).~ dureh die beobaehteten H~ufigkeiten hi, h2, . . . , hs ersetzen, deren Mittelwerte sie sind. Man erhiilt so die Gr5Be

(2) L - - x + x +1 1 s s { hi (x2 - x0) +

+ h2(x~ - xl) + " " + h ~ ( x ~ + l - xs-1)} .

Diese GrSBe L ist im Mittel gleich dem gesuchten M und kann daher als Niiherung fiir M benutzt werden. In tier Formel (2) bedeuten also:

Xl, x2 . . . . , xs die Logarithmen tier Versuehsdosen, h l , ]?'2, ' ' ' , ]is die beobachteten Sterbliehkeitsquotienten, x 0 und xs+a eine (hinzugedaehte) allerkleinste und allergr5gte Dosis,

von denen man annimmt, daB ihre Mortalitgten fast 0 bzw. 100 % betragen 5. Im Fal]e h~ = 1 hiingt L yon x~+l gar nieht ab; man kann dann also

x ~ + l - x~ oder = x~_l w~hlen.

4 Man kann M auch durch die weil3e Fli~che links yon der Wirkungskurve definieren: M = S x dp . Aus dieser Integraldarstellung folg{, dal3 M der Mittelwert der individuell tSd]iehe~ Dosen aller Versuchstiere ist. _ a ,,Fast 100 %" bedeutet hier etwa: zwischen 95 und 100%.

Wirksamkeits- und Konzentrationsbestimmung dureh TierVersuche. 395

2. Der mittlere Fehler yon L .

Um die Genauigkeit der Ngherung (2) beurteilen zu k6nnen, bereehnen wit ihren mittleren Fehler ~t. Da das mittlere Fehlerquadrat einer Summe gleieh der Summe der migtleren Fehlerquadrate der Glieder ist und da weiter der mittlere Fehler einer gemessenen Hgufigkeit h naeh der Wahr-

seheinliehkeitsreehnung V P , ( 1 n p) betrggt, so ergibt sieh

J

1 (1 - p~) (3) Jb~2 = 4 - {~01 ~ i (392 - - x0)2 @

.@ )0 2 (1 - - Pg) (X 3 - - Xl)2 @ . . . . @ Ps (1 - - Ps) ( X s + I - - Xs__l)2] n 2 7t s ]" �9

Wiederum sind die exakten Werte p~, f2, . . . , P~ unbekannt. Wiirde man aber die p (1 -- / )) wie oben dutch h (] -- h) ersetzen, so wiirde man im Mittel einen zu kleinen Wert erhalten. Am deutliehsten sieht man das im Fal len = ], wo h (1 -- h) immer Null ist. Bereehnet man allgemein den Mittelwert yon h (1 - -h ) , so ergibt sieh

h(1 - h) - # - ] ~ = p - (h - p)~ - 2 h p + p2

-= p - (h - p)2 _ 2 ]~p § p2

p (1_ - p) 2 p2 § p2

- p ( l - p ) p (1 - -~ ) _ ( n _ l ) p ( ~ - p) /b n

Daher ist der Mittelwert yon

[ h , ( 1 - (4) m~=u ~ - ~ (x2-xoP+

h2 (1 -- h2) -- x~_ 1)2 § n.~--I (x~--xl) 2 § 2 4 7 h~n~(1 ha)l (x~+~--

genau gleieh #2. Sind die nj nieht zu klein, so kann man m 2 als Ngherungs- wert fiir #2 benutzen.

B e i s p i e l 1. Chen , A n d e r s o n und R o b b i n s 6 beobaehteten ffir salzsaures Geisemiein bei je 10 roten Kaninehen folgende Sterbequotienten: '

Dosis . . . . 6 7 8 9 10 11 12 13

Gestorben 0/10 1/10 3/10 6/10 8/]0 5/10 9/10 10/10

In den Forme]n (2) und (4) kann man, dahs = 1 ist, ruhig X~+l --- x~ wghlen. Die Differenzen x j + l - xj-1 mSgen ietzt mit d~ bezeiehnet werden. Die Bereehmmg yon L und m verlguft nun folgendermagen:

6 Chen, A n d e r s o n u. B o b b i n s : Quart. J. Pharmacy a. Pharmacol. 11, s~ (193s).

396 B . L . w ~ ~ DEa WA~aD~:

Dosis ] (I -- h) x d x h d x ' h d 2 Ih d 2 h (i-- h) Lundm

6 7 8 9

I0 ii 12 13

0,778 0,845 0,903 0,954 1,000 1,041 1,079 1,114

0,125 0,109 0,097 0,087 0,079 0,073 0,035

0,0 0,1 0,012 0,3 0,033 0,6 0,058 0,8 0,070 0,5 0,040 0,9 0,066 1,0 0,035

0,0156 0,0119 0,0094 0,0076 0,0062 0,0053

0 0,09 0,21 0,24 0,16 0,25

,09

0,00141 250 226 121 156 048

0,00942

xs ~ xs + 1 .~. 1,114 2

1 -- 2 " 0,314 = -- 0,157

L ~ 0,957

mU _ 0,009 42 4 .9

0~000 262 m ~ 0,0162

Ergebnis : M = 0,957 :k 0,0162.

B l is s 7 fand aus demselben experimentellen Material mit einer anderen Methode, die viel mehr Rechnung e~fordert:

M ---- 0,961 :h 0,0166.

Man sieht hier schon, dal~ die Fli ichenmethode den raffinierteren englischen Rechenverfahren an Genauigkeit nicht nachsteht . Wir kommen darauf in w 4 zurfick.

Sind alle Differenzen x~+l - - xj kons tan t ---- 8 und sind alle n~ ---- n ,

so geht (3) in die yon G a d d u m s schon angegebene Formel

r (Z # 2 = ~ - - n = P - - p ) T

fiber. G a 4 4 u m ha t die Summe in 4er Klammer ffir verschiedene Werte yon (~/(~ unter der Annahme einer normalen Wirkungskurve aus den Tafetn des Wahrscheinlichkeitsintegrals berechnet un4 stets den Wef t 0,564 ge- fun4en. Denselben Wer t f in4et m a n auch, indem man 4ie Summe gen~hert du tch das In tegra l

c o

(1 - p ) ~ V~ - 0 , 5 6 4 . . .

ersetzt. Somit kSnnen wir, wenn a bekannt ist, den mit t leren Fehler 4er Flaehenmethode im Fall konstanter Dffferenzen und konstanter Tierzahlen nach der Formel

(5) ~2 = 0,564 ~--~ ? t

berechnen, die auch fiir kleine n richtig ist 9.

7 Bliss , C.I . : Quart. J. Pharmacy a. Pbarmacol. 1 1 , 2 0 2 (1938") -- 8 Gad- dum, J. H.: Med. Res. Counsil Reports on Biol. Standards III , 27 (1833). -- 9 Warum G a d d u m das I. c. bezweifelt, ist mir unklar.

Wirksamkeits-und Konzentrationsbestimmung durch Tierversuehe. 397

3. B e r e e h n u n g der S t r e u u n g m

Es fragt sich nun, wie man a praktisch berechnet. Nach dem V0rbild yon T r e v a n i~ verfahren wir dabei folgendermaSen. Die Streuung der tSdliehen Dosis kann (auch wenn die Wirkungskurve nieht normal sein sollte) dutch

1

(~2 = ~ ( x - - M) 2 dp i 1 r

0

definiert werden. Ersetzt man das Integral durch eine Summe

(_xj + x j + i 11i)2 (Pj+I -- Pj),

so mug man das bekannte Sheppardsehe Korrekturglied ~e/12 abziehen:

(6) 6 2 ~- X3 ~-~xj + 1 M ( p j + 1 - - P j ) 12

Um einen brauehbaren Niherungswert zu erhalten, ersetze man wiecler die unbekannten Wahrscheinlichkeiten p dutch die beobaehteten H~ufigkeiten h. So erhiilt man eine GrSge s 2, deren Mittelwert gleich a ~ is~:

Es ist nun aber nicht erlaubt, das M in (6) ohne weiteres dutch den Niherungswert L zu ersetzen, wie es T r e v a n l0 rut. Dutch diese Ersetzung wird die Summe ngmlieh um ( L - M) 2 verkleinert. Der Mittelwert yon (L - - M ) ~ ist #2. Also mul3 man entweder

s 2 = x i + x ] + l L ( h j + l - - h j ) @r 2 2 12 ( 7 a )

oc[er

(7b) 8 2 ~-- ~ (X] + Xj + 1 L')2 (h]~ 1 _ ]~J) @ m 2 (~2 , 2 , 12

setzen, damit der Mittelwert yon s ~ genau ~2 ist.

Die Formel (7 b) ist immer anwendbar, erfordert abet die Berechnung yon m 2. Die Formel (T a) kann nut dann angewandt wer4en, wenn #2 ungefiihr bekannt ist. Man kann z. B. auf Grund eines geseh/itzten Wertes yon ~ zuni~ehst #2 nach (5) bereehnen, ctann s 2 naeh (7a). Weieht das so ermittet~e s stark vom vortgufig angenommenen Wert yon a ~b, so kann man 4as Verf~hren noch einm~I wie4erholen, inclem man den verbesserten Wert s start des vorliufigen a in (5) einsetzt.

Bei 4er praktisehen Reehnung naeh (7 a) empfiehlt es sieh, die Grund- formel (2) folgendermagen umzuformen:

,r

(8) L = --2, xJ+ xj+~ hs). 2 (hi + 1 - 0

10 Bei Gaddum, I. c. 27. Archly f. exper!ment. Path. u. Pharmakol. Bd. 195. 9 8

398 B.L. v_a~ n~a WA~.D~x:

Zur Kontrolle des naeh (7 a) berechneten s 2 kann man noch folgende gleiehwertige Formel benutzen:

(9) s2 = % ~ + 1 (h~ + ~ - - hj) - - L2 + # 2 _ 1~. 0

B e i s p i e l 2. P r i g g e ,1 land bei einem hoehaktiven Diphtherie-Alaun- Impfstoff die folgende Sehutz~irkung (Anzahl der gesehiitzten Tiere 4ureh Anzahl 4er Versuchstiere):

Dosis . . . . 0,004 0,01 0,02 0,04 0,1 0,2 0,4 ccm Gesehiitzt 0]24 0/23 3/24 12/25 23/24 24/25 24/24

Die yon P r i g g e und S e h i i f e r n vo~genommene graphisehe Aus- wertung zeigt, d.ait die beobaehteten Daten gut zu einer normalen Wir- kungskur~e rnit ~ = 0,33 passen. Man kSnnte m 2 naeh (~) ausreehnen und (Tb) anwenden, abet eine grobe ~berschlagsreehnung naeh (5) fiihrt sehneIler zum Ziel. Zwar ist (5), strenggenommen, nieht anwendbar, da wed.er n noeh d genau konstant sind, abet d betrggt durehsehnittlieh 0,33 und n etwa 24; somit w~re #2 nngefiihr gleieh 0,0026. Da es sieh nut um ein kleines Korrekturglied in (T a) handelt, geniigt das.

Ansreehnung yon L und s 2 naeh (7 a) und (8) mit Kontrolle dutch (9) ergibt:

L -- log DL 50 = 0,621--2, also DL 50 = 0,0417 eem; s 2 -- 0,0748, also .s = 0,274.

Man kSnnte nun mit diesem verbesserten s-Wert yon neuem #2 aus- rechnen. Es ist aber nicht gesag~, dal~ der neue s-Weft besser ist als der alte. Gleiehzeitig mit dem Alaun-Impfstoff wurde ni~mlieh yon P r i g g e ein Standardimpfstoff untersueht, fiir den sieh naeh der ,,Zweipunkt- methode" (vgl. w 3) s = 0,39 ergibt. Das gewogene Mittel aus den beiden s-Werten betr~gt etwa 0,3i, in guter Ubereinstimmung mit dem yon Pr igge . nnd Seh~fe r graphiseh ermittelten Weft s = 0,33. A_us tier Annahme a = 0,31 findet man weiter naeh (5) #2 = 0,0024, also # = 0,05. Somit wgre das Ergebnis tier Auswertung:

M := log DL 50 = 0,62 4- 0,05.

B e i s p i e l 3. R. P r i g g e hat mit einer Reihe yon EMotoxinpr~paraten Reihen~ersuehe durehgefiihrt, bei denen nur 2 oder 4 Versuehstiere ]e Dosis verwenclet wurden. Die Dosen wurden immer der Reihe 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 entnommen. Die Frage, wie cliese Versuehsreihen auszuwerten seien, war tier Anlal3 zur vorliegenden Untersuehung.

Bei so kleinen Tierzahlen ist yon allen bekannten Auswertungs- methoden nut die Fl~ehenmethode durchfiihrbar. 16 Yersuehsreihen mit 2 Tieren je Dosis und 8 Versuehsreihen mit 4 Tieren je D0sis waren zur

1~ Prigge, B., u. W. Sch~fer: Naunyn-Schmiedebergs Arch. 191,303 (1939).

Wirksamkeits- und Konzentrationsbestimmung durch Tierversuche. 399

Anwendung der Fliichemnethode geeignet, da sie nach beiden Selden geniigend weir fortgesetzt erschienen le. Fiir alle diese Reihen wurden L und s 2 naeh (8) und (9) bereehnet. Die fiir s 2 gefunclenen Zahlen waren:

2 Tiere je Dosis [ 4 Tiere je Dosis

0,271 0 , 0 6 6 0 , 0 4 4 0,044 ] 0,041 0,360 0,066 0 , 2 9 4 0 , 7 4 4 0,666 0,361 0,504 0,t29 0 , 2 9 4 0 , 1 6 7 0,075 . 0,272 0,360 0,044 0 , 0 7 5 0 , 5 0 0 0,075 i 0,571 0,252

Ieh babe nun o 2 dutch Mittelung aus allen diesen s2-Werten berechnet. Da die ersten 16 Werte ein 4oppelt so groi3es mittleres Fehlerquadrat haben als die letzten 8, so ist den letzteren das doppelte Gewicht beizu- legen is. Es ergab sieh

a 2 = 0,281 :L 0,042, a = 0,530 ~ 0,040.

Dabei wurde der mittlere Fehler yon ~2 (also 0,042) empiriseh aus der Streuung der 24 Einzelwerte ermittelt.

4. I)er Fall ungleicher Tierzahlen.

In den bisherigen Beispielen waren die n~ alle untereinander gleich. Es ist abet nicht nStig und nicht eimnal giinstig, n konstant zu machen. Untersuchen wir doch einmal, wie man bei gegebener Gesamttierzahl die n wiihlen mu$, damit die Genauigkeit der Fli~chenmethode am grSl3ten wird !

Wit nehmen an, dab die Dosenlogarithmen Xo, xl . . . . , x~, x~+ 1 eine arithmetisehe Reihe mit der Differenz d bilden. Dann wird naeh (3)

(1.0) = (1iv

Bei gegebenem N = Z~n wird die Summe (10) am kleinsten, wenn die n

proportional zu [p (1 -- p) sind:

l~a diesem Fall wird

= 7 X (1 - p) ,

N = c s

1~ , ,Gentigend wel t for~gesetzt" h e i s t eine iReihe dt~nn, w e n n m a n a n n e h m e n kann, dab der n~chstgrSBeren Dosis eine Mor~alitgt nahe bei 100%, der n~ichst- kleineren eine Mortalit~it nahe bei 0 ~o entspricht. Das Urteil dariiber ist unver- meidlich subjektiv; jedoch wurden in diesem Fall bei der Auswahl der ,,gentigend langen" Versuchsreihen obj ektive IKriterien angewandt, die j ede Willkiir ausschlief3en. _ la Der mittlere Fehler yon s '2 ist ngmlich, wie aus (7b) leicht folgt, umgekehr$ proportinal zu V ~.

28*

400 B.L. VA~ DERWAE~DEN:

also N # 2 : ~ ( ~ V P ( I - - ~ ) 2

,~ X Vr (1 - v )

" = V.v Der Z~hler kann wieder gen~ihert dutch ein Integral .[ )//0 (1 -- i9) d x

ersetzt werden, das (nach einer numerisehen Integration) den Wert 1,62 o- hat. Somit ergibt sich

G (11) # -= 1,62 V~-.

Fiir die Praxis bedeutet das: Die G e n a u i g k e i t der F l ~ c h e n - m e t h o d e wi rd d a n n am g r 5 ~ t e n , w e n n die T i e r z a h l e n n un-

ge f~h r p r o p o r t i o n a l zu V p ( 1 - p) g e w ~ h l t w e r d e n , also in der N~he der 50%-Dos i s grSl~er als fiir die w e l t e r e n t f e r n t e n D o sen. Nachdem man also dutch einen Vorversuch (mit 1 bis 2 Tieren j e Dosis) die ungef~hre Lage yon ~ = log DL 50 festgestellt hat, erhShe man die Tierzahlen in der bT~ihe dieser Dosis solange, his die gewiinschte Ge- nanigkeit erreicht ist.

Die Tafel am Schluf~ dieser Arbeit gibt in Spalte 4 die Werte [p (1 -- 19), zu denen die giinstigsten Tierzahlen n proportional sin& Die Tafel zeigt, da~ die giinstigsten Tierzahl'en maximal sind zwischen ~ -- o und ~ + o, etwa halb so grol~ zwisehen ~ :~- o und ~ • 2 o und wieder dreimal kleiner zwischen ,~ ~: 2 o und $ -~ 3 o. Der mittlere Fehler tt ist im giinstigsten Fall durch (11) gegeben.

Dutch die gesehilderte Versuchsanordnung wird der yon G a d d u m (1. e. S. 28) gegen die Fl~ichenmethcde erhobene Einwand der Tierversehwen- dung entkr~ftet.

5. Der mittlere Fehler # bei nieht konstanten Tierzahlen.

Zur Berechnung yon/~e batten wir bisher nur 8ie Forme] (4), die nur fiir grol~e nj gent~gend genau ist, und ffir besondere F~lle noeh die Formeln (5) und (11). In allen anderen F~llen ist man auf die allgemeine Formel (3) angewiesen, in der die Wahrseheinlichkeiten ~1, - . . , 1% unbekannt sin& Wird abet die Wirkungskurve als normal angenommen und sind ~ u n d o bekannt, so kann man I91 . . . . . p~ berechnen und in (3) einsetzen. Fiir ~ kann man immer die ~q~herung L [Formel (2) oder (8)] benutzen. Ist nun auch eine gute ~gherung s yon ~ bekannt, so kann man zu jedem Dosenlogarith- runs x die GrSf~e

x - - L

Y - - s

berechnen, daraus p nach Spalte 3 der Tafel am Schlul~ dieser Arbeit, schliel~lich #2 nach (3). Das Verfahren ist allerdings etwas miihsam; daher wird man in der Praxis h~ufig die weniger genaue Reehnung naeh (4), (5) oder (11) vorziehen.


w 3. Die Bestimmung der Wirkungsgeraden dureh einen, zwei oder mehr Punkte.

Die in diesem Paragraphen zu besprechenden Methoden setzen alle voraus, daJ~ die Wirkungskurve normal ist, d .h . dal~ sie, auf logarith- misches Wahrschein]ichkeitspapier gezeichnet, eine Gerade ergibt. Sie sind auSerdem nut dann anwendbar, wean die Tierzahlen nl , n2, . . . , ns gro$ sind. Die AnzahI s der versehiedenen Dosen braucht dagegen nicht grol] zu sein; unter Umstiinden geniigen eine oder zwei Dosen.

Geht man darauf aus, die Wirkungsgerade rechnerisch oder graphiseh zu bestimmen, so bietet sieh folgende (Jberleguug dar. Die empirisehen H~ufigkeiten/tl, �9 �9 h~ unterscheiden sich bei grol~en nl , . . . , n~ nicht sehr von den wahren Mortalit~ten Pl, - . . , Ps. Transformier~ man nun die p-Skala nach w 1 dureh Einfiihrung der y, sie nach einem bestimmten Gesetz

p = W (y)

mit den io zusammenh~ngen, so kann man die H~ufigkeiten h ebenso transformieren:

h = W(y'). Die Spalten 2 und 3 unserer Tafel gestatten sofort die Bereehuung

yon y' zu gegebenem h. Bei Benutzung des logarithmischen Wahrsehein- lichkeitspapiers braucht man die y' gar nieht erst zu berechnen, da die transformierte Skala tier Papiereinteilung bereits zugrunde liege: man tr/igt direkt zu jeder Dosis die beobachtete H~ufigkeit h auf uud hag dann jeweils einen Punkt rnit den Koordinaten (x, y'). Die so gewonnenen Punkte nennen wir die Beobachtungspunkte.

Wenn nun die' h sich yon den p nut wenig uuterscheiden, so werden die y' sich auch nur wenig yon den y unterscheiden, aul3er wenn p nahe an 0 oder 100 Wo liegt, da dann eine kleine Jnderung yon p nach Abb. 3 eine starke Anderung von y zur Folge hat 14. Da die Punkte (x, y) auf tier Wirkungsgeraden liegen und die y' sich nut wenig yon d e n y unterscheiden, muJ~ die Wirkungsgerade nahe be i den Beobachtungspunkten (x, y') vorbeigehen.

Ans diesen~ Grundgedanken ergeben sich in verschiedenen FMlen folgende Verfahren:

1. Die Einpunktmethode.

Ist die Streunng ~ und damit auch die Steigung der Wirkungsgeraden bekannt, so braucht man zu ihrer Bestimmung nut einen Punkt (x, y) zu kennen. Da man y nicht genau kennt, legt man die Gerade dutch den Beobachtungspun~ (x, y'). Man kann dabei entweder graphisch vorgehen,

la In der Praxis wird man die Forderung, dal~ p nicht zu nahe bei 0 oder 100 % liegen soil, dadurch erffillen, daf] man nur solche Beobachtungen heranzieht, bei denen k und k beide nicht zu klein (etwa beide grOfJer als 1 oder 2) sind.

~02 B.L. vAN DE~WAE~DEN:

indem man die Gerade auf dem logarithmischen Wahrscheinlichkeitspapier dutch den gegebenen Punkt mit der gegebenen Steigung einfach zieht, oder rechnerisch naeh der Formel

x - - ~ = ~ y

o(~er ~ = x - - a y .

D a y ' Bin Naherungswert fiir y ist, ergibt sich fiir ~ der N~herungswert

(12) ~' = x -- ey ' .

Ist a genau bekannt, so ist clef mittlere Fehler yon ~' gleieh a # , , wo #~ der mittlere Fehler yon y' ist. Dieser ist, solange p nieht nahe bei Null oder Eins liegt, nach G a d d u m 4urch

(13) n / ~ = 2 ~p(1 - p)e ~J~

gegeben. Die Tafel am Sehlul3 dieser Arbeit gibt in ihrer 5. Spalte den Weft der reehten Seite an. Ist abet der fiir a angenommene Weft s selber mit einem mittleren Fehler p~ behaftet, so ist der mittlere Fehler yon $ ' = x - sy ' dureh

2 2 2 2 (14) t t2 = a2 ~v § #s(Y § # , )

gegebenlL

Die Formel (14) zeigt, 4al~ #e dann am kleinsten ist, wenn y nahe bei 0 liegt, also wenn die benutzte Dosis x nahe bei der 50 %-Dosis liegt; 4enn dann werden alle 4rei Glieder yon (14) mSgliehst klein. Praktiseh wird man demnaeh so verfahren, dal~ man fi~r jedes Pr~parat zunaehst 4urch einen Vorversueh die m~gef~hre GrSl]e 4er 50%-Dosis ermittelt (etwa naeh 4er Fl~ehenmethode) und 4ann fiir 4iese Dosis bei einer gr5- l~eren Anzahl yon Tieren die Sterbliehkeit feststellt, falls eine gesteigerte Genauigkeit gew[inseht wi~d.

Zur praktischen Bestimmung des mittleren FeMers # wit4 man, da man den exakten Weft yU in (14) nicht kennt, 4ie GrSBe y2 + #.~ durch die der Beobaehtung entnommene GrSl~e y,e ersetzen, deren Mittelwert gerade y~ § ~ 2 ist'. Welter wird man den exakten Weft ~e durch einen den

Y Beobaehtnngen entnommenen N~herungswert s e ersetzen, der etwa nach

~5 Zum Beweis yon (14) nehmen wir an, dag fftr a und y Ni~herungswerte s und y' ~ur Verftigung stehen, deren Mittelwerte gleieh a bzw. y sind. Man hat dann, wenn tier Querstrieh Mi~telwertbildung bedeutet:

~' = x - - sy ' , $ = x - - a y ,

(~, ~)o. = (.sy'--ay)2 = s ~ y , 2 _ 2 a 2y2+o2y9-

_- (~2 + t,~) (y: + ~ ) - ~ y~ = ~ z~+ ~ (y~ + ,~).

Dabei ist angenommen worden, dal~ sund y" unabh~ngig sind, was in der Praxis nicht immer der Fall ist. Auch die Annahmen s-= a und y' = y sind oft nur n/~herungsweise erffillt.


w 2 gefunden werden kann. So erh~tlt man an Stelle yon ( l l ) die praktiseh brauehbare Niiherungsformel

(15) m2 = s2/~ + #~ y,2,

~ n a e h (13) zu bereehnen ist. in der ~u v

Liegt y nahe bei Null, so ist das zweite Glied in (14) klein gegen das erste. Es maeht dann fiir den Wert yon # nieh~ viel aus, wenn man das

2 fiir 0 zweite Glied ganz wegl~l]t un4 im ersten GliecI den Weft y o n / ~ y = einsetzt. So erh~lt man die einfache Nfiherung

(16) #2 ~" Y n ' ~ a~" # ~'- 1,25 Un �9 &

B e i s p i e l 4. P r i g g e 16 hat zur Eichung eines bakteriellen Toxins 50 Tiere mit 1,8 mg vergiftet; es starben 18 yon ihnen. Bei einem anderen Toxin gleicher IIerkunft , abet yon anderer Stiirke, war die Steigung der Wirkungsgeraden best immt worden, mit dem Ergebnis:

1 R - - - - 0,846 ~: 0,154 also a = 1,18 ~ 0,215. (~

:In die Formel (12) hat man einzusetzen:

x = log 1,8 = 0,26,

y' = -- 0,36 (wegen h = 18/50 naeh der Tabelle, Spalte 1 und 2).

Somit ergibt (12):

~' = 0,26 -~ 0,30 = 0,56, also DL 50 = 3,6 mg.

:In die Formel (15) hat man einzusetzen

/~ = 0,215, 50#~ = 1,65 naeh der Tabelle, Spalte 4.

Somit ergibt (15)

m 2 ~ 0,046 -1- 0,006 = 0,052, also m = 0,23,

w~hrend die ungenauere Formel (I6) ergeben wiirde

# ~-~ 0,21.

Es bestiitigt sieh also, dal3 man bei so grogen Werten yon n stat t (15) ruhig die einfachere Formel (16) anwenden kann, sofern nut die beobaehtete ]-Iiiufigkeit nieht allzu stark yon 50 ~o abweieht. Als Ergebnis der Reehnung hat man zu vermerken:

= 0,56 • 0,23.

1~ Pr igge, R., u. W. Schemer, Naunyn-Schmiedebergs Arch. 191, 297 (1939). Der mittlere Fehler des yon Pr igge errechneten R wurde nach Formel (6) der zi~ierten G a d d u m schen Abhandlung berecbne~. Der mittlere l%hler p~ ergibt sich daraus nach der Formel Ps = "s~/~R"

4 ~ 4 B . L . V A N D E t ~ W A E R D E ] ~ :

2 . D i e Z w e i p u n k t m e t h o d e .

Is t ~ nicht bekannt, so braucht man zur Festlegung der Wirkungs- geraden 2 l~unkte (xl, Yl) und (x2, y~). Das graphische Verfahren liefert direkt die gen~herte Wirkungsgerade als Verbindungsgerade der beiden Beobachtungspunkte (xl, y'~) nnd (xs, y's). Will man abet lieber rechnen, so hat man aus den 2 Gleichungen

x2 -- ~ = e y2

die Unbekannten ~ und a aufzul5sen; das ergibt

_ x l y 2 - x 2 y l

y2 - y l

X 2 - - X 1 O ' - -

Y2 - - Yl

Ersetzt man wieder die y dutch die beobachteten y', so erhglt man die N~herungswerte (17) ~' - - xl y~ - x2 y~

y~ - y l '

X2 - - 3; 1 (18) ~' = - - . y~ - yl

Die Zweipunktmethode ist bei kleinen Tierzahlen praktisch nicht durchfiihrbar. Denn einerseits miissen y~ und Y2 welt genug auseinanderliegen, damit der Nenner in (17) nicht Null wird oder zu nahe an Null herankommt; andererseits aber diirfen Pl und p,2 wieder nicht zu nahe bei 0 oder 100 % tiegen, damit die gen~herte Ersetzung d e r y dutch die y' noch erlaubt ist. Bei kleinen Tierzahlen (bis e~wa 15 Tiere je Dosis) sind diese beiden For- de~ungen iiberhaupt nicht veIeinbarl~; bei gr51~eren Tierzahlen (etwa 30 Tiere oder mehr je Dosis) sind sie wohl vereinbar, aber sie verlangen, dal~ Yl etwa zwischen - - 1,5 und - - 0,5 und Y2 etwa zwischen 0,5 und 1,5 liegt. Aul~erhalb dieser Grenzen wird die Methode fraglich oder zumindest sehr ungenau. Das heii~t also, fiir die Anwendbarkeit de~ Methode ist erforderlich, da~ man dutch Vorversuche die ungefghren Werte yon ~ und a ermittelt, damit man die beiden Dosen so einrichten kann, da~ ihre Lo- gari thmen nahe bei ~ -- a und ~ + a liegen ~s.

17 Die n~there theoretische Ausfiihrung dieser Behguptung kann ich mir ersparen, well die yon Behrens und K~rber mit ,,Zetteltieren" durchgefiihrte Untersuchung (Naunyn- Schmiedebergs Arch. 177,637 (1935) sie in schlag.ender Weise experimentell bestgtigt. Von insges~mt 175 Auswertungen mit je zweimal 15 ,,Tieren" konnten 45 nicht verwertet werden. ,,Bei der Wahl zu enger Gruppen- abst~nde sind die nicht zu verwertenden Ergebnisse darguf zuriickzufiihren, dal~ eine niedere Dosis eine hShere ~ortalitgt als die dazugehSrige hShere Dosis erg~b, wghrend bei der Wahl der grol3en Gruppenabst~nde die nicht zu verwertenden darauf zur~ickzufiihren sind, dab eine Gruppe die Mortalit~t 100% bzw. 0% aufwies." -- is Vgl. dazu Punkt 2 der Zusammenfassung yon Behrens u. K~r- bet , l. c.


Wit berechnen nun den mittleren Fehler # des nach der Zweipunkt- methode ermittelten ~' ffir grol]e Tierzahlen. Nach bekannten Formeln ist,

#2= ~Oy'~/ "l \Oy~] 2

wobei nach der Differentiation die y ' dutch die y zu ersetzen sind. Fiihrt man die Differentiation naeh (17) aus, so kommt

Diese Formel gilt nur unter der Voraussetzung, da~ ~' gen~hert als lineare Funktion yon Y'I und Y'2 betrachtet werden kann; dafiir ist aber nStig, cta$ Y.2 - - Yl nicht zu nahe bei ~ull liegt. Bei 30--50 Tieren je Dosis mull man etwa Y2 -- Yl > 1�89 also x2 -- Xl > ]�89 ~ verlangen, bei mehr als 50 Tieren x2 - - xl > ~. Die in (19) vorkommenden #,~ kSnnen, sofern Pl und P2 nicht zu nahe an 0 oder 100 % herankommen, aus der Tafel am Schlu$ tier Arbeit entnommen werden.

Zur Diskussion des Ausdrucks (19) nehmen wir nl = n2 an. Bei gegebenem Y2 -- Y~ wird #2 am kleinsten, wenn y~ und Y2 entgegengesetzt gleich sind19:

Y l = - - Y , Y ~ = Y .

Der Ausdruck (19) geht dann in

( r2 2 #2 : 2 ~ty

tiber. Der Faktor #~ ist am kleinsten, wenn y mSglichst nahe bei 0 liegt; andererseits darf man abet y wieder nicht zu klein w~hlen, da daml Y2 -- Yl zu klein wird. Bei m~13ig grol~em n wahle man etwa y = 1 ; bei sehr grol~em n kann man y sogar noch etwas kleiner w~hlen. Bei y = 1 ist xl = ~ -- und x2 = ~ § a, welter nach der Tabelle n#~ = 1,51, also

(r2 #2 __ 2,28 ~n"

Setzt man N = n~ § n2 = 2 n, so folgt

(20) ~ = L 5 1 ~ -

Gen~ihert gilt diese Formel auch dann noch, wenn n 1 und n2 nicht genau gleich und x~ und x2 nicht gena~ gleieh $ =~ a sind; denn in der b~he ihres Minimums /~ndert sich eine Funktion bekannt]ieh nut wenig. Um eine N~herungsformel handelt es sich auf alle F~lle, da die Herleitung yon (19) bereits auf einer N~herung beruht. Ffir N > 100 di~rfte d i e N~herung gut stimmen, w~hrend fiir N < 100 das wahre # etwas gxSl~er ist.

Vergleieht man den eben hergeleiteten mittleren Fehler der Zwei- punktmethode mit dem der Einpunkt- und der Fl~chenmethode, so k o m m t man zu dem folgenden Ergebnis:

1~ ]3ei ungleiohen n 1 und n 2 erh~lt ma.n st~att der Bedingung Yl = -- Y2 die andere n 1 Yi q- n2 Y2 = O, wenigstens solange y~ und y,_, klein sind.

406 B.L. vA~ DE~ ~'AERDEN:

W e n n ~ u n d ~ y o n v o r n h e r e i n u n g e f ~ h r b e k a n n t s ind u n d n i c h t zu s t a r k s c h w a n k e n , so i s t die E i n p u n k * m e t h o d e den a n d e r e n v o r z u z i e h e n . S ind d iese V o r a u s s e t z u n g e n n i c h t er- f i i l l t , so h a t m a n "die W a h l z w i s c h e n de r F l g c h e n m e t h o d e u n d de r Z w e i p u n k t m e t h o d e . S t e h e n i n s g e s a m t e t w a N = 100Tiere zu r V e r f i i g u n g , so s ind be ide M e t h o d e n bei o p t i m a l e r An- w e n d u n g 2~ u n g e f ~ h r g l e i eh genau . Bei w e n i g e r als 1 0 0 T i e r e n ( i n sgesamt ) i s t die F l ~ c h e n m e t h o d e , bei m e h r die Z w e i p u n k t - m e t h o d e v o r z u z i e h e n , s o f e r n d i e W i r k u n g s k u r v e n o r m a l ist .

Genau ebenso wie den mittleren Fehler yon ~' nach (17) kann man auch den yon ~' aus (18) berechnen; man findet

_ ~ 2 2 . ~(21) ~ x ~ - ~ , 1 / ~ + ~

B e i s p i e l 5. Der Pr iggesche A]aunimpfstoff (vgl. Beispie] 2) sollte mit einem Standardimpfstoff verglichen wer4en. Die beobachteten Erfolgs- zahlen beim Standardimpfstoff waren die folgenden:

D o s i s . . . . . . . . . . . . 0 ,5 c c m 2 e c m

G e s c h i i t z t . . . . . . . . 3/24 15 /23

Die Tafeln ergeben xl = -- 0,301, x2 = 0,301, h~ = 12,5 %, h2 = 65,2 %, y'~ = - 1,15o, y'~ = o,391,

2 4 , L = 2,59, 2 3 , ~ = 1,66.

Die Formeln (17), (18) und (19) ergeben

~ ' = 0,148, a ' = 0,39, # = 0,067.

Der Wert a' =- 0,39 wurde oben (Beispiel 2) bereits benutz~. Das Er- gebnis der Auswertung nach der Zweilounktmethode ist also

= 0,15 • 0,067.

Ffir den mittleren Fehler yon a' finder man nach (2]) 0,07. Der ;genauere Wef t s = 0,31, der oben (Beispiel 2) dutch Mittelung aus 0,39 und dem wesentlich genaneren Weft 0,27 gefunden wurde, hat sicherlich einen erheblich kleineren raittleren Fehler; eine robe Sch~tzung dieses mittleren Fehlers ergab 0,04. Also:

= 0,31 ~ 0,04.

2o ,,Optimale Anwendung" heist bei tier Fl:~ichenmethode: Tierzahlen ungef~hr proportional zu UP (1 -- p); bei der Zweipunktmethode: Dosen etwa gleich ~ • a.


3. Die Mehrpunktmethoden.

Hat man Inehr als 2 Beobachtungspunkte, so kann man erstens graphiseh vorgehen, indem man die Wirkungskurve auf Wahrseheinlieh- keitspapier so zeichnet, dab sie mhg]iehst nahe bei den Beobachtungs- punkten vorbeigeht. Wie man dabei die verschiedenen Gewichte dieser s mit Hilfe der Pr iggeschen ,,Mutungsgrenzen" graphisch beriick- siehtlgt und so auch die Ergebnisse mit h = 0 und h -- 1 mit heranziehen kann, haben P r i g g e und Sch~fe r 1. c. angegeben und mit Beispielen erliiutert.

Man kann aber auch rechnerisch nach der bekannten Methode der Regressionslinien (,,Methode der kleinsten Quadrate") vorgehen; U r b a n ~1 und G a d d u m ~2 haben das niiher ausgefiihrt. Die Hauptschwierigkeit ist dabei die Bestimnmung der Gewichte, die den mittleren Fehlerquadraten 4er beobachteten y! nmgekehrt proportional, also Funktionen yon p sind. G a d d u m ersetzt hier die p einfach durch die beobachteten h, was nur in der lgiihe von 50 % zuliissig ist.

Bl iss 2s hat vorgeschlagen, lieber aus einer graphisch bestimmten vorliiufigen Wirkungskurve die p-Werte zu ermitteln und mit ihrer Hilfe die Gewichte zu bestimmen. R. A. F i s h e r hat in einem Anhang dazu ein geistreiches Verfahren angegeben, das es gestattet, auch die Fiille h = 0 und h =- 1 zu beriicksichtigen. Es beruht auf der ,,Method of Maximum Likehhood", yon der die Methode der kleinsten Quadrate nur die erste Approximation darstellt.

Alle diese Methoden erfordern sehr viel Reehnung, die sich, wie wit in w 4 sehen werden, nicht durch erhhhte Genauigkeit belohnt macht. Wenn das vorliegende Beobachtungsmaterial einmal so beschaffen ist, dal3 man weder die Fl~iehenmethode, noch die Ein- oder Zweipunktmethode anwenden kann nnd wenn man sich mit einer graphischen Bestimmung der Wirkungskurve nicht begntigen will, so wird man notgedrungen zu den Mehrpunktmethoden greifen. Hat man aber die Einrichtung des Ex- periments selbst noch in der Hand, so wird man zweckm~l~ig so verfahren, dal~ eine dieser drei Rechenmethoden anwendbar wird.

w 4. Die Maximalmethode (Method of Maximal Likelihood).

Um die ,,efficiency" einer Auswertungsmethode zu beurteilen, vergleieht man sie nach R. A. F i s h e r mit der Maximahnethode, die unter allen Auswertungsmethoden den kleinsten mittleren Fehler besitzt. Die Maximalmethode ist auf die verschiedensten statistischen Auswertungs- probleme anwendbar; sie erfordert aber in nnserem Falle unverhiiltnis- miil~ig Inehr Rechnung als die anderen besprochenen Verfahren. Sie setzt

21 Urban, F.M.: Arch. Psych. 15, 261 (1909); 16, 168 (1910). -- 22 Gad- alum, J. H.: Med. Research. Counsll Reports on Biol. Standards III, Methods of Biological Assay depending on a Quantal Response (London 1933). -- 2~ Bliss, 'C. I.: Ann: Appl. Biol. 22, 134 (1934).

408 B . L . VA~ DER WAEI~DE~:

(22) a

(23) a

wobei

wieder eine normale Wirkungskurve voraus; die Dosen x t , x2 . . . , x~ und die Tierzahlen n l , n2 . . . . , n~ sind je tz t ganz beliebig.

Das Prob lem isL die Kons t an t en ~, a der Wi rkungskurve

so zu bes t immen, da~ eine mSglichst gute I )bere ins t immung der gefundenen Hguf igke i ten ha . . . . . h,, m i t ihren Erwar tungswer ten Pt , �9 �9 P,~ erreicht wird. Nach R. A. F i s h e r ~4 berechnet m a n zu dem Zweek die Wahrschein-

l ichkeit dafiir, dal~ die beobachte ten Anzahlen kl . . . . , k, u n d / q , . . . , k~ durch Zufall entstehen. Der Logar i thmus dieser Wahrseheinl ichkei t ist bis auf addi t ive Glieder, die nicht interessieren, durch

A = Z k l n p + Z / c l n ( 1 - - p )

gegeben. A ist eine F u n k t i o n der unbekann ten K o n s t a n t e n ~ und a. N u n

bes teh t die Maxi lnalmethode darin, dal~ m a n ~ = ~ und a - - 6 so bes t immt , dal~ A z u m M a x i m u m wird. I n d e m m a n also die Ablei tungen yon A nach und nach a Null setzt, erh~lt m a n die Bedingungen

0A - r ~ o ( y ) + X ~ ( - y ) = o ,

OA -- Z k y ~ p ( y ) + Z [ c y ~ p ( - - y) -~ O,

Oc~

d W' (y) Y~ (Y) = dy In W (y) - - W (y)

gesetzt wurde. Die Funk t ionen ~f (y) und y W (y) sind aus der Tafel a m Sehlui3 dieser

Arbei t zu entnehmen. Setzen wit zur Abki i rzung

x (24) z

so wird y = t - - r , also kann m a n die Gleichungen (22) und (23) aueh so schreiben:

( 2 5 ) A ' = O A _ X k ~ ( t - - r ) + X / c ~ ( r - t ) =-0 or

( 2 6 ) - - Z / c ( t - - r ) F ( t - - z ) - - Z k ( T - - t) F ( r - - t) = 0 .

Setzt m a n ~f (t . r) ~ y~ und F (T - - t) = y), so kann m a n fiir (25) auch sohreiben:

n ' = -Zk~+Z~) = o .

N i m m t m a n zuerst fiir a einen plausiblen N~herungswert , so f inder m a n aus (24) die zu den versehiedenen Dosenlogar i thmen x gehSrigen t und kann

e4 F i she r , R. A.: Proe. Cambridge philos. Soe., Biol. Sci 22, 700 (1924); vgl. aueh R. A. F i she r : Statistical Methods for Research Workers.

Wirksamkeits- und Konzentrationsbestimmung durch Tielwersuehe. 409

dann dutch Probieren ein ~ finden, das die Gleiehung (25) befriedigt. Dabei k o m m t der Umstancl zu Hilfe, dab A ' n~herungsweise eine lineare Funk t ion yon T ist. Sind also ~1 und 72 zwei Ngherungswert.e, die den riehtigen W e f t T zwisehen sich einsehliegen, so kann m a n den richtigen W e f t ~ dutch lineare In te rpola t ion f inden:

~ - ~ (~) A ' (27) T ----- T 1 - - A' (~2) A' (T1).

Aus dem so gefundenen T ergibt sieh naeh (24) das gesuchte ~ = wa.

Gliicklieherweise ist dieses g in den meis ten Fgllen nieht sehr s tark yon dem

angenommenen a -Wef t abhgngig. H a t m a n einmal g, so kann m a n in derselben Weise dutch Probieren ~ = ~ so bes t immen, dab aueh (26) erfiillt wird.

B e i s p i e l 6. Bei einem seiner Endo tox inpr~para te (vgl. Beispiel 3), n~mlich dem festen 1131 A*, l and P r i g g e dis folgenden Sterbequot ienten:

Dosis . . . . 500 200 100 50 20 10 5 2 1 Gestorben 3/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/~ 0/~ 0/4 0/4

Die F lgehenmethode ist bier nieht anwendbar , da die Dosenreihe naeh oben nieht weir genug fortgesetzt ist. Die Anwendung der Maximalmethode wird dadureh erleiehtert, dal~ s bereits reeht gut bekann t ist (vgl. Bei- spiel 3). Der bequemen I~eehnung halber nehmen wit s = 0,5 (start 0,53) am U m (25) zn 15sen, babe ieh zuerst r l = 5,1 versueht ; da die linke Seite A' posi t iv ausfiel, war ~1 zu kle in . Sodann wurde ~2 = 5,3 versueht . Die Reehnung verl~uft folgendermagen (x = log Dosi.s, T = 2 x):

i !3 6 00i I01 1 Dosis x t k k t -- 5,1 k lfl k g, t -- 5,3 k y~ k ~o . . . . . . . . . . . . . . [

500 2,7 5,4 [ 3 1 0,3 1,85 1,00 0,1 2,21 0,86 200 - - 0,5 1,14 1,53 - - 0 , 7 1 , 2 9 1,24 100 2,0 4,0 -- 1,1 2~9 1,01 -- 1,3 3~50 0,76

1,7 - 1,7 0,39 - 1,9 o s 7 20 1,3 2,6 0 0,07 - 2 , 7 0,04

1,0 2 , 0 10 ~ - 3,t 0,01 - 3,3 0,01 5 0,7 1,4 0 4 -- 3,7 4,01 !

Somit wird

also naeh (27)

A ' ( t l ) = - - 2,99 ~- 4,01 = 1,02, A' ( ts ) = 3,50 d- 3,18 = - - 0,32,

0,2 T = 5,1 d-1~34" 1,02 = 5,252,

---= aT = 0,5 ~ - - 2,626.

Der mit t lere Fehler t~ yon ~ ist naeh F i s h e r geniihert dutch

0~A 1

410 B .L . VAN DE~ WAERDE~-:

oder O2 A ' OA' a 'a

(28) 0 ~ 2 - o ~ - F a

gegeben. Da A' geniihert eine lineare Funktion yon r i s t , kann man deJx Differentialquotienten O A ' / O ~ dutch den Differenzenquotienten

A' (T~) -- A' (T1~ 1,34 ~ 2 - - zl 0,2

ersetzen. Demnaeh wird ~;~ 0,2

- - = 0,149, a '~ 1,34

Ergebnis demnach: ,a = o / 149 = 0 , 1 9 a .

= 2.63 -~ 0,19.

In diesem Beispiel war G yon vornherein bekannt, was die Reehnung sehr erleichterte. Ist a nicht bekannt, so wird das Verfahren ttuBerst mfih- sam; man hat sieh daher naeh brauchbaren N~herungsmethoden urn-

�9 gesehen.

Sind die k und /~ nicht zu klein, so ist

A ~ C -- ~ ' (~--_k)~9.k~ -- C _ V~ ~, ~i--~(P -- h)~

eine gute N~hemng ffir A, und die Maxima]methode geht in die Methode der kleinsten Qua&ate fiber (vgl. G a d d n m , 1. c. S. 41). wie man die

Ngherung iverbessein kann ffir den Fall, dab einige k oder k Null sind oder nahe bei Null liegen, hat B l i s s nach R. A. F i s h e r angegeben (vgl. w 3).

Wir vergleichen nun die Genauigkeit der in w 2 und 3 angegebenen Methoden mit der der Maximalmethode. Wir nehmen dabei an, a sei genfigend genau bekannt und es handle sieh nut um den mittleren Fehler/~

yon ~. Wie wit sehon sahen, ist

OA' a ~

Xkv, ' (y) + X ~ v / ( - y ) ~ - ~ .

Ersetzt man links die k dutch ihre Erwartungswerte p n , so wi~d die Niiherung nicht schlechter, und man erhiilt

~ ' n {p ~p' (y) + (1 -- p) ~' (-- y)} ~ a~

W' (y)2 / w ( - y) ~2

oder wegen W (y) + W (-- y) = 1

W' (y)~ (~ (29) ~-~ n W ~ ,,- ~-~ (y) W' (-- y)~-~ vT.,"

Wirksamkeits- und IKonzentrationsbestimmung durch Tierversuche. 411

Die Briiche links werden max imal fiir y = 0. Also wird die Genauigkeit . der Maximalmethode a m grSf~ten, wenn aUe benutz ten Dosen nahe bei cIer 50 %-Dosis liegen. Die maxima] erreichbare Genauigkeit ist dutch

(30) ~ - ~ - ~ ~

gegeben, also genau gleich der max imalen Genauigkeit der E in2unkt - methode.

D a m i t Jst bewiesen, da$ die E inpunktmetho4e , angewandt auf e ine Dosis in der N~he der 50 %-Dosis, die grSl]te Genauigkeit erreicht, die sich bei gegebener Gesamtt ierzahl iiber]~aup~ erzwingen Igflt.

Wi t wollen nun die Genauigkeit der Fl i ichenmethode im Fall gleicher n mi t der max imal erre ichbaren Genauigkeit vergleichen. Wie in w 2 nehmen wit an, dab die Differenzen xj + 1 -- % kons tan t sind und da~ d i e Dosen yon einer ioraktisch unwirksamen zu einer solchen Dosis, die p r a k - t isch alle Tiere tStet, aufsteigen. Die Summe (29) l~il]t sich dann (/ihnlich

T a b e l l e n

Z

m

~+2(5

$+3~

Y p(~ n#~ w(g) tyr ) z y p(O/o ) i#(y) y~(y)

o 50,0 o,oo o 50,0 L 50 1,57 o,8o ~ o,8oi o,oo 0,1 54,0 50 1,58 I 0,74 0,07 II - - 0,1 I 46,0 I 0,86 I - - 0,09.. 0,2 57,9 [ 49 1,59 0,68 0,13 11 -- 0,2 I 42,1 I 0,93 -- 0,19 0,3 61,8 / 49 1,62 0,62 0,19 II -- 0,3 I 38,2 / 1,00 I -- 0,30 0,4 1 65,5 / 47 1,67 J 0,56 0,22 li - 0,4 1 34,5 / 1,07 ] ~ 0,43 0,5[ 69,1 I 46 1,72 i 0,61 0,25 II - o,51 30,9 [ 1,14 i - 0,57 0,6 1 72,6 i 45 1,79 I 0 , 4 6 0 , 2 8 II - 0,6127,4 I 1,22 i - 0,73 0,7 75,8 [ 43 1,88 0,41 0,29 II - 0,7 I 24,2 I 1,29 I -- 0,90

41 0,37 0,8[ 78,8 I 1,99 0,30 II - 0 ,81 2 1 , 2 / 1 , 3 7 / - 1 , 0 9 0,9 81,6 39 2,12 0,33 0,29 It - 0,9 [ 18,4 / 1,45 I 1,30 1,0] 84,1 I 37 2,28 0,29 0,29 II ~+~ - 1,0115,9 / 1,53 I - 1,53 1,11 86,4 34 2,47 I 0,25 0,28 Ir -- 1,1 I 13,6 I 1,61 I -- 1,77 1,2 88,5 32 2,70 I 0,22 0,26 I -- 1,2 / 11,5 / 1,69 I -- 2,03 1,3 90,3 I 30 3,00 10,19 0,25 I --1,31 9,7 [1,77 l - -2 ,30 1,4 I 91,9 27 3,32 I 0,16 0,23 I -- 1.,4 ! 8,1 [ 1,85 / -- 2,60 1,5 I 93,3 I 25 3,72 I 0,14 0,21 il -- 1,5 6,7 / 1,94 - - 2,91 1,6~ 94,5 I 23 4,21 I 0,12 0,19 I -- t,6 5,5 I 2,02 I -- 3,24 1,7:95,5 1 2] 4,811 0,10 0,17 II - i,7 4,5 1 2,11 I - 3,59 1,8i 96,4 19 5,561 0,08 0,15 H - 1 , 8 3,6 [ 2,20 / -- 3,95 1,9 i 97,1 ~ 17 6,48 I 0,07 0.13 ~I -- 1,9 2,9 I 2,28 -- 4,34 2,01 97,7 1 15 7,631 0,06 Gll I[ ~ +2 ~ -- 2,0 2,312,3, / - 4,75 2,1 I 98,2 I 13 9,1 0 ,040 ,09 II 1 - 2,1 1,812,46 / - 5,17 2;2198,6 ] 12 1 0 , 9 0,04 o,o8 II 2 , 5 5 1 - 5 , 6 1

- , ,3 1,1 1 2,64 / - 6;07 0,03 13,2 0,07 il 2,3198,9[ lO - 2 , 2 1,4 2,4! 99,2 16,2 0,02 0,06 i - - 2,4 0,8 I 2,73 / - - 6,55- 2,5199,42,6i 99,51 s 20,1 / 0,02 0,04 II - 2,5 0 , 6 1 2 , 8 2 / - 7,06

0,01 0 , 0 4 25,1 .i -- 2,6 0,5 / 2,91 / -- 7,58 2,7 ~, 99,7 I 56 31,8 0 , 0 1 0 , 0 3 I - 2,7 0,3 ] 3,01 / - 8,12 2,8t 99,7 I 40,7 0,02 I -- 2,8 0,3 ] 3,10 / - - 8,67

52,6 -- 2,9 0,2 / 3,19 I - - 9,25. 2'9199'8 I 0,01 i3,0] 99,9, ~ 0,01 0,02 il

I 68,6 0,00 O,Ol II ~ + 3 a - - 3,0 0,1 / 3,28 I -- 9,85,.

z~12 B . L . VAN D E R W A E t t D E N : Wirksamkeits- u. Konzentrationsbestimmung u s w ~

wie die entsprechende Summe in w 2) in ein Integral verwandein und es ergibt sich, in ldbereinstimmnng mit G a d d u m (1. c. S. 28)

(31) #2= 0,554 '~. n

In w 2 fanden wir fiir das mitt]ere Fehlerquadrat der Fliichenmethode

/~2 = 0,564 a~. n

Der mittlere Fehler der Fl~chenmethode ist somit nur um 1 ~o gr51~er a]s der kleinste mittlere Fehler, der sich bei dieser Versuchsanordnung iiberhaupt erreichen l~gt. Da die Fl~chenmethode erheblieh weniger Reehen- aufwand erfordert und yon der Voraussetzung einer normalen Wirkungs- kurve unabhiingig ist, so ist sie in den F~]len, in denen sie anwendbar ist, alien anderen Reehenmethoden vorzuziehen.

Z u s a m m e n f a s s u n g .

Verschiedene Verfahren zur Konzentrationsbestimmung yon Wir- kungsstoffen aus Tierversuchen werden auf ihre Genauigkeit bin geprt~ft und mit dem genauesten Verfahren, der ,,MaximMmethode" yon R.A. F i she r , vergliehen. Dabei zeigt sich, dal] bei kleinen Tierzahlen und vSIlig unbekannter Konzentration des Wirkungsstoffes die ,Flgchenmethode" yon Wi r th , Behrens und K g r b e r allen anderen Rechenverfahren vorzuziehen ist (w 4). Es werden Formeln angegeben, nach denen man bei dieser Methode nieht nut die mittlere tSdliche Dosis [w 2, Formeln (2) und (8)], sondern anch die Streuung der tSd]ichen Dosis oder Steigung der Wirkungsgeraden (9), sowie den mittleren Fehler der Auswertung [(4)

-und (5)] berechnen kann. Es wird welter angegeben, wie man die Experi- mente einzuriehten hat, nm mit m6gliehst wenig Tieren eine gute Genauig- keit zu erzielen (w 2). Sind andererseits die mittlere tSd]iche Dosis und die Streuung ~ genghert bekannt, so ist die genaueste Auswertungsmethode die ,,Einpunktmethode", die darin besteht, dal3 eine Dosis, bei der ungef~hr 50 ~o der Tiere reagiert, einer grSgeren Anzahl von Tieren eingegeben wird und durch den so gewonnenen Beobachtungspunkt die Wirkungsgerade gelegt wird [w 3, Fmmel (12)]. Der mittlere Fehler dieser Methode wird angegeben [Formeln 05) und (16)]. Bei grol~en Tierz~hlen kommt, besonders wenn a nicht von vornherein bekannt ist, auch noeh die ,,Zweipunkt- methode" in Betracht, deren mittlerer Fehler dureh Formel (19) gegeben wird.

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Wirksamkeits- und Konzentrationsbestimmung durch Tierversuche